PL212342B1 - Metoda otrzymywania peptydu opioidowego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiot wynalazku stanowi metoda otrzymywania peptydu opioidowego, zwyczajowo nazywanego bifaliną, o sekwencji podanej na rycinie 1, która może być stosowana w syntezie na dużą skalę, szczególnie w procesie syntezy peptydu z przeznaczeniem do stosowania jako lek.

Bifalina stanowi peptyd dimeryczny, w którym dwa identyczne czteropeptydowe fragmenty są połączone mostkiem diacylohydrazydowym, jak to pokazano na rycinie 1. Synteza peptydu opioidowego bifaliny została po raz pierwszy opisana i opatentowana w roku 1981 przez Andrzeja W. Lipkowskiego w patencie polskim nr 131 730 p.t. „Sposób wytwarzania nowych peptydów o aktywności morfinopodobnej”, a następnie opublikowana przez A. W. Lipkowskiego, A.M. Konecką, I. Sroczyńską w artykule pt;. Double-enkephalins - synthesis, activity on guinea pig ileum and analgesic effect, w roku 1982, w piśmie Peptides, tom 3, na stronach 697-700. Zasadniczymi etapami otrzymywania peptydu bifaliny jest sposób wytworzenia diacylohydrazydu oraz metoda ochrony grup aminowych w trakcie syntezy gwarantujących jednoznaczność syntezy. Opisywana synteza zakładała syntezę peptydu w wyniku kondensacji N-chronionego tripeptydu z N,N-hydrazydem difenyloalanin. N-chroniony tripeptyd otrzymuje się w wieloetapowej syntezie kolejnego dołączania N-blokowanych aminokwasów do estru alkilowego glicyny. Synteza wymaga stosowania drogich substratów oraz żmudnych procesów oczyszczania produktów przejściowych z wykorzystaniem technik chromatografii kolumnowej lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej. W opisanej pierwszej metodzie syntezy diacylohydrazyd otrzymuje się w dwuetapowym etapie syntezy otrzymywania metodą estrów aktywnych hydrazydu N-benzyloksykarbonylofenyloananiny, a następnie acylowania hydrazydu drugą cząsteczką N-benzyloksykarbonylofenyloalaniny. Grupę benzyloksykarbonylową ochraniającą grupy aminowe fenyloalaniny usuwa się działaniem bromowodoru w kwasie octowym. Modyfikację syntezy diacylohydrazydu w jednym etapie acylowania opisali G. Li, W. Haq, L. Xiang, B.S. Lou, R. Hughes, I.A. de Leon, P. Davis, T. J. Gillespie, M. Romanowski, X. Zhu, A. Misicka, A.W. Lipkowski, F. Porreca, T.P. Davis, H.I. Yamamura, D. F. O'Brien i V. J. Hruby w artykule p.t. „Modifications of the 4,4'-residues and SAR studies of biphalin, a highly potent opioid receptor active peptide” w roku 1998, w piśmie naukowym Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, tom 6, na stronach 555-560. Diacylohydrazyd otrzymywano w wyniku działania dwóch równoważników t-butyloksykarbonylofenyloalaniny na 1 równoważnik hydrazyny przy zastosowaniu jako czynnik sprzęgający drogiego i nietrwałego odczynnika heksafluorofosforan O-benzatriol-1-yl-1,1,3,3-tetrametylouroniowy, o skrócie handlowym BOP, w obecności diizopropyloetyloaminy. Ochrona grup aminowych była usuwana działaniem 4 M chlorowodoru w kwasie octowym. Obydwie opisane metody były użyteczne w małej skali laboratoryjnej. Duże koszty oraz przewidywane kłopoty techniczne ograniczają możliwość zastosowania opisanych metod w skali większej, wymaganej przy produkcji bifaliny do stosowania jako lek.

W trakcie badania wariantów syntezy bifaliny, niespodziewanie okazało się, że N,N'-hydrazyd dibutyloksykarbonylofenyloalaniny można otrzymać w wyniku modyfikacji, bardzo korzystnego ekonomicznie, procesu aktywacji grupy kwasowej pochodnych fenyloalaniny działaniem dicykloheksylokarbodiimidu lub diizopropylokarbodiimidu w obecności lub bez N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego (HOSu), których powstające aktywne formy skutecznie acylują obydwa azoty hydrazyny. Jednocześnie, nieoczekiwanie okazało się, że odblokowywanie grupy ochronnej butyloksykarbonylowej, na wszystkich etapach syntezy bifaliny można prowadzić w roztworach rozpuszczalników organicznych ze stężonym kwasem solnym, co znacznie obniża koszty reakcji prowadzenia reakcji.

Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania peptydu opioidowego o zwyczajowej nazwie bifalina i wzorze przedstawionym na ryc. 1, znamienny tym, że otrzymuje się związek przejściowy stanowiący N,N'-hydrazyd ditertbutyloksykarbonylofenyloalaniny, który po uprzednim usunięciu grup ditertbutyloksykarbonylowych, poddaje się reakcji kondensacji z t-butyloksykarbonylotyrozylo-D-alanyloglicyną, przy czym związek przejściowy stanowiący N,N'-hydrazyd ditertbutyloksykarbonylofenyloalaniny otrzymuje się:

- przez otrzymanie aktywnego estru N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego butyloksykarbonylofenyloalaniny w wyniku działania dicykloheksylokarbodiimidu i N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego w obecności aminy trzeciorzędowej na t-butylokarboksylofenyloalaninę i następnie acylowanie obydwu azotów hydrazyny przez aktywny ester N-chronionej fenyloalaniny, albo

- przez otrzymanie aktywnego estru N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego butyloksykarbonylo-fenyloalaniny w wyniku działania diizopropylokarbodiimidu i N-hydroksyimidu kwasu bursztynowePL 212 342 B1 go, w obecności aminy trzeciorzędowej i następnie acylowanie obydwu azotów hydrazyny przez aktywny ester N-chronionej fenyloalaniny, albo

- przez działanie dicykloheksylokarbodiimidu na mieszaninę hydrazyny oraz t-butylokarboksylofenyloalaninę w obecności trzeciorzędowej aminy, albo

- przez działanie diizopropylokarbodiimidu na mieszaninę t-butyloksykarbonylofenyloalaniny i hydrazyny w obecności aminy trzeciorzędowej. Powyższy sposób jest znamienny tym, że usunięcie grup ochronnych t-butyloksykarbonylowych pochodnych aminokwasów lub peptydów przeprowadza się działaniem roztworu stężonego kwasu solnego w rozpuszczalniku organicznym etanolu lub metanolu lub n-butanolu lub izopropanolu lub octanie metylu lub octanie etylu lub kwasie octowym lub N,N-dimetyloformamidzie.

Rycina 1 przedstawia wzór chemiczny peptydu opioidowego bifalina.

Dla lepszego zilustrowania przedmiotowego wynalazku polegającego na modyfikacji procesów syntezy bifaliny przedstawiono przykładowe warianty syntezy w przykładach. Nie należy jednak ograniczać zakresu wynalazku jedynie do treści poniższych przykładów.

P r z y k ł a d I.

t-Butyloksykarbonylofenyloalaninę (Boc-Phe, 20 mmoli) i N-hydroksyimid kwasu bursztynowego (HOSu 30 mmoli) rozpuszczono w 50 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) i dodano 30 mmoli diizopropyloetyloaminy (DIPEA), a następnie oziębiono do temperatury w przedziale 0-7°C. Do oziębionego, mieszanego roztworu dodano dicykloheksylokarbodiimid (DCC, 20 mmoli). Po 0,5 godziny rozwór doprowadzono do temperatury pokojowej, w zakresie 18-22°C i w tej temperaturze mieszano przez 0,5 godz. Wytrącony osad dicykloheksylomocznika (DCU) odsączono i przemyto DMF (2x10 ml). Do przesączu wkroplono hydrat hydrazyny w ilości 10 mmoli. Mieszano rozwór przez okres w zakresie 4-12 godzin. Do roztworu dodano 300 ml 0,1 molowego roztworu kwasu cytrynowego. Wytrącony osad związku przejściowego [(Boc-Phe-NH-)2] odsączono, przemyto kolejno 100 ml wody, 300 ml 0,1 molowego roztworu kwaśnego węglanu potasu (KHCO3), 150 ml KHCO3 oraz dwukrotnie 100 ml wody. Następnie osad zawieszono w 75 ml kwasu octowego i mieszając dodano 75 ml stężonego kwasu solnego. Po około 30 min kwas octowy i solny odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostały osad przemyto octanem etylu i wysuszono. Otrzymano związek przejściowy stanowiący dichlorowodorek N,N'-hydrazydu difenyloalaniny z wydajnością w zakresie 90-98%. Związek ten można stosować w dalszych etapach reakcji bez dodatkowego oczyszczania lub też można oczyścić przez rozpuszczenie w metanolu i wytrącenie octanem etylu i następnie odsączenie.

Następnie dichlorowodorek N,N'-hydrazydu difenyloalaniny (10 mmoli) rozpuszczono w 50 ml DMF i dodano 20 mmoli diizopropyloetyloaminy (DIPEA) i t-butyloksykarbonylotyrozylo-D-alanylo-glicyny, 20 mmoli. Mieszaninę reakcyjną oziębiono do temperatury w zakresie 0-5°C. Do oziębionego roztworu dodano 20 mmoli DCC. Po godzinie mieszania w temperaturze 0-5°C, mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury w zakresie 18-22°C i mieszano minimum 2 godzin. Wytrącony osad DCU odsączono i przemyto dwukrotnie 20 ml DMF. Do przesączu dodano 200 ml 5% kwasu cytrynowego. Wytrącony osad odsączono i przemyto dwukrotnie 20 ml wody. Osad zawieszono w 20 ml kwasu octowego i dodano 20 ml stężonego kwasu solnego. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 min w temperaturze w zakresie od 20 do 50°C. Następnie kwas octowy i kwas solny odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość krystalizowano przez rozpuszczenie w etanolu i wytrącenie produktu octanem etylu. Osad odsączono i przemyto octanem etylu i wysuszono. Otrzymano produkt stanowiący dichlorowodorek N,N'-di(tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalaniny), z wydajnością całkowitą w zakresie od 80 do 92% o właściwościach analitycznych potwierdzających otrzymanie właściwego produktu o czystości około 95%. Dalsze oczyszczanie produktu przeprowadza się metodą chromatografii wysokosprawnej HPLC w układzie gradientowym (A) metanol, (B) 0,05% HCl w zakresie od 10% do 40% fazy A. Wydzielone odpowiednie frakcje odparowano, otrzymując produkt o czystości przekraczającej 99,5%.

P r z y k ł a d II.

t-Butyloksykarbonylofenyloalaninę (Boc-Phe, 20 mmoli) i N-hydroksyimid kwasu bursztynowego (HOSu 30 mmoli) rozpuszczono w 50 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) i oziębiono do temperatury w przedziale 0-7°C. Do oziębionego, mieszanego roztworu dodano diizopropylokarbodiimid (DIC, 20 mmoli). Po 0,5 godziny rozwór doprowadzono do temperatury pokojowej, w zakresie 18-22°C i w tej temperaturze mieszano przez 0,5 godz., a następnie wkroplono hydrat hydrazyny w ilości 10 mmoli. Mieszano rozwór przez okres w zakresie 4-12 godzin. Do roztworu dodano 300 ml octanu etylu zawierającego 10% eteru etylowego. Wytrącony osad związku przejściowego [(Boc-Phe-NH-)2]

PL 212 342 B1 odsączono. Osad przemyto dwukrotnie 15 ml octanu etylu. Następnie osad zawieszono w 75 ml kwasu octowego i mieszając dodano 75 ml stężonego kwasu octowego. Po około 30 min kwas octowy i solny odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostały osad przemyto octanem etylu i wysuszono. Otrzymano związek przejściowy stanowiący dichlorowodorek N,N'-hydrazydu difenyloalaniny z wydajnością w zakresie 90-98%. Związek ten można stosować w dalszych etapach reakcji bez dodatkowego oczyszczania lub też można oczyścić przez rozpuszczenie w metanolu i wytrącenie octanem etylu i następnie odsączenie.

Następnie dichlorowodorek N,N'-hydrazydu difenyloalaniny (10 mmoli) rozpuszczono w 50 ml DMF i dodano 20 mmoli diisopropyloetyloaminy (DIPEA) i t-butyloksykarbonylotyrozylo-D-alanylo-glicyny, 20 mmoli. Mieszaninę reakcyjną oziębiono do temperatury w zakresie 0-5°C. Do oziębionego roztworu dodano 20 mmoli DCC. Po godzinie mieszania w temperaturze 0-5°C, mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury w zakresie 18-22°C i mieszano minimum 2 godzin. Wytrącony osad DCU odsączono i przemyto dwukrotnie 20 ml DMF. Do przesączu dodano 200 ml 5% kwasu cytrynowego. Wytrącony osad odsączono i przemyto dwukrotnie 20 ml wody. Osad zawieszono w 20 ml kwasu octowego i dodano 20 ml stężonego kwasu solnego. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 min, w temperaturze w zakresie od 20 do 50°C. Następnie kwas octowy i kwas solny odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość krystalizowano przez rozpuszczenie w etanolu i wytrącenie produktu octanem etylu. Osad odsączono i przemyto octanem etylu i wysuszono. Otrzymano produkt stanowiący dichlorowodorek N,N'-di(tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalaniny), z wydajnością całkowitą w zakresie od 80 do 85% o właściwościach analitycznych potwierdzających otrzymanie właściwego produktu o czystości około 95%. Dalsze oczyszczanie produktu przeprowadza się metodą chromatografii wysokosprawnej HPLC w układzie gradientowym (A) metanol, (B) 0,05% HCl w zakresie od 10% do 40% fazy A. Wydzielone odpowiednie frakcje odparowano, otrzymując produkt o czystości przekradającej 99,5%.

P r z y k ł a d III t-Butyloksykarbonylofenyloalaninę (Boc-Phe, 20 mmoli) i N-hydroksybenzotriazol (HOBt 30 mmoli) rozpuszczono w 50 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) i oziębiono do temperatury w przedziale 0-7°C. Do oziębionego, mieszanego roztworu dodano diizopropylokarbodiimid (DIC, 20 mmoli). Po 0,5 godziny rozwór doprowadzono do temperatury pokojowej, w zakresie 18-22°C i w tej temperaturze mieszano przez 0,5 godz., a następnie wkroplono hydrat hydrazyny w ilości 10 mmoli. Mieszano rozwór przez okres w zakresie 4-12 godzin. Do roztworu dodano 300 ml octanu etylu zawierającego 10% eteru etylowego. Wytrącony osad związku przejściowego [(Boc-Phe-NH-)2] odsączono. Osad przemyto dwukrotnie 15 ml octanu etylu. Następnie osad zawieszono w 75 ml kwasu octowego i mieszając dodano 75 ml stężonego kwasu solnego. Po około 30 min kwas octowy i solny odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostały osad przemyto octanem etylu i wysuszono. Otrzymano związek przejściowy stanowiący dichlorowodorek N,N'-hydrazydu difenyloalaniny z wydajnością w zakresie 90-98%. Związek ten można stosować w dalszych etapach reakcji bez dodatkowego oczyszczania lub też można oczyścić przez rozpuszczenie w metanolu i wytrącenie octanem etylu i następnie odsączenie.

Następnie dichlorowodorek N,N'-hydrazydu difenyloalaniny (10 mmoli) rozpuszczono w 50 ml DMF i dodano 20 mmoli dizopropyloetyloaminy (DIPEA) i t-butyloksykarbonylotyrozylo-D-alanylo-glicyny, 20 mmoli. Mieszaninę reakcyjną oziębiono do temperatury w zakresie 0-5°C. Do oziębionego roztworu dodano 20 mmoli DIC. Po godzinie mieszania w temperaturze 0-5°C, mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury w zakresie 18-22°C i mieszano minimum 2 godzin. Do przesączu dodano 150 ml octanu etylu zawierającego 10% eteru etylowego. Wytrącony osad odsączono i przemyto dwukrotnie 20 ml octanem etylu. Osad zawieszono w 20 ml kwasu octowego i dodano 20 ml stężonego kwasu solnego. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 min w temperaturze w zakresie od 20 do 50°C. Następnie kwas octowy i kwas solny odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość krystalizowano przez rozpuszczenie w etanolu i wytrącenie produktu octanem etylu. Osad odsączono i przemyto octanem etylu i wysuszono. Otrzymano produkt stanowiący dichlorowodorek N,N'-di(tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalaniny), z wydajnością całkowitą w zakresie od 85 do 95% o właściwościach analitycznych potwierdzających otrzymanie właściwego produktu o czystości około 96%. Dalsze oczyszczanie produktu przeprowadza się metodą chromatografii wysokosprawnej HPLC w układzie gradientowym (A) etanol, (B) 0,05% HCl w zakresie od 10% do 40% fazy A. Wydzielone odpowiednie frakcje odparowano, otrzymując produkt o czystości przekraczającej 99,5%.

PL 212 342 B1

P r z y k ł a d IV t-Butyloksykarbonylofenyloalaninę (Boc-Phe, 20 mmoli) rozpuszczono w 50 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) i dodano 20 mmoli diizopropyloetyloaminy (DIPEA) i 10 mmoli wodzianu hydrazyny (ΝΗ₂ΝΗ₂·Η₂Ο), a następnie oziębiono do temperatury w przedziale 0-7°C. Do oziębionego, mieszanego roztworu dodano dicykloheksylokarbodiimid (DCC, 20 mmoli). Reakcję prowadzono przez 0,5 godziny w temperaturze 0-7°C, a następnie przez 2 godziny w temperaturze 20-25°C. Wytrącony osad dicykloheksylomocznika (DCU) odsączono i przemyto czterokrotnie 20 ml octanu etylu. Połączone przesącze przemywano kolejno, dwukrotnie 100 ml 0,1 molowym roztworem wodnym kwasu cytrynowego, dwukrotnie 50 ml wody, dwukrotnie 100 ml 0,1 molowym roztworem węglanu sodu (Na2CO3) i 50 ml wody. Po odparowaniu octanu etylu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano surowy związek przejściowy (Boc-Phe-NH-)2, który następnie przetwarzano według sposobu opisanego w przykładzie I. Otrzymano produkt końcowy z wydajnością 73% o czystości przekraczającej 99,5%.

Claims (2)

1. Sposób otrzymywania peptydu opioidowego o zwyczajowej nazwie bifalina i wzorze przedstawionym na ryc. 1, znamienny tym, że otrzymuje się związek przejściowy stanowiący N,N'-hydrazyd ditertbutyloksykarbonylofenyloalaniny, który po uprzednim usunięciu grup ditertbutyloksykarbonylowych, poddaje się reakcji kondensacji z t-butyloksykarbonylotyrozylo-D-alanylo-glicyną,

- przy czym związek przejściowy stanowiący N,N'-hydrazyd ditertbutyloksykarbonylofenyloalaniny otrzymuje się:

- przez otrzymanie aktywnego estru N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego butyloksykarbonylo-fenyloalaniny w wyniku działania dicykloheksylokarbodiimidu i N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego w obecności aminy trzeciorzędowej na t-butylokarboksylofenyloalaninę i następnie acylowanie obydwu azotów hydrazyny przez aktywny ester N-chronionej fenyloalaniny, albo

- przez otrzymanie aktywnego estru N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego butyloksykarbonylo-fenyloalaniny w wyniku działania diizopropylokarbodiimidu i N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego, w obecności aminy trzeciorzędowej i następnie acylowanie obydwu azotów hydrazyny przez aktywny ester N-chronionej fenyloalaniny, albo

- przez działanie dicykloheksylokarbodiimidu na mieszaninę hydrazyny oraz t-butylokarboksylofenyloalaninę w obecności trzeciorzędowej aminy, albo

- przez działanie diizopropylokarbodiimidu na mieszaninę t-butyloksykarbonylofenyloalaniny i hydrazyny w obecności aminy trzeciorzędowej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że usunięcie grup ochronnych t-butyloksykarbonylowych pochodnych aminokwasów lub peptydów przeprowadza się działaniem roztworu stężonego kwasu solnego w rozpuszczalniku organicznym etanolu lub metanolu lub n-butanolu lub izopropanolu lub octanie metylu lub octanie etylu lub kwasie octowym lub N,N-dimetyloformamidzie.