PL235185B1 - Polimer chitozanowy do zastosowania do usuwania heparyny - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest usieciowany polimer chitozanowy do zastosowania do usuwania heparyny z krwi i innych płynów fizjologicznych.

Heparyna, substancja odkryta przez McLeana prawie wiek temu, znajduje kliniczne zastosowanie od 1937 i jest pierwszym opartym na polisacharydach lekiem, który znalazł szerokie zastosowanie w leczeniu ludzi. Heparyna jest złożoną mieszaniną glukozaminoglikanów (GAG) o wysokim stopniu sulfonowania (posiada największą wśród cząsteczek biologicznych gęstość ładunku ujemnego z średnio 2,7 ładunkami ujemnymi na jednostkę powtarzalną, którą stanowią dwie jednostki glukozy), która jest wytwarzana i przechowywana w komórkach tucznych tkanek zwierzęcych (np. w jelitach wieprzowych lub płucach wołowych). Wykazuje bardzo silne działanie hamujące krzepnięcie krwi, chociaż zaledwie jedna trzecia cząsteczek heparyny posiada właściwości przeciwkrzepliwe. Jej działanie polega na zwiększeniu zdolności antytrombiny (AT) do dezaktywowania trombiny i czynnika Xa, enzymów odpowiedzialnych za krzepnięcie krwi. Dlatego heparyna jest lekiem z wyboru w sytuacjach, w których konieczne jest osiągnięcie szybkiego efektu antykoagulacyjnego, np. podczas operacji chirurgicznych, w szczególności w celu zapobiegania tworzeniu się skrzepów w urządzeniach stosowanych w terapii pozaustrojowej takich jak dializatory lub oksygenatory. Posiada ona również wiele innych zastosowań terapeutycznych, np. w leczeniu niestabilnej dusznicy bolesnej lub ostrego zawału serca.

Jednakże podawanie heparyny wiąże się z wieloma efektami ubocznymi, wśród których najczęściej spotykane są krwawienia, trombocytopenia indukowana heparyną (heparin induced thrombocytopenia, HIT) i osteoporoza.

W związku z tym często zachodzi potrzeba usunięcia heparyny z krwioobiegu po uzyskaniu pożądanego działania antykoagulacyjnego. Opracowano szereg metod jej usuwania. Najczęściej stosowane jest podawanie protaminy, białka wprowadzonego do praktyki klinicznej jako antagonistę heparyny prawie jednocześnie z heparyną (Fischer, A Biochem Zeit. 278, 133, 1935). Charakteryzuje się ono niezwykle wysoką zawartością aminokwasów zasadowych (takich jak arginina, lizyna i histydyna), mogącą osiągać 80%. Innym polimerem stosowanym do usuwania heparyny jest poli-L-lizyna (Ma, X., Mohammad, S.F., Kim, S.W. Biotechnology and Bioengineering Volume 40, Issue 4, 5 August 1992, Pages 530-536), którą stosuje się również do wzmacniania działania protaminy. Jeszcze innym podejściem do problemu usuwania heparyny jest jej enzymatyczna degradacja za pomocą immobilizowanej heparynazy (Kolde, H.-J., Pelzer, H., Borzhenskaya, L., Russo, A., Rose, M., Tejidor, L. Hamostaseologie Volume 14, Issue 1, 1994, Pages 37-43).

Niestety, wymienione metody usuwania heparyny mogą same powodować efekty uboczne. Protamina, jeśli nie zostanie usunięta z krwioobiegu, może powodować niepożądane reakcje u około 10% pacjentów. Mogą one być bardzo poważne, a często nawet śmiertelne i obejmują nadciśnienie płucne, niedociśnienie tętnicze, wstrząs anafilaktyczny, trombocytopenię, granulocytopenię, aktywację układu dopełniacza i uwolnienie cytokin. Usuwanie heparyny poprzez zastosowanie protaminy jest niekompletne i towarzyszą mu reakcje alergiczne. Z drugiej strony poli-L-lizyna jest nadal dość drogim polimerem.

Podjęto wiele prób skonstruowania urządzeń do usuwania heparyny, w większości opartych na zastosowaniu immobilizowanej poli-L-lizyny (Joseph B. Zwischenberger, MD, Roger A. Vertrees, BA, CCP, Robert L. Brunston, Jr., MD, Weike Tao, MD, Scott K. Alpard, MD, and Paul S. Brown, Jr., MD, The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 1998 Volume 115, Number 3; Zwischenberger, J.B., Tao, W., Deyo, D.J., Vertrees, R.A., Alpard, S.K., Shulman, G. Annals of Thoracic Burgery Volume 71, Issue 1, 2001, Pages 270-277). Urządzenie do usuwania heparyny (HRD, heparin removal device), opisane w powyższych publikacjach, włączone jest w krwioobieg pacjenta pozaustrojowo poprzez połączenie żylno-żylne. Dokonuje się w nim separacji osocza, które po usunięciu z niego heparyny przez kontakt z poli-L-lizyną, jest zawracane do krwi pacjenta. Pomimo obiecujących wyników eksperymentalnych, doświadczenia z zastosowaniem tego typu urządzeń są ograniczone i jak dotąd żadne z nich nie zostało wdrożone do praktyki klinicznej. Metodą często stosowaną w celu uniknięcia komplikacji spowodowanych przez niezwiązane związki będące antagonistami heparyny jest ich immobilizacja na podłożach polimerowych znajdujących się w urządzeniu do usuwania heparyny. Na przykład protaminę osadzono na matrycy otrzymanej przez naszczepienie polimeru akrylowego na celulozie (Hou, K.C., Roy, S., Zaniewski, R., Shumway, E. Artificial Organs Volume 14, Issue 6, 1990, Pages 436-442) lub wewnątrz włókien celulozowych (Wang, T., Byun, Y., Kim, J.-S., Liang, J., Yang, V.C. International Journal of Bio-Chromatography Volume 6, Issue 2, 2001,

PL 235 185 B1

Pages 133-149). Wykazano, że przy przepływie krwi 100 mL/min skonstruowany bioreaktor usuwał ponad 50% podanej heparyny w ciągu 10 minut. Podczas gdy szybkie wstrzyknięcie protaminy u psów powoduje silne niedociśnienie, zastosowanie bioreaktora zawierającego immobilizowaną protaminę nie spowodowało żadnych statystycznie istotnych zmian w monitorowanych parametrach hemodynamicznych. Inne doniesienie opisuje skuteczne usuwanie heparyny przy pomocy kulek otrzymanych z alginianu i poli-L-lizyny (M. Sunil Varghese, D. Hildebrandt, and D. Glasser, N. J. Crowther, D. M. Rubin, Artificial Cells, Blood Substitutes, and Biotechnology, 34: 419-432, 2006).

Znane jest oddziaływanie pomiędzy chitozanem o wzorze 4 (R oznacza H lub COCH3) i heparyną. Na przykład otrzymano nanosfery wkraplając roztwór heparyny do roztworu chitozanu (Liu, Z., Jiao, Y., Liu, F., Zhang, Z. (2007) Journal of Biomedical Materials Research - Part A, 83 (3), pp. 806-812) lub mikrosfery chitozanu usieciowanego epichlorohydryną pokryte heparyną poprzez zanurzenie w jej roztworze. Jednak nie ma doniesień dotyczących zastosowania polimerów chitozanowych do usuwania heparyny z krwi lub innych płynów fizjologicznych.

W opisie zgłoszenia patentowego WO 96 022 58 ujawniono zastosowanie chitozanu z przyłączoną do niego heparyną do wytwarzania środka antyadhezyjnego, przeznaczonego do zapobiegania lub do istotnej redukcji niepożądanej adhezji tkanki otaczającej tkankę uszkodzoną np. w procesie leczenia ran. W publikacji EP 1260237 ujawniono polimer chitozanowy sieciowany genipiną oraz jego zastosowanie do wytwarzania implantów albo opatrunków. W opisie zgłoszenia patentowego WO 2007100588 ujawniono hydrożel wykorzystywany w biosensorze, w którym genipina jest tu używana do usieciowania chitozanu w formie filmu. W żadnym z trzech przytoczonych dokumentów nie wspomina się o możliwości usuwania heparyny z krwi ani za pomocą chitozanu, ani za pomocą chitozanu usieciowanego genipiną.

Przedmiotem wynalazku jest polimer chitozanowy usieciowany genipiną, o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza H lub COCH3, lub grupę -CH2CH(OH)CH2N+(CH3)3 albo grupę X o wzorze 2 lub o wzorze 3, przy czym przynajmniej jedno R musi oznaczać grupę X, a n i m są liczbami naturalnymi, do zastosowania do usuwania heparyny z krwi i płynów fizjologicznych u ssaka.

Korzystnie polimer stosuje się w formie mikrosfer. Są to najkorzystniej hydrożelowe mikrosfery otrzymane w wyniku reakcji w odwróconej emulsji. Hydrożelowe mikrosfery polimeru chitozanu usieciowanego genipiną otrzymuje się mieszając roztwór chitozanu i rozpuszczalnik organiczny niemieszający się z wodą, korzystnie cykloheksan, a następnie powstałe mikrosfery sieciuje się dodając roztwór genipiny i ogrzewając w temperaturze, w której zarówno woda, jak i rozpuszczalnik organiczny są ciekłe, najkorzystniej w temperaturze, w której woda jak i rozpuszczalnik są ciekłe, najkorzystniej w temp. 60°C. W celu otrzymania polimeru, w którym R oznacza grupę -CH2CH(OH)CH2N(CH3)3 otrzymane powyżej mikrosfery poddaje się reakcji z chlorkiem glicydylotrimetyloamoniowym.

Polimer według wynalazku korzystnie stosuje się również w formie filmu. Polimer w formie filmu otrzymuje się dodając genipinę do roztworu chitozanu, który wylewa się na powierzchnię i utrzymuje w temperaturze 0-100°C, korzystnie w temperaturze 50°C, aż do uzyskania odpowiedniego stopnia usieciowania. W celu otrzymania filmu polimeru, w którym R oznacza grupę -CH2CH(OH)CH2N(CH3)3 film opisany powyżej poddaje się reakcji z chlorkiem glicydylotrimetyloamoniowym.

Polimer według wynalazku może znaleźć zastosowanie jako wypełnienie w urządzeniach do pozaustrojowego usuwania heparyny. Usieciowane genipiną polimery chitozanowe wiążą heparynę w roztworze wodnym. Szybkość i wydajność wiązania zależą od pH i zmniejszają się ze wzrostem pH roztworu. Jednakże w pH 7,4, charakterystycznym dla krwi, wiązanie heparyny może być w części przypadków zbyt wolne i mało wydajne. Podstawienie chitozanu chlorkiem glicydylotrimetyloamoniowym (GTMAC) zdecydowanie zwiększa wydajność i szybkość adsorpcji heparyny w pH 7,4 charakterystycznym dla krwi. GTMAC nie ulega protonowaniu zależnemu od wartości pH, dlatego nadaje makrocząsteczce ładunek dodatni nawet przy wyższych wartościach pH. Ponadto chitozan podstawiony GTMAC wykazuje bardziej skuteczne działanie antybakteryjne i przeciwgrzybicze w porównaniu z niepodstawionym chitozanem, co jest dodatkową zaletą korzystnej postaci wynalazku.

Szybkość procesu adsorpcji heparyny może być dostosowana do potrzeb poprzez zastosowanie polimeru w formie mikrosfer w odpowiedniej ilości i doborowi masy użytych mikrosfer.

Jedną z głównych zalet polimeru według wynalazku, jest to, że chitozan i genipina są niedrogie i nietoksyczne. Chitozan jest dobrze znanym biodegradowalnym i biozgodnym polimerem. Znalazł on wiele biomedycznych zastosowań w postaci roztworu, filmów i mikrosfer. Genipina (wzór 5) jest naturalnym nietoksycznym środkiem sieciującym wyekstrahowanym z owoców Gardenia jasminoides. Sieciowanie genipiną łatwo jest kontrolować, ponieważ usieciowany polimer staje się intensywnie

PL 235 185 B1 niebieski. Również surfaktanty użyte do stabilizowania emulsji przy wytwarzaniu mikrosfer znane są z nietoksyczności.

Zbadano również możliwość desorpcji heparyny związanej z polimerem według wynalazku. Stwierdzono, że dodanie stężonego roztworu NaCl do zawiesiny mikrosfer ChGpGl zawierających zaadsorbowaną heparynę prowadziło do desorpcji heparyny, zatem polimer według wynalazku może być używany ponownie do usuwania heparyny.

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach wykonania. W eksperymentach przedstawionych w przykładach użyto następujących produktów: niskocząsteczkowy chitozan (Ch) (Aldrich), genipina (Gp, Challenge Bioproducts Co., Ltd., 98%), chlorek glicydylotrimetyloamoniowy (GTMAC, Fluka, 90%), sodowa sól heparyny z błony śluzowej jelita wołowego (Sigma), Span 80 (Fluka), Span 40 (Fluka), Azur A (Fluka, standard Fluka), chlorek potasu (do analizy, POCh), diwodorofosforan potasu (do analizy, POCh), wodorofosforan disodowy (do analizy, POCh), chlorek sodowy (do analizy, POCh), cykloheksan (Lach-Ner, do analizy) i kwas octowy (POCh). Związki te zastosowano bez oczyszczania. Woda została przedestylowana dwukrotnie i oczyszczona za pomocą Millipore Simplicity System.

Wyniki badań przedstawiono na rysunkach, przy czym:

Fig. 1 przedstawia zależność względnego stężenia heparyny (co=200 ąg/ml, V=5 ml) od czasu po dodaniu 40 mg mikrosfer ChGp do roztworu buforowego o pH równym 6,0 (·), 6,8 (), 7,4 (♦) i 8,0. (A).

Fig. 2 przedstawia zależność względnego stężenia heparyny (co=200 ąg/mL, V=5 mL) od czasu dla 40 (·) i 150 mg () mikrosfer ChGp dodanych w pH 6,8 (a) i dla 20 (·), 40 () i 80 mg (♦) mikrosfer ChGp dodanych w pH 7,4 (b).

Fig. 3 przedstawia zależność względnego stężenia heparyny (co=200 ąg/ml, V=5 ml) od czasu po dodaniu 40 mg mikrosfer ChGp (·) i ChGpGl () w pH 7,4.

Fig. 4 przedstawia zależność względnego stężenia heparyny (co=200 ąg/ml, V=5 ml, bufor PBS) od czasu dla 20 (·), 40 () i 80 mg (♦) mikrosfer ChGpGl w pH 7,4.

P r z y k ł a d 1

Synteza mikrosfer chitozanowych usieciowanych genipiną (ChGp)

Chitozan (0,5 g) został rozpuszczony w 35 ml 0,7% obj./obj. kwasu octowego, następnie dializowany względem wody w celu usunięcia kwasu octowego. Po dializie wartość pH wynosiła 5,2. Powyższy roztwór chitozanu został zmieszany z 250 ml cykloheksanu w kolbie okrągłodennej o pojemności 500 ml zawierającej 0,5 g surfaktanta Span 80 i 0,25 g surfaktanta Span 40. Mieszaninę emulsyfikowano mieszając mieszadłem mechanicznym z szybkością 1200 obrotów na minutę. Następnie dodano ml 5% wag./obj. roztworu genipiny w 70% obj./obj. roztworze etanolu. Mieszaninę ogrzano do temperatury 60°C i kontynuowano mieszanie. Po 3 godzinach faza wodna nabrała niebieskawego koloru, co wskazywało na zajście reakcji sieciowania genipiną. Mieszaninę pozostawiono na noc bez mieszania w temperaturze pokojowej. Otrzymane mikrosfery chitozanowe przemyto dużą ilością cykloheksanu i odfiltrowano na lejku Buchnera. Mikrosfery osuszono przy użyciu bibuły filtracyjnej i przechowywano w lodówce szczelnie zamknięte, aby zapobiec ich wyschnięciu. Część mikrosfer została osuszona w 40°C w suszarce próżniowej.

P r z y k ł a d 2

Synteza filmu polimeru chitozanowego usieciowanego genipiną (ChGp)

Chitozan (0,5 g) został rozpuszczony w 35 ml 0,7% obj./obj. kwasu octowego, następnie dializowany względem wody w celu usunięcia kwasu octowego. Po dializie wartość pH wynosiła 5,2. 3,5 ml tego roztworu zmieszano z 40 ąl 5% wag./obj. roztworu genipiny w wodnym roztworze etanolu 70% obj./obj. Otrzymaną mieszaninę wylano na szalkę Petriego, nakryto i podgrzewano w 50°C przez

h. Film był gotowy po upływie doby.

P r z y k ł a d 3

Synteza mikrosfer chitozanowych zmodyfikowanych kationowo (ChGpGl)

Około 0,25 g mikrosfer ChGp umieszczono na 5 h w 50 ml rozcieńczonego kwasu octowego o pH około 5. Następnie zawiesinę mikrosfer w powyższym roztworze umieszczono w kolbie okrągłodennej o objętości 100 ml i dodano 10 ml GTMAC. Mieszano mieszadłem mechanicznym utrzymując temperaturę 55°C. Mikrosfery odfiltrowano pod zmniejszonym ciśnieniem i przemyto kilkakrotnie dużą ilością metanolu, a następnie buforem o pH 7,4, w którym wykonywano dalsze badania mikrosfer.

P r z y k ł a d 4

Badania adsorpcji heparyny przez mikrosfery ChGp

Stężenie heparyny w roztworze oznaczano spektrofotometrycznie stosując barwnik Azur A. W skrócie, do 0,1 ml roztworu heparyny dodano 0,9 ml odpowiedniego buforu i 1 ml roztworu Azuru A o stężeniu

PL 235 185 B1

4.0-10^-5 M. Roztwór następnie wymieszano i zmierzono jego widmo absorpcyjne. Stężenie heparyny oznaczano na podstawie intensywności pasma absorpcyjnego przy 630 nm, które odpowiada monomerycznym cząsteczkom Azuru A.

Adsorpcję heparyny przez mikrosfery zbadano dodając mikrosfery do buforowanych wodnych roztworów heparyny i mierząc zmiany stężenia heparyny, stosując metodę kolorymetryczną wykorzystującą Azur A jako titrant. Stwierdzono, że w 5 ml roztworu buforowego o pH 6,0 stężenie heparyny spada od początkowej wartości 200 pg/ml prawie do zera w ciągu 50 minut po dodaniu 40 mg mikrosfer ChGp (Fig. 1). Ilość heparyny zaadsorbowanej przez mikrosfery ChGp zmienia się drastycznie ze zmianą pH w zakresie 6,0-8,0. Podczas gdy w pH 6,8 heparyna może być praktycznie całkowicie usunięta z 5 ml roztworu o stężeniu 200 pg/mL przez 40 mg mikrosfer ChGp, w pH 7,4-8,0 zaledwie około 20% heparyny może zostać zaadsorbowane w tych samych warunkach.

Zbadano również jak ilość mikrosfer ChGp wpływa na profil adsorpcji heparyny i czy ilość heparyny zaadsorbowanej przy wyższych wartościach pH może być zwiększona przez zwiększenie ilości mikrosfer ChGp (Fig. 2). Stwierdzono, że w pH 6,8 ilość dodanych mikrosfer ChGp silnie wpływa na szybkość adsorpcji heparyny. Wzrost masy mikrosfer ChGp z 40 do 150 mg skraca czas potrzebny do zmniejszenia stężenia heparyny o 50% z 25 do 10 minut. Z drugiej strony, w pH 7,4 adsorpcja heparyny jest dużo wolniejsza, mniej wydajna i mniej wrażliwa na ilość dodanych mikrosfer ChGp. Dodatek 80 g mikrosfer ChGp powodował niewielki i wolny spadek stężenia heparyny - do 60% jego początkowej wartości w ciągu 50 minut.

P r z y k ł a d 5

Badania adsorpcji heparyny przez mikrosfery ChGpGl

Badanie przeprowadzono sposobem jak w przykładzie 4. Zdolność adsorpcyjna mikrosfer ChGpGl w stosunku do heparyny, zarówno jeśli chodzi o szybkość adsorpcji, jak i ilość zaadsorbowanej heparyny w przeliczeniu na jednostkę masy mikrosfer, uległa zdecydowanej poprawie dzięki podstawieniu mikrosfer ChGp grupami amoniowymi. Fig. 3 przedstawia porównanie adsorpcji heparyny przez identyczne masy mikrosfer ChGp i ChGpGl. Podczas gdy w pH 7,4 40 mg mikrosfer ChGp może zaadsorbować jedynie około 20% heparyny w 5 ml roztworu zawierającego 200 pg/mL heparyny, mikrosfery ChGpGl mogą związać 90% heparyny w tych samych warunkach eksperymentalnych. Proces ten jest bardzo szybki; spadek stężenia heparyny o 50% następuje w ciągu około 5 minut. Porównywalną szybkość adsorpcji heparyny przez mikrosfery ChGp można uzyskać jedynie stosując znacznie niższe pH i używając kilkakrotnie większą ilość mikrosfer.

W celu sprawdzenia czy szybkość i stopień adsorpcji heparyny mogą być kontrolowane poprzez zmianę ilości użytych mikrosfer wykonano również badanie wiązania heparyny przy użyciu różnych ilości mikrosfer ChGpGl (Fig. 4). Wyniki wskazują, że szybkość wiązania heparyny może być zwiększona poprzez zastosowanie większej ilości mikrosfer ChGpGl.

P r z y k ł a d 6

Regeneracja mikrosfer ChGpGl

Zawieszono 80 mikrosfer ChGpGl w 5 ml buforu o pH 7,4 zawierającego 1 mg heparyny. Metodą spektrofotometryczną wykazano, że stężenie heparyny spadło prawie do 0 w ciągu 10 minut. Zawiesinę następnie odwirowywano z szybkością 12 000 obrotów na minutę przez 3 minuty. Usunięto 2,5 ml roztworu i zastąpiono taką samą objętością 2 M roztworu NaCl. Zawiesinę wymieszano, umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na 5 minut i odwirowywano przez następne 5 minut. Pobrano roztwór znad mikrosfer i oznaczono stężenie heparyny metodą spektrofotometryczną stosując Azur A jako barwnik. Wykazano, że w 1 M roztworze NaCl około 55% związanej heparyny ulega desorpcji z mikrosfer ChGpGl. Mikrosfery ChGpGl mogą być zatem potencjalnie używane ponownie do usuwania heparyny.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Polimer chitozanowy usieciowany genipiną, o wzorze 1,

   lub -COCH3, lub

   Wzór 1 w którym R oznacza H o wzorze 2

   -CH₂CH(OH)CH₂N⁺(CH3)3 albo grupę X grupę

   Wzór 2 lub o wzorze 3,

   przy czym przynajmniej jedno R musi oznaczać grupę X, a n i m są liczbami naturalnymi, do zastosowania do usuwania heparyny z krwi i płynów filologicznych u ssaka.
2. 2. Polimer chitozanowy według zastrz. 1, znamienny tym, że jest przeznaczony do zastosowania w postaci mikrosfer.
3. 3. Polimer chitozanowy według zastrz. 1, znamienny tym, że jest przeznaczony do zastosowania w postaci filmu.