PL226999B1

PL226999B1 - Azotan (III) 3 -karbamoilo -1-metylopirydyniowy, sposób jego otrzymywania izastosowanie

Info

Publication number: PL226999B1
Application number: PL404273A
Authority: PL
Inventors: Stefan Chłopicki; Juliusz Pernak; Michał Niemczak; Karol Kramkowski; Agnieszka Leszczyńska; Agnieszka Leszczynska; Maria Walczak
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2013-06-11
Filing date: 2013-06-11
Publication date: 2017-10-31
Also published as: PL404273A1; EP3008041B1; EP3008041A1; WO2014200373A1

Abstract

Wynalazek dotyczy nowej soli pirydyniowej zawierającej anion jako azotan(III) i kation jako 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowy, sposobu jej otrzymywania oraz zastosowania do wytwarzania środka naczynio-protekcyjnego do leczenia lub profilaktyki stanów lub chorób związanych z dysfunkcją śródbłonka naczyniowego, niewydolnością śródbłonkowej syntezy tlenku azotu (NO) i/lub niewydolnością śródbłonkowej syntezy prostacykliny (PGI2).

Description

Opis wynalazku

Dziedzina techniki

Wynalazek dotyczy nowej soli pirydyniowej w postaci azotanu(lll) 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego(MNANO2) oraz sposobu jego otrzymywania. Rozwiązanie według wynalazku dotyczy także zastosowania azotanu(lll) 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego do wytwarzania środka naczynioprotekcyjnego do leczenia lub profilaktyki stanów lub chorób związanych z dysfunkcją śródbłonka naczyniowego, niewydolnością śródbłonkowej syntezy tlenku azotu (NO) i/lub niewydolnością śródbłonkowej syntezy prostacykliny (PGl2), w tym do wytwarzania leków do leczenia szeregu chorób związanych z dysfunkcją śródbłonka naczyniowego.

Substancja będąca przedmiotem wynalazku wykazuje działanie przeciwzakrzepowe, zależne od hamowania aktywacji płytek krwi oraz hamowania układu krzepnięcia, co wykazano na podstawie badań in vivo przeprowadzonych na dwóch grupach szczurów: normotensyjnych i z nadciśnieniem naczyniowo-nerkowym.

Stan techniki

Halogenki pirydyniowe są znane od początku XX wieku za sprawą Menschutkina, który opisał syntezę pirydyny z chlorkiem alkilowym. Chlorki i bromki 1-alkilopirydyniowe wykazują aktywność wobec bakterii i grzybów oraz są przedstawicielami kationowych związków powierzchniowo czyn nych. Dostępne są dwa chlorki: 1-dodecylopirydyn iowy i 1-heksadecylopirydyniowy. Są one składnikami wielu preparatów handlowych. Wymiana anionu chlorkowego lub bromkowego na anion nieorganiczny lub organiczny spowodowała otrzymanie soli pirydyniowych. Sole pirydyniowe, których temperatura topnienia wynosi poniżej 100°C, zostały nazwane pirydyniowymi ciecz ami jonowymi. Tematyka cieczy jonowych cieszy się coraz większym zainteresowaniem zarówno wśród środowisk naukowych jak i przemysłowych. Obecność podstawników w pierścieniu pirydyny w pirydyniowych cieczach jonowych wpływa na ich właściwości fizykochemiczne jak i biologiczne oraz decyduje o ich toksyczności.

Chlorek 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego (MNACl) jest znanym związkiem i głównym metabolitem nikotynamidu (NA, witamina PP, witamina B3) który jest prekursorem do syntezy NAD i NADP. 1-Metylonikotynamid (MNA) powstaje w wątrobie w reakcji katalizowanej przez N-metylo-transferazę nikotynamidu (Stanulovic et al., 1971). W toku dalszych przemian MNA jest przekształcany przy udziale oksydazy aldehydowej do 1-metylo-4-pirydono-5-karboksamidu (4-PYR) lub 1-metylo-2-pyridono-5-karboksamidu (2-PYR). MNA i jego produkty metabolizmu są wydalane z moczem. Przez wiele lat uważano że MNA jest nieaktywny biologicznie. Opracowano analityczne techniki pomiarów MNA, aby badać stężenie MNA wydalanego z moczem lub znajdującego się w osoczu, i traktowano je jako marker dostępności witaminy PP w ustroju (Holman and De Lange, 1949; Vivian et al., 1958). Niedawno wykazano, że MNA podawany miejscowo jest skuteczny w leczeniu niektórych chorób skórnych (Wozniacka et al., 2005; Gębicki et al., 2003). Odkryto również, że MNA poprzez działanie tej cząsteczki na śródbłonek naczyniowy stymuluje śródbłonek do wydzielania endogennej prostacykli ny (PGl2) zależnej od COX-2 i ma działanie trombolityczne i przeciwzakrzepowe (Chłopicki et al., 2007). Endogenny MNA może więc pełnić rolę stymulatora dla wytwarzania endogennej PGl2.

Chlorki 1-alkoksymetylo-3-karbamoilopirydyniowe wykazują silne działanie bakteriobójcze i grzybobójcze (Pernak et al., 2001).

Z polskiego zgłoszenia patentowego nr PL 358682 znane jest nowe zastosowanie medyczne dinukleotydu nikotynamido-adeninowego (NAD) i/lub fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADO) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do miejscowego podawania na skórę do leczenia łuszczycy i zapobiegania nawrotom łuszczycy. Zgłoszenie to obejmuje również preparat farmaceutyczny do miejscowego stosowania na skórę w leczeniu łuszczycy lub zapobieganiu nawrotom łuszczycy, zawierający substancję czynną wybraną z dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD), fosforanu dinukleotydu nikotynamido-adeninowego (NADP) lub ich mieszanin, w połączeniu z odpowiednim dopuszczalnym farmaceutycznie podłożem, oraz zastosowanie kosmetyczne NAD i/lub NADP do pielęgnacji skóry po ustąpieniu zmian łuszczycowych.

Z kolei z polskiego zgłoszenia patentowego nr PL 364348 znane jest także zastosowanie grupy czwartorzędowych soli pirydyniowych do wytwarzania środka naczynio-protekcyjnego do leczenia i/lub profilaktyki stanów lub chorób związanych z dysfunkcją śródbłonka naczyniowego, stresem oksydacyjnym i niewydolnością śródbłonkowej syntezy prostacykliny (PGI2). Przedmiotem tego zgłoszenia

PL 226 999 B1 jest również grupa soli pirydyniowych przeznaczona do stosowania w suplementacji diety oraz zastosowanie tych pochodnych do wytwarzania środka przeznaczenia żywieniowego do ochrony naczyń krwionośnych u ssaków w stanach lub chorobach związanych z dysfunkcją śródbłonka naczyniowego, stresem oksydacyjnym niewydolnością śródbłonkowej syntezy prostacykliny (PGI2).

W wyniku realizacji prac badawczych nieoczekiwanie okazało się, że sól w postaci azotanu(lll) 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego oprócz zwiększania stymulowania wydzielania endogennej prostacykliny (PGI2), co jest znane ze stanu techniki dla MNA, dodatkowo jest donorem aktywnego biologicznie tlenku azotu (NO) stanowiąc przy tym nowy związek nie tylko o korzystnych działaniach farmakologicznych, ale również o nieoczekiwanym profilu farmakokinetycznym.

Szczegółowy opis wynalazku

Istotą wynalazku jest sól pirydyniowa zawierająca anion azotanowy(lll) i kation 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowy o Wzorze 1

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania azotanu(lll) 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego, który polega na tym, że:

a) chlorek 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowy o Wzorze 2:

rozpuszcza się w alkoholu krótkołańcuchowym, korzystnie w metanolu lub etanolu, miesza się z solą sodową lub potasową lub litową lub amonową azotanu(lll), w stosunku molowym chlorku 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego do soli azotanu(lll) od 1:0,8 do 1:1,2, korzystnie 1:1 w temperaturze od 0°C do temperatury wrzenia rozpuszczalnika, szczególnie korzystnie 45°C w czasie co najmniej 2 godzin,

b) następnie odsącza się nieorganiczny produkt uboczny, po czym z przesączu usuwa się rozpuszczalnik.

Chlorek 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowy jest substratem w reakcji wymiany anionu chlorkowego. Przebieg reakcji zależy od opracowanych warunków syntezy. Z praktyki laboratoryjnej wynika, że dla każdej nowej soli pirydyniowej otrzymanej z chlorku 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego należy indywidualnie opracować warunki syntezy jak i sposób wyizolowywania czystej soli z mieszaniny poreakcyjnej.

Istotą wynalazku jest także związek według wynalazku do stosowania w leczeniu lub profilaktyce stanów lub chorób związanych z dysfunkcją śródbłonka naczyniowego, niewydolnością śródbłonkowej syntezy tlenku azotu (NO) i/lub niewydolnością śródbłonkowej syntezy prostacykliny (PGI2), przy czym wspomniane stan lub choroba wybrane są z następujących:

- miażdżyca tętnic;

- miażdżyca tętnic u pacjentów ze stabilną chorobą wieńcową, niedokrwiennym epizodem mózgowym lub miażdżycą kończyn, w tym zakrzepowo-zarostowym zapaleniem tętnic;

- hipercholesterolemia, hipertriglicerydemia lub niski poziom HDL;

- zakrzepica o innym podłożu niż miażdżyca tętnic, w szczególności zakrzepica związana z implantacją metalowych protez naczyniowych (stentów), operacją pomostowania aortalnowieńcowego (CABG), hemodializą, chorobą zakrzepowo-zatorową żył;

PL 226 999 B1

- czynniki ryzyka rozwoju miażdżycy tętnic wybrane z grupy składającej się z następujących: hipercholesterolemia, nadciśnienie tętnicze, hiperhomocysteinemia, otyłość, stres psychiczny, infekcje, miażdżyca naczyń przeszczepu przy przeszczepie narządów i tolerancja na nitraty;

- grupa składająca się z następujących: przewlekła niewydolność serca, nadciśnienie płucne, zespół nerczycowy, przewlekła niewydolność nerek, zespół ostrej niewydolności oddechowej typu dorosłych (ARDS), mukowiscydoza, przewlekła obturacyjna choroba płuc (COPD), stan przedrzucawkowy - rzucawka, zaburzenia wzwodu, zespół Steina-Leventhala, zespół bezdechu śródsennego, toczeń rumieniowaty układowy, anemia sierpowata, choroba wrzodowa żołądka lub dwunastnicy, jaskra, przewlekła choroba wątroby, zwłaszcza wirusowe zapalenie wątroby, pierwotna amyloidoza.

Dzięki zastosowaniu rozwiązania według wynalazku uzyskano następujące efekty techniczno-ekonomiczne:

- syntezowany azotan(lll) charakteryzuje się temperaturą topnienia równą 82-84°C, jest nową pirydyniową cieczą jonową,

- otrzymana ciecz jonowa jest rozpuszczalna w wodzie, metanolu, etanolu, DMSO, nie jest rozpuszczalna w heksanie, eterze etylowym, jest solą stabilną termicznie do temperatury

150°C,

- syntezowana ciecz jonowa jest higroskopijna, należy przechowywać ją nad środkiem suszącym najlepiej nad P4O10,

- wodne roztwory otrzymanej cieczy jonowej nie są stabilne w czasie co obserwuje się jako zmianę ich barwy od jasno żółtej do brązowej,

- sposób otrzymywania jest efektywny i pozwala usunąć z mieszaniny poreakcyjnej produkt uboczny a wydajność reakcji przekracza 95%,

- syntezowany azotan(lll) 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowy wykazuje działanie przeciwzakrzepowe związane z zahamowaniem płytek krwi oraz zahamowaniem osoczowego układu krzepnięcia.

MNANO2, podawany dożylnie (i.v.) lub dożołądkowo per os (p.o.), wykazuje działanie przeciwzakrzepowe, przeciwpłytkowe, bez wpływu na podstawowe parametry koagulologiczne i morfologiczne krwi, hamuje jednak generację fibryny. Zarówno MNA jak i NO2 podawane oddzielnie w analogicznej dawce nie wywołują takiego spektrum działania farmakologicznego co podkreśla wagę wynalazku. Skrótowy opis figur rysunku

Przedmiot wynalazku został uwidoczniony w przykładach wykonania na załączonym rysunku, na którym:

FIG. 1A przedstawia zależne od dawki przeciwzakrzepowe działanie MNANO2 in vivo u szczurów normotensyjnych (jednorazowe podanie dożylne 10 minut przed indukcją zakrzepicy tętniczej).

FIG. 1B przedstawia porównywalne w stosunku do rezultatów przedstawionych na FIG. 1A przeciwzakrzepowe działanie MNANO2 in vivo u szczurów z nadciśnieniem (którym podawano tą substancję dożylnie 10 minut przed indukcją zakrzepicy tętniczej lub per os przez 3 dni dwa razy dziennie).

FIG. 2 przedstawia przeciwpłytkowe działanie MNANO2 podawanego ex vivo (3 dni podawania per os 2x dziennie) skutkujące zahamowaniem wytwarzania tromboksanu B2 u szczurów z nadciśnieniem i zakrzepicą tętniczą.

FIG. 3 przedstawia niezależne od płytek krwi przeciwzakrzepowe działanie MNANO2 podawanego ex vivo (jednorazowe podanie dożylne lub podawanie per os przez 3 dni 2x dziennie) skutkujące zahamowania wytwarzania fibryny u szczurów z nadciśnieniem i zakrzepicą tętniczą.

FIG. 4A i 4B przedstawiają indywidualne wartości zależności stężenia od czasu dla MNA po jednorazowym podaniu dożylnym MNANO2(4A) oraz MNACl (4B) w dawce 100 mg/kg u szczura (skala półlogarytmiczna).

FIG. 5A i 5B przedstawiają indywidualne wartości zależności stężenia od czasu dla MNA po jednorazowym podaniu dożołądkowym MNANO2 (5A) oraz MNACl (5B) w dawce 100 mg/kg u szczura.

PL 226 999 B1

P r z y k ł a d 1: Synteza azotanu(lll) 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego (MNANO2)

Do kolby wprowadzono 8,63 g (0,05 mola) chlorku 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego oraz ₃ cm³ metanolu, po czym dodano 3,59 g (0,052 mola) azotanu(lll) sodu. Reakcję prowadzono w temperaturze 45°C przez 2 godziny przy ciągłym mieszaniu. W wyniku reakcji wymiany anionu z roztworu strącił się biały osad chlorku sodu. Powstałą sól nieorganiczną odfiltrowano, a metanol odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Następnie zawartość kolby rozpuszczono w bezwodnym etanolu i odsączono pozostały z nadmiaru nierozpuszczalny azotan(lll) sodu. Z przesączu odparowano rozpuszczalnik pod obniżonym ciśnieniem i otrzymano azotan(lll) 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowy z wydajnością 98%. Syntezowana ciecz jonowa jest żółtym ciałem stałym o temperaturze topnienia 82-84°C.

Strukturę związku potwierdzono wykonując widmo protonowego i węglowego magnetycznego rezonansu jądrowego:

¹H NMR (400MHz, CDCfe) δ [ppm] = 4,53 (s, 3H); 4,81 (s, 2H); 8,22 (t, J = 6,6 Hz, 1H); 8,93 (d, J = 9,3 Hz, 1H); 9,01 (d, J = 6,4 Hz 1H); 9,32 (s, 1H);

¹³C NMR (100MHz, CDCl3) δ [ppm] = 168,55; 150,13; 147,93; 146,42; 136,29; 130,88; 51,42.

Analiza elementarna CHN dla C7H9N3O3 (Mmol = 183,16 g/mol): wartości obliczone (%):

C = 45,90; H = 4,95; N = 22,94; wartości zmierzone: C = 45,67; H = 5,11; N = 22,76.

Stabilność termiczną wyznaczono techniką TG w atmosferze azotu (użyto instrument Mettler Toledo Star TGA/DSC 1). Produkt po syntezie zawierał 6% wody, głównie adsorpcyjnej. Tonset5% wynosi 170°C a Tonset = 195°C.

P r z y k ł a d 2: Aktywność farmakologiczna

Aktywność przeciwzakrzepową wykazano MNANO2 badano w modelu zakrzepicy tętniczej stymulowanej prądem w tętnicy szyjnej u szczurów normotensyjnych (Schumacher et al., 1996). MNANO2 podawano szczurom dożylnie (i.v.). W wyniku przeprowadzonych doświadczeń uzyskano wyniki wskazujące na zmniejszenie masy zakrzepu u szczurów, którym podawano MNANO2 w stosunku do grupy kontrolnej (Tabela 1, FIG. 1A), w tym w szczególności największe zmniejszenie masy zakrzepu zaobserwowano w grupie, w której szczurom podawano dawkę 100 mg/kg MNANO2.

Dodatkowo potwierdzono to działanie u szczurów z nadciśnieniem i wykazano, że nie zależy ono od drogi podania. W tym przypadku MNANO2 podawano jednej grupie szczurów dożylnie (i.v.), a drugiej grupie szczurów dożołądkowo (p.o.).W wyniku przeprowadzonych doświadczeń uzyskano wyniki wskazujące na zmniejszenie masy zakrzepu u szczurów, którym podawano MNANO2 w stosunku do grupy kontrolnej w obydwu drogach podania (Tabela 2, FIG. 1B). W przypadku podawania szczurom MNANO2 doustnie zaobserwowano dodatkowo spadek generacji fibryny (FIG. 3).

Z kolei działanie przeciwpłytkowe MNANO2 wykazano na podstawie hamowania aktywności płytek ocenianej na podstawie hamowania wytwarzania tromboksanu B2 (TxB2) przez płytki ex vivo (Luzak et al., 2012) u szczurów z nadciśnieniem po zakrzepicy tętniczej (FIG. 2).

W oparciu o powyższe wnosić można, że przeciwzakrzepowa aktywność MNANO2 zależy od hamowania płytek krwi (FIG. 2). Co istotne, MNANO2 nie wpływa na parametry koagulologiczne, takie jak PT (Tabela 1, Tabela 2), jednak hamuje generację fibryny (Tabela 2, FIG. 3). Uzupełniająco, w oparciu o automatyczne pomiary we krwi pełnej wykazano, że MNANO2 nie powoduje zaburzeń parametrów morfologicznych krwi (Tabela 1, Tabela 2). Dodatkowo, na podstawie oznaczeń chromatograficznych w zebranych po zakrzepicy próbkach krwi zostało wykazane, że MNANO2 jest donorem MNA (Tabela 2).

T a b e l a 1. Działanie MNANO2 u szczurów normotensyjnych

	VEH (n=15)	MNANO2 10 mg/kg i.v. (n=3)	MNANO2 30 mg/kg i.v. (n=3)	MNANO2 100 mg/kg i.v. (n=3)
1	2	3	4	5
Masa zakrzepu [mg]	0,85±0,05	0,78±0,20	0,78±0,05	0,34±0,04**
Krzepnięcie
APTT [sec.]	24,58±1,21	23,00±2,68	25,67±6,07	26,27±2,89
PT [sec.]	20,14±0,48	18,23±0,68	18,10±0,81	19,17±0,27
Fglevel [ng/ml]	2,28±0,08	2,04±0,09	2,15±0,28	1,96±0,11
QUICK	52,90±3,40	61,75±5,42	63,00±7,57	53,33±1,67

PL 226 999 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5
morfologia krwi
WBC [106/μί]	1,72±0,26	1,95±0,35	1,77±0,43	1,12±0,19
RBC [106/μί]	4,92±0,17	4,90±0,18	4,80±0,29	5,38±0,21
HGB [g/dl]	11,98±0,29	12,15±0,26	12,30±0,26	12,67±0,47
HCT [%]	29,84±1,18	30,03±1,26	29,07±1,61	33,33±1,31
MCV [fl]	60,60±0,81	61,25±0,25	60,68±0,33	62,00±1,16
MCH [pg per cell]	24,38±0,48	25,05±0,53	25,73±0,92	25,53±0,48
MCHC [g/dl]	40,36±1,11	40,93±1,00	42,40±1,32	37,97±0,18
PLT [103/μ!]	512±23	493±17	489±23	566±56

T a b e l a 2. Działanie MNANO2 u szczurów z nadciśnieniem

Substancja	VEH (2K1C) n=13	MNANO2 30 mg/kg 8 i.v.; n=6	MNANO2 30 mg/kg p.o.; n=4
Masa zakrzepu [mg]	0,94±0,33	0,46±0,06*	0,39±0,18*
Stężenie MNA w osoczu po pobraniu zakrzepu [nmol/mL]	0,20±0,11	8,72±4,90***	5,76±3,78***
Krzepnięcie
APTT [sec.]	18,79±0,40	18,46±0,81	17,79±0,62
PT [sec.]	18,08±0,20	17,40±0,69	18,16±0,47
Fglevel [ng/ml]	2,56±0,07	2,36±0,13	2,61±0,10
QUICK	58,55±1,98	63,50±5,04	62,00±4,01
generacja fibryny (AUC)	179,86±15,43	186,00±10,23	127,11±9,23*
morfologia krwi
WBC [106/μ!]	3,33±0,18	2,87±0,35	2,93±0,26
RBC [106/μ!]	7,51±0,2	7,36±0,19	7,05±0,18
HGB [g/dl]	13,59±0,35	12,27±0,16	13,23±0,24
HCT [%]	41,58±1,07	38,35±0,49	40,07±0,03
MCV [fl]	55,42±0,31	54,86±0,60	57,00±1,53
MCH [pg per cell]	18,13±0,15	17,51±0,26	18,77±0,71
MCHC [g/dl]	32,68±0,15	31,65±0,21	32,97±0,58
PLT [103/μΟ	623±24	621±18	630±12

Indukcja i kontrola nadciśnienia, a następnie indukcja zakrzepicy tętniczej

Szczury usypiano pentobarbitalem (40 mg/kg, i.p.). Przecinano powłoki skórne i mięśniowe na wysokości lewej nerki. Następnie częściowo podwiązywano lewą tętnicę nerkową przy użyciu wystandaryzowanego zacisku. U tak zoperowanych szczurów (n=60) w ciągu 6 tygodni rozwinęło się nadciśnienie naczyniowo-nerkowe (2K-1C, ang. 2kidney-1clip) (Huang et al., 1981). Grupę kontrolną (n=6), służącą do oceny rozwoju nadciśnienia, stanowiły szczury poddane takiej samej procedurze chirurgicznej, ale bez podwiązania tętnicy nerkowej (PO - grupa pozornie operowana). Po 6 tygodniach od operacji, w celu potwierdzenia rozwoju nadciśnienia, ciśnienie krwi mierzono metodą pośrednią u szczurów czuwających w sposób opisany przez Zatza (1990). Do dalszych badań wykorzystano zwierzęta z ciśnieniem skurczowym (SBP) wyższym niż 140 mm Hg.

PL 226 999 B1

Następnie szczury normotensyjne oraz z nadciśnieniem tętniczym usypiano pentobarbitalem (40 mg/kg, i.p.). Po usunięciu skóry w okolicy szyi izolowano odcinek tętnicy szyjnej wspólnej lewej o długości około 0,5 cm. Aby uniknąć krwotoku izolację przeprowadzono rozrywając tkanki otaczające tętnicę, bez używania ostrych narzędzi.

Metoda zakrzepicy tętniczej (wg. Schumacher et al., 1996) w modyfikacji własnej (Kramkowski et al., 2012) polega na uszkodzeniu śródbłonka wyizolowanego odcinka tętnicy za pomocą prądu elektrycznego (1 mA, 5-15 V, 10 min.). Anoda ma postać drutu z nierdzewnej stali z hacz ykowato zagiętą końcówką umieszczoną w uchwycie dla zachowania stabilności podczas eksperymentu. Jej końcówkę umieszczano pod tętnicą. Pod tętnicę podkładano fragment parafilmu w celu zachowania izolacji. Katodę stanowiła igła umieszczona podskórnie w okolicy tylnej kończyny. Po zakończeniu stymulacji formowanie się zakrzepu trwa 45 minut. Po tym czasie podwiązywano tętnicę po obydwu stronach zakrzepu i wycinano uszkodzony fragment zawierający zakrzep. Zakrzep wydobywano ilościowo z tętnicy, przenoszono na wytarowane wcześniej mikroskopowe szkiełko nakrywkowe. Zakrzepy pozostawiano do wyschnięcia (temperatura pokojowa, wilgotność przeciętna) i ważono nie wcześniej niż po 24 godz.

Wytwarzanie TxB2 ex vivo

Do oceny wytwarzania TxB2 ex vivo posłużyła krew cytrynianowa pobrana z prawej komory serca od szczurów nadciśnieniowych z zakrzepicą tętniczą, którym podawano wcześniej MNANO2 (lub vehiculum) - eksperyment ex vivo. Krew rozcieńczano z 0,9% NaCl w stosunku 1:1 i mieszano w kuwecie agregacyjnej w temperaturze 37 °C z szybkością 1000 obr./min. Po 20, 40 i 60 m inutach oraz w czasie „0” odciągano próbki mieszanej krwi i mieszano z zimnym roztworem ASA (stężenie finalne: 500 μΜ) w stosunku 1:1 .TxB₂ w tak pozyskanych próbkach oznaczano metodą ELISA, według instrukcji producenta zestawu odczynników. Wyniki dotyczące stężenia TxB2 ex vivo ilustruje FIG. 2.

Automatyczna ocena parametrów morfologicznych i koagulologicznych krwi

Morfologię krwi oceniano około 2 minuty po pobraniu w świeżej krwi cytrynianowej, automatycznym aparatem Horiba ABC Vet. Oceniono: liczba białych krwinek (WBC), liczba czerwonych krwinek (RBC), stężenie hemoglobiny (HGB) , hematokryt (HCT), średnią objętość krwinki (MCV), średnią zawartość hemoglobiny w krwince (MCH) oraz średnie stężenia hemoglobiny w krwince (MCHC).

Parametry koagulologiczne: czas protrombinowy (PT), czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT), stężenie fibrynogenu metodą Calussa oraz procentowy wskaźnik czasu protrombinowego (wskaźnik Quicka) oceniano w za pomocą aparatu Caog-Chrom 3003 Bio-ksel Grudziądz wykorzystując zamrożone osocze (-70°C). Osocze to pozyskiwano z krwi cytrynianowej pobranej z prawej komory serca od szczurów normotensyjnych i nadciśnieniowych z zakrzepicą tętniczą, którym podawano wcześniej MNANO2 (lub vehiculum).

Wyniki morfologii oraz parametry koagulologiczne zostały przedstawione w Tabeli 1 oraz Tabeli 2.

P r z y k ł a d 3: Profil farmakokinetyczny MNANO?

Do oznaczenia stężeń 1-metylonikotynamidu (MNA) w osoczu szczura opracowano i zwalidowano metodę z zastosowaniem techniki ultrasprawnej chromatografii cieczowej połączonej z tandemową spektrometrią mas (LC/HESI-MS/MS). Szczurom jednorazowo, dożylnie i dożołądkowo podawno azotan(lll) 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego (MNANO2) lub dla porównania chlorek MNA (MNACl) w dawce 100 mg/kg. Parametry farmakokinetyczne wyznaczono techniką bezmodelową korzystając z programu Phoenix WinNonlin (Pharsight, Sannyvale, C.A., USA).

Na FIG. 4A i FIG. 4B rysunku przedstawiono profil zmian stężenia od czasu po jednorazowym podaniu dożylnym i dożołądkowym odpowiednio MNANO2 oraz MNACl.

W Tabeli 3 przedstawiono zestawienie średnich wartości parametrów farmakokinetycznych w tym układzie.

PL 226 999 B1

T a b e l a 3. Średnie wartości parametrów farmakokinetycznych MNA wyznaczone w osoczu szczura po jednorazowym podaniu dożylnym odpowiednio MNANO2 oraz MNACl w dawce 100 mg/kg

Parametr	Związek
Azotan (III) MNA	Chlorek MNA
C0 [gg/L]	138078±33208	141311±56500
AUC0 ^χ [gg^min/L]	6948716±1810664	4362231±999203
MRT [min]	42.4±6.2	43.7±9.81
T0.5 [min]	61.7±19.6	162.5±76.2
Cl [L/min/kg]	0.015±0.003	0.024±0.005
Vss [L/kg]	0.63±0.1	1.06±0.35

Z kolei FIG. 5A i FIG. 5B ilustrują indywidualne wartości zależności stężenia od czasu dla MNA po jednorazowym podaniu dożołądkowym MNANO2 oraz MNACl w dawce 100 mg/kg u szczura. W Tabeli 4 przedstawiono zestawienie średnich wartości parametrów farmakokinetycznych w tym układzie.

T a b e l a 4. Średnie wartości parametrów farmakokinetycznych MNA wyznaczone w osoczu szczura po jednorazowym podaniu dożołądkowym MNANO2 oraz MNACl w dawce 100 mg/kg

Parametr	Związek
Azotan (III) MNA	Chlorek MNA
AUC0^x [gg^min/L]	638056±167631	407132±164906
tmax [min]	15±10	57.5±82.2
Cmax [gg/L]	8881±5506	2811±3669
MRT [min]	232±38.3	358.7±287.7
T0.5 [min]	178.4±12.2	247.4±201
F [%]	9.18	9.33

Na podstawie uzyskanych wyników po podaniu jednorazowym MNANO2 można stwierdzić że MNA cechuje się stosunkowo krótkim okresem półtrwania, który wynosi 61.7±19.6 min podczas gdy dla MNACl wynosi on 162.5±76.2 min. Średni czas przebywania leku w organizmie dla obu związków jest podobny, równy około 43 min. Objętość dystrybucji dla MNA po podaniu MNANO2 wynosi 0.63±0.1, a po podaniu MNACl jest równa 1.06±0.35 dm³/kg.

Co istotne, po podaniu dożołądkowym MNANO2, stężenie 3-karbamoilo-1-metylonikotynamidu osiąga trzykrotnie wyższe stężenie maksymalne w osoczu szczura w porównaniu do podawania MNACl, a czas pojawienia się stężenia maksymalnego jest czterokrotnie krótszy. Po podaniu dożołądkowym tej samej dawki MNANO2 i MNACl widoczne są również istotne różnice w wartościach pól pod krzywymi stężenie-czas (AUC), będących miarą ilości MNA w organizmie (ok. 2 razy większa dla MNANO2 niż dla MNACl). MNANO2 cechuje się niewielką dostępnością biologiczną (9.18%), lecz porównywalną w stosunku do MNACl (9.33%).

W podsumowaniu można stwierdzić, że profil farmakokinetyczny MNA różni się po podaniu MNANO2 oraz MNACl, w szczególności proces wchłaniania po podaniu MNANO2 przebiega szybciej, obserwowane stężenia MNA w osoczu po podaniu dożołądkowym MNANO2 są wyższe i osiągane w znaczenie krótszym czasie w porównaniu do MNACl.

Cytowana literatura

1. Chlopicki S, Swies J, Mogielnicki A, Buczko W, Bartuś M, Lomnicka M, Adamus J, Gębicki J: 1-Methylnicotinamide (MNA), a primarymetabolite of nicotinamide, exertsanti-thromboticactivitymediated by a cyclooxygenase-2/prostacyclinpathway. Br J Pharmacol 152:230239 (2007).

PL 226 999 B1

2. Gębicki J, Sysa-Jędrzejowska A, Adamus J, Wozniacka A, Rybak M, Zielonka J. 1-Methylnicotinamide: a potentanti-inflammatory agent of vitaminorigin. Pol J Pharmacol 55:109-112 (2003).

3. Holman Wl, De Lange DJ. Fate of N-methylnicotinamide in man. Nature 164:844 (1949).

4. Huang WC, Ploth DW, Bell PD et al. Bilateral renal function responses to converting enzyme inhibitor (SQ 20,881) in two-kidney, one clip Goldblatt hypertensive rats. Hypertension 3:285-93 (1981).

5. Kramkowski K, Mogielnicki A, Leszczynska A, Buczko W. Angiotensin-(1-9), the product of angiotensin I conversion in platelets, enhances arterial thrombosis in rats. J Physiol Pharmacol. 61:317-324 (2010).

6. Luzak B, Rywaniak J, Stanczyk L, Watala C. Pravastatin and simvastatin improves acetylsalicylic acid-mediated in vitro blood platelet inhibition. Eur J Clin Invest. 42:864-72 (2012).

7. Pernak J, Kalewska J, Ksycińska H, Cybulski J. Synthesis and anti-microbial activities of some pyridinium salts with alkoxymethyl hydrophobic group. Eur. J. Med. Chem. 36: 899-907 (2001).

8. Schumacher WA, Steinbacher TE, Megill JR, Durham SK. A ferret model of electricalinduction of arterial thrombosis that is sensitive to aspirin. J Pharmacol Toxicol Methods 35: 3-10 (1996).

9. Stanulovic M, Chaykin S. Metabolic origins of the pyridones of N1-methylnicotinamide in man and rat. Arch Biochem Biophys 145:35-42 (1971).

10. Vivian VM, Chaloupka MM, Reynolds MS. Some aspects of tryptophan metabolism in human subjects. I. Nitrogen balances, blood pyridine nucleotides and urinary excretion of N1methylnicotinamide and N1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide on a low-niacin diet. J Nutr 66:587-598 (1958).

11. Wozniacka A, Wieczorkowska M, Gębicki J, Sysa-Jędrzejowska A. Topical application of 1-methylnicotinamide in the treatment of rosacea: a pilot study. Clin Exp Dermatol 30:632635 (2005).

12. Zatz R. A low cost tail-cuff method for the estimation of mean arterial pressure in conscious

Claims

1. Sól pirydyniowa zawierająca anion azotanowy(III) i kation 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowy o Wzorze 1:

2. Sposób otrzymywania azotanu(lll) 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego o Wzorze 1, znamienny tym, że:

a. chlorek 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowy o Wzorze 2:

rozpuszcza się w alkoholu krótkołańcuchowym, miesza się z solą sodową lub potasową lub litową lub amonową azotanu(lll), w stosunku molowym chlorku 3-karbamoilo-110

PL 226 999 B1

-metylopirydyniowego do soli azotanu(lll) od 1:0,8 do 1:1,2, w temperaturze od 0°C do temperatury wrzenia rozpuszczalnika.

b. następnie odsącza się nieorganiczny produkt uboczny, po czym z przesączu usuwa się rozpuszczalnik.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że alkohol krótkołańcuchowy stanowi metanol lub etanol.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek molowy chlorku 3-karbamoilo-1-metylopirydyniowego do soli azotanu(III) wynosi 1:1.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w temperaturze 45°C, w czasie co najmniej 2 godzin.

6. Związek jak określono w zastrzeżeniu 1 do stosowania w leczeniu lub profilaktyce stanów lub chorób związanych z dysfunkcją śródbłonka naczyniowego, niewydolnością śródbłonkowej syntezy tlenku azotu (NO) i/lub niewydolnością śródbłonkowej syntezy prostacykliny (PGl2), przy czym wspomniane stan lub choroba wybrane są z następujących:

a. miażdżyca tętnic;

b. miażdżyca tętnic u pacjentów ze stabilną choroba wieńcową, niedokrwiennym epizodem mózgowym lub miażdżycą kończyn, w tym zakrzepowo-zarostowym zapaleniem tętnic;

c. hipercholesterolemia, hipertriglicerydemia lub niski poziom HDL;

d. zakrzepica o innym podłożu niż miażdżyca tętnic, w szczególności zakrzepica związana z implantacją metalowych protez naczyniowych (stentów), operacją pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG), hemodializą, chorobą zakrzepowo-zatorową żył;

e. czynniki ryzyka rozwoju miażdżycy tętnic wybrane z grupy składającej się z następujących: hipercholesterolemia, nadciśnienie tętnicze, hiperhomocysteinemia, otyłość, stres psychiczny, infekcje, miażdżyca naczyń przeszczepu przy przeszczepie narządów i tolerancja na nitraty;

f. grupa składająca się z następujących: przewlekła niewydolność serca, nadciśnienie płucne, zespół nerczycowy, przewlekła niewydolność nerek, zespół ostrej niewydolności oddechowej typu dorosłych (ARDS), mukowiscydoza, przewlekła obturacyjna choroba płuc (COPD), stan przedrzucawkowy - rzucawka, zaburzenia wzwodu, zespół SteinaLeventhala, zespół bezdechu śródsennego, toczeń rumieniowaty układowy, anemia sierpowata, choroba wrzodowa żołądka lub dwunastnicy, jaskra, przewlekła choroba wątroby, zwłaszcza wirusowe zapalenie wątroby, pierwotna amyloidoza.