PL248101B1

PL248101B1 - Method for obtaining decellularized extracellular matrix isolated from mammalian tissues and its use in regenerative medicine

Info

Publication number: PL248101B1
Application number: PL441935A
Authority: PL
Inventors: Filip Witold Porzucek; Monika Maria Mańkowska-Woźniak; Jakub Dalibor Rybka; Adam Aron Mieloch
Original assignee: Univ Im Adama Mickiewicza W Poznaniu
Priority date: 2022-08-04
Filing date: 2022-08-04
Publication date: 2025-10-20
Also published as: PL441935A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania decelularyzowanej macierzy pozakomórkowej (ECM), wyizolowanej z tkanki ssaczej oraz zastosowanie w medycynie regeneracyjnej na przykładzie leczenia uszkodzeń łąkotki. Sposób otrzymywania decelularyzowanej macierzy pozakomórkowej dECM, wyizolowanej z tkanki ssaczej, polega na tym, że z pobranych łąkotek usuwa się pozostałości innych tkanek, przemywa wodą oczyszczoną, dalej łąkotki rozdrabnia się w znany sposób z wykorzystaniem elektrowilka z sitem o dużych otworach, następnie ponownie mieli się z wykorzystaniem sita o mniejszych otworach, po czym prowadzi się ekstrakcję w roztworze kwasu mlekowego, przez 12 godzin, w temperaturze pokojowej, przy ciągłym mieszaniu, następnie oddziela się pozostałość po ekstrakcji od roztworu, a uzyskany roztwór zamraża się, a wytłoki kieruje się do drugiej ekstrakcji, którą prowadzi się w takich samych warunkach jak pierwszą, a po oddzieleniu uzyskany roztwór zamraża się, dalej pozostałość po ekstrakcji kieruje się do kolejnego etapu, gdzie do wytłoków dodaje się roztworu pepsyny o stężeniu w zakresie 1 - 6 mg/ml rozpuszczonej w kwasie chlorowodorowym, przy czym hydrolizę prowadzi się w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu przez 48 h, dalej uzyskaną mieszaninę filtruje się na worku separacyjnym wykonanym z siatki poliamidowej o wielkości oczek równych 200 µm, po czym uzyskany przesącz kieruje się do oczyszczania, a pozostałości po hydrolizie zamraża się, a w kolejnym etapie w przesączu stabilizuje się pH na poziomie 9, po czym roztwór wiruje się w temperaturze pokojowej, a supernatant odrzuca się, a retentat w postaci osadu poddaje się liofilizacji poprzez zamrożenie w temperaturze -80°C, przez 72 h, następnie dosusza się przez 8 h, a uzyskany zliofilizowany retentat ECM poddaje się procesowi mielenia kriogenicznego poprzez wymrażanie i trzy cykle mielenia, a po zakończeniu mielenia proszek przesiewa się przez sita o wielkości oczek w zakresie 200 - 400 mikrometrów. Przedmiotem zgłoszenia jest także decelularyzowana macierz pozakomórkowa do zastosowania do leczenia uszkodzeń łąkotki.The subject of the application is a method for obtaining decellularized extracellular matrix (ECM) isolated from mammalian tissue and its use in regenerative medicine, taking as an example the treatment of meniscus damage. The method of obtaining decellularized extracellular matrix (dECM), isolated from mammalian tissue, consists in removing the remains of other tissues from the collected menisci, washing them with purified water, then the menisci are ground in a known manner using an electric grinder with a large-hole sieve, then they are ground again using a sieve with smaller holes, then extraction is carried out in a lactic acid solution for 12 hours at room temperature with constant stirring, then the residue after extraction is separated from the solution, the obtained solution is frozen, and the pomace is sent to the second extraction, which is carried out under the same conditions as the first one, and after separation, the obtained solution is frozen, then the residue after extraction is sent to the next stage, where a pepsin solution with a concentration in the range of 1 - 6 mg/ml dissolved in hydrochloric acid is added to the pomace, wherein the hydrolysis is carried out at room temperature with constant stirring for 48 hours, then the obtained solution is The mixture is filtered through a 200 µm polyamide mesh separation bag. The resulting filtrate is then sent for purification. The hydrolysis residues are frozen. In the next step, the pH in the filtrate is stabilized at 9. The solution is then centrifuged at room temperature, the supernatant is discarded, and the retentate, in the form of a pellet, is freeze-dried by freezing at -80°C for 72 hours. It is then dried for 8 hours. The resulting lyophilized ECM retentate is subjected to cryogenic grinding by freezing and three grinding cycles. After grinding, the powder is sieved through sieves with a mesh size of 200-400 micrometers. The application also covers a decellularized extracellular matrix for use in the treatment of meniscal lesions.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania decelularyzowanej macierzy pozakomórkowej (ECM) wyizolowanej z tkanki ssaczej oraz zastosowanie w medycynie regeneracyjnej na przykładzie leczenia uszkodzeń łąkotki.The subject of the invention is a method for obtaining decellularized extracellular matrix (ECM) isolated from mammalian tissue and its use in regenerative medicine, for example in the treatment of meniscus damage.

Istnieje bogaty i zróżnicowany stan techniki dotyczący otrzymywania ECM z tkanek ssaczych. Jednakże opisane metody często charakteryzują się możliwością wykorzystania jedynie w skali laboratoryjnej. Takim przykładem jest zgłoszenie patentowe o numerze US8906362B2 oparte o pozyskiwanie fragmentów łąkotki, ich decelualaryzację z użyciem detergentów i zanurzenie w zawiesinie komórkowej. Poza faktem, iż metoda ta jest wydajna jedynie w skali laboratoryjnej, pojawia się także problem ograniczonej migracji komórek do wnętrza konstruktu. Inny patent związany z otrzymywanie ECM z tkanek zwierzęcych nosi numer US 8361503 B2. To zgłoszenie znacząco różni się od naszego wynalazku, gdyż pozyskanie ECM opiera się jedynie o trawienie enzymatyczne, bez frakcjonowania. W kolejnym patencie (WO2019/122351 A1) ECM została zaimplementowana jedynie jako dodatek do biotuszu i wymaga wymieszania z innym hydrożelem aby osiągnąć wymagane parametry mechaniczne.There is a rich and diverse body of art concerning the extraction of ECM from mammalian tissues. However, the described methods are often characterized by their suitability only for laboratory-scale use. One example is patent application number US8906362B2, which involves obtaining meniscus fragments, decellularizing them using detergents, and immersing them in a cell suspension. Besides the fact that this method is only effective on a laboratory scale, there is also the problem of limited cell migration into the construct. Another patent related to the extraction of ECM from animal tissues is number US8361503B2. This application differs significantly from our invention, as the extraction of ECM is based solely on enzymatic digestion, without fractionation. In another patent (WO2019/122351 A1), ECM was implemented only as an additive to bioink and requires mixing with another hydrogel to achieve the required mechanical parameters.

Niniejszy wynalazek ma na celu zaproponowanie sposobu pozyskiwania wyróżniającego się doborem metodyki pozwalający w łatwy sposób zwiększyć skalę procesu oraz zapewnić jego maksymalną powtarzalność przy jednoczesnym zachowaniu pożądanych właściwości produktów końcowych oraz jego bezpieczeństwa względem pacjenta. Wyróżnić można zastosowanie takich metod jak: natywna ekstrakcja, sterylizacja i decelularyzacja nadkrytycznym CO2, kriomielenie czy filtracja membranowa. Unikatowość wynalazku polega na zastosowaniu kwaśnej ekstrakcji, lizy enzymatycznej a ostatecznie frakcjonowania składników natywnego ECM i ich późniejsze łączenie w celu uzyskania finalnego produktu spełniającego określone wymagania. Poszczególne frakcje mogą pełnić funkcje strukturalne, mechaniczne, stymulujące proliferację czy różnicowanie. Dzięki zastosowaniu niniejszego podejścia możliwe jest precyzyjne dostosowanie końcowego produktu do specyficznych potrzeb poprzez: manipulowanie jego składem i koncentracją poszczególnych elementów, jak również zastosowanie różnorodnych form aplikacji. Opisany wynalazek może być podany w różnych formach: jako membrana stanowiąca element nadający wytrzymałość mechaniczną, jako aplikacja płynna nastrzykiwana bezpośrednio w otoczenie miejsc uszkodzenia a także w formie predefiniowanego, żelowego rusztowania dla zatopionych w nim komórek. Szczególnym przykładem tego ostatniego jest biodruku 3D - przełomowa technologia inżynierii tkankowej, pozwalającej na precyzyjne zdeponowanie materiału komórkowego i odtworzenie naturalnych struktur tkankowych.The present invention aims to propose a method of obtaining ECM that is distinguished by its methodology, allowing for easy scale-up and maximum reproducibility, while maintaining the desired properties of the final products and patient safety. Methods include native extraction, sterilization and decellularization with supercritical CO2, cryogrinding, and membrane filtration. The uniqueness of the invention lies in the use of acidic extraction, enzymatic lysis, and ultimately, fractionation of native ECM components, followed by their subsequent combination to obtain a final product that meets specific requirements. Individual fractions can perform structural, mechanical, proliferation, or differentiation-stimulating functions. This approach allows for precise tailoring of the final product to specific needs by manipulating its composition and concentration of individual components, as well as by using a variety of application methods. The described invention can be administered in various forms: as a membrane providing mechanical strength, as a liquid application injected directly into the area of damage, or as a predefined gel scaffold for embedded cells. A specific example of the latter is 3D bioprinting – a breakthrough tissue engineering technology that allows for the precise deposition of cellular material and the reconstruction of natural tissue structures.

Łąkotki to elastyczne, chrzęstno-włókniste struktury, które leżą pomiędzy kością udową, a piszczelową. W stawie kolanowym znajdują się dwie takie struktury - łąkotki przyśrodkowa i boczna, nieznacznie różniące się kształtem i rozmiarem. Rolą łąkotek jest precyzyjne dopasowanie powierzchni kości piszczelowej do powierzchni poruszającej się po nich kości udowej. Tym samym amortyzują one obciążenia w obrębie kolana oraz uczestniczą w stabilizacji mechanicznej stawu (Fox et al., 2015).The menisci are flexible, fibrocartilaginous structures that lie between the femur and the tibia. The knee joint contains two such structures – the medial and lateral menisci, which differ slightly in shape and size. The menisci's role is to precisely align the tibia's surface with the femur's surface as it moves across it. They thus cushion loads within the knee and contribute to the mechanical stabilization of the joint (Fox et al., 2015).

Urazy łąkotki są jednymi z najczęstszych uszkodzeń w obrębie kolana, zwłaszcza u osób aktywnych fizycznie jak również osób starszych. Uszkodzenia łąkotki obniżają jakość życia wywołując ból, zwłaszcza podczas chodzenia, co wiąże się także z ograniczoną ruchomością stawu kolanowego i pociąga za sobą ryzyko rozwoju zapalenia kości i stawów. Niestety, z uwagi na bardzo niską zdolność łąkotki do samoregeneracji, pacjenci najczęściej wymagają specjalistycznego leczenia operacyjnego (Lee et al. 2022). Na podstawie rezonansu magnetycznego podejmowana jest decyzja o metodzie leczenia, które w dużej mierze zależy od rozległości uszkodzenia łąkotki. W przypadku niewielkich uszkodzeń, w miejscach potencjalnie zdolnych do regeneracji, operacyjnie zakłada się szwy, które pozwalają na zrośnięcie uszkodzenia i przywrócenie częściowej funkcjonalności łąkotki. W tym przypadku można także dodatkowo zastosować biologiczne wspomaganie gojenia się łąkotki, w postaci otoczenia urazu biokompatybilną membraną czy też podania ekstraktu zawierającego czynniki sprzyjające proliferacji czy różnicowaniu komórek w miejscu uszkodzenia (Ciemniewska-Gorzela et al. 2021). Większe uszkodzenia wymagają częściowej lub całkowitej meninsektomi, czyli usunięcia całej lub fragmentu łąkotki. Usuniętą łąkotkę można zastąpić sztucznymi implantami (Beaufils and Pujol 2018; Guo et al. 2015). Obecnie wykorzystuje się struktury bezkomórkowe, które mają częściowo przejąć funkcje łąkotki, a nie doprowadzić do jej regeneracji. W przypadku usunięcia łąkotki możliwe jest również przeszczepienie jej od osoby zmarłej, jednak przeszkodą jest ograniczona dostępność tkanki i ryzyko odrzucenia takiego przeszczepu przez organizm pacjenta. Możliwe jest także zastosowanie biodrukowanego, trójwymiaro wego implantu łąkotki, składające się z pobranych od pacjenta komórek zdolnych do różnicowania w komórki charakterystyczne dla łąkotki, zatopione w biotuszu stanowiącym element strukturalny (Semba, Mieloch, and Rybka 2020). Ze względu na zastosowanie komponentu biologicznego - żywych, zdolnych do podziałów i różnicowania komórek, istnieje uzasadniona nadzieja na odbudowanie uszkodzonej łąkotki i przywrócenia pełnej funkcjonalności stawu kolanowego.Meniscal injuries are among the most common knee injuries, especially in physically active individuals and the elderly. Meniscal tears reduce quality of life by causing pain, especially during walking, which is also associated with limited knee mobility and carries the risk of developing osteoarthritis. Unfortunately, due to the very low self-healing capacity of the meniscus, patients most often require specialized surgical treatment (Lee et al. 2022). MRI is used to guide treatment decisions, which largely depend on the extent of the meniscal injury. In the case of minor injuries, in areas potentially capable of regeneration, surgical sutures are placed, allowing the injury to heal and restoring partial meniscal functionality. In this case, biological support for meniscal healing can also be used, such as surrounding the injured area with a biocompatible membrane or administering an extract containing factors promoting cell proliferation or differentiation at the injury site (Ciemniewska-Gorzela et al. 2021). Larger damage requires partial or total meninsectomy, which involves the removal of all or part of the meniscus. The removed meniscus can be replaced with artificial implants (Beaufils and Pujol 2018; Guo et al. 2015). Currently, acellular structures are used, which are intended to partially replace the meniscus's functions rather than regenerate it. In the case of meniscus removal, it is also possible to transplant it from a deceased person, but the limited availability of tissue and the risk of rejection by the patient's body are obstacles. It is also possible to use a bioprinted, three-dimensional meniscal implant, consisting of cells collected from the patient capable of differentiating into meniscus-specific cells, embedded in bioink as a structural element (Semba, Mieloch, and Rybka 2020). Due to the use of a biological component—living cells capable of division and differentiation—there is reasonable hope for the reconstruction of the damaged meniscus and the restoration of full knee joint function.

Macierz pozakomórkowa (ang. Extracellularmartix - ECM) pozyskana z łąkotek świńskich stanowi doskonały surowiec do zastosowania w opisanych powyżej rozwiązaniach stosowanych w medycynie regeneracyjnej (Monibi and Cook 2017). ECM jest wieloskładnikową mieszaniną wytwarzaną przez komórki i wypełniającą przestrzenie między nimi. ECM łąkotki składa się w znaczącej części z wody. Pozostałe części składowe to kolagen, glikozaminoglikany (GAG), DNA, glikoproteiny adhezyjne, elastyna, czynniki wzrostu czy białka sygnałowe. ECM charakteryzuje się strukturą sieciową, składającą się z formy upostaciowionej, do której zalicza się włókna kolagenowe, sprężyste i siateczkowe oraz formy bezpostaciowej (istoty podstawowej) - bez strukturalnej części substancji międzykomórkowej. W łąkotce występują różne typy kolagenu, w zależności od regionu łąkotki (Guo et al. 2015). Kolagen nadaje tkankom wytrzymałość na rozciąganie a jego włókna zbudowane są z podjednostek tworzonych przez cząsteczki tropokolagenu, składających się z 3 łańcuchów [?] tworzących helisę. W strefie czerwonej głównym typem kolagenu jest typ I. Jego charakterystyczną cechą jest tworzenie stosunkowo grubych włókien. Inne rodzaje kolagenu są obecne w mniej niż 1%. Włókna ułożone są obwodowo, równolegle do granicy łąkotki. W głębszych warstwach łąkotki znajdują się również włókna ułożone promieniście, wplecione między obwodowe, zapewniając integralność strukturalną (Petersen and Tillmann 1998). W strefie białej występują dwa typy kolagenu - I i II. Przeważa typ II charakteryzujący się zwiększona wytrzymałością na zgniatanie. Silne usieciowanie włókien umożliwia przenoszenie obciążeń. Zawarte w ECM glikozaminoglikany odpowiedzialne są za zapobieganie trwałym zniekształceniom i nadawanie tkance sprężystości. W łąkotce występują głównie: siarczan chondroityny-6, siarczan dermatanu, siarczan chondroityny-4 i siarczan keratyny (Guo et al. 2015). Na macierz poza komórkową składają się również glikoproteiny, pełniące funkcje umożliwienia wchłaniania wody przez łąkotkę, co zwiększa jej stabilność mechaniczną pod wpływem nacisku. Głównymi glikoproteinami w łąkotce są agrekan, biglikan i dekoryna. Ponadto występują też glikoproteiny adhezyjne, pełniące rolę komunikacyjną pomiędzy komórkami i substancją międzykomórkową - fibronektyna, trombospondyna i kolagen VI (Guo et al. 2015). Ze względu na zróżnicowane funkcje poszczególnych składników ECM zasadnym jest ich frakcjonowanie i późniejsze kompilowanie w zależności od zamierzonego celu terapeutycznego.Extracellular matrix (ECM) obtained from porcine menisci is an excellent raw material for use in the regenerative medicine solutions described above (Monibi and Cook 2017). ECM is a multicomponent mixture produced by cells and filling the spaces between them. Meniscal ECM is composed largely of water. Other components include collagen, glycosaminoglycans (GAGs), DNA, adhesive glycoproteins, elastin, growth factors, and signaling proteins. ECM is characterized by a network structure, consisting of a structured form, which includes collagen, elastic, and reticular fibers, and an amorphous form (ground substance)—without the structured extracellular matrix. Different types of collagen are found in the meniscus, depending on the region of the meniscus (Guo et al. 2015). Collagen provides tissues with tensile strength, and its fibers are composed of subunits formed by tropocollagen molecules, consisting of three chains [?] forming a helix. In the red zone, the predominant type of collagen is type I. Its characteristic feature is the formation of relatively thick fibers. Other types of collagen are present in less than 1%. Fibers are arranged circumferentially, parallel to the meniscus border. In the deeper layers of the meniscus, there are also radial fibers interwoven between the circumferential ones, ensuring structural integrity (Petersen and Tillmann 1998). In the white zone, two types of collagen are present: type I and type II. Type II, characterized by increased crushing strength, predominates. Strong fiber cross-linking enables load transfer. Glycosaminoglycans contained in the ECM are responsible for preventing permanent deformation and providing tissue elasticity. The main components found in the meniscus are chondroitin-6 sulfate, dermatan sulfate, chondroitin-4 sulfate, and keratin sulfate (Guo et al. 2015). The extracellular matrix also contains glycoproteins that facilitate water absorption by the meniscus, increasing its mechanical stability under pressure. The main glycoproteins in the meniscus are aggrecan, biglycan, and decorin. Furthermore, adhesive glycoproteins, such as fibronectin, thrombospondin, and collagen VI, also occur, acting as communication between cells and the extracellular matrix (Guo et al. 2015). Due to the diverse functions of individual ECM components, their fractionation and subsequent compilation are essential depending on the intended therapeutic goal.

Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania decelularyzowanej macierzy pozakomórkowej dECM, wyizolowanej z tkanki ssaczej, który polega na tym, że z pobranych łąkotek usuwa się pozostałości innych tkanek, przemywa wodą oczyszczoną, dalej łąkotki rozdrabnia się w znany sposób z wykorzystaniem elektrowilka z sitem o dużych otworach, następnie ponownie mieli się z wykorzystaniem sita o mniejszych otworach, po czym prowadzi się ekstrakcję w roztworze kwasu mlekowego, przez 12 h, w temperaturze pokojowej, przy ciągłym mieszaniu, następnie oddziela się pozostałość po ekstrakcji od roztworu, a uzyskany roztwór zamraża się, a wytłoki kieruje się do drugiej ekstrakcji, którą prowadzi się w takich samych warunkach jak pierwszą, a po oddzieleniu uzyskany roztwór zamraża się, dalej pozostałość po ekstrakcji kieruje się do kolejnego etapu, gdzie do wytłoków dodaje się roztworu pepsyny o stężeniu w zakresie 1-6 mg/ml rozpuszczonej w kwasie chlorowodorowym, przy czym hydrolizę prowadzi się w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu przez 48 h, dalej uzyskaną mieszaninę filtruje się na worku separacyjnym wykonanym z siatki poliamidowej o wielkości oczek równych 200 μm, po czym uzyskany przesącz kieruje się do oczyszczania, a pozostałości po hydrolizie zamraża się, a w kolejnym etapie w przesączu stabilizuje się pH na poziomie 9, po czym roztwór wiruje w temperaturze pokojowej, a supernatant odrzuca się, a retentat w postaci osadu poddaje się liofilizacji poprzez zamrożenie w temperaturze -80°C, przez 72 h, następnie dosusza się przez 8 h, a uzyskany zliofilizowany retentat ECM poddaje się procesowi mielenia kriogenicznego poprzez wymrażanie i trzy cykle mielenia, a po zakończeniu mielenia proszek przesiewa się przez sita o wielkości oczek w zakresie 200-400 mikrometrów.The essence of the invention is a method for obtaining decellularized extracellular matrix dECM, isolated from mammalian tissue, which consists in removing the remains of other tissues from the collected menisci, washing them with purified water, then the menisci are ground in a known manner using an electric grinder with a large-hole sieve, then they are ground again using a sieve with smaller holes, then extraction is carried out in a lactic acid solution for 12 hours at room temperature with continuous stirring, then the residue after extraction is separated from the solution, the obtained solution is frozen, and the pomace is sent to the second extraction, which is carried out under the same conditions as the first one, and after separation, the obtained solution is frozen, then the residue after extraction is sent to the next stage, where a pepsin solution with a concentration in the range of 1-6 mg/ml dissolved in hydrochloric acid is added to the pomace, wherein the hydrolysis is carried out at room temperature with continuous stirring for 48 h, then the obtained mixture is filtered on a separation bag made of a polyamide mesh with a mesh size of 200 μm, then the obtained filtrate is sent for purification, and the residues after hydrolysis are frozen, and in the next step the pH in the filtrate is stabilized at 9, then the solution is centrifuged at room temperature, the supernatant is discarded, and the retentate in the form of a pellet is subjected to lyophilization by freezing at -80°C for 72 h, then it is dried for 8 h, and the obtained lyophilized ECM retentate is subjected to a cryogenic grinding process by freezing and three grinding cycles, and after grinding, the powder is sieved through sieves with a mesh size in the range of 200-400 micrometers.

Korzystnym jest, gdy sproszkowany ECM rozpuszcza się w wodzie oczyszczonej, w stosunku masowym 1:20, następnie inkubuje się na mieszadle magnetycznym przez 1 h, dalej mieszaninę poddaje się wirowaniu, supernatant odrzuca się, a osad ponownie zawiesza w początkowej objętości wody, przy czym operację powtarza się pięciokrotnie, a po ostatnim wirowaniu w formach umieszcza się osad o grubości warstwy w przedziale 1-20 mm, po czym warstwę ECM poddaje się procesowi całkowitego zamrożenia, a następnie prowadzi się proces liofilizacji.It is advantageous when the powdered ECM is dissolved in purified water in a mass ratio of 1:20, then incubated on a magnetic stirrer for 1 h, then the mixture is centrifuged, the supernatant is discarded and the sediment is resuspended in the initial volume of water, the operation being repeated five times, and after the last centrifugation, the sediment with a layer thickness in the range of 1-20 mm is placed in molds, after which the ECM layer is subjected to a complete freezing process, and then the lyophilization process is carried out.

Korzystnym jest także, gdy sproszkowany ECM, po pięciu cyklach płukania, poddaje się ekstrakcji w warunkach nadkrytycznych, gdzie sproszkowany ECM poddaje się procesowi ekstrakcji w temperaturze i pod ciśnieniem zapewniającym stabilność materiału biologicznego i zachowanie jego właściwości w następujący sposób: w początkowym etapie prowadzi się ekstrakcję w systemie ciągłym, z dodatkiem bezwodnego alkoholu etylowego, dalej prowadzi się ekstrakcję w trybie nieciągłym, a w kolejnym etapie prowadzi się ponownie ekstrakcję w trybie ciągłym przy przepływie gazowego CO2 20 l/min z obniżoną zawartością bezwodnego alkoholu etylowego, a następnie prowadzi się dekompresję.It is also advantageous when the powdered ECM, after five washing cycles, is subjected to extraction in supercritical conditions, where the powdered ECM is subjected to an extraction process at a temperature and pressure ensuring the stability of the biological material and preservation of its properties in the following manner: in the initial stage, extraction is carried out in a continuous system, with the addition of anhydrous ethyl alcohol, then extraction is carried out in a discontinuous mode, and in the next stage, extraction is carried out again in a continuous mode at a CO2 gas flow of 20 l/min with a reduced content of anhydrous ethyl alcohol, and then decompression is carried out.

Korzystnym jest również, gdy ekstrakcję prowadzi się z nadkrytycznym dwutlenkiem węgla, a następnie ECM rozpuszcza się w roztworze buforującym w zakresie stężeń 2-15% w zależności od pożądanej gęstości produktu.It is also advantageous when the extraction is carried out with supercritical carbon dioxide and then the ECM is dissolved in a buffering solution in a concentration range of 2-15% depending on the desired product density.

Zwłaszcza korzystnym jest, gdy uzyskane po ekstrakcji pierwszej i drugiej roztwory rozmraża się, dalej poddaje się filtracji na worku ociekowym, po czym uzyskany przesącz zatęża z wykorzystaniem membrany filtracyjnej, następnie przeprowadza się proces diafiltracji poprzez dodanie wody oczyszczonej do retentatu, przy czym diafiltrację powtarza się trzy razy, a następnie retentat poddaje się procesowi liofilizacji.It is particularly advantageous when the solutions obtained after the first and second extraction are thawed, further filtered on a drip bag, then the obtained filtrate is concentrated using a filtration membrane, then the diafiltration process is carried out by adding purified water to the retentate, the diafiltration is repeated three times, and then the retentate is subjected to the lyophilization process.

Ponadto korzystnym jest, gdy liofilizaty ECM i retentatu z ekstrakcji połączone są w zakresie stosunków 20:1-100:1.Furthermore, it is advantageous when the ECM lyophilisates and extraction retentate are combined in a ratio range of 20:1-100:1.

Decelularyzowana macierz pozakomórkowa do zastosowania do leczenia uszkodzeń łąkotki.Decellularized extracellular matrix for use in the treatment of meniscal tears.

Korzystnym jest, gdy decelularyzowana macierz pozakomórkowa ECM ma postać iniekcji, liofilizowanej membrany, biotuszu albo półpłynnej iniekcji, albo ma postać konstruktu wydrukowanego z tworzywa sztucznego korzystnie PETG opłaszczonego rozpuszczoną macierzą w formie żelowej.It is advantageous when the decellularized extracellular matrix (ECM) is in the form of an injection, a lyophilized membrane, bioink or a semi-liquid injection, or is in the form of a construct printed from a plastic material, preferably PETG, coated with a dissolved matrix in a gel form.

Dzięki zastosowaniu rozwiązania według wynalazku uzyskano następujące efekty techniczno-użytkowe:Thanks to the use of the solution according to the invention, the following technical and operational effects were achieved:

• możliwość dowolnego powiększenia skali aż do rozmiarów produkcji przemysłowej, • połączenie natywnej ekstrakcji z hydrolizą enzymatyczną, dzięki czemu możliwe jest frakcjonowanie ECM, • wykorzystanie filtracji 200 μm umożliwia wyodrębnienie nierozpuszczalnej frakcji ECM o małych rozmiarach, • brak konieczności użycia detergentów, • wykorzystanie ekstrakcji nadkrytycznej do decelularyzacji i sterylizacji na ostatnim etapie co znacząco zwiększa wydajność procesu oraz wywołuje efekt sterylizacji, • wykorzystanie kriomłynka umożliwia uzyskanie drobnych, homogennych cząstek bez narażenia składników ECM na denaturację termiczną, • dezaktywację enzymu proteolicznego inna niż denaturacja termiczna, • możliwość frakcjonowania białek ECM (posiadających aktywność biologiczną) poprzez dodanie etapu ekstrakcji przed procesem hydrolizy, • wykorzystanie tkaniny filtracyjnej o wielkości oczek 200 μm do procesu separacji, • wykorzystanie ekstrakcji nadkrytycznym CO2 jako metody sterylizacji i decelularyzacji w końcowym etapie preparacji, • trwała inaktywacja enzymu proteolitycznego poprzez wykorzystanie pepsyny w połączeniu z etapem podnoszenia pH powyżej 8, • zwiększenie biokompatybilności poprzez przemywanie rozdrobnionego liofilizatu.• possibility of any scale-up up to industrial production, • combination of native extraction with enzymatic hydrolysis, which enables fractionation of ECM, • use of 200 μm filtration enables the isolation of the insoluble ECM fraction of small sizes, • no need to use detergents, • use of supercritical extraction for decellularization and sterilization at the last stage, which significantly increases the efficiency of the process and produces a sterilization effect, • use of a cryomill enables obtaining small, homogeneous particles without exposing ECM components to thermal denaturation, • deactivation of the proteolytic enzyme other than thermal denaturation, • possibility of fractionation of ECM proteins (with biological activity) by adding an extraction step before the hydrolysis process, • use of a 200 μm filter fabric for the separation process, • use of supercritical CO2 extraction as a method of sterilization and decellularization in the final stage of preparation, • permanent inactivation of the proteolytic enzyme by using pepsin in combined with the step of raising the pH above 8, • increasing biocompatibility by washing the crushed lyophilisate.

Cechą szczególną wynalazku jest taki dobór etapów procesu, aby możliwym było zapewnienie biokompatybilności z równoczesnym zachowaniem aktywności biologicznej komponentów naturalnie występujących w macierzy zewnątrzkomórkowej. Oznacza to na przykład rezygnację z procesów wymagających znacznego podniesienia temperatury produktu na rzecz pracy w warunkach chłodniczych (kriomielenie) lub zwiększonego ciśnienia. Ponadto zastosowano innowacyjną metodę sterylizacji z jednoczesną decelularyzacją za pomocą ekstrakcji nadkrytycznym dwutlenkiem węgla. Jest ona nie tylko zgodną z założeniem zachowania bioaktywności ECM, ale także znacząco zwiększa wydajność procesu zapewniając bezpieczeństwo mikrobiologiczne produktu. Dzięki zastosowaniu CO2 w stanie nadkrytycznym możliwa była rezygnacja ze stosowania szkodliwych detergentów w trakcie obróbki ECM. Ponadto uzyskany za pomocą przedstawionego sposobu otrzymywania ECM stanowi produkt biokompatybilny czyli nietoksyczny, nieszkodliwy i nie wywołujący odpowiedzi immunologicznej czy inhibicji względem komórek, tkanek i narządów organizmu do którego został podany/wszczepiony. Innowacyjność wynalazku zwiększono poprzez dodano etapy ekstrakcji i filtracji które umożliwiają frakcjonowania ECM i manipulowanie ostatecznym składem produktu w zależności od potrzeb.A distinctive feature of the invention is the selection of process steps that ensure biocompatibility while simultaneously preserving the biological activity of components naturally occurring in the extracellular matrix. This means, for example, eliminating processes requiring a significant increase in product temperature in favor of refrigeration (cryomilling) or increased pressure. Furthermore, an innovative sterilization method with simultaneous decellularization using supercritical carbon dioxide extraction was employed. This method not only maintains the bioactivity of the ECM but also significantly increases process efficiency, ensuring the microbiological safety of the product. The use of supercritical CO2 eliminates the need for harmful detergents during ECM processing. Furthermore, the ECM obtained using the presented method is biocompatible, meaning it is non-toxic, harmless, and does not induce an immune response or inhibition of the cells, tissues, and organs of the organism into which it was administered/implanted. The innovation of the invention was increased by the addition of extraction and filtration steps that enable fractionation of the ECM and manipulation of the final product composition depending on the needs.

Wynalazek może być stosowany w formie płynnej/półpłynnej iniekcji, liofilizowanej membrany czy biotuszu (lub hydrożelowego implantu uzyskanego w dowolny inny sposób np. przez odlew w formie), albo innych form aplikacji. Skład ECM może być dowolnie modyfikowany poprzez dodawanie poszczególnych frakcji w różnych proporcjach. Do dowolnie skomponowanego ECM, na każdym etapie przygotowania (jeśli nie obniży to aktywności podawanego komponentu) mogą zostać dodane dowolne komórki, leki, cytokiny, czynniki wzrostu i inne substancje bioaktywne. Forma iniekcyjna, zawierająca wybrane frakcje ECM, opcjonalnie z dodatkiem komórek pacjenta, może być podana bezpośrednio do przestrzeni stawu kolanowego w celu dostarczenia czynników bioaktywnych, pobudzających proliferację i różnicowanie komórek, a co za tym idzie wspomóc proces regeneracji uszkodzonej łąkotki. Jest to mało inwazyjna forma podania. Hydrożelowy wydruk 3D (lub dowolnie trzymany odlew), zawierający komórki pobrane od pacjenta może zostać dowolnie ukształtowany i stanowić implant wszczepiany pacjentowi, u którego zastosowano menisektomię. W tej formie ECM stanowi zarówno rusztowanie jak i stworzy optymalne środowisko wzrostu dla komórek, które dzieląc się i wytwarzając własną macierz z czasem odbudują usuniętą łąkotkę ECM w formie liofilizowanej membrany, dzięki dużej zawartości kolagenów będzie optymalnym rozwiązaniem wspomagającym leczenie uszkodzonej łąkotki, która została operacyjnie zszyta. Otoczenie miejsca szycia membraną z odpowiednio skomponowanych frakcji ECM po pierwsze pozwoli na zapewnienie mechanicznej ochrony miejsca szycia a po drugie, ze względu na porowatą strukturę membrany ułatwi adhezję komórek i ich zatrzymanie w bliskim otoczeniu miejsca uszkodzenia.The invention can be used as a liquid/semi-liquid injection, as a lyophilized membrane or bioink (or as a hydrogel implant obtained in any other way, e.g., by mold casting), or in other forms of application. The composition of the ECM can be freely modified by adding individual fractions in varying proportions. Any cells, drugs, cytokines, growth factors, and other bioactive substances can be added to the freely composed ECM at any stage of preparation (as long as this does not reduce the activity of the administered component). The injectable form, containing selected ECM fractions, optionally with the addition of patient cells, can be administered directly into the knee joint to deliver bioactive factors that stimulate cell proliferation and differentiation, thus supporting the regeneration of the damaged meniscus. This is a minimally invasive method of administration. A 3D hydrogel print (or a cast of any size) containing cells collected from the patient can be shaped in any desired way and serve as an implant for a patient undergoing a menisectomy. In this form, the ECM serves as both a scaffold and creates an optimal growth environment for cells, which, by dividing and producing their own matrix over time, will rebuild the removed meniscus. The ECM in the form of a lyophilized membrane, thanks to its high collagen content, will be an optimal solution for supporting the treatment of a damaged meniscus that has been surgically repaired. Surrounding the suture site with a membrane composed of appropriately composed ECM fractions will firstly provide mechanical protection for the suture site and secondly, due to the membrane's porous structure, facilitate cell adhesion and retention in close proximity to the damaged site.

Surowcem do wytwarzania przedmiotu wynalazku może być dowolna tkanka pochodzenia zwierzęcego, korzystnie łąkotka wieprzowa. Na etapie mycia łąkotek wykorzystuje się wodę oczyszczoną oraz manualne oddzielnie pozostałych tkanek (ścięgna, tkanka tłuszczowa). Rozdrabnianie surowca przeprowadza się w elektrowilku o parametrach dobranych do wielkości szarży produkcyjnej. Na etapie tym należy kontrolować temperaturę rozdrobnionej tkanki opuszczającej gardziel. Sposób otrzymywania dECM według wynalazku charakteryzuje się tym, że etapy ekstrakcji przeprowadza się w kwaśnym pH, w obecności kwasu organicznego, przy czym proporcje masowe surowca i rozpuszczalnika dobiera się w zależności od stopnia rozdrobnienia surowca. Etap filtracji przeprowadza się z wykorzystaniem sita separacyjnego, korzystnie wykonanego ze stali kwasoodpornej, korzystnie o wielkości otworów 2 mm, jednak nie wyklucza się sit wykonanych z innych materiałów, o innej wielkość otworów. Możliwe jest również odseparowanie pozostałości poekstrakcyjnych od ekstraktu poprzez wirowanie. Uzyskany ekstrakt przekazuje się do mrożenia, a pozostałości poekstrakcyjne kierowane są do dalszych procesów technologicznych. Etap hydrolizy prowadzi się w kwaśnym pH. Korzystnie wykorzystuje się enzymy proteolityczny lub ich mieszaniny. Korzystnie stosunek roztworu enzymu do pozostałości po ekstrakcji wynosi 1:10.The raw material for the invention can be any tissue of animal origin, preferably porcine meniscus. Purified water is used for washing the meniscus, and other tissues (tendons, adipose tissue) are manually separated. Grinding of the raw material is performed in an electric grinder with parameters adjusted to the production batch size. At this stage, the temperature of the ground tissue leaving the throat must be controlled. The method for obtaining dECM according to the invention is characterized by the extraction stages being carried out at an acidic pH, in the presence of an organic acid, with the mass proportions of the raw material and solvent selected depending on the degree of grinding of the raw material. The filtration stage is performed using a separation sieve, preferably made of acid-resistant steel, preferably with a 2 mm mesh size. However, sieves made of other materials with different mesh sizes are also possible. Separation of post-extraction residues from the extract by centrifugation is also possible. The extract obtained is then frozen, and the extraction residue is sent for further processing. The hydrolysis step is carried out at an acidic pH. Proteolytic enzymes or mixtures thereof are preferably used. The preferred ratio of enzyme solution to extraction residue is 1:10.

Sposób otrzymywania dECM według wynalazku polega na tym, że etap filtracji odbywa się z wykorzystaniem materiału filtracyjnego, korzystnie o wielkości porów 200 μm. Uzyskany przesącz kierowany jest do etapu korygacji pH, a pozostałości po hydrolizie mogą być kierowane do ponownej hydrolizy enzymatycznej w celu zwiększenia wydajności. W etapie korygacji pH wykorzystuje się roztwór zasadowy. Etap wirowania prowadzi się na wirówce kubkowej, przekazując osad (stanowiący ECM) do etapu liofilizacji. Etapy liofilizacji wymagają zamrożenia osadu uzyskanego w poprzednim etapie, korzystnie do temperatury poniżej -25°C, a proces liofilizacji na etapie suszenie prowadzi się przy ciśnieniu 1 mBar bądź mniejszym przez 72 h, następnie obniża się ciśnienie do 0,2 mBar i prowadzi dosuszania przez 8 h. Etap rozdrabniania kriogenicznego uzyskanego liofilizatu, prowadzi się w młynku kriogenicznym, dalej uzyskany proszek poddaje się separacji na sicie o wielkości otworów dopasowanej do dalszych etapów procesu. Etap płukania rozdrobnionego liofilizatu przeprowadza się z zastosowaniem rozpuszczalnika polarnego, korzystnie dECM oddziela się poprzez wirowanie, natomiast etap ekstrakcji nadkrytycznej prowadzi się w systemie mieszanym tj. pierwszy etap ekstrakcji odbywa się w systemie zamkniętym, w obecności rozpuszczalnika polarnego, a następnie prowadzi ekstrakcję w systemie ciągłym. Po zakończeniu procesu ekstrakcji w warunkach nadkrytycznych prowadzi się dekompresję przy przepływie gazowego CO2 20 l/min.The method for obtaining dECM according to the invention involves a filtration step using a filter material, preferably with a pore size of 200 μm. The resulting filtrate is sent to a pH adjustment step, and the hydrolysis residue can be sent to enzymatic re-hydrolysis to increase yield. The pH adjustment step uses an alkaline solution. The centrifugation step is performed in a bucket centrifuge, transferring the precipitate (constituting the ECM) to a lyophilization step. The lyophilization stages require freezing the precipitate obtained in the previous stage, preferably to a temperature below -25°C. The lyophilization process is carried out at a pressure of 1 mBar or less for 72 hours, then reduced to 0.2 mBar and further dried for 8 hours. The cryogenic grinding of the obtained lyophilizate is carried out in a cryogenic mill. The resulting powder is then subjected to separation on a sieve with a mesh size adapted to the subsequent process stages. The washing stage of the ground lyophilizate is carried out using a polar solvent, preferably dECM separated by centrifugation, while the supercritical extraction stage is carried out in a mixed system, i.e., the first extraction stage takes place in a closed system in the presence of a polar solvent, followed by continuous extraction. After the extraction process under supercritical conditions, decompression is carried out with a CO2 gas flow of 20 l/min.

PL 248101 Β1PL 248101 Β1

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady:The invention is illustrated by the following examples:

Wyniki:Results:

Przykład 1Example 1

Otrzymywanie nierozpuszczalnych w kwasach frakcji ECM w formie sproszkowanej i niesterylnej.Obtaining acid-insoluble ECM fractions in powdered and non-sterile form.

Jako surowiec wyjściowy wykorzystano łąkotki świńskie. Z pobranych łąkotek usunięto pozostałości innych tkanek i przemyto wodą oczyszczoną. Odważono 1 kg oczyszczonych łąkotek i rozdrobniono mieląc w elektrowilku z wykorzystaniem sitka o dużych otworach. Tak zmielony surowiec ponownie zmielono wykorzystując sito o mniejszych otworach. Surowiec umieszczono w naczyniu i prowadzono ekstrakcję w roztworze kwasu mlekowego. Znawca dziedziny doceni możliwość prowadzenia ekstrakcji w obecności różnych kwasów. Ekstrakcję prowadzono przez noc w temperaturze pokojowej, przy ciągłym mieszaniu. Następnie oddzielono pozostałość po ekstrakcji od roztworu wykorzystując sito wykonane ze stali kwasoodpornej. Uzyskany roztwór zamrożono, a wytłoki skierowano do drugiej ekstrakcji, dodając do nich roztwór kwasu mlekowego do końcowej objętości 10 litrów. Drugą ekstrakcję prowadzono w takich samych warunkach jak pierwszą. Po oddzieleniu uzyskany roztwór zamrożono, a pozostałość po ekstrakcji skierowano do kolejnego etapu. Do wytłoków dodano roztworu pepsyny o stężeniu w zakresie 1-6 mg/ml rozpuszczonej w kwasie chlorowodorowym. Hydrolizę prowadzono w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu przez 48 h. Po zakończeniu hydrolizy mieszaninę filtrowano na worku separacyjnym wykonanym z siatki poliamidowej o wielkości oczek równych 200 μίτι. Uzyskany przesącz skierowano do dalszych etapów oczyszczania, a pozostałości po hydrolizie zamrożono. W kolejnym etapie w przesączu ustabilizowano pH na poziomie 9. Proces korekcji pH wykonywano przy ciągłym mieszaniu. Po ustaleniu pH roztwór wirowano w wirówce kubełkowej w temperaturze pokojowej. Supernatant odrzucono, a osad umieszczono na tacach do liofilizacji. Tak przygotowane tace umieszczono w zamrażarce w temperaturze -80°C. Następnie próbki umieszczono w liofilizatorze. Liofilizację prowadzono przez 72 h. Po tym czasie prowadzono proces dosuszania przez 8 h. Następnie zliofilizowany ECM wyjęto z liofilizatora i przeprowadzono proces mielenia kriogenicznego składający się z fazy wymrażania i 3 cykli mielenia. Po zakończeniu mielenia proszek poddano procesowi przesiewania na sicie o średnicy otworów dobranej w zależności od potrzeb. Tak uzyskany proszek stanowił ECM. Zawartość kolagenu potwierdzono metodami ilościowymi (pomiar hydroksyproliny tab. 1) i jakościowymi Western Biot Fig. 1 przedstawia supernatant wyekstrahowany za pomocą 0,05 M kwasu mlekowego z ECM łąkotki uzyskanej na drodze hydrolizy pepsyną. Ścieżki 1-3 kolejne powtórzenia tej samej preparacji, ścieżka 4 wzorzec kolagenu, ścieżka 5 marker wielkości.Porcine menisci were used as the starting material. Remnants of other tissues were removed from the collected menisci and washed with purified water. One kilogram of cleaned menisci was weighed and ground using a large-hole strainer in an electric grinder. The ground material was then ground again using a smaller-hole strainer. The material was placed in a vessel and extracted in a lactic acid solution. Those skilled in the art will appreciate the possibility of extracting in the presence of various acids. The extraction was carried out overnight at room temperature with constant stirring. The extraction residue was then separated from the solution using a stainless steel sieve. The resulting solution was frozen, and the pomace was sent for a second extraction, adding lactic acid solution to a final volume of 10 liters. The second extraction was performed under the same conditions as the first. After separation, the resulting solution was frozen, and the extraction residue was sent for the next step. Pepsin solution at a concentration of 1-6 mg/ml dissolved in hydrochloric acid was added to the pomace. Hydrolysis was carried out at room temperature with constant stirring for 48 h. After hydrolysis, the mixture was filtered through a 200 μίτι polyamide mesh separation bag. The resulting filtrate was forwarded to further purification steps, and the hydrolysis residues were frozen. In the next step, the filtrate pH was stabilized at 9. The pH was adjusted with constant stirring. After pH adjustment, the solution was centrifuged in a bucket centrifuge at room temperature. The supernatant was discarded, and the pellet was placed on lyophilization trays. The prepared trays were placed in a freezer at -80°C. The samples were then placed in a lyophilizer. Freeze-drying was carried out for 72 hours, followed by an 8-hour drying period. The lyophilized ECM was then removed from the lyophilizer and cryogenic milling was performed, consisting of a freezing phase and three milling cycles. After milling, the powder was sieved through a sieve with a mesh diameter selected according to the needs. The resulting powder constituted the ECM. Collagen content was confirmed using quantitative methods (hydroxyproline measurement, Table 1) and qualitative Western Blot methods. Fig. 1 shows the supernatant extracted with 0.05 M lactic acid from meniscus ECM obtained by pepsin hydrolysis. Lanes 1-3 represent subsequent replicates of the same preparation; lane 4 represents the collagen standard; lane 5 represents the size marker.

Tabela 1Table 1

Etap Zawartość suchej Zawartość kolagenu masy mg/gStage Dry Content Collagen Content by Weight mg/g

Mielona tąkotkaGround tentacle

ECM po ekstrakcji 1ECM after extraction 1

ECM po ekstrakcji 2ECM after extraction 2

ECM po hydrolizie 1ECM after hydrolysis 1

ECM HI po wytrąceniu w pH 9ECM HI after precipitation at pH 9

41,07% . i . ; 76741.07% . and . ; 767

11,91%88811.91%888

12,58%Λ 64312.58%Λ 643

2,02%5292.02%529

13,55%79013.55%790

Przykład 2Example 2

Otrzymywanie nierozpuszczalnych w kwasach frakcji ECM w formie sterylnego proszku.Obtaining acid-insoluble ECM fractions in the form of a sterile powder.

ECM uzyskany zgodnie z przykładem pierwszym poddano ekstrakcji w warunkach nadkrytycznych. Sproszkowany ECM umieszczono w gilzie ekstrakcyjnej. Wlot i wylot zabezpieczono watą. Proces ekstrakcji prowadzono w temperaturze i pod ciśnieniem zapewniającym stabilność materiału biologicznego i zachowanie jego właściwości. W początkowym etapie prowadzono ekstrakcję w systemie ciągłym, z dodatkiem bezwodnego alkoholu etylowego. Po tym czasie zamknięto zawór wylotowy i prowadzono ekstrakcję w trybie nieciągłym. W trzecim etapie prowadzono ponownie ekstrakcję w trybie ciągłym przez przy przepływie gazowego CO2 z obniżoną zawartością bezwodnego alkoholu etylowego. Po zakończeniu procesu zamknięto zawór doprowadzający, wyłączono pompę dozującą EtOH i prowadzono dekompresję. Naczynie ekstrakcyjne wypięto z układu, a następnie zdezynfekowana zewnętrzne powierzchnie 70% EtOH i umieszczono w komorze laminarnej. Proces ekstrakcji nadkrytycznej spowodował spadek ilości DNA oraz wyeliminował mikroorganizmy. Fig. 1 przedstawia posiew mikrobiologiczny z ECM przed (szalka po lewej) i po (szalka po prawej) ekstrakcji w warunkach nadkrytycznych, Fig. 2 przedstawia liczbę JTK/g (jednostek tworzących kolonię) przed i po przeprowadzeniu ekstrakcji nadkrytycznej.The ECM obtained in Example 1 was extracted under supercritical conditions. The powdered ECM was placed in an extraction thimble. The inlet and outlet were secured with cotton wool. The extraction process was carried out at a temperature and pressure ensuring the stability of the biological material and the preservation of its properties. In the initial stage, continuous extraction was conducted with the addition of anhydrous ethyl alcohol. After this time, the outlet valve was closed, and extraction was conducted discontinuously. In the third stage, continuous extraction was again conducted using a flow of CO2 gas with a reduced content of anhydrous ethyl alcohol. After the process was completed, the supply valve was closed, the EtOH dosing pump was turned off, and depressurization was performed. The extraction vessel was removed from the system, its external surfaces were disinfected with 70% EtOH, and then placed in a laminar flow cabinet. The supercritical extraction process reduced the amount of DNA and eliminated microorganisms. Fig. 1 shows the microbiological inoculation of ECM before (left dish) and after (right dish) extraction under supercritical conditions, Fig. 2 shows the number of CFU/g (colony forming units) before and after supercritical extraction.

Przykład 3Example 3

Otrzymywanie nie rozpuszczalnych w kwasach frakcji ECM w formie sterylnego, zdecelularyzowanego proszku.Obtaining acid-insoluble ECM fractions in the form of a sterile, decellularized powder.

ECM przygotowano jak w przykładzie pierwszym. Następnie proszek poddano procesowi płukania wodą destylowaną, który w połączeniu z ekstrakcją CO2 w stanie nadkrytycznym ma za zadanie zwiększenie wydajności decelularyzacji.ECM was prepared as in Example 1. The powder was then rinsed with distilled water, which, combined with supercritical CO2 extraction, was designed to increase decellularization efficiency.

Do sproszkowanego ECM dodano wody destylowanej i mieszano na mieszadle mechanicznym przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę wirowano w wirówce kubełkowej. Proces powtórzono łącznie pięć razy. Po ostatnim wirowaniu osad zebrano i poddano procesowi liofilizacji i procesowi mielenia kriogenicznego. Uzyskany proszek przesiano przez sito i poddano ekstrakcji nadkrytycznej przy parametrach jak w przykładzie 2.Distilled water was added to the powdered ECM and mixed mechanically for 10 minutes at room temperature. The mixture was then centrifuged in a bucket centrifuge. This process was repeated a total of five times. After the final centrifugation, the precipitate was collected and subjected to freeze-drying and cryogenic grinding. The resulting powder was sieved and subjected to supercritical extraction using the same parameters as in Example 2.

Przykład 4Example 4

Otrzymywanie rozpuszczalnych w kwasach ekstraktów ECM w formie proszku.Obtaining acid-soluble ECM extracts in powder form.

Postępowano jak w przykładzie pierwszym. Uzyskane po ekstrakcji I i II roztwory rozmrożono i poddano filtracji na worku ociekowym. Uzyskany przesącz zatężono z wykorzystaniem membrany filtracyjnej. Każdy litr przesączu zatężono do końcowej objętości 50 ml. Następnie przeprowadzono proces diafiltracji dodając wody oczyszczonej do retentatu i ponownie zatężając do objętości 50 ml. Diafiltrację powtórzono łącznie trzy razy. Retentat zliofilizowano w takich samych warunkach jak ECM w przykładzie pierwszym. Tak otrzymane ekstrakty mogą posłużyć jako składnik pożywki do hodowli komórek z nierozpuszczalnymi w kwasach frakcjami ECM. Fig. 3 przedstawia komórki adMSC hodowane bez dodatku, fig. 4 przedstawia Obraz rozdziału SDS PAGE uzyskanego ekstraktu. ekstraktu (A) i z dodatkiem ekstraktu 1 mg/ml (B) do medium.The procedure was as in Example 1. The solutions obtained after extraction I and II were thawed and filtered through a drain bag. The obtained filtrate was concentrated using a filtration membrane. Each liter of the filtrate was concentrated to a final volume of 50 ml. Diafiltration was then performed by adding purified water to the retentate and reconcentrating it to a volume of 50 ml. Diafiltration was repeated a total of three times. The retentate was lyophilized under the same conditions as the ECM in Example 1. The extracts thus obtained can be used as a component of a cell culture medium with acid-insoluble ECM fractions. Fig. 3 shows adMSC cells cultured without the addition of the extract (A) and with the addition of 1 mg/ml extract (B) to the medium.

Przykład 5Example 5

ZastosowanieApplication

Decelularyzowana macierz pozakomórkowa (ECM), wyizolowana z tkanki ssaczej może być stosowana w formie płynnej/półpłynnej iniekcji, liofilizowanej membrany czy biotuszu (lub hydrożelowego implantu uzyskanego w dowolny inny sposób np. przez odlew w formie).Decellularized extracellular matrix (ECM) isolated from mammalian tissue can be used in the form of a liquid/semi-liquid injection, a lyophilized membrane or bioink (or a hydrogel implant obtained in any other way, e.g. by casting in a mold).

W celu przygotowania membrany uzyskane zgodnie z poprzednimi przykładami frakcje ECM rozpuszczono w buforze (np. PBS), w stosunku masowym 1:20. Homogenną mieszaninę wylano do formy wykonanej z PETG tak, aby grubość warstwy zawierała się w przedziale 1-5 mm. Tak przygotowaną formę umieszczono w zamrażarce niskotemperaturowej aż do całkowitego zamrożenia warstwy ECM. Następnie prowadzono proces liofilizacji. Po całkowitym dosuszeniu membranę wyjęto z formy i poddano ekstrakcji w warunkach nadkrytycznych, jak w powyższych przykładach. Tak przygotowana membrana może zostać wszczepiona do organizmu biorcy bezpośrednio lub po uprzednim pokryciu komórkami w warunkach in vitro.To prepare the membrane, ECM fractions obtained according to the previous examples were dissolved in a buffer (e.g., PBS) in a mass ratio of 1:20. The homogeneous mixture was poured into a PETG mold to achieve a layer thickness of 1-5 mm. The prepared mold was placed in a low-temperature freezer until the ECM layer was completely frozen. Subsequently, the lyophilization process was carried out. After complete drying, the membrane was removed from the mold and subjected to supercritical extraction, as in the above examples. The prepared membrane can be implanted directly into the recipient's body or after prior cell coating in vitro.

W celu podania ECM w formie iniekcji zmielony liofilizat, otrzymany zgodnie z opisem wynalazku, należy zastosować ekstrakcję nadkrytycznym dwutlenkiem węgla. Następnie ECM rozpuścić w roztworze buforującym w zakresie stężeń 2-15% w zależności od pożądanej gęstości produktu. Iniekcję przeprowadzić śródoperacyjnie. Dopuszcza się podanie ECM zawierającego żywe komórki, dodane do ECM w trakcie przygotowywania roztworu. W przypadku stosowania iniekcji zawierających komórki zaleca się rozpuszczenie ECM w dedykowanym do danego typu komórek medium hodowlanym. Dopuszcza się również podanie ECM w formie konstruktu wydrukowanego z tworzywa sztucznego (np. PETG) spłaszczonego rozpuszczoną macierzą w formie żelowej przygotowanej zgodnie z opisem powyżej.To administer ECM by injection, the ground lyophilisate obtained according to the invention should be extracted with supercritical carbon dioxide. The ECM should then be dissolved in a buffering solution at a concentration of 2-15%, depending on the desired product density. The injection should be performed intraoperatively. It is acceptable to administer ECM containing living cells, added to the ECM during solution preparation. When using cell-containing injections, it is recommended to dissolve the ECM in a culture medium dedicated to the given cell type. It is also acceptable to administer ECM as a printed plastic construct (e.g., PETG) flattened with the dissolved matrix in a gel form prepared as described above.

Skład ECM może być dowolnie modyfikowany poprzez dodawanie poszczególnych frakcji w różnych proporcjach. Do dowolnie skomponowanego ECM, na każdym etapie przygotowania (jeśli nie obniży to aktywności podawanego komponentu) mogą zostać dodane dowolne komórki, leki, cytokiny, czynniki wzrostu i inne substancje bioaktywneThe composition of ECM can be freely modified by adding individual fractions in varying proportions. Any cells, drugs, cytokines, growth factors, and other bioactive substances can be added to any ECM composition at any stage of preparation (as long as it does not reduce the activity of the administered component).

LiteraturaLiterature

Beaufils, P., and N. Pujol. 2018. Meniscal Repair: Technique. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research 104(l):S137-45. doi: 10.1016/j.otsr.2017.04.016.Beaufils, P., and N. Pujol. 2018. Meniscal Repair: Technique. Orthopedics & Traumatology: Surgery & Research 104(l):S137-45. doi: 10.1016/j.otsr.2017.04.016.

Ciemniewska-Gorzela, Kinga, Paweł Bąkowski, Jakub Naczk, Roland Jakob, and Tomasz Piontek. 2021. Complex Meniscus Tears Treated with Collagen Matrix Wrapping and Bone Marrow Blood Injection: Clinical Effectiveness and Survivorship after a Minimum of 5 Years' Follow-Up. CARTILAGE 13(1_suppl):228S-238S. doi: 10.1177/1947603520924762.ciemniewska-Gorzela, Kinga, Paweł Bąkowski, Jakub Naczk, Roland Jakob, and Tomasz Piontek. 2021. Complex Meniscus Tears Treated with Collagen Matrix Wrapping and Bone Marrow Blood Injection: Clinical Effectiveness and Survivorship after a Minimum of 5 Years' Follow-Up. CARTILAGE 13(1_suppl):228S-238S. doi: 10.1177/1947603520924762.

Fox, Alice J. S., Florian Wanivenhaus, Alissa J. Burge, Russell F. Warren, and Scott A. Rodeo. 2015. The Human Meniscus: A Review of Anatomy, Function, Injury, and Advances in Treatment. Clinical Anatomy 28(2):269-87. doi:10.1002/ca.22456.Fox, Alice J. S., Florian Wanivenhaus, Alissa J. Burge, Russell F. Warren, and Scott A. Rodeo. 2015. The Human Meniscus: A Review of Anatomy, Function, Injury, and Advances in Treatment. Clinical Anatomy 28(2):269-87. doi:10.1002/ca.22456.

Guo, Weimin, Shuyun Liu, Yun Zhu, Changlong Yu, Shibi Lu, Mei Yuan, Yue Gao, Jingxiang Huang, Zhiguo Yuan, Jiang Peng, Aiyuan Wang, Yu Wang, Jifeng Chen, Li Zhang, Xiang Sui, Wenjing Xu, and Quanyi Guo. 2015. Advances and Prospects in Tissue-Engineered Meniscal Scaffolds for Meniscus Regeneration. Stem Cells International2015:1-13. doi: 10.1155/2015/517520.Guo, Weimin, Shuyun Liu, Yun Zhu, Changlong Yu, Shibi Lu, Mei Yuan, Yue Gao, Jingxiang Huang, Zhiguo Yuan, Jiang Peng, Aiyuan Wang, Yu Wang, Jifeng Chen, Li Zhang, Xiang Sui, Wenjing Xu, and Quanyi Guo. 2015. Advances and Prospects in Tissue-Engineered Meniscal Scaffolds for Meniscus Regeneration. Stem Cells International2015:1-13. doi: 10.1155/2015/517520.

Lee, Dustin R., Anna K. Reinholz, Sara E. Till, Yining Lu, Christopher L. Camp, Thomas M. DeBerardino, Michael J. Stuart, and Aaron J. Krych. 2022. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine: Current Controversies for Treatment of Meniscus Root Tears. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine, doi: 10.1007/s12178-022-09759-2.Lee, Dustin R., Anna K. Reinholz, Sara E. Till, Yining Lu, Christopher L. Camp, Thomas M. DeBerardino, Michael J. Stuart, and Aaron J. Krych. 2022. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine: Current Controversies for Treatment of Meniscus Root Tears. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine, doi: 10.1007/s12178-022-09759-2.

Monibi, Farrah A., and James L. Cook. 2017. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews 23(4):386-98. doi: 10.1089/ten.teb.2016.0431.Monibi, Farrah A., and James L. Cook. 2017. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews 23(4):386-98. doi: 10.1089/ten.teb.2016.0431.

Petersen, Wolf, and B. Tillmann. 1998. Collagenous Fibril Texture of the Human Knee Joint Menisci. Anatomy and Embryology 197(4):317-24. doi: 10.1007/s004290050141.Petersen, Wolf, and B. Tillmann. 1998. Collagenous Fibril Texture of the Human Knee Joint Menisci. Anatomy and Embryology 197(4):317-24. doi: 10.1007/s004290050141.

Semba, Julia Anna, Adam Aron Mieloch, and Jakub Dalibor Rybka. 2020. Introduction to the State-of-the-Art 3D Bioprinting Methods, Design, and Applications in Orthopedics. Bioprinting 18:e00070. doi: 10.1016/j.bprint.2019.e00070.Semba, Julia Anna, Adam Aron Mieloch, and Jakub Dalibor Rybka. 2020. Introduction to the State-of-the-Art 3D Bioprinting Methods, Design, and Applications in Orthopedics. Bioprinting 18:e00070. doi: 10.1016/j.bprint.2019.e00070.

Claims

Patent claims

1. A method for obtaining decellularized extracellular matrix dECM, isolated from mammalian tissue, characterized in that the remains of other tissues are removed from the collected menisci, washed with purified water, then the menisci are ground in a known manner using an electric grinder with a large-hole sieve, then ground again using a smaller-hole sieve, then extraction is carried out in a lactic acid solution for 12 hours at room temperature with continuous stirring, then the residue after extraction is separated from the solution, the obtained solution is frozen, and the pomace is sent to the second extraction, which is carried out under the same conditions as the first one, and after separation, the obtained solution is frozen, then the residue after extraction is sent to the next stage, where a pepsin solution with a concentration in the range of 1-6 mg/ml dissolved in hydrochloric acid is added to the pomace, wherein the hydrolysis is carried out at room temperature with continuous stirring for 48 hours, further the obtained mixture is filtered on a separation bag made of a polyamide mesh with a mesh size of 200 μm, then the obtained filtrate is sent for purification, and the residues after hydrolysis are frozen, and in the next step the pH in the filtrate is stabilized at 9, then the solution is centrifuged at room temperature, the supernatant is discarded, and the retentate in the form of a pellet is subjected to lyophilization by freezing at -80°C for 72 h, then it is dried for 8 h, and the obtained lyophilized ECM retentate is subjected to a cryogenic grinding process by freezing and three grinding cycles, and after grinding, the powder is sieved through sieves with a mesh size in the range of 200-400 micrometers.

2. The method according to claim 1, characterized in that the powdered ECM is dissolved in purified water in a mass ratio of 1:20, then incubated on a magnetic stirrer for 1 h, then the mixture is centrifuged, the supernatant is discarded and the sediment is re-suspended in the initial volume of water, the operation being repeated five times, and after the last centrifugation the sediment is placed in molds with a layer thickness in the range of 1-20 mm, after which the ECM layer is subjected to a complete freezing process, and then the lyophilization process is carried out.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the powdered ECM, after five washing cycles, is subjected to extraction in supercritical conditions, where the powdered ECM is subjected to an extraction process at a temperature and pressure ensuring the stability of the biological material and preservation of its properties in the following manner: in the initial stage, extraction is carried out in a continuous system, with the addition of anhydrous ethyl alcohol, further extraction is carried out in a discontinuous mode, and in the next stage, extraction is carried out again in a continuous mode at a CO2 gas flow of 20 l/min with a reduced content of anhydrous ethyl alcohol, and then decompression is carried out.

4. The method according to claims 1-3, characterized in that the extraction is carried out with supercritical carbon dioxide and then the ECM is dissolved in a buffering solution in the concentration range of 2-15% depending on the desired product density.

5. The method according to claim 1, characterized in that the solutions obtained after the first and second extraction are thawed, further filtered on a drip bag, then the obtained filtrate is concentrated using a filtration membrane, then a diafiltration process is carried out by adding purified water to the retentate, wherein the diafiltration is repeated three times, and then the retentate is subjected to a lyophilization process.

6. The method according to claims 1-3 and 5, characterized in that the ECM lyophilisates and the extraction retentate are combined in the ratio range of 20:1-100:1.

7. A decellularized extracellular matrix prepared according to claims 1-6 for use in the treatment of meniscal lesions.

8. The decellularized extracellular matrix ECM according to claim 7 is in the form of an injection, a lyophilized membrane, or a bioink.

9. The decellularized extracellular matrix ECM according to claim 7 is in the form of a semi-liquid injection.

10. The decellularized extracellular matrix ECM according to claim 7 is in the form of a construct printed from a plastic material, preferably PETG, coated with a dissolved matrix in a gel form.