PL213376B1 - Fotochemiczny sposób in vitro lub ex vivo wprowadzania czasteczki do komórki za posrednictwem nosnika adenowirusowego, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie i produkt - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wprowadzania in vitro lub ex vivo cząsteczki do komórek z zastosowaniem czynnika ś wiatł ouczulają cego i naś wietlania komórek ś wiatł em o dł ugoś ci fali odpowiedniej do aktywacji czynnika światłouczulającego, w którym cząsteczkę do wprowadzenia, w szczególności cząsteczkę kwasu nukleinowego, łączy się z nośnikiem adenowirusowym. Niniejszy wynalazek następnie dotyczy kompozycji farmaceutycznej, zastosowania i produktu.

Terapię genową, tj. genetyczną modyfikację komórek pacjenta przeprowadzaną w celu walki z chorobą , postrzega się jako mają cą duż y potencjał terapeutyczny w leczeniu róż nych chorób, takich jak rak, choroby zakaźne, włączając w to zakażenia bakteryjne i wirusowe, choroby układu krążenia, zaburzenia wrodzone, takie jak mukowiscydoza, zaburzenia układu odpornościowego i wiele innych stanów. Kliniczny rozwój terapii genowej napotyka jednak wiele nierozwiązanych problemów, spośród których jednym z najważniejszych jest znalezienie skutecznego i specyficznego sposobu dostarczania leczniczych genów do komórek docelowych in vivo (Verma & Somia, 1997, Nature, vol. 389, 239-242 i Andersen, 1998, Nature vol. 392, 25-30).

Terapia genowa może obejmować wiele różnych podejść i może obejmować przenoszenie sklonowanych ludzkich genów lub segmentów genowych, dwuniciowych ludzkich genów lub segmentów genowych, genów z innych genomów i organizmów, oligonukleotydów i różnych sztucznych genów lub ich fragmentów takich jak geny antysensowne.

W obecnych metodach proponowanych jest wiele ró ż nych noś ników lub wektorów do zastosowania w celu osiągnięcia przenoszenia genów w terapii genowej. Można na przykład wymienić związki polikationowe, lipidy kationowe i układy wirusowe, ale dotychczas w terapii genowej in vivo osiągnięto niewielki sukces. Wśród wielu znanych wad obecnych metod są: niska stabilność wektora w surowicy, ograniczona specyficzność w dostarczaniu genu, niska wydajność w dostarczaniu genu itd. Do zastosowania nośników wirusowych należy podchodzić ze szczególną uwagą w związku z tym, że wprowadzenie elementów wirusa do gospodarza może powodować efekty uboczne, takie jak zapalenie, których nie może zrównoważyć zwiększone przenoszenie w porównaniu z innymi sposobami.

Większość cząsteczek nie przenika łatwo przez błony komórkowe. Sposoby wprowadzania cząsteczek do cytozolu żywych komórek są znane w tej dziedzinie i są użytecznymi narzędziami do manipulowania i badania procesów biologicznych. Pośród najczęściej stosowanych sposobów są mikroiniekcja, fuzja z zastosowaniem cieni erytrocytów i liposomów, osmotyczna Iiza pinosomów, metoda przenoszenia barwnika, elektroporacja, metoda z fosforanem wapnia i transfekcja za pośrednictwem wirusa. Te techniki są użyteczne do manipulowania komórkami w hodowli, jednakże w wielu wypadkach mogą być niepraktyczne, czasochłonne, mało wydajne lub mogą powodować śmierć znacznej liczby komórek. Z tego powodu takie techniki nie są optymalne do zastosowania w badaniach biologicznych lub medycznych, lub w sposobach leczenia, gdzie zwykle nie są wystarczająco wydajne, mogą mieć niedopuszczalne działania toksyczne lub mogą nie nadawać się do zastosowania z przyczyn technicznych.

Wiadomo, że porfiryny i wiele innych związków światłouczulających może wywoływać cytotoksyczne skutki w komórkach i tkankach. Skutki te wynikają z faktu, że podczas ekspozycji na światło związek światłouczulający może stać się toksyczny lub może uwolnić toksyczne substancje takie jak tlen singletowy lub inne utleniacze, które uszkadzają materiał komórkowy lub cząsteczki biologiczne, włączając w to błony komórkowe i struktury komórkowe i takie uszkodzenia komórkowe lub błonowe mogą ewentualnie zabić komórkę. Te działania zostały wykorzystane w leczeniu wielu różnych nieprawidłowości lub chorób, obejmujących zwłaszcza choroby nowotworowe. Ten sposób leczenia nazywa się terapią fotodynamiczną (PDT) i obejmuje on podawanie czynników światłouczulających (fotochemioterapeutycznych) do zmienionej okolicy ciała, następującą potem ekspozycję na światło w celu aktywacji czynnika ś wiatł ouczulają cego i przekształ cenia go do formy cytotoksycznej, dzi ę ki czemu zmienione komórki zostają zabite lub ich potencjał proliferacyjny zostaje zmniejszony. Są znane czynniki światłouczulające, które wybiórczo lub preferencyjnie rozmieszczają się w pożądanych miejscach docelowych np. w guzie lub innych zmianach.

Znany jest pewien zakres czynników światłouczulających w tym szczególnie psoraleny, porfiryny, chloryny i ftalocyjaniny. Takie leki stają się toksyczne po ekspozycji na działanie światła.

Światłouczulające porfiryny działają bezpośrednio przez wytwarzanie toksycznych cząstek tlenowych i są uważane za szczególnie korzystnych kandydatów do terapii fotodynamicznej. Porfiryny są naturalnymi prekursorami pojawiającymi się w syntezie hemu. W szczególności, hem powstaje w moPL 213 376 B1 mencie włączenia żelaza (Fe³⁺) do protoporfiryny IX (PpIX) na skutek działania enzymu ferrochelatazy. PpIX jest bardzo silnym czynnikiem światłouczulającym, podczas gdy hem nie ma żadnych właściwości światłouczulających. Wiele różnych opartych na porfirynach lub pochodnych porfiryn czynników światłouczulających jest znanych w tej dziedzinie i opisanych w literaturze.

Efekt cytotoksyczny opiera się głównie na tworzeniu się tlenu singletowego. Ta bardzo reaktywna forma pośrednia istnieje w komórce bardzo krótko (<0,04 μs). Z tego powodu główny efekt cytotok11 syczny PDT ma miejsce podczas ekspozycji na światło i bardzo blisko miejsc powstawania ¹O2. ¹O2 reaguje z i utlenia białka (histydyna, tryptofan, metionina, cysteina, tyrozyna), DNA (guaninę), nienasycone kwasy tłuszczowe i cholesterol. Jedną z zalet PDT jest fakt, że tkanki nieeksponowane na światło mogą pozostać nieuszkodzone, tzn. można uzyskać swoistość PDT. Istnieje obszerna dokumentacja dotycząca zastosowania PDT do niszczenia niepożądanych populacji komórek, np. komórek nowotworowych. Literatura patentowa opisuje pewną liczbę związków fotodynamicznych, stosowanych samodzielnie lub sprzężonych z czynnikami kierującymi, np. immunoglobulinami przeciwko determinantom receptorowym komórek nowotworowych, co nadaje takim kompleksom większą swoistość komórkową. Pewne związki fotochemiczne, takie jak pochodne hematoporfiryn, mają ponadto naturalną zdolność do rozmieszczania się w komórkach nowotworowych. Takie sposoby i związki są opisane w norweskim patencie nr 173319 i w norweskich zgłoszeniach patentowych nr 90 0731, 176 645, 176 947, 180 742, 176 786, 301 981, 30 0499 i 89 1491. Takie sposoby PDT, są więc zależne od zniszczenia struktur komórkowych prowadzącego do śmierci komórki.

Z drugiej strony WO 96/07432 i równoległe zgłoszenie WO 00/54802, wiążą się ze sposobami, w których stosuje się skutek fotodynamiczny jako mechanizm wprowadzania do cytozolu komórki cząsteczek, które inaczej nie przenikają przez błony, do cytozolu komórki w sposób, który nie musi oznaczać zniszczenia lub śmierci komórki. W tych sposobach cząsteczka do wprowadzenia i czynnik światłouczulający dodawane są równocześnie lub kolejno do komórek, po czym czynnik światłouczulający i cząsteczka ulegają endocytozie lub innemu przemieszczeniu do endosomów, lizosomów lub innych, ograniczonych błonami przedziałów wewnątrzkomórkowych.

Wprowadzana do przedziałów wewnątrzkomórkowych cząsteczka i związek światłouczulający są podawane komórkom łącznie lub kolejno (korzystnie oddzielnie i kolejno) i są łącznie wychwytywane przez komórkę do tych samych przedziałów wewnątrzkomórkowych (to jest są współprzemieszczane). Wprowadzona cząsteczka jest następnie wewnątrz komórki uwalniana przez ekspozycję komórki na światło o długości fali odpowiedniej do aktywacji związku światłouczulającego, który doprowadza do uszkodzenia błon przedziałów wewnątrzkomórkowych i następowego uwolnienia cząsteczki, która jest zlokalizowana w tym samym przedziale, co czynnik światłouczulający, do cytozolu. Ten sposób został nazwany „fotochemiczną internalizacją (PCI). A zatem w tych sposobach ostateczny krok - ekspozycja komórek na światło, kończy się uwolnieniem omawianej cząsteczki z tego samego przedziału wewnątrzkomórkowego co czynnik światłouczulający i pojawieniem się jej w cytozolu.

Uważano, że dla skuteczności tego sposobu istotne jest, aby uwalniane do cytozolu zarówno związek światłouczulający, jak i cząsteczka były obecne w tym samym przedziale wewnątrzkomórkowym w momencie przeprowadzenia naświetlania.

Jednak, potem stwierdzono, że cząsteczki można wprowadzić do cytozolu komórek podobnymi sposobami fotochemicznej internalizacji, ale ekspozycja komórek na światło niekoniecznie musi być ostatnim etapem i sposoby te nie są zależne od rozmieszczenia przenoszonej cząsteczki i czynnika światłouczulającego w tym samym przedziale wewnątrzkomórkowym w momencie ekspozycji na światło. W takich sposobach czynnik światłouczulający może być kontaktowany z komórką i aktywowany przez naświetlanie przed doprowadzeniem do kontaktu z komórką cząsteczki, która ma być internalizowana i w ten sposób dostarczona do cytozolu. W ten sposób, pomimo faktu, że cząsteczka, która ma być internalizowana i czynnik światłouczulający niekoniecznie są rozmieszczone w tym samym przedziale wewnątrzkomórkowym w momencie ekspozycji na światło, cząsteczka nadal przenika do komórki i jest dostarczana do cytozolu. Te wyniki szczegółowo opisano w równolegle złożonym, międzynarodowym zgłoszeniu patentowym (złożonym 29 listopada 2001 w imieniu Norwegian Radium Hospital Research Foundation, w rozdziale zatytułowanym „Metoda), którego włączono niniejszym na drodze odniesienia.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że zastosowanie technik fotochemicznej internalizacji w kombinacji z wektorami wirusowymi może zasadniczo poprawić dostarczanie genów do komórek za pośrednictwem wirusów. Opisana technologia ma duży potencjał do poprawy zarówno wydajności jak i specyficzności terapii genowej in vivo, ponieważ leczenie fotochemiczne ma zastosowanie kliniczne

PL 213 376 B1 (Dougherty i inni, 1998, J. Natl. Cancer Inst, vol. 90, 889-905) i ogólnie rzecz biorąc jest to sposób bardzo specyficzny, mający mało działań ubocznych,.

W ten sposób, wynalazek niniejszy dostarcza sposobu in vitro lub ex vivo wprowadzania cząsteczki do komórki, który obejmuje kontaktowanie komórki z czynnikiem światłouczulającym, kontaktowanie komórki z cząsteczką do wprowadzenia (przenoszoną cząsteczką), która jest związana z noś nikiem wirusowym i naś wietlanie komórki ś wiatł em o dł ugoś ci fali odpowiedniej do aktywacji czynnika światłouczulającego, przy czym nośnikiem wirusowym jest adenowirus, a przenoszoną cząsteczką cząsteczka kwasu nukleinowego.

Te etapy mogą być przeprowadzone w dowolnej odpowiedniej kolejności tak, by ich ostatecznym skutkiem było wychwycenie przez komórkę nośnika wirusowego, a zatem i cząsteczki, która ma być wprowadzona do komórki i internalizacja tej cząsteczki. Żadne inne cząsteczki z wyjątkiem nośnika wirusowego i czynnika światłouczulającego nie są potrzebne do realizacji wynalazku.

Pojęcie „komórka w znaczeniu tu stosowanym obejmuje wszystkie komórki eukariotyczne, włączając w to komórki owadów i grzybów oraz komórki somatyczne i zarodkowe. Zatem przykłady „komórek obejmują wszystkie typy komórek ssaków i innych zwierząt (nie ssaków), komórki roślinne, komórki owadów, komórki grzybów, pierwotniaków i komórki protoplastów, a korzystnie komórki ssaków takich jak człowiek, mysz, szczur, kot, pies, owca, koń, krowa lub koza.

Korzystnie komórką, do której wprowadzana jest cząsteczka sposobem według wynalazku jest komórką ssaka.

„Internalizacja w znaczeniu tu stosowanym, odnosi się do dostarczania cząsteczek, które mają być wprowadzone do komórek (czasem określanych tu jako „cząsteczki przenoszone), z lub bez przyłączonego jeszcze nośnika wirusowego, do cytozolu. W ten sposób, w niniejszym przypadku „internalizacja obejmuje etap uwolnienia cząsteczki, która ma być wprowadzona, ewentualnie w połączeniu z całym lub częścią jej nośnika wirusowego, z wewnątrzkomórkowych otoczonych błonami przedziałów do cytozolu, która może być następnie przeniesiona do jądra. Internalizowana cząsteczka jest uważana za „wprowadzoną do komórki, zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku.

Wewnątrzkomórkowym przedziałem otoczonym błonami może być dowolny taki przedział, który jest obecny w komórce. Korzystnie będzie to otoczony błonami pęcherzyk, szczególnie endosom lub lizosom. Jednak przedział wewnątrzkomórkowy może obejmować także aparat Golgi'ego lub siateczkę śródplazmatyczną.

W znaczeniu tu stosowanym „wychwyt komórkowy lub „przenoszenie odnoszą się do jednego z etapów internalizacji, w którym cząsteczki lub jednostki zewnętrzne w stosunku do błony komórkowej są pobierane do komórki tak, że znajdują się po wewnętrznej stronie błony komórkowej, np. przez endocytozę lub inne, odpowiednie mechanizmy wychwytu, na przykład do lub w powiązaniu z wewnątrzkomórkowym, ograniczonym błonami przedziałem, na przykład siateczką śródplazmatyczną, ciałkiem Golgi'ego, lizosomami, endosomami itp.

Odpowiednimi „cząsteczkami, które wprowadza się do komórki, mogą być dowolne cząsteczki, które mogą być związane z nośnikami wirusowymi, wektorami wirusowymi lub cząstkami wirusa i czasem mogą być nazywane „przenoszonymi cząsteczkami. W sposobie według wynalazku takimi cząsteczkami są ogólnie cząsteczki kwasu nukleinowego i mogą one korzystnie obejmować pełnej długości gen, który ma być wprowadzony do komórki lub jego funkcjonalny fragment, lub mogą one być na przykład sekwencjami cDNA zawierającymi całą sekwencję kodującą genu lub jego funkcjonalny fragment. Alternatywnie, cząsteczki kwasu nukleinowego wprowadzane sposobem według wynalazku mogą obejmować inne formy DNA. Korzystnymi przykładami są cząsteczki antysensownego RNA, rybozymy, aptamery, oligonukletydy lub oligonukleotydy tworzące tryplety lub mogą zawierać czynnik transkrypcyjny „decoy DNA ltd. Korzystnie cząsteczki kwasu nukleinowego zawierają 10 do 30 000 par zasad, np. 20-10000 par zasad.

„Związany z w znaczeniu tu stosowanym odnosi się do cząsteczki, która jest wprowadzana do lub w jakiś sposób połączona z nośnikiem wirusowym, wektorem wirusowym lub cząstką wirusową, np. jest wbudowana w genom tej cząstki wirusowej lub oddzielona od wymienionego genomu, ale transportowana wewnątrz cząstki wirusa. Ogólnie, cząsteczki, które mają być wprowadzone do komórek, pakuje się do lub wprowadza się do cząstki wirusowej, tj. zamyka się lub wprowadza do otoczki wirusowej lub kapsydu. Transportowana cząsteczka korzystnie jest polinukleotydem i korzystnie jest wstawiona do konstruktu wirusowego, który zawiera pewne elementy pochodzące z wirusa konieczne, aby umożliwić zapakowanie konstruktu do zapakowania w nośnik wirusowy. Cząsteczka do transportu może być np. klonowana do miejsca klonowania na genomie nośnika wirusowego. Alternatywnie

PL 213 376 B1 można stosować 2 lub więcej oddzielnych cząsteczek spełniających te warunki, jak opisano poniżej. Takie cząstki wirusowe mogą być tak wybrane, że będą lub nie będą mogły zakażać komórki samodzielnie i jeśli będą zdolne zakażać samodzielnie, gdy zostaną internalizowane do komórki, mogą być tak wybierane, że będą lub nie będą mogły przestawiać endogenne układy komórkowe na replikację wirusa i składać nowe wiriony, które będą wydzielane z komórki. Jednak, ogólnie rzecz biorąc, gdy stosuje się nośniki wirusowe do terapii genowej lub innych zastosowań in vivo, to ze względów bezpieczeństwa są one zwykle defektywne tak, że mogą zakażać komórki gospodarza, ale nie mogą replikować, powodować tworzenia nowych wirionów i zakażać nowych komórek, tj. powodują niekompetentną replikację. Takie zdefektowanie można przeprowadzić za pomocą dowolnych, właściwych środków, ale zwykle przeprowadza się przez delecję pewnych genów wirusowych koniecznych do replikacji wirusa i ewentualne wstawienie genów leczniczych, które mają być przeniesione w miejsce tamtych. Jednak, technologia opisana w tym zgłoszeniu może być również stosowana z wirusami replikacyjnie kompetentnymi lub z ograniczoną replikacją takimi jak np. ONYX-15 (Khuri F. R. i inni, (2000), Nature Med. 6, 879-885) lub wirus opryszczki zwykłej, kodujące kinazę tymidynową adenowirusy z ograniczoną replikacją jak opisane przez Wildnera i współpracowników (Wildner O. i in., (1999) Gene Ther. 6, 57-62; Wildner O. i in., (1999), Cancer. 59, 410-413), lub np. replikujące retrowirusy opisane przez D. Klatzman'a (prezentacja ustna i abstrakt na 8th Meeting of the European Society of Gene Therapy, Sztokholm 7-10 października 2000).

Cała cząsteczka, która ma być wprowadzona do komórki, tj. nośnik wirusowy z wcieloną do lub zamkniętą w nim cząsteczką do wprowadzenia czasem jest tu określana jako „przenoszona cząstka.

Na ogół kwas nukleinowy, który ma być wprowadzony do komórki sposobami według niniejszego wynalazku, jest częścią konstruktu opartego na wirusie, np. plazmidu opartego na wirusie, który zawiera pewne pochodzące z wirusa elementy konieczne do upakowania konstruktu w nośniku wirusowym/kapsydzie wirusowym/wektorze wirusowym. Alternatywnie jednak, kwas nukleinowy, który ma być wprowadzony może tworzyć część jednej cząsteczki, np. plazmidu i może być obecna też druga cząsteczka, która zawiera sekwencję konieczną do rozwoju nośnika wirusowego, który zawiera pierwszą cząsteczkę. Ponadto, jeśli wewnątrzkomórkowe działanie kwasu nukleinowego zależy od ekspresji białka kodowanego przez niego lub produkcji RNA wytwarzanego na jego podstawie, kwas nukleinowy jest dogodnie flankowany przez odpowiednie sekwencje regulatorowe (np. promotory) dla zapewnienia wysokiego poziomu ekspresji w konkretnej komórce docelowej. Takie elementy regulatorowe mogą pochodzić od wirusów (np. promotor CMV z wirusa cytomegalii) lub innego dowolnego stosownego organizmu, a projektowanie odpowiednich konstruktów wirusowych w celu uzyskania dobrej ekspresji białka kodowanego przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jest dobrze znane specjalistom. Na przykład, tkankowo specyficzne lub nadające się do regulacji promotory można zastosować, by uzyskać specyficzną dla tkanki lub choroby lub nadającą się do regulacji ekspresję. Na przykład, jako promotor tkankowo specyficzny można zastosować promotor tyrozynazy specyficzny dla czerniaka. Dobrze znane są nadające się do regulacji promotory takie jak promotory regulowane tetracyliną. Więcej przykładów specyficznych lub nadających się do regulacji promotorów, które mogą być stosowane w niniejszym wynalazku, można znaleźć w Hart, I.R. (Semin. Oncol., 1996, 23, 154-158), Miller i Whelan (Hum. Gene Therapy, 1997), Nettelbeck i Muller (Trends Genet., 2000, 16, 174-181) i Spear (Anticancer Res., 1998, 18,322 3-32 31) i ich źródłach referencyjnych.

Cząsteczką „nośnika wirusowego, z którą jest związana przenoszona cząsteczka, może być dowolny układ adenowirusowy pod warunkiem, że nośnik wirusowy z tego układu będzie się nadawał do połączenia z, wprowadzenia do niego lub zamknięcia w nim cząsteczek, które mają być wprowadzone do komórek. Zatem, na ogół przenoszone cząsteczki upakowuje się w cząstce wirusowej lub kapsydzie wirusowym i stąd pojęcia „cząstka wirusowa, „kapsyd wirusowy i „wektor wirusowy stosuje się tu w znaczeniu „nośnika wirusowego. Te pojęcia, w stosowanych tu znaczeniach, nie obejmują plazmidów opartych na wirusach albo DNA, jakkolwiek takie plazmidy można zastosować do wytworzenia wirusowego nośnika.

Odpowiednimi układami wirusowymi do zastosowania w niniejszym wynalazku są adenowirusy. Jednakże ujawnione tu sposoby można stosować wykorzystując wirusy pochodzące od adenowirusa, retrowirusy, lentiwirusy, wirusy opryszczki, bakteriofagi, wirus grypy, wirus Sendai, wirus Vaccinia, i Bakulowirus, korzystnie adenowirusy, wirusy wywodzące się od adenowirusa, retrowirusy, lentiwrusy i bakteriofagi. Do zastosowania zgodnie z wynalazkiem nośniki wirusowe zwykle tworzy się przez modyfikację naturalnie występujących wirusów, aby dodać pożądane właściwości i zminimalizować możliwą patogenność lub inne działania niepożądane. W ten sposób nośniki wirusowe reprezentują

PL 213 376 B1 odmiany wirusów rutynowo stosowanych do terapii genowej i bardzo dobrze znanych w tej dziedzinie, ale zachowujących swoje podstawowe i rozróżnialne elementy pochodzące od wirusa wyjściowego.

W znaczeniu tu stosowanym „czynnik światłouczulający oznacza czynnik, który jest wrażliwy na światło i który w przypadku wystawienia na wzbudzające światło, przekształca się do postaci cytotoksycznej lub wywołuje powstawanie cytotoksycznych cząstek. Czynnikiem światłouczulającym stosowanym według niniejszego wynalazku (oddzielnym i korzystnie różnym od przenoszonej cząsteczki) jest, korzystnie dowolny taki czynnik, który rozmieszcza się w przedziałach wewnątrzkomórkowych, szczególnie endosomach i lizosomach. Czynniki takie są znane w dziedzinie i opisane w literaturze, w tym w WO96/07432. Trzeba tu wspomnieć o di- i tetrasulfonowanej soli glinowej ftalocyjaniny (np. AlPcS2a), sulfonowanych tetrafenyloporfirynach (TPPSn), błękicie nilowym, pochodnych chloryny e⁶, uroporfirynie I, filoerytrynie, hematoporfirynie i błękicie metylenowym, które jak wykazano, rozmieszczają się w endosomach i lizosomach komórek w hodowli. Takie rozmieszczenie w większości przypadków jest następstwem aktywności procesu endocytozy. Czynnik światłouczulający jest korzystnie czynnikiem, który jest wychwytywany do wewnętrznych przedziałów lizosomów lub endosomów. Jednak mogą być również stosowane inne czynniki światłouczulające, które rozmieszczają się w innych wewnątrzkomórkowych przedziałach np. siateczce śródplazmatycznej albo aparacie Golgi'ego. Można również wyobrazić sobie, że te mechanizmy mogą działać, gdy fotochemiczne traktowanie wpływa na inne składniki komórki (tj. składniki inne niż przedziały ograniczone błonami). Tak więc, istnieje możliwość, że fotochemiczne traktowanie uszkadza cząsteczki istotne dla wewnątrzkomórkowego transportu lub zlewania się pęcherzyków. Tego typu cząsteczki niekoniecznie znajdują się w przedziałach ograniczonych błonami.

Klasy odpowiednich czynników światłouczulających, które można wymienić, obejmują porfiryny, psoraleny, ftalocyjaniny, purpuryny, chloryny, benzoporfiryny, naftalocyjaniny, kationowe barwniki, tetracykliny i lisomotropowe słabe zasady lub ich pochodne lub prekursory (Berg i inni, J. Photochemistry and Photobiology, 1997, 65, 403-409). Inne odpowiednie czynniki światłouczulające obejmują teksafiryny, feoforbidy, porficeny, bakteriochloryny, ketochloryny, pochodne hematoporfiryn i ich pochodne, endogenne czynniki światłouczulające indukowane kwasem 5-aminolewulinowym i jego pochodnymi, dimery albo inne koniugaty między czynnikami światłouczulającymi.

Korzystnie czynnik światłouczulający występuje w postaci wolnej, tj. nie sprzężony z jakąkolwiek inną makrocząsteczką. Szczególnie korzystnie, czynnik światłouczulający jest oddzielony od nośnika wirusowego, tzn. jest odrębną jednostką. Jednak czynnik światłouczulający może alternatywnie być dołączony do, związany z lub sprzężony z nośnikiem lub inną cząsteczką jak opisano poniżej, np. może być dołączony do przeciwciała kierującego albo sprzężony z nośnikiem takim jak polilizyna. Alternatywnie, w pewnych okolicznościach, czynnik światłouczulający można bezpośrednio dołączyć do, związać z, sprzęgnąć z nośnikiem wirusowym lub jego częścią (np. z otaczającą osłonką lipidową np. retrowirusa).

Korzystne czynniki światłouczulające obejmują TPPS4, TPPS2a, AlPcS2a i inne amfifilowe czynniki światłouczulające.

W korzystnym aspekcie, wynalazek niniejszy dostarcza sposobów, w których czynnik światł ouczulający stanowi kwas 5-aminolewulinowy albo estry kwasu 5-aminolewulinowego lub ich farmaceutyczne dopuszczalne sole.

W takich estrach grupa 5-aminowa może być podstawiona lub niepodstawiona, a w tym drugim przypadku będą to estry ALA.

Bardziej szczegółowo, estry ALA do zastosowania według niniejszego wynalazku to estry kwasu 5-aminolewulinowego z ewentualnie podstawionymi alkoholami, tj. estry alkilowe lub podstawione estry alkilowe.

Korzystnie, estry ALA, które mogą być zastosowane są związkami o wzorze I, R²2N-CH2COCH2-CH2CO-OR¹ (I) ₁ (w którym R¹ oznacza alkil ewentualnie podstawiony przez grupę hydroksylową, alkoksylową, acyloksylową, alkoksykarbonyloksylową, aminową, arylową, grupę okso lub fluor i ewentualnie przerwany przez atom tlenu, azotu, siarki lub fosforu; a R², z których każdy może być taki sam lub różny, oznacza atom wodoru lub grupę R¹ i ich sole.

Podstawione grupy alkilowe R¹ mogą być mono- lub polipodstawione. Tak więc odpowiednie grupy R¹ obejmują na przykład niepodstawiony alkil, alkoksyalkil, hydroksyalkoksyalkil, polihydroksyalkil, hydroksypolialkilenooksyalkil i tym podobne. Termin „acyl w znaczeniu tu stosowanym obejmuje zarówno grupy karboksylanowe jak i węglanowe, tak więc grupy alkilowe podstawione acyloksylem

PL 213 376 B1 obejmują na przykład alkilkarbonyloksyalkil. W takich grupach dowolne reszty alkilenowe korzystnie zawierają tyle atomów węgla jak podane poniżej grupy alkilowe. Korzystne grupy arylowe obejmują fenyl i 5-7 członowe monocykliczne grupy heteroaromatyczne, szczególnie fenyl i takie grupy mogą być ewentualnie podstawiane.

Reprezentatywne podstawione grupy alkilowe R¹ obejmują grupy alkoksymetylowe, alkoksyetylowe i alkoksypropylowe lub grupy acyloksymetylowe, acyloksyetylowe i acyloksypropylowe np. piwaloiloksymetylową.

Korzystne estry ALA do zastosowania jako czynniki światłouczulające według wynalazku, obejmują takie estry, w których R¹ oznacza niepodstawioną grupę alkilową i/lub każdy R² oznacza atom wodoru.

W znaczeniu tu stosowanym, termin „alkil obejmuje dowolną dł ugo- lub krótkoł a ń cuchową , o ł a ń cuchu prostym lub rozgałęzionym alifatyczną nasyconą lub nienasycon ą grupę wę glowodorową . Nienasycone grupy alkilowe mogą być mono- lub polinienasycone i obejmują zarówno grupy alkenylowe jak i alkinylowe. Takie grupy mogą zawierać do 40 atomów węgla. Jednak korzystne są grupy alkilowe zawierające do 10, np. 8, bardziej korzystnie do 6, a najkorzystniej do 4 atomów węgla.

Należy tu przede wszystkim wymienić ester ALA-metylowy, ALA-etylowy, ALA-propylowy, ALA-heksylowy, ALA-heptylowy i ALA-oktylowy i ich sole, które reprezentują korzystne czynniki światłouczulające do zastosowania według wynalazku.

Sposoby według niniejszego wynalazku mogą być stosowane in vitro lub in vivo, albo w leczeniu ogólnym albo miejscowym (in situ) lub w traktowaniu komórek ex vivo, a następnie wprowadzaniu ich do organizmu.

Dla przeprowadzenia sposobów według wynalazku, etap „kontaktowania komórek z czynnikiem światłouczulającym i osobno kontaktowania z nośnikiem wirusowym można przeprowadzić w dowolny korzystny lub pożądany sposób. Zatem, jeśli etap kontaktowania ma zachodzić in vitro komórki korzystnie można utrzymywać w wodnym podłożu, takim jak na przykład odpowiednie podłoże do hodowli komórkowej i czynnik światłouczulający albo nośnik wirusowy można dodać w odpowiedniej chwili po prostu do podłoża w odpowiednich warunkach, na przykład w odpowiednim stężeniu i przez odpowiednio dł ugi czas.

Czynnik światłouczulający wprowadza się w kontakt z komórkami w odpowiednim stężeniu i przez odpowiednio dł ugi czas, które mogą być ł atwo okreś lone przez specjalistę przy zastosowaniu rutynowych technik i będą zależały przede wszystkim od rodzaju zastosowanego czynnika światłouczulającego i rodzaju komórek. Stężenie czynnika światłouczulającego musi być takie, że po wychwycie do komórki (np. połączeniu z albo do jednego lub więcej wewnątrzkomórkowego przedziału) i aktywacji ś wiatł em, jedna lub wię cej struktur komórkowych ulegnie rozerwaniu, np. jedna lub wię cej przedziałów wewnątrzkomórkowych ulegnie lizie lub rozerwaniu. Na przykład, czynnik światłouczulający stosowany w podanych tu przykładach można stosować w stężeniach, na przykład, 10 do μg/ml. Ogólnie zakres stężeń stosowanych in vitro może być szerszy, np. 0,05 - 500 μg/ml. Do leczenia in vivo ludzi czynnik światłouczulający stosuje się w zakresie dawek 0,05 - 20 mg/kg masy ciała przy podawaniu ogólnym albo w stężeniu 0,1-20% w rozpuszczalniku do stosowania zewnętrznego. U mniejszych zwierząt zakres stężeń różni się i może być odpowiednio dostosowany.

Czas inkubacji komórek z czynnikiem światłouczulającym (tj. czas „kontaktu) można zmieniać od kilku minut do kilku godzin, np. nawet do 48 godzin lub dłużej. Czas inkubacji powinien być tak długi, aby czynnik światłouczulający był wychwycony przez odpowiednie komórki.

Po inkubacji komórek z czynnikiem światłouczulającym może ewentualnie następować okres inkubacji w podłożu wolnym od czynnika światłouczulającego, zanim komórki zostaną wystawione na działanie światła lub do podłoża zostanie dodana przenoszona cząsteczka.

Przenoszoną cząsteczką może być dowolna cząsteczka kwasu nukleinowego, tak jak to przedstawiono powyżej i wprowadza się ją w kontakt z komórkami w połączeniu z nośnikiem wirusowym w odpowiednim stężeniu/dawce i przez odpowiednio długi czas. Właściwe stężenie nośnika wirusowego można ustalić w oparciu o skuteczność wychwytu tego nośnika do komórek i pożądane, końcowe stężenie, które ma być osiągnięte w komórkach. Jedną z nieoczekiwanych korzyści z zastosowania PCI w połączeniu z nośnikiem wirusowym jest to, że można stosować niższe dawki cząstek wirusowych, uzyskując taką samą skuteczność transfekcji, np. stosując do 20 razy mniej cząstek wirusowych. Odpowiednie dawki wirusowego nośnika, które mają być zastosowane, będą zależeć oczywiście od rodzaju zastosowanego wirusa i dla zastosowań in vivo, od sposobu podawania, rodzaju leczonej choroby, od tego czy zastosowano czy nie zastosowano kierujące ligandy (patrz poniżej) itd.

PL 213 376 B1

Typowo powinno się wprowadzić do guza, za pomocą iniekcji 10³ do 10¹³ jednostek tworzących łysinki niereplikującego wektora adenowirusowego (pfus, cząstki zakaźne). To powinno zwykle odpowiadać od 10⁵ do 10¹⁵ fizycznej ilości cząstek wirusowych, ponieważ w „zwykłych preparatach wirusowych tylko około 1% fizycznych cząstek wirusowych jest zdolnych do zakażenia. Dla wirusów zdolnych do replikacji dawki skuteczne mogą być nawet niższe w stosunku do podanych powyżej, np. można stosować tak niskie dawki jak 10³ cząstek, np. od 10³ do 10⁶, 10¹⁰ lub 10¹⁵ cząstek. Z drugiej strony, gdy stosuje się podawanie ogólnoustrojowe, może być konieczne zwiększenie dawki.

Kolejną, stwierdzoną korzyścią jest to, że można osiągnąć znacznie zwiększoną skuteczność transfekcji; nawet do 100% komórek ulegnie transfekcji. Przy zastosowaniu znanych metod takie poziomy były niemożliwe lub wręcz te sposoby wymagały wysokich dawek wirusów. Zatem, korzystnie stosując sposoby według wynalazku można osiągnąć transfekcję więcej niż 50%, szczególnie korzystnie więcej niż 75, 85 lub 95% całkowitej liczby komórek.

„Okres transfekcji lub „okres wychwytu komórkowego dla nośników wirusowych, tj. czas kontaktu nośników z komórką, może wynosić kilka minut lub do kilku godzin, na przykład można stosować czas transfekcji od 10 minut aż do 10 lub 24 godzin, na przykład 15 minut aż do 10 godzin lub na przykład 15 lub 30 minut aż do 2, 3, 4 lub 6 godzin. Wydłużenie okresu transfekcji może powodować zwiększenie wychwytu wymienionego nośnika. W korzystnej postaci wykonania nośnik wirusowy kontaktuje się z komórką przez 15 minut do 6 godzin.

Nośniki wirusowe mogą być dodawane przed, po lub równocześnie z naświetlaniem. Gdy nośniki wirusowe dodaje się po naświetlaniu, można je dodawać na przykład od 0 do 4 lub od 0 do 24 godzin po naświetlaniu, np. później niż 1, 2, 4, 8, 10 lub nawet 12 godzin po naświetlaniu. Ewentualnie, po kontakcie z nośnikiem wirusowym, komórki można przenieść do podłoża wolnego od nośnika, np. przed naświetlaniem, np. na dłużej niż 5 minut, jak na 15 minut do 2 godzin, np. na 30 minut. Gdy nośniki dodaje się przed naświetlaniem, można je dodawać na przykład w ciągu 12 godzin poprzedzających naświetlanie, np. 15 minut do 2 godzin poprzedzających naświetlanie, ewentualnie z przerwą w podłożu wolnym od nośnika.

Zrozumiałe jest, że trudno jest kontrolować in vivo czas przeznaczony na transfekcję przez kontakt wirusowego nośnika z komórką. Jednak czas kontaktu można kontrolować przez odpowiedni kontakt i etap płukania, kiedy tę procedurę przeprowadza się ex vivo, in vitro oraz w kilku typach podawania miejscowego.

Czynnik uczulający na światło i nośnik wirusowy związany z cząsteczką, która ma być wprowadzona, można dodawać razem lub osobno do komórek poprzedzając traktowanie światłem/naświetlanie jak to opisano w WO96/07432, WO00/54802 i jednocześnie złożonego i tu załączonego zgłoszenia (międzynarodowe zgłoszenie patentowe złożone 29 listopada 2001 w imieniu Norwegian Radium Hospital Research Foundation zatytułowane „Metoda) lub czynnik światłouczulający można dodać najpierw, a następnie przeprowadzić etap naświetlania i potem dodawać nośnik wirusowy jak opisano w jednocześnie złożonym zgłoszeniu tu załączonym. W drugiej metodzie korzystnie naświetlanie przeprowadza się przed wychwyceniem przez komórki przenoszonej cząsteczki (tu nośnika wirusowego), szczególnie korzystnie przenoszoną cząsteczkę kontaktuje się z komórką po naświetlaniu, np. od 0 do 4 godzin po naświetlaniu. Alternatywnie, komórkę kontaktuje się z przenoszoną cząsteczką zasadniczo w tym samym czasie co naświetla.

Innymi słowy, etap naświetlania można przeprowadzać przed wychwyceniem przez komórki nośnika wirusowego do dowolnego wewnątrzkomórkowego przedziału lub po tym wychwyceniu, pod warunkiem, że czynnik światłouczulający jak zostanie wychwycony do przedziałów wewnątrzkomórkowych przed naświetlaniem. Jeżeli zarówno czynnik światłouczulający jak i nośnik wirusowy zostaną wychwycone do przedziałów wewnątrzkomórkowych komórki w czasie ekspozycji na światło, to nośnik wirusowy i czynnik światłouczulający mogą być rozmieszczone w tych samych lub innych przedziałach wewnątrzkomórkowych w momencie ekspozycji na światło. Dalsze szczegóły określania czasu dodawania różnych składników do komórek omówione są powyżej w dokumentach należących do stanu techniki WO96/07432 i WO00/54802 lub w tu załączonym, złożonym równocześnie zgłoszeniu, które są źródłem referencyjnym dla niniejszego zgłoszenia.

W każdym przypadku, ramy czasowe, w których nośnik wirusowy można wprowadzić w kontakt z komórkami i będzie on ciągle wychwytywany i internalizowany przez komórki, może zależeć od różnych czynników, takich jak na przykład rodzaj komórek, konkretny zastosowany nośnik, konkretny zastosowany czynnik światłouczulający i czas traktowania światłem. Jeżeli to konieczne, ramy czasoPL 213 376 B1 we mogą być ustalone dla konkretnego zestawu warunków i ich ustalenie będzie leżało w zakresie kompetencji specjalisty.

Czas podania nośnika wirusowego będzie zależał od tego czy stosuje się sposoby in vitro czy in vivo. W metodach in vitro nośnik wirusowy można na ogół wprowadzić w kontakt ze wszystkimi komórkami docelowymi równocześnie, tj. czas podania jest identyczny z czasem kontaktu, np. jeśli komórki rosną w hodowli in vitro, to wówczas stosunkowo łatwo jest wprowadzić nośnik w kontakt z komórkami w odpowiednim momencie. Jednak in vivo, w sposobach nie stanowią cych przedmiot wynalazku, kontakt komórek docelowych z nośnikiem wirusowym jest oczywiście bardziej skomplikowany i zależeć będzie od sposobu podania, rodzaju nośnika wirusowego i położenia komórek docelowych. Na przykład, jeśli nośniki wirusowe mogą być podane bezpośrednio do komórek docelowych, np. przez iniekcję, wówczas wejdą w kontakt z komórkami docelowymi (lub przynajmniej ich częścią) stosunkowo szybko, np. po upływie minut lub godzin po podaniu.

Jednak, jeśli nośniki wirusowe podaje się w iniekcji dożylnej dla osiągnięcia odległego celu, wówczas wejście ich w kontakt z komórkami docelowymi może zająć dłuższy czas. Na przykład, osiągnięcie komórek docelowych może zająć 24 do 96 godzin od podania. Ten „czas podróży musi być brany pod uwagę przy wyborze odpowiedniego czasu podania nośnika wirusowego w odniesieniu do czasu podania czynnika światłouczulającego i czasu naświetlania. Te same rozważania dotyczą także czasu podawania czynnika światłouczulającego. Jednak inaczej niż w przypadku przenoszonej cząsteczki, istotne jest by ten czynnik podano dostatecznie wcześnie przed naświetlaniem tak, aby w momencie naświetlania był on już wychwycony do wewnątrzkomórkowego przedziału. Zatem korzystnie podaje się wymieniony czynnik 1 do 72 godzin przed naświetlaniem, np. 4 do 72, tak jak 4 do 48 lub 4 do 24 godzin przed naświetlaniem. Szczególnie korzystnie w sposobie według wynalazku czynnik światłouczulający kontaktuje się z komórką 4 do 24 godzin przed naświetlaniem Znowu, jak omówiono powyżej w związku z etapem wprowadzania w kontakt z komórkami nośników wirusowych (i w konsekwencji przenoszonych cząsteczek), określenie czasu podania czynnika światłouczulającego, w odniesieniu do momentu naświetlania, będzie zależało od czasu potrzebnego na osiągnięcie przez czynnik światłouczulający komórek docelowych i jego przez nie wychwycenie. Ten czas może zmieniać się zależnie od tego czy sposoby są stosowane in vitro, czy in vivo i od tego czy podanie następuje bezpośrednio do tkanki docelowej, czy też celem jest miejsce odległe. W każdym przypadku istotne jest, aby czynnik światłouczulający został wychwycony przez komórki docelowe przed naświetlaniem. Czynnik ten może być w kontakcie z komórkami tuż przed naświetlaniem, np. przez 1 lub 4 do 72 godzin, korzystnie 4 do 24 godzin, np. 12 do 20 godzin przed naś wietlaniem lub kontakt moż e zostać przerwany tuż przed naświetlaniem, np. może pozostawać dłużej niż 5 minut, np. 10 minut do 8 godzin, np. 1 do 4 lub 6 godzin w podłożu wolnym od czynnika i/lub zawierającym przenoszoną cząsteczkę.

Zatem, pomimo że sytuacja in vivo jest bardziej skomplikowana niż in vitro, czas podawania musi być taki, że nim nastąpi naświetlanie, odpowiednia ilość czynnika światłouczulającego zostanie skontaktowana i wychwycona przez komórki docelowe, i albo (i) przed lub podczas naświetlania przenoszona cząsteczka (i jej wirusowy nośnik) będzie równocześnie wychwycona przez komórki lub będzie wychwycona po wystarczająco długim kontakcie z komórkami docelowymi, do tych samych lub innych przedziałów wewnątrzkomórkowych co czynnik światłouczulający albo (ii) po naświetlaniu przenoszona cząsteczka i związany z nią nośnik wirusowy będą w kontakcie z komórkami przez wystarczająco długi czas, aby zostać wychwycone przez te komórki.

Ewentualnie czynnik światłouczulający może być przyłączony do, związany z lub sprzężony z jedną lub więcej cząsteczką nośnikową, cząsteczką kierującą lub wektorem kierującym, które mogą ułatwiać lub zwiększać wychwyt czynnika światłouczulającego lub mogą kierować lub dostarczać te jednostki do konkretnego rodzaju komórki, tkanki lub przedziału wewnątrzkomórkowego. Przykłady układów nośnikowych obejmują polilizynę (np. poli-L-lizynę lub poli-D-lizynę), polietylenoiminę lub dendrymery (np. kationowe dendrymery takie jak SuperFect^®) lub inne polikationy, siarczan dekstranu, różne lipidy kationowe, takie jak DOTAP lub lipofektynę lub kationowe lipidy wytwarzane w oparciu o „lipidy pomocnicze takie jak DOPE, liposomy, zrekonstruowane cz ą steczki LDL, przestrzennie stabilizowane liposomy lub inne cząstki pochodzące z układów wirusowych, takich jak na przykład adenowirus, lentiwirusy i inne retrowirusy, wirus związany z adenowirusem, bakteriofagi itd. Te układy nośnikowe mogą na ogół poprawić farmakokinetykę i zwiększyć wychwyt komórkowy czynnika światłouczulającego i mogą również skierować czynnik światłouczulający do wewnątrzkomórkowych przedziałów, które są szczególnie korzystne dla uzyskania fotochemicznej internalizacji, ale na ogół nie

PL 213 376 B1 mają zdolności do kierowania czynnika światłouczulającego do konkretnych komórek (np. komórek raka) lub tkanek.

Nośnik wirusowy może również być przyłączony do, związany z lub sprzężony z jedną lub więcej cząsteczkami nośnikowymi, cząsteczkami kierującymi lub kierującymi wektorami. Alternatywnie, pewne powierzchniowe modyfikacje cząstek nośnika wirusowego mogą być korzystne do zastosowania w niniejszym wynalazku. Potencjalnymi korzyściami wynikającymi z zastosowania takich nośników i/lub powierzchniowych modyfikacji są: (i) poprawa farmakokinetyki i biodystrybucji wektora wirusowego, zwykle poprzez wydłużenie okresu, w którym znajduje się on w krążeniu; (ii) maskowanie zdolności wirusa do wiązania się z właściwym mu receptorem, umożliwiające jego ponowne skierowanie do innych receptorów (i w ten sposób do tkanek, które normalnie nie są przez tego wirusa zakażane); (iii) dostarczanie dodatniego ładunku powierzchniowego na wektorze wirusowym tak, że jest on w stanie wiązać i zakażać większy zakres komórek niż wynikałoby to z jego naturalnego mechanizmu zakażania; (iv) „ukrycie wirusa przed układem odpornościowym.

Korzystnie nośnik wirusowy jest przyłączony do, związany z lub sprzężony z cząsteczką nośnikową i korzystnie obejmuje polikationy (np. polilizynę lub SuperFect^®) lub lipidy kationowe.

Przykładami nośników, które mogą być zastosowane w ten sposób, są polikationy (Lanuti M. i in. (1999), Gene. Ther. 6, 1600-1610; Arcasoy S.M. i in. (1997), Gene Ther. 4, 32-8; Dodds E. i in. (1999), J. Neurochem. 72, 2105-2122) i lipidy kationowe (Clark P.R. i in. (1999) Cancer Gene Ther. 6, 437-446). Przykładami powierzchniowych modyfikacji, które mogą być zastosowane w ten sposób, są: glikol polietylenowy (Croyle M.A. i in. (2000) Hum. Gene Ther. 11, 1713-1722) i polimery oparte na poli-[N-(2-hydroksypropylo)metakrylamidzie] (Seymour, L. i in. (2000) J. Gene Med. Suppl. do Vol 2(5), str. 52).

W celu uzyskania specyficzności i wybiórczości w naprowadzaniu cząsteczek nośnika wirusowego (i w konsekwencji przenoszonej cząsteczki) i/lub czynnika światłouczulającego do konkretnego rodzaju komórek lub tkanek, te jednostki mogą być związane lub sprzężone ze specyficzną cząsteczką kierującą, która będzie promować specyficzny wychwyt komórkowy przenoszonej cząsteczki do pożądanych komórek lub tkanek. Takie cząsteczki kierujące mogą również kierować przenoszoną cząsteczkę i/lub czynnik światłouczulający do przedziałów wewnątrzkomórkowych, co jest szczególnie korzystne dla uzyskania fotochemicznej internalizacji.

Można zastosować wiele różnych cząsteczek kierujących, np. jak opisano w publikacjach Curiel, D.T. (1999), Ann. New I York Acad. Sci. 886, 158-171; Bilbao, G. i in. (1998), w Gene Therapy of Cancer (Walden i in., wyd., Plenum Press, New York), Peng K.W. i Russell S.J. (1999), Curr. Opin. Biotechnol. 10, 454-457, Wickham T.J. (2000), Gene Ther. 7, 110-114.

Dodatkowo, należy zauważyć, że można dobierać czynniki światłouczulające, które są właściwe dla sposobów według niniejszego wynalazku, a znane są z tego, że mają samoistną skłonność do umieszczania się w korzystnych lokalizacjach w pewnych miejscach tkankowych, i wówczas nie muszą być przyłączane do specyficznych nośników. Przykładowo, pewne czynniki światłouczulające, takie jak pochodne hematoporfiryny, są znane z tego, że umieszczają się preferencyjnie lub wybiórczo w tkankach guza lub innych zmianach. Kilka innych przykł adów opisano w publikacji Boyle i Dolphin (Photochem. Photobiol. 64: 469-485 (1996)). Takie preferencyjne lokalizacje mogą być włączone do sposobów według niniejszego wynalazku.

Cząsteczka kierująca może być przyłączona do, związana lub sprzężona z nośnikiem wirusowym, z czynnikiem światłouczulającym, lub z każdym z nich oraz można stosować ten sam lub różny nośnik lub cząsteczkę kierującą.

Takie cząsteczki lub nośniki kierujące, jak opisane powyżej, mogą być również zastosowane do kierowania nośnika wirusowego lub czynnika światłouczulającego do konkretnych przedziałów wewnątrzkomórkowych, które są szczególnie korzystne dla zastosowania PCI, np. Iizosomy i endosomy.

Uważa się, że przenoszona cząsteczka pozostaje początkowo w połączeniu z nośnikiem wirusowym w cytozolu komórki do czasu rozpoczęcia naświetlania, które uwolni przenoszone cząstki z przedziałów wewnątrzkomórkowych. Od momentu, gdy przenoszone cząstki uległy internalizacji do cytozolu komórek, występujące zjawiska zależą od wybranego układu nośnika wirusowego. Przykładowo, w przypadku adenowirusa, cząstki adenowirusa (połączone z przenoszoną cząsteczką) zwykle migrują w kierunku jądra, po czym wirusowe DNA (i w konsekwencji cząsteczka przenoszonego kwasu nukleinowego) wchodzi do jądra komórki. W każdym przypadku, w którym przenoszona cząsteczka kwasu nukleinowego jest wbudowana w cząstkę lub nośnik wirusowy, w następstwie fotochemicznej internalizacji i możliwych dalszych zjawisk zależnych od nośnika wirusowego, cząsteczka kwasu nuPL 213 376 B1 kleinowego powinna znajdować się w prawidłowym położeniu wewnątrzkomórkowym, tak aby mogły zachodzić odpowiednie procesy komórkowe, które umożliwiają ujawnienie pożądanych funkcji wprowadzonej przenoszonej cząsteczki. Przykładowo, jeśli przenoszona cząsteczka koduje żądane białko, potrzebne są etapy obróbki prowadzące do ekspresji tego pożądanego białka. Jeśli przenoszona cząsteczka jest cząsteczką DNA kodującą antysensowne RNA, wówczas potrzebne są etapy obróbki prowadzące do transkrypcji RNA na bazie DNA.

Etap naświetlania w celu aktywacji czynnika światłouczulającego, może mieć miejsce zgodnie z zasadami i procedurami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Przyk ł adowo, dł ugość fali i natężenie ś wiatła można wybrać według zastosowanego czynnika światłouczulającego, z korzystnym poziomem dawek od 40 do 200 J/cm², np. 100 J/cm² i długością fali 300-800 nm, np. 500-700 nm. Odpowiednie źródła światła są dobrze znane w tej dziedzinie. Czas, w którym komórki są poddawane działaniu światła i stosowane dawki światła, zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku, mogą być różne. Ogólnie, odpowiednie okresy naświetlania i dawki mogą być dobrane przez specjalistę, tak by umożliwiały rozerwanie przedziałów wewnątrzkomórkowych zawierających czynnik światłouczulający i nast ę pnie wychwyt i/lub uwalnianie przenoszonych czą stek do cytozolu. Skuteczność internalizacji przenoszonej cząstki do cytozolu wydaje się zwiększać wraz z wydłużeniem okresu naświetlania. Korzystna długość okresu naświetlania zależy od czynnika światłouczulającego, ilości czynnika światłouczulającego zgromadzonej w komórkach lub tkankach docelowych i nakładania się widma absorpcyjnego czynnika światłouczulającego i widma emisyjnego źródła światła. Na ogół okres trwania etapu naświetlania mieści się w zakresie od kilku minut do kilku godzin, np. korzystnie do 60 minut np. od 0,5 lub 1 do 30 minut, na przykład do 10 lub 15 minut, np. od 0,5 do 3 minut lub od 3 do 10 minut i korzystnie okoł o 7 minut, np. 6 do 8 minut. Szczególnie korzystnie etap naś wietlania trwa 1 do 10 minut. Odpowiednie dawki światła mogą być dobrane przez specjalistę i znów będą zależeć od czynnika światłouczulającego, ilości czynnika światłouczulającego zgromadzonej w komórkach lub tkankach docelowych. Przykładowo, dawki światła zwykle stosowane w terapii fotodynamicznej raków z zastosowaniem czynnika światłouczulającego Photofiryn i prekursora protoporfiryny kwasu 5-aminolewulinowego, mieszczą się w zakresie 50-150 J/cm² z fluencją dawki mniejszą niż 200 mW//cm², aby nie dopuścić do hipertermii. Dawki światła są zwykle niższe, gdy stosuje się czynnik światłouczulający z wysokim współczynnikiem ekstyncji w zakresie fal czerwonych widma widzialnego. Jednak, do leczenia tkanek nienowotworowych z mniejszą ilością zgromadzonego czynnika światłouczulającego całkowita konieczna dawka światła może być zasadniczo wyższa niż w leczeniu raków.

Sposoby według wynalazku z pewnością spowodują w jakimś stopniu zabicie komórek przez fotochemiczne traktowanie tj. poprzez działanie czynnika światłouczulającego. Jednak śmierć komórkowa nie jest problemem, a może być istotną zaletą w wielu zastosowaniach, np. leczeniu raka i może nasilać w pewnych przypadkach skutek leczniczy poprzez stymulacje odporności miejscowej. Jednak, sposoby według wynalazku mogą być tak modyfikowane, żeby ułamek lub stosunek komórek przeżywających podlegał regulacji przez zmianę dawki światła w odniesieniu do stężenia czynnika światłouczulającego. Takie techniki są znane w tej dziedzinie. Bez względu na liczbę śmierci komórkowych spowodowanych przez czyste fotochemiczne traktowanie, ważne jest takie regulowanie dawki światła, aby część samodzielnych komórek, w których manifestuje się skutek PCI, nie ginęła pod wpływem czystego fotochemicznego traktowania (chociaż mogą one zginąć w konsekwencji skutków PCI).

W niektórych zastosowaniach moż e być wł a ś ciwe utrzymanie przy ż yciu po traktowaniu PCI większej liczby żywotnych komórek. Przykładowo, w niektórych sposobach terapii genowej jest istotna liczba żywotnych komórek, które mogą wykazywać ekspresję białka kodowanego przez przenoszoną cząsteczkę kwasu nukleinowego. W takich zastosowaniach właściwe jest żeby przeżyła cała populacja lub większość, lub znacząca większość komórek (np. co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 60, 70, 80 lub 90% komórek). W korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku przynajmniej 50% komórek, do których wprowadza się cząsteczkę, nie ulega uśmierceniu. Nie jest to oczywiście zawsze pożądane, zwłaszcza wtedy gdy PCI stosuje się do wprowadzenia cytotoksycznych, przenoszonych cząsteczek i wtedy dalsze zabijanie komórek nie jest wadą. Skutki cytotoksyczne można również jednak, osiągnąć przez zastosowanie, na przykład, terapii genowej, w której leczniczy gen ulega internalizacji do komórek guza za pomocą sposobu według wynalazku np. tak, że te komórki będą produkowały immunologicznie aktywne substancje, które wzbudzą miejscowe, odpornościowe zabijanie pozostałych komórek raka lub wzbudzą ogólną odpowiedź odpornościową przeciwko komórkom guza. W takich przypadkach, po traktowaniu PCI jest konieczna pewna ilość żywych komórek.

PL 213 376 B1

Zalety związane z internalizacją przenoszonej cząsteczki przy zastosowaniu sposobów PCI w połączeniu z nośnikami wirusowymi to: 1) brak ograniczeń co do rozmiaru cząsteczki, która ma być wprowadzona do komórki, o ile ta cząsteczka może być wbudowana do wirusowego nośnika i jej nośnik wirusowy będzie mógł być wychwycony przez komórkę docelową; 2) sposoby są miejscowo specyficzne tak, że podlegają im tylko obszary naświetlane; 3) internalizacja nośników wirusowych jest bardziej skuteczna niż w standardowych zakażeniach wirusowych, w zakresie ilości komórek, do których przenoszoną cząsteczkę wprowadzono i/lub poziomu ekspresji przenoszonej cząsteczki; 4) wymagane są niższe dawki i miana wirusa, z powodu większej wydajności internalizacji; 5) metody te nie powodują indukcji nowotworu.

Realizacje, w których przenoszoną cząsteczkę (i jej nośnik wirusowy) dodaje się do komórek po naświetlaniu mają dodatkowe zalety takie jak

a) zmniejszenie fotochemicznego uszkodzenia przenoszonej cząsteczki i jej nośnika wirusowego;

b) uproszczenie leczenia fotochemicznego zmian wewnętrznych w połączeniu z leczeniem chirurgicznym, ponieważ leczenie fotochemiczne można przeprowadzić po chirurgicznym odsłonięciu zmiany następnie np. wykonać iniekcję do guza lub zastosować inny miejscowy sposób podawania nośnika wirusowego (i związanej z nim przenoszonej cząsteczki);

c) sposoby te są mniej zależne od dokładnego wyznaczania czasów leczenia, tj. określenia momentu podania cząsteczki, która ma być wychwycona przez komórki w odniesieniu do momentu naświetlania. To oznacza większe „ramy czasowe dla leczenia. Jest to ważne, ponieważ wychwyt cząsteczki leczniczej może być różny zależnie od różnic w stanie klinicznym, a ponadto wychwyt dla konkretnej zmiany w konkretnej sytuacji klinicznej jest trudny do przewidzenia, z tego powodu uzyskanie większych ram czasowych jest bardzo korzystne;

d) zasadnicze zmniejszenie możliwości lizosomalnego rozkładu przenoszonej cząsteczki dzięki szybkiej translokacji przenoszonej cząsteczki do cytozolu.

Sposoby według niniejszego wynalazku można stosować do wprowadzania cząsteczek do komórek jako alternatywę do wcześniejszych technik fuzji liposomów, transfekcji fosforanem wapnia itd., jak to omówiono powyżej.

Rozwiązania według wynalazku można stosować do wprowadzania do komórek cząsteczek w celu przeprowadzenia terapii genowej.

Terapię genową można przeprowadzić na wiele sposobów, z których najbardziej właściwy może być wybrany przez specjalistę zależnie od patogenezy konkretnej choroby.

Jedno podejście obejmuje kierowane zabijanie konkretnych komórek. To podejście jest popularne w leczeniu raka i obejmuje geny kierowane do komórek docelowych i następnie ich ekspresję, w ten sposób powodując śmierć komórek. Takie zabijanie komórek może zachodzić poprzez bezpośredni mechanizm, np. jeśli wprowadzane geny kodują letalną toksynę lub prolek, który nadaje komórkom wrażliwość na zabijanie przez podany następnie lek. Alternatywnie, zabijanie komórek może być pośrednie, np. przez zastosowanie immunostymulujących genów w celu prowokowania lub nasilenia odpowiedzi odpornościowej wobec komórek docelowych lub przez zastosowanie genów, które kodują białko powodujące śmierć komórek przez interakcję z egzogennie podaną cząsteczką (np. gen kodujący enzym, który aktywuje prolek, taki jak HSV-tk, który aktywuje GCV). Odpowiednie geny samobójcze, geny kodujące proleki i geny immnostymulujące są dobrze znane i udokumentowane w stanie techniki.

Kolejne podejście obejmuje kierowane hamowanie ekspresji genów. Różne techniki specyficznego blokowania ekspresji genów na poziomie DNA, RNA lub białek są dobrze znane specjalistom i każda z nich może być zastosowana w połączeniu ze sposobami według niniejszego wynalazku, które można zastosować do wprowadzenia odpowiednich narzędzi molekularnych do zablokowania ekspresji genu wewnątrz komórki. W ten sposób, w korzystnym aspekcie wynalazku cząsteczka, którą wprowadza się, jest sekwencją DNA zawierającą lub zdolną do transkrypcji lub ekspresji funkcjonalnego produktu, który zahamuje ekspresję genu na jakimś poziomie w komórkach docelowych, np. przez zawarcie, ekspresję lub transkrypcję antysensownych cząsteczek, rybozymów lub wewnątrzkomórkowych przeciwciał.

Kolejne podejście obejmuje genowe wzmocnienie terapii, kiedy choroba jest spowodowana przez utratę funkcji genu i choroby można leczyć przez wprowadzanie dodatkowych kopii genu, naturalnie występującego w odpowiednich komórkach pacjenta. Zatem następną korzystną cechą wynalazku jest to, że cząsteczka, która ma być wprowadzona, jest genem lub jego częścią zdolną do ekspresji funkcjonalnego produktu w celu kompensacji niedoboru u pacjenta.

PL 213 376 B1

Jeszcze kolejnym podejściem jest naprawa za pomocą kierowanej mutacji, w której wprowadzanie kwasu nukleinowego do odpowiednich komórek pacjenta prowadzi do bezpośredniej naprawy mutacji w DNA pacjenta powodującej chorobę. Sposoby takiej naprawy są dobrze znane i opisane w tej dziedzinie.

W następstwie przenoszenia kwasów nukleinowych/genów do komórek zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku, wstawione geny/kwasy nukleinowe mogą wbudowywać się do chromosomów komórki gospodarza, lub pozostawać jako pozachromosomowe elementy genetyczne (tj. episomy resztkowe). Odpowiednie wektory można wybrać lub zaprojektować, aby wywołać każdą z tych moż liwoś ci.

Zaletą integracji wprowadzanego genu z chromosomem jest to, że gen może być powielany przy replikacji chromosomów poprzedzającej podział komórki. Ponieważ komórki potomne również zawierają wprowadzane geny, uzyskuje się utrwaloną ekspresję wprowadzanego genu. Rezultatem terapii genowej, w której stosuje się takie podejście jest dostarczenie możliwości leczenia pewnych chorób. Przykładowo, w tkankach składających się z aktywnie dzielących się komórek, celem może być nakierowanie komórek macierzystych (mniejszościowej populacji niezróżnicowanych komórek prekursorowych, które dają początek dojrzałym zróżnicowanym komórkom tkanki). Integracja z chromosomem ma jednak swoje dobrze opisane wady, które obejmują np. niebezpieczeństwo rozwoju raka przykładowo z powodu przypadkowej integracji, prowadzącej do aktywacji onkogenu.

Terapia genowa ex vivo, w której komórki docelowe pobiera się od pacjenta, poddaje się obróbce in vitro, a następnie ponownie wprowadza się do organizmu pacjenta, daje możliwość wybrania komórek, w których integracja była skuteczna. Przykładowo, przez amplifikację komórek in vitro można sprawdzić ich fenotyp dla wykazania oczywistej transformacji nowotworowej, przed przeniesieniem komórek z powrotem do organizmu pacjenta. Zatem, terapia ex vivo jest korzystna, gdy pożądana jest integracja z chromosomami.

Alternatywnie wektor zawierający przeznaczony do wprowadzenia gen/kwas nukleinowy może zostać tak zaprojektowany, żeby wprowadzane do komórki geny pozostały jako elementy pozachrosomalne i mogły ulec ekspresji na wysokim poziomie. W przypadku komórek intensywnie dzielących się, wprowadzony gen może nie rozmieszczać się równomiernie w komórkach potomnych i z tego powodu długotrwała ekspresja może stanowić problem. W następstwie tego, może zaistnieć konieczność powtarzania leczenia obejmującego przenoszenie genów, aby uzyskać skutek leczniczy w zaburzeniu genetycznym. Możliwość powtarzania tego typu leczenia zwiększa się dzięki niniejszym sposobom przenoszenia, opartym na PCI, które pozwalają uzyskać większą skuteczność kierowanego przenoszenia genów (patrz poniżej). Ponadto, w niektórych przypadkach utrwalona długoterminowa ekspresja nie jest konieczna. Przykładowo, terapie genowe raka często obejmują przenoszenie i ekspresję genów w komórkach raka, przeprowadzane z zamiarem zabicia komórek. W takich sposobach, gdy złośliwość zostanie usunięta, gen leczniczy prawdopodobnie nie jest potrzebny.

Jak wspomniano powyżej, odpowiednimi do zastosowania według niniejszego wynalazku układami wirusowymi są adenowirusy. Jednakże nie można wykluczyć zastosowania innych układów takich jak, wirusy związane z adenowirusem, retrowirusy, lentiwirusy, wirusy Herpes, wirus Sendai, bakteriofagi, wirus Vaccinia i Baculovirus.

Korzystną cechą retrowirusów jest zdolność do integracji z chromosomowym DNA, ale zakażają one tylko aktywnie dzielące się komórki. Zintegrowany DNA może być ciągle powielany, dając możliwość trwałego wyleczenia choroby. Ich zdolność do zakażania wyłącznie aktywnie dzielących się komórek jakkolwiek niekorzystna do leczenia wielu chorób, jednak jest korzystna do terapii genowej raków w tkankach normalnie nie zawierających dzielących się komórek, ponieważ aktywnie dzielące się komórki raka będą zakażane wybiórczo i niszczone bez wielkiego ryzyka dla niedzielących się komórek zdrowej tkanki.

Wirusy związane z adenowirusem wymagają współinfekcji z wirusem pomocniczym takim jak adenowirus lub HSV dla skutecznego zakażenia, tj. zakażenia, w rezultacie którego wytwarzane są wiriony potomne. Jednak, przy braku wirusa pomocniczego nadal może zajść integracja DNA z chromosomem. Zatem, można wybrać odpowiedni typ wektora wirusowego związanego z adenowirusem, zależnie od przewidywanego zastosowania.

Z drugiej strony, adenowirusy mogą zakaż ać takż e niedzielą ce się komórki. Wejś cie do komórki następuje w drodze endocytozy za pośrednictwem receptora, ale aczkolwiek wstawiony kwas nukleinowy migruje do jądra, nie stwierdza się jego integracji, tak więc ekspresja wstawionych genów może być podtrzymywana tylko przez krótki okres. Wektory adenowirusowe można wytwarzać w bardzo

PL 213 376 B1 wysokich mianach i typowo dopuszczalny rozmiar wstawki wynosi do 7-8 kilozasad, ale ostatnie osiągnięcia w rozwoju technologii wektora adenowirusowego pozwalają zastosować wstawki o wymiarach do około 30 kilozasad, do specjalnie zaprojektowanych wektorów wirusowych (Kochanek (1999),

Hum. Gene Ther. 10, 2451-2459).

Ze względu na ich zdolność do zakażania wielu różnych rodzajów komórek, adenowirusy znalazły szerokie zastosowania i są popularnymi wektorami stosowanymi w strategiach terapii genowej in vivo. Istotnie, adenowirusy są korzystnymi nośnikami wirusowymi do zastosowania w sposobach według niniejszego wynalazku.

Jednak, jakkolwiek adenowirusy są jednymi z najskuteczniejszych wektorów wirusowych w dostarczaniu genów in vivo, to ich zastosowanie komplikuje kilka poważnych problemów, np. odpowiedź odpornościowa na wirusa, przemijająca ekspresja genu i złe rozmieszczenie w tkankach prowadzące do mało skutecznej transdukcji w tkankach docelowych. Również trudna jest do ograniczenia do komórek docelowych ekspresja dostarczonych przez adenowirusa genów leczniczych, a może to być bardzo ważne przy zapobieganiu działaniom ubocznym, na przykład wynikającym z ekspresji toksycznego produktu genu (np. przeznaczonego do zabijania komórek rakowych) w normalnych komórkach organizmu, np. w życiowo ważnych narządach takich jak wątroba. Inne nośniki wirusowe stosowane w terapii genowej mają podobne wady.

Zastosowanie fotochemicznej internalizacji w połączeniu ze sposobami według niniejszego wynalazku, może poprawić kilka z tych problemów. Po pierwsze, zastosowanie PCI może zasadniczo zwiększyć poziom i zakres ekspresji przenoszonego genu w tkankach docelowych (tj. może prowadzić do wyższych poziomów ekspresji przenoszonego genu w większej ilości komórek). Dodatkowo wykazano, że PCI zwiększa skuteczność zakażenia wirusowego tak, że znacząco mniejsze dawki wirusa są potrzebne do spowodowania takiej ilości transdukcji genów, jak obserwowana bez zastosowania PCI. Ta skuteczność PCI w zwiększaniu zakaźności wirusa, przy niskich wartościach współczynnika zakażania (MOI), powinna umożliwić transdukcję wirusową w obszarze tkanek, które są słabo penetrowane przez wirusa, w ten sposób umożliwiając transdukcję w obszarach, do których dociera zbyt mało cząstek wirusów aby mogły być skutecznie transdukowane za pomocą konwencjonalnego zakażenia. Jest to znacząca poprawa technologii zakażenia wirusowego, ponieważ oczekuje się, że przy podaniu miejscowym stężenie wirusa w tkankach będzie spadać gwałtownie, wraz ze wzrostem odległości od miejsca podania.

Kolejną zaletą zwiększenia skuteczności zakażenia wirusowego wywołanego przez PCI jest to, że nie tracąc na skuteczności transdukcji można stosować niższe dawki wirusa i w ten sposób zredukować problemy immunologiczne związane z adenowirusem lub innym wirusem służącym do terapii genowej. Ostatecznie, traktowanie fotochemiczne można zastosować do zwiększenia specyficzności zakażenia komórek docelowych. Jest to po pierwsze możliwe dlatego, że tylko obszary naświetlane poddawane są PCI i po drugie, ponieważ niektóre czynniki światłouczulające naturalnie gromadzą się w sposób preferencyjny w okolicach zmienionych chorobowo.

Możliwość skierowania aktywności leczniczego genu bezpośrednio do chorej okolicy, po prostu przez jej naświetlenie, jest bardzo korzystnym aspektem niniejszego wynalazku, który powinien znacznie zwiększyć możliwości unikania skutków ubocznych związanych z ekspresją leczniczych genów w „złych miejscach w organizmie. Możliwość stosowania za pomocą PCI mniejszych dawek genowego czynnika terapeutycznego również bierze udział w zmniejszeniu efektów ubocznych. Oczekuje się, że uzyskiwana specyficzność uczyni możliwym podawanie ogólnoustrojowe adenowirusów i innych nośników wirusowych. Ponadto, jak przedstawiono powyżej PCI moż na również łączyć z wektorami kierującymi, co potencjalnie może dodatkowo zwiększyć specyficzność dostarczania genu.

Jak omawiano w poprzednich zastosowaniach PCI, uważa się, że zjawisko nasilenia przez PCI transfekcji kompleksów plazmid/polilizyna i zjawisko zwiększenia dostarczania innych cząsteczek takich jak białka, są związane z wywołanym przez światło rozrywaniem pęcherzyków endocytarnych i nie wiążąc się ż adną teorią , wydaje się uzasadnione, ż e taki sam mechanizm jest odpowiedzialny za stymulację transdukcji genu za pośrednictwem adenowirusa. Jednak, w przeciwieństwie do kompleksów plazmid/polilizyna i innych cząsteczek takich jak białka, ucieczka adenowirusa z endosomów wydaje się być procesem wydajnym, w którym, jak donoszono ponad 40% cząstek wirusa, które związały się z komórkami, osiąga jądro (Greber, U.F. i in. (1993), Cell 75, 477-486; Leopold, P.L. i in. (1998), Hum. Gene Ther. 9, 367-378). Zatem, na podstawie tego co opisano w literaturze można było oczekiwać, że PCI mogłoby, co najwyżej zwiększyć wydajność transdukcji genu za pomocą adenowirusa co najwyżej 2,5 raza, jeśli PCI byłoby zdolne do wywołania transportu do jądra komórki wszystPL 213 376 B1 kich związanych z komórką cząstek wirusa. Z tego powodu całkowicie zaskakujące było, że obserwowano, wzbudzone przez PCI, ponad 20-krotne zwiększenie transdukcji genu i obecnie nie istnieje żadne dobre wytłumaczenie tak nieoczekiwanie dużego efektu. Jedną z możliwości jest to, że cząstki wirusowe poddane PCI mogą mieć wyższą „naturalną wydajność transdukcji niż wirusy podczas normalnego zakażenia, np. dzięki innemu mechanizmowi uwalniania z endosomów. Jest również możliwe, że uwalnianie adenowirusów z endosomów w przypadku zwykłego zakażenia jest mniej wydajne przy niskim MOI, a PCI jest w tych warunkach najskuteczniejsze. Jest również możliwe, że fotochemiczne traktowanie ma wpływ na inne procesy takie jak wychwyt wirusa, transport do jądra lub transkrypcja transgenu.

W kolejnym aspekcie wynalazek niniejszy dostarcza kompozycji farmaceutycznej zawierającej przenoszoną cząsteczkę w połączeniu z nośnikiem wirusowym i czynnik światłouczulający, jak określono powyżej, przy czym przenoszoną cząsteczką jest cząsteczka kwasu nukleinowego, a nośnikiem wirusowym adenowirus. Ewentualnie czynnik światłouczulający w kompozycji może być również związany z cząsteczką nośnika wirusowego lub inną, niewirusową cząsteczką nośnikową, jak te opisane powyżej. Korzystnie nośnik wirusowy jest sam, związany z lub przyłączony do lub sprzężony z jedną lub więcej cząsteczkami nośnikowymi (korzystnie polikationami lub lipidami kationowymi), cząsteczkami kierującymi lub wektorami kierującymi. Ewentualnie zarówno nośnik wirusowy, jak i czynnik światłouczulający lub jeden z nich mogą być związane z taką samą lub inną cząsteczką kierującą, jak opisano powyżej. Korzystnie kompozycję stosuje się w terapii genowej. Stany, choroby i zakażenia, które szczególnie nadają się do terapii genowej obejmują nowotwory złośliwe np. rak podstawnokomórkowy, dysplazja lub inne rozrosty, reumatoidalne zapalenie stawów, miażdżycę, zakażenia wirusowe i inne, łuszczycę, rogowacenie słoneczne, gojenie ran, zrastanie złamań, brodawki i wrodzone zaburzenia genetyczne takie jak mukowiscydoza, zespół Gorlin'a, ataksja teleangiektazja i zaburzenia metaboliczne.

Korzystne geny do zastosowania jako przenoszone cząsteczki w sposobie według wynalazku są genami kodującymi proleki aktywujące enzymy, takie jak kinaza tymidynowa Herpes Simplex lub deaminaza cytozynowa; toksyny białkowe takie jak toksyna błonicza lub gelonina; białka indukujące apoptozę takie jak p53 lub apoptotyna; czynniki immunostymulujące takie jak interleukina (IL-2, IL-12, korzystnie IL-18), czynnik martwicy nowotworu α, chemokiny, antygeny właściwe dla guza takie jak zmutowane białka ras lub Mart-1; czynniki o właściwościach immunosupresyjnych/przeciwzapalnych, takie jak interleukina-10, antagonista receptora dla IL-1 lub rozpuszczalny receptor TNF; czynniki hamujące angiogenezę, takie jak endostatyna; białka pobudzające tworzenie naczyń, takie jak naczyniowy czynnik wzrostu śródbłonka, białka rozpoczynające kaskadę krzepnięcia takie jak czynnik tkankowy; wewnątrzkomórkowe przeciwciała; rekombinowane toksyny odpornościowe, rybozymy lub cząsteczki antysensownego RNA itd.

W kolejnym aspekcie wynalazek niniejszy dostarcza zastosowania przenoszonych cząsteczek w połączeniu z nośnikiem wirusowym i czynnikiem światłouczulającym, jak tu opisano, do wytwarzania leku do zastosowania w leczeniu, korzystnie do terapii genowej, przy czym nośnikiem wirusowym jest adenowirus, a przenoszoną cząsteczką cząsteczka kwasu nukleinowego. Ponadto lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest stosowany w sposobie, w którym przenoszona cząsteczka jest wprowadzana do komórki, a sposób obejmuje kontaktowanie komórki z czynnikiem światłouczulającym, kontaktowanie komórki z przenoszoną cząsteczką, która jest związana z nośnikiem wirusowym i naświetlanie komórki światłem o długości fali odpowiedniej do aktywacji czynnika światłouczulającego. Do tego zastosowania czynnik światłouczulający i związaną z wirusem, przenoszoną cząsteczkę kontaktuje się z komórkami lub tkankami pacjenta albo razem, albo osobno poprzez dobór odpowiedniego czasu podania i wymienione komórki naświetla się w sposób opisany powyżej, światłem o długości fali właściwym by aktywować czynnik światłouczulający.

Niniejszym opisano także sposoby leczenia i korzystne sposoby terapii genowej obejmujące sposoby według wynalazku.

Zatem, ujawniono niniejszym sposoby leczenia lub zapobiegania chorobie, zaburzeniu lub zakażeniu u pacjenta, za pomocą terapii genowej, obejmujące wprowadzenie przenoszonej cząsteczki do jednej lub więcej komórek in vitro, in vivo lub ex vivo, zgodnie ze sposobem opisanym tu uprzednio i w którym konieczne jest (tj. gdy transfekcję przeprowadza się in vitro lub ex vivo) podanie wymienionych komórek pacjentowi.

PL 213 376 B1

Jak tu zdefiniowano „leczenie odnosi się do redukcji, złagodzenia lub eliminacji jednego lub więcej objawów choroby, zaburzenia lub zakażenia, które są leczone, w odniesieniu do objawów występujących przed leczeniem.

„Zapobieganie odnosi się do opóźniania lub zapobiegania momentowi pojawienia się objawów choroby, zaburzenia, lub infekcji.

Opisane niniejszym kompozycje mogą również zawierać komórkę lub populację komórek zawierających przenoszoną cząsteczkę, którą wprowadzono do tych komórek za pomocą sposobów według wynalazku, korzystnie do leczenia, szczególnie do terapii genowej.

Niniejszym opisano komórki lub populacje komórek zawierające przenoszoną cząsteczkę, która została wprowadzona do tych komórek, które to komórki można uzyskać sposobami według niniejszego wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przenoszonej cząsteczki i czynnika światłouczulającego do wytwarzania leku zawierającego komórkę wytworzoną sposobem według wynalazku do leczenia lub zapobiegania chorobie, zaburzeniu lub zakażeniu.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie pacjenta, przez podawanie pacjentowi komórek otrzymanych sposobem według wynalazku lub kompozycji według niniejszego wynalazku. Korzystnie te sposoby stosuje się do terapii genowej, tj. sposób obejmujący etap wprowadzania cząsteczki do komórki jak uprzednio opisano i podawania w ten sposób przygotowanych komórek pacjentowi.

In vivo można zastosować każdy zwykły lub standardowy sposób podawania nośnika wirusowego, czynnika światłouczulającego, komórek zawierających przenoszone cząsteczki, kompozycji itp. znany w tej dziedzinie, np.: iniekcję domięśniową, podskórną, dootrzewnową, doguzową lub dożylną, infuzję, inhalację lub podawanie zewnętrzne, zarówno na powierzchnie ciała zewnętrzne jak i wewnętrzne itp. Do zastosowania in vivo, rozwiązania tu ujawnione można stosować w odniesieniu do dowolnej tkanki, która zawiera komórki, w których rozmieszczą się nośnik wirusowy i czynnik światłouczulający, włączając w to płyny ustrojowe jak i tkanki stałe. Wszystkie tkanki mogą być leczone, o ile komórki docelowe wychwytują czynnik światłouczulający i można odpowiednio je naświetlić. Jeśli chodzi o możliwości naświetlania, oczywiste jest, że nie ma problemu z powierzchniami zewnętrznymi ciała ludzkiego lub zwierzęcego. Dla powierzchni wewnętrznych można zastosować takie techniki skutecznego naświetlania jak np. układy włókien światłowodowych. Ponadto leczenie można przeprowadzić w połączeniu z zabiegiem operacyjnym, który odsłoni okolice, które muszą być poddane leczeniu.

Zatem, kompozycja według wynalazku może być wytworzona dowolnym korzystnym sposobem zgodnie z technikami i procedurami znanymi w dziedzinie farmacji, np. z zastosowaniem jednego lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników lub zaróbek (tj. zgodnie z innymi składnikami kompozycji, jak i fizjologiczną dopuszczalnością dla pacjenta). Rodzaj kompozycji i nośniki lub materiały na zaróbkę, dawkowanie itd. można wybrać w rutynowy sposób zgodnie z pożądaną drogą podawania, celem leczenia itd. Kompozycja według wynalazku może zawierać także inne odpowiednie składniki. Przykładowo, do niektórych zastosowań leczniczych i dróg podawania korzystne może być zastosowanie na przykład czynników, które mogą zwiększyć penetrację nośnika wirusowego do tkanek, np. proteaz (Kuriyama, N. i in., 2000, Hum. Gene Ther. 11:2219-2230).

Kompozycje mogą być podawane miejscowo (np. dojelitowo, policzkowo, podjęzykowo, do okolicy dziąseł, okolicy podniebienia, nosowo, płucnie, dopochwowo, doodbytniczo lub do okolicy oczodołu), doustnie lub pozajelitowo. Kompozycje do stosowania miejscowego są korzystne i obejmują żele, kremy, maści, spraye, płyny, balsamy, sztyfty, mydła, proszki, tabletki, błony, pessaria, aerozole, krople, roztwory i inne postaci powszechnie stosowane w dziedzinie farmacji.

Maści, żele i kremy można np. wytwarzać na podstawie wodnej lub olejowej z dodatkiem odpowiednich środków zagęszczających i/lub żelujących. Płyny można wytwarzać na podstawie wodnej lub olejowej i będą one na ogół zawierać jeden lub kilka środków emulgujących, dyspergujących, zawieszających, zagęszczających lub barwiących. Proszki (zasypki) można wytwarzać za pomocą dowolnej podstawy dla proszku. Krople można wytwarzać na podstawie wodnej lub bezwodnej i mogą one również zawierać jeden lub kilka środków dyspergujących, solubilizujących lub zawieszających. Aerozole są powszechnie podawane z opakowań ciśnieniowych, z zastosowaniem odpowiedniego propelenta.

Alternatywnie, kompozycję można dostarczyć w postaci przystosowanej do podawania doustnego i pozajelitowego. Alternatywne postaci farmaceutyczne obejmują tabletki zwykłe lub powlekane, kapsułki, zawiesiny i roztwory zawierające aktywny składnik, ewentualnie razem z jednym lub kilkoma powszechnie stosowanymi obojętnymi nośnikami i/lub rozcieńczalnikami, np. skrobią kukurydzianą,

PL 213 376 B1 laktozą, sacharozą, celulozą mikrokrystaliczną, stearynianem magnezu, poliwinylopirolidonem, kwasem cytrynowym, kwasem winowym, wodą, wodą/etanolem, wodą/glicerolem, wodą/sorbitolem, wodą/glikolem polietylenowym, glikolem propylenowym, alkoholem stearylowym, karboksymetylocelulozą lub substancjami tłuszczowymi takimi jak tłuszcze twarde, lub ich mieszaninami.

Kompozycja może dodatkowo zawierać środki smarujące, środki nawilżające, środki emulgujące, środki zawieszające, środki konserwujące, środki słodzące, środki zapachowe, środki nasilające adsorpcję, np. wspomniane poniżej środki powierzchniowo przenikające i im podobne. Kompozycje według wynalazku można tak formułować, aby zapewnić szybkie, utrzymujące się lub opóźnione uwalnianie aktywnego składnika po podaniu pacjentowi, z zastosowaniem procedur dobrze znanych w tej dziedzinie. Można również zastosować środki solubilizujące i/lub stabilizujące, np. α, β, γ cyklodekstrynę (CD) i ΗΡ-β cyklodekstrynę.

Dawkowanie można określić w rutynowy sposób i może ono zależeć od rodzaju cząsteczki, celu leczenia, wieku pacjenta, sposobu podawania itd. W odniesieniu do czynnika światłouczulającego powinno się również wziąć pod uwagę silę/zdolność do rozrywania błon podczas naświetlenia.

Jednak na ogół, do zastosowań in vitro odpowiedni zakres stężeń czynnika światłouczulającego wynosi np. 0,05-500 μg/ml. Do leczenia in vivo ludzi, czynnik światłouczulający może być stosowany, przy podawaniu ogólnym, w dawce 0,05-20 mg/kg masy ciała lub w stężeniu 0,1-20%, w rozpuszczalniku do stosowania miejscowego. U mniejszych zwierząt stężenie może być inne i powinno być odpowiednio dla nich dobrane.

Cząsteczka, która ma być wprowadzona w połączeniu z nośnikiem wirusowym, może być obecna w stężeniu 1x10^-9 do 50% tak, jak 3x10^-6 do 50%, np. 0,003 do 30%, np. 0,2 do 10% (w/w) cząstek wirusowych w ostatecznej kompozycji do zastosowania in vivo, w której w/w oznacza stosunek ciężaru nośnika wirusowego z dodatkiem cząsteczki, która ma być wprowadzona do ciężaru ostatecznej kompozycji. Jeżeli stosuje się iniekcje o objętości 1 ml, powinno to odpowiadać około 10⁵ do 10¹⁵ fizycznych cząstek wirusowych. Dla zastosowania in vitro można stosować 1-1x10⁵ cząstek wirusowych, np. 1x10³-1x10⁵.

Przedmiotem wynalazku jest także produkt zawierający przenoszoną cząsteczkę związaną z nośnikiem wirusowym oraz czynnik światłouczulający jak opisano powyżej, przy czym nośnikiem wirusowym jest adenowirus, a przenoszoną cząsteczką cząsteczka kwasu nukleinowego, jako preparat złożony do zastosowania razem lub oddzielnie do leczenia lub zapobiegania chorobie, zaburzeniu lub zakażeniu, przy czym produkt jest stosowany w sposobie, w którym przenoszona cząsteczka jest wprowadzana do komórki, a sposób obejmuje kontaktowanie komórki z czynnikiem światłouczulającym, kontaktowanie komórki z cząsteczką przenoszoną, która jest związana z nośnikiem wirusowym i naświetlanie komórki światłem o długości fali odpowiedniej do aktywacji czynnika światłouczulającego.

Wynalazek zostanie teraz opisany bardziej szczegółowo, w następujących nieograniczających przykładach w odniesieniu do następujących rysunków, w których:

Figura 1 przedstawia znakowanie X-gal fotochemicznie transdukowanych komórek WiDr. Komórki traktowano AlPcS2a (S), zakażano AdHCMV-IacZ (Ad) przy wartości MOI 5 i poddawano traktowaniu światłem jak wskazano na figurze. Komórki inkubowano przez 2 dni, aby pozwolić na rozwinięcie się ekspresji transdukowanego genu β-galaktozydazy, a następnie znakowano je X-gal i badano w opisany sposób, za pomocą mikroskopu. Komórki traktowano następująco: A. Bez traktowania. B. Tylko adenowirus. C. AlPcS2a + 8 minut światła. D AlPcS2a + adenowirus + 8 minut światła.

Figura 2 przedstawia badanie za pomocą cytometrii przepływowej fotochemicznie wzmocnionej transdukcji w komórkach HCT 116 (panel A) i komórek WiDr (panel B). Komórki traktowano AlPcS2a (S), zakażano AdHCMV-IacZ (Ad) przy MOI 5 i naświetlano w opisany sposób. Dwa dni później komórki były obciążane Di-e-galaktopiranozydem znakowanym fluoresceiną i badane za pomocą cytometrii przepływowej. Figura 2A przedstawia wykres punktowy cytometrycznej oceny komórek HCT 116. Komórki po prawej stronie pionowej linii przyjęto za dodatnie pod względem transdukcji adenowirusem, ponieważ w tym obszarze nie występowały komórki ani w grupie komórek nietraktowanych (górny panel), ani w grupie komórek traktowanych samym AlPcS2a i światłem (dolny panel). Różnice w traktowaniu wskazano na każdym panelu. Figura 2B pokazuje wydajność transdukcji jako funkcję dawki światła dla komórek WiDr. Procent komórek dodatnich pod względem β-galaktozydazy określono w sposób opisany dla figury 2A. ((□) S-, Ad+; (▲) S+, Ad-; (·) S+, Ad+) oraz zmierzono średnie natężenie fluorescencji ((O) S+, Ad+). Słupki przedstawiają wartość błędu standardowego średniej (SEM) z 2 do 5 eksperymentów.

PL 213 376 B1

Figura 3 przedstawia zwiększoną przez PCI transdukcję komórek WiDr przy różnych dawkach wirusa. Komórki zakażano AdHCMV-IacZ przy różnych MOI i poddawano fotochemicznemu traktowaniu w opisany sposób. Figura 3A przedstawia średnią fluorescencję w całej populacji komórek. Komórki traktowano następująco: niezacienione słupki: tylko AlPcS2a; zakreskowane skośnie: MOI=1; szare: MOI=5; poziomo zakreskowane: MOI=20; czarne: MOI=50. Słupki błędów (SEM) obliczano na podstawie 3 eksperymentów. Figura 3B pokazuje ile razy wzrosła aktywność β-galaktozydazy w całej populacji komórek. Oznaczenia są takie jak na Figurze 3A. Słupki błędu dotyczą błędu standardowego dla 3 lub 4 eksperymentów.

Figura 4 przedstawia wpływ fotochemicznego traktowania na transdukcję adenowirusem komórek THX.

Figura 5 przedstawia wpływ fotochemicznego traktowania na ekspresję β-galaktozydazy w komórkach THX zakażonych AdHCMV-IacZ. Dla strategii „najpierw światło komórki wstępnie traktowano AlPcS2a inkubowano w podłożu wolnym od AlPcS2a, przez 4 godziny poprzedzające ekspozycje na światło przez 3 min. Po naświetlaniu komórki zakażano AdHCMV-IacZ (w MOI 1) przez 30 minut w temperaturze 37°C. Następnie dodawano 2 ml podłoża i komórki inkubowano przez 2 dni, przed wykonaniem analizy ekspresji β-galaktozydazy. Dla strategii „światło potem komórki traktowane AlPcS2a inkubowano na podłożu wolnym od AlPcS2a przez 3 godziny, przed 30 minutowym zakażaniem AdHCMV-IacZ. Po dodaniu 2 ml podłoża komórki inkubowano przez następne 30 minut, przed 3 minutowym naświetlaniem i dwa dni później analizowano ekspresję β-galaktozydazy.

Figura 6 przedstawia zwiększenie produkcji β-galaktozydazy, w wyniku transdukcji adneowirusem kodującym β-galaktozydazę za pośrednictwem PCI, w zależności od wydłużenia czasu naświetlania. Traktowanie (+,- wskazują czy z, czy bez) i dawki światła (długość naświetlania) są pokazane na figurze dla poszczególnych próbek. Adv: adenowirus AdHCMV-IacZ. S: czynnik światłouczulający AlPcS2a.

Figura 7 przedstawia wpływ PCI na transdukcję komórek WiDr przy różnych wartościach MOI (współczynnika zakażania). □ - bez naświetlania, - 90 sekund naświetlania.

Figura 8 przedstawia wpływ PCI na transdukcję komórek A549 adenowirusem. Traktowanie (+,wskazują czy z, czy bez) i dawki światła (w minutach) są pokazane na figurze dla poszczególnych próbek. A: adenowirus AdHCMV-IacZ. S: czynnik światłouczulający AlPcS2a.

Figura 9 przedstawia wpływ PCI na transdukcję linii komórkowych HeLa i FmexIII. Niezacienione słupki - bez naświetlania, ciemne słupki - 90 sekund naświetlania.

Figura 10 pokazuje wpływ PCI na transdukcję komórek WiDr adenowirusem w połączeniu z poli-L-lizynowym nośnikiem.

Ad: adenowirus AdHCMV-IacZ. PLL: poli-L-lizyna. 5PLL/Ad oznacza, że kompleks średnio zawiera 5 cząsteczek PLL na cząstkę wirusową. O - Ad MOI 5, - 5 PLL/Ad,·· - 500 PLL/Ad, □ - 250 PLL/Ad, ▲ - 50 PLL/Ad.

Figura 11 przedstawia wpływ PCI na transdukcję adenowirusem linii komórkowej ludzkich fibroblastów skóry w której wykorzystuje się pol-L-lizynę jako nośnik dla wirusa, przy różnej długości czasach naświetlania. □ - MOI 5: wirus AdHCMV-IacZ nie będący w kompleksie. - MOI 5/PLL: AdHCMV-IacZ w kompleksie z 250 cząsteczkami PLL przypadającymi na cząstkę wirusa.

Figura 12 przedstawia wpływ PCI na transdukcję adenowirusem, przy zastosowaniu polikationowego dendrymeru SuperFect^® jako nośnika wirusa w różnych stężeniach. Niezacienione słupki bez naświetlania, ciemne słupki - 90 sekund naświetlania.

Figura 13 przedstawia wpływ różnych schematów czasowych naświetlania i podawania adenowirusa. Punkty czasowe po lewej stronie osi Y przedstawiają dodawanie wirusa przed naświetlaniem, punkty czasowe na prawo reprezentują dodawanie po naświetlaniu. - 1 minuta naświetlania; □ bez naświetlania.

Figura 14 przedstawia zwiększenie przez PCI leczniczego działania genu kodującego kinazę tymidynową wirusa opryszczki pospolitej po różnych okresach naświetlania. Śmierć komórek była powodowana przez gancyklowir po zainicjowanej przez PCI transdukcji wektorem adenowirusowym kodującym HSV-tk. Al.: AlPcS_2a; AdV-TK: adenowirus kodujący HSV-tk; GCV: gancyklowir. ♦ - tylko Al; □ - Al+AdV-TK; Δ - AL+GCV przy 10 pg/ml (A), 25 pg/ml (B) lub 100 pg/ml (C); - AL+AdVTK+GCV przy 10 pg/ml (A), 25 pg/ml (B) lub 100 pg/ml (C).

P r z y k ł a d 1

We wstępnych eksperymentach komórki WiDr raka gruczołowego traktowano czynnikiem światłouczulającym AlPcS2a (sól glinową ftalocyjaniny, z dwoma grupami sulfonianowymi na sąsiadujących

PL 213 376 B1 pierścieniach), zakażono adenowirusem AdHCMV-IacZ zawierającym gen reporterowy β-galaktozydazy i poddawano naświetlaniu jak opisano w protokole eksperymentu. Komórki znakowano na aktywność β-galaktozydazy i badanie mikroskopowe wykazało, że zasadniczy ułamek komórek traktowanych światłem wykazywał ekspresję transgenu (Fig. 1D), podczas gdy tylko nieliczne pozytywne komórki wykryto pomiędzy nienaświetlonymi, zakażonymi adenowirusem komórkami (Fig. 1B). Nie stwierdzono pozytywnych komórek w nietraktowanych próbkach (Fig. 1A) lub w próbkach, do których dodawano AlPcS2a i naświetlano, ale bez adenowirusa (Fig. 1C), zatem obserwowany, wzbudzony światłem wzrost ekspresji β-galaktozydazy pochodził z dostarczonego adenowirusem transgenu, a nie z endogennego genu β-galaktozydazy.

P r z y k ł a d 2

Do oceny ilościowej zastosowano cytometrię przepływową, z zastosowaniem substratu di^-D-galaktopiranozydu znakowanego fluoresceiną, który powoduje, że komórki wykazujące ekspresję β-galaktozydazy są fluorescencyjne. Jak można zobaczyć na Figurze 2A fotochemiczne traktowanie zwiększa zasadniczo aktywność β-galaktozydazy w zakażonych adenowirusem komórkach HCT 116. Zatem procent komórek pozytywnych pod względem β-galaktozydazy wzrasta od 6,3±0,1% (odchylenie standardowe, n=3) w przypadku normalnie zakażanych komórek (Ad+ S-, 0 min. światła), do 88±17% (n=3) w przypadku komórek traktowanych optymalnie (Ad+ S+, 8 min. światła). Podobnie, dla tych próbek, wzrastało średnie natężenie fluorescencji wzrosło od 52±11% (n=3) do 632±163% (n=3) względnych jednostek fluorescencji (RFU). Fotochemiczne traktowanie nieznacznie zwiększało też średnie natężenie fluorescencji w niezakażanych komórkach (Fig. 2A, górny i dolny panel) od 6 do 12 RFU. Jednak ze względu na bardzo niski poziom fluorescencji i ilości pozytywnych komórek (0,4% w próbce Ad-, S + , 8 min. naświetlania), nie stwarza to problemów w interpretacji wyników dla komórek zakażanych wirusem.

W hodowli komórek raka jelita grubego WiDr obserwowano nawet większy, zależny od naświetlania wzrost transdukcji genu (Fig. 2B). Zatem maksymalny 22-krotny wzrost w procencie komórek pozytywnych pod względem β-galaktozydazy i 44-krotny wzrost średniego natężenia fluorescencji obserwowano, gdy naświetlane, zakażone komórki porównywano z nienaświetlanymi. Samo fotochemiczne traktowanie (Fig. 2B, Ad-, S+, A), a nie samo naświetlanie (Fig. 2B, Ad+, S-, □) nie zmieniało w sposób znaczący procentu pozytywnych komórek.

Wyniki cytometrii przepływowej potwierdzono przez zastosowanie zestawu chemiluminescencyjnego do oznaczania genu reporterowego β-Gal (Roche, Cat. Nr 1758241) w ekstraktach z komórek WiDr, za pomocą którego wykazano 30 krotny wzrost aktywności β-galaktozydazy w wyniku fotochemicznego traktowania (dane nie przedstawione).

P r z y k ł a d 3

Następnie zbadano wpływ dawki wirusa na fotochemicznie zwiększenie wydajności transdukcji. Jak widać na Fig. 3, fotochemiczne traktowanie zwiększyło wydajność transdukcji przy wszystkich badanych dawkach wirusa. Jednak, wpływ był bardziej zaznaczony przy niskich dawkach (współczynnik zakażania 1 do 5), przy których obserwowano 15- do 35-krotny wzrost średniego natężenia fluorescencji w zakresie, w porównaniu z odpowiednio 10- i 5-krotnym obserwowanym przy MOI 20 i 50 (Fig. 3B). Można również zauważyć (Fig. 3A), że średnie natężenie fluorescencji, uzyskane przy optymalnym czasie naświetlania (7 minut), przy MOI 5 jest około dwa razy takie jak obserwowane bez naświetlania przy MOI 50. Podobnie poziom uzyskiwany przy MOI 1 w połączeniu z traktowaniem światłem jest prawie taki sam jak przy MOI 20 i braku naświetlania. Zatem, przy optymalnym fotochemicznym traktowaniu 20-krotnie niższe dawki wirusa są wystarczające do uzyskania takiego samego poziomu transdukcji genów, jak dla zakażenia bez fotochemicznego traktowania.

Procent komórek pozytywnych pod względem β-galaktozydazy uzyskany przy MOI 50 w tym eksperymencie wynosił 90±3% (n=3) w porównaniu z 13%±4 (n=3) dla komórek nienaświetlanych. Te dane, w połączeniu z wynikami dla komórek HCT 116, przedstawionymi powyżej, wskazują, że PCI w połączeniu z adenowirusem może wywołać transdukcję całej populacji komórek.

Protokoły eksperymentalne

Komórki i adenowirus

Komórki HCT 116 i WiDr raka ludzkiego jelita grubego uzyskano z American Type Culture Collection (ATCC nos. CCL-247 i CCL-218 odpowiednio). Komórki hodowano na podłożu RPMI 1640 zawierającym 10% płodową surowicę cielęcą, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2 mM glutaminy (wszystkie Z Gibco BRL, Paisley Wielka Brytania), w 37°C i atmosferze 5% CO2.

PL 213 376 B1

Rekombinowany adenowirus AdHCMV-IacZ kodujący gen E. coli IacZ, pod kontrolą promotora ludzkiego cytomegalowirusa, uzyskano przez homologiczną rekombinację z zastosowaniem układu pJM17 w komórkach 293 (Addison i in., 1997, J.Gen.Virol. 7 8:1653-610).

Rekombinowane wektory oczyszczono metodą łysinkową, hodowano do wysokiego miana w komórkach 293 i oczyszczano za pomocą wirowania w gradiencie CsCl (Hitt i in., 1995, Methods Mol. Genet. 7;13-30). Roztwór wirusów rozcieńczano w PBS zawierającym 0,68 mM CaCl2 i 0,5 mM MgCl2 do poziomu MOI stosowanego w różnych eksperymentach.

Fotochemiczne traktowanie

Wysiewano 50 000 komórek na studzienkę w 6 studzienkowych płytkach (Costar0 i inkubowano przez noc w 37°C. Następnie dodawano 1 ml podłoża zawierającego 20 mg/ml AlPcS2a (Photphirin

Products, Logan, UT), komórki inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 37°C, płukano trzykrotnie w podłożu i inkubowano jeszcze przez 3 godziny w 37°C. Usuwano podłoże i dodawano 200 μΐ AdHCMV-IacZ. Po 30 minutowej inkubacji w 37°C dodawano 2 ml podłoża i komórki inkubowano przez 30 minut, przed ekspozycją na światło czerwone (Philips TL 20 W/09, filtrowane przez filtr Cinemoid 35, z natężeniem światła osiąganym na komórkach 13,5 W/m²). Przed oceną aktywności β-galaktozydazy komórki inkubowano przez 2 dni w 37°C.

Znakowanie komórek X-gal

Do znakowania X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-e-D-galaktopiranozyd) usuwano podłoże, dodawano 1 ml roztworu utrwalającego (0,5% glutaraldehydu w PBS) i komórki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Roztwór wiążący usuwano i komórki płukano trzykrotnie w PBS, w temperaturze pokojowej (drugie płukanie trwało 10 minut, pierwsze i trzecie przeprowadzano szybko). Następnie dodawano 1 ml roztworu X-gal (5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 1 mM MgCl2, 1 mg/ml) i komórki inkubowano w czasie 4 godzin do całej nocy w 37°C i obserwowano w mikroskopie (powiększenie 100 krotne) stosując mikroskop Axiovert S100 (Zeiss) z aparatem MC100 Spot (Zeiss).

Cytometria przepływowa

Komórki trypsynizowano, wirowano i ponownie zawieszano w 25 ml podłoża i inkubowano przez 5 minut w 37°C. Dodawano 25 ml 2 mM di-e-D-galaktopiranozydu znakowanego fluoresceiną (Molecular Probes, Eugene, OR) i komórki inkubowano przez 1 minutę w 37°C, przed rozcieńczeniem przez dodanie 450 ml schłodzonego lodem podłoża wzrostowego. Próbki trzymano w lodzie przez 30-60 minut, filtrowano przez filtr nylonowy o średnicy oczek 50 mm i oceniano za pomocą cytometru przepływowego FACS-Calibur (Becton Dickinson). Dla każdej próbki zbierano 10000 sygnałów. Fluorescencję fluoresceiny mierzono przez filtr 510-530 nm po wzbudzeniu laserem argonowym (15 mW, 488 nm). Martwe komórki odróżniano od pojedynczych żywych przez bramkowanie na przednim rozproszeniu wobec rozproszenia bocznego. Dane analizowano za pomocą programu CELLQuest (Beckton Dickinson).

P r z y k ł a d 4

Wpływ PCI na transdukcję adenowirusem komórek THX

Materiał

Di-e-D-galaktopiranozyd znakowany fluoresceiną (FDG) zakupiono od Molecular Probes (F-1179). 20 mM roztwór podstawowy przygotowywano przez rozpuszczenie proszku, w mieszaninie DMSO/etanolu w stosunku 1:1. Mieszaninę stopniowo dodawano do odpowiedniej objętości schłodzonej lodem wody, tak by uzyskać roztwór 8:1:1 H2O/DMSO/etanol.

Rekombinowany wirus AdCA171acZ wytwarzano i namnażano w ludzkiej linii komórkowej 293, linii komórkowej nerki zarodka Ad E1-transformowanej, utrzymywanej w podłożu MEM F-11 wzbogaconym 10% FCS, 100 U/ml penicyliny (Gibco-BRL), 0,1 mg/ml streptomycyny (Gibco-BRL) i 2 mM glutaminy.

Konstrukcja rekombinowanego wirusa

Rekombinowany wirus AdCA171acZ kodujący gen E. coli IacZ, pod kontrolą promotora ludzkiego CMV uzyskano przez homologiczną rekombinację z zastosowaniem układu pJM17 w komórkach 293 (Addison i in., 1997, J.Gen.Virol. 78:1653-1661). Rekombinowane wektory oczyszczono metodą łysinkową, hodowano do wysokiego miana w komórkach 293 i oczyszczano metodą wirowania w gradiencie chlorku cezu jak uprzednio opisano (Hitt i in., 1995, Method in Mol. Genet. 7,15-30).

Uczulanie komórek

Komórki THX (4 x 10⁵) wysiewano na 6 cm naczynia i pozwalano im rosnąć przez noc. W blisko 60% stadium zlewności podłoże wzrostowe wymieniano na 2 ml podłoża wzrostowego wzbogaconego 20 μg/ml AlPcS_2a i naczynia wstawiano z powrotem do inkubatora na 16-18 godzin. Następnie odsyPL 213 376 B1 sano podłoże zawierające czynnik uczulający i komórki inkubowano w zwykłym podłożu wzrostowym przez co najmniej 4 godziny poprzedzające traktowanie światłem i zakażanie wirusem.

Zakażanie komórek

Trypsynę-EDTA stosowano do odklejenia komórek z trzech naczyń i obliczano średnią liczbę komórek z zastosowaniem kamery Bϋrcher'a. Rozcieńczenia adenowirusa przygotowano w PBS z 0,68 mM CaCl2 i 0,5 mM MgCl2 zależnie od liczby komórek przeznaczonych do zakażenia. Zwykle komórki zakażano przy współczynniku zakażania (m.o.i.) pomiędzy 1 a 10.

Przed dodaniem wirusa komórki eksponowano przez 3 minuty, na czerwone światło (Philips TL 20W/09, filtrowane przez filtr Cinemoid 35 z natężeniem światła uzyskiwanym na komórkach 1,35 mW/cm²). Następnie odsysano podłoże i dodawano do każdego naczynia 200 μl zawiesiny wirusa (lub PBS z 0,68 mM CaCl2 i 0,5 mM MgCl2 w przypadku komórek kontrolnych nietraktowanych wirusem). Po 30 minutowej inkubacji w 37°C, dodawano 5 ml zwykłego podłoża wzrostowego i pozwalano komórkom rosnąć przez 48 godzin.

Test β-galaktozydazy

Komórki odklejano za pomocą EDTA-trypsyny i ponownie zawieszano w 5 ml podłoża wzrostowego. Po 5 minutowym wirowaniu przy 1000 obr./min., odciągano podłoże, osad komórkowy zawieszano ponownie w 50 μl podłoża wzrostowego i probówki umieszczano na 5 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.

Następnie dodano 50 μl 2 mM roztworu FDG uprzednio ogrzanego do 37°C i probówki umieszczano ponownie na 1 minutę w kąpieli wodnej. W końcu dodawano 900 μl podłoża wzrostowego i probówki inkubowano w lodzie przez 30-60 minut przed badaniem za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano powyżej.

Komórki THX traktowano AlPcS2a (oznaczonym na figurze 4 jako PS) i adenowirusem (oznaczonym na figurze 4 jako wirus) i eksponowano na światło przez 3 lub 4 minuty w sposób opisany w Materiałach i Metodach i mierzono aktywność β-galaktozydazy (β-gal) za pomocą cytometrii przepływowej. Całkowitą aktywność β-gal określano po zebraniu w całość wszystkich dodatnich po względem β-gal komórek i ich aktywności β-gal. Zarówno liczba komórek β-gal dodatnich jak i ich średnia aktywność β-gal zwiększały się po traktowaniu PCI.

Wyniki pokazują, że minimalne zakażenie komórek THX pojawia się, gdy inkubuje się je z samym wirusem lub z wirusem i czynnikiem światłouczulającym, ale pokazują też, że traktowanie fotochemiczne, tj. dodanie światła do czynnika światłouczulającego powoduje znaczne zwiększenie transdukcji komórek (jak to wykazano przez zwiększoną aktywność β-galaktozydazy).

P r z y k ł a d 5

Fotochemiczna stymulacja transdukcji genu za pośrednictwem adenowirusa

Wysiano 5 x 10⁴ komórek THX na studzienkę, na płytki 6-studzienkowe. Następnego dnia dodano 20 μg/ml AlPcS_2a i komórki inkubowano przez 18 godzin w 37°C. Wszystkie procedury po dodaniu AlPcS2a przeprowadzano w zacienieniu. Do strategii „najpierw światło, z komórek płukano AlPcS2a i inkubowano w podłożu wolnym od AlPcS2a przez 4 godziny. Następnie komórki eksponowano na światło przez 3 minuty przed traktowaniem wektorem adenowirusowym AdHCMV-IacZ (określanym również w przykładzie 4 jako AdCA171acZ) przy współczynniku zakażania (MOI) = 1 przez 30 minut. Ten wektor zawiera gen reporterowy β-galaktozydazy, którego ekspresja może być oceniana metodą cytometrii przepływowej (patrz poniżej).

Do strategii „światło potem komórki traktowane AlPcS2a i wypłukane, najpierw traktowano adenowirusem w tym samym stężeniu i przez taki sam czas, jak wskazane powyżej, płukano i po dodaniu świeżego podłoża hodowlanego eksponowano na światło. Komórki nienaświetlane traktowano w podobny sposób z wyjątkiem naświetlania.

Traktowane komórki płukano raz w podłożu hodowlanym i po dodaniu świeżego podłoża inkubowano w 37°C przed dalszymi badaniami. Ekspresję β-galaktozydazy określano metodą cytometrii przepływowej dwa dni po ekspozycji na światło. Szczegółowe sposoby konstrukcji wirusa (który określono jako AdHCMV-IacZ lub AdCA171acZ), traktowania komórek, naświetlania i określania ekspresji β-galaktozydazy, opisano w przykładzie 4.

Wyniki (Figura 5) wykazują, że fotochemiczne traktowanie z zastosowaniem procedury „najpierw światło (przedstawione przez słupki po prawej stronie Figury 5) zwiększa około 6 razy procent komórek wykazujących ekspresję β-galaktozydazy; od 2,5% do 15% w tych warunkach doświadczalnych. Można zauważyć również, że skutek osiągnięty za pomocą procedury „najpierw światło był

PL 213 376 B1 prawie równy efektowi uzyskanemu w sposobie „światło potem (przedstawione przez słupki po lewej stronie Figury 5).

P r z y k ł a d 6

Zwiększenie wytwarzania β-galaktozydazy jako wynik transdukcji adenowirusem kodującym β-galaktozydazę, za pośrednictwem PCI

Komórki hodowano, inkubowane z AlPcS2a, zakażano wirusem AdHCMV-LacZ i naświetlano w sposób opisany w „Protokołach eksperymentalnych w przykładzie 3. Do oceny wytwarzania białka β-galaktozydazy zastosowano zestaw do pomiaru chemiluminescencji reporterowego genu β-gal (Roche, Cat. No. 1758241) według protokołu producenta. Krótko, komórki płukano trzykrotnie w oziębionym uprzednio PBS i do każdej studzienki dodawano 1 ml lizatu komórkowego. Po 30 minutowej inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej ekstrakt komórkowy przenoszono do probówki eppendorfa, wirowano w 4°C przez 2 minuty z maksymalną prędkością, a następnie 50 μl ekstraktu komórkowego (supernatantu) przenoszono do studzienek płytki mikrotitracyjnej. Dodawano 100 μl odczynnika, następnie płytka była pokrywana folią i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut do 1 godziny delikatnie kołysząc. Po inkubacji, płytkę mokrotitracyjną umieszczano w luminometrze (Victor2 Wallac 1420 Multilabel Counter) i automatycznie dodawano 50 μl roztworu inicjacyjnego. Po upływie 1 sekundy, mierzono całkowitą produkcję światła. Ilość β-galaktozydazy obliczano z krzywej standardowej wykreślonej na podstawie próbek zawierających znaną ilość β-galaktozydazy.

Wyniki

Figura 6 przedstawia wzrost produkcji białka β-galaktozydazy, który można uzyskać po transdukcji, indukowanej przez PCI, komórek ludzkiego raka jelita grubego WiDr adenowirusem.

Zatem, na Figurze 6 można zauważyć, że maksymalna dawka światła powoduje 25-krotny wzrost produkcji β-galaktozydazy w komórkach, które uległy transdukcji, co odpowiada wynikom uzyskanym za pomocą cytometrii przepływowej (np. Przykłady 2 i 3).

P r z y k ł a d 7

Wpływ PCI na transdukcję komórek WiDr przy różnych współczynnikach zakażania

Komórki WiDr hodowano w podłożu RPMI 1640 wzbogaconym płodową surowicą cielęcą, Penicyliną/Streptomycyną i L-glutaminą. Podłoże usuwano bez dostępu światła i dodawano podłoże zawierające 1 μg/ml TPPS_2a. Komórki (bez dostępu światła) inkubowano przez 18 godzin w 37°C. Komórki płukano 3 razy podłożem i inkubowano przez następne 3 godziny. Podłoże z 6-studzienkowych płytek usuwano, do każdej studzienki dodawano 200 μl roztworu wirusa AdHCMV-IacZ i komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C (bez dostępu światła). Usuwano roztwór wirusa, a komórki płukano w podłożu. Dodawano 2 ml podłoża i komórki inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C (bez dostępu światła). Niektóre komórki eksponowano przez 90 sekund na niebieskie światło z natężeniem światła osiąganym na komórkach 11 mW/m². Komórki inkubowano przez 2 dni (ciągle bez dostępu światła) przed pomiarem aktywności β-galaktozydazy za pomocą cytometrii przepływowej, w sposób opisany w „Protokołach eksperymentalnych, w przykładzie 3.

Wyniki

Figura 7 przedstawia, że zastosowanie PCI umożliwia osiągnięcie 100% transdukcji komórek, nawet w przypadkach, w których nie jest to możliwe przy zastosowaniu konwencjonalnych sposobów zakażania, nawet przy zastosowaniu bardzo dużych dawek wirusa. Zatem, Figura 6 przedstawia, że osiąga się 100% transdukcję komórek WiDr, przy dawkach wirusa 100 MOI z zastosowaniem PCI, natomiast mniej niż 30% transdukcję uzyskuje się przy konwencjonalnych sposobach zakażania. Podobnie, przy MOI 50, osiąga się >90% transdukcji po PCI, podczas gdy bez zastosowania PCI można uzyskać <20% transdukcję.

P r z y k ł a d 8

Wpływ PCI na transdukcję komórek A549 adenowirusem

Komórki A549 hodowano na podłożu RPMI 1640 wzbogaconym 10% FCS (płodową surowicą cielęcą), penicyliną/streptomycyną i L-glutaminą. Podłoże usuwano przy ograniczeniu dostępu światła i dodawano podłoże zawierające 20 μg/ml AlPcS_2a. Komórki (bez dostępu światła) inkubowano w 37°C, przez 18 godzin. Komórki płukano trzykrotnie w podłożu i inkubowano przez następne 3 godziny. Podłoże usuwano, do każdej studzienki dodawano 200 μl roztworu adenowirusa AdHCMV-lacZ (przy MOI 5) i komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C (bez dostępu światła). Roztwór wirusa usuwano i komórki płukano 4 razy w podłożu. Następnie dodawano 2 ml podłoża i komórki inkubowano przez 30 min w 37°C (bez dostępu światła). Część komórek eksponowano na światło czerwone w sposób opisany w „Protokołach eksperymentalnych”. Komórki inkubowano przez 2 dni (ciągle bez

PL 213 376 B1 dostępu światła) przed pomiarem aktywności β-galaktozydazy za pomocą cytometrii przepływowej, w sposób opisany w „Protokołach eksperymentalnych”, w przykładzie 3.

Wyniki

Figura 8 przedstawia, że PCI może zasadniczo zwiększyć transdukcję genem za pośrednictwem adenowirusa komórek ludzkiego raka płuc. Zatem, w porównaniu z „normalnym zakażeniem” (próba A+ S- 0 minut naświetlania) PCI z 6 minutowym naświetlaniem zwiększa liczbę komórek, które uległy transdukcji około 11 razy, z około 3% do około 33% pozytywnych komórek.

P r z y k ł a d 9

Wpływ PCI na transdukcję linii komórkowych HeLa i FmexIII

Komórki HeLa uzyskano z Americam Type Culture Collection, a komórki ludzkiego czerniaka FmexIII zostały wyprowadzone w Norwegian Radium Hospital. Komórki hodowano, inkubowano z czynnikiem światłouczulającym TPPS_2a (1 μg/ml), zakażano adenowirusem AdHCMV-lacZ (MOI 5), naświetlano i badano w sposób opisany w przykładzie 7.

Wyniki

Figura 9 przedstawia, że PCI zwiększa transdukcję także w liniach komórkowych HeLa i FmexIII.

P r z y k ł a d 10

Wpływ PCI na transdukcję adenowirusem połączonym z nośnikiem poli-L-lizynowym

Komórki WiDr hodowano i inkubowano z czynnikiem światłouczulającym TPPS_2a (1 μg/ml), w sposób opisany w przykładzie 7. Poli-L-lizynę (PLL, ciężar cząsteczkowy 20700) uzyskano od Sigmy. Stężenie cząstek wirusowych w preparacie wirusowym określano przez pomiar A260 zgodnie z Mittereder i in. (J. Virol. 1996 11:7498-7509).

Sporządzono następujące kompleksy Adenowirusa/PLL:

5PLL/Ad: 5 cząsteczek PLL na cząstkę wirusa.

500PLL/Ad: 500 cząsteczek PLL na cząstkę wirusa.

250PLL/Ad: 250 cząsteczek PLL na cząstkę wirusa.

50PLL/Ad: 50 cząsteczek PLL na cząstkę wirusa.

Rozcieńczenie PLL dodawano do rozcieńczenia cząstek wirusowych. Próbki mieszano ostrożnie przez odwracanie lub delikatną aspirację pipetą i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Usuwano podłoże z 6-studzienkowych płytek i do każdej studzienki dodawano 200 μl roztworu adenowirusa lub roztworu PLL/Ad, przy MOI 5. Komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C (bez dostępu światła). Do płytek nie zakażanych adenowirusem dodawano tylko 200 μl PBS. Usuwano 200 μl roztworu i komórki jednorazowo płukano w podłożu. Dodawano 2 ml podłoża i komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C (bez dostępu światła), przed ekspozycją na niebieskie światło w sposób opisany w przykładzie 7. Komórki inkubowano przez 2 dni (ciągle bez dostępu światła) przed analizą aktywności β-galaktozydazy, metodą cytometrii przepływowej w sposób opisany w „Protokołach eksperymentalnych, w przykładzie 3.

Wyniki

Figura 10 przedstawia, że PCI działa także w przypadku, gdy adenowirus jest połączony z nośnikiem poli-L-lizynowym (PLL). Jak można zauważyć na Figurze 10 zakażenie bez PCI (tj. 0 minut światła) daje bardzo niską transdukcję (<5%) zarówno z jak i bez PLL jako nośnikiem. Jest oczywiste, że naświetlanie komórek wywołuje zależne od dawki światła zwiększenie transdukcji zarówno z jak i bez PLL, dzięki skutkom PCI. Jeśli największa wydajność transdukcji uzyskiwana bez PLL wynosiła 37% (O na Figurze 10), to przy zastosowaniu kombinacji PCI i PLL (·) można było uzyskać 87% pozytywnych komórek, reprezentujących >20-krotny wzrost procenta komórek, które uległy transdukcji w porównaniu z tym, co uzyskano w tych samych warunkach bez PCI i 100-krotny wzrost w porównaniu z normalnym zakażeniem (0 minut światła bez PLL). Zatem PCI może zasadniczo zwiększyć wydajność transdukcji adenowirusem pokrytym PLL i przy zastosowaniu tej kombinacji można osiągnąć znacznie większą wydajność transdukcji niż dla kombinacji PCI z nie pokrytym adenowirusem.

P r z y k ł a d 11

Wpływ PCI na transdukcję adenowirusem linii komórkowej ludzkich fibroblastów skóry z zastosowaniem poli-L-lizyny jako nośnika dla wirusa

Fibroblasty HL 116 ludzkiej skóry hodowano i traktowano czynnikiem światłouczulającym TPPS2a w sposób opisany w przykładzie 7. Kompleks PLL i wirusa (250 cząsteczek PLL na cząstkę

PL 213 376 B1 wirusa) przygotowano w sposób opisany w przykładzie 10, a następnie komórki zakażano przy MOI 5, naświetlano i badano w sposób opisany w przykładzie 10.

Wyniki

Figura 11 przedstawia wpływ zastosowania PCI w kombinacji z nośnikiem PLL na linię komórkową fibroblastów skóry ludzkiej (HF 16). Fibroblasty są uważane za bardzo oporne na transdukcję adenowirusem i jak można zobaczyć na Figurze 11 „normalna transdukcja (□, 0 sekund światła bez PLL) tych komórek jest bardzo niska i ulega tylko nieznacznemu zwiększeniu po PCI. Jeśli zastosuje się PLL jako nośnik wydajność transdukcji bez traktowania światłem nieznacznie wzrasta, ale można zauważyć, że PCI w tym przypadku zasadniczo zwiększa transdukcję z wywołanym przez światło wzrostem z 7,5% do 44,5% komórek, które uległy transdukcji w optymalnych warunkach. Zatem zastosowanie połączenia nośnika z technologią PCI może dostarczyć skutecznej transdukcji komórek, które w innych warunkach są bardzo oporne na transdukcję.

P r z y k ł a d 12

Wpływ PCI na transdukcję adenowirusem z zastosowaniem polikationowego dendrymeru SuperFect^® jako nośnika wirusa

Komórki WiDr hodowano i inkubowano z czynnikiem światłouczulającym TPPS_2a (1 μg/ml) w sposób opisany w przykładzie 7. SuperFect^® zakupiono od QIAGEN (3 mg/ml). Zastosowanym adenowirusem był AdHCMV-IacZ.

Kompleksy adenowirus/SuperFect^® przy różnych stężeniach SuperFect^® wytwarzano przez dodawanie różnych ilości SuperFect^® do roztworu adenowirusa i inkubację przez 30 minut, w temperaturze pokojowej.

Usuwano podłoże z 6-studzienkowych płytek i dodawano 200 μl kompleksów adenowirus/SuperFect^® z dawką adenowirusa MOI 5. Komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C (bez dostępu światła). Usuwano 200 μl roztworu, a komórki płukano 1 raz w podłożu. Dodawano 2 ml podłoża i komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C (bez dostępu światła), przed ekspozycją na światło niebieskie w sposób opisany w przykładzie 7. Komórki inkubowano przez 2 dni (ciągle bez dostępu światła) przed badaniem aktywności β-galaktozydazy za pomocą cytometrii przepływowej, w sposób opisany w „Protokołach eksperymentalnych.

Wyniki

W przykładzie 12 wykazano, że PCI jest również skuteczne w połączeniu z innymi niż PLL nośnikami wirusowymi. Zatem, jak pokazano na Figurze 12, kiedy stosuje się dendrymer polikationowy SuperFect^® jako nośnik, PCI może zasadniczo zwiększyć transdukcję genu za pośrednictwem adenowirusa, wtedy gdy nośnik stosuje się w stężeniu niższym niż 50 μg/ml. Maksymalnie, PCI razem z SuperFect^® były w stanie zwiększyć procent komórek, które uległy transdukcji prawie 50-krotnie, w porównaniu z wartościami uzyskiwanymi przy „normalnym zakażeniu (bez PCI i bez SuperFect^®), tymczasem sama PCI bez SuperFect^® dawała maksymalnie 12 krotny wzrost, a sam SuperFec^® dawał wzrost 10 krotny.

P r z y k ł a d 13

Różne schematy czasowe dla naświetlania i podawania adenowirusa

Komórki HCT 116 hodowano i traktowano czynnikiem światłouczulającym TPPS2a w sposób opisany w przykładzie 7. Komórki zakażano adenowirusem Ad-HCMV-LacZ (MOI 5 przez 30 minut) w różnych momentach przed lub po naświetlaniu (które następowało zawsze po 4 godzinach po usunięciu czynnika światłouczulającego). Komórki następnie inkubowano przez 2 dni (ciągle bez dostępu światła) przed badaniem aktywności β-galaktozydazy za pomocą cytometrii przepływowej, w sposób opisany w „Protokołach eksperymentalnych.

Wyniki

Figura 13 przedstawia wpływ czasu traktowania światłem względem czasu dostarczenia wirusa, na wpływ PCI na transdukcję genu za pośrednictwem adenowirusa. Można zauważyć (Figura 13), że naświetlanie PCI jest skuteczne przez długi czas zarówno jeśli wirus jest dostarczany przed jak i po naświetlaniu. Zatem istnieją ramy czasowe o rozpiętości przynajmniej 17 godzin (od podania wirusa na 4 godziny przed naświetlaniem do podania wirusa nawet do 13 godzin po naświetlaniu), w których wirus może być podawany i można przeprowadzać naświetlanie i utrzymany będzie ciągle pozytywny wpływ PCI na transdukcję. Jest to bardzo istotne z klinicznego punktu widzenia, ponieważ pozwala klinicystom na sporą dowolność w planowaniu leczenia i koordynacji z innymi sposobami leczenia, którym poddaje się pacjenta, np. procedurami chirurgicznymi.

PL 213 376 B1

P r z y k ł a d 14

Zwiększenie przez PCI terapeutycznego działania genu z wektora adenowirusowego kodującego kinazę tymidynową wirusa opryszczki pospolitej

Komórki raka gruczołowego HCT116 zakażano adenowirusowym wektorem terapii genowej kodującym gen HSV-tk (AdV-TK) i poddawaniu traktowaniu PCI. Warunki zakażenia opisano w „Protokołach eksperymentalnych (MOI=5). Dwa dni po zakażeniu, dodawano różne stężenia gancyklowiru (GCV), a komórki inkubowano przez następne 3 dni przed oceną przeżywalności komórek sposobem MTT. Ten sposób opiera się na redukcji rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolowej (MTT) do purpurowego, nierozpuszczalnego produktu formazanu przez mitochondrialną dehydrogenazę obecną w żywych, aktywnych metabolicznie komórkach. Do komórek dodaje się 1 ml podłoża zawierającego 0,25 μg MTT, a następnie inkubuje się przez 4 godziny (37°C, 5% atmosfera CO2). Powstające w efekcie kryształki formazanu są rozpuszczane przez dodanie 200 μl isopropanolu (Sigma, MO, USA) do każdej studzienki. Roztwór przenosi się na 96-studzienkową płytkę, która jest odczytywana przez czytnik mikropłytek Multiskan EX (Labsystem, Finlandia) z filtrem pasmowym 570 nm.

Wyniki

Jak można zobaczyć na Figurze 14, zależny od światła wzrost toksyczności GCV można zaobserwować w przypadku trzech różnych dawek GCV w komórkach traktowanych czynnikiem światłouczulającym AlPcS2a, AdV-TK i GCV. Dla porównania, takiego wpływu nie zaobserwowano w grupie kontrolnej komórek otrzymujących wyłącznie czynnik światłouczulający, w grupie otrzymującej czynnik światłouczulający + GCV lub w grupie komórek otrzymujących czynnik światłouczulający i AdV-TK, ale nie GCV. To wykazuje, że wzbudzone przez światło zwiększenie ilości zabitych za pośrednictwem GCV komórek, wynika ze zwiększonego dostarczania genu TK wywołanego przez PCI, prowadzącego do zwiększenia aktywacji proleku GCV. Kombinacja gen HSV-TK/GCV jest szeroko stosowana w klinicznych schematach terapii genowej i ten przykład pokazuje, że PCI może być zastosowane do zwiększenia efektu zabijania komórek przez geny stosowane do terapii genowej raków. Stąd, ten przykład pokazuje, że wpływ PCI na zwiększenie dostarczania genów nie jest ograniczony do genów reporterowych, ale może być zastosowany do genów kodujących białka, które mogą więc pełnić terapeutyczna działanie w komórkach raka.

Claims (43)

1. Sposób in vitro lub ex vivo wprowadzania cząsteczki do komórki, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie komórki z czynnikiem światłouczulającym, kontaktowanie komórki z cząsteczką do wprowadzenia (przenoszoną cząsteczką), która jest związana z nośnikiem wirusowym i naświetlanie komórki światłem o długości fali odpowiedniej do aktywacji czynnika światłouczulającego, przy czym nośnikiem wirusowym jest adenowirus, a przenoszoną cząsteczką cząsteczka kwasu nukleinowego.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórka jest komórką ssaka.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje gen pełnej długości lub cDNA lub inną formę DNA kodującą to samo, lub jego funkcjonalny fragment.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego koduje enzym aktywujący prolek, toksynę białkową, białko indukujące apoptozę, czynnik immunostymulujący, antygen właściwy dla guza, czynnik o właściwościach immunosupresyjnych/przeciwzapalnych, czynnik hamujący angiogenezę, białko indukujące formowanie naczyń, białko rozpoczynające krzepnięcie, przeciwciało wewnątrzkomórkowe lub rekombinowaną toksynę odpornościową.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego koduje antysensowną cząsteczkę RNA, rybozym, aptamer, oligonukleotyd lub oligonukleotyd tworzący tryplet.

6. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że kwas nukleinowy ma długość 20 do 10000 par zasad.

7. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że przenoszona cząsteczka jest polinukleotydem i jest wstawiona do konstruktu wirusowego, który zawiera elementy wirusa konieczne do umożliwienia zapakowania konstruktu do nośnika wirusowego.

8. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że czynnik światłouczulający rozmieszcza się w wewnątrzkomórkowych przedziałach, szczególnie endosomach i lizosomach.

PL 213 376 B1

9. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienny tym, że czynnik światłouczulający jest oddzielony od nośnika wirusowego.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że czynnik światłouczulający i nośnik wirusowy kontaktuje się z komórką kolejno.

11. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 10, znamienny tym, że czynnik światłouczulający jest wybrany z grupy obejmującej TPPS2a, AlPcS2a i inne amfifilowe czynniki światłouczulające.

12. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 10, znamienny tym, że czynnik światłouczulający jest związkiem będącym kwasem 5-aminolewulinowym lub estrami kwasu 5-aminolewulinowego lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami.

13. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 12, znamienny tym, że nośnik wirusowy kontaktuje się z komórką przez 15 minut do 6 godzin.

14. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 13, znamienny tym, że czynnik światłouczulający kontaktuje się z komórką 4 do 24 godzin przed naświetlaniem.

15. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 14, znamienny tym, że etap naświetlania trwa od 1 do 10 minut.

16. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 15, znamienny tym, że nośnik wirusowy dodaje się przed lub po naświetlaniu.

17. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 16, znamienny tym, że czynnik światłouczulający lub nośnik wirusowy lub obydwa dołącza się, wiąże się, lub sprzęga się z jedną lub więcej cząsteczkami nośnika, cząsteczkami kierującymi lub wektorami.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że nośnik wirusowy przyłącza się, wiąże się lub sprzęga się z cząsteczką nośnika.

19. Sposób według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że cząsteczka nośnika obejmuje polikation lub lipid kationowy.

20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że polikationem jest poli-L-lizyna, poli-D-lizyna lub kationowy dendrymer.

21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że lipidem kationowym jest DOTAP.

22. Sposób według zastrz. 18 albo 19, znamienny tym, że cząsteczką nośnika jest liposom lub konstrukt oparty na lipidach.

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że cząsteczką nośnika jest liposom lub konstrukt oparty na lipidach zawierający przynajmniej jeden lipid kationowy.

24. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 23, znamienny tym, że przynajmniej 50% komórek, do których wprowadza się cząsteczkę, nie ulega uśmierceniu.

25. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przenoszoną cząsteczkę w połączeniu z nośnikiem wirusowym i czynnik światłouczulający jak określono w dowolnym z poprzedzających zastrzeżeń, przy czym nośnikiem wirusowym jest adenowirus, a przenoszoną cząsteczką cząsteczka kwasu nukleinowego.

26. Kompozycja według zastrz. 25, do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu chorobie, zaburzeniu lub zakażeniu.

27. Kompozycja według zastrz. 26, do zastosowania w terapii genowej.

28. Kompozycja według zastrz. 27, znamienna tym, że terapię genową osiąga się przez docelowe zabijanie konkretnych komórek, docelowe hamowanie ekspresji genów, leczenie wzmacniające lub naprawienie mutacji przez wprowadzenie genu lub jego części zdolnej do ekspresji funkcjonalnego produktu w celu kompensacji niedoboru u pacjenta.

29. Kompozycja według zastrz. 27 albo 28, znamienna tym, że chorobą, zaburzeniem lub zakażeniem jest rak, reumatoidalne zapalenie stawów, miażdżyca tętnic, zakażenie wirusowe lub inne, łuszczyca, rogowacenie słoneczne, rana, złamanie, brodawka lub wrodzone zaburzenie genetyczne.

30. Kompozycja według zastrz. 27 albo 28 albo 29, znamienna tym, że podawane jest in vivo 10³ do 10¹⁵ cząstek wirusowych.

31. Zastosowanie przenoszonej cząsteczki połączonej z nośnikiem wirusowym i czynnika światłouczulającego jak określono w jednym z zastrz. 1 do 24, przy czym nośnikiem wirusowym jest adenowirus, a przenoszoną cząsteczką cząsteczka kwasu nukleinowego, do wytwarzania leku do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu chorobie, zaburzeniu lub zakażeniu, przy czym lek jest stosowany w sposobie, w którym przenoszona cząsteczka jest wprowadzana do komórki, a sposób obejmuje kontaktowanie komórki z czynnikiem światłouczulającym, kontaktowanie komórki z przenoszoną

PL 213 376 B1 cząsteczką, która jest związana z nośnikiem wirusowym i naświetlanie komórki światłem o długości fali odpowiedniej do aktywacji czynnika światłouczulającego.

32. Zastosowanie według zastrz. 31 w terapii genowej.

33. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że terapię genową osiąga się przez docelowe zabijanie konkretnych komórek, docelowe hamowanie ekspresji genów, leczenie wzmacniające lub naprawienie mutacji przez wprowadzenie genu lub jego części zdolnej do ekspresji funkcjonalnego produktu w celu kompensacji niedoboru u pacjenta.

34. Zastosowanie według jednego z zastrz. 31 do 33, znamienne tym, że chorobą, zaburzeniem lub zakażeniem jest rak, reumatoidalne zapalenie stawów, miażdżyca tętnic, zakażenie wirusowe lub inne, łuszczyca, rogowacenie słoneczne, rana, złamanie, brodawka lub wrodzone zaburzenie genetyczne.

35. Zastosowanie według jednego z zastrz. 31 do 34, znamienne tym, że podawane jest in vivo 10³ do 10¹⁵ cząstek wirusowych.

36. Zastosowanie według jednego z zastrz. 31 do 35, znamienne tym, że przenoszona cząsteczka związana z nośnikiem wirusowym oraz czynnik światłouczulający są przeznaczone do oddzielnego podawania.

37. Zastosowanie przenoszonej cząsteczki i czynnika światłouczulającego do wytwarzania leku zawierającego komórkę wytworzoną sposobem określonym w jednym z zastrz. 1 do 24 do leczenia lub zapobiegania chorobie, zaburzeniu lub zakażeniu.

38. Zastosowanie według zastrz. 37 w terapii genowej.

39. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że terapię genową osiąga się przez docelowe zabijanie konkretnych komórek, docelowe hamowanie ekspresji genów, leczenie wzmacniające lub naprawienie mutacji przez wprowadzenie genu lub jego części zdolnej do ekspresji funkcjonalnego produktu w celu kompensacji niedoboru u pacjenta.

40. Zastosowanie według jednego z zastrz. 37 do 39, znamienne tym, że chorobą, zaburzeniem lub zakażeniem jest rak, reumatoidalne zapalenie stawów, miażdżyca tętnic, zakażenie wirusowe lub inne, łuszczyca, rogowacenie słoneczne, rana, złamanie, brodawka lub wrodzone zaburzenie genetyczne.

41. Zastosowanie według jednego z zastrz. 37 do 40, znamienne tym, że podawane jest in vivo 10³ do 10¹⁵ cząstek wirusowych.

42. Zastosowanie według jednego z zastrz. 37 do 41, znamienne tym, że przenoszona cząsteczka związana z nośnikiem wirusowym oraz czynnik światłouczulający są przeznaczone do oddzielnego podawania.

43. Produkt zawierający przenoszoną cząsteczkę związaną z nośnikiem wirusowym oraz czynnik światłouczulający jak określono w jednym z poprzedzających zastrzeżeń, przy czym nośnikiem wirusowym jest adenowirus, a przenoszoną cząsteczką cząsteczka kwasu nukleinowego, jako preparat złożony do zastosowania razem lub oddzielnie do leczenia lub zapobiegania chorobie, zaburzeniu lub zakażeniu, przy czym produkt jest stosowany w sposobie, w którym przenoszona cząsteczka jest wprowadzana do komórki, a sposób obejmuje kontaktowanie komórki z czynnikiem światłouczulającym, kontaktowanie komórki z cząsteczką przenoszoną, która jest związana z nośnikiem wirusowym i naświetlanie komórki światłem o długości fali odpowiedniej do aktywacji czynnika światłouczulającego.