PL244819B1 - Związek-marker diagnostyczny raka płuca, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka płuca, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego - Google Patents
Związek-marker diagnostyczny raka płuca, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka płuca, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego Download PDFInfo
- Publication number
- PL244819B1 PL244819B1 PL439760A PL43976021A PL244819B1 PL 244819 B1 PL244819 B1 PL 244819B1 PL 439760 A PL439760 A PL 439760A PL 43976021 A PL43976021 A PL 43976021A PL 244819 B1 PL244819 B1 PL 244819B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- compound
- formula
- lung cancer
- abz
- tyr
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 170
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 129
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 title claims abstract description 128
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 75
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 54
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 12
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 91
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 34
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 33
- KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-nitrobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(O)=O)=C1 KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 20
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 12
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000002271 resection Methods 0.000 claims description 6
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 5-(2-aminoethylamino)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AIUKPEQJKQUQKZ-UHFFFAOYSA-N n'-(2,4-dinitrophenyl)ethane-1,2-diamine Chemical compound NCCNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O AIUKPEQJKQUQKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 25
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 21
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 49
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 49
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 25
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 12
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 8
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- -1 9-fluorenylmethoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100074988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nmp-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tris[(dimethylamino)methyl]phenol Chemical compound CN(C)CC1=CC(CN(C)C)=C(O)C(CN(C)C)=C1 AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 4
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Chemical group 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 3
- HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N (2s)-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3h-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N 0.000 description 2
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CCEJTEOJAKTTFU-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-nitrobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC(N)=CC=C1[N+]([O-])=O CCEJTEOJAKTTFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- AZZLDIDWPZLCCW-ZEWNOJEFSA-N Tyr-Ile-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O AZZLDIDWPZLCCW-ZEWNOJEFSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 2
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]phenyl]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C)=CC=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N 0.000 description 1
- SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CC=C1 SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)butanedioic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- QXVFEIPAZSXRGM-DJJJIMSYSA-N (2s,3s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylpentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QXVFEIPAZSXRGM-DJJJIMSYSA-N 0.000 description 1
- BYGHHEDJDSLEKK-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]benzoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NC1=CC=CC=C1C(O)=O BYGHHEDJDSLEKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N N-phenyl amine Natural products NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest nowy związek chemiczny - marker diagnostyczny — do zastosowania medycznego, dokładniej w diagnostyce nowotworowej, w szczególności w diagnostyce raka płuca. Przedmiotem zgłoszenia jest także sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, w szczególności pochodzącej z komórek raka płuca, z użyciem takiego związku. Przedmiotem zgłoszenia jest ponadto sposób in vitro diagnozowania raka płuca, z użyciem takiego związku, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowanie takiego związku do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca i zastosowanie takiego związku do diagnozowania raka płuca. Przedmiotem zgłoszenia jest także taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny raka płuca oraz o sposób leczenia raka płuc obejmujący etap przeprowadzania sposobu diagnozowania raka płuca jak określono powyżej z zastosowaniem takiego związku.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy związek chemiczny - marker diagnostyczny - do zastosowania medycznego, dokładniej w diagnostyce nowotworowej, w szczególności w diagnostyce raka płuca. Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, w szczególności pochodzącej z komórek raka płuca, z użyciem takie go związku, sposób in vitro diagnozowania raka płuca, z użyciem takiego związku, zestaw zawierający taki związek, taki związek do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca, taki związek do zastosowania do diagnozowania raka płuca, taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny raka płuca.
Stan techniki
W roku 2020 na świecie na raka płuca zachorowało ponad 2,2 mln pacjentów i był on drugim z najczęstszych diagnozowanych nowotworów złośliwych na świecie. Raka płuca charakteryzują późne objawy, bardzo szybki postęp choroby i wysoka śmiertelność. W roku 2020 stał się on przyczyną śmierci niemal 1,8 mln pacjentów. Do roku 2030 rak płuca pozostanie najbardziej śmiertelną chorobą nowotworową. Wczesne stadium i zmiany przedrakowe w przebiegu raka płuca nie wywołują objawów. Z tego powodu wczesne wykrycie choroby jest trudne i dochodzi do niego rzadko. U większości chorych rak ten wykrywany jest przypadkowo jako zmiana ogniskowa w czasie zdjęcia rentgenowskiego wykonywanego intencjonalnie lub z innych powodów. Rozpoznanie wiąże się z przeżyciem 5-letnim jedynie na poziome niższym niż 20%. Obecnie pacjenci są diagnozowani w późnym stadium choroby, w którym leczenie jest bardzo ograniczone. Wczesne wykrycie wiąże się z poprawą rokowania. Leczenie operacyjne raka płuca jest jedyną skuteczną metodą, która może doprowadzić do wyleczenia tego nowotworu. Niestety jedynie około 30% pacjentów, u których został rozpoznany rak płuca, kwalifikuje się do leczenia chirurgicznego. Pięcioletnie przeżycie chorych poddawanych chirurgicznemu leczeniu o założeniu radykalnym wynosi 50%. Nie ma żadnego badania laboratoryjnego, w tym również „markera nowotworowego”, ani zestawu badań, które pozwalałyby na wczesne i pewne rozpoznanie raka płuca. W celu efektywnej diagnostyki stosowane są metody obrazowania takie jak zdjęcie rentgenowskie, tomografia komputerowa, rezonans magnetyczny lub pozytonowy rezonans magnetyczny, a w dalszej kolejności biopsja guza. Niewielka populacja pacjentów (5-10%) wykazuje zmiany w ekspresji określonych genów co predysponuje tę grupę do testów genetycznych.
Wiadomo, że proces inicjacji, wzrostu i przerzutowania komórek nowotworu złośliwego przebiega przy udziale wielu czynników, w tym wielu enzymów, w szczególności enzymów hydrolitycznych, zwłaszcza proteolitycznych. Takie enzymy katalizują rozpad enzymatyczny (hydrolityczny lub proteolityczny) białek i peptydów na mniejsze ich fragmenty. Proces ten umożliwia komórkom nowotworowym rozrost przez kolonizację nowych tkanek, wzmożenie procesu tworzenia naczyń krwionośnych (angiogenezy), co umożliwia efektywne dostarczanie substancji odżywczych do guza nowotworowego. Ponadto, enzymy te powstają także w wyniku obumierania komórek zdrowych na skutek procesu rozrostu guza. Wszystkie te procesy tworzą charakterystyczny i swoisty profil aktywności enzymatycznej (proteolitycznej) komórek nowotworowych, charakterystyczny dla guza nowotworowego.
Znane są w dziedzinie chromogeniczne cząsteczki peptydowe, które ulegają rozpadowi enzymatycznemu na mniejsze fragmenty z powstaniem zmiany lub wzrostu zabarwienia badanego roztworu. Ten efekt chromogeniczny jest następstwem uwalniania chromoforu (np. 4-anilidu lub kwasu 2-aminobenzoesowego) z chromogenicznej cząsteczki peptydowej.
Tego typu chromogeniczne cząsteczki peptydowe i ich zastosowania znane są, przykładowo, z publikacji autorstwa Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W., “The preparation and properties of two new chromogenie substrates of trypsin”, Arch Biochem Biophys., listopad 1961; 95:271-8 oraz Hojo K, Maeda M, Iguchi S, Smith T, Okamoto H, Kawasaki K. Amino acids and peptides. XXXV. “Facile preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method”, Chem Pharm Bull (Tokyo), listopad 2000; 48(11): 1740-4.
Jak dotąd nie opisano jednak zastosowania tej klasy związków w diagnostyce raka płuca. W stanie techniki znane są także sposoby otrzymywania peptydów chromogenicznych polegające na przyłączaniu poszczególnych elementów składowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych. Taki proces przyłączania składa się z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) są przyłączane, pozostałości odmywane i kolejno grupy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla każdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od żywicy poprzez reakcję w warunkach kwasowych. Kolejno roztwór oddzielany jest od żywicy w procesie sączenia, a następnie z otrzymanego roztworu peptyd wytrącany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym.
W stanie techniki nie są znane jednakże ani chromogeniczne związki peptydowe odpowiednie do swoistego i wczesnego diagnozowania raka płuca, ani sposoby ich otrzymywania.
W dziedzinie istnieje zatem pilne zapotrzebowanie na „marker nowotworowy” raka płuca, który pozwalałby na wczesne, czułe i swoiste rozpoznanie raka płuca w sposób nieinwazyjny i wiarygodny oraz na sposoby diagnostyczne i sposoby leczenia wykorzystujące taki marker diagnostyczny.
Celem wynalazku jest zatem dostarczenia nowego, swoistego markera diagnostycznego raka płuca oraz sposobów diagnostycznych wykorzystujących taki marker do bezinwazyjnego, szybkiego, czułego, swoistego, wczesnego wykrywania raka płuca, który byłby odpowiedni także do badań przesiewowych, a także sposobów leczenia wykorzystujących taki marker. Cele te zrealizowano dzięki wynalazkom zdefiniowanym w załączonych zastrzeżeniach patentowych, przy czym korzystne jego warianty zostały zdefiniowane w zastrzeżeniach zależnych.
Krótki opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest związek o wzorze 1:
X11-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym związek ten ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Tyr-Ile-Phe-Arg-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
Taki związek według wynalazku ulega korzystnie rozpadowi hydrolitycznemu, korzystniej proteolitycznemu.
Korzystnie w związku według wynalazku para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej si z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), korzystniej parę C1 i C2 stanowi (ABZ)/pNA lub ABZ/ANB-NH2.
Korzystnie związek według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA (wzór 3). Korzystniej związek według wynalazku ulega rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, pochodzącej z komórek raka płuca, obejmujący:
a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem o wzorze 1:
X11-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Tyr-Ile-Phe-Arg-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2), i
b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku aktywność enzymatyczną stanowi korzystnie aktywność hydrolityczna, korzystniej aktywność proteolityczna.
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku jako wspomniany związek korzystnie stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA (wzór 3).
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku jako wspomniany płyn ustrojowy stosuje się mocz, korzystnie mocz ludzki.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro diagnozowania raka płuca, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka płuca u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka płuca, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka płuca, i przy czym do pomiaru wspomnianej aktywności enzymatycznej stosuje się związek o wzorze 1:
X11-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X 1-Tyr-Ile-Phe-Arg-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka płuca według wynalazku wykrywanie aktywności enzymatycznej przeprowadza się sposobem wykrywania aktywności enzymatycznej jak określono powyżej.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka płuca według wynalazku wspomnianą próbkę płynu ustrojowego korzystnie inkubuje się ze wspomnianym związkiem w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub pH zasadowym, korzystnie fizjologicznym, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10 korzystnie 1:5 próbki do buforu pomiarowego.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka płuca według wynalazku wspomniany związek korzystnie stosuje się w stężeniu 0,1-10 mg/ml, w szczególności 0,25-7,5 mg/ml. W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka płuca według wynalazku jako wspomniany związek korzystnie stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka płuca według wynalazku jako wspomnianą próbkę korzystnie stosuje się próbkę moczu, korzystniej moczu ludzkiego.
W takim sposobie wykrywania/diagnozowania raka płuca według wynalazku pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej korzystnie obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300500 nm, korzystniej 380-430 nm, w szczególności 405 ran, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedziału 25-40°C, korzystniej 36-38°C. Przedmiotem wynalazku jest ponadto zestaw zawierający dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej i bufor pomiarowy.
W takim zestawie według wynalazku związek korzystnie stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA.
Przedmiotem wynalazku jest także dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca.
Przedmiotem wynalazku jest również z dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania do diagnozowania raka płuca.
Korzystnie w takim zastosowaniu diagnozowanie raka płuca obejmuje wykrywanie pierwotnego raka płuca, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka płuca i/lub wykrywanie wznowy raka płuca.
Korzystnie związek w takich zastosowaniach według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka płuca. Korzystnie jako taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA.
Zgodnie z wynalazkiem opisano tu sposób leczenia raka płuca, w którym
a) wykrywa się obecność aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca dowolnym sposobem jak określono powyżej w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego, i
b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi się występowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej, podejmuje się leczenie raka płuca u osobnika.
W takim sposobie leczenia, po zakończeniu leczenia zgodnie z punktem b), można przeprowadzać monitorowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca w określonych odstępach czasu.
W takim sposobie leczenia jako próbkę można stosować próbkę moczu, na przykład moczu ludzkiego.
W takim sposobie leczenia jako wspomniany związek można stosować związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA.
Szczegółowy opis wynalazku
Należy rozumieć, że niniejszy wynalazek jest zdefiniowany w załączonych zastrzeżeniach. Niniejszy opis ilustruje różne, nieograniczające, wykonania wynalazku i przykłady jego realizacji. Niniejszy wynalazek nie ogranicza się do jakiejkolwiek konkretnej metodologii, protokołu czy odczynników stosowanych do jego realizacji, o ile nie wskazano inaczej. Zastosowane pojęcia oraz określenia naukowe i techniczne mają znaczenia powszechnie znane i stosowane przez specjalistów w dziedzinie niniejszego wynalazku. Dla wyjaśnienia jednak następujące określenia i skróty zastosowane w opisie i zastrzeżeniach patentowych, należy rozumieć następująco:
Związek chromogeniczny lub inaczej cząsteczka chromogeniczna oznacza związek posiadający właściwości chromogeniczne. Właściwości chromogeniczne oznaczają zdolność związku do tworzenia produktu barwnego.
Związek fluorescencyjny lub inaczej cząsteczka fluorogeniczna oznacza związek posiadający właściwości fluorogeniczne. Właściwości fluorogeniczne oznaczają zdolność związku do tworzenia produktu emitującego fluorescencję.
NMP to N-metylopirolidon; DMF to dimetyloformamid; DCM to chlorek metylenu, inaczej dichlorometan; pNA to 4-nitroanilina, inaczej para-nitroanilina; ABZ to kwas 2-aminobeznoesowy, ANB-NH2 to amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego; Boc to grupa tert-butyloksykarbonylowa; Fmoc to grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa; zaś TFA to kwas trifluorooctowy.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie rak płuca należy rozumieć jako rak (nowotwór złośliwy) pierwotny płuca rozwijający się z tkanek znajdujących się w płucach. Rakiem płuca jest najczęściej rak niedrobnokomórkowy (ok. 90%); rzadziej drobnokomórkowy. Stosowane tu pojęcie rak płuca obejmuje zatem wszelkie nowotwory złośliwe płuca rozwijające się z tkanek znajdujących się w płucach.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie diagnozowanie raka płuca należy rozumieć jako rozpoznanie tej choroby, w szczególności na jej wczesnym etapie, na którym inne metody diagnostyczne są zbyt mało czułe lub/i swoiste. W stosowanym tu znaczeniu diagnozowanie raka płuca obejmuje także wykrywanie choroby resztkowej po chirurgicznym wycięciu raka płuca oraz wykrywanie wznowy raka płuca po wcześniej zakończonym leczeniu raka płuca.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie leczenie raka płuca należy rozumieć jako leczenie na wczesnym etapie rozwoju choroby, pozwalające na istotne wydłużenie czasu przeżycia oraz poprawę jakości życia chorych.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie monitorowanie należy rozumieć jako diagnostykę choroby resztkowej (ang. Minimal Residual Disease (MRD)) - obecności małej liczby przetrwałych w organizmie (w trakcie leczenia lub w remisji) komórek nowotworowych, w ilościach niewykrywanych standardowo stosowanymi metodami diagnostycznymi.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie osobnik należy rozumieć jako człowieka lub ssaka, u którego podejrzewa się występowanie raka płuca, ewentualnie jako człowieka lub ssaka należącego do grupy zwiększonego ryzyka wystąpienia raka płuca, albo człowieka lub ssaka po resekcji raka płuca, lub po zakończonym leczeniu raka płuca. Osobnikiem jest korzystnie człowiek.
Związki według wynalazku mają właściwości chromogeniczne dzięki obecności chromofora oraz fluorogeniczne, tj. zawierają cząsteczki donora i akceptora fluorescencji. Dzięki swojej budowie, opracowanej w taki sposób, że obserwowany jest wzrost barwy w przedziale długości fali 380-440 nm swoiście w wyniku kontaktu badanej próbki płynu ustrojowego od osobnika badanego z rakiem płuca, a jednocześnie nie jest obserwowany taki efekt w reakcji z próbką płynu ustrojowego osobnika zdrowego lub z diagnozą innego typu nowotworu, związki te pozwalają na wykrywanie aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca, a w szczególności diagnozowanie raka płuca w sposób swoisty i czuły, również na wczesnym etapie rozwoju tego raka. Osobnikiem badanym jest korzystnie człowiek. Płynem ustrojowym jest korzystnie mocz, korzystniej ludzki.
W pierwszym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest nowy związek chemiczny o wzorze 1:
X11-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-X26 (wzór 1), przy czym X1 stanowi pochodna aminokwasowa lub fragment peptydowy zawierający cząsteczkę C1 lub X1 składa się z takiej cząsteczki 1 a X2 stanowi pochodna aminokwasowa lub fragment peptydowy zawierający cząsteczkę C2 lub X1 składa się z takiej cząsteczki C2, przy czym parę cząsteczek
C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji. Cyfry w indeksie górnym oznaczają kolejne pozycje reszt w związku według wynalazku oraz kolejność ich dołączania podczas synt ezy. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem można w tym kontekście wymiennie stosować także zapis wzoru 1 bez podawania numeracji reszt. Rdzeń wszystkich związków według wynalazku stanowi tetrapeptyd o wskazanej sekwencji 4 aminokwasów (Tyr-Ile-Phe-Arg), którą przedstawiono także w Wykazie sekwencji jako sekwencję nr 1.
Związek według ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Tyr-Ile-Phe-Arg-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2. Taki mierzalny sygnał optyczny jest mierzony sposobem pomiaru zmiany absorpcji/fluorescencji po rozpadzie enzymatycznym związku. Korzystnie cząsteczki C1 i C2 są rozdzielone od siebie nie więcej niż 10 resztami aminokwasowymi, co zapewnia w ydajne wygaszanie donora fluorescencji przez akceptor fluorescencji. Dla znawcy oczywistym jest, że kluczowym czynnikiem jest odległość pomiędzy donorem i akceptorem fluorescencji. Zatem, w przypadkach, gdy sekwencja aminokwasowa oddzielająca cząsteczkę C1 i C2 jest zwinięta w skręconą lub skondensowaną strukturę drugorzędową, skutkującą zbliżeniem cząsteczek C1 i C2 w stosunku do struktury pierwszorzędowej, odległość między cząsteczkami C1 i C2 może być większa niż 10 reszt aminokwasowych.
Taki związek, dzięki swoim właściwościom chromogenicznym oraz posiadaniu miejsca reaktywnego w pozycji 5 pozwalającego na rozpad enzymatyczny (korzystnie proteolityczny) na mniejsze fragmenty, jest szczególnie odpowiedni do stosowania go jako marker diagnostyczny, w szczególności swoisty marker diagnostyczny raka płuca, w szczególności do zastosowania we wczesnym wykrywaniu raka płuca.
W korzystnych wykonaniach związek według wynalazku ulega rozpadowi hydrolitycznemu, korzystniej proteolitycznemu.
W korzystnych wykonaniach para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), przy czym korzystniej parę cząsteczek C1 i C2 stanowi ABZ/pNA lub ABZ/ANB-NH2.
W korzystnych wykonaniach związek według wynalazku stanowi:
związek o wzorze 2:
ABZ1-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-ANB6-NH2 (wzór 2), lub związek o wzorze 3 :
ABZ1-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-pNA6 (wzór 3), w których ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego, zaś pNA oznacza 4-anilinę.
Taki związek ulega korzystniej rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2 w przypadku związku o wzorze 2, zaś w przypadku związku o wzorze 3 z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-OH oraz fragmentu 2: pNA. Fragmenty 2 stanowią zatem chromofory w postaci wolnej.
Separacja przestrzenna cząsteczek C1 i C2 będąca następstwem rozpadu enzymatycznego związku według wynalazku powoduje powstanie mierzalnego sygnału optycznego, ponieważ fluorescencja emitowana z donora fluorescencji nie jest już wygaszana przez akceptor fluorescencji. Taki mierzalny sygnał optyczny można wykrywać korzystnie przy długości fali 300-500 nm, korzystniej 380-430 nm.
Związki według wynalazku można otrzymywać znanymi sposobami. Przykładowo można je otrzymać z zastosowaniem sposobu otrzymywania peptydów chromogenicznych polegającego na prowadzeniu procesu na nośniku w postaci żywicy, posiadającej grupę Fmoc, którą usuwa się w trakcie prowadzenia reakcji. Przykładowo może to być żywica amidowa, np. TentaGel S RAM lub RinkAmide, ale można także zastosować dowolną inną żywicę dostępną na rynku. Używana żywica do prowadzenia tego procesu powinna zostać odpowiednio przygotowana. Przygotowanie tej żywicy polega na zwiększeniu jej objętości poprzez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi. Korzystnie stosuje się żywicę o osadzeniu 0,23 mmol/g. Z żywicy tej należy usunąć grupę ochronną Fmoc poprzez przemywanie 20% roztworem rozpuszczalnika.
Następnie, znane procesy otrzymywania peptydów chromogenicznych obejmują przyłączanie poszczególnych elementów składowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych.
Ten proces przyłączania składa się z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) są przyłączane, pozostałości odmywane i kolejno grupy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla każdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od żywicy poprzez reakcję w warunkach kwasowych. Następnie roztwór oddzielany jest od żywicy w procesie sączenia, a następnie z otrzymanego roztworu peptyd wytrącany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym. Uzyskany w ten sposób osad peptydu jest wirowany.
Przykładowy, szczegółowy ale nieograniczający, sposób syntezy związków według wynalazku opisano poniżej i w przykładzie 1 poniżej.
Sposób syntezy związków według wynalazku polega na tym, że proces prowadzi się na nośniku w postaci żywicy, korzystnie posiadającej grupę Fmoc, przy czym nośnik przed rozpoczęciem procesu przygotowuje się poprzez zwiększenie jego objętości przez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi, korzystnie dimetyloformamidem, chlorkiem metylenu lub N-metylopirolidonem, i usunięcie grupy ochronnej Fmoc, korzystnie poprzez przemywanie 10-30% roztworem piperydyny, w rozpuszczalnikach, takich jak dimetyloformamid, chlorek metylenu lub N-metylopirolidon. Następnie przeprowadza się sposób w kolejnych etapach:
a) osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego ANB (lub innego chromoforu odpowiedniego do zastosowania zgodnie z wynalazkiem jak zdefiniowano w zastrzeżeniach) na żywicy poprzedza się przemyciem nośnika 3-6% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF, po czym przygotowuje się roztwór ANB w DMF, do którego dodaje się kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6, tak przygotowaną mieszaninę dodaje się do żywicy i miesza się do uzyskania jednorodności, po czym żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i przemywa rozpuszczalnikami, takimi jak DMF, DCM i izopropanolem, a następnie kontynuuje się przyłączanie ANB do żywicy poprzez zastosowanie heksafluorofosforanu O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowego (HATU), a potem heksafluorofosforanu O -(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowego (HBTU) w ilościach nadmiarowych, a po zakończeniu przemywa się nośnik kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i łagodnie suszy się;
b) przyłączanie reszty aminokwasowej do ANB prowadzi się poprzez reakcję z pochodną aminokwasową Fmoc-Arg(Pbf)-OH, przy czym co najmniej pięciokrotny nadmiar molowy pochodnej aminokwasowej w stosunku do żywicy rozpuszcza się w bezwodnej pirydynie i kontaktuje się z żywicą z osadzonym ANB, po czym całość chłodzi się do temperatury nie niższej niż -20°C, a następnie dodaje się POCh w stosunku 1:1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej i całość miesza się, po czym proces mieszania prowadzi się w temperaturze pokojowej, a następnie w podwyższonej temperaturze, zaś po zakończeniu reakcji żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa się DMF oraz MeOH i łagodnie suszy się, po czym uzyskany związek przejściowy poddaje się procesowi acylowania przyłączając kolejno fragment:Tyr-Ile-Phe;
c) acylowanie uzyskanego związku przejściowego prowadzi się przy zastosowaniu pochodnej aminokwasowej, korzystnie Fmoc-Phe-OH, i kolejno Fmoc-Ile-OH, następnie Fmoc-Tys(tBu)-OH i w końcowym etapie syntezy Boc-Abz-OH, przy czym acylowanie prowadzi się etapowo od reszty 6 do 1 z wykorzystaniem diizopropylokarbodiimidu jako środka sprzęgającego, który stosuje się w nadmiarze, a po zakończeniu każdego etapu żywicę przemywa się DMF, i korzystnie podaje testowi chloroanilowemu (test na obecność wolnych grup aminowych), w którym monitoruje się przyłączenia pochodnej aminokwasowej;
d) usunięcie grupy ochronnej Fmoc prowadzi się poprzez przemywanie roztworem 10-30% piperydyny w DMF i kolejnymi przemywaniami każdym z rozpuszczalników: DMF, izopropanolem i chlorkiem metylenu,
e) odszczepianie peptydu od żywicy przeprowadza się stosując mieszaninę TFA:fenol:woda:TIPS przy zachowaniu stosunków odpowiednio 88:5:5:2 v/v/v/v, przy czym mieszaninę miesza się przez okres co najmniej jednej godziny, korzystnie trzy godziny, a uzyskany osada odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym przemywa się eterem dietylowym i uzyskany peptyd odwirowuje się;
f) przygotowanie gotowego produktu przeprowadza się poprzez rozpuszczenie peptydu w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddaje liofilizacji.
W drugim aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej, korzystnie proteolitycznej, obecnej w płynie ustrojowym osobnika, w szczególności pochodzącej z komórek raka płuca, obejmujący a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem według wynalazku i b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek obecnych w związku według wynalazku C1 i C2. W korzystnym wykonaniu tego aspektu osobnikiem badanym jest w takim przypadku człowiek. W innym korzystnym wykonaniu tego aspektu płynem ustrojowym jest mocz, w szczególności ludzki.
W korzystnym wykonaniu tego aspektu stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA.
W trzecim aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest sposób in vitro diagnozowania raka płuca, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka płuca u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej, swoistej dla raka płuca, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka płuca, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka płuca, i przy czym do pomiaru w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej jak określono powyżej stosuje się dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej. Takie wykrywanie aktywności enzymatycznej korzystnie przeprowadza się z zastosowaniem sposobów wykrywania aktywności enzymatycznej jak omówiono powyżej. W korzystnym wykonaniu tego aspektu osobnikiem jest człowiek. W korzystnym wykonaniu tego aspektu płynem ustrojowym jest mocz, w szczególności ludzki. W korzystnym wykonaniu tego aspektu aktywność enzymatyczną swoistą dla raka płuca stanowi aktywność proteolityczna. W korzystnym wykonaniu tego aspektu stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA.
Ponadto, w korzystnym wykonaniu tego aspektu pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej w sposobach według wynalazku obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, zwłaszcza 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze w zakresie 25-40°C, korzystnie 36-38°C. Dzięki, czemu otrzymuje się maksymalnie intensywny mierzalny optyczny sygnał wynikający ze wzrostu absorbancji lub fluorescencji.
Ponadto, w korzystnych wykonaniach wspomnianych sposobów według wynalazku prowadzi się pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej z zastosowaniem związku według wynalazku w zakresie stężeń 0,1-10 mg/ml, korzystniej w stężeniu 1 mg/ml. w korzystnych wykonaniach wspomnianych sposobów według wynalazku badaną próbkę inkubuje się ze związkiem według wynalazku w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub zasadowym, korzystnie fizjologicznym, z próbką płynu ustrojowego, korzystnie ludzkiego moczu, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10, korzystnie 1:5 próbki (np. moczu) do buforu pomiarowego. Próbka korzystnie pochodzi od osoby skierowanej do diagnozy raka płuca. Korzystnie mierzy się intensywność absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, zwłaszcza 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze w zakresie 25-40°C, korzystnie 36-38°C. W powyższych warunkach otrzymujemy maksymalnie intensywny mierzalny sygnał optyczny wynikający ze wzrostu absorbancji lub fluorescencji.
W czwartym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zestaw zawierający dowolny związek według wynalazku i bufor pomiarowy. Bufory pomiarowe znane są w dziedzinie, przy czym odpowiedni do zastosowania w zestawie według wynalazku bufor to na przykład, ale nieograniczająco, bufor Tris-HCl. W korzystnym wykonaniu w takim zestawie według wynalazku wspomniany związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA.
W piątym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca. W szóstym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania do diagnozowania raka płuca. Korzystnie diagnozowanie raka płuca obejmuje zgodnie z wynalazkiem wykrywanie pierwotnego raka płuca, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka płuca i/lub wykrywanie wznowy raka płuca po zakończonym wcześniej leczeniu raka płuca.
W siódmym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka płuca. W korzystnych wykonaniach tego aspektu takim związkiem jest związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-IIe-Phe-Arg-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA
Opisano tu również sposób leczenia raka płuca, w którym
a) wykrywa się obecność aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca dowolnym sposobem według wynalazku jak określono powyżej w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego, i
b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi się występowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej, podejmuje się leczenie raka płuca u osobnika.
W jednym wariancie takiego sposobu leczenia po zakończeniu leczenia zgodnie z punktem b), można przeprowadzać monitorowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca w określonych odstępach czasu jak wiadomo w dziedzinie, np. co tydzień, co kilka tygodni, co miesiąc, co kilka miesięcy, co rok lub w dowolnych innych odstępach uznanych przez specjalistę za stosowne, celem wykrywania choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka płuca lub pojawienia się wznowy. Ponadto, w jednym wariancie takiego sposobu leczenia jako próbkę do badania można stosować próbkę moczu, korzystnie moczu ludzkiego. W innym wariancie takiego sposobu leczenia jako wspomniany związek można stosować związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA (wzór 3).
Zalety niniejszego wynalazku polegają na dostarczeniu nowego związku chemicznego o właściwościach sprawiających, że nadaje się on do zastosowania do czułego i swoistego wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca, do zastosowania jako biomarker diagnostyczny do wykrywania raka płuca, do zastosowania do szybkiego, bezinwazyjnego diagnozowania raka płuca, pozwalającego przy tym na wykrywanie raka płuca na wczesnym etapie jego rozwoju. Kolejną zaletą jest to, że sposoby diagnostyczne według wynalazku mogą być z powodzeniem stosowane w badaniach przesiewowych. Daje to możliwość wykonania pełnej diagnostyki na wczesnym etapie rozwoju nowotworu i w konsekwencji skuteczniejszego leczenia. Wczesne rozpoznanie daje możliwość leczenia operacyjnego, które znacząco wydłuża przeżycie pacjenta. Jest to także istotne w przypadku monitorowania skuteczności przeprowadzonego leczenia chirurgicznego i/lub chemioterapeutycznego raka płuca, dzięki możliwości wykrywania choroby resztkowej lub ewentualnej wznowy.
Niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany na poniższych figurach i w poniższych przykładach, które jednak nie mają na celu ograniczenia w żaden sposób zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzeżeniach patentowych.
Krótki opis figur
Fig. 1 przedstawia wyniki analizy chromatograficznej rozpadu substratu, tj. ABZ-Tyr-Ile-Phe-ArgANB-NH2, w próbce moczu od osobnika z rakiem płuca.
Fig. 2 przedstawia stopień hydrolizy substratu - ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 - w próbkach moczu ze zdiagnozowanym rakiem płuca (próbki 1-50) i moczu pochodzących od osób zdrowych (1Z-25Z). Cyfry arabskie oznaczają numer wybranej próbki moczu.
Fig. 3 przedstawia selektywność hydrolizy substratu - ABZ1-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-ANB6-NH2 (tj. związku o wzorze 2) w próbkach moczu ze zdiagnozowanym rakiem płuca (próbka 1) i moczu pochodzącym od osób z diagnozą innej choroby nowotworowej (próbki 2-9). Cyfry arabskie oznaczają numery poszczególnych rodzajów nowotworów. Badane próbki dla każdego rodzaju nowotworu pochodziły od różnych pacjentów dla każdego z badanych nowotworów. Wyniki oznaczają średnie wartości dla poszczególnych rodzajów nowotworów. Wyniki te wykazują selektywność rozpadu substratu wobec moczu pacjentów z rakiem płuca względem próbek moczu od pacjentów chorych na inne nowotwor y.
Fig. 4 przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu, tj. ABZ1-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-ANB6-NH2, od środowiska pH.
Przykłady
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, niestanowiące jednak jego ograniczenia. O ile nie wskazano inaczej, w poniższych przykładach stosowano znane i/lub komercyjnie dostępne urządzenia, metody, warunki reakcji, odczynniki i zestawy, takie jakie powszechnie stosuje się w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek i jakie są zalecane przez wytwórców odpowiednich odczynników i zestawów.
Przykład 1: Synteza związku według wynalazku
W przykładzie tym przedstawiono syntezę reprezentatywnego związku według niniejszego wynalazku, mianowicie związku: ABZ1-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-ANB6-NH2. Pozostałe peptydy według wynalazku można zsyntetyzować w analogiczny sposób. Cyfry w indeksie górnym oznaczają kolejne pozycje reszt w związku według wynalazku oraz kolejność ich dołączania podczas syntezy. Związki według wynalazku można zamiennie przedstawiać analogicznym wzorem bez podawania pozycji reszt, co nie zmienia kolejności reszt w związkach według wynalazku, gdyż pozostaje ona bez zmian.
1. Otrzymanie peptydu chromogenicznego
a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie peptydu chromogenicznego który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej - na nośniku stałym - z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu, czyli z użyciem osłon.
Związek o sekwencji ABZ1-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-ANB6-NH2, gdzie ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, a ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, zaś ANB to kwas 5-amino-2-benzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych.
Boc-ABZ, Fmoc-Tyr(tBU), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Arg(Pbf).
Syntezę związku według wynalazku, czyli markera diagnostycznego do wykrywania raka płuca, prowadzono na nośniku stałym umożliwiającym przekształcenie kwasu 5-amino-2-beznoesowego w amid ANB-NH2, mianowicie żywicy amidowej TentaGel S RAM firmy RAPP Polymere (Niemcy) o osadzeniu 0,23 mmol/g. Można jednakże zastosować dowolną inną żywicę amidową, np. Rink Amide (Niemcy).
Syntezę związku prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez większość etapów reaktorami była strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.
Wszystkie otrzymywane końcowe związki zawierały w swojej sekwencji w pozycji 1, czyli na N-końcu, kwas 2-aminobenzoesowy (ABZ), zaś w pozycji 6, czyli na C-końcu, cząsteczkę kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB). ABZ pełni tu rolę donora fluorescencji, natomiast ANB - kwas 5-amino-2-benzoesowy pełni rolę wygaszacza fluorescencji i jednocześnie chromoforu. Peptydy w swojej sekwencji zawierały co najmniej i korzystnie jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiędzy resztami aminokwasowymi Asp-ANB-NH2, tj. w pozycji 5 związku. Syntezę polegająca na przyłączaniu pochodnych aminokwasowych prowadzi się od reszty 6 do 1, czyli od końca C do N.
b) Osadzenie ANB na żywicy TentaGel S RAM:
Syntezę peptydów wykonano na żywicy TentaGel S RAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie przygotowano żywicę, w tym dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 1 x 10 minut; IsOH 1 x 10 minut; DCM 1 x 10 minut.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut; 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
c) Test chloranilowy:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu, za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki - do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej ANB (kwasu 5-amino-2-nitrobenozesowego).
d) Osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego na nośniku stałym:
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej - mieszaniny peptydów, było osadzenie ANB na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem chromoforu przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF, DCM i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:
Usunięcie osłony Fmoc-:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
e) Przemywanie
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
f) Test chloranilowy:
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF. Procedurę usuwania osłony Fmoc- oraz cykl przemywań przeprowadzono w naczynku Merrifielda. W osobnej kolbie rozpuszczono ANB w DMF i dodawano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6 v/v/v/v. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania ANB do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O -(7- azabenzotriazol-1-ilo)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan-O -(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N’,N ’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.
g) Przyłączenie C-końcowej reszty aminokwasowej (Fmoc-Asp(OtBu)) do ANB:
Odpowiednią pochodną aminokwasową (9-krotny nadmiar molowy w stosunku do osadzenia żywicy) rozpuszczono w pirydynie i przeniesiono do kolby zawierającej żywicę z osadzonym ANB. Całość chłodzono do uzyskania temperatury -15°C (łaźnia lodowa: 1 cz. wagowa NH4CI, 1 cz. wagowa NaNO3, 1 cz. wagowa lodu). Po osiągnięciu żądanej temperatury dodano POCI3 (w stosunku 1:1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej) i całość mieszano na mieszadle magnetycznym: 20 minut w -15°C, 30 minut w temperaturze pokojowej oraz 6 godzin w 40°C (łaźnia olejowa). Po zakończeniu reakcji żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF oraz MeOH i zostawiono do wysuszenia.
W kolejnym etapie przyłączono resztę w pozycji P2(Fmoc-Phe).
Wszystkie przyłączania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem żywicy za pomocą DMF przez 5 minut. W kolejnych przyłączaniach stosowano diizopropylokarbodiimid jako środek sprzęgający. Procedurę powtarzano dwukrotnie.
Po każdym z acylowań rozpoczynano cykl przemywań żywicy, a następnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przyłączania pochodnej aminokwasowej do wolnych grup aminowych żywicy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzęganiach zabarwienie ziaren najpierw było zielone, a następnie szare, więc konieczne było przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku którego ziarna żywicy badanej testem chloranilowym były bezbarwne. Świadczyło to o przyłączeniu ANB do żywicy TentaGel S RAM, co pozwoliło przejść do następnego etapu syntezy peptydu.
h) Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:
Żywicę wraz z przyłączonym fragmentem ANB-Arg(Pbf) - znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej Phe.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut; 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Ile-OH.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty seryny skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian. Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami
DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - Fmoc-Tyr(tBu) i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.
2. Usuwanie peptydu z nośnika
Po zakończeniu syntezy amid peptydu ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA:fenol:woda:TlPS (88:5:5:2, v/v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.
Po upływie 3 godzin zawartość kolby odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając eterem dietylowym. Powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszczano w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji. W analogiczny sposób można przeprowadzić otrzymywanie pozostałych związków według niniejszego wynalazku.
Potwierdzenie tożsamości/charakterystykę nowego związku według wynalazku przeprowadzono z zastosowaniem analizy HPLC. Warunki tej analizy HPLC były następujące: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8, 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm. Przeprowadzona analiza potwierdziła otrzymanie związku według wynalazku.
Przykład 2: Badanie właściwości peptydu według wynalazku jako markera nowotworowego
Badanie aktywności nowych związków według wynalazku wykonano na grupie 20 chorych z diagnozą raka płuca z wykorzystaniem reprezentatywnego związku według wynalazku. Mechanizm działania związków według wynalazku, w tym reprezentatywnego związku o wzorze 2, polega na swoistym rozpadzie enzymatycznym, dokładniej hydrolizie enzymatycznej, w takim miejscu, które prowadzi do uwolnienia wolnych cząsteczek chromoforów, odpowiednio, ANB-NH2 (amidu kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego) w przypadku związku o wzorze 2 lub pNA (para nitroanilidu) w przypadku związku o wzorze 3, które wykazują absorbancję przy długości fali 320-480 nm, zwłaszcza 380-430 nm, w szczególności 405 nm. Pozostałe związki według wynalazku cechują się analogicznym mechanizmem działania. W tym celu reprezentatywny związek według wynalazku, ABZ1-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5ANB6-NH2, rozpuszczono w dimetylosuflotlenku (w stężeniu 0,5 mg/ml), a następnie 50 μl takiego roztworu zmieszano z 120 μl buforu (200 mM Tris-HCl, pH 8,0) i 80 μl moczu osoby chorej na raka płuca. Pomiar wykonano w płytce 96 dołkowej przeznaczonej do pomiaru absorbancji, a każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach w temperaturze 37°C. Czas trwania pomiaru wynosił 60 minut. W czasie pomiaru monitorowano długość fali charakterystyczną dla uwalniającego się chromoforu (ANB-NH2) przy długości fali 405 nm (zakres 380-430 nm).
Jak pokazano na Fig. 1 analiza RP HPLC losowo wybranego systemu zawierającego mocz pochodzący od osoby z diagnozą raka płuca wskazuje na to, że związek według wynalazku rozpada się na fragment peptydowy ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-OH i grupę chromoforową związku (ANB-NH2).
W wyniku pomiaru wzrost zabarwienia roztworu w czasie zaobserwowano we wszystkich próbkach moczu pochodzących od osób z diagnozą raka płuca. Obserwowana wielkość wzrostu absorbancji w czasie jest różna dla każdej z badanych próbek. Odmienny efekt uzyskano dla 20 próbek osób zdrowych, gdyż w żadnym z 20 badanych próbek moczu nie zaobserwowano wzrostu absorbancji w zakresie diagnostycznym.
Przeprowadzane badania wskazują, że wszystkie próbki 1-50 od osób chorych na raka płuca uległy rozpadowi, lecz w przypadku próbek 7 i 16 rozpad substratu, tj. ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2, zachodził mniej wydajnie niż w przypadku próbek 50 czy 42 (Fig. 2). Taki rezultat może być spowodowany różnicą w aktywności, jak i ilości enzymów odpowiedzialnych za rozpad e nzymatyczny (proteolizę). Ponadto wyniki przedstawione w poniższej Tabeli 1 wskazują, że inkubacja roztworu substratu związku według wynalazku - z próbkami moczu pochodzącymi od osób zdrowych (bez zdiagnozowanego nowotworu, oznaczone cyframi arabskimi kolejno od 1Z do25Z) nie prowadzi do wzrostu absorbancji, a zatem nie zachodzi hydroliza badanego związku. Rezultat wskazuje na brak obecności enzymów proteolitycznych swoistych / charakterystycznych dla raka płuca.
PL 244819 Β1
Tabela 1. Wyniki analizy absorbancji
| 1 | 0,027400 | 0,026000 | 0,02650 |
| 2 | 0,039100 | 0,038900 | 0,04120 |
| 3 | 0,015200 | 0,016600 | 0,01560 |
| 4 | 0,009900 | 0,010300 | 0,01060 |
| 5 | 0,015200 | 0,015500 | 0,01600 |
| 6 | 0,013700 | 0,024600 | 0,02420 |
| 7 | 0,001500 | 0,001700 | 0,00200 |
| 8 | 0,003200 | 0,003100 | 0,00360 |
| 9 | 0,026000 | 0,029400 | 0,02500 |
| 10 | 0,040300 | 0,073800 | 0,05600 |
| 11 | 0,019500 | 0,019000 | 0,01880 |
| 12 | 0,005600 | 0,006800 | 0,00620 |
| 13 | 0,063000 | 0,063300 | 0,06320 |
| 14 | 0,018000 | 0,017600 | 0,01790 |
| 15 | 0,015000 | 0,013900 | 0,01460 |
| 16 | 0,001500 | 0,001600 | 0,00200 |
| 17 | 0,009600 | 0,009500 | 0,01020 |
| 18 | 0,010400 | 0,019000 | 0,01560 |
| 19 | 0,004000 | 0,001200 | 0,00360 |
| 20 | 0,044300 | 0,029900 | 0,03600 |
| 21 | 0,021500 | 0,022000 | 0,02560 |
| 22 | 0,030100 | 0,034900 | 0,03500 |
| 23 | 0,073200 | 0,048300 | 0,06500 |
| 24 | 0,006400 | 0,002600 | 0,00490 |
| 25 | 0,070300 | 0,054900 | 0,06200 |
| 26 | 0,149000 | 0,104900 | 0,10300 |
| 27 | 0,100500 | 0,107800 | 0,10600 |
| 28 | 0,061300 | 0,076500 | 0,07200 |
| 29 | 0,020300 | 0,021800 | 0,02500 |
| 30 | 0,159500 | 0,154300 | 0,15600 |
| 31 | 0,034600 | 0,030600 | 0,03600 |
| 32 | 0,014570 | 0,018600 | 0,01590 |
PL 244819 Β1
| 33 | 0,070000 | 0,062500 | 0,06870 |
| 34 | 0,042100 | 0,024300 | 0,03600 |
| 35 | 0,040200 | 0,071400 | 0,06320 |
| 36 | 0,004600 | 0,005700 | 0,00498 |
| 37 | 0,058000 | 0,065000 | 0,06200 |
| 38 | 0,019400 | 0,017410 | 0,01850 |
| 39 | 0,055900 | 0,019000 | 0,03650 |
| 40 | 0,057200 | 0,030850 | 0,04690 |
| 41 | 0,013800 | 0,016300 | 0,01560 |
| 42 | 0,154300 | 0,197600 | 0,17500 |
| 43 | 0,036600 | 0,046500 | 0,04260 |
| 44 | 0,077300 | 0,040500 | 0,05600 |
| 45 | 0,098300 | 0,149600 | 0,11200 |
| 46 | 0,022900 | 0,021100 | 0,02360 |
| 47 | 0,110800 | 0,109400 | 0,10960 |
| 48 | 0,011600 | 0,015400 | 0,01430 |
| 49 | 0,071400 | 0,081200 | 0,07900 |
| 50 | 0,158800 | 0,186700 | 0,01760 |
| IZ | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 2Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 3Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 4Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 5Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 6Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 7Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 8Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 9Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 10Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| HZ | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 12Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 13Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 14Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
PL 244819 Β1
| 15Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 16Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 17Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 18Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 19Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 20Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 21Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 22Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 23Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 24Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
| 25Z | 0,000000 | 0,000000 | 0,00000 |
Ponadto, przeprowadzano badania selektywności rozpadu substratu, tj. związku według wynalazku, w zależności od badanego raka. Wyniki przeprowadzonych badań przedstawiono na Fig. 3 i wskazują one, że badany substrat, tj. ABZ1-Tyr2-lle3-Phe4-Arg5-ANB6-NH2, inkubowany z próbkami pochodzącymi od pacjentów z diagnozą poszczególnych nowotworów: raka jądra, jelita, nerki, prostaty, trzustki, dróg żółciowych, płuca, jajnika odbytnicy nie rozpada się i nie powoduje wzrostu absorbancji we wskazanym zakresie. Badane próbki każdorazowo stanowiły mieszaninę 20 próbek otrzymanych dla każdego z badanych nowotworów. Wskazuje to na selektywność rozpadu związków według wynalazku, która sprawia, że nadają się one do swoistego wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej wobec raka płuca oraz swoistego diagnozowania raka płuca.
W tabeli 2 poniżej przedstawiono wyniki pomiarów uzyskane dla trzech powtórzeń każdej z próbek.
Tabela 2. Wyniki analizy selektywności rozpadu
| żołądek | 0 | 0 | 0 |
| jelito grube | 0 | 0 | 0 |
| nerka | 0 | 0 | 0 |
| prostata | 0 | 0 | 0 |
| pęcherz moczowy | 0 | 0 | 0 |
| trzustka | 0 | 0 | 0 |
| jajnik | 0 | 0 | 0 |
| wątroba | 0 | 0 | 0 |
| płuco | 0,05416 | 0,06476 | 0,0487 |
Ponadto przeprowadzono pomiary zależności aktywności proteolitycznej reprezentatywnego związku według wynalazku od odczynu środowiska reakcji. W wyniku tego eksperymentu stwierdzono, że w badanym materiale występuje co najmniej jeden enzym wykazujący maksimum aktywności w pH zasadowym (Fig. 4).
Przeprowadzone analizy potwierdziły przydatność związków według wynalazku w czułym i swoistym wykrywaniu aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca, a tym samym ich przydatności także do swoistego diagnozowania raka płuca, jak również jako markera diagnostycznego raka płuca. Mechanizm działania związków według wynalazku polega na ich swoistym rozpadzie enzymatycznym
PL 244819 Β1 w takiej pozycji, która prowadzi do uwolnienia wolnych cząsteczek chromo forów, co powoduje powstanie mierzalnego sygnału optycznego, który można wykorzystywać do celów diagnostycznych, w szczególności w diagnozowaniu raka płuca zgodnie z niniejszym wynalazkiem.
WYKAZ SEKWENCJI < 110> URTESTE S.A.
< 120> Nowy marker diagnostyczny raka płuca <130> I7P49597PLOO <160> 1 <170>BiSSAP 1.3.6 <210 1 <211>4 <212> PRT < 213> Homo sapiens <400 '
Tyr Ile Phe Arg
Claims (24)
1. Związek o wzorze 1:
X11-Tyr2-lle3-Phe4-Arg5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym związek ten ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Tyr-lle-Phe-Arg-OH (fragment 1) orazX2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
2. Związek według zastrz. 1, który to związek ulega rozpadowi hydrolitycznemu, korzystnie proteolitycznemu.
3. Związek według zastrz. 1 albo 2, w którym to związku para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), korzystnie parę C1 i C2 stanowi ABZ/pNA lub ABZ/ANB-NH2.
4. Związek według jednego z zastrzeżeń 1 do 3, który to związek stanowi związek wzorze 2: ABZ-Tyr-lle-Phe-Arg-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-lle-Phe-Arg-pNA (wzór 3).
5. Związek według zastrz. 4, który to związek ulega rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Tyr-lle-Phe-Arg-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2.
6. Sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, pochodzącej z komórek raka płuca, obejmujący:
a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem o wzorze 1:
X11-Tyr2-lle3-Phe4-Arg5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Tyr-Ile-Phe-Arg-OH (fragment 1 ) oraz X2 (fragment 2), i
b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
7. Sposób in vitro według zastrz. 6, w którym aktywność enzymatyczną stanowi aktywność hydrolityczna, korzystnie aktywność proteolityczna.
8. Sposób in vitro według zastrz. 6 albo 7, w którym jako wspomniany związek stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA (wzór 3).
9. Sposób według jednego z zastrz. 6 do 8, w którym jako wspomniany płyn ustrojowy stosuje się mocz, korzystnie mocz ludzki.
10. Sposób in vitro diagnozowania raka płuca, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka płuca u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka płuca, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka płuca, i przy czym do pomiaru wspomnianej aktywności enzymatycznej stosuje się związek o wzorze 1:
X11-Tyr2-Ile3-Phe4-Arg5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Tyr-Ile-Phe-Arg-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
11. Sposób według zastrz. 10, w wykrywanie aktywności enzymatycznej przeprowadza się sposobem jak określono w jednym z zastrz. 6 do 9.
12. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 11, w którym wspomnianą próbkę płynu ustrojowego inkubuje się ze wspomnianym związkiem w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub pH zasadowym, korzystnie fizjologicznym, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10 korzystnie 1:5 próbki do buforu pomiarowego.
13. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 12, w którym wspomniany związek stosuje się w stężeniu 0,1-10 mg/ml, w szczególności 0,25-7,5 mg/ml.
14. Sposób według zastrz. 10 do 13, w którym jako wspomniany związek stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-PheArg-pNA(wzór 3).
15. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 14, w którym jako wspomnianą próbkę stosuję się próbkę moczu, korzystnie moczu ludzkiego.
16. Sposób, według jednego z zastrz. 10 do, 15, w którym pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, w szczególności 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedziału 25-40°C, korzystnie 36-38°C.
17. Zestaw zawierający związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 i bufor pomiarowy.
18. Zestaw według zastrz. 17, w którym związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-lle-Phe-Arg-pNA (wzór 3).
19. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka płuca.
20. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5, do zastosowania do diagnozowania raka płuca.
21. Związek do zastosowania według zastrz. 20, w którym diagnozowanie raka płuca obejmuje wykrywanie pierwotnego raka płuca, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgiczn ej raka płuc i/lub wykrywanie wznowy raka płuca.
22. Związek do zastosowania według jednego z zastrz. 19 do 21, w którym związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA (wzór 3).
23. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka płuca.
24. Związek do zastosowania według zastrz. 23, który to związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Tyr-Ile-Phe-Arg-pNA (wzór 3).
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL439760A PL244819B1 (pl) | 2021-12-07 | 2021-12-07 | Związek-marker diagnostyczny raka płuca, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka płuca, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego |
| MX2024005607A MX2024005607A (es) | 2021-12-07 | 2022-12-05 | Sustrato enzimatico fret y sus usos en el cancer de pulmon. |
| PCT/PL2022/050088 WO2023106945A1 (en) | 2021-12-07 | 2022-12-05 | Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer. |
| KR1020247018178A KR20240120719A (ko) | 2021-12-07 | 2022-12-05 | Fret 효소 기질 및 폐암에서의 그 용도 |
| US18/709,729 US20250003970A1 (en) | 2021-12-07 | 2022-12-05 | Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer |
| IL313308A IL313308A (en) | 2021-12-07 | 2022-12-05 | Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer |
| CA3236947A CA3236947A1 (en) | 2021-12-07 | 2022-12-05 | Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer |
| EP22854178.5A EP4445138A1 (en) | 2021-12-07 | 2022-12-05 | Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer |
| CN202280081825.3A CN118451325A (zh) | 2021-12-07 | 2022-12-05 | Fret酶底物及其在肺癌中的应用 |
| AU2022407963A AU2022407963A1 (en) | 2021-12-07 | 2022-12-05 | Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer. |
| JP2024534265A JP2024543628A (ja) | 2021-12-07 | 2022-12-05 | Ｆｒｅｔ酵素基質及び肺がんにおけるその使用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL439760A PL244819B1 (pl) | 2021-12-07 | 2021-12-07 | Związek-marker diagnostyczny raka płuca, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka płuca, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL439760A1 PL439760A1 (pl) | 2023-06-12 |
| PL244819B1 true PL244819B1 (pl) | 2024-03-11 |
Family
ID=85172854
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL439760A PL244819B1 (pl) | 2021-12-07 | 2021-12-07 | Związek-marker diagnostyczny raka płuca, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka płuca, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20250003970A1 (pl) |
| EP (1) | EP4445138A1 (pl) |
| JP (1) | JP2024543628A (pl) |
| KR (1) | KR20240120719A (pl) |
| CN (1) | CN118451325A (pl) |
| AU (1) | AU2022407963A1 (pl) |
| CA (1) | CA3236947A1 (pl) |
| IL (1) | IL313308A (pl) |
| MX (1) | MX2024005607A (pl) |
| PL (1) | PL244819B1 (pl) |
| WO (1) | WO2023106945A1 (pl) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003302118A1 (en) * | 2002-05-10 | 2004-06-15 | Epitome Biosystems, Inc. | Unique recognition sequences and methods of use thereof in protein analysis |
-
2021
- 2021-12-07 PL PL439760A patent/PL244819B1/pl unknown
-
2022
- 2022-12-05 CN CN202280081825.3A patent/CN118451325A/zh active Pending
- 2022-12-05 MX MX2024005607A patent/MX2024005607A/es unknown
- 2022-12-05 KR KR1020247018178A patent/KR20240120719A/ko active Pending
- 2022-12-05 US US18/709,729 patent/US20250003970A1/en active Pending
- 2022-12-05 WO PCT/PL2022/050088 patent/WO2023106945A1/en not_active Ceased
- 2022-12-05 CA CA3236947A patent/CA3236947A1/en active Pending
- 2022-12-05 JP JP2024534265A patent/JP2024543628A/ja active Pending
- 2022-12-05 AU AU2022407963A patent/AU2022407963A1/en active Pending
- 2022-12-05 IL IL313308A patent/IL313308A/en unknown
- 2022-12-05 EP EP22854178.5A patent/EP4445138A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL439760A1 (pl) | 2023-06-12 |
| EP4445138A1 (en) | 2024-10-16 |
| JP2024543628A (ja) | 2024-11-21 |
| CN118451325A (zh) | 2024-08-06 |
| CA3236947A1 (en) | 2023-06-15 |
| IL313308A (en) | 2024-08-01 |
| US20250003970A1 (en) | 2025-01-02 |
| AU2022407963A1 (en) | 2024-05-02 |
| KR20240120719A (ko) | 2024-08-07 |
| WO2023106945A1 (en) | 2023-06-15 |
| MX2024005607A (es) | 2024-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240353410A1 (en) | Fret enzymatic substrate and uses thereof in liver cancer | |
| PL244819B1 (pl) | Związek-marker diagnostyczny raka płuca, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka płuca, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego | |
| US20250206777A1 (en) | Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer | |
| PL245377B1 (pl) | Związek-marker diagnostyczny raka nerki, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka nerki, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego | |
| PL247268B1 (pl) | Związek-marker diagnostyczny raka dróg żółciowych, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka dróg żółciowych, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku | |
| PL245425B1 (pl) | Związek-marker diagnostyczny raka trzonu macicy, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka trzonu macicy, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego | |
| PL246444B1 (pl) | Związek-marker diagnostyczny raka jajnika, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka jajnika, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku | |
| PL248105B1 (pl) | Związek, marker diagnostyczny raka piersi, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka piersi, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowania takiego związku | |
| KR20250143356A (ko) | 화합물, 위암 진단 마커, 효소 활성 검출 방법, 위암 진단 방법, 화합물을 포함하는 키트, 위암을 치료하기 위한 화합물의 용도 및 방법 |