PL234118B1 - Kardridż mikrodozownika do badania skuteczności terapii w warunkach przepływowych - Google Patents

Abstract

Kardridż mikrodozownika do badania skuteczności terapii w warunkach przepływowych zbudowany jest z dwóch płytek polimerowych, przy czym w dolnej płytce (1) znajdują się mikrokanały wlotowe (1a), które rozchodzą się promieniście od centralnej części kardridża w kierunku jego brzegów natomiast pod płytką dolną (1) znajduje się mikrozawór (B) w obudowie (3) i w centralnej części obudowy (3) znajduje się otwór (3a) o stopniowo zmniejszającej się średnicy, w otworze (3) zamontowana jest sprężyna dociskowa (4) oraz część obrotowa (5) z uszczelką (6). Ponadto na górnej płytce (2) zamontowana jest mikropompa perystaltyczna (C), składająca się z bębna obrotowego (7) zbudowanego z podstawy (7c) z osią centralną (7a) oraz trzech osi bocznych (7b), na których to osiach są luźno zamontowane trzy rolki (8). Całość jest zamknięta górną częścią (9) bębna obrotowego (7), która jest na stałe przyklejona do górnych powierzchni osi bocznych (7b) a bęben (7) jest osadzony luźno w gnieździe (2b) wykonanym w płytce górnej (2) i jest luźno przymocowany do kardridża przy pomocy elementu mocującego (10).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kardridż automatycznego mikrodozownika do badania skuteczności terapii w warunkach przepływowych. Tego typu mikrodozowniki mogą znaleźć zastosowanie w mikrobioanalityce, chemii, biologii czy medycynie.

Mikrodozowanie jest często stosowane w różnych rozwiązaniach komercyjnych. Proces ten jest najczęściej realizowany przez bardzo skomplikowane struktury oparte o rozbudowaną sieć wężyków oraz połączeń elektrycznych, gdzie jako elementy aktywne najczęściej są stosowane elektrozawory. Pracą takich zaworów steruje elektromagnes. Zawory mogą występować w dwóch wersjach - będących zamkniętymi w stanie normalnym lub otwartymi. Dodatkowo są zazwyczaj wyposażone w sprężynę, która ustala ich stan w momencie kiedy nie jest do nich przyłożone napięcie. Niewątpliwą zaletą takich napędów jest ich niski koszt, mała awaryjność oraz łatwość sterowania, bo wystarczy podanie napięcia na konkretny elektromagnes żeby wymusić jego pracę. Natomiast wadą takiego rozwiązania są ich duże rozmiary. W rozwiązaniach komercyjnych występują one w wersji modułowej co bardzo ogranicza ich mobilność, a także utrudnia ich połączenie z mikroukładami do prowadzenia hodowli komórkowych. Wadą takiego rozwiązania może być także znaczna objętość martwa obserwowana w niektórych tego typu rozwiązaniach, co znacznie utrudnia zastosowanie ich w różnych eksperymentach gdyż powoduje duże problemy z oczyszczeniem wężyków i elektrozaworów z uprzednio stosowanych roztworów. Powoduje to także utrudnioną sterylizację takich układów.

W rozwiązaniach komercyjnych są czasami stosowane zawory obrotowe. Najczęściej są one spotykane w połączeniu z wysokosprawną chromatografią cieczową. Jednak, zadaniem tych zaworów jest skierowanie strumienia cieczy do pętli (o ściśle określonej objętości), a następnie skierowanie odmierzonej objętości do kolumny. Zawory tego typu mają charakter modułowy w ogólnym rozumieniu tego pojęcia gdyż oprócz samego zaworu nie stosowana jest stalowa kapilara stanowiąca dodatkowy moduł. Także w tym przypadku gabaryty takiego rozwiązania są dość duże, a dodatkowo operuje on tylko i wyłącznie na jednym roztworze. Żeby wprowadzić do układu kolejny roztwór bądź roztwory konieczne jest rozbudowanie układu o kolejne zawory.

W literaturze prezentowanych jest niewiele rozwiązań umożliwiających zautomatyzowane i zdalnie kontrolowane dozowanie różnych roztworów o różnych stężeniach i ze ściśle zdefiniowanym czasem i przepływem, do mikrosystemów dedykowanych hodowli komórek.

Kardridż przepływowy mikrodozownika zbudowany jest z dwóch płytek polimerowych, korzystnie z polimetakrylanu metylu (PMMA).

W dolnej płytce znajdują się mikrokanały wlotowe, korzystnie siedem kanałów, które rozchodzą się promieniście od centralnej części płytki dolnej w kierunku jej brzegów. Mikrokanały wlotowe rozmieszczone są pod tym samym kątem w stosunku do sąsiadujących kanałów, korzystnie pod kątem 28,8°. Na końcach wszystkich mikrokanałów wlotowych, u ich zbiegu, znajdują się otwory wlotowe. Pomiędzy nimi centralnie znajduje otwór dolotowy połączony z mikrokanałem wylotowym. Pod płytką dolną, pod końcem mikrokanału wylotowego znajduje się mikrozawór. Mikrozawór składa się z obudowy, korzystnie wykonanej w bloku polieteroeteroketonu (PEEK). W centralnej części obudowy znajduje się otwór o stopniowo zmniejszającej się średnicy. W otworze o takiej geometrii montowana jest sprężyna dociskowa oraz część obrotowa z uszczelką. Część obrotowa, korzystnie wykonana z duraluminium, składa się z dwóch części: osi, na której montowana jest sprężyna dociskowa oraz okrągłej podstawy. Do wierzchniej warstwy okrągłej podstawy części obrotowej przyklejona jest gumowa uszczelka. Uszczelka jest elementem mikrozaworu, odpowiedzialnym za jego sprawne działanie. Na powierzchni uszczelki umieszczony jest mikrokanał rozprowadzający w ten sposób, że jeden koniec tego mikrokanału znajduje się dokładnie na środku uszczelki. Takie umiejscowienie mikrokanału gwarantuje, że bez względu na położenie części obrotowej, jeden koniec mikrokanału będzie zawsze połączony z otworem dolotowym mikrokanału wylotowego dolnej płytki. Drugi koniec mikrokanału w uszczelce, w zależności od pozycji części obrotowej, może być połączony z jednym z otworów wylotowych mikrokanałów doprowadzających próbki do mikrozaworu. Sprężyna gwarantuje szczelność takiego mikroukładu. Sprężyna ta powoduje odpowiednie dociśnięcie części obrotowej z uszczelką do powierzchni płytki dolnej. W wyniku zmiany położenia części obrotowej o wartość kąta odpowiadającego rozstawieniu kątowemu mikrokanałów następuje połączenie mikrokanału w uszczelce z innym otworem wylotowym mikrokanału wylotowego doprowadzającego próbki do mikrozaworu. Część obrotowa mikrozaworu, a wraz z nią uszczelka są obracane za pomocą bipolarnego silnika krokowego o momencie trzymającym co najmniej 0,1 Nm, którego wał obraca się korzystnie o 1,8° przy wykonaniu jednego

PL 234 118 B1 kroku. Zmiana wprowadzanego roztworu do mikrozaworu następuje w tym przypadku po wykonaniu 16 kroków przez silnik krokowy. Wał silnika krokowego jest połączony z osią elementu obrotowego przez wpust wykonany w tej osi.

Płytka górna posiada porty wlotowe odpowiadające położeniem końcom mikrokanałów wlotowych oraz port łączący, port dozujący i port wylotowy. Ponadto w płytce górnej znajduje się gniazdo bębna oraz gniazda uchwytowe.

Do płytki górnej zamocowana jest mikropompa perystaltyczna, która składa się z bębna obrotowego zbudowanego z podstawy z osią centralną oraz z trzech osi bocznych. Na osiach tych są luźno zamontowane trzy rolki. Całość jest zamknięta górną częścią bębna, która jest na stałe przyklejona do górnych powierzchni dodatkowych osi. Element ten usztywnia całą konstrukcję bębna oraz uniemożliwia ześlizgnięcie się rolek z dodatkowych osi. Cały bęben jest osadzony luźno w gnieździe bębna, znajdującym się w górnej płytce, w którym może się swobodnie obracać. Bęben jest luźno przymocowany do kardridża przy pomocy elementu mocującego, który jest sztywno osadzony w gniazdach uchwytowych. Na bębnie owinięty jest wężyk silikonowy w ten sposób, że jego jeden koniec jest umieszczony w porcie. Poprzez ten port do mikropompy trafiają roztwory zasysane z mikrokanału wylotowego. Silikonowy wężyk dociskany jest dodatkowo do bębna poprzez element dociskowy. Taka konstrukcja mikropompy sprawia, że obrót bębna powoduje przesuwanie się roztworów w wężyku dociśniętych między dwiema sąsiednimi rolkami w kierunku portu wylotowego, skąd dalej roztwory trafiają do mikrokanału odprowadzającego by ostatecznie poprzez port opuścić mikrodozownik i trafić do podłączonych peryferiów (np. mikrosystem). Ruch bębna jest wymuszany poprzez silnik prądu stałego z przekładnią redukującą obroty. Silnik ten jest przymocowany do spodniej części płytki dolnej a na jego wale, na sztywno, jest osadzony bęben mikropompy.

Kardridż mikrodozownika według wynalazku może być sterowany przez mikrokontroler ATmega328P-PU, który koordynuje pracę poszczególnych podzespołów. Za kontrolę silnika krokowego, napędzającego mikrozawór, może odpowiadać układ Allegro A4988, natomiast za kontrolę silnika prądu stałego, napędzającego mikropompę, układ Instruments MAX14870. Mikrokontroler jest sterowany z poziomu smartfona, z którego komendy są wysyłane do odbiornika bluetooth HC-06 połączonego z mikrokontrolerem poprzez interfejs szeregowy UART. Oprogramowanie mikrokontrolera umożliwia semi-manualne sterowanie dozownikiem, tzn. z poziomu oprogramowania na smartfonie operator może niezależnie sterować pozycją mikrozaworu (w ten sposób decydując, który z roztworów trafia do dozownika), a także przepływem generowanym przez mikropompę. Drugi sposób jest w pełni automatyczny tzn. operator uruchamia program, który od tej pory jest realizowany zgodnie z algorytmem zapisanym w mikrokontrolerze bez dalszego udziału operatora.

Kardridż mikrodozownika według wynalazku został zaprojektowany w taki sposób, aby możliwe było jego łatwe połączenie z dodatkowym mikrosystemem, w którym prowadzona jest hodowla komórek adherentnych (dwuwymiarowa - 2D) lub przestrzennych (trójwymiarowa - 3D), a także żeby umożliwiał automatyczne wprowadzanie do tego mikrosystemu różnych roztworów (medium hodowlanego, badanych związków, reagentów), umożliwiał regulację czasu, w którym wprowadzane są te roztwory, a także regulację ich przepływu. Dodatkowo, kardridż jest odporny na warunki, w których prowadzona jest hodowla komórkowa - szczególnie na wysoką wilgotność, podwyższoną temperaturę oraz podwyższone stężenie dwutlenku węgla. Dzięki temu kardridż mikrodozownika może umożliwić prowadzenie długoterminowego testowania wpływu różnych związków i warunków na hodowle komórkowe. Kardridż mikrodozownika może stać się alternatywnym rozwiązaniem pozwalającym na ocenę działania różnych czynników na ocenę skuteczności terapii w leczeniu chorób np. serca, nowotworowych.

Dzięki zastosowaniu kardridża według wynalazku możliwe będzie automatyzowane dozowanie wybranych roztworów (medium hodowlanego, badanych związków, reagentów) do połączonego z nim mikrosystemu, w którym prowadzona jest hodowla komórkowa. Zastosowanie kardridża mikrodozownika umożliwi regulację czasu, w którym wprowadzane są te roztwory, a także regulację ich przepływu, tak aby sam przepływ substancji nie wpływał na spadek proliferacji komórek. Kardridż mikrodozownika umożliwić może prowadzenie długoterminowego testowania wpływu różnych związków i warunków na hodowle komórkowe. Ponadto, wymiary kardridża mikrodozownika oraz materiały z jakich został wykonany umożliwiają umieszczenie go w inkubatorze wraz z mikrosystemem do hodowli komórek oraz ułatwia jego mobilność.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia kardridż przepływowy mikrodozownika w widoku złożeniowym a Fig. 2 przedstawia w powiększeniu fragment płytki dolnej.

PL 234 118 B1

Kardridż przepływowy zbudowany jest mikrodozownika A, który składa się z dwóch płytek polimerowych z polimetakrylanu metylu (PMMA) o wymiarach 56 mm x 80 mm, przy czym dolna płytka 1 ma grubość 2 mm natomiast górna płytka 2 ma grubość 5 mm. Mikrokanały zostały wykonane na powierzchni dolnej płytki metodą mikrofrezowania i mają kwadratowy przekrój poprzeczny o wymiarze 200 μm. Mikrokanały te nie mają charakteru ciągłego ze względu na konstrukcję wieloportowego mikrozaworu obrotowego. W sekcji kardridża, w której został zabudowany wieloportowy mikrozawór obrotowy B znajduje się siedem mikrokanałów wlotowych 1a o długości 19,5 mm, które rozchodzą się promieniście od centralnej części kardridża w kierunku jego brzegów. Poszczególne mikrokanały znajdują się pod kątem 28,8° w stosunku do sąsiadujących z nimi mikrokanałów. Zadaniem tych mikrokanałów jest doprowadzenie poszczególnych próbek z portów wlotowych 2a w płytce górnej 2 do wnętrza mikrozaworu B. Na końcach wszystkich mikrokanałów wlotowych 1a znajdują się otwory wylotowe 1b o średnicy 0,5 mm, które zostały wywiercone w dolnej płytce 1.

Kolejnym elementem kardridża jest obudowa 3 mikrozaworu B wykonana w bloku polieteroeteroketonu (PEEK) o wymiarach 20 x 20 x 10 mm. W centralnej części obudowy 3 znajduje się otwór 3a o stopniowo zmniejszającej się średnicy. W najniższej części otwór 3 ma średnicę 4,2 mm, następnie rozszerza się do średnicy 6 mm i na końcu do 8,2 mm. W otworze 3 o takiej geometrii montowana jest sprężyna dociskowa 4 oraz część obrotowa 5 z uszczelką 6.

Następnym elementem mikrozaworu B jest część obrotowa 5 wykonana z duraluminium. Element ten składa się z dwóch części: osi 5a o średnicy 4,15 mm, na której montowana jest sprężyna dociskowa 4 oraz okrągłej podstawy 5b o średnicy 8,15 mm i grubości 2 mm. Do wierzchniej warstwy okrągłej podstawy 5b części obrotowej 5 przyklejona jest gumowa uszczelka 6. Uszczelka 6 jest głównym elementem mikrozaworu B, odpowiedzialnym za jego sprawne działanie. Na powierzchni uszczelki 6 umieszczony jest mikrokanał rozprowadzający 6a w ten sposób, że jeden koniec mikrokanału rozprowadzającego 6a znajduje się dokładnie na środku uszczelki 6. Takie umiejscowienie mikrokanału 6a gwarantuje, że bez względu na położenie części obrotowej 5, jeden koniec mikrokanału 6a będzie zawsze połączony z otworem dolotowym 1e mikrokanału wylotowego 1c płytki dolnej 1 odprowadzającego próbki z mikrozaworu B. Drugi koniec mikrokanału 6a w uszczelce 6, w zależności od pozycji części obrotowej 5, może być połączony z jednym z siedmiu otworów wylotowych 1b mikrokanałów wlotowych 1a doprowadzających próbki do mikrozaworu B. Sprężyna 4 gwarantuje szczelność mikrozaworu B. Sprężyna ta powoduje odpowiednie dociśnięcie części obrotowej 5 z uszczelką 6 do powierzchni płytki dolnej 1. Wykonany w uszczelce 6 mikrokanał 6a jest połączony z jednej strony z otworem dolotowym 1e mikrokanału wylotowego 1c próbki z mikrozaworu B, a z drugiej strony z jednym z siedmiu otworów wylotowych 1b mikrokanałów 1a doprowadzających próbki do mikrozaworu B. W wyniku zmiany położenia części obrotowej 5 o wartość kąta wynoszącą 28,8°, następuje połączenie mikrokanału rozprowadzającego 6a w uszczelce 6 z innym otworem wylotowym 1b mikrokanału wlotowego 1a doprowadzającego próbki do mikrozaworu B. Część obrotowa 5 mikrozaworu B, a wraz z nią uszczelka 6 są obracane za pomocą bipolarnego silnika krokowego o momencie trzymającym co najmniej 0,1 Nm, którego wał obraca się o 1,8° przy wykonaniu jednego kroku. Dlatego zmiana wprowadzanego roztworu do mikrozaworu B następuje po wykonaniu 16 kroków przez silnik krokowy. Przepływ roztworów przez mikrodozownik jest wymuszany poprzez mikropompę perystaltyczną C, która jest również zabudowana na kardridżu. Mikropompa ta pracuje w rygorze ssąco-tłoczącym, tzn. zasysa roztwory do mikrozaworu B i dalej za pośrednictwem mikrokanału 1c do mikropompy C, skąd dalej roztwory są tłoczone do peryferiów podłączonych do mikrodozownika (np. do mikrosystemu). Głównym elementem mikropompy C jest bęben obrotowy 7 zbudowany z podstawy 7c z osią centralną 7a o średnicy zewnętrznej 5 mm oraz średnicy wewnętrznej 3 mm, oraz trzech osi bocznych 7b o średnicy 2 mm. Na osiach tych są luźno zamontowane trzy rolki 8. Całość jest zamknięta górną częścią 9 bębna obrotowego 7, która jest na stałe przyklejona do górnych powierzchni osi bocznych 7b. Element ten usztywnia całą konstrukcję bębna 7 oraz uniemożliwia ześlizgnięcie się rolek 8 z osi bocznych 7b. Cały bęben 7 jest osadzony luźno w gnieździe 2b wykonanym w płytce górnej 2, w którym może się swobodnie obracać. Bęben 7 jest luźno przymocowany do kardridża przy pomocy elementu mocującego 10, który jest sztywno osadzony w gniazdach uchwytowych 2d. Na bębnie 7 owinięty jest wężyk silikonowy (nie pokazany na rysunku) w ten sposób, że jego jeden koniec jest umieszczony w porcie dozującym 2c. Poprzez ten port, do mikropompy C trafiają roztwory zasysane z mikrokanału wylotowego 1c. Silikonowy wężyk dociskany jest dodatkowo do bębna 7 poprzez element dociskowy 11. Taka konstrukcja mikropompy C sprawia, że obrót bębna 7 powoduje przesuwanie się roztworów w wężyku dociśniętych między dwiema sąsied

PL 234 118 B1 nimi rolkami 8 w kierunku portu wylotowego 2e, skąd dalej roztwory trafiają do mikrokanału odprowadzającego 1d by ostatecznie poprzez port łączący 2f opuścić mikrodozownik i trafić do podłączonych peryferiów (np. mikrosystem). Ruch bębna 7 jest wymuszany poprzez silnik prądu stałego z przekładnią redukującą obroty 1000:1. Silnik ten jest przymocowany do spodniej części płytki dolnej 1 a na jego wale, na sztywno, jest osadzony bęben 7 mikropompy C.

Do obsługi kardridża mikrodozownika zaprojektowano część elektroniczną, której głównym elementem jest mikrokontroler ATmega328P-PU, który koordynuje pracę poszczególnych podzespołów. Za kontrolę silnika krokowego, napędzającego mikrozawór, odpowiada układ Allegro A4988, natomiast za kontrolę silnika prądu stałego, napędzającego mikropompę, odpowiada układ Instruments ΜΑΧ14870. Mikrokontroler jest sterowany z poziomu smartfona, z którego komendy są wysyłane do odbiornika bluetooth HC-06 połączonego z mikrokontrolerem poprzez interfejs szeregowy UART. Oprogramowanie mikrokontrolera umożliwia semi-manualne sterowanie dozownikiem, tzn. z poziomu oprogramowania na smartfonie operator może niezależnie sterować pozycją mikrozaworu (w ten sposób decydując, który z roztworów trafia do dozownika), a także przepływem generowanym przez mikropompę. Drugi sposób jest w pełni automatyczny tzn. operator uruchamia program, który od tej pory jest realizowany zgodnie z algorytmem zapisanym w mikrokontrolerze bez dalszego udziału operatora.

Większość elementów kardridża mikrodozownika zostało wykonanych metodą mikrofrezowania. Proces wytwarzania rozpoczyna się od zaprojektowania pojedynczych elementów w oprogramowaniu CAD, z dokładnością odwzorowania wymiarów wynoszącą 1 gm. Zaprojektowany model CAD zostaje przetłumaczony na język maszynowy przy pomocy modułu CAM, który to język jest wykorzystywany przez oprogramowanie mikrofrezarki do bezpośredniego frezowania struktur w materiale bazowym. Użyte narzędzia oraz parametry procesu obróbczego zostały zoptymalizowane do frezowania konkretnego materiału oraz odpowiednich struktur. W ten sposób, mikrodozownik wykonano z polimetakrylanu metylu (PMMA) przy czym podczas wykonania dolnej płytki 1 zastosowano:

- frez czołowo-walcowy o średnicy 200 gm do wykonania mikrokanałów 1a, 1c i 1d

- wiertło o średnicy 500 gm do wykonania otworów 1b

- frez czołowo-walcowy o średnicy 1 mm do wykonania pozostałych struktur.

Górną płytkę 2 w całości wykonano przy pomocy frezu walcowo-czołowego o średnicy 1 mm. Parametry procesu frezowania zostały dobrane na zasadzie kompromisu między czasem wykonania mikrostruktur, ich jakości, a także zabezpieczenia wykonywanych struktur i użytego narzędzia przed uszkodzeniem w wyniku przegrzania. Z tych względów prędkość posuwu narzędzia w płaszczyźnie XY została ustawiona na 500 mm/min, prędkość zagłębiania narzędzia w osi Z została ustawiona na 100 mm/min natomiast prędkość obrotowa narzędzia - 12000RPM. Wszystkie struktury wykonano wieloetapowo, przy czym w każdym etapie narzędzie zagłębiało się na głębokość stopniowo zwiększającą się o wartość równą 1/10 średnicy użytego narzędzia. Obie płytki połączono w kardridż poprzez bondowanie termiczne wspomagane rozpuszczalnikowo. Przed właściwym procesem bondowania konieczne jest bardzo dokładne oczyszczenie łączonych powierzchni, które wykonuje się kolejno poprzez mycie w detergencie oraz płukanie kolejno w izopropanolu, metanolu i wodzie dejonizowanej. Po umyciu płytki są dokładnie suszone w temperaturze 95°C przez 15 min. Po wysuszeniu łączone powierzchnie są umieszczane w oparach chloroformu w czasie 4 sekund, łączone ze sobą i umieszczane między płytami grzejnymi prasy hydraulicznej rozgrzanymi do temperatury 96°C. Proces bondowania prowadzony jest pod naciskiem 30 kg/m³ w czasie 20 minut. Po zakończeniu bondowania, kardridż jest stopniowo ochładzany do temperatury pokojowej.

Kolejnym materiałem, zastosowanym w konstrukcji kardridża jest polieteroeteroketon (PEEK), który jest znacznie odporniejszy mechanicznie od PMMA dlatego bardzo dobrze nadaje się jako materiał konstrukcyjny elementów narażonych na zwiększone tarcie. Z tego względu materiał ten użyto do konstrukcji obudowy mikrozaworu 3, rolek 8 mikropompy perystaltycznej C oraz elementu dociskającego 11 wężyk silikonowy do rolek 8. Ze względu na specyficzne właściwości fizyczne PEEK różniące go od PMMA, także proces obróbczy tego materiału uległ modyfikacji. Wszystkie struktury w PEEK wykonano przy pomocy frezu czołowo-walcowego o średnicy 2 mm, którego prędkość obrotową ustawiono na 28000 RPM, prędkość posuwu narzędzia w płaszczyźnie XY ustawiono na 300 mm/min natomiast prędkość zagłębiania - 80 mm/min.

Pozostałe elementy, od których wymagana jest największa wytrzymałość mechaniczna na ściskanie i zginanie wykonano z du raluminium. W materiale tym wykonano element obrotowy mikrozaworu B, dolną 7c oraz górną 9 część bębna 7 mikropompy perystaltycznej C, a także element montażowy 10. Struktury w tych elementach wykonano przy pomocy frezów walcowo-czołowych

PL 234 118 B1 o średnicach 1 mm, 2 mm oraz 3 mm, których prędkość obrotową ustawiono na 30000 RPM, prędkość posuwu w płaszczyźnie XY - 100 mm/min natomiast zgłębianie w osi Z - 50 mm/min. Ostatnim elementem wykonanym metodą mikrofrezowania jest gumowa uszczelka 6 z mikrokanałem 6a, którą wykonano w gumie Viton® o grubości 1 mm. Uszczelka ta w całości została wykonana frezem walcowo-czołowym o średnicy 500 μm, którego prędkość obrotową ustawiono na 18000 RPM, prędkość posuwu w płaszczyźnie XY - 80 mm/min, natomiast prędkość zagłębiania w osi Z - 40 mm/min.

Otrzymany kardridż mikrodozownika wykorzystano do prowadzenia długoterminowej hodowli mezynchemalnych komórek macierzystych (hMSC), hodowanych w specjalnie do tego przygotowanym mikrosystemie. W kardridżu w porcie wlotowym 2a umieszczono medium hodowlane. Do mikrosystemu, w którym umieszczone były komórki hMSC, za pomocą wężyka o średnicy 0,19 mm, przez port łączący 2f, podłączono wysterylizowany światłem UV mikrodozownik według wynalazku. Kardridż mikrodozownika wraz z mikrosystemem umieszczono w inkubatorze w t=37°C, CO2=5%. Następnie, za pomocą opracowanej aplikacji sterowanej ze smartfona uruchomiono program, który realizowany był zgodnie z algorytmem zapisanym w mikrokontrolerze, tzn. zadano przepływ medium hodowlanego 1 μ^^, przez 15 min., co 6 h. Po kolejnych 24 h w kolejnym porcie wlotowym 2a umieszczano roztwór do badania proliferacji komórek (Alamar Blue) i z wykorzystaniem semi-manualnego sterowania mikrodozownikiem do mikrosystemu wprowadzono roztwór z przepływem 1 μ/min, przez 15 min. W kolejnym etapie, mikrosystem odłączano od mikrodozownika poprzez port łączący 2f i prowadzono pomiar spektrofluorymetryczny w mikrosystemie. Następnie, mikrosystem ponownie podłączano do mikrodozownika w porcie łączącym 2f i za pomocą opracowanej aplikacji sterowanej ze smartfona uruchomiono program automatycznego wprowadzania pożywki. Powyższe czynności powtarzano przez kolejne siedem dni. Badania proliferacji komórek hMSC potwierdziły, że zastosowanie kardridża mikrodozownika i możliwość dostarczania świeżego medium hodowlanego w określonych odstępach czasowych (6 h) pozwala na uzyskanie w mikrosystemie długoterminowej hodowli komórek hMSC. W kolejnych badaniach w odpowiednich portach wlotowych 2a planowane jest umieszczenie i automatyczne dozowanie określonych związków stosowanych w różnicowaniu komórek oraz w kardioterapii.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kardridż mikrodozownika do badania skuteczności terapii w warunkach przepływowych, znamienny tym, że zbudowany jest z dwóch płytek polimerowych, przy czym w dolnej płytce (1) znajdują się mikrokanały wlotowe (1a), które rozchodzą się promieniście od centralnej części kardridża w kierunku jego brzegów i poszczególne mikrokanały wlotowe (1a) znajdują się pod identycznym kątem w stosunku do sąsiadujących z nimi mikrokanałów, ponadto na końcach wszystkich mikrokanałów wlotowych (1a) znajdują się otwory wylotowe (1b) natomiast pod płytką dolną (1) znajduje się mikrozawór (B) w obudowie (3) i w centralnej części obudowy (3) znajduje się otwór (3a) o stopniowo zmniejszającej się średnicy, w otworze (3) zamontowana jest sprężyna dociskowa (4) oraz część obrotowa (5) z uszczelką (6), przy czym część obrotowa (5) składa się z dwóch części: osi (5a), na której zamontowana jest sprężyna dociskowa (4) oraz okrągłej podstawy (5b) a do wierzchniej warstwy okrągłej podstawy (5b) części obrotowej (5) przyklejona jest gumowa uszczelka (6), na powierzchni której umieszczony jest mikrokanał rozprowadzający (6a) w ten sposób, że jeden koniec mikrokanału rozprowadzającego (6a) znajduje się dokładnie na środku uszczelki (6) a drugi koniec mikrokanału (6a) w uszczelce (6), w zależności od pozycji części obrotowej (5), połączony jest z jednym z otworów wylotowych (1b) mikrokanałów wlotowych (1a) doprowadzających próbki do mikrozaworu (B), ponadto mikrokanał (6a) jest połączony z jednej strony z otworem dolotowym (1e) mikrokanału odprowadzającego (1c) próbki z mikrozaworu (B), a z drugiej strony z jednym z otworów wylotowych (1b) mikrokanałów (1a) doprowadzających próbki do mikrozaworu (B), ponadto na górnej płytce (2) zamontowana jest mikropompa perystaltyczna (C), składająca się z bębna obrotowego (7) zbudowanego z podstawy (7c) z osią centralną (7a) oraz trzech osi bocznych (7b), na których to osiach są luźno zamontowane trzy rolki (8) a całość jest zamknięta górną częścią (9) bębna obrotowego (7), która jest na stałe przyklejona do górnych powierzchni osi bocznych (7b) a bęben (7) jest osadzony luźno w gnieździe (2b) wykonanym w płytce górnej (2) i jest luźno przymocowany do kardridża przy pomocy elementu mocującego (10), który jest sztywno osadzony w gniazdach uchwytowych (2d) płytki górnej (2), przy czym

   PL 234 118 B1 na bębnie (7) owinięty jest wężyk w ten sposób, że jego jeden koniec jest umieszczony w porcie dozującym (2c) i silikonowy wężyk dociskany jest dodatkowo do bębna (7) poprzez element dociskowy (11).
2. 2. Kardridż według zastrz. 1, znamienny tym, że płytka dolna (1) i płytka górna (2) wykonane są z polimetakrylanu metylu.
3. 3. Kardridż według zastrz. 1, znamienny tym, że mikrokanały wlotowe (1a) w dolnej płytce (1) mają kwadratowy przekrój poprzeczny.
4. 4. Kardridż według zastrz.1, znamienny tym, że w dolnej płytce (1) znajduje się siedem mikrokanałów wlotowych (1a).
5. 5. Kardridż według zastrz. 1, znamienny tym, że mikrokanały wlotowe (1a) znajdują kątem się pod 28,8° w stosunku do sąsiadujących z nimi mikrokanałów.
6. 6. Kardridż według zastrz. 1, znamienny tym, że obudowa (3) mikrozaworu (B) wykonana jest w bloku polieteroeteroketonu.

   PL234 118 B1

   Rysunki

   Fig. 1

   PL234 118 B1

   \.1c 1e

   Fig 2