PL245307B1 - Aggregation of macrophage membrane vesicles and method of its preparation - Google Patents
Aggregation of macrophage membrane vesicles and method of its preparation Download PDFInfo
- Publication number
- PL245307B1 PL245307B1 PL435582A PL43558220A PL245307B1 PL 245307 B1 PL245307 B1 PL 245307B1 PL 435582 A PL435582 A PL 435582A PL 43558220 A PL43558220 A PL 43558220A PL 245307 B1 PL245307 B1 PL 245307B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- macrophage
- vesicles
- antigen
- membrane vesicles
- evs
- Prior art date
Links
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 title claims abstract description 65
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 title description 16
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 title description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 40
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 15
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 5
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- GSSMIHQEWAQUPM-AOLPDKKJSA-N ovalbumin peptide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CN=CN1 GSSMIHQEWAQUPM-AOLPDKKJSA-N 0.000 description 5
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 108010019759 OVA 323-339 Proteins 0.000 description 3
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 3
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 208000006313 Delayed Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091068656 Mus musculus miR-150 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 208000008425 Protein deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002512 suppressor factor Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania agregatu makrofagowych pęcherzyków błonowych, charakteryzujący się tym, że a) uzyskuje się zewnątrzkomórkowe makrofagowe pęcherzyki błonowe wydzielane przez komórki ekspresjonujące konkretny antygen, b) kontaktuje się pęcherzyki otrzymane w etapie a) z przeciwciałami specyficznymi wobec tego antygenu, c) izoluje się agregaty makrofagowych pęcherzyków błonowych. Zgłoszenie obejmuje także agregatu makrofagowych pęcherzyków błonowych, który zawiera makrofagowe pęcherzyki błonowe prezentujące antygen połączone przeciwciałami specyficznymi wobec tego antygenu.The subject of the application is a method for obtaining an aggregate of macrophage membrane vesicles, characterized by: a) obtaining extracellular macrophage membrane vesicles secreted by cells expressing a specific antigen, b) contacting the vesicles obtained in step a) with antibodies specific to this antigen, c) isolating aggregates of macrophage membrane vesicles. The application also covers an aggregate of macrophage membrane vesicles, which contains macrophage membrane vesicles presenting an antigen linked by antibodies specific for that antigen.
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Przedmiotem wynalazku są makrofagowe pęcherzyki błonowe CD9+ MHC II+ wydzielane przez komórki ekspresjonujące konkretny antygen (w opisanym przykładzie peptyd owoalbuminowy) agregowane za pomocą przeciwciał specyficznych wobec tego antygenu.The subject of the invention are CD9+ MHC II+ macrophage membrane vesicles secreted by cells expressing a specific antigen (in the example described, ovalbumin peptide) aggregated using antibodies specific to this antigen.
Efektem technicznym takiej agregacji jest zwiększenie aktywności biologicznej (w porównaniu z takimi samymi pęcherzykami nieagregowanymi) oraz dłuższy czas ich półtrwania w płynach ustrojowych. Dzięki temu uzyskane zgodnie z wynalazkiem agregaty mogą znaleźć szereg zastosowań w terapii.The technical effect of such aggregation is an increase in biological activity (compared to the same non-aggregated vesicles) and a longer half-life in body fluids. Thanks to this, the aggregates obtained in accordance with the invention can find a number of applications in therapy.
Stan technikiState of the art
W publikacji Bryniarski et al. J Allergy Clin Immunol. 2013 July ; 132(1): 170-181 ujawniono obecność łańcuchów lekkich kappa przeciwciał na błonowych pęcherzykach wydzielanych przez limfocyty T CD8+ supresyjne, które pozwalają na dostarczanie tych pęcherzyków wraz z zawartym w nich miRNA150 do komórek T prezentujących antygen. Mogą być one stosowane w terapii (np. alergii). Uzyskano także pęcherzyki błonowe limfocytów T CD8+ supresyjnych od myszy z niedoborem immunoglobulin i opłaszczano je in vitro łańcuchami lekkimi przeciwciał, jednak nie zaobserwowano agregacji pęcherzyków pod ich wpływem.In the publication by Bryniarski et al. J Allergy Clin Immunol. July 2013 ; 132(1): 170-181 revealed the presence of kappa light chains of antibodies on membrane vesicles secreted by suppressive CD8+ T cells, which allow the delivery of these vesicles together with the miRNA150 contained in them to antigen-presenting T cells. They can be used in therapy (e.g. allergies). Membrane vesicles of suppressive CD8+ T lymphocytes were also obtained from immunoglobulin-deficient mice and coated in vitro with antibody light chains, but no aggregation of vesicles under their influence was observed.
W publikacji Nazimek i wsp. FOLIA MEDICA CRACOVIENSIA Vol. LIV, 1,2014: 37-52 opisano wpływ pęcherzyków wydzielanych przez limfocyty T CD8+ supresyjne na makrofagi.The publication by Nazimek et al. FOLIA MEDICA CRACOVIENSIA Vol. LIV, 1, 2014: 37-52 describes the effect of vesicles secreted by suppressive CD8+ T cells on macrophages.
W publikacji K. Nazimek et al. Immunology, 146, 23-32 „Macrophages play an essential role in antigen-specific immune suppression mediated by T CD8+ cell-derived exosomes” opisano rolę makrofagów w immunosupresyjnym działaniu pęcherzyków wydzielanych przez limfocyty T CD8+ supresyjne.In the publication by K. Nazimek et al. Immunology, 146, 23-32 "Macrophages play an essential role in antigen-specific immune suppression mediated by CD8+ T cell-derived exosomes" describes the role of macrophages in the immunosuppressive effect of vesicles secreted by suppressive CD8+ T cells.
W publikacji Ptak W. i wsp. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2015, „From Mysterious Supernatant Entity to miRNA-150 in Antigen-Specific Exosomes: a History of Hapten-Specific T Suppressor Factor” opisano wcześniejsze prace autorów dotyczące roli i mechanizmu działania pęcherzyków wydzielanych przez limfocyty T CD8+ supresyjne.In the publication Ptak W. et al. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2015, "From Mysterious Supernatant Entity to miRNA-150 in Antigen-Specific Exosomes: a History of Hapten-Specific T Suppressor Factor" describes the authors' previous work on the role and mechanism of action of vesicles secreted by suppressive CD8 + T cells.
W publikacji Nazimek i wsp. „Exosomes as mediators of intercellular communication: clinical implications”, POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2015; 125 (5) na fig. 3 C przedstawiono pęcherzyki pokryte przeciwciałami w celu uzyskania ich selektywnego dostarczania do komórek prezentujących antygen wobec którego specyficzne są te przeciwciała. Nie opisano jednak możliwości wykorzystania przeciwciał do agregacji pęcherzyków.In the publication by Nazimek et al. "Exosomes as mediators of intercellular communication: clinical implications", POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2015; 125 (5), Figure 3 C shows vesicles coated with antibodies to achieve their selective delivery to cells presenting the antigen to which these antibodies are specific. However, the possibility of using antibodies for vesicle aggregation has not been described.
W publikacji Nazimek K, Bryniarski K. „Approaches to inducing antigen-specific immune tolerance in allergy and autoimmunity: Focus on antigen-presenting cells and extracellular vesicles”. Scand J Immunol. 2020 ;91:e12881, na fig. 2 przedstawiono EV opłaszczane łańcuchami lekkimi przeciwciał wykorzystane do ukierunkowanego dostarczania do komórek prezentujących określony antygen.In the publication Nazimek K, Bryniarski K. "Approaches to inducing antigen-specific immune tolerance in allergy and autoimmunity: Focus on antigen-presenting cells and extracellular vesicles." Scand J Immunol. 2020 ;91:e12881, Fig. 2 shows EVs coated with antibody light chains used for targeted delivery to cells presenting a specific antigen.
Jednak w żadnym z dokumentów należących do stanu techniki nie opisano możliwości agregacji EV uzyskiwanej za pomocą przeciwciał specyficznych wobec antygenów obecnych na powierzchni EV.However, none of the prior art documents describes the possibility of EV aggregation achieved using antibodies specific to antigens present on the EV surface.
Nieoczekiwanie, dzięki takiej agregacji przeprowadzonej zgodnie z wynalazkiem uzyskano zwiększenie aktywności biologicznej (w porównaniu z takimi samymi pęcherzykami nieagregowanymi) oraz dłuższy czas ich półtrwania w płynach ustrojowych. Możliwość uzyskania takich efektów nie była sugerowana w najbliższym stanie techniki i stanowi istotę przedmiotowego wynalazku.Surprisingly, such aggregation carried out in accordance with the invention resulted in an increase in biological activity (compared to the same non-aggregated vesicles) and a longer half-life in body fluids. The possibility of obtaining such effects has not been suggested in the prior art and is the essence of the present invention.
Przedmiotem wynalazku jest agregat makrofagowych pęcherzyków błonowych oraz sposób jego otrzymywania szczegółowo zdefiniowane w załączonych zastrzeżeniach patentowych.The subject of the invention is an aggregate of macrophage membrane vesicles and a method of obtaining it, defined in detail in the attached patent claims.
W zaprezentowanych poniżej przykładach przedstawiono porównanie aktywności biologicznej/terapeutycznej oraz czasu półtrwania w płynach ustrojowych EV opłaszczanych łańcuchami lekkimi (a więc EV nieagregowanych) z aktywnością i trwałością EV agregowanych przeciwciałami.The examples presented below compare the biological/therapeutic activity and half-life in body fluids of EVs coated with light chains (i.e. non-aggregated EVs) with the activity and durability of EVs aggregated with antibodies.
Nieoczekiwanie ustalono, że zaproponowana w niniejszym wynalazku agregacja pęcherzyków z ekspresją antygenów zgodności tkankowej za pomocą antygenowo-swoistych przeciwciał znacznie podnosi skuteczność ich terapeutycznego działania i wydłuża czas biologicznego półtrwania w płynach ustrojowych. Zasadniczą korzyścią płynącą z wynalazku jest to, że antygenowo-swoiste przeciwciała agregują tylko homologiczne pęcherzyki (z ekspresją tego samego antygenu), a także są białkami, które fizjologicznie ulegają degradacji proteolitycznej w komórkach, stąd są bezpieczne w terapii in vivo.It was surprisingly found that the aggregation of vesicles expressing histocompatibility antigens using antigen-specific antibodies proposed in the present invention significantly increases the effectiveness of their therapeutic effect and extends the biological half-life in body fluids. The main advantage of the invention is that antigen-specific antibodies aggregate only homologous vesicles (expressing the same antigen), and they are proteins that physiologically undergo proteolytic degradation in cells, hence they are safe in in vivo therapy.
Agregaty EV według wynalazku posiadają szereg zalet, które mogą znaleźć praktyczne zastosowanie.EV units according to the invention have a number of advantages that may find practical application.
Za pomocą agregatów EV według wynalazku może być prowadzona regeneracja tkanek z udziałem komórek macierzystych, np. w uszkodzeniach rdzenia kręgowego. Badania na zwierzętach udowodniły możliwość zastąpienia komórek macierzystych przez wydzielone zewnątrzkomórkowe pęcherzyki błonowe, chociaż ich depozycja w miejscu uszkodzenia jest niższa niż w przypadku komórek [Lankford KL, et al. PLoS One 2018; 13(1): e0190358]. Agregacja pęcherzyków z zastosowaniem antygenowo-swoistych przeciwciał powinna zwiększyć ich dawkę w miejscu docelowego działania (przez wydłużenie czasu biologicznego półtrwania oraz aktywności terapeutycznej).The EV aggregates according to the invention can be used to regenerate tissues with the participation of stem cells, e.g. in spinal cord injuries. Animal studies have proven the possibility of replacing stem cells with secreted extracellular membrane vesicles, although their deposition at the site of damage is lower than in the case of cells [Lankford KL, et al. PLoS One 2018; 13(1):e0190358]. Aggregation of vesicles using antigen-specific antibodies should increase their dose at the site of target action (by extending the biological half-life and therapeutic activity).
Za pomocą agregatów EV według wynalazku może być prowadzona także terapia biologiczna schorzeń alergicznych i autoimmunizacyjnych. Sugeruje się możliwość aktywacji komórek regulacyjnych z zastosowaniem odpowiednio przygotowanych pęcherzyków błonowych, których komórkami docelowymi byłyby limfocyty T [Nazimek K, Bryniarski K. Scand J Immunol. 2020; 91(6): e12881]. Stąd agregacja pęcherzyków z ekspresją antygenów zgodności tkankowej za pomocą antygenowo-swoistych przeciwciał powinna umożliwić efektywne oddziaływanie terapeutyczne na te komórki przez zwiększenie jednorazowej dawki pęcherzyków, a także działanie tylko na antygenowo-swoiste limfocyty T odbierające sygnał od obecnych na pęcherzykach determinant antygenowych.Biological therapy of allergic and autoimmune diseases can also be performed using EV aggregates according to the invention. The possibility of activating regulatory cells using appropriately prepared membrane vesicles is suggested, the target cells of which would be T lymphocytes [Nazimek K, Bryniarski K. Scand J Immunol. 2020; 91(6):e12881]. Hence, aggregation of follicles expressing histocompatibility antigens using antigen-specific antibodies should enable an effective therapeutic effect on these cells by increasing the single dose of follicles, as well as acting only on antigen-specific T lymphocytes receiving a signal from the antigenic determinants present on the follicles.
Za pomocą agregatów EV według wynalazku może być prowadzona także terapia w nowotworzeniu. Opracowano metodę aktywacji przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej z udziałem komórek dendrytycznych pulsowanych antygenami nowotworowymi [Nazimek K, Bryniarski K. Int J Mol Sci. 2020; 21(13): 4623]. Sugeruje się, że ich funkcja również może zostać zastąpiona przez pęcherzyki z ekspresją antygenów zgodności tkankowej umożliwiającą prezentację antygenów nowotworowych i indukcję cytotoksycznej odpowiedzi przeciwnowotworowej [Nazimek K, Bryniarski K. Int J Mol Sci. 2020; 21(13): 4623]. Stąd agregacja pęcherzyków powinna wzmocnić ich efekt terapeutyczny oraz umożliwić działanie antygenowo-swoiste.Cancer therapy can also be performed using EV aggregates according to the invention. A method of activating the anti-tumor immune response using dendritic cells pulsed with tumor antigens was developed [Nazimek K, Bryniarski K. Int J Mol Sci. 2020; 21(13): 4623]. It is suggested that their function may also be replaced by vesicles expressing histocompatibility antigens, enabling the presentation of tumor antigens and the induction of a cytotoxic antitumor response [Nazimek K, Bryniarski K. Int J Mol Sci. 2020; 21(13): 4623]. Hence, vesicle aggregation should enhance their therapeutic effect and enable antigen-specific action.
Za pomocą agregatów EV według wynalazku może być prowadzona także terapia genowa. Coraz większym zainteresowaniem w modulacji procesów patologicznych cieszy się terapia genowa polegająca na wprowadzeniu kwasów nukleinowych (DNA lub RNA) do komórek pacjenta w celu np. aktywacji syntezy białek u osób z ich niedoborami [Darband SG, et al. J Control Release 2018; 289: 158-170; Orefice NS. Pharmaceutics 2020; 12(8): 705]. Problemem jest natomiast dostarczenie materiału genetycznego do konkretnych komórek docelowych. Zgodnie z wynalazkiem przewiduje się możliwość zastosowania w tym celu odpowiednio przygotowanych pęcherzyków błonowych według wynalazku. Agregacja pęcherzyków powinna wzmocnić ich efekt terapeutyczny przez zwiększenie dawki oraz selektywność antygenową wiązania się do komórek docelowych.Gene therapy can also be performed using the EV aggregates according to the invention. Gene therapy, which involves the introduction of nucleic acids (DNA or RNA) into the patient's cells in order to, for example, activate protein synthesis in people with protein deficiencies, is becoming more and more popular in the modulation of pathological processes [Darband SG, et al. J Control Release 2018; 289: 158-170; Orefice NS. Pharmaceuticals 2020; 12(8): 705]. The problem, however, is the delivery of genetic material to specific target cells. According to the invention, it is possible to use appropriately prepared membrane vesicles according to the invention for this purpose. Vesicle aggregation should enhance their therapeutic effect by increasing the dose and antigen selectivity of binding to target cells.
Dostrzeżono możliwość modulacji odpowiedzi immunologicznej przez dostarczane z pęcherzykami biologicznie aktywne cząsteczki obecne np. w mleku matki i w mleku krowim [Kandimalla R, et al. Am J Reprod Immunol. 2020; nr artykułu: e13349; O'Reilly D, et al. Adv Nutr. 2020; nr artykułu: nmaa094]. Prowadzona zgodnie z wynalazkiem agregacja pęcherzyków obecnych w produktach spożywczych, przede wszystkim w żywności specjalnego przeznaczenia medycznego, powinna istotnie zwiększyć ich aktywność terapeutyczną, między innymi przez zwiększenie resorpcji pęcherzyków z jelit do krążenia.The possibility of modulation of the immune response by biologically active molecules delivered with the vesicles, present e.g. in mother's milk and cow's milk, has been noticed [Kandimalla R, et al. Am J Reprod Immunol. 2020; article no.: e13349; O'Reilly D, et al. Adv Nutr. 2020; article no.: nmaa094]. The aggregation of vesicles present in food products, especially food for special medical purposes, carried out in accordance with the invention should significantly increase their therapeutic activity, among others, by increasing the resorption of vesicles from the intestines into the circulation.
Przykład 1. Sposób otrzymywania EV agregowanych przeciwciałami.Example 1. Method of obtaining EVs aggregated with antibodies.
Makrofagi otrzewnowe są otrzymywane od myszy, którym 5 dni wcześniej podano dootrzewnowo olej mineralny dla indukcji wysięku otrzewnowego oraz które dwukrotnie (5 i 4 dni wcześniej) immunizowano śródskórnie owoalbuminą dla zapewnienia zdolności tych komórek do ekspresji peptydu owoalbuminowego w kontekście cząsteczek MHC II. Pobrane makrofagi otrzewnowe są następnie inkubowane z zawierającymi miRNA-150 pęcherzykami limfocytów T CD8+ supresyjnych przez 30 minut w 37°C. Zastosowano mysie miRNA-150 czyli tzw. mmu-mir-150-5p o sekwencji przedstawionej jako Sekw. Id. Nr. 1. Po odpłukaniu nadmiaru pęcherzyków limfocytów T CD8+ supresyjnych przez wirowanie przy 300 g, makrofagi są hodowane w standardowych warunkach (37°C, 5% CO2) w podłożu bezbiałkowym Mishell-Dutton przez 48 godzin. Zewnątrzkomórkowe pęcherzyki błonowe (EV) wydzielane przez mysie makrofagi (wcześniej traktowane zawierającymi miRNA-150 pęcherzykami limfocytów T CD8+ supresyjnych) są izolowane z nadsączu z 48-godzinnej hodowli makrofagów przez wirowanie (300 g) dla usunięcia detrytusu komórkowego, następnie seryjne ultrafiltrowanie przez sączki molekularne (średnica porów 0.45 oraz 0.22 μm), oraz ultrawirowanie przy 100000 g przez 70 minut. EV znajdujące się w pelecie po ultrawirowaniu zostają zawieszone w buforowanej fosforanami soli fizjologicznej (DPBS).Peritoneal macrophages are obtained from mice that were intraperitoneally administered 5 days earlier with mineral oil to induce peritoneal exudate and that were immunized intradermally twice (5 and 4 days earlier) with ovalbumin to ensure the ability of these cells to express ovalbumin peptide in the context of MHC II molecules. The collected peritoneal macrophages are then incubated with miRNA-150-containing suppressor CD8+ T cell vesicles for 30 minutes at 37°C. Mouse miRNA-150 was used, i.e. the so-called mmu-mir-150-5p with the sequence shown as SEQ. Id. No. 1. After washing away excess suppressive CD8+ T cell follicles by centrifugation at 300 g, macrophages are cultured under standard conditions (37°C, 5% CO2) in Mishell-Dutton protein-free medium for 48 hours. Extracellular membrane vesicles (EVs) secreted by murine macrophages (previously treated with miRNA-150-containing suppressor CD8+ T cell vesicles) are isolated from the supernatant of a 48-hour macrophage culture by centrifugation (300 g) to remove cellular detritus, followed by serial ultrafiltration through molecular filters (pore diameter 0.45 and 0.22 μm), and ultracentrifugation at 100,000 g for 70 minutes. EVs contained in the pellet after ultracentrifugation are suspended in phosphate-buffered saline (DPBS).
Tak przygotowane EV, zawieszone w objętości około 100 μΙ DPBS, są inkubowane z komercyjnie dostępnymi, antygenowo-swoistymi przeciwciałami klasy IgG (np. poliklonalne królicze przeciwciała IgG anty-peptyd owoalbuminowy 323-339) w proporcji 6 μg przeciwciał na 1 x 1010 pęcherzyków (EV) przez 12 godzin na lodzie (tj. w temperaturze ok. 1°C). Następnie, poprzez kolejne ultrawirowanie przy 100000 g przez 70 minut, usuwany jest nadmiar przeciwciał, a agregowane EV znajdujące się w pelecie są delikatnie zawieszane w DPBS i bezpośrednio używane do testów biologicznych in vivo lub in vitro.EVs prepared in this way, suspended in a volume of approximately 100 μΙ DPBS, are incubated with commercially available, antigen-specific IgG antibodies (e.g. polyclonal rabbit IgG anti-ovalbumin peptide antibodies 323-339) in a proportion of 6 μg of antibodies per 1 x 10 10 vesicles (EV) for 12 hours on ice (i.e. at a temperature of approximately 1°C). Then, by subsequent ultracentrifugation at 100,000 g for 70 min, excess antibodies are removed, and the aggregated EVs contained in the pellet are gently suspended in DPBS and directly used for in vivo or in vitro bioassays.
Ekspresja peptydu owoalbuminowego 323-339 przez makrofagowe EV wynika z ich wydzielania przez makrofagi ekspresjonujące peptyd owoalbuminowy w kontekście cząsteczek MHC II, a dowodzi jej zdolność makrofagowych EV do swoistego wiązania przeciwciał klasy IgG anty-peptyd owoalbuminowy 323-339.The expression of ovalbumin peptide 323-339 by macrophage EVs results from their secretion by macrophages expressing ovalbumin peptide in the context of MHC II molecules, and is evidenced by the ability of macrophage EVs to specifically bind anti-ovalbumin peptide 323-339 IgG antibodies.
Dla uzyskania makrofagowych EV z ekspresją innego immunogennego antygenu niż owoalbumina (np. kazeiny), makrofagi otrzewnowe są pobierane od myszy immunizowanych śródskórnie tym antygenem (w celu aktywacji ekspresji tegoż antygenu przez makrofagi w kontekście MHC II), a następnie traktowane zawierającymi miRNA-150 pęcherzykami limfocytów T CD8+ supresyjnych i hodowane w tych samych warunkach jak opisano powyżej. Makrofagowe EV z ekspresją innego antygenu są następnie izolowane analogicznie do pęcherzyków makrofagowych wykazujących ekspresję peptydu owoalbuminowego 323-339.To obtain macrophage EVs expressing an immunogenic antigen other than ovalbumin (e.g. casein), peritoneal macrophages are collected from mice intradermally immunized with this antigen (in order to activate the expression of this antigen by macrophages in the context of MHC II) and then treated with vesicles containing miRNA-150 suppressive CD8+ T cells and cultured under the same conditions as described above. Macrophage EVs expressing a different antigen are then isolated analogously to macrophage vesicles expressing ovalbumin peptide 323-339.
Przykład 2. Nieoczekiwane zalety EV agregowanych przeciwciałamiExample 2. Unexpected advantages of antibody-aggregated EVs
a. makrofagowe EV agregowane przeciwciałami mocniej hamują limfocyty T efektorowe w nadwrażliwości typu późnego na owoalbuminę u myszy, niż EV nieagregowane.a. macrophage EVs aggregated with antibodies more strongly inhibit effector T cells in delayed-type hypersensitivity to ovalbumin in mice than non-aggregated EVs.
W celu porównania zdolności oddziaływania na limfocyty T efektorowe przez makrofagowe EV agregowane przeciwciałami lub makrofagowe EV nieagregowane przeprowadzono eksperyment, w którym owoalbuminowo-swoiste limfocyty T efektorowe uzyskane od uczulonych myszy szczepu OT-II inkubowano z makrofagowymi EV nieagregowanymi lub agregowanymi przez 30 minut w temperaturze 37°C, a następnie, po odpłukaniu nadmiaru EV przez wirowanie przy 300 g, adoptywnie transferowano te komórki efektorowe do naiwnych biorców. Po 24 godzinach od transferu komórek, podano biorcom owoalbuminę śródskórnie, w celu wywołania obrzęku małżowiny usznej jako objawu nadwrażliwości typu późnego, mierzonego 24 godziny później śrubą mikrometryczną.In order to compare the ability to influence effector T cells by antibody-aggregated macrophage EVs or non-aggregated macrophage EVs, an experiment was performed in which ovalbumin-specific effector T cells obtained from sensitized OT-II strain mice were incubated with non-aggregated or aggregated macrophage EVs for 30 minutes at 37 °C, and then, after washing off excess EVs by centrifugation at 300 g, these effector cells were adoptively transferred to naïve recipients. 24 hours after cell transfer, ovalbumin was administered intradermally to the recipients to induce auricle edema as a symptom of delayed hypersensitivity, measured 24 hours later with a micrometer screw.
Wyniki eksperymentu przedstawiono na Fig. 1.The experimental results are shown in Fig. 1.
Uzyskane wyniki dowodzą, że aktywność owoalbuminowo-swoistych limfocytów T efektorowych jest znamiennie zahamowana przez pre-inkubację z makrofagowymi EV, przy czym limfocyty T efektorowe pre-inkubowane z makrofagowymi EV agregowanymi istotnie słabiej aktywują nadwrażliwość typu późnego u myszy biorców niż limfocyty T efektorowe pre-inkubowane z makrofagowymi EV nieagregowanymi, udowadniając, iż agregacja makrofagowych EV przeciwciałami znacznie wzmaga ich aktywność biologiczną.The obtained results prove that the activity of ovalbumin-specific effector T cells is significantly inhibited by pre-incubation with macrophage EVs, and effector T cells pre-incubated with aggregated macrophage EVs activate delayed-type hypersensitivity in recipient mice significantly less than pre-incubated effector T cells. incubated with non-aggregated macrophage EVs, proving that aggregation of macrophage EVs with antibodies significantly enhances their biological activity.
b. makrofagowe EV agregowane przeciwciałami hamują limfocyty T efektorowe, pre-inkubowane z peptydem owoalbuminowym w celu zablokowania receptorów TCR, w nadwrażliwości typu późnego na owoalbuminę u myszy, podczas gdy EV nieagregowane nie wykazują aktywności supresyjnej względem limfocytów T efektorowych z zablokowanymi receptorami TCR.b. macrophage EVs aggregated with antibodies inhibit effector T cells, pre-incubated with ovalbumin peptide to block TCR receptors, in delayed-type hypersensitivity to ovalbumin in mice, while non-aggregated EVs do not show suppressive activity against effector T cells with blocked TCR receptors.
W celu porównania zdolności oddziaływania na limfocyty T efektorowe z zablokowanymi receptorami TCR przez makrofagowe EV agregowane przeciwciałami lub makrofagowe EV nieagregowane przeprowadzono eksperyment, w którym owoalbuminowo-swoiste limfocyty T efektorowe uzyskane od uczulonych myszy szczepu OT-II pre-inkubowano z peptydem owoalbuminowych 323-339, a następnie z makrofagowymi EV nieagregowanymi lub agregowanymi przez 30 minut w temperaturze 37°C, a następnie, po odpłukaniu nadmiaru EV przez wirowanie przy 300 g, adoptywnie transferowano te komórki efektorowe do naiwnych biorców. Po 24 godzinach od transferu komórek, podano biorcom owoalbuminę śródskórnie, w celu wywołania obrzęku małżowiny usznej jako objawu nadwrażliwości typu późnego, mierzonego 24 godziny później śrubą mikrometryczną.In order to compare the ability to influence effector T cells with blocked TCR receptors by antibody-aggregated macrophage EVs or non-aggregated macrophage EVs, an experiment was performed in which ovalbumin-specific effector T cells obtained from sensitized OT-II strain mice were pre-incubated with the ovalbumin-323-339 peptide. , then with unaggregated or aggregated macrophage EVs for 30 min at 37°C, and then, after washing off excess EVs by centrifugation at 300 g, these effector cells were adoptively transferred to naïve recipients. 24 hours after cell transfer, ovalbumin was administered intradermally to the recipients to induce auricle edema as a symptom of delayed hypersensitivity, measured 24 hours later with a micrometer screw.
Wyniki eksperymentu przedstawiono na Fig. 2.The experimental results are shown in Fig. 2.
Uzyskane wyniki dowodzą, że aktywność owoalbuminowo-swoistych limfocytów T efektorowych traktowanych peptydem owoalbuminowym 323-339 dla zablokowania receptorów TCR jest znamiennie zahamowana jedynie przez pre-inkubację z makrofagowymi EV agregowanymi, a makrofagowe EV nieagregowane nie są zdolne do zahamowania limfocytów T efektorowych z zablokowanym receptorem TCR, udowadniając, iż agregacja makrofagowych EV przeciwciałami znacznie rozszerza zakres ich aktywności biologicznej.The obtained results prove that the activity of ovalbumin-specific effector T cells treated with ovalbumin peptide 323-339 to block TCR receptors is significantly inhibited only by pre-incubation with aggregated macrophage EVs, and non-aggregated macrophage EVs are not able to inhibit receptor-blocked effector T cells. TCR, proving that the aggregation of macrophage EVs with antibodies significantly expands the scope of their biological activity.
Na Fig. 3 zaprezentowano postulowany mechanizm wzmożenia aktywności makrofagowych EV agregowanych przeciwciałami w hamowaniu limfocytów T efektorowych, pre-inkubowanych lub nie z peptydem owoalbuminowym w celu zablokowania receptorów TCR, w porównaniu do EV nieagregowanych.Fig. 3 presents the postulated mechanism of enhanced activity of macrophage EVs aggregated with antibodies in inhibiting effector T cells, pre-incubated or not with ovalbumin peptide to block TCR receptors, compared to non-aggregated EVs.
c. EV wydzielane przez makrofagi (wcześniej traktowane pęcherzykami limfocytów T CD8+ supresyjnych zawierającymi miRNA-150), a otrzymywane od myszy immunizowanych antygenem, wykazują ekspresję CD9 oraz MHC klasy II (I-A/I-E).c. EVs secreted by macrophages (previously treated with suppressive CD8+ T cell vesicles containing miRNA-150), and obtained from mice immunized with the antigen, express CD9 and MHC class II (I-A/I-E).
W celu udowodnienia pęcherzykowej natury makrofagowych EV oraz ich zdolności do wiązania przeciwciał anty-owoalbuminowych związanej z ekspresją MHC klasy II przeprowadzono eksperyment, w którym makrofagowe EV uzyskane od uczulonych myszy OT-II, po opłaszczeniu na kulkach lateksowych, znakowano przeciwciałami skoniugowanymi z fluorochromami, a następnie poddano analizie cytometrycznej.In order to prove the vesicular nature of macrophage EVs and their ability to bind anti-ovalbumin antibodies related to the expression of MHC class II, an experiment was performed in which macrophage EVs obtained from sensitized OT-II mice, after coating on latex beads, were labeled with antibodies conjugated with fluorochromes, and then subjected to cytometric analysis.
Wyniki eksperymentu przedstawiono na Fig. 4.The experimental results are shown in Fig. 4.
Uzyskane wyniki dowodzą, że makrofagowe EV wykazują ekspresję CD9, wskazującą na ich pęcherzykową naturę, oraz że wykazują ekspresję cząsteczek MHC klasy II (I-A/I-E), w kompleksie z którymi mogą wiązać się determinanty antygenowe, następnie wiążące przeciwciała, które agregują makrofagowe EV.The obtained results prove that macrophage EVs express CD9, indicating their vesicular nature, and that they express MHC class II molecules (I-A/I-E), in a complex to which antigenic determinants can bind, and then binding antibodies that aggregate macrophage EVs.
d. CD9+MHC II+ EV wydzielane przez makrofagi (wcześniej traktowane pęcherzykami limfocytów T CD8+ supresyjnych zawierającymi miRNA-150), a otrzymywane od myszy immunizowanych owoalbuminą, wiążą przeciwciała anty-peptyd owoalbuminowy 323-339.d. CD9+MHC II+ EVs secreted by macrophages (previously treated with suppressive CD8+ T cell vesicles containing miRNA-150), and obtained from ovalbumin-immunized mice, bind anti-ovalbumin peptide antibodies 323-339.
W celu ostatecznego udowodnienia zdolności makrofagowych EV do wiązania przeciwciał antypeptyd owoalbuminowy 323-339 przeprowadzono eksperyment, w którym makrofagowe EV uzyskane od uczulonych myszy OT-II inkubowano albo z kontrolnymi przeciwciałami izotypowymi, albo z przeciwciałami anty-peptyd owoalbuminowy 323-339 przez noc na lodzie, a następnie, po opłaszczeniu na kulkach lateksowych, znakowano przeciwciałami skoniugowanymi z fluorochromami lub streptawidynąFITC i poddano analizie cytometrycznej.To definitively prove the ability of macrophage EVs to bind ovalbumin anti-peptide 323-339 antibodies, an experiment was performed in which macrophage EVs obtained from sensitized OT-II mice were incubated with either isotype control antibodies or anti-ovalbumin anti-peptide 323-339 antibodies overnight on ice. , and then, after coating on latex beads, they were labeled with antibodies conjugated with fluorochromes or streptavidinFITC and subjected to cytometric analysis.
Wyniki eksperymentu przedstawiono na Fig. 5.The experimental results are shown in Fig. 5.
Uzyskane wyniki dowodzą, że makrofagowe EV uzyskane od uczulonych myszy OT-II swoiście wiążą się z przeciwciałami anty-peptyd owoalbuminowy 323-339, ale nie z przeciwciałami kontrolnymi, udowadniając możliwość agregacji CD9+MHC II+ EV przez swoiste przeciwciała.The obtained results demonstrate that macrophage EVs obtained from sensitized OT-II mice specifically bind to anti-ovalbumin peptide 323-339 antibodies, but not to control antibodies, proving the possibility of aggregation of CD9+MHC II+ EVs by specific antibodies.
e. makrofagowe EV tworzą agregaty po inkubacji z antygenowo-swoistymi przeciwciałami, co potwierdzono w Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).e. macrophage EVs form aggregates after incubation with antigen-specific antibodies, as confirmed by Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) and transmission electron microscopy (TEM).
W celu potwierdzenia, że makrofagowe EV tworzą agregaty po inkubacji z antygenowo-swoistymi przeciwciałami, przeprowadzono eksperyment, w którym makrofagowe EV uzyskane od uczulonych myszy OT-II inkubowano lub nie z przeciwciałami anty-peptyd owoalbuminowy 323-339 przez noc na lodzie, a następnie poddano analizie NTA i TEM.To confirm that macrophage EVs form aggregates after incubation with antigen-specific antibodies, an experiment was performed in which macrophage EVs obtained from sensitized OT-II mice were incubated or not with anti-ovalbumin peptide 323-339 antibodies overnight on ice and then were analyzed by NTA and TEM.
Wyniki eksperymentu przedstawiono na Fig. 6.The experimental results are shown in Fig. 6.
Uzyskane wyniki dowodzą, że makrofagowe EV tworzą agregaty po inkubacji z antygenowo-swoistymi przeciwciałami, czemu dowodzi stwierdzona w NTA obecność cząstek o wielkości przekraczającej 700 nm tylko w preparatach makrofagowych EV pre-inkubowanych z przeciwciałami, a także jednoznacznie zaobserwowana w transmisyjnej mikroskopii elektronowej tendencja do formowania agregatów jedynie w przypadku makrofagowych EV pre-inkubowanych ze swoistymi przeciwciałami.The obtained results prove that macrophage EVs form aggregates after incubation with antigen-specific antibodies, as evidenced by the presence of particles with a size exceeding 700 nm found in NTA only in macrophage EV preparations pre-incubated with antibodies, as well as the tendency clearly observed in transmission electron microscopy aggregate formation only in the case of macrophage EVs pre-incubated with specific antibodies.
PL 245307 Β1PL 245307 Β1
Wykaz sekwencji <110> Uniwersytet Jagielloński <120> Agregat makrofagowych pęcherzyków' błonowych oraz sposób jego otrzymywania <130> PK/7619/RW <160> 1 <170> Patentln yersion 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RN A <213> artificial <220>List of sequences <110> Jagiellonian University <120> Aggregation of macrophage membrane vesicles and method of its preparation <130> PK/7619/RW <160> 1 <170> Patent yersion 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RN A <213> artificial <220>
<223> sekwencja mysiego miRNA-150 znana jako mmu-mir-150-5p <400> 1 ucucccaacc cuuguaccag ug 22<223> mouse miRNA-150 sequence known as mmu-mir-150-5p <400> 1 ucucccaacc cuuguaccag ug 22
Claims (10)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL435582A PL245307B1 (en) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | Aggregation of macrophage membrane vesicles and method of its preparation |
| PCT/PL2021/050069 WO2022075870A1 (en) | 2020-10-05 | 2021-10-05 | Aggregate of macrophage membrane vesicles and preparation method thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL435582A PL245307B1 (en) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | Aggregation of macrophage membrane vesicles and method of its preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL435582A1 PL435582A1 (en) | 2022-04-11 |
| PL245307B1 true PL245307B1 (en) | 2024-06-24 |
Family
ID=78819601
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL435582A PL245307B1 (en) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | Aggregation of macrophage membrane vesicles and method of its preparation |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL245307B1 (en) |
| WO (1) | WO2022075870A1 (en) |
-
2020
- 2020-10-05 PL PL435582A patent/PL245307B1/en unknown
-
2021
- 2021-10-05 WO PCT/PL2021/050069 patent/WO2022075870A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022075870A1 (en) | 2022-04-14 |
| PL435582A1 (en) | 2022-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6207783B2 (en) | Method for the proliferation of antigen-specific T cells | |
| JP5816627B2 (en) | Method for the proliferation of antigen-specific T cells | |
| EP2787005A1 (en) | Targeted cancer immune therapy | |
| Huang et al. | Reactive oxygen species-sensitive biodegradable mesoporous silica nanoparticles harboring TheraVac elicit tumor-specific immunity for colon tumor treatment | |
| WO2012017033A1 (en) | Method of antigen loading for immunotherapy | |
| JP2018537478A (en) | Method for enhancing immune cell activity in vitro (Ex Vivo: Ex vivo) for cancer immunotherapy using small molecule ablation compounds | |
| CN101258238A (en) | Method for activating antigen-presenting cells | |
| Ma et al. | Enhanced presentation of MHC class Ia, Ib and class II-restricted peptides encapsulated in biodegradable nanoparticles: a promising strategy for tumor immunotherapy | |
| AU5622000A (en) | Autologous adoptive immunotherapy with primed antigen-specific t cells or b cells | |
| Shen et al. | Antileukaemia immunity: effect of exosomes against NB4 acute promyelocytic leukaemia cells | |
| JP2023554589A (en) | Methods and compositions for the treatment of immune-mediated diseases | |
| Dang et al. | Dendritic cell‐targeted delivery of antigens using extracellular vesicles for anti‐cancer immunotherapy | |
| US20140037606A1 (en) | Cell-based, anti-cancer vaccines | |
| CN101085349B (en) | Vesicle-directed immune cells and their application in the preparation of antitumor drugs | |
| PL245307B1 (en) | Aggregation of macrophage membrane vesicles and method of its preparation | |
| US20220331415A1 (en) | Immunoactive microparticles and uses thereof | |
| Huang et al. | Microencapsulation of tumor lysates and live cell engineering with MIP-3α as an effective vaccine | |
| JP2023512670A (en) | Cancer immunotherapy using allogeneic, tumor-specific CD4+ T cell injection transplantation | |
| US20240076616A1 (en) | Method for t-cell expansion and related medical applications | |
| US20220304928A1 (en) | Protein producing nanoliposomes and uses thereof | |
| US20160235827A1 (en) | Placental compositions for stimulation of immunity to pd-l1 | |
| CN104726410B (en) | A kind of efflux body and its application with immune suppression function | |
| US10716810B2 (en) | Canine autologous immunotherapy using dendritic cell induced cancer killing immunocytes | |
| 안은경 | Modulation of Immunity by Nanomaterials for the Treatment of Inflammatory Diseases | |
| Jæhger | Preclinical Evaluation of Novel Drug Delivery Platforms for the Improvement of Adoptive T cell Therapy |