[go: up one dir, main page]

PL213322B1 - Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca polimer glikolu polialkilenowego skoniugowany z biologicznie aktywnym zwiazkiem lub jego prekursorem oraz jej zastosowania - Google Patents

Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca polimer glikolu polialkilenowego skoniugowany z biologicznie aktywnym zwiazkiem lub jego prekursorem oraz jej zastosowania

Info

Publication number
PL213322B1
PL213322B1 PL372728A PL37272803A PL213322B1 PL 213322 B1 PL213322 B1 PL 213322B1 PL 372728 A PL372728 A PL 372728A PL 37272803 A PL37272803 A PL 37272803A PL 213322 B1 PL213322 B1 PL 213322B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
group
ifn
modified
biologically active
interferon
Prior art date
Application number
PL372728A
Other languages
English (en)
Other versions
PL372728A1 (pl
Inventor
Kochung Lin
R. Blake Pepinsky
Ling Ling Chen
Donna M. Hess
Edward Y. Lin
Russell C. Petter
Darren P. Baker
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of PL372728A1 publication Critical patent/PL372728A1/pl
Publication of PL213322B1 publication Critical patent/PL213322B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/31—Somatostatins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • C08G65/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Description

Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej polimer glikolu polialkilenowego skoniugowany z biologicznie aktywnym związkiem lub jego prekursorem oraz jej zastosowania, w szczególności w kompozycjach farmaceutycznych i w zastosowaniach medycznych.
Kowalencyjne przyłączanie polimerów hydrofilowych, takich jak polimery glikoli polialkilenowych, znanych również jako tlenki polialkilenowe, do cząsteczek i powierzchni aktywnych biologicznie jest przedmiotem zainteresowania w biotechnologii i medycynie.
W szczególnoś ci wiele badań poś wię cono zastosowaniu koniugatów poli(glikolu etylenowego) (PEG), znanego również jako poli(tlenek etylenu) (PEO), do podnoszenia rozpuszczalności i trwałości cząsteczek oraz przedłużania okresu półtrwania cząsteczek w krwiobiegu.
W najbardziej rozpowszechnionej postaci PEG jest polimerem liniowym, zakoń czonym na obu końcach grupami hydroksylowymi:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH.
Powyższy polimer, alfa-,omega-dihydrokyspoli(glikol etylenowy), można również przedstawiać jako HO-PEG-OH, gdzie przyjmuje się, że symbol -PEG- przedstawia następującą jednostkę strukturalną:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2przy czym n zazwyczaj przyjmuje wartości od około 4 do około 10000. PEG jest zwykle stosowany jako metoksy-PEG-OH lub mPEG, w którym jednym z końców jest stosunkowo inertna grupa metoksylowa, a drugim grupa hydroksylowa, która łatwo poddaje się modyfikacjom chemicznym. W dodatku w wielu zastosowaniach zamiast PEG można podstawiać kopolimery losowe lub blokowe różnych tlenków alkilenowych (np. tlenek etylenu i tlenek propylenu), których chemia jest pokrewna PEG.
By doprowadzić do koniugacji PEG z cząsteczką stanowiącą przedmiot zainteresowania, często niezbędna jest aktywacja PEG, przez otrzymanie pochodnej PEG, zawierającej reaktywną grupę funkcyjną na co najmniej jednym końcu. Grupę funkcyjną wybiera się na podstawie typu dostępnej grupy reaktywnej w cząsteczce, z którą sprzęga się z PEG.
PEG jest polimerem charakteryzującym się rozpuszczalnością w wodzie i w wielu rozpuszczalnikach organicznych, brakiem toksyczności i brakiem immunogenności. Jednym z zastosowań PEG jest kowalencyjne przyłączenie polimeru do cząsteczek nierozpuszczalnych by uczynić powstały „koniugat” PEG-cząsteczka rozpuszczalnym. Na przykład, wykazano, że nierozpuszczalny w wodzie lek paklitaksel staje się rozpuszczalny po sprzęgnięciu z PEG. Greenwald i wsp., J. Org. Chem., 60:331-336 (1995).
Podejście związane z prolekami, w którym leki są uwalniane przez degradację cząsteczek bardziej złożonych (proleków) w warunkach fizjologicznych, jest mocnym elementem dziedziny dostarczania leków. Proleki można, na przykład, tworzyć przez wiązanie PEG do leków za pomocą wiązań, które są degradowalne w warunkach fizjologicznych. Czas życia proleków PEG in vivo zależy od typu grup(y) funkcyjnych, tworzących wiązanie między PEG i lekiem. Ogólnie wiązania estrowe, tworzone w reakcji kwasów karboksylowych PEG lub aktywowanych kwasów karboksylowych PEG z grupami alkoholowymi w leku, hydrolizują w warunkach fizjologicznych, uwalniając lek, a wiązania amidowe lub węglanowe, tworzone z grupami aminowymi w leku, są trwałe i nie hydrolizują, nie uwalniając wolnego leku. Wykazano, że hydrolityczne dostarczanie leków z estrów PEG można do pewnego stopnia dogodnie kontrolować, kontrolując liczbę połączonych grup metylenowych w łączniku pomiędzy końcowym tlenem PEG i grupą karbonylową przyłączonego kwasu karboksylowego lub pochodnej kwasu karboksylowego. Na przykład, Harris i wsp. w patencie USA nr 5672662 opisują kwas masłowy PEG i kwas propionowy PEG oraz ich aktywowane pochodne jako alternatywę dla karboksymetylo PEG w zwią zkach, gdzie pożądana jest niniejsza reaktywność hydrolityczna odpowiadających pochodnych estrowych. Ogólnie, zobacz publikację PCT WO 01/46291.
Jednym z czynników ograniczających przydatność substancji pochodzenia białkowego w zastosowaniach w terapii medycznej jest to, że gdy podaje się je pozajelitowo, to są eliminowane z organizmu w krótkim czasie. Ta eliminacja może zajść w wyniku degradacji przez proteazy lub przez normalne szlaki oczyszczania organizmu z białek, takie jak filtracja w nerkach. Podawanie doustne tych substancji jest jeszcze bardziej problematyczne, gdyż oprócz proteolizy w żołądku, wysoka kwasowość w żołądku niszczy te substancje, zanim dotrą do zamierzonej tkanki docelowej. Problemy, zwiąPL 213 322 B1 zane z tymi drogami podawania białek są dobrze znane w przemyśle farmaceutycznym, a w próbach ich rozwiązania stosuje się rozmaite strategie. Opublikowano bardzo wiele prac, dotyczących stabilizacji białek. Znane są różne sposoby sprzęgania białek z materiałami polimerycznymi, takie jak stosowanie dekstranów, poliwinylopirolidonów, glikopeptydów, glikolu polietylenowego i poliaminokwasów. Donosi się, że uzyskiwane w ten sposób polipeptydy sprzężone zachowują aktywność biologiczną i rozpuszczalność w wodzie dla zastosowań pozajelitowych.
Szczególnie interesujące jest podwyższanie aktywności biologicznej interferonów, wraz z obniżaniem toksyczności, związanej ze stosowaniem tych białek w leczeniu ludzi. Interferony są rodziną występujących naturalnie małych białek i glikoprotein, wytwarzanych i wydzielanych przez większość komórek jądrzastych w reakcji na infekcję wirusową i inne bodźce antygenowe. Interferony nadają komórkom odporność na infekcje wirusowe i wykazują wielką rozmaitość sposobów działania na komórki. Realizują swoją aktywność komórkową przez wiązanie do swoistych receptorów błonowych na powierzchni komórki. Po związaniu do błony komórkowej, interferony zapoczątkowują złożoną sekwencję zdarzeń wewnątrzkomórkowych. Badania in vitro wykazały, że należą do nich indukcja pewnych enzymów, hamowanie proliferacji komórek, aktywność immunomodulacyjna, w tym podnoszenie aktywności fagocytozy makrofagów, wzmaganie swoistej cytotoksyczności limfocytów wobec komórek docelowych oraz hamowanie replikacji wirusa w zainfekowanych przez wirusy komórkach.
Interferony sprawdzano w leczeniu rozmaitych klinicznych stanów chorobowych. Ustalono zastosowanie ludzkiego interferonu beta w leczeniu stwardnienia rozsianego. Niedawno wydano zgodę na stosowanie dwóch form rekombinowanego interferonu beta w Europie i USA w leczeniu tej choroby: interferonu-beta-1a (AVONEX®, Biogen, Inc., Cambridge, MA i REBIF®, Serono, Genewa, Szwajcaria) oraz interferonu-beta-1b (BETASERON®, Berle, Richmond, CA). Interferon-beta-1a jest wytwarzany w komórkach ssaków z użyciem naturalnej sekwencji genu człowieka i jest glikozylowany, podczas gdy interferon-beta-1b jest wytwarzany w bakteriach E. coli z użyciem zmodyfikowanej sekwencji genu człowieka, która zawiera uzyskane metodami inżynierii genetycznej podstawienie seryna za cysteinę w pozycji aminokwasowej 17 i jest nieglikozylowany.
Wiadomo, że nieimmunologiczne interferony, do których zaliczają się zarówno interferony alfa, jak i beta, hamują wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV) w komórkach zainfekowanych ostro, jak i chronicznie. Zobacz Poli i Fauci, 1992, AIDS Research and Human Retroviruses 8(2):191-197. Ze względu na ich aktywność antywirusową, zwrócono znaczną uwagę na interferony, zwłaszcza interferony alfa, jako czynniki terapeutyczne w leczeniu chorób związanych z wirusem żółtaczki typu C(HCV). Zobacz Hoofnagle i wsp., w: Viral Hepatitis 1981 International Symposium, 1982, Philadelphia, Franklin Institute Press; Hoofnagle i wsp., 1986, New Eng. J. Med. 315:1575-1578; Thomson, 1987, Lancet 1:539-541 Kiyosawa wsp., 1983, w: Zuckerman, wyd., Viral Hepatitis and Liver Disease, Allen K. Liss, New York str. 895-897; Hoofnagle i wsp., 1985, Sem. Liv. Dis., 1985, 9:259-263.
Koniugaty interferon-polimer opisano na przykład w patencie USA nr 4766106, patencie USA nr 4917888, europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0510356 i publikacji zgłoszenia międzynarodowego nr WO 95/13090.
Przewlekłe zapalenie wątroby typu C jest chorobą podstępną i postępującą powoli, która ma znaczny wpływ na jakość życia. Pomimo poprawy jakości puli dawców krwi i niedawnego wprowadzenia badania oddawanej krwi na HCV, ocenia się częstość infekcji ostrych wśród osób otrzymujących transfuzje na 5 do 10%. Zobacz Alter i wsp. w Zuckerman, wyd., Viral Hepatitis and Liver Disease, Allen K. Liss, New York 1988, str. 537-542. Spośród zatem w przybliżeniu 3 milionów osób, które co roku otrzymują transfuzje w Stanach Zjednoczonych ostre zapalenie wątroby typu C rozwinie się mniej więcej u 150000. O ile u wielu pacjentów, którzy ulegają zarażeniu zapaleniem wątroby typu C, rozwinie się schorzenie subkliniczne lub łagodne, to około 50% przejdzie w stadium choroby przewlekłej, charakteryzującej się fluktuującymi odchyleniami poziomu transaminazy w surowicy i zmianami zapalnymi w biopsjach wątroby. Ocenia się, że marskość wątroby wystąpi być może aż u około 20% z tej grupy. Zobacz Koretz i wsp., 1985, Gastroenterology 88: 1251-1254.
Wiadomo, że interferony wpływają na wiele funkcji komórkowych, takich jak replikacja DNA i synteza RNA i białek, zarówno w komórkach normalnych, jak i anormalnych. Efekty cytotoksyczne interferonu nie są zatem ograniczone do komórek nowotworowych lub zainfekowanych przez wirusa, ale ujawniają się też w normalnych, zdrowych komórkach. W wyniku tego podczas leczenia interferonem mogą pojawić się niepożądane efekty uboczne, zwłaszcza gdy wymagane są duże dawki. Podawanie interferonu może prowadzić do zahamowania czynności szpiku, prowadząc zatem do zmniejszenia liczności krwinek czerwonych oraz obniżenia poziomu krwinek białych i płytek. Interferony wy4
PL 213 322 B1 wołują zazwyczaj objawy grypopodobne (np. gorączkę, uczucie zmęczenia, bóle głowy i dreszcze), zaburzenia żołądkowo-jelitowe (np. brak łaknienia, nudności i biegunka), zawroty głowy i kaszel. Długotrwała odpowiedź pacjentów HCV na leczenie interferonem niezmodyfikowanym za pomocą PEG jest często słaba, a leczenie może wywołać drastyczne efekty uboczne, obejmujące, lecz nieograniczające się do retynopatii, zapalenia tarczycy, ostrego zapalenia trzustki i depresji.
Niepożądane efekty uboczne, które towarzyszą terapii interferonem, często ograniczają przydatność leczniczą schematów leczenia interferonem. Istnieje zatem potrzeba podtrzymania lub udoskonalenia korzyści leczniczych takiej terapii, przy jednoczesnym obniżeniu lub wyeliminowaniu niepożądanych efektów ubocznych.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku posiada strukturę określoną wzorem XXII:
w którym P oznacza polimer glikolu polialkilenowego;
X oznacza O;
każdy spośród Z i Z' oznacza niezależnie atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20, przy czym podstawniki wybiera się z grupy, składającej się z atomu fluorowca, grupy hydroksylowej, karbonylowej, karboksylanowej, estrowej, formylowej, acylowej, tiokarbonylowej, tioestrowej, tiooctanowej, tiomrówczanowej, alkoksylowej, fosforylowej, fosfonianowej, fosfmianowej, aminowej, amidowej, amidynowej, iminowej, cyjanowej, nitrowej, azydowej, sulfhydrylowej, siarczanowej, sulfonianowej, sulfamoilowej, sulfonamidowej, sulfonylowej, heterocyklilowej, aralkilowej, reszty aromatycznej, reszty heteroaromatycznej, grupy iminowej, sililowej, eterowej i alkilotiolowej, pod warunkiem, że przynajmniej jeden z Z lub Z' nie oznacza atomu wodoru;
R* oznacza resztę łącznikową utworzoną w reakcji reszty, wybieranej z grupy, składającej się z reszty aldehydowej, hydratu aldehydu i reszty acetalowej ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem;
B oznacza biologicznie aktywny zwią zek, przy czym biologicznie aktywny zwią zek lub jego prekursor obejmuje interferon;
każdy spośród n oznacza niezależnie 0 lub liczbę całkowitą od 1 do 5, a p oznacza 1, 2 lub 3.
W korzystnej postaci wykonania kompozycja farmaceutyczna wedł ug wynalazku posiada strukturę określoną wzorem XXIIa:
Wzór XXIIa
P-X-(CH2)n-CH-R*-B
Z w którym P, X, R', R*, B i n mają znaczenie określone powyż ej; oraz Z oznacza nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20, przy czym podstawniki wybiera się z grupy składającej się
PL 213 322 B1 z atomu fluorowca, grupy hydroksylowej, karbonylowej, karboksylanowej, estrowej, formylowej, acylowej, tiokarbonylowej, tioestrowej, tiooctanowej, tiomrówczanowej, alkoksylowej, fosforylowej, fosfonianowej, fosfinianowej, aminowej, amidowej, amidynowej, iminowej, cyjanowej, nitrowej, azydowej, sulfhydrylowej, siarczanowej, sulfonianowej, sulfamoilowej, sulfonamidowej, sulfonylowej, heterocyklilowej, aralkilowej, reszty aromatycznej, reszty heteroaromatycznej, grupy iminowej, sililowej, eterowej i alkilotiolowej.
Korzystnie P w kompozycji według wynalazku oznacza glikol polietylenowy o strukturze określonej wzorem II:
Wzór II
E-(O-CH2CH2)a-, w którym E oznacza atom wodoru, grupę alkilową C1 do C6 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym lub wykrywalny znacznik i a oznacza liczbę całkowitą od 4 do 10000.
Korzystnie E oznacza grupę metylową. Również korzystnie E oznacza wykrywalny znacznik, a korzystniej znacznik wybrany z grupy składającej się z izotopów radioaktywnych, reszt fluoryzujących, reszt fosforyzujących, reszt chemiluminescencyjnych i kropek kwantowych.
W jednej postaci wykonania R* jest metylenem, a B jest biologicznie aktywnym związkiem związanym przez aminę, korzystniej końcową aminę peptydu włączonego do biologicznie aktywnego związku.
W korzystnej postaci wykonania peptydem w łączonym do biologicznie aktywnego zwią zku zawartego w kompozycji według wynalazku jest interferon, korzystniej interferon-beta, a najkorzystniej interferon-beta-1a.
W kolejnym aspekcie wynalazku kompozycja farmaceutyczna posiada strukturę według wzoru XXII, zdefiniowanego powyżej, w którym
R* oznacza resztę łącznikową, która powstaje w reakcji R z reaktywną resztą związku aktywnego biologicznie lub jego prekursora; oraz
B oznacza niezależnie biologicznie aktywny związek lub jego prekursor obejmujące interferon; przy czym kompozycja obejmuje produkt reakcji aktywowanego polimeru glikolu polialkilenowego i biologicznie aktywnego związku lub jego prekursora, a aktywowany polimer glikolu polialkilenowego ma strukturę określoną wzorem X:
w którym P oznacza polimer glikolu polialkilenowego;
X oznacza O;
Z' oznacza H;
Z oznacza nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową Iub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, w której grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20, przy czym podstawniki są wybrane z grupy składającej się z atomu fluorowca, grupy hydroksylowej, karbonylowej, karboksylanowej, estrowej, formylowej, acylowej, tiokarbonylowej, tioestrowej, tiooctanowej, tiomrówczanowej, alkoksylowej, fosforylowej, fosfonianowej, fosfinianowej, aminowej, amidowej, amidynowej, iminowej, cyjanowej, nitrowej, azydowej, sulfhydrylowej, siarczanowej, sulfonianowej, sulfamoilowej, sulfonamidowej, sulfonylowej, heterocyklilowej, aralkilowej, reszty aromatycznej, reszty heteroaromatycznej, grupy iminowej, sililowej, eterowej i alkilotiolowej;
R oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o wzorze X i biologicznie aktywnym związkiem lub jego prekursorem, przy czym R jest wybrana z grupy składającej się z aldehydu, hydratu aldehydu i reszty acetalowej;
PL 213 322 B1 n oznacza 0 dla -(CH2)n- pomię dzy R* i -(CZZ')-;
n oznacza 0 lub liczbę cał kowitą od 1 do 5 dla -(CH2)n- pomię dzy -(CZZ')- i X, a p oznacza 1, 2 lub 3.
W korzystnej postaci wykonania kompozycja farmaceutyczna wedł ug wynalazku zawiera dodatkowo dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutycznej według wynalazku do zastosowania w medycynie. Korzystnie jest ona stosowana jako lek do leczenia pacjenta podatnego na infekcję wirusową, w szczególności zapalenie wątroby typu C.
Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje ponadto środek aktywny biologicznie wybrany z grupy, składającej się z niskocząsteczkowego środka antywirusowego, środka antywirusowego opartego o kwas nukleinowy i peptydowego środka antywirusowego.
Korzystniej środek antywirusowy do zastosowania w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku wybrany jest z grupy, składającej się z rybawiryny, Ievowiryny, 3TC, FTC, MB686, zidowudyny, acyklowiru, gancyklowiru, viramidu, VX-497, VX-950 i ISIS-14803.
O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe, zastosowane tutaj, mają te same typowe znaczenia, które przyjęłaby osoba o standardowych umiejętnościach w dziedzinie, do której należy ten wynalazek. Choć w realizacji lub testowaniu niniejszego wynalazku można wykorzystać sposoby i materiały podobne lub równoważne tym, które tu opisano, to odpowiednie sposoby i materiał y opisano poniż ej. Wszystkie publikacje, zgł oszenia patentowe, patenty i inne odnoś niki, wzmiankowane tutaj, są włączone w całości na drodze odniesienia. W przypadku konfliktu ważny jest niniejszy opis, włączając definicje. W dodatku, materiały, sposoby i przykłady służą tylko jako ilustracja i nie ograniczenie.
Inne cechy i zalety wynalazku staną się jasne na podstawie poniższego szczegółowego opisu oraz zastrzeżeń.
Krótki opis rysunków
Niniejszy wynalazek będzie można zrozumieć na podstawie poniższego opisu, z odniesieniem do rysynków, w których:
Fig. 1 przedstawia redukujący żel SDS-PAGE, ukazujący czystość IFN-e-1a niezmodyfikowanego i IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu. Ścieżka A: markery masy cząsteczkowej (od góry do dołu odpowiednio 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa i 18 kDa); Ścieżka B: 4 μg IFN-e-1a niezmodyfikowanego; Ścieżka C: 4 μg IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu.
Fig. 2 pokazuje przebiegi sączenia molekularnego IFN-e-1a niezmodyfikowanego i IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu. Panel A: standardy masy cząsteczkowej; Panel B: IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu; Panel C: IFN-e-1a niezmodyfikowany.
Fig. 3 przebieg sączenia molekularnego IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu.
Fig. 4 przedstawia redukujący żel SDS-PAGE, ukazujący czystość IFN-e-1a niezmodyfikowanego i IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu. Ścieżka A: 2,5 μg IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu; Ścieżka B: 2,5 μg IFN-e-1a niezmodyfikowanego; Ścieżka C: markery masy cząsteczkowej (od góry do dołu odpowiednio 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa i 18 kDa).
Fig. 5 pokazuje przebiegi sączenia molekularnego IFN-e-1a niezmodyfikowanego i IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu. Panel A: standardy masy cząsteczkowej; Panel B: IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu.
Fig. 6 przedstawia redukujący żel SDS-PAGE, ukazujący trwałość IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu. Ścieżka A: markery masy cząsteczkowej (od góry do dołu odpowiednio 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa i 18 kDa); Ścieżki B, C, D i E: 2 μg IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu, pobranego do testu w dniach odpowiednio 0, 2, 5 i 7.
Fig. 7 A-B ukazuje aktywność antywirusową próbek różnych ludzkich IFN-e-1a, zmodyfikowanych za pomocą PEG, w funkcji stężenia białka: Fig. 7A; IFN-e-1a niezmodyfikowany (o), IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu (□), IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu (Δ) oraz IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu (◊). Fig. 7B; IFN-e-1a
PL 213 322 B1 niezmodyfikowany (o), IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenylo-acetaldehydu (□), IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenylopropionoaldehydu (Δ) oraz IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-m-fenyloacetaldehydu (◊).
Fig. 8 A-B to wykresy, przedstawiające farmakokinetykę próbek IFN-e-1a niezmodyfikowanego i rozmaitych IFN-e-1a zmodyfikowanych za pomocą PEG: Fig. 8A: IFN-e-1a niezmodyfikowany (panel górny) i IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu (panel dolny). Fig 8B: IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu (panel górny) i 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu (panel dolny).
Fig. 9 A-B to wykresy, przedstawiające farmakokinetykę próbek IFN-e-1a niezmodyfikowanego i rozmaitych IFN-e-1a zmodyfikowanych za pomocą PEG: Fig. 9A: IFN-e-1a niezmodyfikowany (panel górny) i IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenylopropionoaldehydu (panel dolny). Fig. 9B: IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-fenyloacetaldehydu (panel górny) i 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu (panel dolny).
Fig. 10 to wykres słupkowy, porównujący podanie jednorazowe IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu z codziennym podawaniem IFN-e-1a niezmodyfikowanego, pod względem obniżania liczby zorientowanych radialnie nowych naczyń krwionośnośnych w myszach nu/nu, niosących komórki ludzkiego czerniaka złośliwego SK-MEL-1: podanie nośnika jako kontroli raz, tylko w dniu (słupek A); podanie 1 MU (5 μg) IFN-e-1a niezmodyfikowanego raz dziennie w dniach 1-9 włącznie (słupek B); podanie 1 MU (10 μg) IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu raz, tylko w dniu 1 (słupek C) oraz podawanie nośnika jako kontroli raz dziennie w dniach 1-9 włącznie (słupek D).
Szczegółowy opis wynalazku
Niniejszym ujawniono związki i sposoby, przydatne w leczeniu różnych chorób i zaburzeń. Jak wyjaśniono szczegółowo poniżej, do takich chorób i zaburzeń należą w szczególności te, które są podatne na leczenie za pomocą terapii interferonowej, obejmując, ale nie ograniczając się do infekcji wirusowych, takich jak infekcje związane z zapaleniem wątroby oraz choroby z autoagresji, takie jak stwardnienie rozsiane.
Niniejszym ujawniono zaktywowane związki glikoli polialkilenowych o wzorze I:
Wzór I p - X-Q- (Y)m- (CH2)n-CH- R
Z gdzie P jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, takim jak polimer glikolu polialkilenowego. Nieograniczająca lista takich polimerów obejmuje inne homopolimery tlenków polialkilenów, takie jak glikole polipropylenowe, poliole polioksyetylenowane, ich kopolimery oraz ich kopolimery blokowe. Do innych przykładów odpowiednich rozpuszczalnych w wodzie i niepeptydowych szkieletów polimerowych należą poli(oksyetylowany poliol), polialkohol olefinowy), poli(winylopirolidon), poli(hydroksypropylometakrylamid), poli(a-hydroksykwas), poli(alkohol winylowy), polifosfazen, polioksazolina, poli(N-akryloilomorfolina) oraz ich kopolimery, terpolimery i mieszaniny. Szkieletem polimerowym może być poli(glikol etylenowy) lub monometoksy glikol polietylenowy (mPEG), posiadający średnią masę molekularną od około 200 Da do około 400000 Da. Należy wziąć pod uwagę, że przydatne do praktykowania tego wynalazku są również odpowiednie inne spokrewnione polimery i że przyjmuje się, że termin PEG lub poli(glikol etylenowy) jest w tym względzie rozszerzający, a nie ograniczający. Termin PEG obejmuje poli(glikol etylenowy) w każdej jego postaci, w tym alkoksy PEG, dwufunkcyjny PEG, wieloramienny PEG, rozwidlony PEG, rozgałęziony PEG, boczny PEG, lub PEG, zawierający wiązania degradowane.
W klasie związków, reprezentowanych przez Wzór I pomiędzy Y i atomem węgla, do którego przyłączony jest Z znajduje się od zera do pięciu grup metylenowych (tj. n oznacza zero lub liczbę całkowitą od jeden do pięć), a m oznacza zero lub jeden, tj. Y jest obecny lub nieobecny.
X i Y oznaczają niezależnie grupę O, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR', SO2NR5 lub NR'. W pewnych wykonaniach X i Y oznaczają tlen.
Q oznacza nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8 (włączając struktury pierścieniowe bicykliczne skondensowane i z mostkami), podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową, albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową lub
PL 213 322 B1 heteroaryloalkilową, w której grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20, gdzie podstawniki wybiera się z grupy, składającej się z grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sulfamoilowych, sulfonianowych, sililowych, eterowych i alkilotiolowych.
Podstawnik Z oznacza atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub cykliczną grupę heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Podstawniki mogą należeć do grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sulfamoilowych, sulfonianowych, sililowych, eterowych i alkilotiolowych.
Gdy X lub Y oznacza NR', to R' może oznaczać atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub cykliczną grupę heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Podstawniki mogą należeć do grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sulfamoilowych, sulfonianowych, sililowych, eterowych i alkilotiolowych.
R oznacza reaktywną grupę funkcyjną, tj. resztę aktywującą zdolną do reagowania z utworzeniem łącznika lub wiązania między związkiem o Wzorze I i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem. R reprezentuje zatem „grupę aktywującą” zaktywowanych związków glikoli polialkilenowych (PGC), reprezentowanych przez Wzór I. R może oznaczać na przykład resztę kwasu karboksylowego, estrową, aldehydową, hydratem aldehydu, resztą acetalową, grupą hydroksylową, zablokowaną grupą hydroksylową, resztą węglanową, grupą alkenylową, resztą akrylanową, metakrylanową, akrylamidową, podstawioną lub niepodstawioną resztą tiolową, halogenową, podstawioną lub niepodstawioną aminową, zablokowaną aminową, hydrazydową, zablokowaną hydrazydową, sukcynimidylową, izocyjanianową, izotiocyjanianową, ditiopirydynową, winylopirydynową, jodoacetamidową, epoksydową, hydroksysukcynimidylową, azolową, maleimidową, sulfonową, allilową, winylosulfonową, trezylową, sulfo-N-sukcynimidylową, dionową, mesylową, tosylową lub glioksalową. W szczególnych wykonaniach R oznacza hydrat aldehydu.
Do szczególnych przykładów R w literaturze należą węglan N-sukcynimidylu (zobacz np. patenty USA nr 5281698, 5468478), amina (zobacz np. Buckmann i wsp. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zaplipsky i wsp. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hydrazyd (zobacz np. Andresz i wsp. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), popionian sukcynimidylu i propionokarboksylan sukcynimidylu (zobacz np. Olson i wsp. w Poly (ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, str. 170-181, Harris i Zaplipsky Wyd., ACS Washington DC, 1997; zobacz również patent USA nr 5672662) bursztynian sukcynimidylu (zobacz np. Obuchowski i wsp. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) i Joppich i wsp. Makromol. Chem. 180:1381(1979)), ester sukcynimidylu (zobacz np. patent USA nr 4670417), węglan benzotriazolu (zobacz np. patent USA nr 55650234), ester glicydylu (zobacz np. Pitha i wsp. Eur. J. Biochem. 94:11(1979), Elling i wsp. Biotech. Appl. Biochem. 13:354(1991), oksykarbonyloimidazol (zobacz np. Beauchamp i wsp. Anal Biochem. 131:25 (1983), Tondelli i wsp. J. Controlled Release 1:251 (1985)), węglan p-nitrofenylu (zobacz np. Veronese i wsp. Appl Biochem. Biotech., 11:141
PL 213 322 B1 (1985) i Sartore i wsp. Appl. Biochem. Biotech., 27:4510 (1991)), aldehyd (zobacz np. Harris i wsp. J. Polym. Sci. Chem. Ed 22:341 (1984), patent USA nr 5824784, patent USA nr 5252714), maleimid (zobacz np. Goodson i wsp. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani i wsp. w Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984) i Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopirydylodisiarczek (zobacz np. Woghiren i wsp. Bioconj. Chem. 4:314 (1993)), akrylol (zobacz np. Sawhney 15 i wsp. Macromolecules 26:581 (1993)), winylosulfon (zobacz np. patent USA nr 5900461). Dodatkowo dwie cząsteczki polimeru tego wynalazku można również połączyć z aminokwasem lizyną, tworząc dwupodstawioną lizynę, którą można dalej aktywować za pomocą N-hydroksysukcynimidu, tworząc aktywną grupę N-sukcynimidylową (zobacz np. patent USA nr 5932462).
Terminy „grupa funkcyjna”, „reszta aktywna”, „grupa aktywna”, „miejsce reaktywne”, „grupa reaktywna chemicznie” i „reszta reaktywna chemicznie” są stosowane w dziedzinie i tutaj, by odnieść się do odrębnych, definiowalnych części lub jednostek cząsteczki. Te terminy są częściowo synonimiczne w praktyce chemicznej i są stosowane tutaj do wskazania części cząsteczek, posiadających charakterystyczną aktywność chemiczną i zazwyczaj reaktywnych w stosunku do innych cząsteczek. Termin „aktywny”, gdy używa się go w odniesieniu do grup funkcyjnych, ma na celu objęcie tych grup funkcyjnych, które chętnie reagują z grupami elektrofilowymi lub nukleofilowymi w innych cząsteczkach, w odróż nieniu do tych grup, które wymagają silnych katalizatorów lub bardzo niepraktycznych warunków reakcji, by zareagowały. Na przykład, jak rozumie się to w dziedzinie, termin „ester aktywny” obejmuje te estry, które łatwo reagują z grupami nukleofilowymi, takimi jak aminy. Aktywny ester zazwyczaj reaguje z aminą w środowisku wodnym w ciągu minut, gdy tymczasem niektóre estry, takie jak estry metylowe lub etylowe, wymagają silnych katalizatorów by zareagowały z grupą nukleofilową.
W związkach według wynalazku zdefiniowanych powyżej grupa funkcyjna R staje się grupą łącznikową, R*, po reakcji z cząsteczką aktywną biologicznie, tworzącej łącznik lub wiązanie pomiędzy zaktywowanym związkiem glikolu polialkilenowego (PGC) i związkiem aktywnym biologicznie. B oznacza zatem związek aktywny biologicznie po koniugowaniu z PGC, a R* oznacza resztę, powstałą w reakcji R w zaktywowanym PGC z jedną lub wię kszą liczbą reaktywnych grup funkcyjnych w zwią zku aktywnym biologicznie, B, w taki sposób, że pomiędzy PGC i związkiem aktywnym biologicznie tworzy się pojedyncze wiązanie kowalencyjne. W korzystnym wykonaniu R* oznacza resztę, utworzoną w reakcji R w zaktywowanym PGC z pojedynczą reaktywną grupą funkcyjną w związku aktywnym biologicznie, w taki sposób, że pomiędzy zaktywowanym związkiem glikolu polialkilenowego PGC i związkiem aktywnym biologicznie tworzy się wiązanie kowalencyjne.
Korzystne jest, gdy związek aktywny biologicznie lub jego prekursor (B) nie ulega niekorzystnej zmianie w obecności PGC. W dodatku B albo naturalnie posiada grupę funkcyjną, która może reagować i tworzyć łącznik z aktywowanym PGC, albo jest modyfikowana w celu wprowadzenia takiej grupy reaktywnej.
Należy rozumieć, że rekursor B jest nieaktywną lub mniej aktywną formą B, która zmienia się odpowiednio w formę aktywną lub bardziej aktywną w kontakcie z warunkami fizjologicznymi, tj. przy podaniu pacjentowi. Takie zmiany mogą być zmianami konformacyjnymi lub strukturalnymi, obejmując, ale nie ograniczając się do zmiany z formy zablokowanej w formę odblokowaną B. Zgodnie z użyciem tutaj, taka zmiana nie obejmuje uwalniania koniugowanych PGC tego wynalazku.
Zgodnie ze znanym w dziedzinie znaczeniem, termin „zablokowany” dotyczy obecności grupy lub reszty blokującej, która zapobiega reakcji reaktywnej chemicznie grupy funkcyjnej w pewnych warunkach reakcji. Grupa blokująca zmienia się w zależności od typu blokowanej grupy reaktywnej chemicznie. Na przykład jeśli grupą reaktywną chemicznie jest amina lub hydrazyd, to grupę blokującą można wybrać z grupy tert-butyloksykarbonylu (t-BOC) i 9-fluorenylometoksykarbonylu (Fmoc). Jeśli grupą reaktywną chemicznie jest tiol, to grupą blokującą może być ortopirydylodisiarczek. Jeśli grupą reaktywną chemicznie jest kwas karboksylowy, taki jak kwas propanokarboksylowy lub propionowy lub grupa hydroksylowa, to grupą blokującą może być benzyl lub grupa alkilowa, taka jak metyl lub etyl. W wynalazku moż na zastosować inne grupy blokują ce, znane w dziedzinie.
Terminy „reszta łącznikowa”, „połączenie” lub „łącznik” stosowane niniejszym dotyczą reszt lub wiązań, które tworzą się w wyniku reakcji chemicznej i są zawyczaj wiązaniami kowalencyjnymi. Zatem połączenie, reprezentowane przez wiązanie R*-B w powyższych wzorach, tworzy się w reakcji pomiędzy zaktywowaną resztą, R, w PGC ze związkiem aktywnym biologicznie, tj. B'. R* jest resztą łączącą utworzonąz R w reakcji z B', a B jest związkiem aktywnym biologicznie, skoniugowanym z PGC w reakcji grupy funkcyjnej w B' z R.
PL 213 322 B1
Termin „związek aktywny biologicznie” zgodnie z niniejszym znaczeniem dotyczy tych związków, które wykazują jeden lub więcej rodzajów reakcji od działania biologicznego po podaniu pacjentowi oraz zawierają grupy reaktywne, które zawierają reszty reaktywne, które mogą reagować i łączyć się z przynajmniej jednym PGC według wynalazku. Stosowany niniejszym termin „cząsteczka aktywna biologicznie”, „reszta aktywna biologicznie” lub „czynnik aktywny biologicznie” oznacza każdą substancję, która może wpłynąć na jakąkolwiek spośród właściwości fizycznych lub biochemicznych dowolnego podmiotu, obejmując, ale nie ograniczając się do wirusów, bakterii, grzybów, roślin, zwierząt i ludzi. W szczególności, zgodnie z użyciem tutaj, cząsteczki aktywne biologicznie obejmują wszelkie substancje przeznaczone do diagnozy, leczenia, łagodzenia, traktowania lub zapobiegania chorobie człowieka lub innych zwierząt lub te, które w inny sposób podnoszą dobrostan fizyczny lub psychiczny ludzi lub zwierząt.
Przykłady cząsteczek aktywnych biologicznie obejmują, lecz nie ograniczają się do peptydów, analogów peptydów, białek, enzymów, małych cząsteczek, barwników, lipidów, nukleozydów, oligonukleotydów, analogów oligonukleotydów, cukrów, oligosacharydów, komórek, wirusów, liposomów, mikrocząstek, powierzchni i miceli.
Klasy środków aktywnych biologicznie, które są przydatne do zastosowania wraz z wynalazkiem obejmują, lecz nie ograniczają się do chemokin, limfokin, przeciwciał, rozpuszczalnych receptorów, środków przeciwnowotworowych, środków przeciwlękowych, hormonów, czynników wzrostu, antybiotyków, środków grzybobójczych, środków grzybostatycznych, środków antywirusowych, środków sterydowych, środków przeciwdrobnoustrojowych, środków bakteriobójczych, środków przeciwgorączkowych, środków przeciwcukrzycowych, środków rozszerzających oskrzela, środków przeciwbiegunkowych, środków rozszerzających naczynia wieńcowe, glikozydów, spazmolityków, środków przeciw nadciśnieniu, środków przeciwdepresyjnych, środków przeciwlękowych, innych środków psychoterapeutycznych, kortykosterydów, środków przeciwbólowych, środków antykoncepcyjnych, niesterydowych środków przeciwzapalnych, środków obniżających poziom glukozy we krwi, środków obniżających poziom cholesterolu, środków przeciwdrgawkowych, innych środków antyepileptycznych, immunomodulatorów, antycholinergików, sympatolityków, sympatomimetyków, środków rozszerzających naczynia krwionośne, antykoagulantów, środków antyarytmicznych, prostaglandyn o różnych aktywnościach farmakologicznych, diuretyków, środków nasennych, środków antyhistaminowych, środków przeciwnowotworowych, środków onkolitycznych, antyandrogenów, środków przeciwmalarycznych, środków przeciwprądowych oraz innych rodzajów leków. Zobacz Goldman and Gilman's The Basis of Therapeutics (Ninth Edition, Pergamon Press, Inc. USA, 1996) oraz The Merck Index (Thirteenth Edition, Merck & Co., Inc., USA, 2001).
Do związków aktywnych biologicznie należą wszelkie związki, które wykazują w danej postaci odpowiedź biologiczną oraz wszelkie związki, które wykazują odpowiedź biologiczną w wyniku konwersji chemicznej z danej postaci. Na przykład, do związków aktywnych biologicznie należą wszelkie związki, które zawierają grupy blokujące, po odcięciu których pojawiają się związki, które wykazują odpowiedź biologiczną. Takie cięcie może być na przykład wynikiem reakcji związku in vivo z enzymem endogennym lub reakcji związku przed jego podaniem, w tym reakcji ze zaktywowanym PGC. Jako dalszy przykład, do związków aktywnych biologicznie należą wszelkie związki, które ulegają stereotransformacji, in vivo lub ex vivo, tworząc związki, które wykazują odpowiedź lub reakcję biologiczną.
Związki aktywne biologicznie zawierają zazwyczaj kilka miejsc reaktywnych, w których może zajść kowalencyjne przyłączenie zaktywowanego PGC. Na przykład, grupy aminowe mogą ulec acylowaniu, grupy sulfhydrylowe mogą ulec reakcjom addycji i alkilowania, grupy karbonylowe i karboksylowe mogą ulec acylowaniu, a grupy aldehydowe i hydroksylowe mogą ulec aminacji i aminacji redukcyjnej. Do otrzymania zmodyfikowanych za pomocą glikoli polialkilenowych związków aktywnych biologicznie według wynalazku można wykorzystać jedną lub więcej takich reakcji. Ponadto związki aktywne biologicznie można zmodyfikować tak, by utworzyć w nich reszty reaktywne, które ułatwiają takie reakcje i koniugację ze zaktywowanym PGC.
Specjaliści w dziedzinie dostrzegą dostępność licznych mechanizmów reakcji mających na celu umożliwienie koniugacji zaktywowanego PGC ze związkiem aktywnym biologicznie. Na przykład, gdy resztą aktywującą, R, jest grupa hydrazydowa, to można ją sprząc kowalencyjnie z resztami sulfhydrylowymi, cukrowymi i karbonylowymi w związkach aktywnych biologicznie (po utlenieniu tych reszt z utworzeniem aldehydów). Reakcja reszt aktywujących hydrazydy (R) z aldehydami w związkach aktywnych biologicznie (B') wytwarza łącznik hydrazonowy (R*-B). Gdy R jest grupą maleimidową, to
PL 213 322 B1 można je przereagować z grupą sulfhydrylową, tworząc trwały łącznik tioeterowy. Jeśli w związku aktywnym biologicznie nie są obecne grupy sulfhydrylowe, to można je utworzyć przez redukcję disiarczków lub tiolowanie za pomocą 2-iminotiolanu lub SATA. Gdy R oznacza imidoester, to zareaguje on z aminami pierwszorzędowymi w B', tworząc łącznik imidoamidowy. Koniugację imidoestrową przeprowadza się zazwyczaj przy pH 8,5-9,0. Imidoestry mają przewagę nad innymi grupami R przy łączeniu zaktywowanych PGC z aktywnymi biologicznie białkami, gdyż nie zmieniają one ogólnego ładunku białek.
Posiadają one ładunek dodatni w pH fizjologicznym, tak jak aminy pierwszorzędowe, które zastępują. Reakcje imidoestrowe wykonuje się w temperaturze pomiędzy 0°C i pokojową (np. w 4°C) lub w podwyższonej temperaturze w warunkach bezwodnych. Gdy R oznacza NHS-ester, to jego zasadniczą tarczą są aminy pierwszorzędowe. Dostępne grupy aminowe α, na przykład te, które występują przy końcach N peptydów i białek, reagują z NHS-estrami z utworzeniem kowalencyjnych wiązań amidowych.
W pewnych wykonaniach R*-B jest łącznikiem trwałym hydrolitycznie. Łącznik trwały hydrolitycznie oznacza, że połączenie jest zasadniczo trwałe w wodzie i nie reaguje z wodą w użytecznym pH, np. połączenie jest trwałe w warunkach fizjologicznych przez dłuższy okres, być może nawet bezterminowo. W innych wykonaniach R*-B jest łącznikiem nietrwałym hydrolitycznie lub degradowalnym. Łącznik nietrwały hydrolitycznie oznacza, że połączenie jest degradowane w wodzie lub roztworach wodnych, w tym na przykład we krwi. Łącznik nietrwały lub degradowalny enzymatycznie oznacza również, że połączenie może być degradowane przez jeden lub więcej enzymów.
Zgodnie z wiedzą w dziedzinie, polimery polialkilenowe i pokrewne mogą zawierać łączniki degradowalne w szkielecie polimerowym lub w grupie łączącej szkielet polimerowy z jedną lub większą liczbą końcowych grup funkcyjnych cząsteczki PGC. Na przykład łączniki estrowe, tworzone w reakcji np. kwasów karboksylowych PGC lub zaktywowanych kwasów karboksylowych PGC z grupami alkoholowymi w zwią zku aktywnym biologicznie generalnie hydrolizują w warunkach fizjologicznych, uwalniając czynnik. Do innych degradowanych hydrolitycznie łączników należą należą łączniki węglanowe; łączniki iminowe, powstające w reakcji aminy z aldehydem (zobacz np. Oguchi i wsp. Polimer Preprints, 38(1):582-3 (1997)); łączniki z estrów fosforanowych, powstające w reakcji alkoholu z grupą fosforanową ; łączniki acetalowe, które są produktami reakcji mrówczanu z alkoholem; łączniki peptydowe, tworzone przez grupę aminową, np. na końcu PGC i grupę karboksylową peptydu oraz łączniki oligonukleotydowe, tworzone przez grupę fosforamidynową, np. na końcu polimeru i grupę 5' hydroksylową oligonukleotydu.
Glikol polialkilenowy, P, może być glikolem polietylenowym, posiadającym strukturę według Wzoru II:
Wzór II
E-(O-CH2CH2)a-, w którym a oznacza liczbę cał kowitą od 4 do 10000, a E oznacza atom wodoru lub grupę alkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, wykrywalny znacznik lub resztę zdolną do tworzenia wiązania pomiędzy związkiem o Wzorze I i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem.
Gdy zatem E oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania pomiędzy związkiem o Wzorze I i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, to E mo że być resztą kwasu karboksylowego, estrową, aldehydową, hydrat aldehydu, resztę acetalową, grupę hydroksylową, zablokowaną grupę hydroksylową, resztę węglanową, alkenylową, akrylanową, metakrylanową, akrylamidową, podstawioną lub niepodstawioną resztę tiolową, halogenową, podstawioną lub niepodstawioną aminową, zablokowaną aminową, hydrazydową, zablokowaną hydrazydową, sukcynimidylową, izocyjanianową, izotiocyjanianową, ditiopirydynową, winylopirydynową, jodoacetamidową, epoksydową hydroksysukcynimidylową, azolową, maleimidową, sulfonową, allilową, winylosulfonową, trezylową, sulfo-N-sukcynimidylową, dionową, mesylową, tosylową lub glioksalową. Należy przyjąć, że E powinien być kompatybilny z R, tak by nie zachodziła reakcja pomiędzy E i R.
Pod nazwą „wykrywalny znacznik” rozumie się dowolny znacznik, który można wykryć. Nieograniczające przykłady obejmują izotopy radioaktywne, reszty fluoryzujące, reszty fosforyzujące, reszty chemiluminescencyjne i kropki kwantowe. Do innych wykrywalnych znaczników należą biotyna, cysteina, histydyna, hemaglutynina oraz znaczniki myc lub flag.
Niniejszym ujawniono związki, w których E ma strukturę zgodną ze Wzorem III lub IV;
PL 213 322 B1
Wzór III
R-HC-(CH2)n-(Y)m-Q-X-CW2CHW2—
Z
Wzór IV
R'-CH-(CH2)n-X-CW2CW2Z
Każdy spośród Q, X, Y, Z, m oraz n oznacza to, co zdefiniowano powyżej, a każdy spośród W oznacza niezależnie atom wodoru lub grupę alkilową C1 do C7.
W tej klasie zwią zków R” oznacza reszt ę zdolną do tworzenia wią zania mię dzy zwią zkiem o Wzorze III i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, a R'” oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o Wzorze IV i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem.
R” i R'” mogą oznaczać resztę kwasu karboksylowego, estrową, aldehydową, hydrat aldehydu, resztę acetalową, grupę hydroksylową, zablokowaną grupę hydroksylową, resztę węglanową, alkenylową, akrylanową, metakrylanową, akrylamidową, podstawioną lub niepodstawioną resztę tiolową, halogenową, podstawioną lub niepodstawioną aminową, zablokowaną aminową, hydrazydową, zablokowaną hydrazydową, sukcynimidylową, izocyjanianową, izotiocyjanianową, ditiopirydynową, winylopirydynową, jodoacetamidową, epoksydową, hydroksysukcynimidylową, azolową, maleimidową, sulfonową, allilową, winylosulfonową, trezylową, sulfo-N-sukcynimidylową, dionową, mesylową, tosylową lub glioksalową. Należy przyjąć, że R” i R”' powinny być kompatybilne z R, tak by nie zachodziła reakcja z R.
R” i R”' po koniugacji ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, tworzą grupy łącznikowe, jak zdefiniowano powyżej. R** oznacza zatem resztę, powstałą w reakcji R” lub R'” w zaktywowanym PGC z reaktywną grupą funkcyjną w zwią zku aktywnym biologicznie, w taki sposób, że pomiędzy PGC i związkiem aktywnym biologicznie tworzy się wiązanie kowalencyjne. R” i R'” mogą oznaczać tą samą resztę lub różne reszty, a związek aktywny biologicznie, związany do każdej z nich, może być taki sam lub różny.
Zgodnie z niniejszym zastosowaniem, termin „grupa alkilowa” dotyczy rodnikowych lub nasyconych grup alifatycznych, w tym grup alkilowych o łańcuchu prostym, grup alkilowych o łańcuchu rozgałęzionym, grup cykloalkilowych (alicyklicznych), grup cykloalkilowych podstawionych przez grupy alkilowe oraz grup alkilowych podstawionych przez grupy cykloalkilowe. Łańcuch alkilowy prosty lub rozgałęziony może posiadać 30 lub mniej atomów węgla w szkielecie (np. C1-C30 dla łańcuchów prostych C3-C30 dla łańcuchów rozgałęzionych), w szczególności 20 lub mniej. Cykloalkile mogą posiadać 3-10 atomów węgla w swych strukturach pierścieniowych, a w szczegóności 5, 6 lub 7 atomów węgla w swych strukturach pierś cieniowych.
Co więcej, termin „grupa alkilowa” (lub „mniejsza grupa alkilowa”) ma obejmować zarówno „niepodstawione grupy alkilowe”, jak i „podstawione grupy alkilowe”, te ostatnie odnoszą się do reszt alkilowych, posiadających podstawniki, zastępujące atom wodoru przy jednym lub większej liczbie atomów węgla szkieletu węglowodorowego. Do takich podstawników można zaliczyć na przykład grupę halogenową, hydroksylową, karbonylową (taką jak karboksylowa, alkoksykarbonylowa, mrówczanowa lub acylowa), tiokarbonylową (taką jak tioestrowa, tiooctanowa lub tiomrówczanowa) alkoksylową, fosforylową, fosfonianową, fosfinianową, aminową, amidową, amidynową, iminową, cyjanową, nitrową, azydową, sulfhydrylową, alkilotiolową, siarczanową, sulfonianową, sulfamoilową, sulfonamidową, sulfonylową, heterocyklilową, aryloalkilową lub resztę aromatyczną czy heteroaromatyczną. Biegli w dziedzinie dostrzegą, że reszty, podstawiające łańcuch węglowodorowy, same mogą być podstawione, jeśli jest to stosowne. Na przykład do podstawników podstawionej grupy alkilowej mogą należeć podstawione i niepodstawione formy grup aminowych, azydowych, iminowych, amidowych, fosforylowych (włączając fosfonianową i fosfinianową), sulfonylowych (włączając siarczanową, sulfonamidową, sulfamoilową i sulfonianową) i silylowych, a także etery, alkilotiole, karbonyle (włączając ketony, aldehydy, karboksylazy i estry), -CF3, -CN i tym podobne. Grupy cykloalkilowe mogą być dalej podPL 213 322 B1 stawiane przez grupy alkilowe, alkenylowe, alkoksylowe, alkilotiolowe, aminoalkilowe, alkilowe podstawione grupami karbonylowymi, -CF3, -CN i tym podobne.
Termin „aryloalkil” stosowany niniejszym dotyczy grupy alkilowej, podstawionej przez grupę arylową (np. grupę aromatyczną lub heteroaromatyczną). Do przykładowych grup aryloalkilowych należą, ale nie ograniczają się do grup benzylowych i bardziej ogólnie (CH2)nPh, gdzie Ph oznacza grupę fenylową lub podstawioną fenylową, a n oznacza 1, 2 lub 3.
Terminy „alkenyl” i „alkinyl” dotyczą nienasyconych grup alifatycznych, analogicznych pod względem długości i możliwości podstawienia do grup alkilowych, opisanych powyżej, ale zawierających przynajmniej jedno wiązanie, odpowiednio podwójne lub potrójne.
O ile liczba atomów węgla nie jest określona w inny sposób, to termin „mniejsza grupa alkilowa”, zgodnie z użytym tutaj znaczeniem, oznacza grupę alkilową jak określono powyżej, ale posiadającą w strukturze szkieletu od jednego do dziesięciu atomów węgla, w przypadku bardziej korzystnym od jednego do sześciu atomów węgla. Podobnie, „mniejsza grupa alkenylowa” i „mniejsza grupa alkinylowa” mają podobne długości łańcuchów. Korzystnymi grupami alkilowymi są mniejsze grupy alkilowe. Podstawnikiem opisanym niniejszym może być grupa alkilowa jest mniejsza grupa alkilowa.
Stosowany niniejszym termin „grupa arylowa” obejmuje 5-, 6- i 7-członowe jednopierścieniowe grupy aromatyczne, które mogą zawierać od zera do czterech heteroatomów, na przykład benzen, pirol, furan, tiofen, imidazol, oksazol, tiazol, tiazol, pirazol, pirydyna, pirazyna, pirydazyna i pirymidyna oraz tym podobne. Te grupy arylowe, które zawierają heteroatomy w strukturze pierścienia, można również nazywać „arylowymi grupam i heterocyklicznymi” lub „grupami heteroaromatycznymi”. Pierścień aromatyczny można podstawiać w jednej lub większej liczbie pozycji pierścienia, za pomocą takich podstawników, które opisano powyżej, na przykład halogenowych, azydowych, alkilowych, aryloalkilowych, alkenylowych, alkinylowych, cykloalkilowych, hydroksylowych, alkoksylowych, aminowych, nitrowych, sulfhydrylowych, iminowych, amidowych, fosfonianowych, fosfinianowych, karbonylowych, karboksylowych, sililowych, eterowych, alkilotiolowych, sulfonylowych, sulfonamidowych, ketonowych, aldehydowych, estrowych, heterocyklilowych, reszt aromatycznych i heteroaromatycznych, -CF3, -CN i tym podobnych. Termin „aryl” obejmuje również układy wielopierścieniowe, posiadające dwa lub większą liczbę pierścieni, w których dwa sąsiednie pierścienie uwspólniają dwa lub większą liczbę atomów węgla (pierścienie są „pierścieniami skondensowanymi”), z tym, że przynajmniej jeden z pierścieni jest aromatyczny, np. pozostałe pierścienie mogą być grupami cykloalkilowymi, cykloalkenylowymi, cykloalkinylowymi, arylowymi i/lub heterocyklilowymi.
Terminy orto, meta i para stosują się odpowiednio do benzenów dwupodstawionych 1,2-, 1,3i 1,4. Na przykład nazwy 1,2-dimetylobenzen i orto-dimetylobenzen są synonimiczne.
Terminy „grupa heterocyklilowa” lub „grupa heterocykliczna” dotyczą 3- do 10-członowych struktur pierścieniowych, w przypadku bardziej korzystnym pierścieni 3- do 7-członowych, struktury pierścieniowe których zawierają od jednego do czterech heteroatomów. Grupy heterocykliczne mogą być również policykliczne. Do grup heterocyklicznych należą na przykład tiofen, tiantren, furan, piran, izobenzofuran, chromen, ksantyn, fenoksatiyn, pirol, imidazol, pirazol, izotiazol, izoksazol, pirydyna, pirazyna, pirymidyna, pirydazyna, indolizyna, izoindol, indol, indazol, puryna, chinolizyna, izochinolina, chinolina, ftalazyna, naftyrydyna, chinoksalina, chinazolina, cynolina, pterydyna, karbazol, karbolina, fenantrydyna, akrydyna, pirymidyna, fenantrolina, fenazyna, fenarsazyna, fenotiazyna, furazan, fenoksazyna, pirolidyna, oksolan, tiolan, oksazol, piperydyna, piperazyna, morfolina, laktony, laktamy takie jak azetydynony i pirolidonony, stulamy, sultony i tym podobne. Pierścień heterocykliczny można podstawiać w jednej lub większej liczbie pozycji pierścienia, za pomocą takich podstawników, które opisano powyżej, na przykład halogenowych, alkilowych, aryloalkilowych, alkenylowych, alkinylowych, cykloalkilowych, hydroksylowych, aminowych, nitrowych, sulfhydrylowych, iminowych, amidowych, fosfonianowych, fosfinianowych, karbonylowych, karboksylowych, sililowych, eterowych, alkilotiolowych, sulfonylowych, ketonowych, aldehydowych, estrowych, heterocyklilowych, reszt aromatycznych i heteroaromatycznych, -CF3, -CN i tym podobnych.
Termin „grupa karbocykliczna” zgodnie z użyciem tutaj dotyczy pierścieni aromatycznych lub niearomatycznych, w których każdy z atomów pierścienia jest atomem węgla.
Do grup heterocyklicznych i karbocyklicznych należą dwupierścieniowe struktury skondensowane i z mostkami.
Zgodnie z użyciem tutaj termin „grupa nitrowa” oznacza -NO2; termin „halogen” oznacza -F, -Cl, -Br lub -I; termin „grupa sulfhydrylowa” oznacza -SH; termin „grupa hydroksylowa” oznacza -OH, a termin „grupa sulfonylowa” oznacza -SO2.
PL 213 322 B1
Terminy „amina” i „grupa aminowa” są znane w dziedzinie i dotyczą zarówno niepodstawionych, jak i podstawionych amin, np. reszt, które przedstawiają ogólne wzory:
gdzie każdy spośród R9, R10 i R'10 niezależnie oznacza atom wodoru, grupę alkilową, grupę alkenylową, -(CH2)m-R8 lub R9 i R10, które wraz z atomem N, do którego są przyłączone, tworzą grupę heterocykliczną, posiadającą od 4 do 8 atomów w strukturze pierścieniowej; R8 oznacza grupę arylową, cykloalkilową, cykloalkenylową, heterocykliczną lub policykliczną, a m oznacza zero lub liczbę całkowitą w zakresie od 1 do 8.
Termin „grupa alkiloaminowa”, zgodnie z użyciem tutaj, oznacza grupę aminową, zgodnie z definicją powyżej, posiadającą przyłączoną do niej podstawioną lub niepodstawioną grupę alkilową, tj. przynajmniej jedna z grup R9 i R10 jest grupą alkilową.
Termin „grupa acyloaminowa” jest znany w dziedzinie i dotyczy reszty, którą przedstawia ogólny wzór:
ο
-ΝI r9
gdzie R9 oznacza to, co zdefiniowano powyżej, a R'11 oznacza atom wodoru, grupę alkilową, grupę alkenylową lub -(CH2)m-R8, gdzie m oraz R8 oznaczają to, co zdefiniowano powyżej.
Termin „grupa amidowa”, jest znany w dziedzinie, jako grupa aminowa, podstawiona grupą karbonylową i dotyczy reszty, którą przedstawia ogólny wzór:
gdzie R9 i R10 oznaczają to, co zdefiniowano powyżej. Do korzystnych wykonań amidu nie zalicza się imidów, które mogą być nietrwałe.
Termin „grupa amidynowa” jest znany w dziedzinie i dotyczy grupy, którą przedstawia ogólny wzór:
gdzie R9 i R10 oznaczają to, co zdefiniowano powyżej.
Termin „grupa guanidynowa” jest znany w dziedzinie i dotyczy grupy, którą przedstawia ogólny wzór:
gdzie R9 i R10 oznaczają to, co zdefiniowano powyżej.
Termin „grupa alkilotiolowa” oznacza grupę aminową, zgodnie z definicją powyżej, posiadającą przyłączony do niej rodnik siarkowy. W korzystnych wykonaniach reszta „alkilotiolowa” jest reprezentowana przez jedną spośród grup -S-alkilowych, -S-alkenylowych, -S-alkinylowych oraz -(CH2)m-R8, gdzie m oraz R8 oznaczają to, co zdefiniowano powyżej. Do reprezentatywnych grup alkilotiolowych należą grupy metylotiolowa, etylotiolowa i tym podobne.
PL 213 322 B1
Termin „grupa karbonylowa” jest znany w dziedzinie i dotyczy grupy, którą przedstawia ogólny wzór:
gdzie X oznacza wiązanie lub przedstawia tlen lub siarkę, a R11 oznacza atom wodoru, grupę alkilową, grupę alkenylową, -(CH2)m-R8 lub dopuszczalną farmaceutycznie sól, R'11 oznacza atom wodoru, grupę alkilową, grupę alkenylową lub -(CH2)m-R8, gdzie m oraz R8 oznaczają to, co zdefiniowano powyżej. Gdy X oznacza tlen, a R11 lub R'11 nie oznacza atomu wodoru, to wzór przedstawia „ester”. Gdy X oznacza tlen, a R11 oznacza to, co zdefiniowano powyżej, to resztę określa się tutaj jako grupę karboksylową, w przypadku szczególnym, gdy R11 oznacza atom wodoru, to wzór przedstawia „kwas karboksylowy”. Gdy X oznacza tlen, a R'11 oznacza atom wodoru, to wzór przedstawia „mrówczan”. Ogólnie, gdy atom tlenu w powyższym wzorze zostaje zastąpiony przez atom siarki, to wzór przedstawia grupę „tiokarbonylową”. Gdy X oznacza siarkę, a R11 lub R'11 nie oznacza atomu wodoru, to wzór przedstawia „tioester”. Gdy X oznacza siarkę, a R'11 oznacza atom wodoru, to wzór przedstawia „tiomrówczan”. Z drugiej strony, gdy X oznacza wiązanie a R11 nie oznacza atomu wodoru, to powyższy wzór przedstawia grupę „ketonową”. Gdy X oznacza wiązanie, a R11 oznacza atom wodoru, to powyższy wzór przedstawia grupę „aldehydową”.
Terminy „alkoksyl” lub „grupa alkoksylowa”, zgodnie z użyciem tutaj, dotyczą grupy alkilowej, zgodnie z definicją powyżej, do której przyłączony jest rodnik tlenowy. Do reprezentatywnych grup alkoksylowych należą grupy metoksylowa, etoksylowa, propyloksylowa, tert-butoksylowa i tym podobne. „Eter” oznacza dwie grupy węglowodorowe, przyłączone kowalencyjnie do atomu tlenu. Zgodnie z tym podstawnik grupy alkilowej, który sprawia, że ta grupa alkilowa staje się eterem, jest albo przypomina grupę alkoksylową, na przykład reprezentowaną przez jedną spośród grup -O-alkilowych, -O-alkenylowych, -O-alkinylowych, -O-(CH2)m-R8, gdzie m oraz R8 oznaczają to, co zdefiniowano powyżej.
Termin „grupa sulfonianowa” jest znany w dziedzinie i dotyczy grupy, którą przedstawia ogólny wzór:
w którym R41 oznacza parę elektronową, atom wodoru, grupę alkilową, cykloalkilową lub arylową.
Termin „grupa siarczanowa” jest znany w dziedzinie i dotyczy grupy, którą przedstawia ogólny wzór:
w którym R41 oznacza to, co zdefiniowano powyż ej.
Termin „grupa sulfonamidowa” jest znany w dziedzinie i dotyczy grupy, którą przedstawia ogólny wzór:
w którym R9 i R'11 oznaczają to, co zdefiniowano powyżej.
Termin „grupa sulfamoilowa” jest znany w dziedzinie i dotyczy grupy, którą przedstawia ogólny wzór:
PL 213 322 B1 w którym R9 i R10 oznaczają to, co zdefiniowano powyż ej.
Termin „grupa sulfonylowa” jest znany w dziedzinie i dotyczy grupy, którą przedstawia ogólny wzór:
ο
II
-S—r44
II o
w którym R44 wybierany jest z grupy, skł adają cej się z atomu wodoru, grupy alkilowej, alkenylowej, alkinylowej cykloalkilowej, heterocyklilowej, arylowej lub heteroarylowej.
Termin „grupa sulfotlenkowa” jest znany w dziedzinie i dotyczy grupy, którą przedstawia ogólny wzór:
o
II s r44 w którym R44 wybierany jest z grupy, skł adają cej się z atomu wodoru, grupy alkilowej, alkenylowej, alkinylowej cykloalkilowej, heterocyklilowej, aryloalkilowej lub arylowej.
Należy przyjąć, że „podstawienie” lub „podstawiony” implikuje, że takie podstawienie jest w zgodzie z dopuszczalną walencyjnością podstawianego atomu i podstawnika i ż e wynikiem podstawienia jest trwały związek, np. taki, który nie ulega spontanicznej transformacji, takiej jak przegrupowanie, cyklizacja, eliminacja itp.
Przyjmuje się, że termin „podstawiony”, zgodnie z użyciem tutaj, obejmuje wszystkie dopuszczalne podstawniki związków organicznych. Szeroko pojęte, dopuszczalne podstawniki obejmują dopuszczalne podstawniki związków organicznych acykliczne i cykliczne, rozgałęzione i nierozgałęzione, karbocykliczne i heterocykliczne, aromatyczne i niearomatyczne. Przykładowe podstawniki obejmują na przykład te, które opisano tu powyżej. Dopuszczalne podstawniki mogą być pojedyncze lub mnogie oraz takie same lub różne, dla odpowiednich związków organicznych. Heteroatomy takie jak azot mogą posiadać podstawniki wodorowe i/lub dowolne dopuszczalne podstawniki związków organicznych, opisanych tutaj, które spełniają walencyjności heteroatomów.
Wyczerpująca lista skrótów, stosowanych przez chemików organików o zwykłej biegłości w dziedzinie, ukazuje się w pierwszym zeszycie każdego tomu Journal of Organic Chemistry, ta lista jest zazwyczaj prezentowana w tabeli, zatytułowanej Standard List of Abbreviations. Skróty, znajdujące się na tej liście, a także wszystkie skróty, stosowane przez chemików organików o zwykłej biegłości w dziedzinie, są niniejszym włączone do niniejszego opisu.
Niniejszym ujawniono związki o strukturze według Wzoru V:
X, Y, m, n, Z oraz R' oznaczają to, co zdefiniowano powyżej, a R oznacza resztę aktywującą, zdolną do tworzenia wiązania pomiędzy związkiem według Wzoru V i związkiem aktywnym biologicznie lub prekursorem. W szczególnych wykonaniach R jest hydratem aldehydu.
P oznacza to, co zdefiniowano powyżej i może być przedstawiany przez Wzór II:
Wzór II
E-(O-CH2CH2)a-, gdzie E przedstawia to, co zdefiniowano powyżej, a w pewnych wykonaniach może być reprezentowany przez Wzór III lub IV.
T1 i T2 niezależnie są nieobecne lub oznaczają nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną
PL 213 322 B1 grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Podstawnikami mogą być grupy halogenowe, hydroksylowe, karbonylowe, karboksylowe, estrowe, mrówczanowe, acylowe, tiokarbonylowe, tioestrowe, tiooctanowe, tiomrówczanowe, alkoksylowe, fosforylowe, fosfonianowe, fosfinianowe, aminowe, amidowe, amidynowe, iminowe, cyjanowe, nitrowe, azydowe, sulfhydrylowe, siarczanowe, sulfonianowe, sulfamoilowe, sulfonamidowe, sulfonylowe, heterocyklilowe, aryloalkilowe, reszty aromatyczne, reszty heteroaromatyczne, grupy iminowe, sililowe, eterowe lub alkilotiolowe.
Gdy d oznacza zero, to w pierścieniu aromatycznym nie ma dodatkowych podstawników (L). Gdy d oznacza liczbę całkowitą od jeden do cztery, to podstawniki (L) mogą oznaczać nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Podstawniki wybiera się spośród grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sililowych, eterowych lub alkilotiolowych.
Gdy R oznacza aldehyd, to związki należą do grupy reprezentowanej przez Wzór VI:
Wzór VI z
(L)d
gdzie wszystkie inne zmienne są zdefiniowane jak powyżej.
Na przykład, gdy X i Y oznaczają atom tlenu, to związki są reprezentowane przez związek J.
Związek J (L)d
O gdzie podstawniki T1 i T2 mogą mieć układ orto, meta i para.
Gdy podstawniki T1 i T2 są grupami alkilowymi o prostych łańcuchach, a d oznacza zero, to związki są reprezentowane przez Wzór IX:
PL 213 322 B1
gdzie każdy spośród u oznacza niezależnie zero lub liczbę całkowitą od jeden do pięć, a wszystkie inne zmienne są zdefiniowane jak powyżej. W szczególnych wykonaniach Z oznacza atom wodoru lub grupę metylową.
Szczególne klasy związków, należących do grupy reprezentowanej przez Wzór IX, są reprezentowane przez Wzory VII i VIII:
Do reprezentatywnych zaktywowanych związków glikoli polialkilenowych należą poniższe, gdzie polimerem glikolu polialkilenowego jest PEG lub mPEG.
Niniejszym przedstawiono również związki reprezentowane przez Wzór X:
PL 213 322 B1
WzórX
Ρ-X-(CH2)n-CH-R
Z gdzie, jak powyżej, n oznacza zero lub liczbę całkowitą od jeden do pięć, a X oznacza grupy O, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR', SO2NR' lub NR'.
Gdy X oznacza NR', to R' oznacza atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20, gdzie podstawniki wybiera się spośród grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sililowych, eterowych lub alkilotiolowych. Z może oznaczać nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20.Jeśli są obecne, to podstawniki wybiera się spośród grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sililowych, eterowych lub alkilotiolowych.
Zgodnie z definicją powyżej, R oznacza resztę aktywującą, zdolną do tworzenia wiązania pomiędzy związkiem według Wzoru X i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem. W pewnych wykonaniach R jest hydratem aldehydu. P oznacza polimerem glikolu polialkilenowego, jak zdefiniowano powyżej i może być przedstawiany przez Wzór II:
Wzór II
E-(O-CH2CH2)a-, gdzie E oraz a przedstawiają to, co zdefiniowano powyżej, a w pewnych wykonaniach mogą być reprezentowane przez Wzór IIl lub IV. W pewnych wykonaniach E oznacza grupę metylową, a zatem P oznacza mPEG.
Gdy R oznacza aldehyd, a X oznacza tlen, to związki należą do grupy reprezentowanej przez Wzór XI:
Wzór XI:
O
Z gdzie P, Z oraz n oznaczają to, co zdefiniowano dla Wzoru X. Gdy P oznacza mPEG, to związki opisuje Wzór XII:
PL 213 322 B1
a gdy n oznacza jeden, a Z oznacza grupę metylową , to zwią zek przedstawia Wzór XIII:
gdzie a oznacza liczbę całkowitą od 4 do 10000.
Przykłady szlaków syntetycznych do związków opisanych tutaj są ukazane w przykładach poniżej.
Niniejszym opisano kompozycje zaktywowanych związków glikoli polialkilenowych (PGC) oraz jednego lub większej liczby związków aktywnych biologicznie. Jak opisano powyżej, związkami aktywnymi biologicznie są te związki, które wykazują odpowiedź lub reakcję biologiczną przy podaniu pacjentowi. Nieskoniugowane związki aktywne biologicznie można podawać pacjentowi w uzupełnieniu do związków tu ujawnionych. Dodatkowo związki aktywne biologicznie mogą zawierać grupy reaktywne, które są zdolne do reagowania i koniugowania z przynajmniej jednym zaktywowanym PGC.
Niniejszym opisano również koniugaty nowych PGC ze związkami aktywnymi biologicznie. Koniugaty otrzymuje się ze związku o Wzorze I i związku aktywnego biologicznie (B), są one opisane
Wzorem XIV:
Wzór XIV
P - X - Q-(Y)m-(CH2)n-CH-R* -β
Z
Jak powyżej, m oznacza zero lub jeden, tak że Y jest obecny lub nieobcny, n oznacza zero lub liczbę całkowitą od jeden do pięć, a X i Y oznaczają niezależnie grupy O, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR', SO2NR' lub NR'.
Q oznacza nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8 (włączając struktury pierścieniowe bicykliczne skondensowane i z mostkami), podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, gdzie grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Gdy są obecne, to podstawniki wybiera się z grupy, składającej się z grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sililowych, eterowych i alkilotiolowych.
Każdy spośród R' i Z oznacza niezależnie atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową, albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, gdzie grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20, taką, że podstawniki
PL 213 322 B1 wybiera się z grupy, składającej się z grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sililowych, eterowych i alkilotiolowych;
R* oznacza resztę łącznikową, powstającą w reakcji R z odpowiednią grupą funkcyjną w związku aktywnym biologicznie, B, zgodnie z opisem powyżej. Na przykład R* powstaje w reakcji reszty wybieranej spośród kwasów karboksylowych, estrowych, aldehydowych, hydratów aldehydów, reszt acetalowych, grup hydroksylowych, zablokowanych grup hydroksylowych, reszt węglanowych, alkenylowych, akrylanowych, metakrylanowych, akrylamidowych, podstawionych lub niepodstawionych reszt tiolowych, halogenowych, podstawionych lub niepodstawionych aminowych, zablokowanych aminowych, hydrazydowych, zablokowanych hydrazydowych, sukcynimidylowych, izocyjanianowych, izotiocyjanianowych, ditiopirydynowych, winylopirydynowych, jodoacetamidowych, epoksydowych, hydroksysukcynimidylowych, azolowych, maleimidowych, sulfonowych, allilowych, winylosulfonowych, trezylowych, sulfo-N-sukcynimidylowych, dionowych, mesylowych, tosylowych i glioksalowych ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem.
P oznacza polimer glikolu polietylenowego, zgodnie z definicją powyżej i może być reprezentowany przez Wzór II:
Wzór II
E-(O-CH2CH2)a-, gdzie E oznacza atom wodoru, grupę alkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym (np. grupę metylową), wykrywalny znacznik lub resztę zdolną do tworzenia wiązania pomiędzy związkiem o Wzorze XIV i zwią zkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem. Jak powyż ej, a oznacza liczbę całkowitą od 4 do 10000.
Gdy E oznacza wykrywalny znacznik, to znacznik ten może być na przykład izotopem radioaktywnym, resztą fluoryzującą, resztą fosforyzującą, resztą chemiluminescencyjną lub kropką kwantową.
Gdy E oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o Wzorze XIV i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, to E może tworzyć wiązanie z inną cząsteczką związku aktywnego biologicznie (B), tak że zaktywowany związek glikolu polialkilenowego jest związany przy obu końcach do cząsteczki tego samego typu związku aktywnego biologicznie, tworząc dimer cząsteczki.
W pewnych wykonaniach E tworzy wią zanie ze zwią zkiem aktywnym biologicznie innym niż B, tworząc heterodimer związków aktywnych biologicznie lub ich prekursorów.
W innych wykonaniach E tworzy dodatkowe wią zanie ze zwią zkiem aktywnym biologicznie, B, tak że E i R są związane przez różne grupy funkcyjne tej samej cząsteczki związku aktywnego biologicznie lub jej prekursora.
Gdy E może tworzyć wiązanie ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, to E może być taki sam lub inny niż R, a wybiera się go spośród reszt kwasów karboksylowych, estrowych, aldehydowych, hydratów aldehydów, reszt acetalowych, grup hydroksylowych, zablokowanych grup hydroksylowych, reszt węglanowych, alkenylowych, akrylanowych, metakrylanowych, akrylamidowych, podstawionych lub niepodstawionych reszt tiolowych, halogenowych, podstawionych lub niepodstawionych aminowych, zablokowanych aminowych, hydrazydowych, zablokowanych hydrazydowych, sukcynimidylowych, izocyjanianowych, izotiocyjanianowych, ditiopirydynowych, winylopirydynowych, jodoacetamidowych, epoksydowych, hydroksysukcynimidylowych, azolowych, maleimidowych, sulfonowych, allilowych, winylosulfonowych, trezylowych, sulfo-N-sukcynimidylowych, dionowych, mesylowych, tosylowych i glioksalowych.
Gdy E oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, to E może mieć strukturę według Wzoru III lub Wzoru IV:
PL 213 322 B1 ^Ντ,όχ III
R-HC-(CH2)n-(Y)m-Q-X-CW2CHW2
Z
Wzór IV
R'-CH-(CH2)n-X-CW2CW2Z gdzie każdy spośród Q, X, Y, Z, m oraz n oznacza niezależnie to, co zdefiniowano powyżej, każdy spośród W oznacza niezależnie atom wodoru lub grupę alkilową C 1 do C7, R” oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o Wzorze III i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, a R'” oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o Wzorze IV i zwią zkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem.
R” i R'” wybiera się niezależnie spośród reszty kwasu karboksylowego, estrowej, aldehydowej, hydratu aldehydu, reszty acetalowej, grupy hydroksylowej, zablokowanej grupy hydroksylowej, reszty węglanowej, alkenylowej, akrylanowej, metakrylanowej, akryl amidowej, podstawionej lub niepodstawionej reszty tiolowej, halogenowej, podstawionej lub niepodstawionej aminowej, zablokowanej aminowej, hydrazydowej, zablokowanej hydrazydowej, sukcynimidylowej, izocyjanianowej, izotiocyjanianowej, hydroksysukcynimidylowej, azolowej, maleimidowej, sulfonowej, allilowej, winylosulfonowej, trezylowej, sulfo-N-sukcynimidylowej, dionowej, mesylowej, tosylowej lub glioksalowej. Należy przyjąć, że R” i R'” powinny być kompatybilne z R, tak by nie zachodziła reakcja z R.
Gdy Q we Wzorze XIV oznacza podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, to koniugat tworzy się ze zaktywowanego glikolu polialkilenowego o Wzorze V i cząsteczki aktywnej biologicznie (B), opisuje się go według Wzoru XV:
gdzie T1 i T2 niezależnie są nieobecne lub oznaczają nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Jeśli są obecne, to podstawnikami mogą być grupy halogenowe, hydroksylowe, karbonylowe, karboksylowe, estrowe, mrówczanowe, acylowe, tiokarbonylowe, tioestrowe, tiooctanowe, tiomrówczanowe, alkoksylowe, fosforylowe, fosfonianowe, fosfinianowe, aminowe, amidowe, amidynowe, iminowe, cyjanowe, nitrowe, azydowe, sulfhydrylowe, siarczanowe, sulfonianowe, sulfamoilowe, sulfonamidowe, sulfonylowe, heterocyklilowe, aryloalkilowe, reszty aromatyczne, reszty heteroaromatyczne, grupy iminowe, sililowe, eterowe lub alkilotiolowe. W pewnych wykonaniach T1 i T2, jeśli są obecne, oznaczają nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym; d oznacza zero (w pierś cieniu aromatycznym nie ma dodatkowych podstawników L) lub liczbę całkowitą od 1 do 4. Każdy spośród L, gdy jest obecny, oznacza nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową
PL 213 322 B1 lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20.Podstawniki można wybierać spośród grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sililowych, eterowych lub alkilotiolowych. Wszystkie inne zmienne oznaczają to, co opisano powyżej, włączając P, który oznacza polimer glikolu polietylenowego i może być reprezentowany przez Wzór II:
Wzór II
E-(O-CH2CH2)a-, gdzie E oznacza atom wodoru, grupę alkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym (np. grupę metylową), wykrywalny znacznik lub resztę zdolną do tworzenia wiązania pomiędzy związkiem o Wzorze XV i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem. Jak powyżej, a oznacza liczbę całkowitą od 4 do 10000.
Gdy E oznacza wykrywalny znacznik, to znacznik ten może być na przykład izotopem radioaktywnym, resztą fluoryzującą, resztą fosforyzującą, resztą chemiluminescencyjną lub kropką kwantową.
Gdy E oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o Wzorze XV i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, to E może tworzyć wiązanie z inną cząsteczką związku aktywnego biologicznie (B), tak że zaktywowany związek glikolu polialkilenowego jest związany przy obu końcach do cząsteczki tego samego typu związku aktywnego biologicznie, tworząc dimer cząsteczki.
W pewnych wykonaniach E tworzy wiązanie ze związkiem aktywnym biologicznie innym niż B, tworząc heterodimer związków aktywnych biologicznie lub ich prekursorów.
W innych wykonaniach E tworzy dodatkowe wiązanie ze związkiem aktywnym biologicznie, B, tak że E i R są związane przez różne grupy funkcyjne tej samej cząsteczki związku aktywnego biologicznie lub jej prekursora.
Gdy E może tworzyć wiązanie ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, to E może być taki sam lub inny niż R, a wybiera się go spośród reszt kwasów karboksylowych, estrowych, aldehydowych, hydratów aldehydów, reszt acetalowych, grup hydroksylowych, zablokowanych grup hydroksylowych, reszt węglanowych, alkenylowych, akrylanowych, metakrylanowych, akrylamidowych, podstawionych lub niepodstawionych reszt tiolowych, halogenowych, podstawionych lub niepodstawionych aminowych, zablokowanych aminowych, hydrazydowych, zablokowanych hydrazydowych, sukcynimidylowych, izocyjanianowych, izotiocyjanianowych, ditiopirydynowych, winylopirydynowych, jodoacetamidowych, epoksydowych, hydroksysukcynimidylowych, azolowych, maleimidowych, sulfonowych, allilowych, winylosulfonowych, trezylowych, sulfo-N-sukcynimidylowych, dionowych, mesylowych, tosylowych i glioksalowych.
Gdy E oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, to w pewnych wykonaniach E może mieć Wzór III lub Wzór IV:
Wzór III
R-HC-(CH2)n-(Y)m Q-X-C W2CHW2—
Z
Wzór IV
R-CH-(CH2)n-X-CW2CW2Z
PL 213 322 B1 gdzie każdy spośród Q, X, Y, Z, m oraz n oznacza niezależnie to, co zdefiniowano powyżej, każdy spośród W oznacza niezależnie atom wodoru lub grupę alkilową C1 do C7, R” oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o Wzorze III i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, a R''' oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o Wzorze IV i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem.
R” i R''' wybiera się niezależnie spośród reszty kwasu karboksylowego, estrowej, aldehydowej, hydratu aldehydu, reszty acetalowej, grupy hydroksylowej, zablokowanej grupy hydroksylowej, reszty węglanowej, alkenylowej, akrylanowej, metakrylanowej, akrylamidowej, podstawionej lub niepodstawionej reszty tiolowej, halogenowej, podstawionej lub niepodstawionej aminowej, zablokowanej aminowej, hydrazydowej, zablokowanej hydrazydowej, sukcynimidylowej, izocyjanianowej, izotiocyjanianowej, ditiopirydynowej, winylopirydynowej, jodoacetamidowej, epoksydowej, hydroksysukcynimidylowej, azolowej, maleimidowej, sulfonowej, allilowej, winylosulfonowej, trezylowej, sulfo-N-sukcynimidylowej, dionowej, mesylowej, tosylowej lub glioksalowej.
Gdy jest związany przy obu końcach do związku aktywnego biologicznie lub jego prekursora, to te cząsteczki dwufunkcyjne są reprezentowane według Wzoru XX lub Wzoru XXI:
gdzie każdy spośród X i Y, T1 i T2, R' i Z, L, Q, m, a oraz n oznacza to, co zdefiniowano powyżej, a każdy spośród W oznacza niezależnie atom wodoru lub grupę alkilową C1 do C7. R* i R** oznaczają niezależnie reszty łącznikowe, powstające w reakcji R i R” ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, a każdy spośród B i B' oznacza związek aktywny biologicznie lub jego prekursor, po sprzęgnięciu odpowiednio z R i R”.
W pewnych wykonaniach B i B' oznaczają ten sam typ zwią zku aktywnego biologicznie. W innych wykonaniach B i B' oznaczają różne związki aktywne biologicznie. W jeszcze innych wykonaniach B i B' oznaczają tą samą cząsteczkę aktywną biologicznie. W dodatkowych wykonaniach R* i R** oznaczają to samo. W innych wykonaniach R* i R** oznaczają co innego. Na przykład w pewnych wykonaniach E może tworzyć wiązanie z inną cząsteczką związku aktywnego biologicznie (B=B'), tak że zaktywowany PGC jest związany z obydwu końców z cząsteczką tego samego typu związku aktywnego biologicznie, tworząc dimer cząsteczki. W pewnych wykonaniach E tworzy wiązanie ze związkiem aktywnym biologicznie innym niż B (B nie oznacza B'), tworząc heterodimer związków aktywnych biologicznie lub ich prekursorów. W innych wykonaniach E tworzy dodatkowe wiązanie ze związkiem aktywnym biologicznie, B, takie że E (przez R” lub R'”) oraz R są związane przez różne grupy funkcyjne tej samej cząsteczki związku aktywnego biologicznie lub jego prekursora.
W pewnych wykonaniach R* lub R** oznacza grupę metylenową, a B lub B' oznacza cząsteczkę aktywną biologicznie, zawierającą grupę aminową, tak że grupa metylenowa tworzy wiązanie z grupą aminową w B. Na przykład amina może być aminą końcową peptydu, aminą łańcucha bocznego aminokwasu w peptydzie lub aminą podstawnika glikozylacji w peptydzie glikozylowanym. W pewnych wykonaniach peptydem jest interferon, taki jak interferon-beta, np. interferon-beta-1a. W pewnych wykonaniach ten typ wią zania powstaje w wyniku reakcji alkilowania redukcyjnego.
PL 213 322 B1
Gdy podstawniki T1 i T2 we Wzorze XV oznaczają grupy alkilowe o łańcuchu prostym, to X i Y oznaczają tlen, a d oznacza zero, to koniugaty są reprezentowane przez Wzór XIX:
gdzie każdy spośród u oznacza niezależnie zero lub liczbę całkowitą od jeden do pięć, a wszystkie inne zmienne oznaczają to, co zdefiniowano powyżej. W szczególnych wykonaniach Z oznacza atom wodoru lub grupę metylową.
Szczególne klasy związków, należących do grupy reprezentowanej przez Wzór XV są reprezentowane przez Wzory XVII i XVIII, powstające w reakcjach związków o Wzorach odpowiednio VII i VIIl ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem:
gdzie n oznacza zero lub liczbę całkowitą od jeden do pięć, P oznacza polimer glikolu polietylenowego, zgodnie z opisem powyżej, Z oznacza atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, R* oznacza resztę łącznikową zgodnie z opisem powyżej, B oznacza cząsteczkę aktywną biologicznie. Te związki mogą być dwufunkcyjne lub jednofunkcyjne, w zależności od natury E, zgodnie z opisem powyżej.
W pewnych wykonaniach R* oznacza grupę metylenową, a B oznacza cząsteczkę aktywną biologicznie, zawierającą grupę aminową, tak że grupa metylenowa tworzy wiązanie z grupą aminową w B. Na przykład amina może być aminą końcową peptydu, aminą łańcucha bocznego aminokwasu w peptydzie lub aminą podstawnika glikozylacji w peptydzie glikozylowanym. W pewnych wykonaniach peptydem jest interferon, taki jak interferon-beta, np. interferon-beta-1a. W pewnych wykonaniach ten typ wiązania powstaje w wyniku reakcji alkilowania redukcyjnego.
Koniugaty mogą również powstawać w reakcjach związków według Wzoru X ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, tworzących koniugaty o Wzorze XXII:
Wzór XXII
Ρ-X-(CH2)n-CH-R*-B
Z gdzie B oznacza cząsteczkę aktywną biologicznie, zgodnie z opisem powyżej, a n oznacza 0 lub liczbę całkowitą od jeden do pięć.
PL 213 322 B1
X oznacza grupy O, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR', SO2NR5 lub NR', gdy oznacza NR', to R' oznacza atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łań cuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Jeśli są obecne, to podstawniki wybiera się spośród grupy, składającej się z grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sililowych, eterowych lub alkilotiolowych.
Z oznacza nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Podstawniki mogą być spośród grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sililowych, eterowych lub alkilotiolowych.
R* oznacza resztę łącznikową, powstającą w reakcji R z odpowiednią grupą funkcyjną w związku aktywnym biologicznie, B, zgodnie z opisem powyżej. Na przykład R* powstaje w reakcji reszty wybieranej spośród kwasów karboksylowych, estrowych, aldehydowych, hydratów aldehydów, reszt acetalowych, grup hydroksylowych, zablokowanych grup hydroksylowych, reszt węglanowych, alkenylowych, akrylanowych, metakrylanowych, akrylamidowych, podstawionych lub niepodstawionych reszt tiolowych, halogenowych, podstawionych lub niepodstawionych aminowych, zablokowanych aminowych, hydrazydowych, zablokowanych hydrazydowych, sukcynimidylowych, izocyjanianowych, izotiocyjanianowych, ditiopirydynowych, winylopirydynowych, jodoacetamidowych, epoksydowych, hydroksysukcynimidylowych, azolowych, maleimidowych, sulfonowych, allilowych, winylosulfonowych, trezylowych, sulfo-N-sukcynimidylowych, dionowych, mesylowych, tosylowych i glioksalowych ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem.
W pewnych wykonaniach Z oznacza grupę metylową , a n oznacza jeden.
P oznacza polimer glikolu polietylenowego, zgodnie z definicją powyżej i może być reprezentowany przez Wzór II:
Wzór II
E-(O-CH2CH2)a-, gdzie E oznacza atom wodoru, grupę alkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym (np. metylową), wykrywalny znacznik lub resztę odpowiednią dla tworzenia wiązania pomiędzy związkiem o wzorze XXII i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem. Jak powyżej, a oznacza liczbę całkowitą od 4 do 10000.
Gdy E oznacza wykrywalny znacznik, to ten znacznik może być na przykład izotopem radioaktywnym, resztą fluoryzującą, resztą fosforyzującą, resztą chemiluminescencyjną lub kropką kwantową.
Gdy E oznacza resztę odpowiednią do tworzenia wiązania z cząsteczką aktywną biologicznie lub jej prekursorem, to powstaje cząsteczka dwufunkcyjna. E może tworzyć wiązanie z inną cząsteczką związku aktywnego biologicznie (B) tak, że zaktywowany związek glikolu polialkilenowego jest związany przy obu końcach do cząsteczki tego samego typu związku aktywnego biologicznie, tworząc dimer cząsteczki.
W pewnych wykonaniach E tworzy wią zanie ze zwią zkiem aktywnym biologicznie innym niż B, tworząc heterodimer związków aktywnych biologicznie lub ich prekursorów.
W innych wykonaniach E tworzy dodatkowe wią zanie ze zwią zkiem aktywnym biologicznie, B, tak że E i R są związane przez różne grupy funkcyjne tej samej cząsteczki związku aktywnego biologicznie lub jej prekursora.
PL 213 322 B1
Gdy E jest zdolny do tworzenia wiązania z cząsteczką aktywną biologicznie lub jej prekursorem, to E może być taki sam lub inny niż R, a wybiera się go spośród reszty kwasu karboksylowego, estrowej, aldehydowej, hydratu aldehydu, reszty acetalowej, grupy hydroksylowej, zablokowanej grupy hydroksylowej, reszty węglanowej, alkenylowej, akrylanowej, metakrylanowej, akryl amidowej, podstawionej lub niepodstawionej reszty tiolowej, halogenowej, podstawionej lub niepodstawionej aminowej, zablokowanej aminowej, hydrazydowej, zablokowanej hydrazydowej, sukcynimidylowej, izocyjanianowej, izotiocyjanianowej, ditiopirydynowej, winylopirydynowej, jodoacetamidowej, epoksydowej, hydroksysukcynimidylowej, azolowej, maleimidowej, sulfonowej, allilowej, winylosulfonowej, trezylowej, sulfo-N-sukcynimidylowej, dionowej, mesylowej, tosylowej lub glioksalowej.
W pewnych wykonaniach E może mieć strukturę według Wzoru III lub Wzoru IV:
Wzór III
R-HC-(CH2)n-(Y)m-Q-X-CW2CHW2—
Z
Wzór IV
R'-CH-(CH2)n-X-CW2CW2Z gdzie każdy spośród Q, X, Y, Z, m oraz n oznacza niezależnie to, co zdefiniowano powyżej, każdy spośród W oznacza niezależnie atom wodoru lub grupę alkilową C1 do C7; R” oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o Wzorze III i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem, a R”' oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o Wzorze IV i związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem.
R” i R''' wybiera się niezależnie spośród reszt kwasów karboksylowych, estrowych, aldehydowych, hydratów aldehydów, reszt acetalowych, grup hydroksylowych, zablokowanych grupę hydroksylowych, reszt węglanowych, alkenylowych, akrylanowych, metakrylanowych, akrylamidowych, podstawionych lub niepodstawionych reszt tiolowych, halogenowych, podstawionych lub niepodstawionych aminowych, zablokowanych aminowych, hydrazydowych, zablokowanych hydrazydowych, sukcynimidylowych, izocyjanianowych, izotiocyjanianowych, ditiopirydynowych, winylopirydynowych, jodoacetamidowych, epoksydowych, hydroksysukcynimidylowych, azolowych, maleimidowych, sulfonowych, allilowych, winylosulfonowych, trezylowych, sulfo-N-sukcynimidylowych, dionowych, mesylowych, tosylowych lub glioksalowych. Mogą one być takie same albo inne niż R.
Gdy są związane przy obu końcach do cząsteczki związku aktywnego biologicznie lub jego prekursora, to te cząsteczki dwufunkcyjne mogą być reprezentowane według Wzoru XXIV lub Wzoru XXV:
PL 213 322 B1 gdzie każdy spośród X i Y oznacza niezależnie grupy O, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR', SO2NR' lub NR', a każdy spośród R' i Z oznacza niezależnie atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym.
Q oznacza nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8 (włączając struktury pierścieniowe bicykliczne skondensowane i z mostkami), podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, gdzie grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Gdy są obecne, to podstawniki wybiera się z grupy, składającej się z grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sililowych, eterowych i alkilotiolowych.
Każdy spośród W oznacza niezależnie atom wodoru lub grupę alkilową C1 do C7; a oznacza liczbę całkowitą od 4 do 10000 i każdy spośród n oznacza niezależnie 0 lub liczbę całkowitą od 1 do 5.
R* i R** oznaczają niezależnie reszty łącznikowe, zgodnie z opisem powyżej, B i B' oznaczają niezależnie związki aktywne biologicznie i mogą być takie same lub różne.
E (przez R” lub R''') może tworzyć wiązanie z inną cząsteczką związku aktywnego biologicznie (B), tak że zaktywowany związek glikolu polialkilenowego jest związany przy obu końcach do cząsteczki tego samego typu związku aktywnego biologicznie, tworząc dimer cząsteczki.
W pewnych wykonaniach E (przez R” lub R''') tworzy wią zanie ze zwią zkiem aktywnym biologicznie innym niż B, tworząc heterodimer związków aktywnych biologicznie lub ich prekursorów.
W innych wykonaniach E (przez R” lub R''') tworzy dodatkowe wi ą zanie ze zwią zkiem aktywnym biologicznie, B, tak że E i R są związane przez różne grupy funkcyjne tej samej cząsteczki związku aktywnego biologicznie lub jej prekursora.
R” i R''' mogą być takie same lub inne, wybiera się je spośród reszt kwasów karboksylowych, estrowych, aldehydowych, hydratów aldehydów, reszt acetalowych, grup hydroksylowych, zablokowanych grupę hydroksylowych, reszt węglanowych, alkenylowych, akrylanowych, metakrylanowych, akrylamidowych, podstawionych lub niepodstawionych reszt tiolowych, halogenowych, podstawionych lub niepodstawionych aminowych, zablokowanych aminowych, hydrazydowych, zablokowanych hydrazydowych, sukcynimidylowych, izocyjanianowych, izotiocyjanianowych, ditiopirydynowych, winylopirydynowych, jodoacetamidowych, epoksydowych, hydroksysukcynimidylowych, azolowych, maleimidowych, sulfonowych, allilowych, winylosulfonowych, trezylowych, sulfo-N-sukcynimidylowych, dionowych, mesylowych, tosylowych lub glioksalowych.
W pewnych wykonaniach R* i R** oznaczają grupę metylenową, a B i B' oznaczają cząsteczkę aktywną biologicznie, zawierającą grupę aminową, tak że grupa metylenowa tworzy wiązanie z grupą aminową w B. Na przykład amina może być aminą końcową peptydu, aminą łańcucha bocznego aminokwasu w peptydzie lub aminą podstawnika glikozylacji w peptydzie glikozylowanym. W pewnych wykonaniach peptydem jest interferon, taki jak interferon-beta, np. interferon-beta-1a. W pewnych wykonaniach ten typ wiązania powstaje w wyniku reakcji alkilowania redukcyjnego.
Koniugaty można również otrzymywać przez sprzęganie związku aktywnego biologicznie ze związkami glikoli polialkilenowych, jak opisano w przykładach. W pewnych wykonaniach sprzęganie uzyskuje się w wyniku reakcji alkilowania redukcyjnego.
Do interesujących związków aktywnych biologicznie należą wszelkie substancje przeznaczone do diagnozy, leczenia, łagodzenia, traktowania lub zapobiegania chorobie człowieka lub innych zwierząt lub te, które w inny sposób podnoszą dobrostan fizyczny lub psychiczny ludzi lub zwierząt.
Przykłady cząsteczek aktywnych biologicznie obejmują, lecz nie ograniczają się do peptydów, analogów peptydów, białek, enzymów, małych cząsteczek, barwników, lipidów, nukleozydów, oligonukleotydów, analogów oligonukleotydów, cukrów, oligosacharydów, komórek, wirusów, liposomów, mikrocząstek, powierzchni i miceli. Ta klasa związków obejmuje również prekursory tych rodzajów cząsteczek. Klasy środków aktywnych biologicznie, które są przydatne do zastosowania obejmują, lecz nie ograniczają się do cytokin, chemokin, limfokin, rozpuszczalnych receptorów, przeciwciał, antybiotyków, środków grzybobójczych, środków antywirusowych, środków przeciwzapalnych, środków przeciwnowotworowych, środków sercowo-naczyniowych, środków przeciwlękowych, hormonów, czynników wzrostu, środków sterydowych i tym podobnych.
PL 213 322 B1
Związkiem aktywnym biologicznie może być peptyd, taki jak interferon, włączając interferonbeta (np. interferon-beta-1a) lub interferon-alfa.
Jako że modyfikacja polimeryczna PGC obniża odpowiedź antygenową, peptyd obcy nie musi być całkowicie autologiczny aby mógł zostać użyty jako lek. Na przykład, peptyd, taki jak interferon, stosowany do otrzymywania koniugatów polimerowych, może zostać otrzymany z ekstraktu pochodzącego od ssaka, takiego jak interferon człowieka, przeżuwacza, albo też wołu, czy też może zostać otrzymany syntetycznie lub na drodze rekombinacji.
Niniejszym przedstawiono związki i sposoby leczenia chorób, które są podatne na leczenie interferonem alfa lub beta. Podawanie interferonu beta koniugowanego z glikolem polialkilenowym (dalej „PGC IFN-beta”, „PGC IFN-β”, „PEG IFN-beta”, „PEG IFN-β”, „zmodyfikowany przez PEG IFN-beta”, „zmodyfikowany przez PEG IFN-β”) zapewnia poprawę korzyści leczniczych, jednocześnie znacznie obniżając, bądź całkowicie usuwając niepożądane efekty uboczne, towarzyszące zazwyczaj konwencjonalnemu stosowaniu schematów leczenia interferonem alfa lub beta.
PGC IFN-beta można otrzymać przez przyłączenie polimeru polialkilenowego do końcowej grupy aminowej cząsteczki IFN beta.
Z końcem N IFN beta w wyniku reakcji alkilowania redukcyjnego można przyłączyć pojedynczą cząsteczkę zaktywowanego glikolu polialkilenowego.
Koniugat PGC IFN-beta można skomponować na przykład w postaci cieczy lub liofilizowanego proszku do zastrzyków. Celem koniugowania IFN-beta z PGC jest poprawa dostarczalności białka przez znaczące wydłużenie jego okresu półtrwania w surowicy, a tym samym zapewnienie przedłużonej aktywności IFN beta.
Termin „interferon” lub „IFN”, zgodnie z użyciem tutaj oznacza, że rodzinę wysoce homologicznych, swoistych gatunkowo białek, które hamują replikację wirusową i proliferację komórkową oraz modulują odpowiedź immunologiczną. Interferony ludzkie grupuje się w dwie klasy; Typ I, obejmujący interferon-α i -β oraz Typ II, który reprezentuje tylko interferon-γ. Uzyskano formy rekombinowane każdej z grup, które są dostępne handlowo. Podtypy w obu tych grupach wydziela się w oparciu o ich cechy antygenowe/strukturalne.
Terminy „beta interferon, „beta-interferon”, „beta IFN”, „beta-IFN”, ..β interferon”, „β-interferon”, ..β IFN”, „β-IFN”, „interferon beta”, „interferon-beta”, „IFN beta”, „IFN-beta”, „interferon β”, „interferon-β, „IFN β”, „IFN-β” i „interferon z fibroblastów człowieka” są tu stosowane zamiennie, by opisać członków grupy interferonu beta, którzy posiadają odrębne sekwencje aminokwasowe, zidentyfikowane za pomocą wyizolowania i zsekwencjonowania DNA, kodującego peptydy.
Dodatkowo terminy „beta interferon 1a”, „beta interferon-1a”, „beta-interferon 1a”, „beta-interferon-1a”, „beta IFN 1a”, „beta IFN-1a”, „beta-IFN 1a”, „beta-IFN-1a”, „β interferon 1a”, „β interferon-1a”, „β-interferon 1a”, „β-interferon-1a”, „β IFN 1a”, „β IFN-1a”, „β-IFN 1a”, ^-IFN·^’’, „interferon beta 1a”, „interferon beta-1a”, „interferon-beta 1a”, „interferon-beta-1a”, „interferon β 1a”, „interferon-β-1a”, „interferon-β 1a, „interferon-β-1a”, „IFN beta 1a”, „IFN beta-1a”, „IFN-beta 1a”, „IFN-beta-1a”, „IFN β 1a, „IFN p-1a”, „IFN-β 1a, JFN-β·^’’, są tu stosowane zamiennie, by opisać wytwarzane metodą rekombinacji lub syntezy interferon beta, który posiada występującą naturalnie (dziki· typ) sekwencję aminokwasową.
Nadejście technologii rekombinowanego DNA, zastosowanej do wytwarzania interferonu, umożliwiło owocną syntezę kilku interferonów ludzkich, umożliwiając tym samym fermentację, produkcję, izolację i oczyszczanie różnych interferonów do homogenności na dużą skalę. Interferony wytwarzane metodą rekombinacji zachowują pewną lub w zasadzie pełną aktywność antywirusową i immunomodulatorową in vitro oraz in vivo. Należy również przyjąć, że techniki rekombinacji mogą również obejmować miejsce glikozylacji dla dodania reszty węglowodanowej do polipeptydu otrzymanego metodą rekombinacji.
Rozważa się również konstrukcję plazmidów rekombinowanego DNA, zawierających sekwencje kodujące przynajmniej część interferonu z fibroblastów człowieka i ekspresję polipeptydu, posiadającego aktywność biologiczną lub immunologiczną interferonu z fibroblastów człowieka. Za pomocą technik znanych biegłym w dziedzinie można również uzyskać konstrukcję hybrydowych genów interferonu-beta, zawierających kombinacje sekwencji różnych podtypów.
Typowe odpowiednie interferony-beta obejmują, ale nie ograniczają się do interferonu beta-1a, takiego jak AVONEX®, dostępny od Miogen, Inc., Cambridge, MA oraz interferonu beta-1b, takiego jak BETASERON®, dostępny od Berlex, Richmond, CA.
PL 213 322 B1
Istnieje wiele mechanizmów, za pośrednictwem których indukowane przez IFN produkty genów dostarczają efektów ochronnych przeciwko infekcji wirusowej. Takie efekty hamujące wirusa zachodzą w różnych stadiach cyklu życiowego wirusa. Zobacz patent USA nr 6030785. Na przykład IFN może hamować odpłaszczowanie cząstek wirusa, penetrację i/lub fuzję, powodowaną przez wirusa.
Stanami chorobowymi, które można leczyć kompozycjami farmaceutycznymi według wynalazku są zasadniczo te, które są podatne na leczenie interferonem. Na przykład, do stanów podatnych należą te, które zareagują dodatnio lub korzystnie (w sensie, w którym te terminy są znane w dziedzinie medycyny) na terapię opartą na interferonie beta. Do stanów, które można leczyć za pomocą terapii opartej na interferonie beta, opisanej tutaj, należą te stany, w których leczenie interferonem beta wykazuje pewną skuteczność, w których natomiast ujemne skutki uboczne leczenia za pomocą IFN-β przewyższają korzyści. Wynikiem leczenia może być znaczne ograniczenie lub usunięcie efektów ubocznych, w porównaniu z konwencjonalnym leczeniem interferonem beta. W dodatku możliwe jest leczenie stanów tradycyjnie uważanych za niewrażliwe na leczenie IFN-β, lub takie, w których leczenie za pomocą możliwych do podawania dawek IFN-β jest niepraktyczne.
Związki PGC IFN-β można stosować osobno lub w kombinacji z jednym lub większą liczbą środków przydatnych w leczeniu danego stanu. Przeprowadzono przynajmniej jedno badanie pilotowe rekombinowanego interferonu beta-1a w leczeniu przewlekłego zapalenia wątroby typu C. Ogólnie zobacz Habersetzer i wsp., Liver 30:437- 441 (2000). Na przykład w leczeniu infekcji wirusowej związki można podawać w kombinacji ze znanymi środkami antywirusowymi. Zobacz Kakumu i wsp., Gastroenterology 105:507-12 (1993) i Pepinsky i wsp., J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 297:1059-1066 (2001).
Zgodnie z użyciem tutaj termin „środki antywirusowe” mogą obejmować na przykład małe cząsteczki, peptydy, cukry, białka, cząsteczki pochodzenia wirusowego, inhibitory proteaz, analogi nukleotydów i/lub analogi nukleozydów. „Mała cząsteczka”, jako termin tu używany, dotyczy cząsteczki organicznej mniejszej niż około 2500 amu (jednostek masy atomowej), w przypadku korzystnym mniejszej niż około 1000 amu. Przykłady stosownych związków antywirusowych obejmują, lecz nie ograniczają się do rybawiryny, levowiryny, 3TC, FTC, MB686, zidowudyny, acyklowiru, gancyklowiru, viramidu, VX-497, VX-950 i ISIS-14803.
Przykładowe stany, które można leczyć interferonem, obejmują, lecz nie ograniczają się do zaburzeń proliferacji komórek, w szczególności stwardnienia rozsianego, raka (np. białaczki kosmatokomórkowej, mięsaka Kaposiego, białaczki szpikowej przewlekłej, szpiczaka mnogiego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka złośliwego, raka jajników, chłoniaka z limfocytów T skóry) oraz infekcji wirusowych. Nie ograniczając, leczenie interferonem może zostać wykorzystane do leczenia stanów, które uległyby poprawie dzięki zahamowaniu replikacji wirusów wrażliwych na interferon. Na przykład interferon można zastosować osobno lub w kombinacji z AZT w leczeniu wirusa niedoboru odporności człowieka (HIV)/AIDS lub w kombinacji z rybawiryną w leczeniu HCV. Infekcje wirusowe, które można leczyć obejmują, lecz nie ograniczają się do zapalenia wątroby typu A, zapalenia wątroby typu B, zapalenia wątroby typu C, innych zapaleń wątroby typu nie-A/nie-B, infekcji wirusem opryszczki, wirusem Epsteina-Barra (EBV), cytomegalowirusem (CMV), wirusem opryszczki zwykłej, ludzkim wirusem opryszczki typu 6 (HHV-6), papillomawirusem, wirusem ospy, pikornawirusem, adenowirusem, rinowirusem, ludzkim wirusem limfotropowym T typu 1 i 2 (HTLV-1/-2), ludzkim rotawirusem, wścieklizny, infekcji retrowirusem, w tym HIV, zapalenia opon mózgowych i infekcji dróg oddechowych. Sposoby tu opisane można również zastosować do modyfikowania różnych reakcji immunologicznych.
Zaobserwowano korelację pomiędzy genotypem HCV i odpowiedzią na terapię interferonem. Zobacz patent USA nr 6030785; Enomoto i wsp., N. Engl. J. Med.334:77-81 (1996); Enomoto i wsp., J. Clin. Invest. 96:224-30 (1995). Stopień odpowiedzi u pacjentów zarażonych HCV-1b wynosi mniej niż 40%. Zobacz patent USA nr 6030785. Podobnie niski stopień odpowiedzi zaobserwowano u pacjentów zarażonych HCV-1a. Zobacz tamże, Hoofnagel i wsp., Intervirology 37:87-100 (1994). Jednakże stopień odpowiedzi u pacjentów zarażonych HCV-2 wynosi blisko 80%. Zobacz patent USA nr 6030785; Fred i wsp., Semin. Liver Dis. 15:82-91 (1995). Stwierdzono w istocie, że sekwencja aminokwasowa szczególnego obszaru białka NS5A genotypu 1b HCV koreluje z wrażliwością na interferon. Zobacz patent USA nr 6030785. Zobacz również Enomoto i wsp., 1996; Enomoto i wsp., 1995. Zidentyfikowano również ten obszar jako obszar determinujący wrażliwość na interferon (ISDR).
Koniugat PGC IFN-beta podawany jest w ilości skutecznej farmakologicznie w celu leczenia dowolnego spośród stanów opisanych powyżej, co opiera się na aktywności IFN beta w koniugacje polimerycznym. Termin „ilość skuteczna farmakologicznie” oznacza ilość leku lub środka farmaceuPL 213 322 B1 tycznego, który wywoła reakcję biologiczną lub medyczną tkanki, układu, zwierzęcia lub człowieka, pożądanej przez badacza lub klinicystę. Jest to ilość, która wystarcza do wywołania w znaczącym stopniu dodatniej odpowiedzi klinicznej, przy utrzymaniu obniżonego poziomu efektów ubocznych. Ilość PGC IFN-beta, którą można podawać pacjentowi w takiej potrzebie, mieści się w zakresie 0,01-100 do μg-100 μg/kg, a w przypadku bardziej korzystnym 0,01-100 do μg-10 μg/kg, podawanym w dawce pojedynczej lub podzielonej.
Podawanie opisanych dawek może następować co drugi dzień, ale w przypadku korzystnym zachodzi raz w tygodniu lub raz na dwa tygodnie. Dawki podawane są przez okres co najmniej 24 tygodni w zastrzykach.
Podawanie dawki może być doustne, miejscowe, dożylne, podskórne, domięśniowe lub za pomocą wszelkich innych sposobów ogólnoustrojowych. W oparciu o ocenę lekarza prowadzącego, ilość podawanego leku oraz schemat leczenia będą zależeć od leku, płci i historii medycznej leczonego pacjenta, liczności neutrofili (np. zaawansowania neutropenii), zaawansowania konkretnej jednostki chorobowej oraz tolerancji pacjenta na leczenie, uwidoczniającej się przez toksyczność lokalną i ustrojowe efekty uboczne.
W praktyce koniugaty tu opisane podawane są w ilościach, które będą wystarczające dla zahamowanie lub zapobieżenia niepożądanym stanom chorobowym lub chorobom pacjenta, będącego ssakiem i będą stosowane w postaci najodpowiedniejszej dla danej potrzeby. W przypadku korzystnym kompozycje są odpowiednie dla stosowania wewnętrznego i zawierają skuteczną ilość aktywnego farmakologicznie związku, osobno lub w kombinacji z innymi środkami aktywnymi, wraz z jednym lub większą liczbą dopuszczalnych farmaceutycznie nośników. Związki te są szczególnie użyteczne dzięki temu, że mają bardzo niską, jeśli w ogóle jakąkolwiek toksyczność.
Opisane tu koniugaty mogą tworzyć składnik aktywny kompozycji farmaceutycznej i zazwyczaj podaje się je w mieszaninie z odpowiednimi rozcieńczalnikami farmaceutycznymi, zaróbkami lub nośnikami (nazywanymi tu zbiorczo materiałami „nośnikowymi”), dobieranymi odpowiednio z punktu widzenia zamierzonej formy podawania, to jest tabletek doustnych, kapsułek, eliksirów, syropów i tym podobnych. Kompozycje będą zazwyczaj zawierać skuteczną ilość związku aktywnego lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli i w dodatku mogą zawierać wszelkie materiały nośnikowe, które są zwyczajowo stosowane w naukach farmaceutycznych. W zależności od zamierzonej formy podawania, kompozycje mogą mieć postać dawkowania stałą, półstałą lub płynną, taką jak na przykład materiały do zastrzyków, tabletki, czopki, pigułki, kapsułki z opóźnionym uwalnianiem, proszki, ciecze, zawiesiny i typ podobnie, w przypadku korzystnym w dawkach pojedynczych.
W praktyce można stosować konwencjonalne kompozycje farmaceutyczne, zawierające skuteczną farmaceutycznie ilość koniugatu, np. PGC IFN-beta, wraz z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami, adiuwantami, rozcieńczalnikami, konserwantami i/lub solubilizatorami.
Kompozycje farmaceutyczne interferonu zawierają rozcieńczalniki z różnymi buforami (np. arginina, Tris-HCl, octan, fosforan), posiadającymi zakres pH i siły jonowej, nośnikami (np. albuminą osocza krwi człowieka), solubilizatorami (np. tween, polisorbinian) i konserwantami (np. alkohol benzylowy). Zobacz na przykład patent USA nr 4496537.
Podawanie związków aktywnych tu opisanych może zachodzić za pośrednictwem wszelkich dopuszczalnych sposobów podawania środków leczniczych. Te sposoby obejmują podawanie ogólnoustrojowe lub lokalne, takie jak doustne, donosowe, pozajelitowe, przezskórne, podskórne lub miejscowe.
Na przykład do podawania doustnego w postaci tabletki lub kapsułki (np. kapsułki żelatynowej) składnik aktywny leku można połączyć z nietoksycznym, dopuszczalnym farmaceutycznie, neutralnym nośnikiem doustnym, takim jak etanol, glicerol, woda i tym podobne. Ponadto, gdy jest to pożądane lub konieczne, do mieszaniny można włączyć odpowiednie substancje łączące, poślizgowe, dezintegrujące i barwniki. Do odpowiednich substancji łączących należą skrobia, krzemian magnezowoglinowy, pasta skrobiowa, żelatyna, metyloceluloza, sól sodowa karboksymetylocelulozy i/lub poliwinylopirolidon, cukry, słodziki na bazie kukurydzy, gumy naturalne i syntetyczne, takie jak guma arabska, tragakant lub alginian sodu, glikol polietylenowy, woski i tym podobne. Do substancji poślizgowych, stosowanych dla tej postaci dawkowania, należą oleinian sodu, stearynian sodu, stearynian magnezu, benzoesan sodu, octan sodu, chlorek sodu, krzemionka, talk, kwas stearynowy, jego sól magnezowa bądź wapniowa i/lub glikol polietylenowy i tym podobne. Do substancji dezintegrujących należą, bez ograniczeń, skrobia, metyloceluloza, agar, bentonit, skrobie gumy ksantanowej, agar, kwas alginowy lub jego sól sodowa lub mieszaniny musujące czy tym podobne. Do rozcieńczalników należą np. laktoza, dekstroza, cukroza, mannitol, sorbitol, celuloza i/lub glicyna.
PL 213 322 B1
Koniugaty opisane niniejszym można również podawać w takich postaciach dawkowania doustnego, jak tabletki lub kapsułki o opóźnionym uwalnianiu lub przedłużonym uwalnianiu, pigułki, proszki, granulki, eliksiry, nalewki, zawiesiny, syropy i emulsje.
Ciecze, szczególnie kompozycje do zastrzyków można na przykład otrzymać przez rozpuszczanie, rozpraszanie itp. Związek aktywny rozpuszcza się lub miesza z rozpuszczalnikiem o czystości farmaceutycznej, takim jak na przykład woda, roztwór soli fizjologicznej, roztwór wodny dekstrozy, glicerol, etanol i tym podobne, by uzyskać w ten sposób roztwór lub zawiesinę do zastrzyków. Można ponadto skomponować postacie stałe, dla rozpuszczania a cieczy przed zastrzykiem. W przypadku korzystnym kompozycje do zastrzyków są wodnymi roztworami lub zawiesinami izotonicznymi. Kompozycje można wyjaławiać i/lub dodawać do nich adiuwanty, takie jak środki konserwujące, stabilizujące, zwilżające lub emulgujące, promotory rozpuszczania, sole dla regulacji ciśnienia osmotycznego i/lub bufory. W dodatku mogą one również zawierać inne wartościowe leczniczo substancje.
Koniugaty można podawać w postaci dożylnej (np. bolus lub wlew), dootrzewnowej, podskórnej lub domięśniowej, we wszystkich przypadkach stosując formy dobrze znane osobom o zwykłej biegłości w dziedzinie farmacji. Środki do zastrzyków można wytwarzać w postaci konwencjonalnej, jako roztwory ciekłe lub zawiesiny.
Dla zastrzyków i wlewów podskórnych, domięśniowych i dożylnych stosowane jest ogólnie podawanie zastrzyków pozajelitowych. Na przykład gdy dla podania 0,01-100 μο/kg, a w przypadku bardziej korzystnym 0,01-10 μg/kg zmodyfikowanego za pomocą PEG INF-beta w ciągu tygodnia stosuje się zastrzyk podskórny, to można podać dwa zastrzyki po 0,005-50 μg/kg, a w przypadku bardziej korzystnym 0,005-5 μg/kg w czasie 0 i 72 godziny. Jeden ze sposobów podawania pozajelitowego wykorzystuje dodatkowo implantację układu powolnego uwalniania lub przedłużonego uwalniania, który zapewnia stały poziom dawkowania, zgodnie z patentem USA nr 3710795.
Ponadto koniugaty można podawać w postaci donosowej przez zastosowanie miejscowe odpowienich nośników donorowych lub w postaci przezskómej, z użyciem postaci plastrów przezskómych, dobrze znanych osobom o zwykłej biegłości w dziedzinie. Przy podawaniu za pomocą układu podawania przezskómego, podawanie dawki jest oczywiście ciągłe, a nie przerywane, w trakcie schematu dawkowania. Do innych korzystnych preparatów miejscowych należą kremy, maści, mleczka, aerozole, rozpylacze i żele, przy czym podawana ilość wynosiłaby 10-100 razy więcej niż dawka dostarczana zazwyczaj przy podawaniu pozajelitowym.
Do zaróbek dla kompozycji stałych można zastosować farmaceutyczne formy mannitolu, laktozy, skrobi, stearynianu magnezu, soli sodowej sacharyny, talku, celulozy, glukozy, sacharozy, węglanu magnezu i tym podobnych. Zdefiniowany powyżej związek aktywny można również skomponować jako czopki, stosując jako nośniki na przykład glikole polialkilenowe, na przykład glikol polipropylenowy. W pewnych wykonaniach korzystne jest sporządzanie czopków z emulsji lub zwiesin tłuszczowych.
Koniugaty można również podawać w postaci liposomowych układów podawania, takich jak małe pęcherzyki jednowarstwowe, duże pęcherzyki jednowarstwowe i pęcherzyki wielowarstwowe. Liposomy można sporządzać z rozmaitych fosfolipidów, zawierających cholesterol, stearyloaminę lub fosfatydylocholiny. W pewnych wykonaniach film składników lipidowych uwodnią się za pomocą roztworu wodnego leku, tworząc warstwę lipidową, otaczającą lek, jak opisano w patencie USA nr 5262564.
Koniugaty można również podawać z użyciem fuzji z immunoglobulinami, jako nośnikami indywidualnymi, z którymi są sprzęgane cząsteczki związku.
Koniugaty można również sprzęgać z rozpuszczalnymi polimerami jako sterowalnymi nośnikami leków. Do takich polierów należy poliwinylopirolidon, kopolimer piranu, polihydroksypropylo-metakryloamido-fenol, polihydroksyetyloaspanamidofenol lub politlenek etylenu-polilizyna, podstawiona resztami palmitynowymi. Koniugaty można również sprząc z białkami, takimi jak na przykład białka receptorowe i albumina. Związki można ponadto sprzęgać z klasą polimerów biodegradowalnych, przydatnych dla osiągania kontrolowanego uwalniania leku, np. kwasem polimlekowym, poliepsilon-kaprolaktonem, kwasem polihydroksymasłowym, poliortoestrami, poliacetalami, polidihydropiranami, policyjanoakrylanami i usieciowanymi lub amfipatycznymi kopolimerami blokowymi hydrożeli.
Jeśli jest to pożądane, to kompozycje farmaceutyczne, które mają być podawane, mogą również zawierać małe ilości nietoksycznych substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające lub emulgujące, środki buforujące pH i inne substancje, takie jak na przykład octan sodu, oleinian trietanolaminy itp. Schemat dawkowania, wykorzystujący kioniugaty, dobiera się na podstawie rozmaitych czynników, takich jak rodzaj, gatunek, wiek, waga, płeć i choroba pacjenta, zaawansowanie choroby, którą ma się leczyć, droga podawania, funkcje wątrobowe i nerkowe pacjenta oraz konPL 213 322 B1 kretny związek, lub jego sól, który ma być podawany. Bierze się pod uwagę aktywność związków i wrażliwość pacjenta na efekty uboczne. Lekarz lub weterynarz o zwykłej biegłości może z łatwością ustalić i przepisać skuteczną ilość leku, wymaganą do zapobieżenia, przeciwdziałania lub zatrzymania postępu choroby.
Dawkowanie doustne, gdy stosuje się je wobec wskazanych efektów, mieści się pomiędzy około 0,01-100 μg/kg dziennie, w przypadku bardziej korzystnym 0,01-10 μg/kg dziennie. W przypadku korzystnym kompozycje są dostarczane w postaci odliczonych tabletek, zawierających 0,5-5000 μg, a w przypadku bardziej korzystnym 0,5-500 μg.
Można stosować dawki pojedyncze lub podzielone dla każdej drogi podawania. Na przykład związki mogą być podawane codziennie lub raz na tydzień, w dawce pojedynczej, albo też dawka całkowita może zostać podana w dawkach podzielonych na dwie, trzy lub cztery porcje.
Każda z powyższych kompozycji farmaceutycznych może zawierać 0,1-99%, 1-70% lub, w przypadku korzystnym, 1-50% związków tu opisanych jako składników aktywnych.
Zgodnie z opisem powyżej przebieg choroby i odpowiedź na podawanie leku można monitorować za pomocą badań klinicznych i laboratoryjnych. Skuteczność leczenia jest określona przez zakres, w jakim uległy złagodzeniu opisane uprzednio oznaki i objawy choroby, np. przewlekłego zapalenia wątroby oraz przez zakres, w jakim zostają wyeliminowane lub znacząco ograniczone normalne efekty uboczne interferonu (tj. objawy grypopochodne, takie jak gorączka, ból głowy, dreszcze, bóle mięśniowe, uczucie zmęczenia oraz objawy związane z ośrodkowym systemem nerwowym, takie jak depresja, parestezja, zaburzenia koncentracji).
W pewnych wykonaniach związek polialkilowany (np. interferon zmodyfikowany za pomocą PEG) jest podawany w powiązaniu z jednym lub większą liczbą środków farmaceutycznych, przydatnych w leczeniu danej choroby. Na przykład białko polialkilowane można podawać w kombinacji ze znanym środkiem antywirusowym lub środkiem, służącym leczeniu infekcji wirusowej. Do środków antywirusowych należą na przykład rybawiryna, levowiryna, 3TC, FTC, MB686, zidowudyna, acyklowir, gancyklowir, viramid, VX-497, VX-950 i ISIS-14803.
Koniugat i środek antywirusowy mogą być podawane jednocześnie (np. środki są podawane pacjentowi razem); podawane kolejno (np. środki są podawane pacjentowi jeden po drugim) lub podawane alternatywnie (np. środki są podawane w powtarzalnej serii, takiej jak środek A, potem środek B, potem środek A itp.).
PGC IFN-beta (np. PEG IFN-beta) może być podawany pacjentom, zakażonym wirusem zapalenia wątroby typu C. Korzystnejest zastosowanie PEG IFN-beta-1a.
Pacjentów wybiera się do leczenia spośród pacjentów pozytywnych ze względu na przeciwciała anty-HCV z aktywnym przewlekłym zapaleniem wątroby, udokumentowanym przez biopsję.
W celu badania przebiegi replikacji HCV u pacjentów w odpowiedzi na podawanie leku można mierzyć RNA HCV w próbkach surowicy, przez na przykład zagnieżdżony test reakcji łańcuchowej polimerazy, który wykorzystuje dwa zbiory primerów, wywiedzionych z regionów genów niestrukturalnych NS3 i NS4 genomu HCV. Zobacz Farci i wsp., 1991, New Eng. J. Med. 325:98-104. Ulrich i wsp., 1990 J. Clin. Incest., 86:1609-1614.
Aktywność antywirusową można mierzyć za pośrednictwem zmian miana RNA HCV. Dane o RNA HCV można analizować porównując miana przy końcu leczenia z pomiarem odniesienia przed leczeniem. Obniżenie RNA HCV w 4 tygodniu stanowi dowód aktywności antywirusowej związku. Zobacz Kleter i wsp., 1993, Antimicrob. Agents Chemother. 37(3):595-7; Orito i wsp., 1995, J. Medical Virology, 46:109-115. Zmiana o przynajmniej dwa rzędy wielkości (>2 log) jest interpretowana jako dowód aktywności antywirusowej.
Osoba cierpiąca na przewlekłą infekcję zapalenia wątroby typu C może przejawiać jeden lub większą liczbę następujących oznak lub objawów: (a) podwyższony poziom aminotransferazy alaninowej (ALT), (b) pozytywny test na przeciwciała anty-HCV, (c) obecność HCV wykazana przez pozytywny test na RNA HCV, (d) obraz kliniczny przewlekłego schorzenia wątroby, (e) uszkodzenie komórek wątroby. Takie kryteria mogą zostać zastosowane nie tylko do diagnozowania zapalenia wątroby typu C, ale można ich użyć do oceny odpowiedzi pacjenta na podawanie leku.
Wiadomo, że podwyższona aminotransferaza alaninowa (ALT) i aminotransferaza aspartylowa (AST) występują w niekontrolowanym zapaleniu wątroby typu C, a pełna odpowiedź na leczenie jest generalnie definiowana jako normalizacja tych enzymów w surowicy, szczególnie ALT. Zobacz Davis i wsp., 1989, New Eng. J. Med. 321:1501-1506. ALT jest enzymem uwalnianym, gdy niszczone są komórki wątroby, symptomatycznym dla infekcji HCV. Interferon powoduje syntezę enzymu syntetazy
PL 213 322 B1
2',5'-oligoadenylowej (2'5'OAS), który ze swej strony powoduje degradację mRNA wirusa. Zobacz
Houglum, 1983, Clinical Pharmacology 2:20-28. Podniesienie poziomu 2'5'OAS w surowicy współwystępuje z obniżeniem poziomu ALT.
Badanie histologiczne próbek biopsji wątroby może zostać wykorzystane jako drugie kryterium oceny. Zobacz np. Knodell i wsp., 1981, Hepatology 1:431-435, podany tam Histologiczny Indeks Aktywności (zapalenie żyły wrotnej, martwica kęsowa lub mostkująca, uszkodzenie płatu i zwłóknienie) dostarcza metody zliczeniowej dla aktywności choroby.
Bezpieczeństwo i tolerancję leczenia można ustalić w badaniu klinicznym i pomiarze liczności krwinek białych i neutrofili. Można to kontrolować za pomocą okresowego monitorowania parametrów hematologicznych, np. krwinek białych, neutrofili, płytek i krwinek czerwonych.
Za pomocą konwencjonalnych sposobów znanych w dziedzinie można sporządzić rozmaite inne kompozycje o uwalnianiu przedłużonym lub długotrwałym.
Przykłady
P r z y k ł a d 1: Synteza zaktywowanych glikoli polialkilenowych
A) Alkilowanie alkoholi
Zaktywowane glikole polialkilenowe syntezuje się przez alkilowanie glikoli polialkilenowych, posiadających wolną końcową alkoholową grupę funkcyjną. Ogólna reakcja jest przedstawiona na Schemacie I.
Glikol polialkilenowy (P-OH) reaguje z halidem alkilu (A), tworząc eter (B). Związek B jest następnie hydroksylowany, tworząc alkohol (C), który jest utleniany do aldehydu (D). W tych związkach n oznacza liczbę całkowitą od jeden do pięć, a Z oznacza nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Z może również oznaczać nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C7, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową, albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową (grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20). Dla związków podstawionych podstawniki mogą być grupami halogenowymi, hydroksylowymi, karbonylowymi, karboksylowymi, estrowymi, mrówczanowymi, acylowymi, tiokarbonylowymi, tioestrowymi, tiooctanowymi, tiomrówczanowymi, alkoksylowymi, fosforylowymi, fosfonianowymi, fosfinianowymi, aminowymi, amidowymi, amidynowymi, iminowymi, cyjanowymi, nitrowymi, azydowymi, sulfhydrylowymi, siarczanowymi, sulfonianowymi, sulfamoilowymi, sulfonamidowymi, sulfonylowymi, heterocyklilowymi, aryloalkilowymi, resztami aromatycznymi, resztami heteroaromatycznymi, grupami iminowymi, sililowymi, eterowymi lub alkilotiolowymi. Zazwyczaj P-OH oznacza glikol polietylenowy (PEG) lub glikol monoetoksy-polietylenowy (mPEG), posiadający masę cząsteczkową 5000 do 40000 daltonów (Da).
Synteza mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu jest przedstawiona dla przykładu na Schemacie II.
PL 213 322 B1 mPEG-OH o masie cząsteczkowej 20000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) zadano NaH (12 mg, 0,5 mmol) w THF (35 ml). Następnie dodano do mieszaniny pięćdziesiąt równoważników 3-bromo-2-metylopropenu (3,34 g, 5 mmol) oraz katalityczną ilość KI. Powstałą mieszaninę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 16 godz. Następnie dodano wodę (1 ml), po czym rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. Do pozostałości dodano CH2CI2 (25 ml), warstwę organiczną oddzielono, wysuszono nad bezwodnym Na2SO4, po czym zredukowano objętość do około 2 ml. Ten roztwór CH2Cl2 wkroplono do eteru (150 ml). Zebrano otrzymany biały osad, otrzymując 1,9 g związku 1. 1HNMR (CDCla, 400 MHz) wykazał δ 4,98 (s, 1H), 4,91 (s, 1H), 1,74 (s, 3H).
Do związku 1 (1,9 g, 0,1 mmol) w THF (20 ml) i CH2Cl2 (2 ml) w 0°C dodano BH3 w THF (1,0 M, 3,5 ml). Mieszaninę mieszano w łaźni lodowej przez 1 godz. Do tej mieszaniny powoli dodano NaOH (2,0 M, 2,5 ml), a następnie 30% H2O2 (0,8 ml). Mieszaninę ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez około 16 godz. Przeprowadzono powyższą procedurę odzyskiwania produktu (CH2Cl2, wytrącanie z eteru), otrzymując 1,8 g 2 w postaci białego ciała stałego.
Związek 2 (250 mg) rozpuszczono w CH2Cl2 (2,5 ml), po czym dodano nadjodynianu Dessa-Martina (DMP; 15 mg), mieszając przez 30 min w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny dodano nasycony NaHCO3 i Na2S2O3 (2 ml), po czym mieszano mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Przeprowadzono powyższą procedurę odzyskiwania produktu, otrzymując 3 (mPEG-O-2-metylopropionoaldehyd, 120 mg) w postaci białego ciała stałego. 1HNMR (CDCl3, 400 MHz) wykazał δ 9,75 (s, 1H), 2,69 (m, 1H), 1,16 (d, 3H).
Dla alkoholi aromatycznych postępuje się w myśl podobnej procedury, co ukazuje Schemat III.
PL 213 322 B1
Ogólnie, alkohol aromatyczny (E) reaguje z halidem alkilu (A), tworząc monoeter (F). Pozostałą grupę alkoholową związku przekształca się w halid (np. bromek) w związku G, który następnie reaguje z glikolem polialkilenowym (P-OH), tworzą c eter (H). Ten zwią zek zostaje przekształ cony w aldehyd (J) przez hydroborowanie do alkoholu pierwszorzędowego (I), a następnie utlenienie. W tych związkach n oznacza liczbę całkowitą od zero do pięć, d oznacza liczbę całkowitą od jeden do cztery, a Z oznacza nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20. Z może również oznaczać nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C7, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową, albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową (grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20). Dla związków podstawionych podstawniki mogą być grupami halogenowymi, hydroksylowymi, karbonylowymi, karboksylowymi, estrowymi, mrówczanowymi, acylowymi, tiokarbonylowymi, tioestrowymi, tiooctanowymi, tiomrówczanowymi, alkoksylowymi, fosforylowymi, fosfonianowymi, fosfinianowymi, aminowymi, amidowymi, amidynowymi, iminowymi, cyjanowymi, nitrowymi, azydowymi, sulfhydrylowymi, siarczanowymi, sulfonianowymi, sulfamoilowymi, sulfonamidowymi, sulfonylowymi, heterocyklilowymi, aryloalkilowymi, resztami aromatycznymi, resztami heteroaromatycznymi, grupami iminowymi, sililowymi, eterowymi lub alkilotiolowymi.
Dodatkowo T1 i T2 niezależnie są nieobecne lub oznaczają nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, mogąc mieć konfigurację względną orto, meta i para.
Każdy spośród R' i Z oznacza niezależnie atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym. Każdy spośród L oznacza niezależnie nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20. Podstawniki wybiera się spośród grup halogenowych, hydroksylowych, karbonylowych, karboksylowych, estrowych, mrówczanowych, acylowych, tiokarbonylowych, tioestrowych, tiooctanowych, tiomrówczanowych, alkoksylowych, fosforylowych, fosfonianowych, fosfinianowych, aminowych, amidowych, amidynowych, iminowych, cyjanowych, nitrowych, azydowych, sulfhydrylowych, siarczanowych, sulfonianowych, sulfamoilowych, sulfonamidowych, sulfonylowych, heterocyklilowych, aryloalkilowych, reszt aromatycznych, reszt heteroaromatycznych, grup iminowych, sililowych, eterowych lub alkilotiolowych.
Zazwyczaj P-OH oznacza glikol polietylenowy (PEG) lub monometoksy glikol polietylenowy (mPEG), posiadający masę cząsteczkową od 5000 do 40000 Da.
Dla przykładu Schemat IV przedstawia syntezę mPEG-O-p-metylofenylo-O-2-metylopropiono-
PL 213 322 B1
Do roztworu alkoholu 4-hydroksybenzylowego (2,4 g, 20 mmol) w THF (50 ml) i wodzie (2,5 ml) dodano najpierw wodorotlenek sodu (1,5 g, 37,5 mmol), a następnie 3-bromo-2-metylopropen (4,1 g, mmol). Tą mieszaninę reakcyjną ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 16 godz. Do mieszaniny dodano 10% kwas cytrynowy (2,5 ml), po czym usunięto rozpuszczalnik pod próżnią. Pozostałość wyekstrahowano octanem etylu (3 X 15 ml), a połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym
NaCl (10 ml), wysuszono i zatężono, otrzymując związek 4 (3,3 g, 93%). 1HNMR (CDCI3, 400 MHz) wykazał δ 7,29(m, 2H), 6,92 (m, 2H), 5,14(s, 1H), 5,01(s, 1H), 4,56(s, 2H), 4,46(s, 2H), 1,85(s, 3H).
Chlorek metylu (MsCl; 2,5 g, 15,7 mmol) i trietyloaminę (TEA; 2,8 ml, 20 mmol) dodano do roztworu związku 4 (2,0 g, 11,2 mmol w CH2CI2 (25 ml) w 0°C i mieszaninę reakcyjną umieszczono w lodówce na 16 godz. Typowa procedura odzyskiwania produktu dała jasnożółty olej (2,5 g, 87%). %). 1HNMR (CDCI3, 400 MHz) wykazał δ 7,31 (m, 2H), 6,94 (m, 2H), 5,16 (s, 1H), 5,01 (s, 1H), 5,03 (s, 2H), 4,59 (s, 2H), 4,44 (s, 2H), 3,67 (s, 3H), 1,85 (s, 3H). Ten olej (2,4 g, 9,4 mmol) rozpuszczono w THF (20 ml) i dodano LiBr (2,0 g, 23,0 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 1 godz., po czym ochłodzono ją do temperatury pokojowej. Do mieszaniny dodano wodę (2,5 ml), po czym usunięto rozpuszczalnik pod próżnią. Pozostałość wyekstrahowano octanem etylu (3 x 15 ml), a połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym NaCl (10 ml), wysuszono nad bezwodnym Na2SO4 i zatężono, otrzymując pożądany bromek 5 (2,3 g, 96%) jako jasnożółty olej. 1HNMR (CDCl3, 400 MHz) wykazał δ 7,29 (m, 2H), 6,88 (m, 2H), 5,11 (s, 1H), 4,98 (s, 1H), 4,53 (s, 2H), 4,44 (s, 2H), 1,83 (s, 3H). mPEG-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) zadano NaH (12 mg, 0,5 mmol) w THF (35 ml), a następnie dodano do mieszaniny związek 5 (0,55 g, 22,8 mmol) wraz z katalityczną ilością KI. Powstałą mieszaninę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 16 godz. Następnie dodano wodę (1,0 ml), po czym rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. Do pozostałości dodano CH2Cl2 (25 ml), warstwę organiczną oddzielono, wysuszono nad bezwodnym Na2SO4, po czym zredukowano objętość do około 2 ml. Wkroplenie do eteru (150 ml) dało biały osad, który zebrano, otrzymując 6 (1,5 g) w postaci białego proszku. 1HNMR (CDCl3, 400 MHz) wykazał δ 7,21 (d, 2H), 6,90 (d, 2H), 5,01 (s, 1H), 4,99 (s, 1H), 4,54 (s, 2H), 4,43 (s, 2H), 1,84 (s, 3H).
Do roztworu związku 6 (1,0 g, 0,05 mmol) w THF (10 ml) i CH2CI2 (2 ml), ochłodzonego do 0°C dodano BH3/THF (1,0 M, 3,5 ml), po czym mieszaninę mieszano przez 1 godz. Do tej mieszaniny powoli dodano 2,0 M NaOH (2,5 ml), a następnie 30% H2O2 (0,8 ml). Mieszaninę odstawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano przez 16 godz. Przeprowadzono powyższą procedurę odzyskiwania produktu (CH2CI2, wytrącanie z eteru), otrzymując 7 (350 mg) w postaci białego ciała stałego. 1HNMR (CDCI3, 400 MHz) wykazał δ 7,21 (d, 2H), 6,84 (d, 2H), 4,54 (s, 2H), 2,90 (m, 2H), 1,96 (d, 3H).
Związek 7 (150 mg, 0,0075 mmol) rozpuszczono w CH2CI2 (1,5 ml), po czym dodano DMP (15 mg), mieszając przez 1,5 godz. w temperaturze pokojowej. 1HNMR (CDCl3, 400 MHz) wykazał δ 9,76 (s, 1H), 7,21 (d, 2H), 6,78 (d, 2H), 4,44 (s, 2H), 4,14 (m, 2H), 2,85 (m, 1H), 1,21 (d, 3H). Do mieszaniny dodano nasycony NaHCO3 (0,5 ml) i Na2S2O3 (0,5 ml), po czym kontynuowano mieszanie w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Przeprowadzono powyższą procedurę odzyskiwania produktu (CH2CI2, wytrącanie z eteru), otrzymując 8 (92 mg) w postaci białego ciała stałego.
mPEG-O-w-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehyd (9) zsyntezowano podobnie, jak przedstawiono na Schemacie V.
PL 213 322 B1
Do roztworu alkoholu 3-hydroksybenzylowego (2,4 g, 20 mmol) w THF (50 ml) i wodzie (2,5 ml) dodano najpierw wodorotlenek sodu (1,5 g, 37,5 mmol), a następnie 3-bromo-2-metylopropen (4,1 g, mmol). Tą mieszaninę reakcyjną ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 16 godz. Do mieszaniny dodano 10% kwas cytrynowy (2,5 ml), po czym usunięto rozpuszczalnik pod próżnią. Pozostałość wyekstrahowano octanem etylu (3 X 15 ml), a połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym NaCl (10 ml), wysuszono i zatężono, otrzymując związek 10 (3,2 g, 90%). 1HNMR (CDCl3, 400 MHz) wykazał δ 7,26 (m, 2H), 6,94 (m, 2H), 6,86 (m, 1H), 5,11 (s, 1H), 5,01 (s, 1H), 4,61 (s, 1H), 4,44 (s, 2H), 1,82 (s, 3H).
MsCl (2,5 g, 15,7 mmol) i TeA (2,8 ml, 20 mmol) dodano do roztworu związku 10 (2,0 g, 11,2 mmol w CH2CI2 (25 ml) w 0°C i mieszaninę reakcyjną umieszczono w lodówce na 16 godz. Typowa procedura odzyskiwania produktu dała jasnożółty olej (2,5 g, 87%). 1HNMR (CDCl3, 400 MHz) wykazał δ 7,31 (m, 2H), 7,05 (m, 2H), 6,91 (m, 1H), 5,16 (s, 1H), 5,04 (s, 1H), 4,59 (s, 1H), 4,46 (s, 2H), 3,71 (s, 3H), 1,84 (s, 3H). Ten olej (2,4 g, 9,4 mmol) rozpuszczono w THF (20 ml) i dodano LiBr (2,0 g, 23,0 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 1 godz., po czym ochłodzono ją do temperatury pokojowej. Do mieszaniny dodano wodę (2,5 ml), po czym usunięto rozpuszczalnik pod próżnią. Pozostałość wyekstrahowano octanem etylu (3x15 ml), a połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym NaCl (10 ml), wysuszono nad bezwodnym Na2SO4 i zatężono, otrzymując pożądany bromek 11 (2,2 g, 92%) jako jasnożółty olej. 1HNMR (CDCl3, 400 MHz) wykazał δ 7,29 (m, 2H), 6,98 (m, 2H), 6,85 (m, 1H), 5,14 (s, 2H), 4,98 (s, 2H), 4,50 (s, 2H), 4,44 (s, 2H), 1,82 (d, 3H).
mPEG-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) zadano NaH (12 mg, 0,5 mmol) w THF (35 ml), a następnie dodano do mieszaniny związek 11 (0,55 g, 22,8 mmol) wraz z katalityczną ilością KI. Powstałą mieszaninę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 16 godz. Następnie dodano wodę (1,0 ml), po czym rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. Do pozostałości dodano CH2CI2 (25 ml), warstwę organiczną oddzielono, wysuszono nad bezwodnym Na2SO4. Po czym zredukowano objętość do około 2 ml. Wkroplenie do eteru (150 ml) dało biały osad, który zebrano, otrzymując 12 (1,8 g) w postaci białego proszku. 1HNMR (CDCfe, 400 MHz) wykazał δ 7,19 (m, 1H), 6,88 (m, 2H), 6,75 (m, 1H), 4,44 (s, 2H), 4,10 (m, 2H), 1,82 (d, 3H).
Do roztworu związku 12 (1,0 g, 0,05 mmol) w THF (7,5 ml) i CH2Cl2 (2,5 ml), ochłodzonego do 0°C dodano BH3/THF (1,0 M, 3,5 ml), po czym mieszaninę mieszano przez 1 godz. Do tej mieszaniny powoli dodano 2,0 M NaOH (3 ml), a następnie 30% H2O2 (0,85 ml). Mieszaninę odstawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano przez 16 godz. Przeprowadzono powyższą procedurę odzyskiwania produktu (CH2CI2, wytrącanie z eteru), otrzymując 13 (450 mg) w postaci białego ciała stałego. 1HNMR (CDCl3, 400 MHz) wykazał δ 7,15 (m, 1H), 6,84 (m, 2H), 6,69 (m, 1H), 4,50 (s, 2H), 2,90 (m, 2H), 1,95 (d, 3H).
Związek 13 (200 mg, 0,01 mmol) rozpuszczono w CH2Cl2 (1,5 ml), po czym dodano DMP (20 mg), mieszając mieszaninę reakcyjną przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. 1HNMR (CDCl3, 400 MHz) wykazał δ 9,74 (s, 1H), 7,17 (m, 1H), 6,86 (m, 2H), 6,74 (m, 1H), 4,48 (s, 2H), 4,15 (m, 2H), 2,78 (m, 1H), 1,22 (d, 3H). Do mieszaniny dodano nasycony NaHCO3 (0,5 ml) i Na2S2O3 (0,5 ml), po czym kontynuowano mieszanie w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Przeprowadzoną powyższą procedurę odzyskiwania produktu (CH2Cl2, wytrącanie z eteru), otrzymując 9 (142 mg) w postaci białego ciała stałego.
B) Otrzymywanie w reakcji z alkoholami aromatycznymi
Zaktywowane glikole polialkilenowe syntezuje się w reakcji Mitsunobu pomiędzy glikolem polialkilenowym, posiadającym wolną końcową alkoholową grupę funkcyjną i alkoholem aromatycznym. Ogólna reakcja jest przedstawiona na Schemacie VI.
PL 213 322 B1
Glikol polialkilenowy (P-OH) reaguje z alkoholem (K), tworząc eter (L). W tych związkach m oznacza zero lub jeden, d oznacza zero lub liczbę cał kowitą od jeden do cztery, n oznacza zero lub liczbę całkowitą od jeden do pięć. Y oznacza O, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR', SO2NR' Iub NR'.
T1 i T2 niezależnie są nieobecne lub oznaczają nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym.
R' i Z oznaczają niezależnie atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym.
Każdy spośród L (jeśli jest obecny) oznacza niezależnie nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C7, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową, albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową. Grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20, a podstawniki mogą być grupami halogenowymi, hydroksylowymi, karbonylowymi, karboksylowymi, estrowymi, mrówczanowymi, acylowymi, tiokarbonylowymi, tioestrowymi, tiooctanowymi, tiomrówczanowymi, alkoksylowymi, fosforylowymi, fosfonianowymi, fosfinianowymi, aminowymi, amidowymi, amidynowymi, iminowymi, cyjanowymi, nitrowymi, azydowymi, sulfhydrylowymi, siarczanowymi, sulfonianowymi, sulfamoilowymi, sulfonamidowymi, sulfonylowymi, heterocyklilowymi, aryloalkilowymi, resztami aromatycznymi, resztami heteroaromatycznymi, grupami iminowymi, sililowymi, eterowymi lub alkilotiolowymi.
P oznacza polimer glikolu polialkilenowego. Zazwyczaj P-OH oznacza glikol polietylenowy (PEG) lub glikol monoetoksy-polietylenowy (mPEG), posiadający masę cząsteczkową 5000 do 40000 Da.
Synteza mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu (16) jest przedstawiona dla przykładu na Schemacie VII.
4-hydroksyfenyloacetaldehyd (15) zsyntezowano zgodnie z opisem w Heterocycles, 2000, 53, 777-784. Alkohol 4-hydroksyfenetylowy (Związek 14, 1,0 g, 7,3 mmol, Aldrich) rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (8 ml, Aldrich). Podczas mieszania dodano powoli TEA (2,2 ml, 16 mmol, Aldrich). Kompleks pirydyna-trójtlenek siarki (SO3.py) (2,5 g, 16 mmol, Aldrich) rozpuszczono całkowicie w dimetylosulfotlenku (9 ml, Aldrich), po czym ten roztwór wkroplono do alkoholu, mieszając energicznie. Po zakończeniu mieszania przez 1 godz. w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną rozcieńczono za pomocą CH2Cl2, a następnie przemyto lodowatą wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono do sucha. W wyniku oczyszczania za pomocą chromatografii na silikażelu z użyciem heksanu-octanu etylu jako eluenta (5:1, następnie 2:1) uzyskano 488 mg (49%) 4-hydroksyfenyloacetaldehydu (15).
mPEG-OH 20 kDa (101 mg, 0,005 mmol) i 4-hydroksyfenyloacetaldehyd (15) (39 mg, 0,29 mmol) azeotropowano czterokrotnie z toluenem, a następnie rozpuszczono w bezwodnym CH2Cl2 (2 ml, Aldrich). Do tego roztworu dodano trifenylofosfinę (PPh3; 66 mg, 0,25 mmol, Aldrich), a następnie diizopropyloazodikarboksylan (DIAD; 49 gl, 0,25 mmol, Aldrich), mieszając. Po trzech dniach mieszania w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną wkroplono do energicznie mieszanego eteru dietylowego. Powstały osad oddzielono przez sączenie i przemyto trzy razy eterem dietylowym. Surowy materiał rozpuszczono w CH2Cl2 i przemyto wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SO4,
PL 213 322 B1 przesączono i zatężono do sucha. Materiał rozpuszczono w minimalnej ilości CH2Cl2, a następnie wytrącono przez wkroplenie do mieszanego eteru dietylowego. Ten materiał zebrano przez sączenie, przemyto trzy razy eterem dietylowym i wysuszono, uzyskując 63 mg (62%) mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu (16).
Syntezę mPEG-O-p-fenylopropionaldehydu (17) przeprowadzono w podobny sposób.
4-hydroksyfenylopropionaldehyd otrzymano za pomocą syntezy analogicznej do 4-hydroksyfenyloacetaldehydu (Heterocycles, 2000, 53, 777-784). 3-(4-hydroksyfenylo)-1-propanol (1,0 g, 6,6 mmol, Aldrich) rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (8 ml, Aldrich). Podczas mieszania dodano powoli TEA (2,0 ml, 14 mmol, Aldrich). Kompleks pirydynatrójtlenek siarki (SO3.py) (2,3 g, 15 mmol, Aldrich) rozpuszczono całkowicie w dimetylosulfotlenku (9 ml, Aldrich), po czym ten roztwór wkroplono do alkoholu, mieszając energicznie. Po zakończeniu mieszania przez 1 godz. w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną rozcieńczono za pomocą CH2Cl2, a następnie przemyto lodowatą wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono do sucha. W wyniku oczyszczania za pomocą chromatografii na silikażelu z użyciem heksanu-octanu etylu jako eluenta (5:1, następnie 2:1) uzyskano 745 mg (75%) 4-hydroksyfenylopropionoaldehydu.
mPEG-OH 20 kDa (100 mg, 0,005 mmol) i 4-hydroksyfenylopropionoaldehyd (40 mg, 0,27 mmol) azeotropowano czterokrotnie z toluenem, a następnie rozpuszczono w bezwodnym CH2Cl2 (2 ml, Aldrich). Do tego roztworu dodano trifenylofosfinę (PPh3; 66 mg, 0,25 mmol, Aldrich), a następnie diizopropyloazodikarboksylan (49 μ( 0,25 mmol, Aldrich), mieszając. Po trzech dniach mieszania w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną wkroplono do energicznie mieszanego eteru dietylowego. Powstały osad oddzielono przez sączenie i przemyto trzy razy eterem dietylowym. Surowy materiał rozpuszczono w CH2Cl2 i przemyto wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono do sucha. Materiał rozpuszczono w minimalnej ilości CH2Cl2, a następnie wytrącono przez wkroplenie do mieszanego eteru dietylowego. Ten materiał zebrano przez sączenie, przemyto trzy razy eterem dietylowym i wysuszono, uzyskując 60 mg (60%) mPEG-O-p-fenylopropionoaldehydu (17).
Syntezę mPEG-O-m-fenyloacetaldehydu (18) również przeprowadzono w ten sposób.
3-hydroksyfenyloacetaldehyd otrzymano za pomocą syntezy analogicznej do 4-hydroksyfenyloacetaldehydu (Heterocycles, 2000, 53, 777-784). 3-hydroksyfenetylowy (1,0 g, 7,5 mmol, Aldrich) rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (8 ml, Aldrich). Podczas mieszania dodano powoli TEA (2,0 ml, 14 mmol, Aldrich). Kompleks pirydyna-trójtlenek siarki (SO3.Py) (2,3 g, 15 mmol, Aldrich) rozpuszczono całkowicie w dimetylosulfotlenku (9 ml, Aldrich), po czym ten roztwór wkroplono do alkoholu, mieszając energicznie. Po zakończeniu mieszania przez 1 godz. w temperaturze pokojowej reakcję zatrzymano lodowatą wodą, a następnie wyekstrahowane za pomocą CH2Cl2. Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono do sucha. W wyniku oczyszczania za pomocą chromatografii na silikażelu z użyciem heksanu-octanu etylu jako eluenta (3:1, następnie 1:1) uzyskano 225 mg (22%) 3-hydroksyfenyloacetaldehydu.
mPEG-OH 20 kDa (307 mg, 0,015 mmol) i 3-hydroksyfenyloacetaldehyd (117 mg, 0,86 mmol) azeotropowano czterokrotnie z toluenem, a następnie rozpuszczono w bezwodnym CH2Cl2 (5 ml, Aldrich). Do tego roztworu dodano trifenylofosfinę (200 mg, 0,76 mmol, Aldrich), a następnie diizoproPL 213 322 B1 pyloazodikarboksylan (147 μ!, 0,75 mmol, Aldrich), mieszając. Po trzech dniach mieszania w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną wkroplono do energicznie mieszanego eteru dietylowego. Powstały osad oddzielono przez sączenie i przemyto trzy razy eterem dietylowym, a następnie wysuszono, uzyskując 284 mg (93%) mPEG-O-m-fenyloacetaldehydu (18).
Chiralne związki typu N-hydroksysukcynimidan (NHS) PEG-cynamonianu Β wytwarza się, na przykład, jak pokazano na Schematach VIII i IX.
α-metylo-e-hydroksycynamonian
Związki PEG-dihydrourokanian-NHS wytwarza się również w reakcji Mitsunobu, jak ukazano na Schemacie X:
PL 213 322 B1
Związki PEG-dihydrocynamonian-NHS wytwarza się również z alkoholi aromatycznych, jak ukazano na Schemacie XI:
PEG-benzofurany i PEG-indole wytwarza się, jak ukazano na Schematach XII i XIII:
PL 213 322 B1
C) Otrzymywanie za pomocą reakcji PEG-amin
PEG-aminy reagują z halidami alkili, tworząc PEG-amidy. Przykład otrzymywania koniugatu
PEG-amid-bicyklooktan-NHS jest przedstawiony na Schemacie XIV:
PEG-amina pierwszorzędowa ulega koniugacji z halidem arylu, tworząc koniugat PEG-amina drugorzędowa, którą następnie poddaje się reakcji w warunkach Hecka (stereospecyficzne, katalizowane przez pallad sprzęganie alkenu z halidem lub triflatem organicznym, nieposiadającym atomów wodoru β w hybrydyzacji sp3) z NHS-alkenem, uzyskując pożądany koniugat PEG. Syntezę koniugatu zwierającego pirymidynę przedstawia Schemat XV:
PL 213 322 B1
Koniugaty PEG-sulfonamid również syntezuje się w ten sposób, jak ukazano na Schemacie XVI:
oraz
PL 213 322 B1
D) Związki otrzymywane w reakcji z heterocyklami.
Związki PEG reagują z pierścieniowymi lub niepierścieniowymi atomami azotu, tworząc reaktywne związki PEG. Reprezentatywne reakcji przedstawiają Schematy XVlI dla aminopirolidyny i XVIII
PL 213 322 B1
P r z y k ł a d 2: Otrzymywanie koniugatów peptydowych.
Koniugaty peptydowe można otrzymywać w reakcji białka ze zaktywowaną cząsteczką PGC. Na przykład interferon (IFN) można poddać reakcji z PEG-aldehydem w obecności czynnika redukującego (np. cyjanoborowodorku sodu) na drodze alkilowania redukcyjnego, otrzymując koniugat PEG-białko, połączony łącznikiem aminowym. Zobacz np. patent europejski 0154316 B1.
Ludzki IFN-β zmodyfikowano za pomocą PEG z użyciem następujących glikoli polialkilenowych:
kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu, 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu, 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu, 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu, 20 kDa mPEG-O-p-fenylopropionoaldehydu oraz 20 kDa mPEG-O-m-fenyloacetaldehydu. Białka zmodyfikowane za pomocą PEG oczyszczono do homogenności z odpowiednich mieszanin reakcyjnych, po czym poddano je szeregowi testów kontrolnych, by potwierdzić naturę, czystość i moc zmodyfikowanych białek.
Poniżej przedtawiono szczegółowy opis otrzymywania i kontroli ludzkiego IFN-p-1a, zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu, 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu i 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu.
A) Otrzymywanie i właściwości IFN-P-1 a, zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu
Ludzki IFN-p-1a zmodyfikowano na końcu N za pomocą PEG z użyciem 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu. Wynikiem alkilowania redukcyjnego, zastosowanego do przyłączenia PEG do szkieletu IFN-p-1a, jest powstanie łącznika aminowego, który jest skrajnie odporny na degradację. IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą pEg poddano dokładnej kontroli, obejmującej analizę za pomocą SDS-PAGE, sączenie molekularne (SEC), mapowanie peptydowe oraz ocenę aktywności w teście antywirusowym in vitro. Czystość produktu, zmierzona za pomocą SDS-PAGE, przekraczała 90%. W próbce zmodyfikowanej za pomocą PEG nie było żadnych śladów agregatów. Poziom pozostałości niezmodyfikowanego IFN-p-1 a w produkcie był poniżej granicy pomiaru ilościowego, ale zdaje się reprezentować około 1% produktu. Aktywność swoista IFN-p-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG w teście aktywności antywirusowej obniżyła się w przybliżeniu 2-krotnie w porównaniu do niezmodyfikowanego IFN-p-1a (EC50 = 32 pg/ml dla IFN-p-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu wobec EC50 = 14 pg/ml dla niezmodyfikowanego IFN-p-1a). Roztwór nierozcieńczony IFN-p-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG skomponowano jako 30 μg/ml w soli fizjologicznej, zbuforowanej za pomocą fosforanu (PBS), pH 7,3, zawierającej 14 mg/ml albuminy surowicy
PL 213 322 B1 człowieka (HSA), podobnie do kompozycji, stosowanej dla AVONEX® (Biogen, Cambridge, MA), którą poddano szerokim badaniom. Materiał dostarczono jako zamrożoną ciecz, przechowywaną w -70°C.
Właściwości IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu podsumowano w tabeli 1:
T a b e l a 1
Właściwości IFN-p-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopro-pionoaldehydu
Wydajność modyfikacji PEG >90%
Stosunek IFN-p-1a/PEG 1:1
Czystość >90%
Miejsce przyłączenia koniec N
Aktywność antywirusowa EC50 32 pg/ml
1. Otrzymywanie IFN-P-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu ml nieskomponowanego AVONEX® (nierozcieńczony produkt pośredni IFN-e-1a, seria kliniczna nierozcieńczonego leku, która przeszła wszystkie testy dla stosowania u ludzi, 250 μg/ml w 100 mM fosforanie sodu pH 7,2, 200 mM NaCl) rozcieńczono za pomocą 12 ml 165 mM MES pH 5,0 i 50 μl 5N HCl. Próbkę naniesiono na 300 μl kolumnę SP-Sepharose FF (Pharmacia). Kolumnę przemyto 3 x 300 μl 5 mM fosforanem sodu pH 5,5, 75 mM NaCl, po czym białko wymyto 5 mM fosforanem sodu pH 5,5, 600 mM NaCl. Frakcje wycieku zanalizowano pod względem absorpcji przy 280 nm, a stężenie IFN-e-1a w próbkach oszacowano z zastosowaniem współczynnika ekstynkcji 1,51 dla roztworu 1 mg/ml. Frakcje w szczycie połączono, uzyskując stężenie IFN-e-1a 3,66 mg/ml, a następnie rozcieńczono do 1,2 mg/ml za pomocą wody.
Do 0,8 ml IFN-e-1a z rozcieńczonej próbki, wymytej z SP-Sepharose, dodano 0,5 M fosforan sodu pH 6,0 do stężenia 50 mM, dodano cyjanoborowodorek sodu (Aldrich) do stężenia 5 mM oraz dodano 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehyd do stężenia 5 mg/ml. Próbkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 16 godz. w ciemności. IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą PEG oczyszczono z mieszaniny reakcyjnej na 0,5 ml kolumnie SP-Sepharose FF w sposób następujący: 0,6 ml mieszaniny reakcyjnej rozcieńczono za pomocą 2,4 ml 20 mM MES pH 5,0 i naniesiono na kolumnę SP-Sepharose. Kolumnę przemyto 5 mM fosforanem sodu pH 5,5, 75 mM NaCl, po czym IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą PEG wymyto z kolumny za pomocą 25 mM MES pH 6,4, 400 mM NaCl. IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą PEG oczyszczano dalej na kolumnie FPLC z sitem molekularnym Superose 6 HR 10/30 z 5 mM fosforanem sodu pH 5,5, 150 mM NaCl jako fazą ruchomą. Kolumnę z sitem molekularnym (25 ml) przemywano przy 20 ml/godz., zbierając frakcje 0,5 ml. Frakcje wycieku zanalizowano pod względem zawartości białka przez absorpcję przy 280 nm, połączono, po czym ustalono stężenie białka w próbkach. Stężenie IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG przedstawia się w postaci równoważników IFN, gdyż reszta PEG nie ma wkładu do absorbancji przy 280 nm. Próbki białka pobrano do analizy, a pozostałą porcję rozcieńczono do 30 μg/ml za pomocą buforu kompozycji, zawierającego HSA, podzielono po 0,25 ml/fiolka i przechowywano w -70°C.
2. Widmo UV oczyszczonego IFN-P-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu
Widmo UV (240-340 nm) IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu uzyskano z użyciem próbki nierozcieńczonej, przed skomponowaniem z HSA. Próbka zmodyfikowana za pomocą PEG wykazała maksimum absorbancji przy 278-279 nm i minimum absorbancji przy 249-250 nm, zgodnie z obserwacjami dla niezmodyfikowanego nierozcieńczonego produktu pośredniego IFN-e-1a. Stężenie białka dla produktu zmodyfikowanego za pomocą PEG
0,1% oszacowano z widma, stosując współczynnik ekstynkcji ε2800,1% = 1,51. Stężenie białka dla nierozcieńczonej próbki zmodyfikowanej za pomocą PEG wynosiło 0,23 mg/ml. W próbce nie było zmętnienia, czego dowodzi brak absorbancji przy 320 nm.
3. Właściwości IFN-P-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu za pomocą SDS-PAGE μg IFN-e-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu poddano SDS-PAGE w warunkach redukujących na żelu gradientowym
10-20%. Żel wybarwiono za pomocą błękitu Coomassie R-250, jak przedstawiono na fig. 1 (Ścieżka A:
PL 213 322 B1 markery masy cząsteczkowej (od góry do dołu odpowiednio 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa i 18 kDa); Ścieżka B: 4 IFN^-1a niezmodyfikowany; Ścieżka C: IFN^-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu). Analiza SDS-PAGE IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu ukazała pojedynczy silny prążek przy masie pozornej 55 kDa, zgodnej z modyfikacją jedną cząsteczką PEG. Nie wykryto form o wyższej masie, które wynikałyby z obecności dodatkowych grup PEG. W oczyszczonym produkcie zmodyfikowanym za pomocą PEG wykryto IFN-e-1a niezmodyfikowany, jego ilość jest jednak poniżej progu oznaczenia ilościowego. Oceniono, że poziom IFN-e-1a niezmodyfikowanego odpowiada zaledwie 1% całości białka.
4. Właściwości IFN-l<-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu za pomocą sączenia molekularnego
IFN-e-1a niezmodyfikowany i zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu poddano SEC na kolumnie analitycznej FPLC z sitem molekularnym Superose 6 HR 10/30 z PBS pH 7,2 jako fazą ruchomą. Kolumnę przemywano przy 20 ml/godz., a wyciek monitorowano pod względem absorbancji przy 280 nm, jak przedstawiono na fig. 2: Panel A: standardy masy cząsteczkowej (670 kDa, tyroglobulina; 158 kDa gamma globulina; 44 kDa owoalbumina; 17 kDa mioglobina; 1,3 kDa witamina B12), Panel B: IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu; Panel C: IFN-e-1a niezmodyfikowany. IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu wymył się jako pojedynczy ostry szczyt przy pozornej masie cząsteczkowej około 200 kDa, zgodnie z dużą objętością hydrodynamiczną PEG. Nie wykryto dowodów obecności agregatów. W preparacie wykryto IFN-e-1a niezmodyfikowany, jego ilość jest jednak poniżej progu oznaczenia ilościowego. Na podstawie wielkości szczytu oceniono, że poziom IFN-e-1a niezmodyfikowanego odpowiada 1% lub mniej produktu, w zgodzie z wynikiem SDS-PAGE.
5. Analiza IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu za pomocą mapowania peptydowego
Swoistość reakcji modyfikacji za pomocą PEG ustalono za pomocą mapowania peptydowego. IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu oraz IFN-e-1a niezmodyfikowany poddano trawieniu endoprotezą Lys-C z Achromobacter (Wako Bioproducts), a powstałe produkty trawienia rozdzielono za pomocą HPLC z fazą odwróconą na kolumnie Vydac C4, z użyciem 30 min. gradientu od 0 do 70% acetonitrylu w 0,1% TFA. Wyciek z kolumny monitorowano za pomocą absorbancji przy 214 nm.
Wszystkie peptydy przewidywane po trawieniu IPN-e-1a endoprotezą Lys-C zidentyfikowano uprzednio za pomocą sekwencjonowania od końca N i spektrometrii mas (Pepinsky i wsp., (2001) J Pharmacology and Experimental Therapeutics 297:1059), a spośród tych tylko peptyd, który zawiera koniec N IFN^-1a został zmieniony przez modyfikację za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu, czego dowodzi jego zniknięcie z mapy peptydowej. Dane z mapowania wykazują zatem, że modyfikacja PEG jest nakierowana na koniec N białka, gdyż tylko modyfikacja na końcu N spowodowałaby swoistą utratę tego peptydu.
B) Otrzymywanie i właściwości IFN-l<-1a, zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu
Ludzki IFN^-1a zmodyfikowano na końcu N za pomocą PEG z użyciem 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu. Wynikiem alkilowania redukcyjnego, zastosowanego do przyłączenia PEG do szkieletu IFN^-1a, jest powstanie łącznika aminowego, który jest skrajnie odporny na degradację. IFN^-1a zmodyfikowany za pomocą PEG poddano dokładnej kontroli, obejmującej analizę za pomocą SDS-PAGE, sączenie molekularne (SEC), mapowanie peptydowe oraz ocenę aktywności w teście antywirusowym in vitro. Czystość produktu, zmierzona za pomocą SDS-PAGE, przekraczała 95%. W próbce zmodyfikowanej za pomocą PEG nie było żadnych śladów agregatów. Poziom pozostałości niezmodyfikowanego IFN^-1a w produkcie był poniżej granicy pomiaru ilościowego, ale zdaje się reprezentować około 1% produktu. Aktywność swoista IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG w teście aktywności antywirusowej obniżyła się w przybliżeniu 2-krotnie w porównaniu do niezmodyfikowanego IFN^-1a (EC50 = 31 pg/ml dla IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu wobec EC50 = 14 pg/ml dla niezmodyfikowanego IFN-β-1a). Roztwór nierozcieńczony IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG skomponowano jako 30 μg/ml w soli fizjologicznej, zbuforowanej za pomocą fosforanu (PBS), pH 7,3, zawierającej 15 mg/ml albuminy surowicy człowieka (HSA), podobnie do kompozycji, stosowanej dla
PL 213 322 B1
AVONEX® (Biogen, Cambridge, MA), którą poddano szerokim badaniom. Materiał dostarczono jako zamrożoną ciecz, przechowywaną w -70°C.
Właściwości IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu podsumowano w tabeli 2:
T a b e l a 2
Właściwości IFN-p-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu
Wydajność modyfikacji PEG >98%
Stosunek IFN-p-1a/PEG 1:1
Czystość >95%
Miejsce przyłączenia koniec N
Aktywność antywirusowa EC50 31 pg/ml
1. Otrzymywanie IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehvdu ml nieskomponowanego AVONEX® (nierozcieńczony produkt pośredni IFN-e-1a, seria kliniczna nierozcieńczonego leku, która przeszła wszystkie testy dla stosowania u ludzi, 254 μg/ml w 100 mM fosforanie sodu pH 7,2, 200 mM NaCl) rozcieńczono za pomocą 96 ml 165 mM MES pH 5,0 i 400 μl 5 N HCl. Próbkę naniesiono na 1,2 ml kolumnę SP-Sepharose FF (Pharmacia). Kolumnę przemyto 6,5 ml 5 mM fosforanem sodu pH 5,5, 75 mM NaCl, po czym białko wymyto 5 mM fosforanem sodu pH 5,5, 600 mM NaCl. Frakcje wycieku zanalizowano pod względem absorpcji przy 280 nm, a stężenie IFN-e-1a w próbkach oszacowano z zastosowaniem współczynnika ekstynkcji 1,51 dla roztworu 1 mg/ml. Frakcje w szczycie połączono, uzyskując stężenie IFN-e-1a 4,4 mg/ml.
Do 2,36 ml roztworu 4,4 mg/ml IPN-e-1a, z próbki wymytej z SP-Sepharose, dodano 0,5 M fosforan sodu pH 6,0 do stężenia 50 mM, dodano cyjan oboro wodorek sodu (Aldrich) do stężenia 5 mM oraz dodano 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehyd do stężenia 10 mg/ml. Próbkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 21 godz. w ciemności. IPN-e-1a zmodyfikowany za pomocą PEG oczyszczono z mieszaniny reakcyjnej na 8,0 ml kolumnie SP-Sepharose FF w sposób następujący: 9,44 ml mieszaniny reakcyjnej rozcieńczono za pomocą 37,7 ml 20 mM MES pH 5,0 i naniesiono na kolumnę SP-Sepharose. Kolumnę przemyto fosforanem sodu pH 5,5, 75 mM NaCl, po czym IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą PEG wymyto z kolumny za pomocą 25 mM MES pH 6,4, 400 mM NaCl. IEN-e-1a zmodyfikowany za pomocą PEG oczyszczano dalej na kolumnie FPLC z sitem molekularnym Superose 6 HR 10/30 z 5 mM fosforanem sodu pH 5,5, 150 mM NaCl jako fazą ruchomą. Kolumnę z sitem molekularnym (25 ml) przemywano przy 24 ml/godz., zbierając frakcje 0,25 ml. Frakcje wycieku zanalizowano pod względem zawartości białka przez absorpcję przy 280 nm, połączono, po czym ustalono stężenie białka w próbkach. Stężenie IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG przedstawia się w postaci równoważników IFN, po uwzględnieniu wkładu PEG do absorbancji przy 280 nm z użyciem współczynnika ekstynkcji równego 2 dla roztworu 1 mg/ml IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG. Próbki białka pobrano do analizy, a pozostałą porcję rozcieńczono do 30 μg/ml za pomocą buforu kompozycji, zawierającego HSA, podzielono po 0,25 ml/fiolka i przechowywano w -70°C.
2. Widmo UV oczyszczonego IFN-P-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu.
Widmo UV (240-340 nm) IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kPa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu uzyskano z użyciem próbki nierozcieńczonej, przed skomponowaniem z HSA. Próbka zmodyfikowana za pomocą PEG wykazała maksimum absorbancji przy 278-279 nm i minimum absorbancji przy 249-250 nm, zgodnie z obserwacjami dla niezmodyfikowanego nierozcieńczonego produktu pośredniego IFN^-1a. Stężenie białka dla produktu zmodyfikowanego
0,1% za pomocą PEG oszacowano z widma, stosując współczynnik ekstynkcji ε2800,1% = 2,0. Stężenie białka dla nierozcieńczonej próbki zmodyfikowanej za pomocą PEG wynosiło 0,42 mg/ml. W próbce nie było zmętnienia, czego dowodzi brak absorbancji przy 320 nm.
PL 213 322 B1
3. Właściwości IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kPa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu za pomocą SPS-PAGE.
2,1 μg IFN-e-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu poddano SDS-PAGE w warunkach redukujących na żelu gradientowym 4-20%. Żel wybarwiono za pomocą błękitu Coomassie R-250. Analiza SDS-PAGE IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu ukazała pojedynczy silny prążek przy masie pozornej 55 kDa, zgodnej z modyfikacją jedną cząsteczką PEG. Nie wykryto form o wyższej masie, które wynikałyby z obecności dodatkowych grup PEG. W oczyszczonym produkcie zmodyfikowanym za pomocą PEG wykryto IFN-e-1a niezmodyfikowany, jego ilość jest jednak poniżej progu oznaczenia ilościowego. Oceniono, że poziom IFN-e-1a niezmodyfikowanego odpowiada zaledwie 1% całości białka.
4. Właściwości IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu za pomocą sączenia molekularnego
IFN-e-1a niezmodyfikowany i zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu poddano SEC na kolumnie analitycznej FPLC z sitem molekularnym Superose 6 HR 10/30 z PBS pH 7,2 jako fazą ruchomą. Kolumnę przemywano przy 24 ml/godz., a wyciek monitorowano pod względem absorbancji przy 280 nm. IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu wymył się jako pojedynczy ostry szczyt, nie wykryto dowodów obecności agregatów (fig. 3).
5. Analiza IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu za pomocą mapowania peptydowego
Swoistość reakcji modyfikacji za pomocą PEG ustalono za pomocą mapowania peptydowego. 13,3 μg IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu oraz IFN-e-1a niezmodyfikowanego poddano trawieniu 20% (wag./wag.) endoprotezą Lys-C z Achromobacter (Wako Bioproducts) w PBS, zawierającym 5 mM DTT, 1 mM EDTA, przy pH 7,6 w temperaturze pokojowej przez 30 godz. (objętość końcowa = 100 μ^. Następnie dodano 4 μl 1M DTT i 100 μl 8M mocznika, po czym próbki inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Peptydy rozdzielono za pomocą HPLC z fazą odwróconą na kolumnie Vydac C18 (214TP51) z użyciem 70 min. gradientu od 0 do 63% acetonitrylu w 0,1% TFA, a nastepnie 10 min. gradientu od 63 do 80% acetonitrylu w 0,1% TFA. Wyciek z kolumny monitorowano za pomocą absorbancji przy 214 nm.
Wszystkie peptydy przewidywane po trawieniu IPN-e-1a endoprotezą Lys-C zidentyfikowano uprzednio za pomocą sekwencjonowania od końca N i spektrometrii mas (Pepinsky i wsp., (2001) J. Pharmacology and Experimental Therapeutics 297:1059), a spośród tych tylko peptyd, który zawiera koniec N IFN-e-1a został zmieniony przez modyfikację za pomocą 20 kDa mPEG-O-mmetylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu, czego dowodzi jego zniknięcie z mapy peptydowej. Dane z mapowania wykazują zatem, że modyfikacja PEG jest nakierowana na koniec N białka, gdyż tylko modyfikacja na końcu N spowodowałaby swoistą utratę tego peptydu.
C) Otrzymywanie i właściwości IFN-e-1a, zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu
Ludzki IFN-e-1a zmodyfikowano na końcu N za pomocą PEG z użyciem 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu. Wynikiem alkilowania redukcyjnego, zastosowanego do przyłączenia PEG do szkieletu IFN-e-1a, jest powstanie łącznika aminowego, który jest skrajnie odporny na degradację. IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą PEG poddano dokładnej kontroli, obejmującej analizę za pomocą SDS-PAGE, sączenie molekularne (SEC), mapowanie peptydowe oraz ocenę aktywności w teście antywirusowym in vitro. Czystość produktu, zmierzona za pomocą SDS-PAGE, przekraczała 95%. W próbce zmodyfikowanej za pomocą PEG nie było żadnych śladów agregatów. Poziom pozostałości niezmodyfikowanego IFN-e-1a w produkcie był poniżej granicy pomiaru ilościowego, ale zdaje się reprezentować około 1% produktu. W teście trwałości nie stwierdzono agregacji lub degradacji IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu w buforze Tris pH 7,4, po inkubacji w 37°C przez 7 dni. Aktywność swoista IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG w teście aktywności antywirusowej obniżyła się w przybliżeniu 2-krotnie w porównaniu do niezmodyfikowanego IFN-e-1a (EC50=31 pg/ml dla IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetalde-hydu wobec EC50 = 14 pg/ml dla niezmodyfikowanego IFN-e-1a). Roztwór nierozcieńczony IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG skomponowano jako 30 μg/ml w soli fizjologicznej, zbuforowanej za pomocą fosforanu (PBS), pH 7,3, zawierającej 14 mg/ml albuminy surowicy człowieka
PL 213 322 B1 (HSA), podobnie do kompozycji, stosowanej dla AVONEX® (Biogen, Cambridge, MA), którą poddano szerokim badaniom. Materiał dostarczono jako zamrożoną ciecz, przechowywaną w -70°C.
Właściwości IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu podsumowano w tabeli 3:
T a b e l a 3
Właściwości !FN-p-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-Q-p-fenyloacetaldehydu
Wydajność modyfikacji PEG >80%
Stosunek IFN-e-1a/PEG 1: 1
Czystość >95%
Miejsce przyłączenia koniec N
Aktywność antywirusowa EC50 31 pg/ml
1. Otrzymywanie IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-Q-p-fenyloacetaldehydu.
ml nieskomponowanego AVONEX® (nierozcieńczony produkt pośredni IFN-e-1a, seria kliniczna nierozcieńczonego leku, która przeszła wszystkie testy dla stosowania u ludzi, 250 gg/ml w 100 mM fosforanie sodu pH 7,2. 200 mM NaCl) rozcieńczono za pomocą 24 ml 165 mM MES pH 5,0, 100 gl 5 N HCl i 24 ml wody. Próbkę naniesiono na 600 gl kolumnę SP-Sepharose FF (Pharmacia). Kolumnę przemyto 2 x 900 gl 5 mM fosforanem sodu pH 5,5, 75 mM NaCl, po czym białko wymyto 5 mM fosforanem sodu pH 5,5, 600 mM NaCl. Frakcje wycieku zanalizowano pod względem absorpcji przy 280 nm, a stężenie IFN-e-1a w próbkach oszacowano z zastosowaniem współczynnika ekstynkcji 1,51 dla roztworu 1 mg/ml. Frakcje w szczycie połączono, uzyskując stężenie IFN-e-1a 2,3 mg/ml.
Do 1,2 ml roztworu IFN-e-1a, z próbki wymytej z SP-Sepharose, dodano 0,5 M fosforan sodu pH 6,0 do stężenia 50 mM, dodano cyjanoborowodorek sodu (Aldrich) do stężenia 5 mM oraz dodano 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehyd do stężenia 10 mg/ml. Próbkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 18 godz. w ciemności. IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą PEG oczyszczono z mieszaniny reakcyjnej na 0,75 ml kolumnie SP-Sepharose FF w sposób następujący: 1,5 ml mieszaniny reakcyjnej rozcieńczono za pomocą 7,5 ml 20 mM MES pH 5,0, 7,5 ml wody i 5 gl 5 N HCl i naniesiono na kolumnę SP-Sepharose. Kolumnę przemyto fosforanem sodu pH 5,5, 75 mM NaCl, po czym IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą PEG wymyto z kolumny za pomocą 20 mM MES pH 6,0, 600 mM NaCl. IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą PEG oczyszczano dalej na kolumnie FPLC z sitem molekularnym Superose 6 HR 10/30 z 5 mM fosforanem sodu pH 5,5, 150 mM NaCl jako fazą ruchomą. Kolumnę z sitem molekularnym (25 ml) przemywano przy 20 ml/godz., zbierając frakcje 0,5 ml. Frakcje wycieku zanalizowano pod względem zawartości białka przez absorpcję przy 280 nm, połączono, po czym ustalono stężenie białka w próbkach. Stężenie IFN-p-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG przedstawia się w postaci równoważników IFN, po uwzględnieniu wkładu PEG (20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehyd posiada współczynnik ekstynkcji przy 280 nm równy 0,5 dla roztworu 1 mg/ml) do absorbancji przy 280 nm z użyciem współczynnika ekstynkcji równego 2 dla roztworu 1 mg/ml IFN-p-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG. Próbki białka pobrano do analizy, a pozostałą porcję rozcieńczono do 30 gg/ml za pomocą buforu kompozycji, zawierającego HSA, podzielono po 0,25 ml/fiolka i przechowywano w -70°C.
2. Widmo UV oczyszczonego IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu.
Widmo UV (240-340 nm) IFN-p-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu uzyskano z użyciem próbki nierozcieńczonej, przed skomponowaniem z HSA. Próbka zmodyfikowana za pomocą PEG wykazała maksimum absorbancji przy 278-279 nm i minimum absorbancji przy 249-250 nm, zgodnie z obserwacjami dla niezmodyfikowanego nierozcieńczonego produktu pośredniego IFN-e-1a. Stężenie białka dla produktu zmodyfikowanego za pomocą PEG oszacowa0,1% no z widma, stosując współczynnik ekstynkcji ε2800,1% = 2,0. Stężenie białka dla nierozcieńczonej próbki zmodyfikowanej za pomocą PEG wynosiło 0,10 mg/ml. W próbce nie było zmętnienia, czego dowodzi brak absorbancji przy 320 nm.
3. Właściwości IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu za pomocą SDS-PAGE.
2,5 gg IFN-p-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu poddano SDS-PAGE w warunkach redukujących na żelu gradientowym 10-20%. Żel
PL 213 322 B1 wybarwiony za pomocą błękitu Coomassie R-250 przedstawia fig. 4 (Ścieżka A: IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu; Ścieżka B: IFN-e-1a niezmodyfikowany; Ścieżka C: markery masy cząsteczkowej (od góry do dołu odpowiednio 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa i 18 kDa). Analiza SDS-PAGE IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu ukazała pojedynczy silny prążek przy masie pozornej 55 kDa, zgodnej z modyfikacją jedną cząsteczką PEG. Nie wykryto form o wyższej masie, które wynikałyby z obecności dodatkowych grup PEG. W oczyszczonym produkcie zmodyfikowanym za pomocą PEG wykryto IFN-e-1a niezmodyfikowany, jego ilość jest jednak poniżej progu oznaczenia ilościowego. Oceniono, że poziom IFN-e-1a niezmodyfikowanego odpowiada zaledwie 1% całości białka.
4. Właściwości IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu za pomocą sączenia molekularnego.
IFN-e-1a niezmodyfikowany i zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu poddano SEC na kolumnie analitycznej FPLC z sitem molekularnym Superose 6 HR 10/30 z PBS pH 7,2 jako fazą ruchomą. Kolumnę przemywano przy 20 ml/godz., a wyciek monitorowano pod względem absorbancji przy 280 nm, jak pokazano na fig. 5: Panel A: standardy masy cząsteczkowej (670 kDa, tyroglobulina; 158 kDa gamma globulina; 44 kDa owoalbumina; 17 kDa mioglobina;
I, 3 kDa witamina B12); Panel B: IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu. IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą PEG wymył się jako pojedynczy ostry szczyt przy pozornej masie cząsteczkowej około 200 kDa, zgodnie z dużą objętością hydrodynamiczną PEG. Nie wykryto dowodów obecności agregatów. W preparacie wykryto IFN-e-1a niezmodyfikowany, jego ilość jest jednak poniżej progu oznaczenia ilościowego. Na podstawie wielkości szczytu oceniono, że poziom IFN-e-1a niezmodyfikowanego odpowiada 1% lub mniej produktu, w zgodzie z wynikiem SDSPAGE.
5. Analiza IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu za pomocą mapowania peptydowego. Swoistość reakcji modyfikacji za pomocą PEG ustalono za pomocą mapowania peptydowego. IFN-e-1a niezmodyfikowany i zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu oraz IFN-e-1a poddano trawieniu endoprotezą Lys-C z Achromobacter (Wako Bioproducts), a otrzymane produkty trawienia rozdzielono za pomocą HPLC z fazą odwróconą na kolumnie Vydac C4 z użyciem 30 min. gradientu od 0 do 70% acetonitrylu w 0,1% TFA. Wyciek z kolumny monitorowano za pomocą absorbancji przy 214 nm.
Wszystkie peptydy przewidywane po trawieniu IFN-e-1a endoprotezą Lys-C zidentyfikowano uprzednio za pomocą sekwencjonowania od końca N i spektrometrii mas (Pepinsky i wsp., (2001)
J. Pharmacology and Experimental Therapeutics 297:1059), a spośród tych tylko peptyd, który zawiera koniec N IFN-e-1a został zmieniony przez modyfikację za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu, czego dowodzi jego zniknięcie z mapy peptydowej. Dane z mapowania wykazują zatem, że modyfikacja PEG jest nakierowana na koniec N białka, gdyż tylko modyfikacja na końcu N spowodowałaby swoistą utratę tego peptydu.
6. Trwałość IFN-B-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kPa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu.
By sprawdzić trwałość IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kPa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu, próbki rozcieńczono do 0,1 μg/ml za pomocą buforu Tris-HCl, pH 7,4, po czym inkubowano w 37°C w ciągu 7 dni. 20 μl próbki (2 μg) pobierano w dniach 0, 2, 5 i 7 i analizowano za pomocą SPS-PAGE w warunkach redukujących, jak przedstawiono na fig. 6: Ścieżka A: markery masy cząsteczkowej (od góry do dołu odpowiednio 100 kPa, 68 kPa, 45 kDa, 27 kDa i 18 kDa); Ścieżki B, C, D i E: 2 μg IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu, pobranego do testu w dniach odpowiednio 0, 2, 5 i 7. Nawet po 7 dniach w 37°C nie zaobserwowano agregacji lub degradacji IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG.
P r z y k ł a d 3. Swoista aktywność ludzkiego IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG w teście antywirusowym in vitro
Swoistą aktywność antywirusową próbek ludzkiego IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG sprawdzono na komórkach raka płuc człowieka (komórki A549), które wyeksponowano na wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMC), z zastosowaniem barwnika metabolicznego 2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-2H-tetrazolium-5-karboksyanilidu (MTT; M-5655, Sigma, ST. Louis, MO), jako miary komórek aktywnych metabolicznie, pozostałych po ekspozycji na wirusa. W skrócie, komórki A549 inkubowano przez 24 godz. z IFN-e-1a albo niezmodyfikowanym, albo zmodyfikowanym za pomocą PEG (począwszy od 66,7 pg/ml, rozcieńczając kolejno 1,5-krotnie do 0,8 pg/ml) przed ekspozycją na wirusa. Komórki eksponowano następnie przez 2 dni na wirusa EMC przy rozPL 213 322 B1 cieńczeniu, w wyniku którego w nieobecności IFN następowała całkowita śmierć komórek. Następnie szalki wybarwiono MTT. Roztwór wyjściowy MTT sporządzono dla 5 mg/ml w PBS i wyjałowiono przez filtrowanie, po czym 50 μl tego roztworu rozcieńczano do kultur komórkowych (100 μl na studzienkę). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30-60 min. usunięto roztwór MTT w pożywce, komórki przemyto za pomocą 100 μl PBS, a następnie zmetabolizowany barwnik rozpuszczono za pomocą 100 μl 1,2 N HCl w izopropanolu. Żywe komórki (stwierdzone przez obecność barwnika) zliczono za pomocą absorbancji w 450 nm. Dane zanalizowano wykreślając absorbancję wobec stężenia IFN-p-1a, a aktywność IFN-p-1a zdefiniowano jako stężenie, przy którym 50% komórek zostało zabitych, tj. efekt cytopatyczny 50% (EC50) lub 50% maksimum OD450. Test przeprowadzono osiem razy dla IFN-p-1a niezmodyfikowanego i trzy do czterech razy dla różnych próbek IFN-p-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG. W każdym z testów dla każdego stężenia białka zbierano po dwa punkty. Przykładowe wykresy przeżywalności komórek wobec stężenia IFN-p-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocąPEG ukazano na fig. 7A i 7B. Na fig. 7A symbole są następujące: IFN-p-1a niezmodyfikowany (o), IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu (□), IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu (Δ) oraz IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu (◊). Na Fig. 7B symbole są następujące: IFN-p-1 a niezmodyfikowany (o), IFN-p-1 a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu (c), IFN-p-1 a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenylopropionoaldehydu (Δ) oraz IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-fenyloacetaldehydu (◊).
Wartości EC50 (stężenie dające półmaksymalną ochronę antywirusową) dla IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu, 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu, 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu, 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu, 20 kDa mPEG-O-p-fenylopropionoaldehydu oraz 20 kDa mPEG-O-m-fenyloacetaldehydu przedstawiono w tabeli 4. Wszystkie IFN-p-1a zmodyfikowane za pomocą PEG zmodyfikowano i oczyszczono do homogenności zasadniczo tak, jak opisano dla IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu, IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu oraz IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu, zgodnie z opisem powyżej.
T a b e l a 4
Swoista aktywność antywirusowa !FN-p-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanych za pomocą PEG
Białko Średnia EC50 (pg/ml)
IFN-p-1a niezmodyfikowany 14 (zakres 12-16)
IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metyIopropionoaldehydu 32 (zakres 12-16)
IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu 41 (zakres 36-47)
IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu 31 (zakres 27-35)
IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu 31 (zakres 25-39)
IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenylopropionoaldehydu 31 (zakres 27-34)
IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-fenyloacetaldehydu 27 (zakres 25-29)
P r z y k ł a d 4. Farmakokinetyka IFN-p-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanych za pomocą PEG, podawanych dożylnie szczurom
Samicom szczurów Lewis z założonymi kaniulami wstrzyknięto dożylnie albo 80 pg/kg IPN-p-1a niezmodyfikowanego, albo 24 pg/kg następujących IFN-p-1 a zmodyfikowanych za pomocą PEG: IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu, IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu, IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu, IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenylopropionoaldehydu, IPN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-fenyloacetaldehydu oraz IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu. Zarówno białko niezmodyfikowane, jak i zmodyfikowanych za pomocą
PL 213 322 B1
PEG skomponowano w obecności 14-15 mg/ml HSA jako nośnika. Dla białka niezmodyfikowanego krew (0,2 ml) pobierano przez kaniulę w różnych punktach czasowych, bezpośrednio przed podaniem oraz w 0,083, 0,25, 0,5, 1,25, 3 oraz 5 godzin po podaniu. Dla białek zmodyfikowanych za pomocą PEG krew (0,2 ml) pobierano przez kaniulę bezpośrednio przed podaniem oraz w 0,083, 0,25, 0,5, 1,25, 3, 24, 48 oraz 72 godziny po podaniu. Całą krew zbierano do probówek do rozdziału surowicy (Beckton Dickinson nr 365956) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 60 min., by umożliwić powstanie skrzepu. Skrzepniętą krew wirowano przez 10 min. w 4°C, surowicę usuwano i przechowywano w -70°C do wykonania testu.
Próbki surowicy rozmrażano wówczas i badano w testach antywirusowych. Próbki surowicy rozcieńczano 1:50 do pożywki zawierającej surowicę (Dulbecco's Modified Eagles Medium, zawierająca 10% (obj./obj.) surowicy z płodów cielęcych, po 100 U penicyliny i streptomycyny oraz 2 mM L-glutaminy) i badano w testach antywirusowych. Próbki miareczkowano do ustalonych studzienek 96studzienkowej płytki do kultur tkankowych, zawierających komórki ludzkiego raka płuc (A549, #CCL185, ATCC, Rockville, MD). Na każdej płytce testowano rozcieńczenia standardu (66,7, 44,4, 29,6, 19,8, 13,2, 8,8, 5,9, 3,9, 2,6, 1,7, 1,2 oraz 0,8 pg/ml tej samej formy IFN^-1a, podawanej szczurowi) i trzech próbek surowicy. Komórki A549 inkubowano z rozcieńczonymi próbkami surowic przez 24 godz. przed ekspozycją na wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMC). Po dwóch dniach inkubacji z wirusem żywe komórki wybarwiano roztworem MTT (5 mg/ml w buforze fosforanowym) przez 1 godz., przemyto buforem fosforanowym, a następnie rozpuszczono za pomocą 1,2 N HCl w izopropanolu. Studzienki zliczono następnie przy 450 nm. Dla każdej płytki utworzono krzywe standardowe IFN^-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanych za pomocą PEG, które wykorzystano do ustalenia ilości IFN^-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanych za pomocą PEG w każdej z badanych próbek. Następnie wyliczono parametry farmakokinetyczne za pomocą analizy niekompartmentalnej z użyciem oprogramowania WinNonLin wersja 3.0 lub 3.3.
Figura 8A przedstawia wykresy stężenia w funkcji czasu dla IFN^-1a niezmodyfikowanego (panel górny) i IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu (panel dolny), a fig. 8B przedstawia wykresy stężenia w funkcji czasu dla IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu (panel górny) i 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu (panel dolny). Punkty danych są średnimi z pomiarów dla trzech szczurów.
Tabela 5 przedstawia parametry farmakokinetyczne Cmax (maksymalne stężenie obserwowane), t% (półokres eliminacji), AUC (powierzchnia pod krzywą), Vss (objętość PU dystrybucji w stanie stacjonarnym), szybkość usuwania oraz MRT (średni czas rezydencji) dla IFN^-1a niezmodyfikowanego i tych form IFN^-1a zmodyfikowanych za pomocą PEG. Dane przedstawione na fig. 8A i 8B oraz w tabeli 5 uzyskano w tym samym eksperymencie.
Figura 9A przedstawia wykresy stężenia w funkcji czasu dla IFN^-1a niezmodyfikowanego (panel górny) i IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p--fenylopropionoaldehydu (panel dolny). Figura 9B przedstawia wykresy stężenia w funkcji czasu dla IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-fenyloacetaldehydu (panel górny) i IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu (panel dolny). Punkty danych są średnimi z pomiarów dla 3 szczurów.
Tabela 6 przedstawia parametry farmakokinetyczne dla IFN^-1a niezmodyfikowanego i tych form IFN^-1a zmodyfikowanych za pomocą PEG. Dane przedstawione na fig. 9A i 9B oraz w tabeli 6 uzyskano w tym samym eksperymencie, niezależnie od danych, przedstawionych na fig. 8A i 8B oraz w tabeli 5.
Jak jasno wynika z danych, przedstawionych na fig. 8A, 8B, 9A i 9B oraz w tabelach 5 i 6, modyfikacja IFN^-1a za pomocą PEG z użyciem cząsteczek PEG ujawnionych niniejszym poprawia właściwości farmakokinetyczne IFN^-1a. We wszystkich przypadkach białka zmodyfikowane za pomocą PEG były usuwane wolniej niż IFN^-1a niezmodyfikowany, dając w wyniku szybkości usuwania 3,9-8,3 ml/godz./kg w porównaniu z 160-170 ml/godz./kg dla białka niezmodyfikowanego. W konsekwencji obniżonych szybkości usuwania średni czas rezydencji (MRT) podniósł się z około 1 godz. dla białka niezmodyfikowanego do 4,8-7,6 godz. dla białek zmodyfikowanych za pomocą PEG. Podobnie półokres eliminacji t% podniósł się z około 1 godz. dla białka niezmodyfikowanego do 5,2-13 godz. dla białek zmodyfikowanych za pomocą PEG. Wartości powierzchni pod krzywą (AUC) również podniosły się znacząco w wyniku modyfikacji IFN^-1a za pomocą PEG. Dla IFN^-1a niezmodyfikowanego AUC wyniosła około 0,5 μg·godz./ml, podczas gdy dla białek zmodyfikowanych za pomocą PEG warPL 213 322 B1 tości AUC wyniosły od około 3 do 6 μg·godz./ml, pomimo faktu, że białka zmodyfikowane za pomocą PEG dawkowano na poziomie 3,3 razy niższym niż białko niezmodyfikowane. Wartości dla maksymalnego stężenia obserwowanego (Cmax) były generalnie wyższe dla IFN^-1a niezmodyfikowanego niż dla białek zmodyfikowanych za pomocą PEG, odzwierciedlając niższą dawkę podawanych białek zmodyfikowanych. Dla objętości dystrybucji w stanie stacjonarnym (Vss) wartości dla wszystkich białek zmodyfikowanych za pomocą PEG były niższe niż dla IFN^-1a niezmodyfikowanego, co wskazuje na ograniczenie ich zdolności do opuszczania centralnego kompartymentu krwi.
T a b e l a 5:
Parametry farmakokinetyczne dla IFN-fJ>-1a niezmodyfikowanego, IFN-fJ>-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu, IFN-fJ>-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu oraz IFN-fJ>-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu po podaniu dożylnym szczuroma
Parametr Jednostki IFN-Ma niezmodyfi- kowany IFN-β·^ zmodyfikowany za pomocą. 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu IFN-β·^ zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-p-metylopropionoaldehydu IFN-β·^ zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenyloacetaldehydu
Cmn Pg/ml 1 400 000 720 000 710 000 590 000
t/ godz. 0,98 13 11 6,8
AUC pg-godz./ /ml 510 000 4 800 000 4 500 000 2 900 000
Vss ml/kg 160 39 40 53
Usuwanie ml godz./kg 160 5,0 5,3 8,3
MRT godz. 0,98 7,6 7,4 6,4
a Dane farmakokinetyczne dla IFN-p-1a niezmodyfikowanego oraz IFN-p-1a zmodyfikowanych za pomocą
PEG otrzymano w tym samym eksperymencie
T a b e l a 6:
Parametry farmakokinetyczne dla IFN-fJ>-1a niezmodyfikowanego, IFN-fJ>-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-fenylopropionoaldehydu, IFN-fJ>-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-fenyloacetaldehydu oraz IFN-fJ>-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-m-metylofenylo-O-2-metylopropionoaldehydu po podaniu dożylnym szczuroma
Parametr Jednostki IFN-β·^ niezmody- fikowany FN^-fa zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu FN^-ta zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-p-metylofenylo-O-2metylopropionoaldehydu IFN-p-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-pfenyloacetaldehydu
Cnm pg ml 670 000 930 000 550 000 700 000
t/ godz. 0,92 5,2 7,7 7,1
AUC pg-godz./ml 470 000 4 700 000 3 800 000 6 200 000
Vss ml kg 140 25 46 21
Usuwanie ml godz./kg 170 5,1 6,4 3,93
MRT godz. 0,81 4,8 7,2 5,5
a Dane farmakokinetyczne dla IFN-p-1a niezmodyfikowanego oraz IFN-p-1a zmodyfikowanych za pomocą. PEG otrzymano w tym samym eksperymencie
P r z y k ł a d 5: Porównawcza farmakokinetyka i farmakodynamika ludzkiego IFN^-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG u naczelnych innych niż człowiek
Badania porównawcze dawek pojedynczych i powtarzanych wykonano z użyciem IFN^-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG, aby ocenić ich porównawczą trwałość i aktywność u naczelnych innych niż człowiek. W tych badaniach porównano farmakokinetykę i farmako56
PL 213 322 B1 dynamikę koniugatów IFN-e-1a zmodyfikowanych za pomocą PEG z danymi dla IFN-e-1a niezmodyfikowanego, a wnioski z nich płynące można rozciągnąć na ludzi.
Zwierzęta i metody
Eksperyment I (dawka powtarzana)
Jest to badanie dawek powtarzanych w grupach równoległych, by ocenić porównawczą farmakokinetykę i farmakodynamikę IFN-e-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG. W tym eksperymencie użyto zdrowych naczelnych (małp rezus). Przed podaniem dawki wszystkie zwierzęta zostały zbadane pod kątem objawów chorobowych przez weterynarza, specjalizującego się w zwierzętach laboratoryjnych, dwukrotnie w ciągu 14 dni przed podaniem środków testowanych; jedno z tych badań musiało się odbyć w ciągu 24 godzin przed pierwszym podaniem środków testowanych. Środki testowane podano tylko zwierzętom zdrowym. Do oceny należało ogólne badanie fizyczne oraz pobrania krwi przed podaniem dawki, dla pomiaru wartości odniesienia dla parametrów kliniczno-patologicznych i wartości odniesienia dla przeciwciał przeciw IFN-e-1a. Wszystkie zwierzęta zważono, zarejestrowano również temperatury ich ciała w ciągu 24 godz. przed podaniem środków testowanych. Do badania włączono 12 zwierząt, które podzielono na grupy po trzy, otrzymujące 1 x 106 U/kg IFN-e-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG, ale nieróżniącego się pod innymi względami. Podawanie odbyło się drogą albo podskórną (SC), albo dożylną (IV). Sześć samców otrzymało środek testowany drogą IV (po 3 na grupę), a inne sześć samców otrzymało środek testowany drogą SC (po 3 na grupę). Żadne ze zwierząt nie mogło mieć uprzedniego kontaktu z IFN-β. Każde ze zwierząt dostało dawki dwa razy, w odstępie czterech tygodni. Objętość dawki wynosi 1,0 ml/kg. Krew pobierano dla testów farmakokinetycznych w 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 i 96 godzin po każdym zastrzyku. Próbki krwi dla pomiaru markera odpowiedzi biologicznej, indukowanej przez IFN, neopteryny w surowicy, pobierano w 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 i 504 godz. po podaniu środka badanego. Oceny stanu zdrowia w okresie badania polegały na oględzinach klinicznych, przeprowadzanych 30 min i 1 godz. po podaniu dawki, nastawionych na objawy toksyczności. Prowadzono codzienne obserwacje zachowania w klatkach i rejestrowano wygląd ogólny, oznaki toksyczności, dyskomfortu i zmian w zachowaniu. Rejestrowano wagę ciała i temperaturę w regularnych odstępach w ciągu 21 dni po podaniu dawki.
Eksperyment 2 (dawka pojedyncza)
Jest to badanie dawki pojedynczej w grupach równoległych, by ocenić porównawczą farmakokinetykę i farmakodynamikę IFN-e-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG. W tym eksperymencie użyto zdrowych naczelnych (małp rezus). Przed podaniem dawki wszystkie zwierzęta zostały zbadane pod kątem objawów chorobowych przez weterynarza, specjalizującego się w zwierzętach laboratoryjnych, dwukrotnie w ciągu 14 dni przed podaniem środków testowanych; jedno z tych badań musiało się odbyć w ciągu 24 godzin przed pierwszym podaniem środków testowanych. Środki testowane podano tylko zwierzętom zdrowym. Do oceny należało ogólne badanie fizyczne oraz pobrania krwi przed podaniem dawki, dla pomiaru wartości odniesienia dla parametrów kliniczno-patologicznych i wartości odniesienia dla przeciwciał przeciw IFN-e-1a. Wszystkie zwierzęta zważono, zarejestrowano również temperatury ich ciała w ciągu 24 godz. przed podaniem środków testowanych. Do badania włączono dwadzieścia zwierząt, które przypisano do jednej z pięciu grup po cztery zwierzęta (2 samce i 2 samice w grupie), otrzymujące albo 1 x 106 U/kg IFN-e-1a niezmodyfi56 kowanego lub zmodyfikowanego za pomocą PEG domięśniowo (IM) lub 2 x 105 U/kg, 1 x 106 U/kg albo 5 x 106 U/kg IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG dożylnie (IV). Żadne ze zwierząt nie mogło mieć uprzedniego kontaktu z IFN-β. Objętość dawki wynosiła zazwyczaj 1,0 ml/kg. Krew pobierano dla testów farmakokinetycznych w 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 i 96 godzin oraz w 7, 14, 21 i 28 dni po podaniu badanego leku. Próbki krwi dla pomiaru markera odpowiedzi biologicznej, indukowanej przez IFN, syntazy 2'-5'-oligoadenylowej, pobierano w 0, 12, 24, 48, 72 i 96 godzin, oraz w 7, 14, 21 i 28 dni po podaniu badanego leku. Oceny stanu zdrowia w okresie badania polegały na oględzinach klinicznych, przeprowadzanych 30 min. i 1 godz. po podaniu dawki, nastawionych na objawy toksyczności. Prowadzono codzienne obserwacje zachowania w klatkach i rejestrowano wygląd ogólny, oznaki toksyczności, dyskomfortu i zmian w zachowaniu. Rejestrowano wagę ciała i temperaturę w regularnych odstępach w ciągu 28 dni po podaniu dawki.
Metody testowania
Poziom IFN-e-1a w surowicy wyznacza się ilościowo za pomocą testu efektu cytopatycznego (CPE). Test CPE mierzy poziom aktywności antywirusowej wywołanej przez IFN. Poziom aktywności antywirusowej w próbce odzwierciedla liczbę cząsteczek aktywnego IFN obecnych w tej próbce
PL 213 322 B1 w chwili pobrania krwi. To podejście jest standardowym sposobem oceny farmakokinetyki IFN-β. Test CPE wykrywa zdolność IFN-β do ochrony komórek ludzkiego raka płuc (A549, #CCL-185, ATCC, Rockville, MD) przed cytotoksycznością, wywoływaną przez wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMC). Komórki inkubuje się wstępnie przez 15-20 godz. z próbkami surowicy, by umożliwić indukcję i syntezę białek indukowanych przez IFN, które są odpowiedzialne za odpowiedź antywirusową. Następnie dodaje się wirusa EMC i kontynuuje inkubację przez dalsze 30 godzin, po czym dokonuje się oceny cytotoksyczności z użyciem wybarwiania fioletem krystalicznym. Równolegle z próbkami na każdej z płytek testowych badany jest wewnętrzny standard IFN-β oraz wewnętrzny standard IFN-β zmodyfikowanego za pomocą PEG. Ten standard jest skalibrowany wobec standardu referencyjnego IFN naturalnego z fibroblastów ludzkich (Wtórny Standard Międzynarodowy WHO dla Interferonu, Fibroblast Ludzki, GB-23-902-53). Każda z płytek testowych zawiera również studzienki kontrolne dla wzrostu, nie zawierające ani IFN-β żadnego rodzaju, ani EMC oraz studzienki kontrolne dla wirusa, które zawierają komórki i EMC, ale nie IFN-β. Przygotowano również płytki kontrolne, zawierające standard i próbki, by ustalić ewentualny efekt próbek na wzrost komórek. Te płytki wybarwiono bez dodatku wirusa. Na każdej powtórzonej dwukrotnie płytce próbki i standardy zduplikowano, uzyskując cztery punkty danych dla każdej próbki. Wyniki przedstawiono w postaci średniej geometrycznej z tych czterech powtórzeń. Próg detekcji w tym teście wynosi 10 U/ml. Stężenia neopteryny w surowicy zmierzono w laboratorium farmakologii klinicznej za pomocą testów dostępnych na rynku. Stężenia 2'-5'-OAS w surowicy zmierzono w laboratorium zewnętrznym za pomocą walidowanego testu dostępnego na rynku.
Metody farmakokinetyczne i statystyczne
Do dopasowania modeli farmakokinetycznych do danych zastosowano program Strip™ (Micromath, Inc., Salt Lake City, UT). Średnie geometryczne stężeń wykreślono w funkcji czasu dla każdej grupy. Uważa się, że średnie geometryczne są odpowiedniejsze niż średnie arytmetyczne, gdyż wyniki testu wyrażone są przez rozcieńczenia. Poziomy IFN w surowicy koryguje się za pomocą wartości odniesienia, a stężenia w surowicy poniżej poziomu detekcji ustala się jako 5 U/ml, co odpowiada połowie dolnego progu detekcji. Dla danych dla wlewów IV do zmierzonych stężeń w surowicy każdego ze zwierząt dopasowuje się model dwukompartymentowy dla wlewów IV, a do danych S.C. dopasowuje się model dwukompartymentowy dla zastrzyków.
Oblicza się następujące parametry farmakokinetyczne:
i. zaobserwowane stężenie szczytowe, Cmax (U/ml);
ii. powierzchnia pod krzywą od 0 do 48 godz., AUC (U x godz./ml) z użyciem zasady trapzów;
iii. półokres eliminacji (godz.);
a dla danych dla wlewów IV (jeśli zastosowano IV):
iv. półokres dystrybucji (godz.);
v. usuwanie (ml/godz./kg);
vi. pozorną objętość dystrybucji, Vd (ml/kg).
Do obliczania półokresów eliminacji po zastrzykach IV i S.C. zastosowano program WinNonLin (wersja 1.0, Scientific Consulting Inc., Apel, NC). Dla neopteryny i 2'-5'-OAS dla każdej grupy przedstawiono średnie arytmetyczne w funkcji czasu. Obliczono Emax, maksymalne odchylenie od linii podstawowej. Cmax, AUC i Emax poddano jednostronnej analizie wariancji w celu porównania grup dawkowania. Cmax i AUC poddaje się transformacji logarytmicznej przed przystąpieniem do analizy, przedstawione są średnie geometryczne.
P r z y k ł a d 6: Efekty antyangiogenne ludzkiego IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG. Zdolność IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG do hamowania proliferacji komórek śródbłonka in vitro.
Komórki ludzkiego śródbłonka żylnego (Cell Systems, nr kat. 2V0-P75) oraz komórki ludzkiego śródbłonka skórnych naczyń włosowatych (Cell Systems, nr kat. 2M1-C25) podtrzymywano w kulturze za pomocą zestawu pożywek CS-C (Cell Systems, kat. # 4Z0-500). 24 godz. przed eksperymentem komórki trypsynizowano, zawieszono ponownie w pożywce testowej, 90% M199 i 10% surowicy płodów bydlęcych (FBS) oraz dostosowano do pożądanej gęstości komórek. Następnie wysiano komórki na pokryte żelatyną płytki 24- lub 96-studzienkowe, w ilości odpowiednio 12500 komórek na studzienkę lub 2000 komórek na studzienkę. Po całonocnej inkubacji pożywkę testową zastąpiono świeżą pożywką, zawierającą 20 ng/ml rekombinowanego ludzkiego zasadowego Czynnika Wzrostu Fibroblastów (bFGF) (Beton Dickinson, nr kat. 40060), po czym dodano różne stężenia IFN^-1a niezmodyfikowanego lub zmodyfikowanego za pomocą opisanego tu PEG lub dodatnie próbki kontrolne (jako
PL 213 322 B1 dodatnie próbki kontrolne można zastosować endostatynę albo przeciwciało przeciw bFGF). Objętość końcową ustalono na 0,5 ml w płytce 24-studzienkowej lub 0,2 ml w płytce 96-studzienkowej. Po 72 godz. komórki trypsynizowano dla zliczenia w liczniku Coultera, zamrożono dla odczytu fluorescencji CyQuant lub wyznakowano za pomocą [3H]-tymidyny. Ten test in vitro sprawdza efekt cząsteczek IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG ujawnonego niniejszym na proliferację komórek śródbłonka, które mogą świadczyć o efekcie antyangiogennym in vivo. Zobacz O'Reilly i wsp., Cell 88: 277-285 (1997).
P r z y k ł a d 7: Modele in vivo dla badania efektów antyangiogennych i neowaskularyzacyjnych ludzkiego IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG oraz IFN-β gryzonia zmodyfikowanych za pomocą PEG.
IFN-e-1a niezmodyfikowany oraz IFN-e-1a zmodyfikowany za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu sprawdzono pod względem ich zdolności do hamowania tworzenia zorientowanych promieniście naczyń, wnikających w obrzeże guzów czerniaka złośliwego człowieka SK-MEL-1 w bezgrasiczych nagich homozygotycznych (nu/nu) myszach. Komórki SK-MEL-1 hodowano do 80% konfluencji, a nastepnie 2 x 106 komórek inokulowano śródskómie (objętość 0,1 ml w dniu 0) w boku w linii śródpachowej trzytygodniowych bezgrasiczych nagich homozygotycznych (nu/nu) myszy NCR (Taconic, Germantown, NY). Po 24 godzinach (dzień 1) grupy po trzy myszy otrzymały następujące dawki podskórne kontrolnej próbki nośnika, IFN-e-1a niezmodyfikowanego oraz IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropiono aldehydu:
Grupa A: 0,1 ml 45,6 mg/ml albuminy surowicy człowieka (kontrola nośnika), tylko raz w dniu 1
Grupa B: 0,1 ml 45,6 mg/ml albuminy surowicy człowieka, zawierającej 1 MU (5 μg) IFN-e-1a niezmodyfikowanego, codziennie w dniach 1-9 włącznie
Grupa C: 0,1 ml 45,6 mg/ml albuminy surowicy człowieka, zawierającej 1 jednostkę MU (10 μg) IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu, tylko raz w dniu 1
Grupa D: 0,1 ml 45,6 mg/ml albuminy surowicy człowieka (kontrola nośnika), codziennie w dniach 1-9 włącznie
Myszy zabito w dniu 10 (Avertin, 0,5 ml dootrzewnowo), po czym zbadano miejsca inokulacji pod względem neowaskularyzacji, mierzonej przez obserwatora niedoinformowanego o grupach badania. Naczynia zliczono pod stałym powiększeniem pod mikroskopem anatomicznym. Każde zorientowane radialnie naczynie, wnikające w obrzeże guza było zliczane jako pojedyncze naczynie. Każda grupa składała się z trzech myszy.
Jak przedstawiono na fig. 10, jednorazowe podanie 1 MU IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu (grupa C) obniżyło liczbę nowych naczyń równie skutecznie, jak codzienne podawanie 1 MU IFN-e-1a niezmodyfikowanego (grupa B). Efekt IFN-e-1a zmodyfikowanego za pomocą 20 kDa mPEG-O-2-metylopropionoaldehydu jest jednak wyraźniejszy, jeśli weźmie się pod uwagę fakt, że codzienne podawanie samego nośnika miało pewien efekt hamujący (porównaj grupę A, nośnik podany raz z grupą D, nośnik podawany codziennie).
Opracowano szereg innych modeli, które można zastosować do badania efektów antyangiogennych i antyneowaskularyzacyjnych cząsteczek zmodyfikowanych za pomocą PEG. Niektóre spośród tych modeli opisano w patentach USA 5733876 (31 marca 1998: „Sposoby hamowania angiogenezy”) i 5135919 (4 sierpnia 1992: „Sposób i kompozycja farmaceutyczna dla hamowania angiogenezy”). Do innych testów należą bezskorupowy test błony chorioallantoinowej (CAM) Taylora i Folkmana; Nature 297:307 (1982) oraz Cruma i wsp., Science 230:1375 (1985); model antyangiogenny z metodą grzbietowego worka powietrznego myszy Folkmana i wsp.; J. Exp. Med. 133: 275 (1971) oraz test mikrokieszonki rogówkowej Gimbrone Jr. i wsp., J. Natl. Cancer Inst. 52:413 (1974), w którym u dorosłych samców szczurów szczepu Sprague-Dawley (Charles River, Japonia) wywołuje się waskularyzację rogówki przez implantację do każdej rogówki 500 ng bFGF (wołowego, R & D Systems, Inc.), zaimpregnowanego perełkach kopolimeru etylen-octan winylu. Istnieje ponadto model, w którym angiogenezę wywołuje się w myszach NIH-Swiss lub bezgrasiczych nagich (nu/nu) po implantacji komórek raka sutka MCF-7 lub komórek raka jajnika NIH-OVCAR-3, zgodnie z opisem w Lindner i Borden; Int. J. Cancer 71:456 (1997). Do indukcji angiogenezy zgodnie z opisem powyżej można użyć innych Iini komórek nowotworowych, włączając (lecz nie ograniczając się do) komórki ludzkiego czerniaka złośliwego SK-MEL-1. Dla białek niezmodyfikowanych oraz zmodyfikowanych za pomocą PEG jak opisano niniejszym można zastosować różne dawki z różnymi częstotliwościami dawkowania i w różnych okresach.
PL 213 322 B1
Inne sposoby badania IFN-β myszy i szczura zmodyfikowanych za pomocą PEG pod względem efektów antryangiogennych w modelach zwierzęcych obejmują (lecz nie ograniczają się do) protokołów dla skriningu nowych potencjalnych leków przeciwnowotworowych, jak opisano w oryginalnym Cancer Chemotherapy Reports, część 3, tom 3, nr 2, wrzesień 1972 oraz w suplemencie In Vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH Publication nr 84-2635, luty 1984. Ze względu na swoistość gatunkową interferonów typu I, aby zbadać aktywność antyangiogenną IFN-β zmodyfikowanych za pomocą PEG w modelach gryzonich, otrzymano próbki gryzonich (np. myszych i szczurzych) IFN-β zmodyfikowanych za pomocą PEG. Takie metody skriningu są przedstawione na przykładzie protokołu badania efektów antyangiogennych mysich IFN-β zmodyfikowanych za pomocą PEG na implantowany podskórnie rak płuc Lewisa:
Źródło linii nowotworu
Ta linia nowotworu powstała spontanicznie w 1951 jako rak płuc u myszy C57BL/6.
Streszczenie procedury testowej
Fragment nowotworu ulega implantacji podskórnej w rejonie pachy myszy B6D2F1. Środek badany (tj. interferon zmodyfikowany za pomocą PEG ujawniony niniejszym) jest podawany w różnych dawkach, podskórnie (SC) lub dootrzewnowo (IP), przez wiele dni po zaimplantowaniu guza. Mierzonym parametrem jest średni czas przeżycia. Wyniki są przedstawione jako wartości procentowe kontrolnego czasu przeżycia.
Zwierzęta
Propagacja: myszy c57/BL/6
Badanie: myszy B6D2F1.
Waga: myszy mieszczą się w zakresie wag różniącym się o 3 g, z wartością minimalną 18 g dla samców i 17 g dla samic.
Płeć: wszystkie zwierzęta, stosowane w badaniach i grupach kontrolnych w jednym eksperymencie są tej samej płci.
Źródło: Jeśli możliwe, wszystkie zwierzęta w jednym eksperymencie pochodzą z jednego źródła.
Skala eksperymentu
Dziesięć zwierząt na grupę badania
Transfer nowotworu
Propagacja:
Fragment: przygotować 2-4 mm fragment guza donorowego.
Czas: dzień 13-15.
Miejsce: zaimplanować fragment S.C. w rejonie pachy z nakłuciem w obszarze pachwiny.
Badanie:
Fragment: przygotować 2-4 mm fragment guza donorowego.
Czas: dzień 13-15.
Miejsce: zaimplantować fragment S.C. w rejonie pachy z nakłuciem w obszarze pachwiny.
Schemat badania
Dzień 0: zaimplantować nowotwór. Wyhodować kultury bakteryjne. Zbadać związek, stanowiący kontrolę pozytywną w eksperymentach o numerach nieparzystych. Przygotować materiały. Odnotowywać przypadki śmierci codziennie.
Dzień 1: Sprawdzić kultury. Odrzucić eksperyment, jeśli nastąpiło zanieczyszczenie. Zrandomizować zwierzęta. Postępować z nimi według instrukcji (w dniu 1 i następnych).
Dzień 2: Ponownie sprawdzić kultury. Odrzucić eksperyment, jeśli nastąpiło zanieczyszczenie.
Dzień 5: 2 dzień ważenia, także dzień wstępnej oceny toksyczności leku badanego.
Dzień 14: Dzień kontroli kwestii wczesnej śmierci
Dzień 48: Dzień kontroli, nie pobiera się niczego
Dzień 60: Zakończenie i ocena badania. Zbadać płuca pod kątem nowotworów.
Kontrola jakości
Zaplanować podawanie związku kontroli pozytywnej (NSC 26271); cytoksanu w dawce 100 mg/kg/zastrzyk) w każdym eksperymencie oznaczonym liczbą nieparzystą, protokół którego stanowi podawanie dootrzewnowe tylko w dniu 1. Najniższy limit test/kontrola dla kontroli pozytywnej. Niższy ogranicznik dla kontroli pozytywnej wynosi 140%. Dopuszczalny średni kontrolny okres przeżycia bez leczenia wynosi 19-35,6 dni.
PL 213 322 B1
Ocena
Mierzonym parametrem jest mediana okresu przeżycia. Obliczyć średnie masy ciał zwierząt w Dniu 1 i Dniu 5, obliczyć stosunek test/kontrola dla wszystkich grup badania. Oblicza się średnie masy ciał zwierząt w dniu klasyfikacji nowotworów oraz w dniu badania końcowego. Stosunek test/kontrola oblicza się dla wszystkich grup badania, w których w Dniu 5 przy życiu zostaje >65% zwierząt. Wartość stosunku test/kontrola <86% wskazuje na toksyczność. W ocenie toksyczności można również wykorzystać nadmierne różnice wagi ciała (test minus kontrola).
Kryteria aktywności
Wyjściowy stosunek test/kontrola większy lub równy 140% uważa się za niezbędny dla wykazania umiarkowanej aktywności. Powtarzalną wartość stosunku test/kontrola większą lub równą 150% uważa się za świadczącą o znaczącej aktywności.
P r z y k ł a d 8: Modele in vivo dla badania efektów przeciwrozrostowych i przeciwnowotworowych ludzkiego IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG oraz IFN-β gryzonia zmodyfikowanych za pomocą PEG.
Dostępne są różne modele in vivo dla badania efektów przeciwrozrostowych i przeciwnowotworowych ludzkiego IFN-e-1a niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG jak opisano powyżej. W modelu opisanym przez Bailon i wsp., Bioconjugate Chemistry 12:195 (2001), nagim myszom bezgrasiczym (Harlan) implantuje się podskórnie do boku w tylnej części ciała 2 x 106 komórek nerki ludzkiej A498, komórek nerki ludzkiej ACHN lub komórek nerki ludzkiej G402, po czym umożliwia się rozwój nowotworu przez 3-6 tygodni. Następnie podaje się różne dawki IFN^-1a niezmodyfikowanego lub zmodyfikowanego, przy różnych częstotliwościach dawkowania oraz różnych długościach czasu podawania, po czym objętość guza mierzy się i porównuje dla różnych schematów. W innym modelu, opisanym przez Linder i Borden, J. Interferon Cytokine Res 17: 681 (1997), samicom nagich (nu/nu) myszy bezgrasiczych BALB/c, którm usunięto jajniki, implantuje się 2 x 106 komórek ludzkiego raka sutka MCF-7 (plus estradiol), MDA-MB-231, MDA-MB-468 lub BT-20, komórek ludzkiego raka jajnika NIH-OVCAR-3, komórek ludzkiego raka okrężnicy HT-29 lub komórek ludzkiego czerniaka złośliwego SK-MEL-1 lub FEMX do warstwy skóry właściwej, pokrywającej sutki leżące najbliżej pach, po czym ocenia się rozmiar guza w funkcji czasu. Następnie podaje się różne dawki IFN^-1a niezmodyfikowanego lub zmodyfikowanego, przy różnych częstotliwościach dawkowania oraz różnych długościach czasu podawania po czym objętość guza mierzy się i porównuje dla różnych schematów. Inne modele dla badania efektów przeciwrozrostowych i przeciwnowotworowych ludzkiego IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG obejmują (ale nie ograniczając się do nich) modele lokalne i metastatyczne nowotworu płuc, opisane przez Qin i wsp., Molecular Therapy 4: 356 (2001) oraz modele przeszczepów międzygatunkowych metastaz wątrobowych ludzkiego raka jelita grubego u nagich myszy, opisane przez Tada i wsp., J Clinical Investigation 108: 83 (2001).
Inne sposoby badania efektów przeciwrozrostowych i przeciwnowotworowych mysiego i szczurzego IFN-β zmodyfikowanego za pomocą PEG obejmują (ale nie ograniczając się do nich) mysi model międzybłoniaka złośliwego, opisany przez Odaka i wsp., Cancer Res 61: 6201 (2001), modele lokalne i metastatyczne nowotworu płuc, opisane przez Qin i wsp., Molecular Therapy 4: 356 (2001) oraz syngeniczne modele mysie metastaz wątrobowych raka jelita grubego, opisane przez Tada i wsp., J Clinical Investigation 108: 83 (2001).
P r z y k ł a d 9: Modele in vivo dla badania efektów przeciwwirusowych mysiego IFN-β zmodyfikowanego za pomocą PEG oraz ludzkiego IFN^-1a zmodyfikowanego za pomocą PEG.
Dostępny jest model in vivo dla badania efektu mysiego IFN-β niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG na poziom ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u transgenicznych-HBV myszy SCID. Larkin i wsp., Nature Medicine 5:907 (1999). W tym modelu transgeniczne myszy SCID, niosące dimer „głowa-ogon” genomu HBV człowieka, posiadają wykrywalny poziom postaci replikatywnych HBV oraz przedgenomowego RNA w wątrobie, a także wirusa HBV w surowicy. Hepatocyty myszy pochodzące od myszy transgenicznych są również pozytywne pod względem białek HBsAg, HBcAg i HbxAg, co wskazuje a replikację wirusa. Przykład protokołu dla porównywania mysiego IFN-β niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG jest podany poniżej.
myszy (5 grup po 5 plus 5 zapasowych) o porównywalnych mianach wirusa miareczkowano w dwóch niezależnych punktach czasowych (w odstępie przynajmniej 1 tygodnia) w celu ustalenia miana odniesienia i by upewnić się co do niezmienności tego miana przed podaniem mysiego IFN-β. Grupom po 5 myszy podaje się 3 razy w tygodniu (poniedziałek, środa i piątek) podskórnie następujące dawki, przedstawione w tabeli 7.
PL 213 322 B1
T a b e l a 7
Grupa Próbka dawkowana
1 kontrola nośnika (1 mg/ml albuminy z osocza krwi myszy, MSA).
2 30 U mysiego IFN-β niezmodyfikowanego w 1 mg/ml MSA
3 300 U mysiego IFN-β niezmodyfikowanego w 1 mg/ml MSA
4 3000 U mysiego IFN-β niezmodyfikowanego w 1 mg/ml MSA
5 30 U IFN-β mysiego zmodyfikowanego za pomocą PEG w 1 mg/ml MSA
6 300 U IFN-β mysiego zmodyfikowanego za pomocą PEG w 1 mg/ml MSA
7 3000 U IFN-β mysiego zmodyfikowanego za pomocą PEG w 1 mg/ml MSA
Miana wirusa ustala się raz w tygodniu podczas okresu dawkowania oraz raz na tydzień lub dwa przez 6 miesięcy po zakończeniu dawkowania. Dla porównania zwierząt leczonych nośnikiem i IFN-β pod względem usuwania i ponownego ustalania miana wirusa tworzy się wykresy miana wirua od czasu. Następnie wykonuje się drugi eksperyment dla odpowiednich dawek mysiego IFN-p niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG, z udziałem 10-20 myszy w grupie, dla w sumie 30-60 myszy (10-20 dla kontroli, 10-20 dla mysiego IFN-β niezmodyfikowanego, 10-20 dla mysiego IFN-p zmodyfikowanego za pomocą PEG). Miana wirusa mierzy się jak powyżej, a zaraz po zabiciu surowicę analizuje się za pomocą SDS-PAGE i testu Westerna, pod względem miana wirusa oraz HbsAg. Wątroby również się pobiera, zamraża lub ustala, wedle potrzeby, a następnie wybarwia na obecność HbsAg, HbcAg ora HbsAg. Na próbkach surowicy i tkanek można wykonywać również stosowne testy histologiczne, histochemiczne lub biochemiczne, znane biegłym w dziedzinie.
Dostępny jest również model mysi in vivo dla badania efektu ludzkiego IFN-p niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG na poziom wirusa ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), u myszy niosących chimerowe wątroby człowieka. Mercer i wsp., Nature Medicine 7:927 (2001). W tym modelu myszom SCID, niosącym transgen aktywatora plazminogenu (Alb-uPA) oraz myszom, którym wszczepiono surowicę od ludzi zakażonych różnymi genotypami HCV, wszczepia się normalne hepatocyty człowieka. Wszczepione komórki wątroby człowieka zostają zainfekowane przez wirusa, który następnie namnaża się. Poziom RNA HCV w surowicy można zmierzyć za pomocą PCR, tak samo jak poziomy pozytywnego i negatywnego (postać replikacyjna) RNA w komórkach wątroby. Wykonuje się odpowiedni protokół badania, podobny (lecz nie ograniczony) do opisanego powyżej dla mysiego IFN-p niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG, w myszach transgenicznych HBV SCID, w celu oceny skuteczności IFN-p niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego za pomocą PEG, w tym modelu, tj. ustalenia efektu leczenia na miano HCV, histologię wątroby, poziom ALT w surowicy oraz obecność form replikacyjnych HCV w przeszczepionej tkance wątroby człowieka. Na próbkach surowicy i tkanek można wykonywać również stosowne testy histologiczne, histochemiczne lub biochemiczne, podobne do znanych specjalistom w dziedzinie.

Claims (35)

1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że posiada strukturę określoną wzorem
PL 213 322 B1 w którym P oznacza polimer glikolu polialkilenowego;
X oznacza O;
każdy spośród Z i Z' oznacza niezależnie atom wodoru, nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20, przy czym podstawniki wybiera się z grupy, składającej się z atomu fluorowca, grupy hydroksylowej, karbonylowej, karboksylanowej, estrowej, formylowej, acylowej, tiokarbonylowej, tioestrowej, tiooctanowej, tiomrówczanowej, alkoksylowej, fosforylowej, fosfonianowej, fosfinianowej, aminowej, amidowej, amidynowej, iminowej, cyjanowej, nitrowej, azydowej, sulfhydrylowej, siarczanowej, sulfonianowej, sulfamoilowej, sulfonamidowej, sulfonylowej, heterocyklilowej, aralkilowej, reszty aromatycznej, reszty heteroaromatycznej, grupy iminowej, sililowej, eterowej i alkilotiolowej, pod warunkiem, że przynajmniej jeden z Z lub Z' nie oznacza atomu wodoru;
R* oznacza resztę łącznikową utworzoną w reakcji reszty, wybieranej z grupy, składającej się z reszty aldehydowej, hydratu aldehydu i reszty acetalowej ze związkiem aktywnym biologicznie lub jego prekursorem;
B oznacza biologicznie aktywny zwią zek, przy czym biologicznie aktywny zwią zek lub jego prekursor obejmuje interferon;
każdy spośród n oznacza niezależnie 0 lub liczbę całkowitą od 1 do 5, a p oznacza 1, 2 lub 3.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że P oznacza glikol polietylenowy o strukturze określonej wzorem II;
Wzór II
E-(O-CH2CH2)a-, w którym E oznacza atom wodoru, grupę alkilową C1 do C6 o ł a ń cuchu prostym lub rozgałęzionym lub wykrywalny znacznik i a oznacza liczbę całkowitą od 4 do 10000.
3. Kompozycja wedł ug zastrz. 2, znamienna tym, ż e E oznacza grupę metylową .
4. Kompozycja wedł ug zastrz. 2, znamienna tym, ż e E oznacza wykrywalny znacznik.
5. Kompozycja wedł ug zastrz. 4, znamienna tym, ż e wykrywalny znacznik jest wybrany z grupy składającej się z izotopów radioaktywnych, reszt fluoryzujących, reszt fosforyzujących, reszt chemiluminescencyjnych i kropek kwantowych.
6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że R* jest metylenem a B jest biologicznie aktywnym związkiem związanym przez aminę.
7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że amina jest końcową aminą peptydu włączonego do biologicznie aktywnego związku.
8. Kompozycja wedł ug zastrz. 7, znamienna tym, ż e peptydem jest interferon.
9. Kompozycja wedł ug zastrz. 8, znamienna tym, ż e interferonem jest interferon-beta.
10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że interferonem-beta jest interferon-beta-1a.
11. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że posiada strukturę określoną wzorem
XXIIa:
Wzór XXIIa
P-X-(CH2)n-CH-R*-B
Z w którym P, X, R', R*, B i n mają znaczenie określone w zastrz. 1; oraz
Z oznacza nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową lub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, taką że grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20, przy czym podstawniki wybiera się z grupy składającej się z atomu fluorowca, grupy hydroksylowej, karbonylowej, karboksylanowej, estrowej, formylowej, acylowej, tiokarbonylowej, tioestrowej, tiooctanowej, tiomrówczanowej, alkoksylowej, fosforylowej, fosfonianowej, fosfiPL 213 322 B1 nianowej, aminowej, amidowej, amidynowej, iminowej, cyjanowej, nitrowej, azydowej, sulfhydrylowej, siarczanowej, sulfonianowej, sulfamoilowej, sulfonamidowej, sulfonylowej, heterocyklilowej, aralkilowej, reszty aromatycznej, reszty heteroaromatycznej, grupy iminowej, sililowej, eterowej i alkilotiolowej.
12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że P oznacza glikol polietylenowy o strukturze określonej wzorem II:
Wzór II
E-(O-CH2CH2)a-, w którym E oznacza atom wodoru, grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o ł a ń cuchu prostym lub rozgałęzionym, lub wykrywalny znacznik i a oznacza liczbę całkowitą od 4 do 10000.
13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że E oznacza grupę metylową.
14. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że E oznacza wykrywalny znacznik.
15. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że wykrywalny znacznik jest wybrany z grupy składającej się z izotopów radioaktywnych, reszt fluoryzujących, reszt fosforyzujących, reszt chemiluminescencyjnych i kropek kwantowych.
16. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że R* jest metylenem a B jest biologicznie aktywnym związkiem związanym przez aminę.
17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że amina jest końcową aminą peptydu włączonego do biologicznie aktywnego związku.
18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że peptydem jest interferon.
19. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że interferonem jest interferon-beta.
20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że interferonem-beta jest interferon-beta-1a.
21. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że posiada strukturę według wzoru XXII:
w którym P, X, Z i n mają znaczenie jak okreś lono poniż ej
R* oznacza resztę łącznikową, która powstaje w reakcji R z reaktywną resztą związku aktywnego biologicznie lub jego prekursora; oraz
B oznacza niezależnie biologicznie aktywny związek lub jego prekursor, przy czym biologicznie aktywny związek lub prekursor obejmuje interferon;
przy czym kompozycja obejmuje produkt reakcji aktywowanego polimeru glikolu polialkilenowego i biologicznie aktywnego związku lub jego prekursora, a aktywowany polimer glikolu polialkilenowego ma strukturę określoną wzorem X:
WzórX ρ-χ·
Z' cz
-(CH2)n-R
P w którym P oznacza polimer glikolu polialkilenowego;
X oznacza O;
Z' oznacza H;
Z oznacza nasyconą lub nienasyconą grupę alkilową lub heteroalkilową C1 do C20 o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, nasyconą lub nienasyconą cykliczną grupę alkilową Iub heteroalkilową C3 do C8, podstawioną lub niepodstawioną grupę arylową lub heteroarylową albo podstawioną lub niepodstawioną grupę alkiloarylową, w której grupa alkilowa jest nasyconą lub nienasyconą grupą alkilową lub heteroalkiloarylową C1 do C20, przy czym podstawniki są wybrane z grupy składającej się
PL 213 322 B1 z atomu fluorowca, grupy hydroksylowej, karbonylowej, karboksylanowej, estrowej, formylowej, acylowej, tiokarbonylowej, tioestrowej, tiooctanowej, tiomrówczanowej, alkoksylowej, fosforylowej, fosfonianowej, fosfinianowej, aminowej, amidowej, amidynowej, iminowej, cyjanowej, nitrowej, azydowej, sulfhydrylowej, siarczanowej, sulfonianowej, sulfamoilowej, sulfonamidowej, sulfonylowej, heterocyklilowej, aralkilowej, reszty aromatycznej, reszty heteroaromatycznej, grupy iminowej, sililowej, eterowej i alkilotiolowej;
R oznacza resztę zdolną do tworzenia wiązania między związkiem o wzorze X i biologicznie aktywnym związkiem lub jego prekursorem, przy czym R jest wybrana z grupy składającej się z aldehydu, hydratu aldehydu i reszty acetalowej;
n oznacza 0 dla -(CH2)n- pomiędzy R* i -(CZZ')-;
n oznacza 0 lub liczbę całkowitą od 1 do 5 dla -(CH2)n- pomiędzy -(CZZ')- i X, a p oznacza 1, 2 lub 3.
22. Kompozycja farmaceutyczna według jednego z zastrz. 1-21, znamienna tym, że zawiera dodatkowo dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
23. Kompozycja farmaceutyczna posiadająca strukturę zdefiniowaną wzorem XXII jak określono w zastrz. 1 do zastosowania jako lek do leczenia pacjenta podatnego na infekcję wirusową.
24. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że B we wskazanym wzorze oznacza interferon.
25. Kompozycja według zastrz. 24, znamienna tym, że B we wskazanym wzorze oznacza interferon-beta-1a.
26. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że obejmuje ponadto środek aktywny biologicznie wybrany z grupy, składającej się z niskocząsteczkowego środka antywirusowego, środka antywirusowego opartego o kwas nukleinowy i peptydowego środka antywirusowego.
27. Kompozycja według zastrz. 26, znamienna tym, że środek antywirusowy wybrany jest z grupy, składającej się z rybawiryny, levowiryny, 3TC, FTC, MB686, zidowudyny, acyklowiru, gancyklowiru, viramidu, VX-497, VX-950 i ISIS-14803.
28. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że infekcją wirusową jest przewlekłe zapalenie wątroby typu C.
29. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że posiada strukturę zdefiniowaną wzorem XXIIa jak określono w zastrz. 11.
30. Kompozycja według zastrz. 29, znamienna tym, że B we wskazanym wzorze oznacza interferon.
31. Kompozycja według zastrz. 30, znamienna tym, że B we wskazanym wzorze oznacza interferon-beta-1a.
32. Kompozycja według zastrz. 29, znamienna tym, że obejmuje ponadto środek aktywny biologicznie wybrany z grupy, składającej się z niskocząsteczkowego środka antywirusowego, środka antywirusowego opartego o kwas nukleinowy i peptydowego środka antywirusowego.
33. Kompozycja według zastrz. 32, znamienna tym, że środek antywirusowy wybrany jest z grupy składającej się z rybawiryny, levowiryny, 3TC, FTC, MB686, zidowudyny, acyklowiru, gancyklowiru, viramidu, VX-497, VX-950 i ISIS-14803.
34. Kompozycja według zastrz. 29, znamienna tym, że infekcją wirusową jest przewlekłe zapalenie wątroby typu C.
35. Kompozycja farmaceutyczna określona w zastrz. 1 do zastosowania w medycynie.
PL372728A 2002-01-18 2003-01-17 Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca polimer glikolu polialkilenowego skoniugowany z biologicznie aktywnym zwiazkiem lub jego prekursorem oraz jej zastosowania PL213322B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34991702P 2002-01-18 2002-01-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL372728A1 PL372728A1 (pl) 2005-08-08
PL213322B1 true PL213322B1 (pl) 2013-02-28

Family

ID=27613339

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL397261A PL397261A1 (pl) 2002-01-18 2003-01-17 Aktywowany polimer glikolu polialkilenowego, kompozycja i kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie
PL372728A PL213322B1 (pl) 2002-01-18 2003-01-17 Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca polimer glikolu polialkilenowego skoniugowany z biologicznie aktywnym zwiazkiem lub jego prekursorem oraz jej zastosowania

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL397261A PL397261A1 (pl) 2002-01-18 2003-01-17 Aktywowany polimer glikolu polialkilenowego, kompozycja i kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie

Country Status (35)

Country Link
US (2) US8017733B2 (pl)
EP (3) EP1476181B1 (pl)
JP (5) JP2005526151A (pl)
KR (1) KR100964411B1 (pl)
CN (2) CN1630530A (pl)
AU (1) AU2003210564B2 (pl)
BE (1) BE2016C040I2 (pl)
BG (1) BG66525B1 (pl)
BR (1) BRPI0306993B8 (pl)
CA (4) CA2473526C (pl)
CY (2) CY2016027I2 (pl)
CZ (1) CZ2004877A3 (pl)
DK (2) DK1476181T3 (pl)
EA (2) EA009783B1 (pl)
EE (1) EE05509B1 (pl)
ES (2) ES2774801T3 (pl)
FR (1) FR16C0034I2 (pl)
GE (2) GEP20064024B (pl)
HU (4) HU230473B1 (pl)
IL (1) IL163006A (pl)
IS (1) IS2989B (pl)
LU (1) LU93162I2 (pl)
ME (2) MEP35608A (pl)
MX (1) MXPA04006855A (pl)
NL (1) NL300826I2 (pl)
NO (3) NO339857B1 (pl)
NZ (1) NZ534708A (pl)
PL (2) PL397261A1 (pl)
PT (1) PT3025726T (pl)
RS (1) RS55578B1 (pl)
SI (2) SI1476181T1 (pl)
SK (1) SK3102004A3 (pl)
UA (1) UA82184C2 (pl)
WO (1) WO2003061577A2 (pl)
ZA (1) ZA200406555B (pl)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150246097A9 (en) * 2002-01-18 2015-09-03 Biogen Idec Ma Inc. Polyalkylene Polymer Compounds and Uses Thereof
CA2473526C (en) * 2002-01-18 2013-10-22 Biogen Idec Ma Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
AP2005003246A0 (en) 2002-09-09 2005-03-31 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanals
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
EP1667708B9 (en) 2002-12-26 2012-10-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. POLYETHYLENE GLYCOL CONJUGATES OF INTERFERON-BETA-1b WITH ENHANCED IN VITRO BIOLOGICAL POTENCY
US20040136952A1 (en) * 2002-12-26 2004-07-15 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
KR101025143B1 (ko) 2002-12-31 2011-04-01 넥타르 테라퓨틱스 가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체
US7432331B2 (en) 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
EP2044959A1 (en) 2003-06-26 2009-04-08 pSivida Inc In-situ gelling drug delivery system
TWI367103B (en) 2003-06-26 2012-07-01 Psivida Inc Bioerodible sustained release drug delivery systems
EP1758583A2 (en) * 2004-05-31 2007-03-07 Ranbaxy Laboratories Limited Arylpiperazine derivatives useful as adrenergic receptor antagonists
US7851565B2 (en) 2004-12-21 2010-12-14 Nektar Therapeutics Stabilized polymeric thiol reagents
WO2006130553A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Schering Corporation Hcv protease inhibitors
SG196786A1 (en) * 2005-07-08 2014-02-13 Elan Pharm Inc Preparation of polymer conjugates of therapeutic, agricultural, and food additive compounds
EP2019690A2 (en) * 2006-05-22 2009-02-04 Elan Pharmaceuticals Inc. Preparation of polymer conjugates of vla-4 antagonists via a mitsunobu's reaction
US20100222546A1 (en) * 2006-11-28 2010-09-02 David Crich Methods for the preparation of functionalized peptides, proteins and carbohydrates and their conjugates
US20090016985A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric drug delivery system containing a multi-substituted aromatic moiety
CA2693645A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric drug delivery systems containing an aromatic allylic acid
CL2008002399A1 (es) * 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
AU2009255994B2 (en) * 2008-06-05 2014-07-17 Bristol-Myers Squibb Company Use of pegylated Type III Interferons for the treatment of hepatitis C
MX2011001167A (es) * 2008-07-31 2011-04-12 Pharmaessentia Corp Conjugados peptido-polimero.
GB0823309D0 (en) * 2008-12-19 2009-01-28 Univ Bath Functionalising reagents and their uses
US20120072207A1 (en) 2009-06-02 2012-03-22 Panasonic Corporation Down-mixing device, encoder, and method therefor
UA109646C2 (uk) * 2009-12-10 2015-09-25 Терапевтичне застосування кон'югатів білка з полімером
US20130225789A1 (en) * 2012-02-29 2013-08-29 Yi Sun Polyethylene Glycol Having Hetero Multiple Functional Groups
US8993614B2 (en) 2012-03-15 2015-03-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Substituted pyrrolidine-2-carboxamides
KR101475630B1 (ko) * 2013-05-31 2014-12-22 동국대학교 산학협력단 포도근 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 c형 간염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2016013911A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
RS61128B1 (sr) * 2014-08-19 2020-12-31 Biogen Ma Inc Postupak pegilacije
GB201419108D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Glythera Ltd Materials and methods relating to linkers for use in antibody drug conjugates
JP6820841B2 (ja) 2014-11-06 2021-01-27 ファーマエッセンティア コーポレイション ペグ化インターフェロンのための投薬計画
EP3421442B1 (en) * 2017-06-28 2020-08-05 Construction Research & Technology GmbH Dispersant for inorganic particles
US11472894B2 (en) 2018-07-23 2022-10-18 Carnegie Mellon University Enzyme-assisted ATRP procedures
WO2020028715A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Russell Alan J Amino-reactive positively charged atrp initiators that maintain their positive charge during synthesis of biomacro-initiators
CN109232898A (zh) * 2018-08-02 2019-01-18 张玲 一种具有抗凝血功能的聚酰亚胺新材料的制备方法
CN111534458B (zh) * 2020-04-13 2022-01-14 浙江工业大学 无色杆菌tbc-1及其在降解1,3,6,8-四溴咔唑中的应用
CN113716982B (zh) * 2021-08-24 2022-05-06 重庆云瑞肥业有限公司 一种食品垃圾回收用发酵制肥装置

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
DE3262575D1 (en) 1981-12-23 1985-04-18 Schering Corp Stabilised interferon formulations and their preparation
WO1985003934A1 (fr) * 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteine modifiee chimiquement et son procede de preparation
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5286637A (en) * 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
AU3423293A (en) 1991-12-19 1993-07-19 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5262564A (en) 1992-10-30 1993-11-16 Octamer, Inc. Sulfinic acid adducts of organo nitroso compounds useful as retroviral inactivating agents anti-retroviral agents and anti-tumor agents
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
PT730470E (pt) 1993-11-10 2002-08-30 Enzon Inc Conjugados melhorados de interferao-polimero
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
JPH10510516A (ja) 1994-12-07 1998-10-13 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ アレルゲン性を減らしたポリペプチド
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
WO1997014740A1 (en) * 1995-10-19 1997-04-24 Receptagen Corporation Discrete-length polyethylene glycols
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) * 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
AU5773798A (en) 1997-01-29 1998-08-18 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
PL335721A1 (en) 1997-03-05 2000-05-08 Ribogene Novel methods of screening serving the purpose of identifying the factors of selective hepatitis c virus replication inhibition
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US7642323B2 (en) 1997-11-06 2010-01-05 Nektar Therapeutics Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
EP1037649B1 (en) * 1997-12-17 2009-09-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
ATE268609T1 (de) * 1998-03-12 2004-06-15 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
CN100335503C (zh) 1998-04-28 2007-09-05 应用研究系统Ars股份公司 多元醇干扰素β偶联物
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
EA004789B9 (ru) * 1998-10-16 2017-05-31 Байоджен, Инк. Полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона и их использование
CA2376714A1 (en) * 1999-06-11 2001-01-04 Shearwater Corporation Hydrogels derived from chitosan and poly(ethylene glycol) or related polymers
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
IL147581A0 (en) 1999-08-27 2002-08-14 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
CA2394980C (en) 1999-12-22 2008-05-13 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) * 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
ES2367891T3 (es) * 2000-09-29 2011-11-10 Schering Corporation Interleucina-10 pegilada.
US7053150B2 (en) 2000-12-18 2006-05-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Segmented polymers and their conjugates
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
EA009771B1 (ru) * 2001-02-01 2008-04-28 Байоджен Айдек Ма, Инк. Полипептид нейбластина, способы его получения и применения
WO2002074806A2 (en) 2001-02-27 2002-09-26 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US7009033B2 (en) 2001-07-02 2006-03-07 Polymer Source Inc. Heterofunctional polyethylene glycol and polyethylene oxide, process for their manufacture
SI1436012T1 (en) * 2001-10-18 2018-03-30 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of opioid antagonists
MXPA04004809A (es) * 2001-11-20 2004-08-11 Pharmacia Corp Conjugados de hormona de crecimiento humana modificada quimicamente.
US6956135B2 (en) 2001-12-11 2005-10-18 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
KR100488351B1 (ko) 2001-12-11 2005-05-11 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체
US6916962B2 (en) 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US7041855B2 (en) 2001-12-11 2006-05-09 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
AU2002357806A1 (en) * 2001-12-11 2003-06-23 Sun Bio, Inc. Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes
CA2473526C (en) * 2002-01-18 2013-10-22 Biogen Idec Ma Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
AP2005003246A0 (en) 2002-09-09 2005-03-31 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanals
EP1667708B9 (en) 2002-12-26 2012-10-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. POLYETHYLENE GLYCOL CONJUGATES OF INTERFERON-BETA-1b WITH ENHANCED IN VITRO BIOLOGICAL POTENCY
US20110165122A1 (en) * 2009-11-10 2011-07-07 The Regents Of The University Of California Method for targeted and sustained antiviral therapy

Also Published As

Publication number Publication date
EA200400962A1 (ru) 2005-06-30
US8017733B2 (en) 2011-09-13
PL397261A1 (pl) 2012-03-26
EP3669887A1 (en) 2020-06-24
EP3025726B1 (en) 2019-11-20
EE200400105A (et) 2004-12-15
CA2473526C (en) 2013-10-22
CA2840490A1 (en) 2003-07-31
CA2473526A1 (en) 2003-07-31
EA011829B1 (ru) 2009-06-30
ES2774801T3 (es) 2020-07-22
WO2003061577A2 (en) 2003-07-31
HK1224185A1 (en) 2017-08-18
CA2753899C (en) 2014-03-25
RS63504A (sr) 2007-02-05
EA009783B1 (ru) 2008-04-28
CA2753899A1 (en) 2003-07-31
SK3102004A3 (sk) 2005-01-03
HUP0500457A2 (hu) 2005-08-29
NO2017013I1 (no) 2017-04-10
JP2005526151A (ja) 2005-09-02
SI3025726T1 (sl) 2020-03-31
NL300826I2 (pl) 2017-03-16
HUS1600035I1 (hu) 2016-10-28
HUP0500457A3 (en) 2012-09-28
WO2003061577A8 (en) 2008-11-20
HU230473B1 (hu) 2016-07-28
IS7353A (is) 2004-07-15
UA82184C2 (uk) 2008-03-25
JP5275125B2 (ja) 2013-08-28
EP1476181A2 (en) 2004-11-17
AU2003210564B2 (en) 2008-10-23
CA2952488C (en) 2019-05-07
NO2017013I2 (no) 2018-08-20
US8524660B2 (en) 2013-09-03
ZA200406555B (en) 2005-11-30
GEP20074024B (en) 2007-01-10
RS55578B1 (sr) 2017-06-30
WO2003061577A3 (en) 2003-10-02
US20120014916A1 (en) 2012-01-19
CZ2004877A3 (cs) 2004-12-15
MEP35608A (hr) 2011-02-10
SI1476181T1 (sl) 2016-10-28
CA2840490C (en) 2017-02-28
EA200701386A1 (ru) 2007-10-26
JP2013136756A (ja) 2013-07-11
PL372728A1 (pl) 2005-08-08
PT3025726T (pt) 2020-01-09
JP2016014022A (ja) 2016-01-28
HK1072721A1 (zh) 2005-09-09
GEP20064024B (en) 2007-01-10
NO344612B1 (no) 2020-02-10
BR0306993A (pt) 2005-09-06
NZ534708A (en) 2007-05-31
HUE028163T2 (en) 2016-11-28
IS2989B (is) 2017-11-15
CY2016027I1 (el) 2017-06-28
BG108839A (bg) 2005-04-30
MXPA04006855A (es) 2005-04-19
NO20043422L (no) 2004-10-11
ES2566797T3 (es) 2016-04-15
FR16C0034I2 (fr) 2019-10-04
US20050107277A1 (en) 2005-05-19
ME00239B (me) 2011-05-10
CY2016027I2 (el) 2017-06-28
CN101700401B (zh) 2013-08-14
JP6030717B2 (ja) 2016-11-24
NO339857B1 (no) 2017-02-06
BRPI0306993B8 (pt) 2021-05-25
DK1476181T3 (en) 2016-05-23
FR16C0034I1 (pl) 2016-09-23
EP1476181B1 (en) 2016-03-23
DK3025726T3 (da) 2019-12-09
BG66525B1 (bg) 2016-04-28
BRPI0306993B1 (pt) 2020-03-10
CA2952488A1 (en) 2003-07-31
JP2009235409A (ja) 2009-10-15
HUE047557T2 (hu) 2020-04-28
KR100964411B1 (ko) 2010-06-15
KR20040081463A (ko) 2004-09-21
CN1630530A (zh) 2005-06-22
BE2016C040I2 (pl) 2022-05-17
NO20151082A1 (no) 2015-08-26
EP1476181A4 (en) 2008-11-19
LU93162I2 (fr) 2016-10-03
CN101700401A (zh) 2010-05-05
CY1122841T1 (el) 2021-10-29
EE05509B1 (et) 2012-02-15
IL163006A (en) 2011-01-31
EP3025726A1 (en) 2016-06-01
JP2012255156A (ja) 2012-12-27
HK1143553A1 (en) 2011-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL213322B1 (pl) Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca polimer glikolu polialkilenowego skoniugowany z biologicznie aktywnym zwiazkiem lub jego prekursorem oraz jej zastosowania
AU2003210564A1 (en) Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound
JP2005526151A5 (pl)
US20170049904A1 (en) Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
HK1224185B (en) Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
HK1072721B (en) Polyalkylene polymer compounds and uses thereof