PL233552B1

PL233552B1 - Sposób oczyszczania diatoksantyny

Info

Publication number: PL233552B1
Application number: PL41217715A
Authority: PL
Inventors: Paulina Kuczyńska; Małgorzata Jemioła-Rzemińska
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2019-10-31
Also published as: PL412177A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji i oczyszczania diatoksantyny składający się z pięciu etapów, takich jak: hodowla okrzemek, ekstrakcja barwników, frakcjonowanie barwników, alkalizacja złoża do chromatografii oraz chromatografia kolumnowa, których prowadzenie w warunkach zgodnych z wynalazkiem pozwala na uzyskanie diatoksantyny o wysokim stopniu czystości.

Chromatografia kolumnowa jest najbardziej cenioną metodą preparatywną i jedyną mającą zastosowanie przemysłowe, co więcej nie wymaga użycia kosztownej aparatury ani specjalistów uprawnionych do wykonania procedury. Alternatywnie, może być stosowana chromatografia cienkowarstwowa (TLC), jednakże jest ona jedynie metodą analityczną i nie pozwala na użycie przemysłowe. Coraz częściej istnieje konieczność używania techniki HPLC do pozyskania czystych preparatów, jednak skala takiej produkcji jest nieporównywalnie mniejsza i o wiele bardziej kosztowna.

W celu obniżenia kosztów produkcji często stosuje się syntetyzowane chemicznie zamienniki substancji naturalnych. Należy jednak zwrócić uwagę na fakt, że ich przyswajalność oraz działanie biologiczne są w znacznym stopniu ograniczone. Producenci z branży karotenoidowej widzą przyszłość w pozyskiwaniu naturalnych barwników z mikroorganizmów morskich. Można je bowiem hodować w bioreaktorach na skalę przemysłową, a koszty izolacji mogą być niższe od drogich syntez chemicznych. Karotenoidy cieszą się ogromnym zainteresowaniem na rynku medycznym, kosmetycznym i spożywczym. Ich właściwości antyoksydacyjne, zdolność do usuwania wolnych rodników, a także zapobieganie uszkodzeniom DNA stwarzają możliwość wykorzystania w produktach farmaceutycznych, suplementach diety, wysokiej jakości kosmetykach aktywnych biologicznie, a także jako dodatku do żywności podnoszącego jej wartość odżywczą. W ostatnich latach opublikowano szereg prac dokumentujących możliwość stosowania technologii liposomowej enkapsulacji karotenoidów pozwalającej zarówno na ochronę przed degradacją jak i zwiększenie ich przyswajalności.

Diatoksantyna jest jednym z pożądanych barwników karotenoidowych.

Celem wynalazku jest dostarczenie nadającego się do stosowania w skali przemysłowej sposobu otrzymywania diatoksantyny o stopniu czystości >99%.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania diatoksantyny charakteryzujący się tym, że:

a) prowadzi się hodowlę okrzemek, zwłaszcza gatunku Phaeodactylum tricornutum, przy intensywności światła 100 μE m^-2s^-1 i fotoperiodzie światło/ciemność wynoszącym 16h/8h, korzystnie do uzyskania hodowli o gęstości 2'106 komórek/ml, a następnie poddaje się stresowi świetlnemu przez nie więcej niż 5 h, korzystnie 2 h, w świetle białym o intensywności 1250 μE m^-2s^-1 oraz oddziela się komórki okrzemek,

b) z uzyskanych komórek prowadzi się ekstrakcję barwników w mieszaninie ekstrakcyjnej składającej się ze składnika A i składnika B w stosunku objętościowym 9:1, przy czym jako składnik A stosuje się mieszaninę metanolu z 0,2 M octanem amonu w proporcjach objętościowych 9:1, natomiast jako składnik B stosuje się octan etylu, przy czym mieszaninę ekstrakcyjną stosuje się w ilości 10 ml na 2-10⁹ komórek, a następnie odwirowuje się i oddziela się uzyskany nadsącz,

c) wykonuje się wstępne oczyszczanie poprzez frakcjonowanie barwników zawartych w nadsączu uzyskanym w etapie b), przy czym frakcjonowanie prowadzi się w mieszaninie składającej się ze składnika A, składnika B oraz składnika C w stosunku objętościowym 4:1:2, przy czym jako składnik A stosuje się mieszaninę heksanu z eterem dietylowym w proporcjach objętościowych 1:1, jako składnik B stosuje się benzynę ekstrakcyjną, a jako składnik C stosuję się wodę, przy czym jako frakcję zawierającą karotenoidy zbiera się frakcję o mniejszej gęstości,

d) przygotowuje się kolumnę chromatograficzną, przy czym jako złoże chromatograficzne stosuje się złoże krzemionkowe o pH=9, alkalizowane w szczególności wodorowęglanem sodu, zrównoważone następnie mieszaniną składającą się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych 90:10,

e) prowadzi się rozdział mieszaniny barwników uzyskanej w etapie c) na kolumnie uzyskanej w etapie d), przy czym mieszaninę barwników uzyskaną z 2-10⁹ komórek nanosi się na 20 g złoża, przy czym mieszaninę barwników rozpuszcza się w mieszaninie składającej się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych 90:10, a następnie prowadzi się elucję mieszaniną składającą się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych od 90:10 do 70:30, przy czym jako frakcję zawierającą diatoksantynę zbiera się trzecią frakcję barwników schodzącą z kolumny,

PL 233 552 B1 korzystnie ulegającą elucji przy zastosowaniu mieszaniny heksan:aceton w proporcjach objętościowych 80:20.

Korzystnie, etap a) prowadzi się w temperaturze od 15 do 20°C, korzystnie 15°C.

Korzystnie, w etapie a) komórki okrzemek oddziela się poprzez wirowanie przy 5500xg w temp. 4°C przez 5 min.

Korzystnie, nadsącz uzyskany w etapie b) zagęszcza się poprzez odparowanie w atmosferze beztlenowej, zwłaszcza atmosferze azotu. Można też stosować inne metody odparowywania, istotne jest uniknięcie obecności tlenu.

Korzystnie, frakcję zawierającą karotenoidy uzyskaną w etapie c) dodatkowo przemywa się wodą destylowaną.

Korzystnie, frakcjonowanie w etapie c) powtarza się kilkukrotnie, a uzyskaną frakcję zawierającą karotenoidy zagęszcza się poprzez odparowanie w atmosferze beztlenowej, korzystnie w atmosferze azotu.

Korzystnie, w etapie d) stosuje się złoże krzemionkowe o masie 60 g/mol, rozmiarze cząstek 0.040- 0.063 mm, usieciowaniu 230-400.

Korzystnie, w etapie e) elucję mieszaniną składającą się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych 90:10 prowadzi się do momentu zebrania pierwszej frakcji schodzącej z kolumny.

Korzystnie, w etapie e) elucję mieszaniną składającą się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych 80:20 prowadzi się od momentu zejścia z kolumny pierwszej frakcji do momentu zebrania drugiej oraz trzeciej frakcji schodzącej z kolumny.

Korzystnie, w etapie e) elucję mieszaniną składającą się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych 70:30 prowadzi się od momentu zejścia z kolumny trzeciej frakcji do momentu zebrania czwartej frakcji schodzącej z kolumny.

Korzystnie, w etapie e) elucję acetonem prowadzi się od momentu zejścia z kolumny czwartej frakcji do momentu zebrania piątej frakcji schodzącej z kolumny i oczyszczenia złoża.

Korzystnie, uzyskaną w etapie e) frakcję zawierającą oczyszczoną diatoksantynę odparowuje się w atmosferze azotu i przechowuje w temperaturze -80°C chroniąc przed światłem.

Sposób według wynalazku pozwala na uzyskanie około 5 ąg diatoksantyny o stopniu czystości >99% z 2-10⁹ komórek okrzemek w czasie 22 godzin.

Opisana procedura izolacji i oczyszczania diatoksantyny jest jak dotąd jedyną pozwalającą na pozyskanie barwnika o bardzo wysokim stopniu czystości (>99%), możliwą do przeprowadzenia w skali przemysłowej. Ogromnym jej atutem jest niski koszt produkcji i krótki czas realizacji. Począwszy od wirowania hodowli okrzemek do uzyskania czystego barwnika czas przeprowadzenia procedury wynosi około 22 godziny.

Dla lepszego wyjaśnienia istoty wynalazku niniejszy opis został uzupełniony następującymi rysunkami:

Ryc. 1. Przykładowy chromatogram HPLC ekstraktu barwników z okrzemek hodowanych stale w świetle białym o intensywności 1250 ąE m^-2s^-1. Hodowlę testowano przez 7 dni. Zawartość diatoksantyny (pik o czasie retencji 12.044 min.) w tych warunkach wynosiła około 15% jednak każdorazowo stwierdzono obecność zarówno izomeru diatoksantyny (pik o czasie retencji 12.378 min.) jak i barwników cyklu wiolaksantynowego (piki o czasach retencji 11.152 oraz 12.777 min).

Ryc. 2. Przykładowy chromatogram HPLC ekstraktu barwników z okrzemek hodowanych w świetle białym o intensywności 700 ąE m^-2s^-1 w fotoperiodzie 6/18 h (dzień/noc). Hodowlę testowano przez 7 dni. Zawartość diatoksantyny (pik o czasie retencji 11.837 min.) w tych warunkach wynosiła około 9% jednak każdorazowo stwierdzono obecność zarówno izomeru diatoksantyny (pik o czasie retencji 12.170 min.) jak i barwników cyklu wiolaksantynowego (piki o czasach retencji 10.967 oraz 12.558 min).

Ryc. 3. Przykładowy chromatogram HPLC ekstraktu barwników z okrzemek hodowanych w świetle białym o intensywności 100 ąE m^-2s^-1 w fotoperiodzie 16/8 h (dzień/noc) i poddanych naświetlaniu przez 2 h światłem białym o intensywności 1250 ąE m^-2s^-1. Zawartość diatoksantyny (pik o czasie retencji 11.412 min.) w tych warunkach wynosiła około 8%, przy czym nie stwierdzono obecności ani izomeru diatoksantyny ani barwników cyklu wiolaksantynowego.

Ryc. 4. Etapy frakcjonowania barwników: (A) zmydlony ekstrakt barwników po dodaniu mieszaniny heksan:eter dietylowy (1:1 obj./obj.) - brak rozdziału frakcji; (B) zmydlony ekstrakt barwników po dodaniu mieszaniny heksan:eter dietylowy (1:1 obj./obj.) oraz benzyny ekstrakcyjnej - niewyraźny rozdział frakcji; (C) zmydlony ekstrakt barwników po dodaniu mieszaniny heksan:eter dietylowy (1:1 obj./obj.), benzyny ekstrakcyjnej oraz wody - bardzo wyraźny rozdział frakcji; (D) zebrane frakcje karotenoidowe

PL 233 552 Β1 po procesie rozdzielania frakcji - widoczna mętność roztworu; (E) przemywanie frakcji karotenoidowej wodą w celu usunięcia polarnych związków nie mających charakteru barwnikowego; (F) frakcja karotenoidowa po drugim przemywaniu wodą - klarowny roztwór; biały kolor na zdjęciach odpowiada żółtej frakcji karotenoidowej zaś ciemny odcień na zdjęciach A, B, C odpowiada zielonej frakcji chlorofilowej.

Ryc. 5. Przykładowy chromatogram (po lewej) analizy HPLC-DAD wraz z widmem absorpcji (po prawej) potwierdzający czystość uzyskanego preparatu.

Przykład 1. Hodowla okrzemek.

Hodowlę P. tricornutum prowadzi się w warunkach sterylnych, w pożywce f/2-Si (Guillard, 1975) przygotowanej z wody morskiej wzbogaconej o substancje nieorganiczne oraz witaminy [Tabela. 1], Hodowla prowadzona była w komorze hodowlanej w temperaturze 15°C w świetle białym o intensywności 100 μΕ rrr²s·¹ w fotoperiodzie 16/8h (światło/ciemność). Podczas logarytmicznej fazy wzrostu doprowadzono 1 litr hodowli do gęstości 2-10⁶ komórek/ml. Następnie przenoszono hodowlę do warunków stresu świetlnego: 2 h w temperaturze 15°C w świetle białym o intensywności 1250 μΕ nr²s·¹.

Tabela 1. Składniki pożywki f/2-Si do hodowli Phaeodactylum tricornutum (Guillard,1975).

Składnik pożywki	Stężenie w roztworze wyjściowym	Stężenie w pożywce
Sól morska*	-	1.6%
NaNO₃	-	0.882 mM
NaH₂PO₄-2H₂O	-	0.036 mM
Witaminy:
Cyjanokobal amina	0.3 μΜ	0.3 nM
Chlorowodorek ti aminy	296.4 μΜ	296.4 nM
Biotyna	2.0 μΜ	2.0 nM
Mikroelementy:
Na₂EDTA	12.372 mM	12.372 μΜ
FeCh-óHaO	11.654 mM	11.654 μΜ
CuSO₄-5H₂O	0.040 mM	0.040 μΜ
ZnSO₄-7H₂O	0.077 mM	0.077 μΜ
CoC1₂-6H₂O	0.042 mM	0.042 μΜ
MnCl₂-4H₂O	0.910 mM	0.910 μΜ
Ν3₂ΜοΟ₄·2Ι1₂O	0.024 mM	0.024 μΜ

*Zastosowano sól morską Tropie Marin BIO-ACTIF SEA SALT

Wykorzystana pożywka f/2 jest standardowym medium do hodowli glonów morskich. Jednym z jej składników jest krzemian sodu niezbędny w hodowli większości okrzemek. Jednak Phaeodactylum tricornutum jest gatunkiem nie wymagającym obecności krzemu, który ponadto utrudnia ekstrakcję barwników, przez co należałoby dodatkowo homogenizować komórki mechanicznie. W przykładowej realizacji, Phaeodactylum tricornutum hodowano bez użycia krzemianu sodu. Objętość płynnej hodowli nie powinna przekraczać połowy objętości naczynia, gdyż pogorszenie warunków tlenowych osłabia tempo wzrostu komórek. W celu uzyskania każdorazowo tej samej ilości materiału do izolacji o pożądanym składzie barwnikowym okrzemki powinny znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu przy zachowaniu gęstości nie większej niż 2-10⁶ komórek/ml. Przeszczepianie okrzemek do nowej pożywki co 3-4

PL 233 552 B1 dni gwarantuje ich wysoką żywotność. Jako najbardziej wiarygodną metodę oceny jakości hodowli należałoby uznać mikroskopowe zliczanie komórek. W korzystnej realizacji mogą być stosowane warunki temperaturowe w zakresie 15-20°C. Warunki świetlne mają kluczowe znaczenie dla procesu, którego celem jest uzyskanie komórek o możliwie największej zawartości diatoksantyny przy jednoczesnym ograniczeniu obecności barwników i izomerów uniemożliwiających uzyskanie czystego preparatu. Stres świetlny jest niezbędny do wyprodukowania diatoksantyny przez komórki okrzemek jednak stosowanie światła o zbyt wysokim natężeniu indukuje cykl wiolaksantynowy, co wiąże się z obecnością niepożądanych barwników. Kilkugodzinne naświetlanie zarówno światłem o dużej intensywności (1250 μΕ m ²s 1) jak i o niższej intensywności (700 μΕ m ²s 1) uruchamia syntezę dodatkowych barwników oraz powstanie izomerów [Ryc. 1,2]. W związku z tym jako warunki szczególnie korzystne wybrano naświetlanie w temperaturze 15°C światłem o intensywności 1250 μE m ²s ¹ przez 2 h, co jest bezpiecznym czasem dającym gwarancję uzyskania pożądanego składu barwnikowego [Ryc. 3].

P r z y k ł a d 2. Ekstrakcja barwników.

Wirowano 1 L hodowli okrzemek przy 5500xg w temp. 4°C przez 5 min. Zawieszano osad w 20 ml buforu PBS o pH=7 i ponowne wirowano przy takich samych parametrach. Uzyskany osad zamrażano w ciekłym azocie. Ekstrakcję barwników wykonywano poprzez dodanie mieszaniny ekstrakcyjnej A:B (9:1 obj./obj.); A: metanol z dodatkiem 0.2 M octanu amonu (9:1 obj./obj.), B: octan etylu, do osadu w proporcji 10 ml mieszaniny do 2-10⁹ komórek. Intensywnie wytrząsano 2 x 10 s, a następnie wirowano przy 14000xg w temp. 4°C przez 4 min. Zbierano nadsącz i odparowywano w atmosferze azotu.

Dla uzyskania pożądanego efektu istotne jest dobranie odpowiedniej objętości mieszaniny ekstrakcyjnej do liczby komórek ponieważ wpływa to na wydajność procesu ekstrakcji. Zmniejszenie objętości mieszaniny względem liczby komórek skutkuje zmniejszeniem ilości pozyskanych barwników, w tym diatoksantyny. Zwiększenie tej objętości nie zwiększa wydajności ekstrakcji, a jedynie podnosi koszt procesu i wydłuża czas odparowywania składników mieszaniny. Rodzaj mieszaniny ekstrakcyjnej ma bardzo istotny wpływ na efektywność procesu. Abele i wsp. (2012) wykazali, że taka właśnie mieszanina, w przeciwieństwie do acetonu czy metanolu, pozwala na wydajną ekstrakcję ksantofili i ograniczoną ekstrakcję chlorofili i β-karotenu, co jest pożądanym efektem. Dodatkowo obecność jonów amonowych przeciwdziała izomeryzacji. Podczas prowadzenia testów sposobu ekstrakcji barwników wykazano, że dodatkowa homogenizacja komórek za pomocą szklanych kulek nie zwiększa wydajności procesu. Ponowna ekstrakcja barwników z osadu powstałego po pierwszej ekstrakcji również nie skutkuje zwiększeniem wydajności tego etapu.

P r z y k ł a d 3. Frakcjonowanie barwników.

Prowadzi się reakcję zmydlania poprzez rozpuszczenie osadu uzyskanego w przykładzie 2 w 35 ml 95% etanolu, dodanie 3,5 ml 60% KOH, delikatne mieszanie przez dobę w temperaturze 4°C. Następnie rozdziela się frakcję chlorofilową od karotenoidowej poprzez:

1) dodanie do mieszaniny barwników stopniowo: 40 ml mieszaniny heksan:eter dietylowy (1:1 obj./obj.), 10 ml benzyny ekstrakcyjnej oraz 20 ml wody destylowanej; delikatne wymieszanie składników i pozostawienie do rozdzielenia się faz; zebranie górnej frakcji karotenoidowej;

2) do pozostałej frakcji chlorofilowej dodanie 10 ml mieszaniny heksan:eter dietylowy (1:1 obj./obj.), 2,5 ml benzyny ekstrakcyjnej i 5 ml wody destylowanej; ponowne wymieszanie składników i pozostawienie do rozdzielenia się faz; zebranie frakcji karotenoidowej;

3) powtórzenie etapu oznaczonego „2)” w celu zwiększenia wydajności procedury.

W korzystnej realizacji wykonuje się dodatkowe przemywanie uzyskanej frakcji karotenoidowej. W tym celu do zebranych i połączonych ze sobą frakcji karotenoidowych dodaje się wody destylowanej w proporcji 1:1 obj./obj.; intensywnie miesza, odstawia się do rozdzielenia faz i zbiera się górną frakcję karotenoidową. Przemywanie wykonywano dwukrotnie. Następnie odparowywano mieszaninę barwników w atmosferze azotu.

Reakcja zmydlania jest stosowana w procedurze izolacji barwników fotosyntetycznych w celu usunięcia związków o charakterze lipidowym. Frakcjonowanie barwników zmydlonego ekstraktu pozwala na usunięcie chlorofili stanowiących ponad 30% barwników zawartych w mieszaninie. Dla właściwego przeprowadzenia frakcjonowania barwników istotny jest dobór odpowiednich rozpuszczalników organicznych i ich zastosowanie w odpowiednich proporcjach tak, aby uzyskać frakcję (górną) zawierającą jak największą ilość diatoksantyny z równoczesnym wyeliminowaniem obecności powstałych w wyniku zastosowania KOH mydeł. Używana do frakcjonowania barwników fotosyntetycznych roślin wyższych i glonów mieszanina heksan: eter dietylowy (1:1 obj./obj.), w przypadku izolacji diatoksantyny

PL 233 552 B1 nie prowadzi do rozdziału faz [Ryc. 4A], Dodatek benzyny prowadzi do częściowego rozdziału faz jednak ich granica jest słabo widoczna [Ryc. 4B], Dopiero dodanie wody jako czwartego składnika pozwala uzyskać dwie dobrze rozdzielone frakcje [Ryc. 4C], przy czym diatoksantyna preferencyjnie rozpuszcza się w fazie górnej. Ponowne, dwukrotne przemycie frakcji dolnej poprzez dodanie 10 ml mieszaniny heksan:eter dietylowy (1:1 obj./obj.), 2,5 ml benzyny ekstrakcyjnej i 5 ml wody destylowanej pozwala efektywnie przeprowadzić całą dostępną pulę diatoksantyny do frakcji górnej. Zwiększenie liczby powtórzeń wpływa niekorzystnie na proces ponieważ nie zwiększa ilości diatoksantyny ale powoduje wzrost zawartości fukoksantyny w uzyskanej frakcji karotenoidowej. Przeprowadzenie frakcjonowania barwników jest istotne dla dalszego oczyszczania, ponieważ pozwala na usunięcie chlorofili, a także znacznej ilości fukoksantyny. Pominięcie tego etapu uniemożliwia uzyskanie czystej diatoksantyny.

P r z y k ł a d 4. Przygotowanie kolumny chromatograficznej.

Złoże krzemionkowe (Merck, Silica gel 60 (0.040-0.063 mm)) zalkalizowano zgodnie z procedurą znaną z Nagy i wsp., 2009. W tym celu 200 g złoża dodano do 2 L nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i mieszano przez 2 h w temperaturze pokojowej. Filtrację złoża przeprowadzono na bibule filtracyjnej w lejku Buchnera za pomocą pompy próżniowej. Po przesączeniu roztworu węglanu sodu złoże przemywano dodając stopniowo 2 L wody destylowanej, a następnie 500 ml acetonu. Złoże osuszano pod dygestorium przez 24 h. Uzyskane w ten sposób złoże (20 g) nałożono w mieszaninie heksan:aceton (90:10 obj./obj.) na kolumnę szklaną o średnicy 2 cm i długości co najmniej 30 cm.

Stosowanie alkalicznego złoża uniemożliwia powstawanie izomeru cis podczas chromatografii, nie daje to jednak gwarancji efektywnego rozdziału. Aby uzyskać diatoksantynę o czystości >99% należy przestrzegać warunków rozdziału opisanych poniżej. Istotnym elementem efektywnej chromatografii jest również proporcja barwników do złoża, tzn. karotenoidowa część ekstraktu z 2-109 komórek powinna być nałożona na 20 g złoża krzemionkowego. Zmniejszenie ilości złoża spowoduje przeładowanie kolumny co skutkuje tym, że efektywne rozdzielenie barwników nie jest możliwe, zaś zwiększenie nie jest ekonomiczne - nie poprawia efektywności rozdziału a co więcej wydłuża jego czas trwania. Średnica kolumny znacząco wpływa na proces rozdziału, w szczególności jej zwiększenie powoduje, że odległości między poszczególnymi frakcjami są mniejsze, co zdecydowanie utrudni ich rozdzielenie. W związku z tym proporcja pomiędzy długością, a średnicą kolumny powinna być zachowana.

P r z y k ł a d 5. Rozdział chromatograficzny.

Na kolumnie przygotowanej w przykładzie 4 prowadzi się chromatografię kolumnową. W tym celu wykonuje się:

1) rozpuszczenie osadu barwników w 3 ml mieszaniny heksan:aceton (90:10 obj./obj.) i nałożenie go na kolumnę,

2) elucję mieszaniną heksan:aceton (90:10 obj./obj.) do zebrania pierwszej frakcji,

3) elucję mieszaniną heksan:aceton (80:20 obj./obj.) i zebranie drugiej frakcji,

4) elucję mieszaniną heksan:aceton (80:20 obj./obj.) i zebranie trzeciej frakcji, którą jest diatok- santyna,

5) elucję mieszaniną heksan:aceton (70:30 obj./obj.) i zebranie czwartej frakcji,

6) elucję acetonem w celu zebrania piątej frakcji i oczyszczenia kolumny w celu ponownego jej użycia.

Etapy 5 i 6 można pominąć stosując każdorazowo kolumnę chromatograficzną wypełnioną nowym złożem.

Opisany sposób pozwala na uzyskanie około 5 pg diatoksantyny o stopniu czystości >99% z 2-109 komórek okrzemek w czasie 22 godzin.

Odpowiednie przeprowadzenie rozdziału chromatograficznego jest podstawą uzyskania oczyszczonej diatoksantyny. Rozpuszczenie osadu barwników w 3 ml mieszaniny heksan:aceton (90:10 obj./obj.) jest optymalne by wszystkie składniki wniknęły w złoże w podobnym czasie. Testy z użyciem innych eluentów wykazały ich znaczący wpływ na proces rozdziału. Zastosowanie wyłącznie dwóch eluentów tj. heksan:aceton (90:10 obj./obj., 60:40 obj./obj.) skutkuje uzyskaniem tylko dwóch frakcji: β-karotenu oraz mieszaniny diadinoksantyny i diatoksantyny. Próba rozdziału diatoksantyny i diadinoksantyny przy użyciu innych dwóch eluentów tj. B:C (35:65 obj./obj.) oraz B:C (29:71 obj./obj.); B: 90% acetonitryl 10% woda, C: octan etylu; również nie pozwoliła na uzyskanie czystej diatoksantyny. W związku z tym zastosowanie eluentów w podany sposób jest kluczowym elementem procedury. Zastosowanie eluentu w proporcji heksan:aceton (90:10 obj./obj.) pozwala na wymywanie β-karotenu oraz rozpoczęcie migracji drugiej frakcji, którą stanowi niezidentyfikowany związek z grupy karotenoidów, przy jednoczesnym

PL 233 552 B1 zatrzymaniu migracji pozostałych barwników. Zmiana proporcji mieszaniny na 80:20 powoduje całkowite wymycie frakcji drugiej oraz rozpoczęcie migracji frakcji trzeciej, którą jest diatoksantyna. Równocześnie następuje powolna migracja frakcji czwartej, którą jest diadinoksantyna. Po zebraniu właściwego barwnika czyli diatoksantyny należy zmienić proporcje mieszaniny na 70:30 obj./obj. i prowadzić elucję diadinoksantyny. Bardzo ważne jest, by zmiany proporcji mieszaniny nie stosować przed całkowitym wypłynięciem diatoksantyny z kolumny, gdyż uniemożliwi to rozdzielenie tych barwników. Po zebraniu diadinoksantyny można prowadzić dalszą elucję acetonem, co powoduje usunięcie pozostałych barwników, w tym fukoksantyny, a tym samym umożliwia ponowne użycie złoża. Ta możliwość znacząco podnosi ekonomikę procesu.

P r z y k ł a d 6. Przechowywanie diatoksantyny.

Uzyskaną w przykładzie 5 frakcję zawierającą oczyszczoną diatoksantynę [Ryc. 5.] należy odparować w atmosferze azotu i przechowywać w szczelnym opakowaniu w temperatur ze -80°C chroniąc przed światłem. Podwyższona temperatura, dostępność tlenu oraz światła powodują rozkład barwnika, co wynika z jego właściwości fizykochemicznych, analogicznie jak to ma miejsce w przypadku innych związków karotenoidowych. Kilkukrotne rozmrażanie produktu nie powodowało żadnych zmian. Jak dotąd pierwszy uzyskany preparat ma 10 miesięcy i nie stwierdzono jego rozkładu.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania diatoksantyny, znamienny tym, że:

a) prowadzi się hodowlę okrzemek, zwłaszcza gatunku Phaeodactylum tricornutum, przy intensywności światła 100 μE m²s1 i fotoperiodzie światło/ciemność wynoszącym 16h/8h, korzystnie do uzyskania hodowli o gęstości 2-10⁶ komórek/ml, a następnie poddaje się stresowi świetlnemu przez nie więcej niż 5 h, korzystnie 2 h, w świetle białym o intensywności 1250 μE m^s^-1, oraz oddziela się komórki okrzemek,

b) z uzyskanych komórek prowadzi się ekstrakcję barwników w mieszaninie ekstrakcyjnej składającej się ze składnika A i składnika B w stosunku objętościowym 9:1, przy czym jako składnik A stosuje się mieszaninę metanolu z 0,2 M octanem amonu w proporcjach objętościowych 9:1, natomiast jako składnik B stosuje się octan etylu, przy czym mieszaninę ekstrakcyjną stosuje się w ilości 10 ml na 2-109 komórek, a następnie odwirowuje się i oddziela się uzyskany nadsącz,

c) wykonuje się wstępne oczyszczanie poprzez frakcjonowanie barwników zawartych w nadsączu uzyskanym w etapie b), przy czym frakcjonowanie prowadzi się w mieszaninie składającej się ze składnika A, składnika B oraz składnika C w stosunku objętościowym 4:1:2, przy czym jako składnik A stosuje się mieszaninę heksanu z eterem dietylowym w proporcjach objętościowych 1:1, jako składnik B stosuje się benzynę ekstrakcyjną, a jako składnik C stosuję się wodę, przy czym jako frakcję zawierającą karotenoidy zbiera się frakcję o mniejszej gęstości,

d) przygotowuje się kolumnę chromatograficzną, przy czym jako złoże chromatograficzne stosuje się złoże krzemionkowe o pH=9, alkalizowane w szczególności wodorowęglanem sodu, zrównoważone następnie mieszaniną składającą się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych 90:10,

e) prowadzi się rozdział mieszaniny barwników uzyskanej w etapie c) na kolumnie uzyskanej w etapie d), przy czym mieszaninę barwników uzyskaną z 2-109 komórek nanosi się na 20 g złoża, przy czym mieszaninę barwników rozpuszcza się w mieszaninie składającej się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych 90:10, a następnie prowadzi się elucję mieszaniną składającą się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych od 90:10 do 70:30, przy czym jako frakcję zawierającą diatoksantynę zbiera się trzecią frakcję barwników schodzącą z kolumny, korzystnie ulegającą elucji przy zastosowaniu mieszaniny heksan:aceton w proporcjach objętościowych 80:20.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap a) prowadzi się w temperaturze od 15 do 20°C, korzystnie 15°C.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) komórki okrzemek oddziela się poprzez wirowanie przy 5500xg w temp. 4°C przez 5 min.

PL 233 552 B1
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nadsącz uzyskany w etapie b) zagęszcza się poprzez odparowanie w atmosferze beztlenowej, zwłaszcza w atmosferze azotu.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcję zawierającą karotenoidy uzyskaną w etapie c) dodatkowo przemywa się wodą destylowaną.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcjonowanie w etapie c) powtarza się kilkukrotnie, a uzyskaną frakcję zawierającą karotenoidy zagęszcza się poprzez odparowanie w atmosferze beztlenowej, korzystnie w atmosferze azotu.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie d) stosuje się złoże krzemionkowe o masie 60 g/mol, rozmiarze cząstek 0.040-0.063 mm, usieciowaniu 230-400.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie e) elucję mieszaniną składającą się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych 90:10 prowadzi się do momentu zebrania pierwszej frakcji schodzącej z kolumny.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie e) elucję mieszaniną składającą się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych 80:20 prowadzi się od momentu zejścia z kolumny pierwszej frakcji do momentu zebrania drugiej oraz trzeciej frakcji schodzącej z kolumny.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie e) elucję mieszaniną składającą się z heksanu i acetonu w proporcjach objętościowych 70:30 prowadzi się od momentu zejścia z kolumny trzeciej frakcji do momentu zebrania czwartej frakcji schodzącej z kolumny.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie e) elucję acetonem prowadzi się od momentu zejścia z kolumny czwartej frakcji do momentu zebrania piątej frakcji schodzącej z kolumny i oczyszczenia złoża.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskaną w etapie e) frakcję zawierającą oczyszczoną diatoksantynę odparowuje się w atmosferze azotu i przechowuje w temperaturze -80°C chroniąc przed światłem.