PL247511B1 - Roztwór optycznie oczyszczający i rozszerzający tkanki, jego zastosowanie oraz sposób oczyszczania i rozszerzania tkanek - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest roztwór optycznie oczyszczający i rozszerzający tkanki, zawierający imidazol, 1-(3-aminopropylo)imidazol oraz mocznik, który to roztwór służy do precyzyjnej akwizycji i segmentacji danych pochodzących z mikroskopii fluorescencyjnej, jego zastosowanie oraz sposób oczyszczania i rozszerzania tkanek z jego wykorzystaniem.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest roztwór optycznie oczyszczający i rozszerzający tkanki, służący do precyzyjnej akwizycji i segmentacji danych pochodzących z mikroskopii fluorescencyjnej, jego zastosowanie oraz sposób oczyszczania i rozszerzania tkanek.

Podstawowym ograniczeniem dotychczasowych badań ilościowych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej było zawężenie zakresu obrazowania do maksymalnie kilku warstw komórek wynikające z nieprzejrzystości tkanek - a co za tym idzie zdecydowanym osłabieniem jakości danych wraz ze wzrastającą głębokością obrazowania.

Techniki optycznego oczyszczania tkanek (ang. tissue optical clearing, TOC), łączą korzyści płynące z obrazowania makroskopowego i histologii, niemal w całości znoszą tę barierę, pozwalając na przeprowadzanie pomiarów mikroskopowych czyli obrazowanie całych narządów, a nawet całych ciał, np. gryzoni laboratoryjnych, z rozdzielczością komórkową i subkomórkową [1,2]. Z jednej strony otwiera to zupełnie nowe możliwości zadawania i weryfikacji pytań badawczych w prawdziwym kontekście 3D narządów, z drugiej zaś jeszcze jaskrawiej uwidacznia niedoskonałości metod stosowanych podczas rekonstrukcji i segmentacji uzyskiwanych danych.

Obrazowanie całego narządu bez uprzedniego cięcia na mniejsze, mikroskopijne fragmenty, wymaga uczynienia go przezroczystym dla światła widzialnego co, w połączeniu z odpowiednimi technikami mikroskopii fluorescencyjnej, otwiera drogę do przeprowadzania wirtualnego „cięcia”, warstwa po warstwie, z wykorzystaniem światła zamiast fizycznego ostrza. W związku z tym podstawową, unikatową korzyścią płynącą ze stosowania TOC, jest możliwość obrazowania grubych wycinków lub całej objętości narządu w dowolnej płaszczyźnie bez utraty materiału i obecności artefaktów związanych z cięciem histologicznym. Niezależnie od metody efekt przezroczystości przy jednoczesnym zachowaniu natywnej (lub bliskiej natywnej) lokalizacji białek i kwasów nukleinowych uzyskiwany jest podczas dwóch głównych etapów - (1) usunięcia związków rozpraszających i/lub absorbujących światło oraz (2) wyrównania współczynnika załamania światła (ang. refractive index, RI) pomiędzy pozostałą próbką i roztworem, w którym ta próbka pozostaje zanurzona i będzie docelowo obrazowana.

Do czynników rozpraszających zaliczamy lipidy, włókna kolagenowe i elastynowe oraz cytoszkieletu, a także niejednorodną dystrybucję wymienionych związków w przestrzeni narządu [3]. Choć opisane zostały techniki TOC zachowujące tłuszcze, takie jak SeeDB [4], ScaleS [5], czy UbasM [6], oferują one mierny poziom przezroczystości, a ich zastosowanie jest z reguły ograniczone do niewielkiego zwiększenia głębokości obrazowania, nie oczyszczania sensu stricto. Z kolei związkami chemicznymi uznanymi za silnie absorbujące światło są hem, melanina oraz lipofuscyna, przy czym specyficzne protokoły usuwające zostały opisane dla pierwszych dwóch spośród wymienionych.

Dotychczas opublikowano ponad 100 protokołów TOC, które na podstawie wykorzystywanych w nich odczynników klasyfikujemy do czterech chemicznych kategorii metod: rozpuszczalnikowych (ang. solvent-based tissue optical clearing), rozwadniających (ang. hyperhydrating Solutions), transformujących tkanki (ang. tissue transforming methods) oraz wodnych o wysokim współczynniku załamania światła (ang. high-refractive index aqueous solutions).

Podejściem, które łączy zalety TOC z dramatycznie poprawioną rozdzielczością obrazowania jest mikroskopia oparta o rozszerzenie (ang. expansion microscopy, ExM) bazująca na transformacji komórek/tkanek w żelowe hybrydy. W ExM rozszerzanie jest procesem w pełni kontrolowanym i pożądanym, osiąganym podczas 4 etapów: (1) inkubacji ze związkami sieciującymi, (2) polimeryzacji in situ, (3) homogenizacji enzymatycznej (zazwyczaj z wykorzystaniem proteinazy K) lub mechanicznej tkanki oraz (4) rozszerzenia żelu z wykorzystaniem wody. W przypadku klasycznych protokołów ExM, preparat ulega ~4.5x liniowemu rozszerzeniu, co oznacza że jego objętość rośnie około 100-krotnie i w 98-99% składa się z wody [7]. Dzięki ExM klasyczne obiektywy, których dotychczasowa rozdzielczość wynosiła 270 nm, pozwalają na wizualizację tkanek z efektywną rozdzielczością na poziomie 60 nm (270 nm / 4,5), a więc znacznie poniżej poziomu dyfrakcji klasycznych mikroskopów świetlnych.

W przypadku ExM wartość powiększenia jest w pełni kontrolowana i może być modyfikowana poprzez zastosowanie odmiennych chemicznie monomerów (zawierających więcej hydrofitowych grup bocznych lub tworzących mniej połączeń krzyżowych) bądź kolejnej rundy rozszerzania wcześniej rozszerzonego preparatu. Standardowy hydrożel wykorzystywany w ExM i gwarantujący 4.5x rozszerzenie składa się z akrylanu sodu, akrylamidu oraz N,N’-metylenodiakrylamidu. Aby jeszcze bardziej zwiększyć efektywną rozdzielczość obrazowania zamieniono dwa ostatnie związki na N,N-dimetyloakrylamid, co w sposób powtarzalny pozwoliło osiągnąć aż 10x liniowe powiększenie preparatów podczas jednej rundy rozszerzania [8, 9]. Niedawno grupa Boydena przesunęła granicę jeszcze dalej, opracowując protokół dwukrotnego rozszerzenia (2*4.5x) dzięki któremu osiągnięto sumaryczne ~20x rozszerzenie liniowe przekładające się na osiągalną rozdzielczość na poziomie ~25 nm przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów świetlnych [10]. Należy podkreślić, iż stosowanie protokołów o tak znaczących wartościach rozszerzania wymaga dużego doświadczenia, szczególnie na etapie kontroli, czy rozszerzanie zostało przeprowadzone w sposób izotropowy, jak podają to liczne oryginalne prace.

Niezależnie od techniki rozszerzenia, ostateczna hybryda składa się z ~1% pierwotnego materiału biologicznego oraz ~99% wody, co czyni ją w pełni przezroczystą i teoretycznie dostępną do obrazowania w kontekście 3D również z wykorzystaniem wysokoprzepustowych technik obrazowania, takich jak LSFM. Mimo to, ExM służy obecnie badaniu pojedynczych komórek lub struktur subkomórkowych, takich jak mikrotubule czy chromatyna. Z jednej strony dystans roboczy obecnych obiektywów przystosowanych do imersji wodnej uniemożliwia obrazowanie tak znacznie rozszerzonych preparatów, z drugiej zaś czas niezbędny do przeprowadzenia obrazowania i późniejszej analizy nawet niewielkich obszarów aktualnie skutecznie odstręcza od podejmowania takich prób. Warto również zwrócić uwagę na podstawowe ograniczenie ExM - przestrzenne „rozcieńczenie” cząsteczek fluorescencyjnych obecnych w tkance, którego nasilenie narasta wraz z głębokością obrazowania. W przypadku mniej gęsto rozdystrybuowanych epitopów lub suboptymalnego barwienia IHC okazać się może, że struktury w rzeczywistości ciągłe, np. mikrotubule, są obrazowane w sposób nieciągły, co prowadzi do fałszywego odzwierciedlenia rzeczywistości.

Nawet pomijając znaczny poziom skomplikowania dostępnych protokołów oraz trudność pracy z powstałymi delikatnymi hybrydami, należy pamiętać iż minimalna wartość powiększenia objętości tkanek w przypadku ExM to aż 20x (2000%), co czyni obrazowanie nawet najcieńszych skrawków zadaniem praktycznie niemożliwym pod względem czaso- i pracochłonności, a także pracy z bezlikiem generowanych danych.

Niedawno, korzystając z serii roztworów składających się z imidazolu oraz antypiryny, zaprezentowano pierwszą metodę oczyszczającą i rozszerzającą w sposób kontrolowany bez potrzeby syntezy hydrożeli - CUBIC-X [11]. Niestety, CUBIC-X zaaplikowany do mysiego mózgowia, podobnie do klasycznych metod ExM, również oferuje bardzo znaczący wzrost objętości narządu na poziomie ~10x, co niemal praktycznie wyklucza go z codziennej praktyki laboratoryjnej.

W stanie techniki brakuje metody, która znacznie ułatwiłaby proces segmentacji pojedynczych komórek, bez jednoczesnego zwiększenia objętości badanych narządów o kilkanaście - kilkadziesiąt razy, czyniąc ich obrazowanie niemożliwym do ukończenia w normalnych warunkach pracowni mikroskopii. Zatem techniki TOC, które gwarantowałyby łatwość stosowania i szybkość przeprowadzenia procedury z jednoczesnym umiarkowanym rozszerzeniem tkanek, a tym samym przestrzeni pomiędzy komórkami, mogłyby przyczynić się do znacznego poprawienia jakości przeprowadzanego obrazowania i następowej analizy danych z narzędziami typu CytoMAP [12]. Jednocześnie, umiarkowane rozszerzenie tkanki oznaczałoby potencjalną maksymalizację dokładności przy niewielkim wydłużeniu czasu obrazowania, co mogłoby odmienić oblicze ExM z techniki czasochłonnej i ograniczonej do badania pojedynczych komórek lub niewielkich narządów, takich jak mysie mózgowie.

Głównym celem wynalazku było opracowanie roztworu umożliwiającego uzyskanie optycznego oczyszczenia i powtarzalnego rozszerzenia tkanek, którego stosowanie umożliwiałoby obrazowanie grubych (>40 μm) skrawków narządów i zwiększałoby dokładność ilościowej analizy danych pochodzących z mikroskopii fluorescencyjnej. Dzięki identyfikacji związków rozszerzających tkankę, które wykazują wysoki (>1,40) współczynnik załamania światła (ang. refractive index, RI). Twórcy wynalazku opracowali roztwór służący do optycznego oczyszczenia i umiarkowanego, acz powtarzalnego rozszerzenia tkanek - roztwór ISEE (ang. Improved Segmentation with bEnign Expansion). Roztwór ISEE gwarantuje wysoką przezroczystość, rozszerza tkanki o około 10-18%, korzystnie o około 15%, w każdej z osi i znacznie poprawia jakość segmentacji sygnału jądrowego z zastosowaniem metod półautomatycznych. Twórcy wynalazku zweryfikowali kompatybilność rozszerzania pod wpływem ISEE z wieloma mysimi narządami oraz wykazali możliwość detekcji sygnału jądrowego w obrębie całych, grubych (~200 μm) skrawków węzłów limfatycznych.

Przedmiotem wynalazku jest zatem roztwór optycznie oczyszczający i rozszerzający tkanki, określany dalej również jako „ISEE” albo „roztwór ISEE”, który jest wodnym roztworem zawierającym imidazol, 1-(3-aminopropylo)imidazol (dalej określany również jako API) oraz mocznik. W korzystnej postaci wykonania, w roztworze ISEE według wynalazku sumaryczne stężenie kombinacji dwóch spośród imidazolu, 1-(3-aminopropylo)imidazolu oraz mocznika wynosi od 10% wag./obj. do 85% wag./obj., korzystniej od 20% wag./obj. do 75% wag./obj., jeszcze korzystniej od 30% wag./obj. do 65% wag./obj., a najkorzystniej od 45% wag./obj. do 55% wag./obj. Maksymalne stężenie kombinacji dwóch spośród imidazolu, 1-(3-aminopropylo)imidazolu oraz mocznika w roztworze według wynalazku, tj. 85% wag./obj., wynika z faktu, że przy większym stężeniu następuje przesycenie roztworu i pojawiają się kryształy wyżej wskazanych związków, które deformują oczyszczaną i rozszerzaną tkankę, a dodatkowo generują niespecyficzne świecenie w badaniach mikroskopowych. Poniżej minimalnego stężenia wskazanego dla roztworu ISEE według wynalazku, tj. 10% wag./obj., współczynnik załamania światła jest zbyt niski i nie jest możliwe uzyskanie efektu przezroczystości oczyszczanej i rozszerzanej tkanki.

Określenie „tkanki” w znaczeniu tu stosowanym oznaczają dowolne próbki tkanek o grubości od 10 do 500 μm. Określenie to obejmuje przykładowo tkanki z różnych narządów, takich jak, na przykład, węzły limfatyczne, serce, naczynia krwionośne, przełyk, żołądek, wątroba, pęcherzyk żółciowy, trzustka, jelito, okrężnica, odbytnica, nadnercza, nerki, moczowód, pęcherz moczowy, grasica, śledziona, skóra, mięsień, mózg, rdzeń kręgowy, nerw, jajnik, jajowód, macica, gardło, krtań, tchawica, oskrzele, płuco, przepona, chrząstka, więzadła i ścięgna. Określenie to odnosi się zarówno do skrawków, jak i do całych narządów, które będą poddawane obrazowaniu mikroskopowemu.

W szczególnie korzystnej postaci wykonania roztwór ISEE według wynalazku zawiera imidazol w stężeniu od 25 do 30% wag./obj., najkorzystniej w stężeniu 25% wag./obj., 1-(3-aminopropylo)imidazol w stężeniu od 25 do 30% wag./obj., najkorzystniej w stężeniu 30% wag./obj., oraz mocznik w stężeniu od 20 do 25% wag./obj., najkorzystniej w stężeniu 20% wag./obj.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie roztworu ISEE według wynalazku do optycznego oczyszczania i rozszerzania tkanek. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku optycznie oczyszczone i rozszerzone tkanki są obrazowane technikami mikroskopowymi. Techniki mikroskopowe w znaczeniu tu stosowanym obejmują dowolne techniki mikroskopii optycznej. Korzystnie, zgodnie z zastosowaniem według wynalazku tkanki optycznie oczyszczone i rozszerzone przy użyciu ISEE według wynalazku są obrazowane technikami obrazowania fluorescencyjnego, a najkorzystniej technikami mikroskopii konfokalnej. Korzystnie, zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, tkanki optycznie oczyszczane i rozszerzane za pomocą roztworu ISEE według wynalazku stanowią skrawki (fragmenty) narządów lub całe narządy, a korzystnie narządy stanowią te wybrane z grupy obejmującej węzły limfatyczne (WL), wątrobę, mózg, płuca, śledzionę, serce i nerki.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obrazowanie tkanek optycznie oczyszczanych i rozszerzanych za pomocą roztworu ISEE według wynalazku jest wykonywane w okresie do jednego miesiąca po optycznym oczyszczaniu i rozszerzaniu tkanek. W korzystnej postaci wykonania, zgodnie z zastosowaniem według wynalazku tkanki optycznie oczyszczane i rozszerzane stanowią próbki tkanek o grubości od 40 μm do 200 μm.

Przedmiotem wynalazku jest dodatkowo sposób optycznego oczyszczania i rozszerzania tkanek, w którym tkanki o grubości od 10 do 500 μm są inkubowane w roztworze ISEE według wynalazku. W korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku tkanki są inkubowane w roztworze ISEE według wynalazku przez okres 5 do 75 min, przy czym korzystnie tkanki o grubości od 40 μm do 200 μm są inkubowane przez okres od 15 do 30 min, korzystniej tkanki o grubości 40 μm są inkubowane przez 15 min, a tkanki o grubości 100-200 μm są inkubowane przez 30 min.

Przedmiot wynalazku uwidoczniono na rysunku, na którym:

Figura 1 przedstawia wykres% zmiany powierzchni badanego wycinka w wyniku inkubacji z badanymi związkami chemicznymi, który pozwala na wstępną ocenę potencjału rozszerzania WL przez te związki.

Figura 2 ilustruje wpływ stężenia imidazolu (Imi), 1-(3-aminopropylo)imidazolu (API) i mocznika (M) na rozszerzanie mysich WL przez ocenę zmiany powierzchni badanych wycinków: (A) - 25% wag./obj. mocznika i zmienne stężenia Imi i API, (B) - 10% wag./obj. mocznika i zmienne stężenia Imi i API, (C) roztworów zawierających 25% wag./obj. mocznika i 10% wag./obj. mocznika, odpowiednio, przy czym 10% wag./obj. stężenie mocznika charakteryzują się wyższym potencjałem do rozszerzania WL; test t-Studenta dla niezależnych grup: t = 3,841, df = 22, p = 0,0009.

Figura 3 ilustruje potencjał rozszerzania WL przez ocenę zmiany powierzchni badanych wycinków dla roztworów o następujących składach: (I) 26% wag./obj. imidazolu, 25% wag./obj. API, 23% wag./obj. mocznika, (II) 27,5% wag./obj. imidazolu, 27,5% wag./obj. API, 20% wag./obj. mocznika, (III) 25% wag./obj. imidazolu, 30% wag./obj. API, 20% wag./obj. mocznika, (IV) 30% wag./obj. imidazolu, 25% wag./obj. API, 20% wag./obj. mocznika; jednokierunkowa ANOVA, p > 0,05.

Figura 4 przedstawia zależność transmitancji roztworu ISEE o składzie 25% wag./obj. imidazol, 30% wag./obj. API, 20% wag./obj. mocznik, od długości światła widzialnego.

Figura 5 przedstawia (A) wykres powierzchni skrawka mierzonej po 30, 90, 150 i 300 min inkubacji w roztworze ISEE o składzie 25% wag./obj. imidazolu, 30% wag./obj. API, 20% wag./obj. mocznika [n = 4; jednokierunkowa ANOVA, test post-hoc Tukeya; **p < 0,01, *p < 0,05]; (B) zdjęcia makroskopowe ilustrujące zmianę reprezentatywnego skrawka podczas 5 godzin inkubacji w ISEE (1 kratka = 1 mm); (C) maskę kształtu wybranego węzła inkubowanego 30 minut (kolor czarny), na który naniesiono obrys kształtów tego samego węzła po 150 i 300 minutach inkubacji (kolor żółty).

Figura 6 przedstawia (A) obrazy tych samych regionów 40-μm skrawka mysiego WL zarejestrowane przed (oznaczone na figurze jako PBS) i po optycznym oczyszczeniu i rozszerzeniu (oznaczone na figurze jako ISEE), skala 500 μm, które zostały wykorzystane do analizy ilościowej pod względem liczby jąder komórkowych (elipsy prezentują analizowane grudki, zaś kwadraty - regiony pozagrudkowe), (B) i (C) obrazy dopasowane i wycięte z obrazów przedstawionych w (A), skala 20 μm i 100 μm, odpowiednio, które pokazują, że inkubacja w ISEE poprawia jakość i rozdzielczość obrazowania zarówno na początku, jak i na końcu zakresu, co pozwala na dokonanie dokładniejszej segmentacji, a (D) wykres zależności liczby wykrytych jąder w zależności od wykorzystanego obiektywu i przeprowadzenia inkubacji w ISEE, który pokazuje, że ISEE zwiększa liczbę wykrywanych jąder komórkowych przy zastosowaniu takiego samego powiększenia układu optycznego nie tylko w całej objętości badanych regionów, ale również wierzchnich warstwach obrazowanego zakresu w przypadku grudek; jednokierunkowa ANOVA z testem post-hoc Tukeya, **p < 0,01, n = 6 regionów grudkowych i n = 7 pozagrudkowych.

Figura 7 przedstawia zależność średnicy jąder komórkowych mierzonych w obrębie grudek WL w tkankach poddanych oczyszczaniu z wykorzystaniem Ce3D w porównaniu z tkankami kontrolnymi; test t-Studenta dla niezależnych grup: t = 0,8354, df = 419, p = 0,4039.

Figura 8 przedstawia (A) zdjęcia 100-μm skrawków pochodzących z tego samego mysiego WL po optycznym oczyszczeniu i rozszerzeniu (ISEE) oraz oczyszczeniu (Ce3D) i wykorzystane do analizy ilościowej pod względem liczby jąder komórkowych, skala, całe skrawki 300 μm, pozostałe regiony 50 μm, (B) wykres zależności średnicy jąder dla próbki poddanej oczyszczaniu i rozszerzaniu w ISEE oraz dla próbki oczyszczanej Ce3D, z którego wynika, że ISEE zwiększa średnicę jąder komórkowych zmierzonych w grudkach o -15 [test t-Studenta dla niezależnych grup: t = 16,75, df = 598, ****p < 0,0001], (C) wykres liczby jąder komórkowych dla próbki poddanej oczyszczaniu i rozszerzaniu w ISEE oraz dla próbki oczyszczanej Ce3D, przy czym na potrzeby segmentacji założono, iż wykrywane obiekty stanowią idealne kule których promień, plus i minus dwa odchylenia standardowe, wyliczono na podstawie zmierzonych średnic [test t-Studenta dla niezależnych grup: t = 4,839, df = 22, ****p < 0,0001], (D) wykres liczby jąder komórkowych dla próbki poddanej oczyszczaniu i rozszerzaniu w ISEE oraz dla próbki oczyszczanej Ce3D, przy czym w tej analizie do górnego zakresu objętości wyliczonej w (C) objętości dodano 50%, kompensując spadek rozdzielczości w osi z [test t-Studenta dla niezależnych grup: t = 3,789, df = 22, **p = 0,01]. ‘

Figura 9 przedstawia zdjęcia grubych skrawków mysich WL o pierwotnej wielkości 200 μm zobrazowane z wykorzystaniem obiektywu HC PL APO CS2 40χ/1.30, które potwierdzają wysoki stopień przezroczystości uzyskiwanych preparatów, skala, 50 μm.

Figura 10 przedstawia zdjęcia skrawków o grubości 200 μm narządów mysich przed i po poddaniu działaniu ISEE przez 1 godzinę.

Szczegółowy opis wynalazku

W wyniku przeprowadzonych doświadczeń Twórcy wynalazku opracowali ISEE - roztwory optycznie oczyszczające i rozszerzające tkanki w sposób umiarkowany, powtarzalny oraz izometryczny (o -10-18%, korzystniej o -15% liniowo). Zatem roztwory ISEE mogą wypełnić bardzo istotną lukę pomiędzy obecnie stosowanymi technikami TOC oraz ExM, co umożliwia na istotnie dokładniejszą segmentację danych, bez olbrzymiego wzrostu ich objętości.

Do oceny użyteczności danej techniki do obrazowania grubych (>40 μm) skrawków tkanek należy brać pod uwagę liczne czynniki wpływające zarówno na tkankę, ale również komfort pracy oraz dokładność i czas niezbędny do przeprowadzenia zaplanowanej analizy [13]. Na jednym biegunie łatwości przeprowadzania TOC i późniejszej pracy z danymi pozycjonujemy metody rozpuszczalnikowe. Ich proste, krótkie protokoły, gwarantujące najwyższy stopień przezroczystości [14] i powodujące obkurczenie tkanek (a więc i ostatecznych plików) o kilkadziesiąt procent czynią z nich świetne narzędzie do wizualizacji dużych objętości tkanek w eksperymentach skoncentrowanych na ocenie rzadko występujących populacji komórek lub dużych struktur o charakterze tubularnym.

ISEE oferuje znaczną przewagę w porównaniu z technikami znanymi ze stanu techniki, z uwagi na powtarzalne rozszerzanie tkanek o ok. 10-18%, korzystniej o ok. 15% liniowo. Dzięki temu, możliwe było uzyskanie preferencyjnych warunków segmentacji jąder komórkowych w porównaniu do tkanek kontrolnych (Fig. 6). Widząc jak znacząca jest różnica jakości uzyskiwanego sygnału wraz ze wzrostem głębokości obrazowania nawet cienkich (40-μm) skrawków WL, analizę rozszerzono o wyłącznie bardzo dobrze oświetlone obszary kontrolne (wierzchnie 10-μm tkanki) oraz odpowiadający im zakres po ISEE (12-μm). Mimo że podejście to faworyzuje tkanki kontrolne z uwagi na pojawiającą się powierzchnię cięcia, a wraz z nią małe obiekty (których szerszy zakres został naturalnie przyjęty w przypadku warunków dla segmentacji przed rozszerzeniem), ISEE wciąż pozwolił na znamiennie skuteczniejszą detekcję sygnału jądrowego dla gęsto upakowanych regionów grudek (Fig. 6D). Należało również wyjaśnić kwestię, czy to efekt rozszerzenia, a nie samego oczyszczenia i zwiększenia jakości sygnału poprzez lepszy stosunek i profil sygnału do tła, odpowiada za poprawę warunków segmentacji. W tym celu przeprowadzono obrazowanie grubych (100-μm) skrawków pochodzących z tego samego WL z wykorzystaniem ISEE oraz referencyjnej metody TOC dla WL - Ce3D, która wywiera neutralny lub minimalnie kurczący wpływ na ich wielkość (Fig. 7). Proces segmentacji oferowany przez większość dostępnych programów, w tym wykorzystywany w badaniu Imaris, jest półautomatyczny. Oznacza to, że wyniki segmentacji/liczba wykrytych obiektów w dużym stopniu zależy od wartości objętości, czy sferyczności segmentowanych obiektów, zadanych przez eksperymentatora. Aby zminimalizować możliwość ingerencji w jakość segmentacji w poszczególnych warunkach, segmentację sygnału jądrowego przeprowadzono w 2 wariantach, z bardzo sztywnymi, ale i obiektywnymi założeniami dotyczącymi wielkości i kształtów obiektów, zakładając że przyjmują one kształt idealnej kuli i wyliczając ich objętość na podstawie średnic jąder komórkowych zmierzonych w obrębie grudek (Fig. 8B). Niezależnie od przyjętej strategii segmentacji, jej wykonanie po ISEE było bardziej skuteczne, co potwierdzono zarówno ilościowo (Fig. 8A), jak i było wyraźnie zauważalne jakościowo (Fig. 8B). W badaniach, których wyniki przedstawiono poniżej skupiono się na warunkach (zarówno obrazowania, jak i analizy danych) zbliżonych do tych stosowanych w większości laboratoriów biologicznych, a więc pozbawionych dostępu i doświadczenia do zaawansowanych technik segmentacji z wykorzystaniem sieci neuronalnych i uczenia maszynowego.

Należy podkreślić, iż niektóre spośród metod TOC ze stanu techniki powodują rozszerzenie powierzchni tkanek o kilkanaście-kilkadziesiąt procent, np. Sca leS w przypadku wątroby [15], UbasM jelita [16], czy CUBIC-L/R WL [17]. Dla wyżej wymienionych roztworów stanowi to jednak efekt uboczny, który jest niekontrolowany, wysoce zmienny i zależny od tkanki. Przykładowo, SeeDB2 opisane na potrzeby super-rozdzielczego obrazowania mózgu w pełni zachowuje jego kształt [18], doprowadzając do wysoce zmiennego, choć średnio -20% wzrostu powierzchni inkubowanych WL [17]. Dla porównania, zwiększenie powierzchni obserwowane w przypadku ISEE nie jest efektem mniej lub bardziej losowego procesu denaturacji i pęcznienia, prowadzących do deformacji tkanki, a pozwala na bardzo precyzyjne zachowanie struktury komórkowej (Fig. 6A-B). Przeprowadzone obrazowania konfokalne WL pozwalają stwierdzić, iż traktowanie ISEE nie wprowadza błędów do analizy dystrybucji przestrzennej komórek i odległości pomiędzy nimi (należy jednak z uwagą manipulować delikatną po rozszerzeniu tkanką, gdyż może to wprowadzać zmiany w jej kształcie, Fig. 5C). Choć wydawać by się mogło że zaskakujący, wykazany izometryczny charakter rozszerzania z ISEE można lepiej zrozumieć w perspektywie najnowszych wyników grupy Uedy, która wykazała iż budowa utrwalonej, delipidowej tkanki, przypomina „elektrolitowy żel” podatny na powtarzalne kurczenie i rozciąganie [19]. Ta sama grupa opisała pierwszy roztwór rozszerzający mysie mózgowie, bez korzystania z żeli akrylamidowych charakterystycznych dla ExM. Niestety, znaczny współczynnik uzyskiwanego rozszerzenia (~10x pod względem objętości) sprawia że obrazowanie 1 mózgowia z wykorzystaniem LSFM (z krokiem w osi z = 5 μm) trwa 4 dni, zaś dane zajmują 14 Tb. Istotną przewagą ISEE w kontekście obrazowania konfokalnego jest stosunkowo niewielkie rozszerzenie objętości na poziomie -60-70%. Może to stanowić rozsądny kompromis pomiędzy zwiększeniem czasu obrazowania i objętości danych, a korzyścią oferowaną przez znacznie lepsze warunki detekcji, co potwierdzają wyniki przeprowadzonej segmentacji (Fig. 6C).

Na uwagę zasługuje również łatwość i czas inkubacji niezbędny do przeprowadzenia reakcji rozszerzania i oczyszczania z wykorzystaniem ISEE. Cały proces w przypadku pracy ze skrawkami o grubości 40-200 μm oparty jest w ISEE o kilkunastominutową inkubację z jednym tylko odczynnikiem o RI = 1,47, pełniącym dodatkowo funkcję ostatecznego medium, w którym dochodzi do obrazowania.

Dotychczas najszybszą i bazującą na jednym odczynniku była technika FOCM [20]. Techniki oparte na jednym odczynniku, prócz prostoty stosowania przez badaczy pozbawionych wcześniejszego doświadczenia z TOC, oferują dodatkową korzyść, fundamentalną podczas pracy z dość cienkimi (jak na obrazowanie wolumetryczne) skrawkami - ograniczają ryzyko zniszczenia preparatu podczas kolejnych etapów wymiany roztworów.

Twórcy wynalazku przeprowadzili obrazowanie konfokalne na pierwotnie 200-μm (-230 μm po rozszerzeniu) skrawkach WL z uwagi na nominalne ograniczenie dystansu roboczego stosowanego przez nas obiektywu 40χ/1.3 NA do 240 μm. Należy podkreślić, że uzyskiwany poziom przezroczystości zdecydowanie nie ogranicza stosowania ISEE do skrawków o tej grubości, co pozwala na uzyskiwanie niemal identycznych jakościowo obrazów na początku i końcu zakresu obrazowania (Fig. 9).

Twórcy wynalazku wykazali, że ISEE są roztworami TOC, które gwarantują izometryczne, powtarzalne rozszerzanie mysich węzłów limfatycznych o 10-18%, korzystnie o 15% liniowo. Wartość ta tylko nieznacznie (o -60-70%) wydłuża czas akwizycji danych i zwiększa ich późniejszą objętość, jednocześnie oferując korzystne warunki dla skutecznego procesu segmentacji. ISEE poprawia skuteczność segmentacji sygnału pochodzącego z jąder komórkowych. Efekt ten jest szczególnie znaczący w przypadku gęsto upakowanych regionów, takich jak grudki limfocytów B, zarówno w przypadku porównania z klasycznymi warunkami obrazowania, jak i referencyjną techniką TOC - Ce3D. Ponadto ISEE, na poziomie rozdzielczości mikroskopii konfokalnej z wykorzystaniem obiektywu powiększającego 40-krotnie, nie prowadzi do deformacji tkanki lub poszczególnych typów jej komórek. Co więcej ISEE, o współczynniku załamania światła wynoszącym 1,47, pełni jednocześnie funkcję roztworu optycznie oczyszczającego, rozszerzającego i wyrównującego współczynnik refrakcji, co pozwala na wykorzystywanie go jako medium podczas obrazowania.

PRZYKŁADY

1. Materiał i metody

1.1. Tkanki wykorzystane w doświadczeniach

W eksperymentach wykorzystano tkanki pobrane od myszy ze szczepu wsobnego C57BL/6Jcmdb (hodowane w Centrum Medycyny Doświadczalnej w Białymstoku oraz Instytucie Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego w Warszawie), C57BL/6-Tg(Foxp3-DTR/EGFP)23.2Spar/Mmjax, B6.129S4-Arg1tm1.1Lky/J oraz B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J (hodowane w Warszawskim Uniwersytecie Medycznym). Zwierzęta miały zapewnione kontrolowane środowisko (temperatura 24°C, cykl dobowy 12/12) i zapewniony dostęp do wody i paszy ad libitum. Zwierzęta uśmiercano poprzez dyslokację rdzenia kręgowego, poprzedzoną ekspozycją na izofluran (FDG9623, Baxter). Izolowane tkanki były utrwalane przez 1 dobę w 4% roztworze paraformaldehydu (BD Cytofix/Cytoperm™, No. 554722, BD Bioscences) w 4°C przed wykorzystaniem w doświadczeniach.

Wszystkie czynności zostały przeprowadzone w zgodzie z Dyrektywą Parlamentu Europejskiego i Rady (2010/63/UE) i polskim Prawem. Myszy były jedynie donorami tkanek, co oznacza brak konieczności uzyskania zgody Komisji Etycznej.

1.2. Selekcja związków chemicznych o potencjale do rozszerzania tkanek i analiza danych dotyczących powierzchni tkanek

Bazując na metodologii poszukiwania związków chemicznych o potencjale rozszerzającym tkanki w CUBIC-X [11] wyselekcjonowano 10 związków chemicznych potencjalnie rozszerzających tkanki i gwarantujących wysoki RI ostatecznego roztworu. Mysie węzły limfatyczne (WL) były fotografowane z wykorzystaniem trinokularu (BIO000629, Jangar) wyposażonego w kamerę cyfrową USB 5MP (BIO000695, Jangar) przed procedurą oczyszczenia i rozszerzenia, a następnie inkubowane w 2 ml testowanych roztworów i fotografowane ponownie po 24 godzinach od rozpoczęcia inkubacji. Ostatecznie zdjęcia były obrysowywane, a powierzchnie tkanek mierzone w programie ImageJ (wersja 1.52n; National Institutes of Health) z wykorzystaniem narzędzia polygon selections.

W pierwszej serii eksperymentów testowano wpływ pojedynczych roztworów na objętość WL. Zastosowano następujące stężenia: 100%, 75%, 50%, 25%, 15% oraz 5% (waga do objętości, wag./obj. lub objętość do objętości, v/v, w zależności od stanu skupienia substancji w temperaturze pokojowej), przy czym wartość 100% oznaczała maksymalną rozpuszczalność substancji w wodzie w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem glicyny, N-laurylosarkozyny oraz Tricine, których stężenia odpowiadały stężeniom wagowym. W kolejnej serii eksperymentów testowano 10% mieszaniny związków potencjalnie najbardziej optymalnych substancji (powodujących rozszerzenie powierzchni o ~25%).

1.3. Przygotowywanie skrawków histologicznych

Utrwalone narządy zatapiano w 3% wag./obj. roztworze agarozy (Sigma-Aldrich) w wodzie, po czym skrawano na zadaną grubość z wykorzystaniem Vibratomu (VT1000S, Leica). Skrawki przechowywano w 1x buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (ang. phosphate buffered saline, PBS, SigmaAldrich) z dodatkiem 0,05% azydku sodu (NaN3, Sigma-Aldrich).

1.4. Barwienia jądrowe

Do skrawków dodawano barwnik jądrowy - Hoechst 33342 (1 : 10 000, Thermo Fisher Scientific) dla tkanek poddawanych oczyszczaniu z wykorzystaniem trójwymiarowej mikroskopii wspartej oczyszczaniem (ang. clearing-enhanced 3 dimensional microscopy, Ce3D), lub jodek propidyny (1 : 5000, Thermo Fisher Scientific) w przypadku wszystkich pozostałych.

Do zatapiania preparatów kontrolnych wykorzystywano odczynnik Fluoromount-G (Thermo Fisher Scientific), pozostałe preparaty zatapiane były w ostatecznym roztworze oczyszczającym i rozszerzającym (ISEE) lub Ce3D, w zależności od zastosowanej metody TOC.

1.5. Optyczne oczyszczanie

1.5.1. ISEE

Opracowany roztwór do optycznego oczyszczania i rozszerzania składa się z 25% imidazolu (I202-100G, Merck), 20% mocznika (U5378-5KG, Sigma-Aldrich), 30% 1-(3-aminopropylo)imidazolu (API) (272264-50G, Merck) oraz 25% wody (stężenie wagowo-objętościowe) i ma RI = 1,47. W wypadku oczyszczania z ISEE, tkanki o grubości 40 μm inkubowane były w roztworze przez 15 minut, zaś 100-200 μm przez 30 minut, po czym zatapiane i obrazowane.

1.5.2. Ce3D

Roztwór przygotowywano zgodnie z opublikowanym protokołem [21]. W skrócie, przygotowano 40% v/v roztwór N-metylacetamidu (M26305-100G, Sigma-Aldrich) w PBS, którego używano do rozpuszczania Histodenz (D2158-100G, Sigma-Aldrich) do 86% wag./obj. w 37°C. Po całkowitym rozpuszczeniu, które następowało po 5-6 godzinach, do roztworu dodawano Triton X-100 (0,1% v/v, Sigma-Aldrich) oraz 1-tioglicerol (0,5% v/v, M1753-100ML, Sigma-Aldrich). W celu oczyszczenia mysich węzłów limfatycznych, inkubację przeprowadzano przez 24 godziny z delikatną rotacją.

1.6. Obrazowanie konfokalne

Do obrazowania preparatów wyznakowanych fluorescencyjnie użyto mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP8 (Leica Microsystems) wyposażonego w moduł Navigator oraz obiektywy HC PL APO CS2 20χ/0.75 oraz HC PL ApO CS2 40χ/1.30 z imersją olejową. Wzbudzenia dokonywano z wykorzystaniem lasera światła białego (ang. white light laser, WLL) lub argonowego w odpowiednich dla danych fluoroforów długościach. W ogromnej większości detekcja była przeprowadzana z wykorzystaniem detektorów hybrydowych, HyD, w rozdzielczości 1024x1024, obraz 8-bitowy, prędkość 600, krok w osi z = 2 μm.

1.7. Porównanie detekcji jąder komórkowych w skrawkach 40 μm

Wybarwione, 40 μm skrawki mysich WL, obrazowano z wykorzystaniem SP8 i obiektywem 40χ/1.3 NA, po czym poddawano oczyszczaniu i rozszerzaniu z ISEE. Po 15 minutach inkubacji skrawki obrazowano powtórnie z wykorzystaniem obiektywu 40χ/1.3 NA oraz 20χ/0.75 NA. Uzyskane dane odtwarzano z wykorzystaniem ImageJ (National Institutes of Health) i za pomocą polygon selections na plikach pochodzących z obrazowania z obiektywem 40χ po ISEE. Wyznaczano 2 grupy regionów poddawanych analizie o odmiennym stopniu upakowania komórek: (1) regiony w obrębi e grudek limfocytów B oraz (2) poza grudkami. Następnie te same, zapamiętane regiony, aplikowano do danych zobrazowanych z obiektywem 20χ po ISEE oraz, po uprzednim pomniejszeniu o 12,7%, do danych kontrolnych. Wszystkie regiony wycinano z oryginalnych plików oraz zapisywano w formacie tiff. Następnie, z wykorzystaniem Imaris File Converter (Bitplane) dokonywano konwersji do formatu .ims (Imaris, Bitplane). W programie Imaris przeprowadzano analizę z wykorzystaniem funkcji surface dla detekcji jąder komórkowych (dokładne parametry segmentacji sygnałów zostały przedstawione w Tabeli 1), po czym dane ilościowe dotyczące liczby wykrytych obiektów eksportowano do formatów csv./.xlsx.

PL 247511 Β1

Tabela 1

Parametry segmentacji jader komórkowych w programie Imaris

Fig.; grupa	Wielkość ROI (XY)* (pm)	„Surface Grain Size” (pm)	“Diameter of Largest Sphere” (pm)	“Manuał Threshold”	“Region Growing Estimated Diameter” (pm)	“Volume” (pm3)
14C; ISEE,	232x232	0,568	80	25 - mas	4,04	66,5 -238,0
14D; ISEE	232x232	0,568	80	25 - mas	4,04	66,5 - 365,0
14C; Ce3D	200x200	0,568	80	25 - mas	3,59	36,4- 163,0
14D; C»3D	200x200	0,568	80	25 - mas	3,59	36,4 - 243,0
12;40x/20x ISEE	Cały obszar grudki lub 119x116 poza grudką	0,568	80	25 - mas	4,04	66,5-365,0
12;40xPBS	Cały obszar grudki lub 104x102 poza grudką	0,568	80	25 max	3,59	36,4 243,0
12;40x/20x ISEE, 12 pm, grudka	Cały obszar grudki	0,568	100	7 - max	4,04	66,5-365,0
12;40x PBS, 10 pm	Cały obszar grudki lub 104x102 poza grudką	0.568	100	1 - max	3,59	36.4-243,0
12;40x/20x ISEE, 12 pm poza grudką	119x116	0,568	100	1 - max	4,04	66,5-365,0

*W osi z analizowano całą grubość preparatu lub 10/12 pm w wyszczególnionych grupach.

1.8. Porównanie detekcji jąder komórkowych w skrawkach 100 pm

Tkanki (pochodzące z następujących po sobie skrawków tego samego WL) wybarwione i oczyszczone zgodnie z powyższym opisem, poddawano obrazowaniu z wykorzystaniem SP8 wyposażonego w obiektyw 40x/1.3 NA. Aby odnaleźć oczekiwaną objętość obiektów poddawanych segmentacji, zmierzono po 100 średnic przekrojów jąder komórkowych zlokalizowanych na terenie grudek limfocytów B. Dane były następnie poddawane analizie w oprogramowaniu Imaris (Bitplane) z wykorzystaniem funkcji surface. Analizie poddawano identyczną liczbę regionów o ściśle określonych parametrach zawartych wTabeli 1.

1.9. Analiza statystyczna

Na wykresach przedstawiono średnie ze słupkami błędu jako błędu standardowego średniej. Dane uznawano za statystycznie istotne dla P < 0.05. Liczbę badanych elementów podano w legendach rycin. Dane przeanalizowano statystycznie w programie GraphPad Prism 9 (GraphPad Software). W przypadku danych o rozkładzie normalnym (testowano przy użyciu testu Shapiro-Wilka) i równych wariancjach pomiędzy grupami stosowano test t-Studenta lub jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA). W przypadku analizy wariancji dla istotnych statystycznie wyników przeprowadzano test post-hoc Tukeya.

2. Wyniki

2.1. Selekcja roztworu rozszerzającego tkanki o potencjalnie wysokim współczynniku załamania światła

Wykorzystując dotychczas przeprowadzone obszerne (1691 substancji) badanie przesiewowe związków o potencjale do rozszerzania tkanek i utrzymywania wysokiego (>1,45) Rl w roztworach wodnych [11], wyselekcjonowano 10 związków do oceny ich wpływu na zmianę powierzchni mysich WL: 1-(3-aminopropylo)imidazol (API), dihydrazyd kwasu adypinowego (AADH), β-alanina, etanoloamina, imidazol, mocznik, 3-pikoliloamina (na wykresie Picolylamine), Tricine (N-[2-hydroksy-1,1-bis(hydroksymetylo)etylo]glicyna), N-laurylosarkozyna i glicyna.

Pierwsza seria doświadczeń, której wyniki przedstawiono na Fig. 1, wykazała iż wszystkie testowane związki, oprócz N-laurylosarkozyny, glicyny oraz N-[2-hydroksy-1,1-bis(hydroksymetylo)etylo]glicyna Tricine, doprowadzały do znacznego (co najmniej 20%) powiększenia powierzchni tkanek już w ciągu 24 godzin od rozpoczęcia inkubacji (Fig. 1A). Ponadto, zauważono że imidazol doprowadza do oczyszczenia optycznego WL (Fig. 1B Skala, 1 mm).

PL 247511 Β1

W wyniku przeprowadzonego testu przesiewowego wykluczono z dalszych badań 3 związki o niskim (<20% wzrostu powierzchni) potencjale rozszerzania mysich WL - N-laurylosarkozynę, glicynę oraz Tricine. Wyniki pokazują, że przy imidazolu uzyskuje się nie tylko znaczące rozszerzenie WL, ale również ich oczyszczenie optyczne. Co więcej 10% roztwory zawierające imidazol, API lub mocznik charakteryzują się najwyższym potencjałem do ograniczonego rozszerzania tkanek.

Następnie zbadano, czy możliwe jest uzyskanie nasilonego powiększenia narządów po łącznym zastosowaniu mieszanin wyselekcjonowanych związków, obserwując najwyższe wartości średniego rozszerzania powierzchni (co najmniej o 30%) w przypadku 5 par związków: (I) 1-(3-aminopropylo)imidazolu (API) z imidazolem, (II) API z mocznikiem, (III) mocznika z imidazolem, (IV) API z imidazolem i mocznikiem oraz (V) API z 3-pikoliloaminą (Fig. 1C). Po tym etapie usunięto 3-pikoliloaminę z dalszych analiz z uwagi na brak korzystnego działania w połączeniu przyjednoczesnej tendencji do powodowania obkurczenia tkanki w wyższych niż 15% stężeniach (Fig. 1 A), których użycie byłoby zapewne niezbędne do osiągnięcia wysokiego Rl ostatecznego roztworu. API lub mocznik (Fig. 1C) charakteryzują się najwyższym potencjałem do ograniczonego rozszerzania tkanek.

Aby zweryfikować, czy w przypadku kombinacji API z imidazolem i mocznikiem, to ten ostatni związek znany ze swych właściwości indukujących pęcznienie tkanek [22], wywiera najsilniejsze działanie, przeprowadzono obserwację wpływu różnych stężeń API i imidazolu z dwoma, stałymi stężeniami mocznika - 10% oraz 25% (Fig. 2).

Wykazano, iż kumulatywnie roztwory zawierające 25% mocznika charakteryzują się niższym potencjałem rozszerzania tkanek (średnio 22,34% vs 35,64%, Fig. 2C). Jednocześnie zaobserwowano, iż roztwór składający się w 30% z API, 30% imidazolu, 25% mocznika i 15% wody, był roztworem spełniającym definicję roztworu przesyconego - możliwym do rozpuszczenia w warunkach podwyższonej temperatury (~40°C), jednak szybko krystalizującym po ekspozycji na powietrze lub w temperaturze pracowni mikroskopii konfokalnej (~22°C).

Opierając się na powyższych obserwacjach, poczyniono próby uzyskania roztworu będącego mieszaniną API, imidazolu, mocznika i wody o wysokim Rl (> -1,45), zawierającym mniej niż 25% mocznika oraz mniej niż 30% API oraz imidazolu. Opracowano 4 alternatywne roztwory o podobnym Rl oraz składzie (Tabela 2), a także potencjale do rozszerzania powierzchni węzłów limfatycznych o -30-35% (Fig. 3).

Tabela 2

Skład testowanych roztworów

Numer	Stężenie imidazolu [%]	Stężenie API [%]	Stężenie mocznika [%]	Stężenie wody [%]	Rl
1	26	25	23	26	1,465
II	27,5	27,5	20	25	1,467
III	25	30	20	25	1,470
IV	30	25	20	25	1,465

Z uwagi na wymienione podobieństwa, do dalszych badań wybrano roztwór charakteryzujący się najwyższym Rl (roztwór „III”). W skład roztworu ISEE (ang. Improved Segmentation with bEnign Expansion), który posłużył do dalszych eksperymentów, wchodzi 30% wag./obj. API, 25% wag./obj. imidazolu, 20% wag./obj. mocznika oraz 25% wody. ISEE (roztwór „III”) ma Rl = 1,47, pH -12 oraz charakteryzuje się wysoką transmitancją w zakresie widma światła widzialnego (Fig. 4).

2.2. ISEE dokonuje błyskawicznego oraz trwałego oczyszczenia i rozszerzenia grubych skrawków tkanek

W celu zweryfikowania po jakim czasie reakcja rozszerzania się wysyca, 200-pm skrawki WL inkubowano w ISEE (roztwór „III”), dalej: ISEE, przez 5 godzin okresowo je fotografując. Co interesujące, reakcja rozszerzenia wysycała się już po pierwszych 30 minutach inkubacji, a powierzchnia pozostawała taka sama w ciągu kolejnych 4,5 h (tj. w ciągu 30 minut od rozpoczęcia inkubacji, 200-pm skrawki WL uzyskują ostateczną wartość rozszerzenia powierzchni) (Fig. 5A-B). Pomimo niezmiennej w czasie powierzchni WL, zauważono niewielkie odchylenia kształtów ich powierzchni w trakcie trwania inkubacji. Jak przedstawiono na Fig. 5C kształt uchwycony po 150 minutach niemal idealnie odpowiada kształtowi z 30 minuty inkubacji, jednak w 300 minucie widoczne są niewielkie zmiany kształtu (zaznaczone strzałkami) wynikające z mechanicznej manipulacji skrawkami.

2.3. ISEE poprawia dokładność segmentacji w porównaniu z klasycznym protokołem o obrazowania konfokalnego

Po zweryfikowaniu użyteczności ISEE wyrażonej bardzo szybkim i równomiernym rozszerzaniem i oczyszczaniem, przeprowadzono doświadczenie porównujące dokładność segmentacji sygnału pochodzącego z barwienia jądrowego. Aby zweryfikować hipotezę zakładającą, że rozszerzenie obiektów zainteresowania (tj. jąder komórkowych) oraz przestrzeni pomiędzy nimi wraz z efektem oczyszczenia poprawi dokładność analizy, przeprowadzano obrazowanie tych samych fragmentów tkanek przed oczyszczeniem z obiektywem 40x/1.30 (warunki kontrolne) oraz z obiektywami 40x/1.30 i 20x/0.75 po inkubowaniu w ISEE (warunki eksperymentalne). Aby jak najbardziej zbliżyć się do typowych warunków obrazowania, doświadczenie przeprowadzono na tkankach o grubości 40 μm (obrazując je w całości w osi z) w rozdzielczości 1024x1024 i prędkości 600 w formacie 8-bitowym, dostosowując moc lasera tak, aby minimalizować liczbę pikseli wykraczających poza zakres detekcji. W obrębie WL oznaczono dwa typu regionów charakteryzujące się odmiennym stopniem upakowania komórek: (1) gęsto upakowane grudki oraz (2) regiony w obrębie strefy limfocytów T o niższym stopniu zagęszczenia komórkowego (Fig. 6A). Objętość regionów w przypadku ISEE była automatycznie zwiększona z wykorzystaniem ImageJ przy założeniu liniowego rozszerzenia tkanki o 14,5%, co pozwoliło na skuteczne dopasowanie i wycięcie tych samych regionów (Fig. 6A-B) stanowiąc kolejny dowód na izometryczność procesu rozszerzania. Poprawa rozdzielczości obrazowania po inkubowaniu w ISEE jest widoczna zarówno w górnych częściach zakresu obrazowania (ang. stack, efekt rozszerzania) jak i w częściach dolnych, gdzie obserwuje się nakładający efekt rozszerzania i oczyszczania (Fig. 6 prawy panel). Zgodnie z hipotezą, poprawienie rozdzielczości obrazowania pod wpływem ISEE pozwoliło na dokonanie dokładniejszej segmentacji z wykorzystaniem półautomatycznego procesu tworzenia powierzchni w programie Imaris (Bitplane, Fig. 6C, założenia przyjęte do segmentacji dotyczące wielkości obiektów zostały opisane w części opisu pt. Materiały i metody oraz Tabeli 1). Obserwując, jak znacząco wraz ze wzrostem głębokości, zmniejsza się jakość uzyskiwanych obrazów w przypadku regionów kontrolnych, postanowiono powtórzyć analizę w obrębie tych samych regionów, jednak włączając wyłącznie pełne przekroje z pierwszych 10 (obrazowanie kontrolne) lub 12 μm (obrazowanie po rozszerzeniu) tkanki. Tak znaczące ograniczenie obrazowania z jednej strony pozwala na zbadanie przede wszystkim efektu rozszerzania, a nie oczyszczania (z uwagi na dość podobną jakość danych przy wierzchu tkanki), faworyzuje jednak segmentację dla warunków kontrolnych (które zakładają obecność odpowiednio mniejszych obiektów, a które to w sposób sztuczny pojawią się na liniach cięcia tkanki). W wyniku pogłębionej analizy ilościowej wykazano skuteczność ISEE w przypadku grudek, co jednak nie miało miejsca w przypadku mniej gęsto upakowanych regionów limfocytów T (Fig. 6D prawy panel).

2.4. ISEE poprawia dokładność segmentacji w porównaniu z referencyjną techniką TOC

Choć uzyskane wyniki wykazały poprawę segmentacji jąder komórkowych po zastosowaniu ISEE w porównaniu do grupy kontrolnej, obrazowanej w sposób klasyczny po wcześniejszym zatopieniu w Fluoromount-G®, zweryfikować należało, czy efekt ten pozostanie utrzymany w porównaniu z inną techniką TOC. W tym celu zastosowano technikę Ce3D - metodę referencyjną dla oczyszczania mysich WL, o udokumentowanym braku wpływu na wielkość tkanki lub minimalnie ją obkurczającą. Wyniki przedstawione na Fig. 7 potwierdzają, że Ce3D nie zmienia kształtu oczyszczanej tkanki. Średnica jąder komórkowych mierzonych w obrębie grudek WL w tkankach poddanych oczyszczaniu z wykorzystaniem Ce3D nie odbiega od średnicy obserwowanej w tkankach kontrolnych.

Z uwagi na brak możliwości dokonania obrazowania tych samych regionów w ISEE i po Ce3D i na odwrót, obrazowano kolejne, 100-μm skrawki pochodzące z tego samego WL, zakładając jednorodny stopień upakowania grudek (Fig. 8A). W wyniku analizy ilościowej potwierdzono powiększenie węzła po ISEE o ~15% liniowo w porównaniu do niezmieniającego wielkości tkanki Ce3D (Fig. 8B) oraz udowodniono, iż widoczne „gołym okiem” powiększenie przestrzeni pomiędzy jądrami komórkowymi w przypadku ISEE poprawia jakość segmentacji w stosunku do Ce3D niezależnie od przyjętych warunków wstępnych tego procesu (Fig. 8C-D).

Należy podkreślić, iż możliwość obrazowania konfokalnego z wykorzystaniem ISEE nie ogranicza się do 100 μm skrawków. Aby to zweryfikować, przeprowadzono obrazowanie skrawka WL o pierwotnej grubości 200 μm (czyli ~230 μm po rozszerzeniu), co stanowi wartość graniczną dla katalogowego dystansu roboczego obiektywu HC PL APO CS2 40x/1.30 (WD = 0,24 mm). Wyniki przedstawione na Fig. 9 potwierdzają wysoki stopień przezroczystości uzyskiwanych preparatów.

2.5. ISEE i optyczne oczyszczanie innych narządów

Ostatecznie zweryfikowano użyteczność ISEE w stosunku do oczyszczania i rozszerzania wszystkich głównych narządów myszy (wątroby, mózgu, płuc, śledziony, serca, nerek) i uzyskano wyniki bardzo zbliżone do WL, tj. bardzo wysoki poziom przezroczystości oraz rozszerzenie liniowe na poziomie ~10-18% w zależności od narządu. Na Fig. 10 przedstawiono zdjęcia skrawków narządów mysich przed i po ISEE.

LITERATURA

1. Richardson DS, Lichtman JW. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 16 lipiec 2015; 162(2): 246-57.

2. Costantini I, Costantini I, Cicchi R, Cicchi R, Silvestri L, Silvestri L, i in. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomed Opt Express, BOE. 1 październik 2019; 10(10): 5251-67.

3. Yu T, Zhu J, Li D, Zhu D. Physical and chemical mechanisms of tissue optical clearing. iScience. 19 marzec 2021; 24(3): 102178.

4. Ke MT, Fujimoto S, Imai T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. sierpień 2013; 16(8): 1154-61.

5. Hama H, Hioki H, Namiki K, Hoshida T, Kurokawa H, Ishidate F, i in. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. Październik 2015; 18(10): 1518-29.

6. Chen L, Li G, Li Y, Li Y, Zhu H, Tang L, i in. UbasM: An effective balanced o optical clearing method for intact biomedical imaging. Sci Rep. 22 wrzesień 2017; 7(1): 12218.

7. Gallagher BR, Zhao Y. Expansion microscopy: A powerful nanoscale imaging tool for neuroscientists. Neurobiology of Disease. 1 lipiec 2021; 154: 105362.

8. Truckenbrodt S, Maidom M, Crzan D, Wildhagen H, Kabatas S, Rizzoli SO. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Rep. wrzesień 2018; 19(9): e45836.

9. Truckenbrodt S, Sommer C, Rizzoli SO, Danzl JG. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nat Protoc. marzec 2019; 14(3): 832-63.

10. Chang JB, Chen F, Yoon YG, Jung EE, Babcock H, Kang JS, i in. Iterative expansion microscopy. Nat Methods, czerwiec 2017; 14(6): 593-9.

11. Murakami TC, Mano T, Saikawa S, Horiguchi SA, Shigeta D, Baba K, i in. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nat Neurosci. kwiecień 2018; 21(4): 625-37.

12. Stoltzfus CR, Filipek J, Gern BH, Olin BE, Leal JM, Wu Y, i in. CytoMAP: A Spatial Analysis Toolbox Reveals Features of Myeloid Cell Organization in Lymphoid Tissues. Cell Reports. 21 kwiecień 2020; 31(3): 107523.

13. Weiss KR, Voigt FF, Shepherd DP, Huisken J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nat Protoc. czerwiec 2021; 16(6): 2732-48.

14. Orlich M, Kiefer F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. luty 2018; 33(2): 181-99.

15. Xu J, Ma Y, Yu T, Zhu D. Quantitative assessment of optical clearing methods in various intact mouse organs. J Biophotonics, luty 2019; 12(2): e201800134.

16. Bossolani GDP, Pinteion I, Detrez JD, Buckinx R, Thys S, Zanoni JN, i in. Comparative analysis reveals Ce3D as optimal clearing method for in toto imaging of the mouse intestine. Neurogastroenterology & Motility. 2019; 31(5): el3560.

17. Matryba P, Sosnowska A, Wolny A, Bozycki L, Greig A, Grzybowski J, i in. Systematic Evaluation of Chemically Distinct Tissue Optical Clearing Techniques in Murine Lymph Nodes. The Journal of Immunology. 17 styczeń 2020. Dostępne na: https://www.jimmunol.org/content/early/2020/01/16/jimmunol.1900847

18. Ke MT, Nakai Y, Fujimoto S, Takayama R, Yoshida S, Kitajima TS, i in. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Reports. 22 marzec 2016; 14(11): 2718-32.

19. Susaki EA, Shimizu C, Kuno A, Tainaka K, Li X, Nishi K, i in. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nat Commun. 27 kwiecień 2020; 11(1): 1982.

20. Zhu X, Huang L, Zheng Y, Song Y, Xu Q, Wang J, i in. Ultrafast optical clearing method for threedimensional imaging with cellular resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 4 czerwiec 2019; 116(23): 11480-9.

21. Li W, Germain RN, Gerner MY. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. czerwiec 2019; 14(6): 1708-33.

22. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, Kishino F, Tawara T, Watanabe TM, i in. Whole-Brain Imaging with Single-Cell Resolution Using Chemical Cocktails and Computational Analysis. Cell. 24 kwiecień 2014; 157(3): 726-39.

Claims (20)

1. Roztwór optycznie oczyszczający i rozszerzający tkanki, znamienny tym, że jest wodnym roztworem zawierającym imidazol, 1-(3-aminopropylo)imidazol oraz mocznik.

2. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że sumaryczne stężenie kombinacji dwóch spośród imidazolu, 1-(3-aminopropylo)imidazolu oraz mocznika wynosi od 10% wag./obj. do 85% wag./obj.

3. Roztwór według zastrz. 2, znamienny tym, że sumaryczne stężenie kombinacji dwóch spośród imidazolu, 1-(3-aminopropylo)imidazolu oraz mocznika wynosi od 20% wag./obj. do 75% wag./obj.

4. Roztwór według zastrz. 3, znamienny tym, że sumaryczne stężenie kombinacji dwóch spośród imidazolu, 1-(3-aminopropylo)imidazolu oraz mocznika wynosi od 30% wag./obj. do 65% wag./obj.

5. Roztwór według zastrz. 4, znamienny tym, że stężenie kombinacji dwóch spośród imidazolu, 1-(3-aminopropylo)imidazolu oraz mocznika wynosi od 45% wag./obj. do 55% wag./obj.

6. Roztwór według dowolnego spośród zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że stężenie imidazolu wynosi od 25 do 30% wag./obj., stężenie 1-(3-aminopropylo)imidazolu wynosi od 25 do 30% wag./obj., a stężenie mocznika wynosi od 20 do 25% wag./obj.

7. Roztwór według zastrz. 6, znamienny tym, że stężenie imidazolu wynosi 25% wag./obj., stężenie 1-(3-aminopropylo)imidazolu wynosi 30% wag./obj., a stężenie mocznika wynosi od 20% wag./obj.

8. Zastosowanie roztworu określonego w zastrz. 1 do 7 do optycznego oczyszczania i rozszerzania tkanek.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że optycznie oczyszczone i rozszerzone tkanki są obrazowane technikami mikroskopowymi.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że technikami obrazowania mikroskopowego są techniki obrazowania fluorescencyjnego.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że technikami obrazowania fluorescencyjnego są techniki mikroskopii konfokalnej.

12. Zastosowanie według dowolnego spośród zastrz. 8 do 11, znamienne tym, że optycznie oczyszczane i rozszerzane tkanki stanowią skrawki narządów lub całe narządy.

13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że narządy stanowią te wybrane z grupy obejmującej węzły limfatyczne, wątrobę, mózg, płuca, śledzionę, serce, nerki.

14. Zastosowanie według dowolnego spośród zastrz. 9 do 13, znamienne tym, że obrazowanie jest wykonywane w okresie do jednego miesiąca po optycznym oczyszczaniu i rozszerzaniu tkanek.

15. Zastosowanie według dowolnego spośród zastrz. 8 do 14, znamienne tym, że tkanki optycznie oczyszczane i rozszerzane mają grubość od 10 μm do 500 μm.

16. Sposób optycznego oczyszczania i rozszerzania tkanek, znamienny tym, że tkanki o grubości od 10 do 500 μm są inkubowane w roztworze określonym w dowolnym spośród zastrz. 1 do 7.

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że tkanki są inkubowane przez okres 5 do 75 min.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że tkanki o grubości od 40 μm do 200 μm są inkubowane przez okres od 15 do 30 min.

19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że tkanki o grubości 40 μm są inkubowane przez 15 min.

20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że tkanki o grubości 100-200 μm są inkubowane przez 30 min.