PL235053B1

PL235053B1 - Method for producing hyaluronic acid

Info

Publication number: PL235053B1
Application number: PL420924A
Authority: PL
Inventors: Tomasz Kapela; Tomasz Grabowski
Original assignee: Biologistyka Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date: 2017-03-21
Filing date: 2017-03-21
Publication date: 2020-05-18
Also published as: PL420924A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania kwasu hialuronowego z wykorzystaniem hodowli kultur bakterii zdolnych do produkcji kwasu hialuronowego, obejmujący kolejne etapy: przygotowania inokulum, zaszczepienia fermentora i hodowli bakterii oraz czynności pofermentacyjnych (ang. downstream) charakteryzuje się tym, że: podłoże hodowlane poddaje się zaszczepieniu kulturą bakterii zdolną do produkcji kwasu hialuronowego, następnie zaszczepione podłoże hodowlane namnaża się na wytrząsarce przy obrotach w zakresie od 100 do 250 obr/min, w temperaturze od 30 do 37°C w czasie od 10 do 24 godz.; następnie fermentor wypełnia się podłożem hodowlanym, po czym podłoże hodowlane szczepi się inokulum w objętości od 5 do 20% obj. fermentora, a następnie prowadzi się hodowlę w temp. od 30 do 37°C, przy stężeniu tlenu od 10 do 40%, w czasie od 12 do 24 godz.; a następnie zawiesinę poddaje się wirowaniu na wirówce ciągłej przy obrotach od 10000 do 15000 obr/min, po czym komórki bakteryjne zawiesza się w wodzie dejonizowanej z dodatkiem od 0,05 do 0,5% wag. detergentów przy zastosowaniu ultradźwięków w czasie od 0,5 do 2 godz., po czym ponownie wiruje się, a uzyskany supernatant filtruje się na membranach do filtracji stycznej o wielkości porów w zakresie od 2 do 10 kDa, po czym filtrat schładza się do temperatury od 4 do 10°C, a następnie dodaje się rozpuszczalnik organiczny o temperaturze od -20 do -10°C w objętości od 100 do 300% obj. w stosunku do filtratu, po czym mieszaninę filtratu i rozpuszczalnika organicznego pozostawia się w temperaturze od -20 do -10°C na czas od 12 do 24 godz., a następnie zawiesinę kwasu hialuronowego odwirowuje się przy obrotach od 5000 do 10000 obr/min, po czym otrzymany osad kwasu hialuronowego rozpuszcza się w wodzie (123) o temperaturze od 40 do 70°C oraz filtruje, a następnie filtrat schładza się do temperatury od 4 do 10°C oraz dodaje się rozpuszczalnik organiczny o temperaturze od -20 do -10°C w objętości od 100 do 300% obj. w stosunku do filtratu, a następnie mieszaninę filtratu i rozpuszczalnika organicznego wytrąca się w temperaturze od -20 do -10°C w czasie od 12 do 24 godz., po czym osad kwasu hialuronowego suszy się w temperaturze od 20 do 40°C pod ciśnieniem od 5 do 300 mbar.The subject of the application is a method of producing hyaluronic acid using cultures of bacteria capable of producing hyaluronic acid, including the following stages: preparation of inoculum, inoculation of the fermenter and bacterial culture, as well as post-fermentation activities (downstream), characterized by the following: the culture medium is inoculated with the culture bacteria capable of producing hyaluronic acid, then the inoculated culture medium is multiplied on a shaker at a speed ranging from 100 to 250 rpm, at a temperature from 30 to 37°C for 10 to 24 hours; then the fermenter is filled with culture medium, after which the culture medium is inoculated with inoculum in a volume of 5 to 20% by volume. fermenter, and then culture is carried out at a temperature of 30 to 37°C, with an oxygen concentration of 10 to 40%, for 12 to 24 hours; and then the suspension is centrifuged in a continuous centrifuge at a speed of 10,000 to 15,000 rpm, after which the bacterial cells are suspended in deionized water with the addition of 0.05 to 0.5% by weight. detergents using ultrasound for 0.5 to 2 hours, then centrifuged again, and the obtained supernatant is filtered on tangential filtration membranes with pore sizes ranging from 2 to 10 kDa, and then the filtrate is cooled to a temperature of 4 to 10°C, and then an organic solvent with a temperature of -20 to -10°C is added in a volume of 100 to 300% vol. in relation to the filtrate, then the mixture of filtrate and organic solvent is left at a temperature of -20 to -10°C for 12 to 24 hours, and then the hyaluronic acid suspension is centrifuged at a speed of 5,000 to 10,000 rpm, then the obtained hyaluronic acid precipitate is dissolved in water (123) with a temperature of 40 to 70°C and filtered, and then the filtrate is cooled to a temperature of 4 to 10°C and an organic solvent with a temperature of -20 to -10 is added °C in volume from 100 to 300% vol. in relation to the filtrate, and then the mixture of filtrate and organic solvent is precipitated at a temperature of -20 to -10°C for 12 to 24 hours, and then the hyaluronic acid precipitate is dried at a temperature of 20 to 40°C under pressure from 5 to 300 mbar.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu hialuronowego.The present invention relates to a method of producing hyaluronic acid.

Kwas hialuronowy jest śluzowatym, liniowym heteropolisacharydem należącym do grupy glikozaminoglikanów o masie cząsteczkowej w zakresie zazwyczaj od 50000 do 8000000 Da. Łańcuch polimerowy kwasu hialuronowego jest złożony z naprzemiennie występujących jednostek kwasu D-glukuronowego oraz N-acetylo-D-glukozaminy, które są połączone ze sobą za pomocą naprzemiennie występujących wiązań 1-3 oraz 1-4 glikozydowych. Kwas hialuronowy w roztworach wodnych stanowi konformację sztywnej lewoskrętnej helisy, która jest stabilizowana za pośrednictwem mostków wodorowych.Hyaluronic acid is a mucilaginous, linear heteropolysaccharide belonging to the group of glycosaminoglycans with a molecular weight typically ranging from 50,000 to 8,000,000 Da. The polymer chain of hyaluronic acid is composed of alternating units of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine, which are linked to each other by alternating 1-3 and 1-4 glycosidic bonds. Hyaluronic acid in aqueous solutions is the conformation of a rigid left-handed helix that is stabilized by hydrogen bridges.

Kwas hialuronowy znajduje bardzo szerokie zastosowanie w rozmaitych dziedzinach medycyny oraz kosmetologii, między innymi w okulistyce, dermatologii, radioterapii, reumatologii, ginekologii czy chirurgii. W okulistyce, kwas hialuronowy stosuje się między innymi, w chirurgii zaćmy, rogówki, jaskry, tylnego odcinka oka , zeza i urazów. W dermatologii stosuje się go między innymi w leczeniu oparzeń i blizn, jako matrycę do autologicznych przeszczepów skóry, jako leki wspomagające leczenie owrzodzeń czy uzupełnianiu ubytków tkanki podskórnej wynikających z terapii przeciwwirusowej u chorych na AIDS. W radioterapii kwas hialuronowy jest wykorzystywany między innymi jako krem zmniejszający częstość reakcji zapalnych po naświetleniach raków głowy, szyi, piersi i narządów miednicy. W reumatologii i ortopedii stosowanie kwasu hialuronowego pozwala między innymi na łagodzenie objawów choroby zwyrodnieniowej i reumatoidalnego zapalenia stawów, zmniejszając ból i poprawiając motorykę stawów lub również jako matryca do przeszczepów chrząstki. W ginekologii kwas hialuronowy może być wykorzystywany między innymi do leczenia uszkodzeń spowodowanych zabiegami chirurgicznymi, jako matryca do leków ginekologicznych oraz jako środek poprawiający gojenie się zmian w pochwie po napromieniowaniu. W chirurgii kwas hialuronowy aplikuje się na rany, dzięki czemu uzyskuje się szybsze gojenie ran oraz łagodniejsze bliznowacenie. Ponadto hialuronowy może być stosowany w zapobieganiu zrostów po operacjach jamy brzusznej czy korekcji defektów twarzy.Hyaluronic acid is widely used in various fields of medicine and cosmetology, including ophthalmology, dermatology, radiotherapy, rheumatology, gynecology and surgery. In ophthalmology, hyaluronic acid is used in cataract, corneal, glaucoma, posterior eye surgery, strabismus and trauma, among others. In dermatology, it is used, inter alia, in the treatment of burns and scars, as a matrix for autologous skin transplants, as drugs supporting the treatment of ulcers or replacing subcutaneous tissue defects resulting from antiviral therapy in AIDS patients. In radiotherapy, hyaluronic acid is used, among others, as a cream that reduces the frequency of inflammatory reactions after irradiation of head, neck, breast and pelvic cancers. In rheumatology and orthopedics, the use of hyaluronic acid allows, inter alia, to alleviate the symptoms of degenerative disease and rheumatoid arthritis, reducing pain and improving joint motility, or also as a matrix for cartilage transplants. In gynecology, hyaluronic acid can be used, inter alia, to treat damage caused by surgical procedures, as a matrix for gynecological drugs, and as a means of improving the healing of vaginal lesions after irradiation. In surgery, hyaluronic acid is applied to wounds, which results in faster wound healing and milder scarring. In addition, hyaluronic acid can be used to prevent adhesions after abdominal surgery or to correct facial defects.

Kwas hialuronowy występuje naturalnie we wszystkich tkankach i płynach ustrojowych kręgowców, a jego najwyższe stężenia występują przykładowo w mięśniu sercowym i zastawkach wsierdzia, pępowinie, ciele szklistym oka, płynie okołostawowym oraz błonie śluzowej jamy ustnej.Hyaluronic acid occurs naturally in all tissues and body fluids of vertebrates, and its highest concentrations are found, for example, in the myocardium and endocardial valves, the umbilical cord, the vitreous body of the eye, periarticular fluid, and oral mucosa.

Związek ten jest również syntetyzowany przez organizmy niższe - wchodzi w skład otoczek ścian komórkowych bakterii, przykładowo Streptococcus pyogenes, Aerobacter aerogenes oraz Pasteurella. Kwas hialuronowy pochodzenia bakteryjnego ma identyczny skład z kwasem hialuronowym pochodzącym od organizmów wyższych, co uniemożliwia organizmowi gospodarza uruchomienia mechanizmów obronnych, takich jak proces fagocytozy czy uczynnienie układu dopełniacza wobec czynnika wirulencji jakim jest kwas hialuronowy pochodzenia bakteryjnego. Dzięki temu bakteryjny kwas hialuronowy może być wykorzystywany w medycynie czy kosmetologii.This compound is also synthesized by lower organisms - it is part of bacterial cell wall envelopes, for example Streptococcus pyogenes, Aerobacter aerogenes and Pasteurella. Hyaluronic acid of bacterial origin has an identical composition to hyaluronic acid from higher organisms, which prevents the host organism from activating defense mechanisms, such as the phagocytosis process or activating the complement system against the virulence factor, which is bacterial hyaluronic acid. Thanks to this, bacterial hyaluronic acid can be used in medicine and cosmetology.

W praktyce, podstawowym sposobem otrzymywania kwasu hialuronowego jest jego izolacja z tkanek organizmów zwierzęcych, przykładowo ze skóry rekina, oczu bydlęcych, pępowiny, płynu stawowego kurczaków, a w szczególności z grzebieni kogucich. Niemniej jednak, kwas hialuronowy występuje naturalnie w organizmach zwierzęcych w formie kompleksu z innymi biopolimerami, przykładowo białkami, które zanieczyszczając preparaty kwasu hialuronowego wykazują działanie alergenne. Z tego względu, istnieje konieczność oczyszczania preparatów w celu uzyskania czystego kwasu.In practice, the basic method of obtaining hyaluronic acid is its isolation from animal tissues, for example shark skin, bovine eyes, umbilical cord, chicken synovial fluid, and in particular rooster's combs. Nevertheless, hyaluronic acid occurs naturally in animal organisms in the form of a complex with other biopolymers, for example proteins, which, by contaminating hyaluronic acid preparations, have an allergenic effect. Therefore, it is necessary to purify the preparations in order to obtain a pure acid.

Ze względu na wyżej wymienione niedoskonałości kwasu hialuronowego otrzymywanego z tkanek zwierzęcych, związek ten otrzymuje się również za pomocą metody bazującej na hodowli odpowiednich szczepów bakterii, przykładowo bakterii Streptococcus. Bakterie tego gatunku są w stanie przetwarzać glukozę oraz produkować kwas hialuronowy jako drugorzędowy metabolit, który wykorzystują do budowania otoczek ochronnych. Kwas hialuronowy pochodzenia mikrobiologicznego charakteryzuje się wyższą czystością oraz niższym kosztem produkcji w porównaniu do kwasu hialuronowego pochodzenia zwierzęcego.Due to the above-mentioned imperfections of hyaluronic acid obtained from animal tissues, this compound is also obtained by a method based on the cultivation of appropriate bacterial strains, for example Streptococcus bacteria. Bacteria of this species are able to process glucose and produce hyaluronic acid as a secondary metabolite, which they use to build protective envelopes. Hyaluronic acid of microbial origin is characterized by higher purity and lower production cost compared to hyaluronic acid of animal origin.

Z literatury patentowej znane są rozwiązania dotyczące otrzymywania kwasu hialuronowego z tkanek zwierzęcych oraz mikroorganizmów.The patent literature provides solutions for the production of hyaluronic acid from animal tissues and microorganisms.

Z amerykańskiego dokumentu patentowego US4141973 znany jest sposób izolowania kwasu hialuronowego o wysokiej masie cząsteczkowej z tkanek zwierzęcych o jego wysokiej zawartości. Otrzymywanie kwasu hialuronowego według powyższego wynalazku odbywa się w procesie zawierającym etapy: usuwania krwi z tkanki zwierzęcej, ekstrakcji kwasu hialuronowego, deproteinizacji ekstraktu kwasu hialuronowego, usuwanie jakichkolwiek czynników wywołujących zapalenie poprzez obróbkęUS4141973 discloses a method for isolating high molecular weight hyaluronic acid from animal tissues with its high content. The preparation of hyaluronic acid according to the above invention is carried out in a process comprising the steps of: removing blood from animal tissue, extracting hyaluronic acid, deproteinizing hyaluronic acid extract, removing any inflammatory factors by treatment

PL 235 053 B1 ekstraktu kwasu hialuronowego o pH równym 7 chloroformem oraz oddzielenie fazy chloroformu od kwasu hialuronowego. Otrzymany w ten sposób czysty kwas hialuronowy nie zawiera mikroorganizmów, białek ani pirogenów, więc jego stosowanie nie wywołuje stanów zapalnych.Of hyaluronic acid extract with a pH of 7 with chloroform and separation of the chloroform phase from hyaluronic acid. The pure hyaluronic acid obtained in this way does not contain microorganisms, proteins or pyrogens, so its use does not cause inflammation.

Z amerykańskiego dokumentu patentowego US4801539 znany jest sposób otrzymywania kwasu hialuronowego na drodze fermentacji mikrobiologicznej paciorkowców wyizolowanych przykładowo ze spojówki gałki ocznej świnki morskiej. Podłoże hodowlane według przykładowego sposobu wykonania składa się z glukozy, ekstraktu drożdżowego oraz przeciwspieniacza polieterowego. Sterylną pożywkę mikrobiologiczną szczepiono komórkami bakterii Streptococcus zooepidemicus, po czym hodowlę prowadzono przez okres dwóch dni. Po tym okresie usunięto białka z mieszaniny za pomocą roztworu chloroformu z alkoholem izoamylowym, a składniki o niskiej masie cząsteczkowej usunięto poprzez zastosowanie ultrafiltracji. Następnie kwas hialuronowy odzyskiwano za pomocą liofilizacji. Kwas hialuronowy otrzymany metodą według wynalazku jest wolny od zanieczyszczenia streptolizyną, co jest pożądane w przypadku stosowania do go kompozycji naskórnych.The US patent US4801539 discloses a method of obtaining hyaluronic acid by microbial fermentation of streptococci isolated, for example, from the conjunctiva of a guinea pig. The culture medium of an exemplary embodiment consists of glucose, yeast extract, and a polyether antifoam. The sterile microbial medium was inoculated with Streptococcus zooepidemicus bacterial cells, and the cultivation was carried out for two days. After this period, proteins were removed from the mixture with a chloroform / isoamyl alcohol solution, and the low molecular weight components were removed by ultrafiltration. Subsequently, hyaluronic acid was recovered by lyophilization. The hyaluronic acid obtained by the method of the invention is free of streptolysin contamination, which is desirable when applied to skin compositions.

Z amerykańskiego dokumentu patentowego US4517295 znany jest sposób otrzymywania kwasu hialuronowego na drodze procesu zawierającego etapy: fermentacji mikrobiologicznej paciorkowców, następnie oddzielania bakterii od bulionu oraz izolowania kwasu hialuronowego od pozostałych zawartości bulionu. Fermentację, według powyższego wynalazku przeprowadza się w warunkach beztlenowych, w środowisku wzbogaconym o dwutlenek węgla. Zastosowanie rozwiązania według wynalazku pozwala na uzyskanie kwasu hialuronowego o wysokiej czystości, z wysoką wydajnością.From the US patent US4517295 there is known a method of obtaining hyaluronic acid by a process comprising the steps of: microbial fermentation of streptococci, then separating the bacteria from the broth and isolating hyaluronic acid from the remaining contents of the broth. The fermentation according to the above invention is carried out under anaerobic conditions in a carbon dioxide enriched environment. The use of the solution according to the invention allows to obtain hyaluronic acid of high purity, with high efficiency.

Z amerykańskiego dokumentu patentowego US4897349 znany jest sposób biosyntezy kwasu hialuronowego oparty na fermentacji z wykorzystaniem bakterii S. zooepidemicus, S. equisimilis lub S. pyogenes. Dzięki zastosowaniu podłoża hodowlanego zawierającego takie składniki odżywcze jak węglowodany, aminokwasy, witaminy, sole nieorganiczne oraz substancje dodatkowe ze względu na bardzo złożone wymagania żywieniowe paciorkowców, oraz przy kontroli stężenia dwutlenku węgla podczas fermentacji, uzyskano ogólną poprawę wydajności otrzymywanego kwasu hialuronowego.From the US patent US4897349 there is known a method of biosynthesis of hyaluronic acid based on fermentation using the bacteria S. zooepidemicus, S. equisimilis or S. pyogenes. Due to the very complex nutritional requirements of streptococci, and the control of carbon dioxide concentration during fermentation, an overall improvement in the yield of hyaluronic acid was achieved thanks to the use of a culture medium containing such nutrients as carbohydrates, amino acids, vitamins, inorganic salts and additives.

Mimo istniejących rozwiązań w dziedzinie otrzymywania kwasu hialuronowego ze źródeł biologicznych, nadal istnieje potrzeba udoskonalenia tych technologii w celu obniżenia kosztów produkcji oraz ograniczenia stosowania wybuchowych rozpuszczalników organicznych.Despite the existing solutions in the field of obtaining hyaluronic acid from biological sources, there is still a need to improve these technologies in order to reduce production costs and limit the use of explosive organic solvents.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu hialuronowego z wykorzystaniem hodowli kultur bakterii zdolnych do produkcji kwasu hialuronowego, obejmujący kolejne etapy: przygotowania inokulum, zaszczepienia fermentora i hodowli bakterii oraz czynności pofermentacyjnych (ang. downstream) charakteryzujący się tym, że: podłoże hodowlane poddaje się zaszczepieniu kulturą bakterii zdolną do produkcji kwasu hialuronowego, następnie zaszczepione podłoże hodowlane namnaża się na wytrząsarce przy obrotach w zakresie od 100 do 250 obr./min, w temperaturze od 30 do 37°C w czasie od 10 do 24 godz.; następnie fermentor wypełnia się podłożem hodowlanym, po czym podłoże hodowlane szczepi się inokulum w objętości od 5 do 20% obj. fermentora, a następnie prowadzi się hodowlę w temp. od 30 do 37°C, przy stężeniu tlenu od 10 do 40%, w czasie od 12 do 24 godz.; a następnie zawiesinę poddaje się wirowaniu na wirówce ciągłej przy obrotach od 10000 do 15000 obr./min, po czym komórki bakteryjne zawiesza się w wodzie dejonizowanej z dodatkiem od 0,05 do 0,5% wag. detergentów przy zastosowaniu ultradźwięków w czasie od 0,5 do 2 godz., po czym ponownie wiruje się, a uzyskany supernatant filtruje się na membranach do filtracji stycznej o wielkości porów w zakresie od 2 do 10 kDa, po czym filtrat schładza się do temperatury od 4 do 10°C, a następnie dodaje się rozpuszczalnik organiczny o temperaturze od -20 do - 10°C w objętości od 100 do 300% obj. w stosunku do filtratu, po czym mieszaninę filtratu i rozpuszczalnika organicznego pozostawia się w temperaturze od -20 do -10°C na czas od 12 do 24 godz., a następnie zawiesinę kwasu hialuronowego odwirowuje się przy obrotach od 5000 do 10000 obr./min, po czym otrzymany osad kwasu hialuronowego r ozpuszcza się w wodzie (123) o temperaturze od 40 do 70°C oraz filtruje, a następnie filtrat schładza się do temperatury od 4 do 10°C oraz dodaje się rozpuszczalnik organiczny o temperaturze od -20 do -10°C w objętości od 100 do 300% obj. w stosunku do filtratu, a następnie mieszaninę filtratu i rozpuszczalnika organicznego wytrąca się w temperaturze od -20 do -10°C w czasie od 12 do 24 godz., po czym osad kwasu hialuronowego suszy się w temperaturze od 20 do 40°C pod ciśnieniem od 5 do 300 mbar.The subject of the invention is a method for the production of hyaluronic acid with the use of culture of bacteria capable of producing hyaluronic acid, comprising the following steps: preparation of the inoculum, fermenter inoculation and bacterial culture as well as downstream activities characterized in that: the culture medium is inoculated with a culture bacteria capable of producing hyaluronic acid, then the inoculated culture medium is grown on a shaker at a rotation speed ranging from 100 to 250 rpm, at a temperature of 30 to 37 ° C for 10 to 24 hours; then the fermentor is filled with the culture medium, then the culture medium is inoculated with the inoculum at a volume of 5 to 20 vol.%. fermentor, and then cultivation is carried out at the temperature from 30 to 37 ° C, at the oxygen concentration from 10 to 40%, for 12 to 24 hours; and then the suspension is subjected to centrifugation in a continuous centrifuge at 10,000 to 15,000 rpm, then the bacterial cells are suspended in deionized water with the addition of 0.05 to 0.5 wt. of detergents using ultrasound for 0.5 to 2 hours, then centrifuged again, and the obtained supernatant is filtered on tangential filtration membranes with pore sizes ranging from 2 to 10 kDa, after which the filtrate is cooled to a temperature from 4 to 10 ° C, followed by the addition of an organic solvent having a temperature of -20 to -10 ° C in a volume of 100 to 300 vol.%. with respect to the filtrate, then the mixture of the filtrate and the organic solvent is left at a temperature of -20 to -10 ° C for 12 to 24 hours, and then the hyaluronic acid suspension is centrifuged at 5,000 to 10,000 rpm , then the obtained hyaluronic acid precipitate is dissolved in water (123) at a temperature of 40 to 70 ° C and filtered, then the filtrate is cooled to a temperature of 4 to 10 ° C and an organic solvent with a temperature of -20 to -10 ° C in a volume of 100 to 300 vol.% with respect to the filtrate, then the mixture of the filtrate and the organic solvent is precipitated at a temperature of -20 to -10 ° C for 12 to 24 hours, then the precipitate of hyaluronic acid is dried at a temperature of 20 to 40 ° C under pressure from 5 to 300 mbar.

Korzystnie, stosuje się podłoże hodowlane, które zawiera: glukozę w ilości od 2 do 15% wag., glicerol w ilości od 0,1 do 10% wag., siarczan (VI) magnezu (II) w ilości od 0,05 do 0,1% wag., fosforan (V) potasu w ilości od 0,05 do 0,2% wag., namok kukurydziany w ilości od 1 do 5% wag. i ekstrakt drożdżowy w ilości od 2 do 10% wag., pepton kazeinowy w ilości od 1 do 5% wag i pepton sojowy w ilości od 1 do 5% wag.Preferably, a culture medium is used which comprises: glucose in an amount from 2 to 15 wt.%, Glycerol in an amount from 0.1 to 10 wt.%, Magnesium (II) sulfate in an amount from 0.05 to 0 , 1 wt.%, Potassium phosphate in an amount of 0.05 to 0.2 wt.%, Corn steep in an amount of 1 to 5 wt.%. and yeast extract in an amount of 2 to 10 wt%, casein peptone in an amount of 1 to 5 wt% and soy peptone in an amount of 1 to 5 wt%.

PL 235 053 B1PL 235 053 B1

Korzystnie, jako kultury bakterii do produkcji kwasu hialuronowego stosuje się szczepy bakterii rodzaju Streptococcus.Preferably, bacterial cultures of the genus Streptococcus are used as bacterial cultures for the production of hyaluronic acid.

Korzystnie, jako rozpuszczalnik organicznym do wytrącania kwasu hialuronowego stosuje się etanol, metanol, aceton lub izopropanol.Preferably, ethanol, methanol, acetone or isopropanol is used as the organic solvent for the precipitation of hyaluronic acid.

Przedmiot wynalazku przedstawiono w przykładach wykonania na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia schemat blokowy procesu wytwarzania kwasu hialuronowego z wykorzystaniem hodowli kultur bakterii.The subject of the invention is shown in the drawing examples, in which Fig. 1 shows a block diagram of the process of producing hyaluronic acid using bacterial culture.

Na Fig. 1 przedstawiono schematycznie sposób wytwarzania kwasu hialuronowego. Sposób obejmuje trzy etapy: przygotowanie inokulum (I), zaszczepienie fermentora i hodowli (II) oraz czynności pofermentacyjne, zwane z języka angielskiego etapem „downstream” (III). Na etapy składają się operacje jednostkowe: Zaszczepiania 103, 108, namnażania 104, hodowli 109, wirowania 110, 121, zawieszania 111, filtracji 116, schładzania 118, rozpuszczania 124, wytrącania 129 oraz suszenia 131 poszczególnych substratów i produktów pośrednich: podłoża hodowlanego 101,107, inokulum 106, wody detergentów 112, osadu bakteryjnego 114, osadu 117, 126, rozpuszczalnika organicznego 119, 128 oraz wody 123 a także z wykorzystaniem fermentora 106 do uzyskania kwasu hialuronowego 132.Fig. 1 shows a schematic view of the production of hyaluronic acid. The method comprises three steps: preparation of the inoculum (I), inoculation of the fermentor and culture (II), and post-fermentation activities, known as the downstream stage (III). The stages consist of unit operations: inoculation 103, 108, multiplication 104, cultivation 109, centrifugation 110, 121, suspension 111, filtration 116, cooling 118, dissolving 124, precipitation 129 and drying 131 of individual substrates and intermediates: the culture medium 101, 107, inoculum 106, detergent water 112, bacterial pellet 114, pellet 117, 126, organic solvent 119, 128, and water 123, and using fermentor 106 to obtain hyaluronic acid 132.

Kwas hialuronowy (132) według powyższego wynalazku wytwarza się w procesie składającym się z trzech etapów: przygotowania inokulum (I), zaszczepienia fermentora i hodowli (II) oraz tzw. „downstream” (III).Hyaluronic acid (132) according to the above invention is produced in a process consisting of three steps: preparation of the inoculum (I), inoculation of the fermentor and culture (II) and the so-called "Downstream" (III).

Na etapie przygotowania inokulum (I), podłoże hodowlane (101) zawierające w zależności od użytych kultur bakterii: źródło węgla w postaci glukozy w ilości od 2 do 15% wag. i glicerolu w ilości od do 10% wag., sole przykładowo siarczan (VI) magnezu (II) w ilości od 0,2 do 2% wag., oraz forforan (V) potasu w ilości od 0,1 do 1% wag., źródło azotu w postaci namoku kukurydzianego w ilości od 1 do 10% wag. i ekstraktu drożdżowego w ilości od 1 do 10% wag., oraz źródło białka w postaci peptonu kazeinowego w ilości od 1 do 5% wag. i peptonu sojowego w ilości od 1 do 5% wag. poddaje się zaszczepieniu (103) kulturą bakterii rodzaju Streptococcus lub zmodyfikowanym genetycznie szczepem bakterii rodzaju Bacillus (102) zdolną do produkcji kwasu hialuronowego. Następnie, zaszczepione podłoże hodowlane namnaża się (104) na wytrząsarce przy obrotach w zakresie od 100 do 250 obr./min, w temperaturze od 30 do 37°C w czasie od 10 do 24 godz., do osiągnięcia gęstości optycznej podłoża hodowlanego OD 620 w zakresie od 0,6 do 1,2. W kolejnym etapie, zaszczepienia fermentowa i hodowli (II), fermentor( 106) wypełnia się podłożem hodowlanym (107) zawierającym w zależności od użytych kultur bakterii źródło węgla w postaci glukozy w ilości od 2 do 15% wag. i glicerolu w ilości od 2 do 10% wag., sole przykładowo siarczan (VI) magnezu (II) w ilości od 0,2 do 2% wag. oraz fosforan (V) potasu w ilości od 0,1 do 1% wag., źródło azotu w postaci namoku kukurydzianego w ilości od 1 do 10% wag. i ekstraktu drożdżowego w ilości od 1 do 10% wag., oraz źródło białka w postaci peptonu kazeinowego w ilości od 1 do 5% wag i peptonu sojowego w ilości od 1 do 5% wag. oraz szczepi się (108) inokulum (105) w objętości od 5 do 20% obj. fermentora (106). Następnie, prowadzi się hodowlę (109) w temp. Od 30 do 37°C, przy stężeniu tlenu od 10 do 40%, w czasie od 12 do 24 godz., do osiągnięcia wartości gęstości optycznej OD620 w zakresie od 12 do 35.At the stage of preparation of the inoculum (I), the culture medium (101) containing, depending on the bacterial cultures used: a carbon source in the form of glucose in an amount of 2 to 15 wt. % and glycerol in an amount of from to 10% by weight, salts, for example, magnesium (II) sulfate in an amount of from 0.2 to 2% by weight, and potassium phosphate in an amount of from 0.1 to 1% by weight. , a source of nitrogen in the form of corn steep in an amount from 1 to 10 wt.%. and yeast extract in an amount of 1 to 10 wt.%, and a casein peptone protein source in an amount of 1 to 5 wt.%. and soy peptone in an amount of 1 to 5 wt.%. subjected to inoculation (103) with a bacterial culture of the genus Streptococcus or with a genetically modified strain of bacteria of the genus Bacillus (102) capable of producing hyaluronic acid. Then, the inoculated culture medium is grown (104) on a shaker at 100 to 250 rpm, 30 to 37 ° C for 10 to 24 hours, until the optical density of the culture medium is OD 620 ranging from 0.6 to 1.2. In the next step, fermentation and culture inoculation (II), the fermentor (106) is filled with the culture medium (107) containing, depending on the bacteria cultures used, a carbon source in the form of glucose in an amount of 2 to 15 wt.%. and glycerol in an amount of 2 to 10 wt.%, salts, for example magnesium (II) sulfate in an amount of 0.2 to 2 wt.%. and potassium phosphate in an amount of 0.1 to 1 wt.%, a corn steep nitrogen source in an amount of 1 to 10 wt.%. and yeast extract in an amount of 1 to 10 wt.%, and a casein peptone protein source in an amount of 1 to 5 wt.% and soy peptone in an amount of 1 to 5 wt.%. and inoculating (108) the inoculum (105) at a volume of 5 to 20 vol. fermenter (106). Then, the cultivation of (109) is carried out at the temperature from 30 to 37 ° C, with the oxygen concentration from 10 to 40%, for 12 to 24 hours, until the optical density value OD620 in the range from 12 to 35 is obtained.

Po zakończonej hodowli (109) w ostatnim etapie procesu, tzw. „downstream” (III) zawiesinę poddaje się wirowaniu (110) na wirówce ciągłej przy obrotach od 10000 do 15000 obr./min. Następnie, komórki bakteryjne zawiesza się (111) w wodzie dejonizowanej z dodatkiem od 0,05 do 0,5% wag. detergentów (112), przykładowo SDS, Triton X100, cholan sodu, Brij 35 przy zastosowaniu ultradźwięków w czasie od 0,5 do 2 godz., po czym ponownie wiruje się (113), w wyniku którego uzyskuje się dwie frakcje: osad bakteryjny (114) oraz supernatant (115) wykorzystywany do dalszej obróbki. Następnie supernatant (115) filtruje się (116) na membranach do filtracji stycznej (ang. TFF - Tangential Flow Filtration) o wielkości porów w zakresie od 2 do 10 kDa w celu usunięcia małych cząstek osadu (117), a filtrat schładza się (118) do temperatury od 4 do 10°C, po czym dodaje się rozpuszczalnik organiczny (119), przykładowo etanol, metanol, aceton czy izopropanol o temperaturze od -20 do -10°C w objętości od 100 do 300% obj. w stosunku do filtratu. Mieszaninę filtratu i rozpuszczalnika organicznego pozostawia się w temperaturze od -20 do -10°C na czas od 12 do 24 godz. Następnie, zawiesinę kwasu hialuronowego odwirowuje się (121) przy obrotach od 5000 do 10000 obr./min, po czym otrzymany osad kwasu hialuronowego (122) rozpuszcza się w wodzie (123) o temperaturze od 40 do 70°C.After the completion of breeding (109) in the last stage of the process, the so-called "Downstream" (III) the suspension is centrifuged (110) in a continuous centrifuge at 10,000 to 15,000 rpm. Then, the bacterial cells are suspended (111) in deionized water with the addition of 0.05 to 0.5 wt. detergents (112), for example SDS, Triton X100, sodium cholate, Brij 35 using ultrasound for 0.5 to 2 hours, followed by re-centrifugation (113), resulting in two fractions: bacterial sediment ( 114) and supernatant (115) used for further processing. The supernatant (115) is then filtered (116) on Tangential Flow Filtration (TFF) membranes with a pore size ranging from 2 to 10 kDa to remove small sediment particles (117), and the filtrate is cooled (118 ) to a temperature of 4 to 10 ° C, then an organic solvent (119), for example ethanol, methanol, acetone or isopropanol at -20 to -10 ° C in a volume of 100 to 300 vol.%, is added. in relation to the filtrate. The mixture of filtrate and organic solvent is allowed to stand at -20 to -10 ° C for 12 to 24 hours. Thereafter, the hyaluronic acid suspension is centrifuged (121) at a speed of 5000 to 10000 rpm, after which the obtained hyaluronic acid precipitate (122) is dissolved in water (123) at a temperature of 40 to 70 ° C.

Nierozpuszczony w wodzie osad (126) oddziela się poprzez filtrację (125), a następnie filtrat (127) schładza się do temperatury od 4 do 10°C oraz dodaje się rozpuszczalnik organiczny(128), przykładowo etanol, metanol, aceton czy izopropanol o temperaturze od -20 do -10°C w objętości od 100 do 300% obj. w stosunku do filtratu. Mieszaninę filtratu (127) i rozpuszczalnika organicznego (128) wytrąca sięThe solid (126) undissolved in water is separated by filtration (125), then the filtrate (127) is cooled to 4 to 10 ° C and an organic solvent (128) is added, for example ethanol, methanol, acetone or isopropanol at a temperature of -20 to -10 ° C in a volume of 100 to 300 vol.% in relation to the filtrate. A mixture of the filtrate (127) and organic solvent (128) precipitates

PL 235 053 B1 (129) w temperaturze od -20 do -10°C w czasie od 12 do 24 godz. Następnie, powstały w ten sposób osad kwasu hialuronowego (130) suszy się (131) w temperaturze od 20 do 40°C pod ciśnieniem od 5 do 300 mbar do uzyskania stałej suchej masy, w wyniku czego uzyskuje się produkt finalny jakim jest oczyszczony kwas hialuronowy(132).(129) at -20 to -10 ° C for 12 to 24 hours. Subsequently, the resulting precipitate of hyaluronic acid (130) is dried (131) at a temperature of 20 to 40 ° C under a pressure of 5 to 300 mbar until a constant dry weight is obtained, resulting in the final product of purified hyaluronic acid. (132).

Powyższy sposób otrzymywania kwasu hialuronowego charakteryzuje się obniżeniem kosztów otrzymania poprzez zastosowanie glicerolu jako źródła węgla w pożywce oraz znaczną redukcją wykorzystywania niebezpiecznych rozpuszczalników wybuchowych, podczas etapu „downstream”, a co za tym idzie wysoką ekoefektywnością. Preparaty na bazie kwasu hialuronowego otrzymanego sposobem według powyższego wynalazku charakteryzują się wysoką biokompatybilnością oraz bezpieczeństwem stosowania poprzez ograniczenie możliwości wystąpienia immunogeniczności i reakcji nadwrażliwości, co może mieć miejsce w przypadku preparatów zawierających kwas hialuronowy pochodzenia zwierzęcego.The above method of obtaining hyaluronic acid is characterized by lower production costs by using glycerol as a carbon source in the medium and a significant reduction in the use of hazardous explosive solvents during the "downstream" stage, and thus high eco-efficiency. Preparations based on hyaluronic acid obtained by the method according to the above invention are characterized by high biocompatibility and safety of use by limiting the possibility of immunogenicity and hypersensitivity reactions, which may occur in the case of preparations containing hyaluronic acid of animal origin.

Claims

Patent claims

1. Method for the production of hyaluronic acid using the culture of bacteria capable of producing hyaluronic acid, comprising the following steps: inoculum preparation, fermenter inoculation and bacterial culture, and downstream activities, characterized by:

- the culture medium is inoculated with a bacterial culture capable of producing hyaluronic acid, then the inoculated culture medium is multiplied on a shaker at a speed ranging from 100 to 250 rpm, at a temperature of 30 to 37 ° C for 10 to 24 hours .;

- then the fermentor is filled with the culture medium, then the culture medium is inoculated with the inoculum in a volume of 5 to 20 vol. fermentor, and then cultivation is carried out at the temperature from 30 to 37 ° C, at the oxygen concentration from 10 to 40%, for 12 to 24 hours;

- then the suspension is subjected to centrifugation in a continuous centrifuge at a speed of 10,000 to 15,000 rpm, then the bacterial cells are suspended in deionized water with the addition of 0.05 to 0.5 wt. of detergents using ultrasound for 0.5 to 2 hours, then centrifuged again, and the obtained supernatant is filtered on tangential filtration membranes with pore sizes ranging from 2 to 10 kDa, after which the filtrate is cooled to a temperature from 4 to 10 ° C, followed by the addition of an organic solvent having a temperature of -20 to -10 ° C in a volume of 100 to 300 vol.%. with respect to the filtrate, then the mixture of the filtrate and the organic solvent is left at a temperature of -20 to -10 ° C for 12 to 24 hours, and then the hyaluronic acid suspension is centrifuged at 5,000 to 10,000 rpm , then the obtained hyaluronic acid precipitate is dissolved in water (123) with a temperature of 40 to 70 ° C and filtered, then the filtrate is cooled to a temperature of 4 to 10 ° C and an organic solvent with a temperature of -20 to - is added 10 ° C in a volume of 100 to 300 vol.% with respect to the filtrate, then the mixture of the filtrate and the organic solvent is precipitated at a temperature of -20 to -10 ° C for 12 to 24 hours, then the precipitate of hyaluronic acid is dried at a temperature of 20 to 40 ° C under pressure from 5 to 300 mbar.

2. The method according to p. 2. The process of claim 1, characterized in that the culture medium comprises: glucose in an amount from 2 to 15 wt.%, Glycerol in an amount from 0.1 to 10 wt.%, Magnesium (II) sulfate in an amount from 0 0.05 to 0.1 wt.%, Potassium phosphate in an amount of 0.05 to 0.2 wt.%, Corn steep in an amount of 1 to 5 wt.%. and yeast extract in an amount of 2 to 10 wt%, casein peptone in an amount of 1 to 5 wt% and soy peptone in an amount of 1 to 5 wt%.

3. The method of producing hyaluronic acid according to any one of claims 1 to 3. A method according to claim 1-2, characterized in that strains of bacteria of the genus Streptococcus are used as the bacterial cultures for the production of hyaluronic acid.

4. The method of producing hyaluronic acid according to any one of claims 1 to 4. A process as claimed in 1-3, characterized in that the organic solvent for the precipitation of hyaluronic acid is ethanol, methanol, acetone or isopropanol.