[go: up one dir, main page]

PL212113B1 - Wariant polipeptydu, kompozycja zawierająca wariant tego polipeptydu, sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, sposób obróbki materiału roślinnego, sekwencja nukleotydowa, konstrukt zawierający tą sekwencję nukleotydową i zastosowania wariantu polipeptydu - Google Patents

Wariant polipeptydu, kompozycja zawierająca wariant tego polipeptydu, sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, sposób obróbki materiału roślinnego, sekwencja nukleotydowa, konstrukt zawierający tą sekwencję nukleotydową i zastosowania wariantu polipeptydu

Info

Publication number
PL212113B1
PL212113B1 PL362558A PL36255801A PL212113B1 PL 212113 B1 PL212113 B1 PL 212113B1 PL 362558 A PL362558 A PL 362558A PL 36255801 A PL36255801 A PL 36255801A PL 212113 B1 PL212113 B1 PL 212113B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
xylanase
polypeptide
inhibitor
gly
variant
Prior art date
Application number
PL362558A
Other languages
English (en)
Other versions
PL362558A1 (pl
Inventor
Ole Sibbesen
Jens Frisbaek Sorensen
Original Assignee
Danisco
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0005585A external-priority patent/GB0005585D0/en
Priority claimed from GB0015751A external-priority patent/GB0015751D0/en
Application filed by Danisco filed Critical Danisco
Publication of PL362558A1 publication Critical patent/PL362558A1/pl
Publication of PL212113B1 publication Critical patent/PL212113B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest wariant polipeptydu, kompozycja zawierająca wariant tego polipeptydu, sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, sposób obróbki materiału roślinnego, sekwencja nukleotydowa, konstrukt zawierający tą sekwencję nukleotydową i zastosowania wariantu polipeptydu.
Wariant polipeptydu ma aktywność enzymów ksylanazy o zmienionej wrażliwości na inhibitory ksylanazy.
Tło wynalazku
Przez wiele lat, endo-β-1,4-ksylanazy (EC 3.2.1.8) (przytaczane w niniejszym opisie jako ksylanazy) stosowano do modyfikacji węglowodanów złożonych pochodzących ze ściany komórkowej materiału roślinnego. Dobrze wiadomo w stanie techniki, że funkcjonalność różnych ksylanaz (pochodzących od różnych drobnoustrojów lub roślin) jest bardzo różna.
Przeprowadzono szerokie badania charakteryzujące funkcjonalność kasylanaz, na dobrze scharakteryzowanych i czystych substratach (Kormelink i inni, 1992). Badania te ukazują, że różne ksylanazy mają różne specyficzne wymagania odnośnie podstawienia szkieletu ksylozowego arabinoksylanu (AX). Niektóre ksylanazy wymagają trzech niepodstawionych reszt ksylozowych do hydrolizowania szkieletu ksylozowego; inne wymagają tylko jednej lub dwóch. Jako powód tych różnic specyficzności, uważa się trójwymiarową strukturę ksylanazy, czyli sekwencję aminokwasową. Jednak przełożenie tych różnic w sekwencji aminokwasowej na różnice funkcjonalności ksylanaz, gdy ksylanaza działa w złożonym środowisku takim jak materiał roślinny nie została udokumentowana aż do dzisiaj.
Substraty ksylanazy znajdujące się w pszenicy (mące pszennej), tradycyjnie dzieli się dwie frakcje: AX nie możliwą do ekstrakcji wodą (WU-AX) oraz AX możliwą do ekstrakcji wodą (WE-AX). Stosunek WU-AX:WE-AX w mące pszennej wynosi w przybliżeniu 70:30. Istnieją liczne wytłumaczenia, dlaczego istnieją dwie różne frakcje AX. Starsza literatura (D'Appolonia i MacArthur (1976) oraz Montgomery i Smith (1955)) opisuje całkiem duże różnice stopnia podstawienia między WE-AX i WU-AX. Najwyższy stopień podstawienia znaleziono w WE-ΑΧ. Wykorzystano go przy tłumaczeniu, dlaczego niektóre z AX są możliwe do ekstrakcji. Wysoki stopień podstawienia czyni polimer rozpuszczalnym w porównaniu z niższym stopniem podstawienia, który powodowałby wytworzenie wiązania wodorowego między polimerami i w konsekwencji wytrącenie.
Uważa się, że różnica między funkcjonalnością różnych ksylanaz jest spowodowana różnicami specyficzności ksylanazy, a przez to ich preferencji wobec substratów WU- AX lub WE-AX.
W pewnych zastosowaniach (np. piekarnictwie) pożądane jest wytwarzanie rozpuszczalnych polimerów o wysokim ciężarze cząsteczkowym (HMW) z frakcji WU-AX. Takie polimery koreluje się ze zwiększaniem objętości przy robieniu chleba (Rouau, 1993; Rouau i inni, 1994 i Courtin i inni, 1999).
W innych zastosowaniach, pożądana jest modyfikacja WU-AX HMW, obniżając ciężar cząsteczkowy, redukując efekt hydrokoloidowy i skutkiem tego wiązanie wody w produkcie (suchary, oddzielanie mąki, itd.).
Te różne zastosowania wymagają różnej funkcjonalności ksylanaz stosowanych w pracy. Jak wymieniono powyżej, różnicę funkcjonalności tłumaczy się przez różną specyficzność substratowe ksylanaz.
Streszczenie wynalazku
Przeciwnie do wcześniejszych badań, wykazaliśmy obecnie, że przy określaniu funkcjonalności ksylanazy istotne są czynniki inne niż specyficzność substratowa ksylanaz określona na czystych, dobrze scharakteryzowanych substratach. Dane przedstawione w niniejszym opisie ukazują, że endogeniczne inhibitory ksylanazy narzucają funkcjonalność ksylanaz aktualnie stosowanych np. w układach mąki pszennej. Oznacza to, że ksylanaza, która normalnie modyfikuje WU-AX dając zwiększoną lepkość płynnego ciasta w układzie mąki pszennej, ma inną funkcjonalność jeśli brak jest endogenicznego inhibitora ksylanazy w mące pszennej. Tak więc, spostrzeżenia te wskazują, że plan i zastosowanie nieinhibitowanych ksylanaz, np. przy użyciu miejscowo skierowanej mutagenezy, mogłoby być sposobem do naśladowania braku inhibitorów ksylanazy w różnych materiałach roślinnych, dając nowym ksylanazom całkowicie nową funkcjonalność. Takie ksylanazy byłyby bardzo skuteczne w zastosowaniach, w których konieczne jest zmniejszenie lepkości. Nieinhibitowane ksylanazy działałyby szybko na AX i podlegały w pierwszym rzędzie raczej wpływowi swej specyficznej aktywności, niż endogenicznym inhibitorom. Z naszych badań wynika, że wpływ inhibitorowy jest prawdopodobnie
PL 212 113 B1 daleko bardziej istotny niż specyficzna aktywność. W rzeczywistości, niniejsze wyniki pokazują po raz pierwszy, że istnieje 10-50-krotna różnica poziomu inhibicji wśród ksylanaz rodziny 11.
Ponadto, zaplanowano i przetestowano szereg ksylanaz modyfikowanych przez miejscowo skierowaną mutagenezę, aby wykazać, że mogą być wytwarzane ksylanazy, które posiadają zmniejszoną wrażliwość wobec inhibitorów ksylanazy obecnych w materiale roślinnym. W szczególności, zidentyfikowano liczne reszty w ksylanazach rodziny 11, które wpływają na stopień inhibicji ksylanazy.
Tak więc będzie możliwe wytworzenie wariantów ksylanaz mających zmniejszoną wrażliwość wobec inhibitorów ksylanazowych, a przez to zmienioną funkcjonalność. Pozwoli to np. na zmniejszenie ilości ksylanazy koniecznej w wielu zastosowaniach, takich jak pasze zwierzęce, produkcja skrobi, piekarnictwo, oddzielanie mąki (mielenie na mokro) oraz wytwarzanie papieru i miazgi.
W związku z tym, niniejszy wynalazek opisuje wariant polipeptydu ksylanazy lub jego fragment, mający aktywność ksylanazy, obejmujący jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych takich, że polipeptyd lub jego fragment ma zmienioną wrażliwość wobec inhibitora ksylanazy, w porównaniu z enzymem pierwotnym.
Przedmiotem wynalazku jest wariant polipeptydu lub jego fragment posiadający aktywność ksylanazy zawierający mutację wybraną spośród: D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D i D11F/G34D w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1, lub równoważnej(ych) pozycji(ach) w innych ksylanazach rodziny 11 tak, że wariant polipeptydu lub jego fragmentu ma zredukowaną wrażliwość na inhibitor ksylanazy w porównaniu z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej ukazanej jako SEQ ID Nr 1.
W korzystnym wykonaniu polipeptydu według wynalazku zawiera on mutację D11F.
W bardziej korzystnym rozwiązaniu wariant polipeptydu zawiera mutację D11F/R122D.
Według wynalazku, korzystnie wspomnianym inhibitorem jest inhibitor naturalnie znajdujący się w tkankach roślinnych.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja, charakteryzująca się tym, że zawiera wariant polipeptydu zdefiniowanego powyżej.
Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, polegający na tym, że kontaktuje się wspomnianą roślinną ścianę komórkową z polipeptydem zdefiniowanym powyżej lub z kompozycją według wynalazku zawierająca ten polipeptyd.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób obróbki materiału roślinnego, polegający na tym, że kontaktuje się ten materiał roślinny z polipeptydem według wynalazku zdefiniowanym powyżej lub z kompozycją według wynalazku zawierająca ten polipeptyd.
Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja nukleotydowa, charakteryzująca się tym, że koduje wariant polipeptydu według wynalazku jak zdefiniowano powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest także konstrukt, który zawiera sekwencję nukleotydową zdefiniowaną powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie wariantu polipeptydu według wynalazku zdefiniowanego powyżej w sposobie modyfikowania materiału roślinnego.
Następnie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wariantu polipeptydu według wynalazku zdefiniowanego powyżej w jednym lub więcej spośród: pieczenia, pasz dla zwierząt, wytwarzania skrobi, oddzielania mąki (mielenie na mokro) oraz wytwarzania papieru i miazgi drzewnej.
Wynalazek dotyczy również zastosowania wariantu polipeptydu zdefiniowanego powyżej w jednym lub więcej spośród: obróbki zbóż, w obróbce drewna i we wzmacnianiu procesu bielenia miazgi drzewnej.
Tutaj, „enzym macierzysty” oznacza enzym ksylanazę, z którego otrzymuje się lub można otrzymać wariant enzymu ksylanazy. Jeśli chodzi o określenie „dający się otrzymać”, wariant nie koniecznie pochodzi od enzymu pierwotnego. Zamiast tego, wariant można otrzymać np. przez stosowanie technik rekombinacji DNA, które wykorzystują sekwencję (sekwencje) nukleotydową kodującą wymieniony wariant sekwencji ksylanazy, czyli tutaj sekwencja (sekwencje) nukleotydowa jest podobna do zmutowanej (zmutowanych) sekwencji nukleotydowej, lecz nie są one wytworzone przez mutację macierzystej sekwencji nukleotydowej (nukleotydowych). Wariant można nawet wytworzyć przez chemiczną modyfikację enzymu macierzystego.
Dla pewnych postaci realizacji, enzymem macierzystym jest enzym dzikiego typu. Określenie „dzikiego typu” jest terminem technicznym rozumianym przez fachowców i obejmuje fenotyp, który jest charakterystyczny dla większości członków rodzajów występujących naturalnie i kontrastujących fenotypem mutanta. Tak więc, w niniejszym kontekście, enzym typu dzikiego może oznaczać postać
PL 212 113 B1 enzymu naturalnie występującego w większości istotnych rodzajów. Generalnie, istotny enzym dzikiego typu w stosunku do wariantów polipeptydów według wynalazku, oznacza najściślej spokrewniony odpowiadający enzym dzikiego typu, w kategoriach homologii sekwencji. Przykładowo, dla poszczególnych zmutowanych ksylanaz opisanych w przykładach, odpowiadającą ksylanazą A dzikiego typu B.subtilis, konkretniej dzikiego typu ksylanazą A B.subtilis opisaną przez Paice i innych, 1986 i pokazaną jako SEQ ID 1. Jednakże, jeśli poszczególną sekwencję dzikiego typu użyto jako podstawę do wytworzenia wariantu polipeptydu według wynalazku, będzie to odpowiadająca sekwencja dzikiego typu, bez względu na istnienie innej sekwencji dzikiego typu, która jest ściślej spokrewniona w kategoriach homologii sekwencji aminokwasowej.
Dla pewnych postaci realizacji, wariant polipeptydu korzystnie pochodzi od ksylanazy z rodziny 11.
Jednym z naszych zaskakujących spostrzeżeń jest to, że jak dotąd w naszych badaniach, mutacja w miejscu aktywnym ksylanazy nie ma mierzalnego wpływu na inhibicję przeciwko inhibitorowi ksylanazy. Jest to bezpośrednie przeciwieństwo w stosunku do mutacji, które są wykonywane poza miejscem aktywnym - które to mutacje są omówione poniżej bardziej szczegółowo.
W zalecanym aspekcie, modyfikacją aminokwasową jest modyfikacja jednej lub więcej powierzchniowych reszt aminokwasowych.
W bardziej zalecanym aspekcie, modyfikacją aminokwasową jest modyfikacja jednej lub więcej reszt dostępnych dla rozpuszczalnika. Tutaj, rozpuszczalnikiem jest woda.
W bardziej zalecanym aspekcie, modyfikacją aminokwasową jest modyfikacja jednej lub więcej reszt powierzchniowych poza miejscem aktywnym.
W bardzo zalecanym aspekcie, modyfikacją aminokwasową jest modyfikacja jednej lub więcej reszt powierzchniowych poza miejscem aktywnym i która jest/są dostępne dla rozpuszczalnika co najmniej w 8%. Tutaj, rozpuszczalnikiem jest woda.
W bardzo zalecanym aspekcie, modyfikacją aminokwasową jest modyfikacja jednej lub więcej reszt powierzchniowych poza miejscem aktywnym i która jest/są dostępne dla rozpuszczalnika co najmniej w 10%. Tutaj, rozpuszczalnikiem jest woda.
Dostępność dla rozpuszczalnika można określić przy użyciu Swiss-Pdb Viewer (wersja 3,5b1), którą można zlokalizować przez internet na stronie http:///www.expasy.ch/spdbv/mainpage.html. Swiss-Pdb Viewer jest prezentowana przez Glaxo Wellcome Experimental Research.
Aminokwasy powierzchniowe enzymów ksylanazowych może określać fachowiec.
Przykładowo, sekwencja aminokwasowa ksylanazy A B.subtilis, jest pokazana jako SEQ ID/nr 1. Pod względem tej sekwencji, reszty aminokwasów powierzchniowych to:
Ala1-Trp6, Asn8, Thr10-Gly23, Asn25, Ser27, Asn29, Ser31-Asn32, Gly34, Thr43-Thr44, Ser46-Thr50, Asn52, Asn54, Gly56-Asn61, Asn63, Arg73-Leu76, Thr87-Arg89, Thr91-Lys95, Thr97, Lys99, Asp101-Gly102, Thr104, Thr109-Thr111, Tyr113-Asn114, Asp119-Thr124, Thr126,
Gln133-Asn141, Thr143, Thr145, Thr147-Asn148, Asn151, Lys154-Gly157, Asn159-Leu160, Ser162-Trp164, Gln175, Ser177, Ser179, Asn181, Thr183, Trp185.
Jak zaznaczono, aminokwasy powierzchniowe enzymów ksylanazowych (takich jak ksylanaza A Thermomyces lanuginosus, którego kodująca sekwencja nukleotydowa jest przedstawiona jako SEQ ID nr 9) są możliwe do określenia przez fachowca.
Skutkiem tego, dla pewnych aspektów, niniejszy opis obejmuje wariant polipeptydu ksylanazy lub jego fragment mający aktywność ksylanazy, który to wariant polipeptydu ksylanazy lub fragment obejmuje jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych w którejkolwiek z reszt aminokwasowych:
Ala1-Trp6, Asn8, Thr10-Gly23, Asn25, Ser27, Asn29, Ser31-Asn32, Gly34, Thr43-Thr44, Ser46-Thr50, Asn52, Asn54, Gly56-Asn61, Asn63, Arg73-Leu76, Thr87-Arg89, Thr91-Lys95, Thr97, Lys99, Asp101-Gly102, Thr104, Thr109-Thr111, Tyr113-Asn114, Asp119-Thr124, Thr126,
Gln133-Asn141, Thr143, Thr145, Thr147-Asn148, Asn151, Lys154-Gly157, Asn159-Leu160, Ser162-Trp164, Gln175, Ser177, Ser179, Asn181, Thr183, Trp185 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej/ich równoważnych pozycji w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.
Tak więc w jednej postaci realizacji, niniejszy opis omawia wariant polipeptydu ksylanazy lub jego fragment mający aktywność ksylanazową, obejmujący jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych przy którejkolwiek reszcie aminokwasowej numer:
PL 212 113 B1
11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 32, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 i 175 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych pozycji w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.
W jednej postaci realizacji, niniejszy opis omawia wariant polipeptydu ksylanazy lub jego fragment mających aktywność ksylanazową, obejmujący jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych przy którejkolwiek reszcie aminokwasowej numer 11, 12 i 13 sekwencji aminokwasowej B. subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych pozycji w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.
Konkretne zalecane przykłady wykonywanych modyfikacji są przedstawione w niniejszym, w sekwencji przykładów.
Dla pewnych postaci realizacji, korzystnie wariant polipeptyd ksylanazowego lub jego fragment mający aktywność ksylanazy, obejmuje jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych przy jakiejkolwiek reszcie aminokwasowej numer: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 61, 62, 63, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 173, 174, 175, 176, 177, 178 sekwencji aminokwasowej B. subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej pozycjach równoważnych w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.
Dla wygody, czasami przytaczamy reszty aminokwasowe numer: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 61, 62, 63, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 173, 174, 175, 176, 177, 178 jako „prążek 1.
Fig. 1 ukazuje strukturę 3-D ksylanazy B.subtilis, mającą sekwencję aminokwasową pokazaną jako SEQ ID nr 1. Prążek 1 jest opisany w fig. 1 jako górna warstwa cząsteczki i rozciąga się około 13 angstremów od góry cząsteczki, gdy cząsteczka jest zorientowana jak ukazano w fig. 1. Prążek 1 kończy się na reszcie Phe125 po lewej stronie patrząc na fig. 1 i na reszcie Asn61 po prawej stronie oglądając fig. 1.
Poza tym, albo alternatywnie dla pewnych postaci realizacji, korzystnie wariant polipeptydu ksylanazowego lub jego fragment mający aktywność ksylanazy, obejmuje jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych przy którejkolwiek innej reszcie aminokwasowej.
Korzystnie wymienione inne modyfikacje mogą występować przy którejkolwiek jednej lub więcej reszt aminokwasowych numer: 3, 4, 5, 6, 7, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 108, 109, 110, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 , 168, 169, 170, 171, 172, 179, 180, 181, 182, 183 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1, lub jej równoważnych pozycjach w innych homologicznych polipeptydach ksylanazy.
Dla wygody, czasem przytaczamy reszty aminokwasowe numer: 3, 4, 5, 6, 7, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 108, 109, 110, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 179, 180, 181, 182, 183 sekwencji aminokwasowej B.subtilis jako „prążek 2.
Korzystnie, wymienione inne modyfikacje mogą wystąpić przy którejkolwiek jednej lub więcej powierzchniowych reszt aminokwasowych numer: 3, 4, 5, 6, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 43, 44, 56, 57, 58, 59, 60, 73, 74, 75, 76, 87, 91, 92, 93, 94, 109, 110, 126, 159, 160, 162, 163, 164, 179, 181, 183 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych pozycjach w innych homologicznych polipeptydach ksylanazy.
Korzystnie, niniejszy opis obejmuje wariant polipeptydu ksylanazowego lub jego fragment mających aktywność ksylanazy, który obejmuje jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych w prążku 1 i ewentualnie/lub prążku 2 sekwencji aminokwasowej B.subtilis lub jej równoważnych pozycji (prążków) w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych. Skutkiem tego, modyfikacja występuje w co najmniej prążku 1; lecz może występować tylko w samym prążku 2.
Wariant polipeptydu ksylanazowego może obejmować inne modyfikacje w innych resztach aminokwasowych, takich jak modyfikacje przy którejkolwiek z reszt aminokwasowych: 1,2, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 144, 1465, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 184, 185 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych pozycjach w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.
PL 212 113 B1
Wariant polipeptydu ksylanazowego może obejmować inne modyfikacje w innych resztach aminokwasów powierzchniowych: 1, 2, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 95, 97, 99, 101, 102, 104, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 143, 145, 147, 148, 151, 154, 155, 156, 157, 185 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych pozycjach w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.
Korzystnie, inhibitorem jest inhibitor znajdujący się naturalnie w tkankach roślinnych. Korzystnie wrażliwość wariantu enzymu ksylanazowego wobec inhibitora jest mniejsza w porównaniu z pierwotnym enzymem ksylanazowym.
Niniejszy wynalazek dostarcza także cząsteczkę kwasu nukleinowego (sekwencję nukleotydową) kodującą polipeptyd według wynalazku. Dostarcza także wektor zawierający kwas nukleinowy opisany w wynalazku, ewentualnie operacyjnie połączony z sekwencją regulatorową zdolną do bezpośredniej ekspresji wymienionego kwasu nukleinowego, w odpowiedniej komórce gospodarza. Podaje się także komórkę gospodarza obejmującą kwas nukleinowy lub wektor opisany w wynalazku.
W innym aspekcie opis dostarcza sposób wytworzenia polipeptydu według wynalazku, obejmujący transformowanie komórki gospodarza kwasem nukleinowym kodującym wymieniony polipeptyd, hodowlę transformowanej komórki i ekspresję wymienionego polipeptydu.
Nasze wyniki pokazują, że te warianty polipeptydów mają ulepszone właściwości, które czynią je odpowiednimi dla wielu zastosowań, takich jak pieczywo, pasze zwierzęce wytwarzanie skrobi, oddzielanie mąki (mielenie na mokro) oraz wytwarzanie papieru i miazgi.
W związku z tym, niniejszy wynalazek podaje także zastosowanie wariantu polipeptydu według wynalazku i sposób modyfikowania materiałów roślinnych.
Podaje się także zastosowanie wariantu polipeptydu według wynalazku, w pieczeniu. Wynalazek dodatkowo podaje zastosowanie wariantu polieptydu według wynalazku przy obrabianiu zbóż, wytwarzaniu skrobi i pasz zwierzęcych oraz zastosowanie wariantu polipeptydu według wynalazku w obrabianiu drewna np. wzmacnianiu wybielania miazgi drzewnej.
W dodatkowym aspekcie, niniejszy opis podaje sposób zmieniania wrażliwości polipeptydu ksylanazowego wobec inhibitora, który to sposób obejmuje modyfikację jednej lub więcej reszt aminokwasowych wymienionego enzymu wybranej spośród aminokwasów numer: 11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 32, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 i 175 na podstawie numeracji aminokwasów ksylanazy B. subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych reszt w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych. Korzystnie, wrażliwość jest zmniejszona.
Co istotne, nasze wyniki pokazują także, po raz pierwszy, że inhibitory ksylanazy odgrywają istotną rolę w określaniu funkcjonalności enzymów ksylanazowych w kompleksowym układzie, takim jak materiał roślinny. Przez określenie „funkcjonalność, rozumiemy właściwości biochemiczne ksylanazy w danym układzie. Właściwości te obejmują specyficzność substratową, parametry kinetyczne Km i Vmax (tam gdzie trzeba) oraz charakter produktów reakcji otrzymanych przez działanie ksylanazy w tym układzie. Funkcjonalność można także w konsekwencji opisać w kategoriach wpływu na właściwości fizyczne i/lub chemiczne materiału roślinnego, na który oddziałuje ksylanaza, np. rozmiar, do którego zmienia się lepkość materiału.
W taki sam sposób, w jaki można wykorzystywać warianty ksylanazy w różnych zastosowaniach przy obrabianiu, można wykorzystywać inhibitory ksylanazy w różnych zastosowaniach przy obrabianiu, takich jak pieczywo, obróbka miazgi drzewnej i obróbka zbóż.
Szczegółowy opis wynalazku
Chociaż ogólnie wszystkie techniki molekularne wymienione w niniejszym są dobrze znane w technice, można się odnieść w szczególności do Sambrook i inni, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) oraz Ausubel i inni, Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4-te wydanie, John Wiley & Sons, Inc.
A. Warianty polipeptydów ksylanazy
Enzymy ksylanazowe opisywano u blisko 100 różnych organizmów, łącznie z roślinami, grzybami i bakteriami. Enzymy ksylanazowe klasyfikuje się w kilka z ponad 40 rodzin enzymów glikozylohydrolaz.
Enzymy glikozylohydrolazowe, które obejmują ksylanazy, mannazy, amylazy, β-glukanazy, celulazy i inne karbohydrazy, klasyfikuje się na podstawie takich właściwości jak sekwencja aminokwasów, struktura trójwymiarowa i geometria miejsca katalitycznego (Gilkes i inni, 1991, Microbiol. Reviews 55: 303-315).
Szczególnie interesujące dla zastosowań w piekarnictwie są enzymy klasyfikowane w rodzinie 11. Wszystkie one są ksylanazami i są znane jako „ksylanazy rodziny 11. Niektóre publikacje przytaczają
PL 212 113 B1 je synonimowo jako ksylanazy rodziny G, lecz określenie „ksylanazy rodziny 11” będzie stosowane w niniejszym do określenia zarówno ksylanaz rodziny G jak i rodziny 11.
Tablica A wymienia kilka znanych ksylanaz z rodziny 11. Większość z nich ma ciężar cząsteczkowy wynoszący około 21000 Da. Trzy z ksylanaz rodziny 11 (Clostridium stercorarium XynA, Streptomyces Iividans XynB i Thermomonospora fusca XynA) mają wyższy ciężar cząsteczkowy wynoszący 31000 do 50000 Da. Jednakże te ksylanazy mają sekwencję rdzenia katalitycznego wynoszącą około 21000 Da podobnie jak inne ksylanazy rodziny 11. Sekwencje aminokwasowe ksylanaz rodziny 11 (lub dla większych enzymów, rdzeń katalityczny) wykazują wyższy stopień podobieństwa, zwykle wynoszący ponad 40% aminokwasów identycznych w prawidłowym uszeregowaniu aminokwasów. Ksylanazy rodziny 11, które pochodzą od bakterii, drożdży lub grzybów, dzielą tę samą ogólną strukturę cząsteczkową.
Fig. 22 ukazuje dane uszeregowania sekwencji aminokwasowej dla 51 ksylanaz rodziny 11.
T a b e l a A - Ksylanazy rodziny 11
Aspergillus niger Xyn A Aspergillus kawachii Xyn C
Aspergillus tubigensis Xyn A Bacillus circulans Xyn A
Bacillus pumilus Xyn A Bacillus subtilis Xyn A
Cellulomonas fimi Xyn D Chainia spp Xyn
Clostridium acetobutylicum Xyn B Clostridium stercorarium Xyn A
Fibrobacter succinogenes Xyn C Neocallimastix patriciarum Xyn A
Nocardiopsis dassonvillei Xyn II Ruminococcus flacefaciens Xyn A
Streptomyces Iividans Xyn C Streptomyces lividans Xyn B
Streptomyces thermoviolaceus Xyn II Streptomyces sp. nr 36a Xyn
Trichoderma harzianum Xyn Trichoderma reesei Xyn I
Trichoderma reesei Xyn II T richoderma viride Xyn
Wariant ksylanazy według wynalazku
Wariant polipeptydu ksylanazy według wynalazku otrzymuje się zwykle przez modyfikację polipeptydu ksylanazowego, przez substytucję, delecję lub addycję jednej lub więcej reszt aminokwasowych wewnątrz sekwencji aminokwasowej polipeptydu ksylanazowego. Korzystnie, modyfikacje obejmują jedną lub dwie substytucje aminokwasowe. Modyfikacje sekwencji polipeptydowych można przeprowadzić przy użyciu standardowych technik, takich jak mutageneza skierowana miejscowo. Modyfikacja może także nastąpić w wyniku stosowania technik chemicznych, takich jak modyfikacja chemiczna jednej lub więcej reszt aminokwasowych.
Sekwencją wyjściową może być sekwencja dzikiego typu lub sekwencja nie występująca naturalnie, np. pochodna, którą poddano inżynierii białka. Modyfikowana sekwencja ksylanazy może pochodzić z jakiegokolwiek źródła, np. bakteryjnego, grzybowego lub roślinnego. Korzystnie, modyfikowana sekwencja ksylanazowa jest ksylanazą rodziny 11, korzystnie ksylanazą rodziny 11 wybraną spośród ksylanazy I Trichoderma reesei, ksylanazy II Trichoderma reesei, ksylanazy Trichoderma harzianum, ksylanazy Trichoderma viride, ksylanazy A Bacillus circulans, ksylanazy A Bacillus subtilis, ksylanazy A Aspergillus niger, ksylanazy C Aspergillus kawachii, ksylanazy A Aspergillus tubigensis, ksylanazy B Streptomyces Iividans i ksylanazy C Streptomyces Iividans.
W szczególnie zalecanej postaci realizacji, modyfikowaną sekwencją ksylanazy jest sekwencja ksylanazy B.substilis ukazana jako SEQ ID nr 1 lub jej homolog. Korzystnie wymieniony homolog ma co najmniej 40, 50, 60 lub 80% homologii przez co najmniej 50 lub 100 reszt aminokwasowych, jak określono przy użyciu pakietu GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, USA; Devereux i inni, 1984, Nucleic Acids Research 12:387).
Specyficzne modyfikacje, które są zalecane zgodnie z niniejszym opisem obejmują jedną lub dwie substytucje w pozycjach 11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 i 175 na podstawie numerowania aminokwasów ksylanazy B.subtilis ukazanych jako SEQ ID nr 1 lub równoważnych reszt w innych homologicznych polipeptydach ksylanazy.
PL 212 113 B1
Szczególnie zalecane substytucje opisane tutaj obejmują jeden lub więcej D11Y, D11N, D11F, D11K, D11S, D11W, G12F, I15K, N17K, N17Y, N17D, N29K, N29Y, N29D, S31K, S31Y, S31D,
N32K, G34D, G34F, G34T, Y114A, Y113D, Y113K, N114A, N114D, N114F, N114K, Dl19§K, D119Y, D119N, G120K, G120D, G120F, G120Y, G120N, D121N, D121K, D121F, D121A, R122D, R122F, R122A, T123K, T123Y, T123D, T124K, T124Y, T124D, Q175E, Q175S i Q175L (w odniesieniu do sekwencji ksylanazy B.subtilis) lub ich równoważników w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych. Dodatkowe odniesienia do specyficznych reszt ksylanazy B.subtilis ukazanych jako SEQ ID nr 1 będą także obejmować ich równoważniki w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.
Można przeprowadzić połączenia mutacji, np. mutacje przy dwóch lub więcej z wyżej wymienionych resztach. Przykłady takich połączeń są przedstawione w sekcji przykładów w niniejszym.
W dodatkowej postaci realizacji, warianty polipeptydów według wynalazku mogą być oczyszczonymi i wyizolowanymi zmutowanymi ksylanazami naturalnie występującymi. Alternatywnie, zmutowane ksylanazy można wytworzyć przez poddanie organizmów mutagenom, a następnie skriningowi pod względem szczegółów obejmujących mutacje w genach ksylanazowych. Naturalnie występujące mutanty i mutanty wytworzone przez losową mutagenezę można identyfikować/przesiewać stosując różne techniki, takie jak skrining PCR przy użyciu odpowiednich primerów kwasu nukleinowego, w celu powielenia regionów genów ksylanazy i sekwencjonowania otrzymanych fragmentów.
Tak więc warianty polipeptydów według wynalazku obejmują naturalnie występujące zmutowane ksylanazy (oczyszczone i wyizolowane z organizmów, w których one występują lub otrzymane rekombinacyjnie), zmutowane ksylanazy otrzymane przez losową mutagenezę oraz zmutowane ksylanazy otrzymane przez miejscowo skierowaną mutagenezę.
Warianty polipeptydów według wynalazku można także poddawać dodatkowym modyfikacjom, które niekoniecznie wpływają na wrażliwość wobec inhibitorów, włączając każdą substytucję, odmianę, modyfikację, zastąpienie, delecję lub addycję jednego (lub więcej) aminokwasów z sekwencji lub do sekwencji, zapewniając, że otrzymana sekwencja aminokwasowa zachowa aktywność ksylanazy, przy czym korzystnie posiada co najmniej zasadniczo taką samą aktywność ksylanazową jak sekwencja nie modyfikowana.
Można wykonywać substytucje konserwatywne, np. zgodnie z poniższą tabelą. Aminokwasy w tym samym bloku w drugiej kolumnie i korzystnie w tym samym wierszu i w trzeciej kolumnie, można podstawiać między sobą:
Alifatyczne Nie polarne G A P
I L V
Polarne - bez ładunku C S T M
N Q
Polarne - naładowane D E
K R
Aromatyczne H F W Y
Polipeptydy według wynalazku obejmują także fragmenty sekwencji pełnej długości wymienionych powyżej, mających aktywność ksylanazy.
Polipeptydy według wynalazku mogą dodatkowo obejmować heterologiczne sekwencje aminokwasowe, zwykle przy końcu N lub końcu C, korzystnie końcu N. Sekwencje heterologiczne mogą obejmować sekwencje, które wpływają na nacelowywanie wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowe (tak jak sekwencje liderowe).
Polipeptydy według wynalazku wykonuje się zwykle za pomocą rekombinacji, np. jak opisano poniżej. Jednak można je także wykonać za pomocą syntezy, przy użyciu technik dobrze znanych fachowcom, takim jak synteza w fazie stałej. Polipeptydy według wynalazku można także wytworzyć jako białka fuzyjne, np. aby pomóc w ekstrakcji i oczyszczaniu. Może być także wygodne wprowadzenie miejsca rozszczepienia między partnerem w białku fuzyjnym, a sekwencją interesującego białka, pozwalając na usunięcie sekwencji białka fuzyjnego, tak jak miejsce rozszczepienia trombinowego. Korzystnie, białko fuzyjne nie będzie przeszkadzać działaniu sekwencji interesującego białka.
PL 212 113 B1
Oczekuje się, że stosowanie komórek gospodarza zapewni takie modyfikacje potranslacyjne jakie mogą być potrzebne do nadania optymalnej aktywności biologicznej produktom rekombinacyjnej ekspresji według wynalazku.
Polipeptydy według wynalazku mogą występować w postaci zasadniczo wyizolowanej. Zrozumiałe będzie, że białko można wymieszać z nośnikami lub rozcieńczalnikami, które nie zakłócą zamierzonego celu białka i będzie ono wciąż postrzegane jako zasadniczo wyizolowane. Polipeptyd według wynalazku może także występować w postaci zasadniczo oczyszczonej, w którym to przypadku będzie ono generalnie obejmować białko w preparacie, w którym ponad 90%, np. 95%, 98% lub 99% białka w preparacie jest polipeptydem według wynalazku.
Warianty polipeptydów według wynalazku mają zmienioną wrażliwość wobec inhibitorów w porównaniu z pierwotną sekwencją ksylanazy, które mogą być odpowiadającą ksylanazą dzikiego typu. Korzystnie, warianty polipeptydów mają zmniejszoną wrażliwość wobec inhibitorów ksylanazowych. Określenie „zmieniona wrażliwość wobec inhibitorów ksylanazowych oznacza, że stopień, do którego inhibitowana jest aktywność endo-e-1,4-ksylanazowa wariantu polipeptydu według wynalazku, przez inhibitor ksylanazy, jest inna niż ta pierwotnego enzymu ksylanazowego, który może być białkiem dzikiego typu. Może to być spowodowane np. zmianą struktury trójwymiarowej wariantu polipeptydu tak, że inhibitor nie wiąże już z takim samym powinowactwem jak czyni to wobec pierwotnego enzymu ksylanazowego, który może być enzymem dzikiego typu.
Wrażliwość wariantów polipeptydów według wynalazku wobec inhibitorów ksylanazowych można testować przy użyciu np. testu opisanego w przykładzie 4 i poniżej. Odpowiednim inhibitorem do stosowania w teście jest inhibitor oczyszczony z mąki pszennej w przykładzie 1. Inne inhibitory są opisane poniżej.
Test ksylanazy (aktywność endo-β-1,4-ksylanazy)
Próbki ksylanazy rozcieńcza się w kwasie cytrynowym (0,1 M) - bufor wodorofosforanu disodowego (0,2 M), pH 5,0, aby otrzymać w przybliżeniu OD = 0,7 w końcowym teście. Trzy rozcieńczenia próbki i standardu wewnętrznego o określonej aktywności, utrzymuje się w stałej temperaturze 40°C przez 5 minut. O czasie = 5 minut, do roztworu enzymu dodaje się 1 tabletkę Xylanase (usieciowany, barwiony substrat ksylanowy). O czasie = 15 minut (lub w pewnych przypadkach dłużej, w zależności od aktywności ksylanazowej występującej w próbce), reakcję kończy się dodając 10 ml 2% TRIS. Mieszaninę reakcyjną wiruje się i mierzy OD supernatantu przy 590 nm. Biorąc pod uwagę rozcieńczenia i ilość ksylanazy, można obliczyć aktywność próbki (TXU, Total-Xylanase-Units), w stosunku do standardu.
Inhibitory ksylanazy
Jak stosuje się w niniejszym, określenie „inhibitor ksylanazy odnosi się do związku, zwykle białka, którego rolą jest kontrola depolimeryzacji złożonych węglowodanów, takich jak arabinoksylan, znajdujących się w ścianie komórkowej roślin. Te inhibitory ksylanazowe są zdolne do redukcji aktywności naturalnie występujących enzymów ksylanazowych, jak również tych pochodzenia grzybowego, czy bakteryjnego. Chociaż obecność inhibitorów ksylanazy opisywano w nasionach zbóż (patrz np. McLauchlan i inni 1999a; Rouau i Suget 1998) ich wpływ na skuteczność enzymów ksylanazowych nie został szeroko zbadany.
McLauchlan i inni 1999a ujawnia izolowanie i charakteryzację białka z pszenicy, które wiąże i inhibituje dwie ksylanazy rodziny 11. Podobnie, WO 98/49278 pokazuje wpływ ekstraktu mąki pszennej na aktywność grupy ksylanaz drobnoustrojowych, z których wszystkie klasyfikuje się jako ksylanazy rodziny 11. Debyser i inni (1999) także ujawnia, że endoksylanazy od Aspergillus niger i Bacillus subtilis, które obie są członkami ksylanaz rodziny 11, były inhibitowane przez pszenny inhibitor ksylanazy zwany TAXI. McLauchlan i inni (1999b) poucza, że ekstrakty z rynkowych mąk, takich jak pszenna, jęczmienna, ryżowa i kukurydziana, są zdolne do inhibitowania ksylanaz zarówno rodziny 10 jak i 11.
Inhibitorem ksylanazy może być każdy odpowiedni inhibitor ksylanazy. Przykładowo, inhibitorem ksylanazy może być inhibitor opisany w WO-A-98/49278 i/lub inhibitor ksylanazy opisany przez Rouau, X i Surget A (1998), McLauchlan R i innych (1999) i/lub inhibitor ksylanazy opisany w brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9828599.2 (złożonym 23 grudnia 1998), brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9907805.7 (złożonym 6 kwietnia 1999) oraz brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9908645.6 (złożonym 15 kwietnia 1999).
PL 212 113 B1
Test inhibitora ksylanazy
Miesza się 100 μl frakcji kandydata na inhibitor, 250 μl roztworu ksylanazy (zawierającego 12 TXU ksylanazy drobnoustrojowej/ml) oraz 650 μl buforu (0,1 M kwas cytrynowy - 0,2 M bufor wodorofosforan disodowy, pH 5,0).
Mieszaninę utrzymuje się w stałej temperaturze 40°C przez 5 minut. O czasie - 5 minut, dodaje się jedną tabletkę Xylanase. O czasie = 15 minut, reakcję przerywa się przez dodanie 10 ml 2% TRIS. Mieszaninę reakcyjną wiruje się (3500 g, 10 minut, temperatura pokojowa) i supernatant mierzy przy 590 nm. Inhibicję oblicza się jako aktywność resztkową w porównaniu z wartością pustą. Wartość pustą otrzymuje się w ten sam sposób z wyjątkiem tego, że 100 μl inhibitora zastępuje się 100 μl buforu (0,1 M kwas cytrynowy - 0,2 M bufor wodorofosforan disodowy, pH 5,0).
Specyficzny inhibitor ksylanazy
Jak zaznaczono, inhibitorem ksylanazy, który można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem, jest inhibitor opisany w brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9828599.2 (złożonym 23 grudnia 1998), brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9907805.7 (złożonym 6 kwietnia 1999) oraz brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9908645.6 (złożonym 15 kwietnia 1999).
Ten endogeniczny inhibitor endo-e-1,4-ksylanazy można otrzymać z mąki pszennej. Inhibitor jest dipeptydem, mającym MW wynoszącą około 40 kDa (jak zmierzono przez SDS-PAGE lub spektrometrię masową) oraz pl wynoszący około 8 do około 9,5.
Analiza sekwencji do dzisiaj ujawniała, że inhibitor posiada co najmniej jedną lub więcej sekwencji przedstawionych jako SEQ ID nr 2, SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 7 i/lub SEQ ID nr 8.
Te inhibitory opisane w poprzednim stanie techniki można także stosować w testach określających wrażliwość wariantu polipeptydu według wynalazku wobec inhibitorów ksylanazowych. Można je także stosować jak opisano poniżej do modulowania funkcjonalności ksylanazy.
Polinukleotydy
Polinukleotydy według wynalazku zawierają sekwencje kwasu nukleinowego kodujące sekwencje wariantu polipeptydu według wynalazku. Zrozumiałe będzie przez fachowca, że liczne inne polinuklotydy mogą kodować ten sam polipeptyd, w wyniku degeneracji kodu genetycznego. Poza tym, zrozumiałe będzie, że fachowcy mogą, stosując rutynowe techniki, wykonywać substytucje nukleotydowe, które nie wpływają na sekwencję polipeptydu kodowanego przez polinukleotydy według wynalazku, aby odzwierciedlić stosowanie kodonu każdego poszczególnego organizmu gospodarza, w którym ma nastąpić ekspresja polipeptydów według wynalazku.
Polinukleotydy według wynalazku mogą obejmować DNA lub RNA. Mogą one mieć pojedynczą nić lub podwójną nić. Mogą to być także polinukleotydy, które obejmują syntetyczne lub modyfikowane nukleotydy. W stanie techniki znane są liczne różne rodzaje modyfikacji w stosunku do oligonukleotydów. Obejmują one szkielety metylofosfonianowe i fosforotionianowe, dodatek akrydyny lub łańcuchów polilizyny na końcach 3' i/lub 5' cząsteczki. Dla celów niniejszego wynalazku, zrozumiałe będzie, że opisane w niniejszym polinukleotydy można modyfikować każdą metodą dostępną w technice. Takie modyfikacje można przeprowadzać w celu wzmocnienia aktywności in vivo lub długości życia polinukleotydów według wynalazku.
Wektory nukleotydowe i komórki gospodarza
Polinukleotydy według wynalazku można wprowadzać do rekombinowanych wektorów, które można powielać.
Wektor można stosować do replikacji kwasu nukleinowego w zgodnej komórce gospodarza. Tak więc w dodatkowej postaci realizacji, opis podaje sposób wykonania polinukleotydów według wynalazku, przez wprowadzenie polinukleotydu według wynalazku do wektora, który można powielać, wprowadzenie wektora do zgodnej komórki gospodarza i hodowlę komórki gospodarza w warunkach, które powodują replikacje wektora. Wektor można odzyskiwać z komórki gospodarza. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują bakterie, takie jak E.coli, drożdże i grzyby.
Korzystnie, opisany polinukleotyd w wektorze jest połączony operacyjnie z sekwencją regulatorową, która jest zdolna do zapewnienia ekspresji sekwencji kodującej przez komórkę gospodarza, czyli wektor jest wektorem ekspresji. Określenie „operacyjnie połączony odnosi się do zestawienia, w którym opisane składniki występują w związku pozwalającym im na funkcjonowanie w zamierzony sposób. Sekwencja regulatorowa „operacyjnie połączona z sekwencją kodującą, połączona jest w taki sposób, że ekspresję sekwencji kodującej uzyskuje się w warunkach zgodnych z sekwencjami
PL 212 113 B1 kontrolnymi. Określenie „sekwencje regulatorowe obejmuje promotory i wzmacniacze oraz inne sygnały regulacji ekspresji.
Wzmocnienie ekspresji polinukleotydu kodującego polipeptyd według wynalazku, można także uzyskać przez selekcję heterologicznych regionów regulatorowych, np. promotora, regionów liderowych i terminatorowych wydzielania, które służą do zwiększania ekspresji oraz, jeśli trzeba, poziomu sekwencji interesującego białka z wybranego gospodarza ekspresji i/lub w celu zapewnienia możliwej do indukcji kontroli ekspresji polipeptydu według wynalazku.
Oprócz promotora natywnego w stosunku do genu kodującego polipeptyd według wynalazku, można stosować inne promotory do kierowania ekspresji polipeptydu według wynalazku. Promotor można wybrać pod względem jego skuteczności w kierowaniu ekspresją polipeptydu według wynalazku, w żądanym gospodarzu ekspresji.
Można także wybrać konstytutywny promotor, kierujący ekspresją żądanego polipeptydu według wynalazku. Przykładami silnych konstytutywnych i/lub możliwych do indukcji promotorów, które są zalecane do stosowania w grzybowych gospodarzach ekspresji są promotory, które można otrzymać z genów grzybowych dla ksylanazy (xlnA), fitazy, ATP-syntetazy, podjednostki 9 (oliC), izomerazy triozofosforanu (tpi) dehydrogenazy alkoholowej (AdhA), a-amylazy(amy), anyloglukozydazy (AG - z genu glaA), acetamidazy (amdS) oraz dehydrogenazy gliceroaldehydo-3-fosforanowej (gpd).
Przykłady silnych promotorów drożdżowych to te otrzymywane z genów dla dehydrogenazy alkoholowej, laktazy, kinazy 3-fosfoglicerynianowej i izomerazy triozofosforanowej.
Przykłady silnych promotorów bakteryjnych to promotory α-amylazy i SP02 jak również promotory z genów proteaz zewnątrzkomórkowych.
Można także stosować promotory hybrydowe do poprawiania możliwej do indukcji regulacji konstrukcji ekspresji.
Często pożądane jest dla polipeptydu według wynalazku, aby był wydzielany z gospodarza ekspresji do pożywki hodowlanej, skąd polipeptyd według wynalazku może być łatwo odzyskiwany. Sekwencję liderową wydzielania polipeptydu według wynalazku można stosować w celu wywierania wpływu na wydzielanie w następstwie ekspresji polipeptydu według wynalazku. Jednak zwiększenie ekspresji polipeptydu według wynalazku czasami powoduje wytwarzanie białka na poziomie, poza którym gospodarz ekspresji nie jest zdolny do obrabiania i wydzielania, tworząc wąskie gardło tak, że białkowy produkt akumuluje się wewnątrz komórki. W związku z tym, w opisie wskazano także heterologiczne sekwencje liderowe zapewniające najskuteczniejsze wydzielanie polipeptydu według wynalazku z wybranego gospodarza ekspresji.
Lider wydzielania może być wybrany na podstawie żądanego gospodarza ekspresji. Można wybrać heterologicznego lidera wydzielania, który jest homologiczny wobec innych regionów regulatorowych konstrukcji ekspresji. Przykładowo, lider silnie wydzielanego białka amyloglukozydazy (AG) może być stosowany w połączeniu z samym promotorem amyloglukozydazy (AG), jak również w połączeniu z innymi promotorami. W kontekście opisu niniejszego wynalazku można także stosować hybrydowe sekwencje sygnałowe.
Przykładami zalecanych heterologicznych sekwencji liderowych wydzielania są te pochodzące od genu grzybowej amyloglukozydazy (AG) (glaA - wersja zarówno 18 jak i 24-aminokwasowa, np. od Aspergillus), gen czynnika α (drożdże, np. Saccharomyces oraz Kluyveromyces) albo gen α-amylazy (Bacillus).
Takie wektory można transformować do odpowiedniej komórki gospodarza, jak opisano powyżej, w celu ekspresji opisywanego polipeptydu. Tak więc, w dodatkowym aspekcie, opis niniejszy podaje sposób wytwarzania wspomnianych polipeptydów, który obejmuje hodowlę komórki gospodarza transformowanej lub transfekowanej wektorem ekspresji jaki opisano powyżej, w warunkach zapewniających ekspresję przez wektor z sekwencją kodującą, kodujący polipeptydy, oraz odzyskanie polipeptydów otrzymanych w następstwie ekspresji. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują np. komórki grzybowe, takie jak komórki Aspergillus i drożdżowe, takie jak komórki drożdżowe z rodzaju Kluyveromyces lub Saccharomyces. Inne odpowiednie komórki gospodarza są omówione poniżej.
Wektorami mogą być np. wektory plazmidowe, wirusowe lub fagowe posiadające początek replikacji, ewentualnie promotor dla ekspresji wymienionego poIinukleotydu i ewentualnie regulator promotora. Wektory mogą zawierać jeden lub więcej możliwych do selekcji genów markerowych. Najodpowiedniejszymi systemami selekcji dla przemysłowych drobnoustrojów są te utworzone przez grupę markerów selekcji, które nie wymagają mutacji w organizmie gospodarza. Przykładami grzybowych markerów selekcji są geny dla acetamidazy (amdS), syntetazy ATP, podjednostki 9 (oliC), orotydyno12
PL 212 113 B1
5'-fosfatodekarboksylazy (prvA), oporności fleomycynowej i benomylowej (benA). Przykłady nie grzybowych markerów selekcji są gen oporności G418 (może on być także stosowany w drożdżach lecz nie w grzybach), gen oporności ampicylinowej (E.coli), gen oporności neomycynowej (Bacillus) oraz gen uidA E.coli, kodujący β-glukuronidazę (GUS). Wektory można stosować in vitro, np. do wytwarzania RNA albo stosować do transfekcji komórki gospodarza.
Dodatkowo opis podaje komórki gospodarza transformowane lub transfekowane polinukleotydem opisanym w wynalazku. Korzystnie, wymieniony polinukleotyd jest zawarty w wektorze w celu replikacji i ekspresji wymienionych polinukleotydów. Komórki będą tak wybrane, aby być zgodnymi w wymienionych wektorem i np. mogą to być komórki prokariotyczne (np. bakteryjne), grzybowe, drożdżowe lub roślinne.
Bakterie z rodzaju Bacillus są bardzo odpowiednie jako gospodarze heterologiczni, z powodu ich zdolności do wydzielania białek do pożywki hodowlanej. Inne bakterie odpowiednie jako gospodarze to te z rodzajów Streptomyces i Pseudomonas.
W zależności od charakteru polinukleotydu kodującego polipeptyd i/lub konieczności dodatkowej obróbki białka, które uległo ekspresji, zalecany może być gospodarz eukariotyczny, taki jak drożdże lub grzyby. Ogólnie, komórki drożdżowe są bardziej polecane niż komórki grzybowe, ponieważ są one łatwiejsze do manipulacji. Jednak niektóre białka są albo słabo wydzielane z komórki drożdżowej albo w pewnych przypadkach nie są prawidłowo obrabiane (np. hiperglikozylacja u drożdży). W tych przypadkach, powinien być wybrany grzybowy organizm gospodarza.
Można także wybrać gospodarza heterologicznego, w którym wytwarzany polipeptyd jest w postaci, która jest zasadniczo pozbawiona innych ksylanaz. Można to osiągnąć wybierając gospodarza, który nie wytwarza normalnie takich enzymów.
Przykłady zalecanych gospodarzy ekspresji opisane w niniejszym opisie, to grzyby, takie jak gatunki Aspergillus oraz gatunki Trichoderma; bakterie takie jak gatunki Bacillus, gatunki Streptomyces i gatunki Pseudomonas; oraz drożdże, takie jak gatunki Kluyveromyces i gatunki Saccharomyces.
Szczególnie zalecanych gospodarzy ekspresji można wybrać spośród Aspergillus niger, Aspergillus niger odmiana tubigensis, Aspergillus niger odmiana awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kuyveromyces lactis i Saccharomyces cerevisiae.
Wytwarzanie polipeptydu według wynalazku można uzyskać przez hodowlę drobnoustrojowych gospodarzy ekspresji, których transformowano jednym lub więcej polinukleotydów według niniejszego wynalazku, w konwencjonalnej odżywczej pożywce fermentacyjnej.
Pożywka farmentacyjna może obejmować znaną pożywkę hodowlaną zawierającą źródło węgla (np. glukozę, maltozę, melasę itd.), źródło azotu (np. siarczan amonu, azotan amonu, chlorek amonowy itd.), źródło azotu organicznego (np. ekstrakt drożdżowy, ekstrakt słodowy, pepton itd.) oraz źródła nieorganicznych substancji odżywczych (np. fosforan, magnez, potas, cynk, żelazo itd.). Ewentualnie można dodać środek indukujący.
Wybór odpowiedniej pożywki może być na podstawie wyboru gospodarzy ekspresji i/lub wymagań regulatorowych konstrukcji ekspresji. Takie pożywki są dobrze znane fachowcom. Pożywka może, jeśli trzeba, zawierać dodatkowe składniki faworyzujące transformowanych gospodarzy ekspresji ponad inne potencjalnie zanieczyszczające drobnoustroje.
Po fermentacji, komórki można usunąć z bulionu fermentacyjnego za pomocą wirowania lub filtracji. Po usunięciu komórek, można potem odzyskiwać wariant polipeptydu według wynalazku i, jeśli trzeba, oczyszczać i izolować konwencjonalnymi metodami.
Organizmy
Określenie „organizm w stosunku do niniejszego wynalazku, obejmuje każdy organizm, który mógłby zawierać sekwencję nukleotydową kodującą wariant białka ksylanazowego według niniejszego wynalazku i/lub produkty otrzymywane od nich, w którym transkrypcyjna sekwencja regulatorowa może pozwolić na ekspresję sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku, jeśli jest obecna w organizmie. Odpowiednie organizmy mogą obejmować prokariotę, grzyba, drożdże lub roślinę. Pod względem aspektu ksylanazy niniejszego wynalazku, zalecanym organizmem może być bakteria, korzystnie z rodzaju Bacillus, korzystnie Bacillus subtilis.
Określenie „organizm transgeniczny w stosunku do niniejszego wynalazku, obejmuje każdy organizm, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko według niniejszego wynalazku i/lub produkty od niego otrzymane, w którym transkrypcyjna sekwencja regulatorowa może pozwolić na
PL 212 113 B1 ekspresję sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku, wewnątrz organizmu. Korzystnie, sekwencja nukleotydowa jest włączona do genomu organizmu.
Określenie „organizm transgeniczny nie pokrywa natywnych nukleotydowych sekwencji kodujących w ich naturalnym środowisku, kiedy znajdują się one pod kontrolą swego natywnego promotora, który także znajduje się w swym naturalnym środowisku.
Zatem, organizm transgeniczny obejmuje organizm zawierający jakąkolwiek sekwencję lub połączenie nukleotydowej sekwencji kodującej, sekwencję aminokwasową według niniejszego wynalazku, konstrukt według niniejszego wynalazku (łącznie z ich kombinacjami), opisane w opisie wektory, plazmidy, komórki, tkanki albo ich produkty. Transformowana komórka lub organizm może wytworzyć dopuszczalne ilości żądanego związku, który byłby łatwo odzyskiwany z komórki lub organizmu.
Transformacja komórki gospodarza lub organizmów gospodarza
Jak zaznaczono wcześniej, organizm gospodarza może być organizmem prokariotycznym lub eukariotycznym. Przykłady odpowiednich gospodarzy prokariotycznych obejmują E.coli i Bacillus subtilis. Opisy transformacji gospodarzy prokariotycznych są dobrze udokumentowane w technice, np. patrz Sambrook i inni (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-gie wydanie, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) oraz Ausubel i inni, Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4-te wydanie, John Wiley & Sons, Inc.
Jeśli wykorzystuje się gospodarza prokariotycznego, wtedy sekwencja nukleotydowa może wymagać odpowiedniej modyfikacji przed transformacją - takiej jak usunięcie intronów.
Jak wspomniano powyżej, zalecanym organizmem gospodarza jest rodzaj Bacillus, tak jak Bacillus subtilis .
W innej postaci realizacji, organizmem transgenicznym mogą być drożdże. Pod tym względem, drożdże były także szeroko wykorzystywane jako podłoże dla ekspresji genu heterologicznego. Gatunki Saccharomyces cerevisiae mają długą historię stosowania w przemyśle, łącznie ze stosowaniem do ekspresji genu heterologicznego. Ekspresja genów heterologicznych w Saccharomyces cerevisiae została opisana przez Goodey i innych (1987, Yeast Biotechnology,DR Berry i inni, wydawcy, strony 401-429, Allen i Unwin, Londyn) oraz przez King i innych (1989, Molecular and Cell Biology of Yeast, E F Walton and G T Yarronton, wydawcy, strony 107-133, Blackie, Glasgow).
Z kilku powodów Saccharomyces cerevisiae jest dobrze dopasowany do ekspresji genu heterologicznego. Po pierwsze, nie jest on patogeniczny dla ludzi i jest niezdolny do wytwarzania pewnych endotoksyn. Po drugie, ma on długą historię bezpiecznego stosowania w ciągu wieków wykorzystania rynkowego, w różnych celach. Doprowadziło to do szerokiej publicznej akceptacji. Po trzecie, szerokie wykorzystanie rynkowe i badania poświęcone organizmowi, spowodowało powstanie bagatej wiedzy o genetyce i fizjologii, jak również cechach fermentacji na wielką skalę Saccharomyces cerevisiae.
Przegląd zasad ekspresji genu heterologicznego w Saccharomyces cerevisiae i wydzielanie produktów genowych, jest podane u E Hinchcliffe E Kenny (1993, „Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes, Yeasts, tom 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, wydawcy, 2-gie wydanie, Academic Press Ltd.).
Dostępnych jest kilka wektorów drożdżowych, łącznie z wektorami integracyjnymi, które wymagają rekombinacji z genomem gospodarza w celu ich utrzymania oraz autonomicznej replikacji wektorów plazmidowych.
Aby wytworzyć transgeniczne Saccharomyces, wytwarza się konstrukcje ekspresji przez wprowadzenie sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku do konstrukcji zaplanowanej do ekspresji w drożdżach. Opracowano kilka rodzajów konstrukcji stosowanych do ekspresji heterologicznej. Konstrukcje zawierają promotor aktywny w drożdżach połączonych przez fuzję z sekwencją nukleotydową według niniejszego wynalazku, zwykle stosuje się promotor pochodzenia drożdzowego, taki jak promotor GAL1. Zazwyczaj wykorzystuje się sekwencję sygnałową pochodzenia drożdżowego, taką jak sekwencja kodująca peptyd sygnałowy SUC2. Terminator aktywny w drożdżach kończy układ ekspresji.
Opracowano kilka protokołów transformacji dla transformacji drożdży. Przykładowo, transgeniczny Saccharomyces według niniejszego wynalazku można wytworzyć postępując zgodnie z opisem Hinnen i innych (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs J D (1978, Nature Londyn, 275, 104; oraz Ito, H i innych (1983, J Bacteriology 153, 163-168).
Komórki transformowanych drożdży selekcjonuje się stosując różne markery selekcji. Wśród markerów stosowanych do transformacji są liczne markery auksotroficzne, takie jak LEU2, HIS4 i TRP1 oraz
PL 212 113 B1 markery dominującej oporności antybiotykowej, takie jak markery antybiotyków amino glikozydowych, np. G418.
Innym organizmem gospodarza jest roślina. Podstawową zasadą w konstruowaniu genetycznie modyfikowanych roślin jest insercja informacji genetycznej do genomu rośliny, tak aby otrzymać stabilne utrzymanie wprowadzonego materiału genetycznego.
Roślinę transgeniczną według wynalazku można wytworzyć z każdej rośliny, takiej jak rośliny nasienne (okrytozalążkowe), oraz iglaste. Okrytozalążkowe obejmują dwuliścienne i jednoliścienne. Przykłady roślin dwuliściennych obejmują tytoń (Nicotiana plumbaginifolia oraz nicotiana tabacum), rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana), Brassica napus, Brassica nigra, Datura innoxia, Vicia narbonensis, Vicia Faba, groszek (Pisum sativum), kalafior, goździk i soczewica (Lens culinaris). Przykłady roślin jednoliściennych obejmują zboża, takie jak pszenica, jęczmień, owies i kukurydza.
Techniki wytwarzania roślin transgenicznych są dobrze znane w technice. Zwykle, albo całe rośliny, komórki albo protoplasty można transformować odpowiednią konstrukcją kwasu nukleinowego kodującą cząsteczkę palca cynkowego lub docelowego DNA (patrz powyżej dla przykładów konstrukcji kwasu nukleinowego). Istnieje wiele metod wprowadzania transformujących konstrukcji DNA do komórek, lecz nie wszystkie są odpowiednie do dostarczania DNA do komórek roślinnych. Odpowiednie metody obejmują infekcję Agrobacterium (patrz między innymi Turpen i inni, 1993, J. Virol. Methods, 42:227-239) lub bezpośrednie dostarczanie DNA, tak jak np. przez transformację za pośrednictwem PEG, przez elektroporację lub akcelerację cząstek opłaszczonych DNA. Metody akceleracji są generalnie zalecane i obejmują np. bombardowanie mikropociskami. Typowy protokół wytwarzania roślin transgenicznych (w szczególności jednoliściennych), wzięty z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych nr 5 874 265, jest opisany poniżej.
Przykładem metody dostarczania transformujących segmentów DNA do komórek roślin, jest bombardowanie mikropociskami. W tej metodzie, cząstki pochodzenia nie biologicznego, można powlekać kwasami nukleinowymi i dostarczać do komórek przez siłę napędzającą. Przykładowe cząstki obejmują te złożone z wolframu, złota, platyny i innych.
Szczególną korzyścią bombardowania mikropociskami, oprócz tego, że jest do skuteczny sposób powtarzalnego, stabilnego transformowania zarówno dwuliściennych jak i jednoliściennych, jest to, że nie potrzebna jest ani izolacja protoplastów ani wrażliwość na infekcję Agrobacterium. Ilustracyjną postacią realizacji metody dostarczania DNA do komórek roślinnych przez akcelerację jest Biolistic Particie Delivery System, który można stosować do napędzenia cząsteczek powleczonych DNA przez ekran, taki jak stal nierdzewna lub ekran Nytex, na powierzchnię filtra powleczonego komórkami roślinnymi hodowanymi w zawiesinie. Ekran rozprasza cząstki wolframowe z DNA tak, że nie są one dostarczane do biorczych komórek w wielkich agregatach. Uważa się, że bez ekranu oddzielającego urządzenie wyrzucające od komórek do bombardowania, pociski mogą się zlepiać i być zbyt duże, aby uzyskać wysoką częstość transformacji. Może to być spowodowane uszkodzeniem zadanym komórkom biorczym przez pociski, które są zbyt duże.
Do bombardowania, komórki w zawiesinie są korzystnie skoncentrowane na filtrach. Filtry zawierające komórki do bombardowania, są ustawione w odpowiedniej odległości poniżej płyty zatrzymującej makropociski. Jeśli trzeba, między działkiem i komórkami do bombardowania ustawia się także jeden lub więcej ekranów. Stosując techniki przedłożone w niniejszym, można otrzymać do 1000 lub więcej ugrupowań komórkowych wykazujących krótkotrwałą ekspresję genu markerowego („ognisk) na bombardowanym filtrze. Liczba komórek w ognisku, która wykazuje ekspresję produktu genu egzogenicznego 48 godzin po bombardowaniu, często wynosi od 1 do 10, a średnio 2 do 3.
Po przeprowadzeniu dostarczenia egzogenicznego DNA do komórek biorczych którąkolwiek z metod omówionych powyżej, zalecanym etapem jest identyfikacja transformowanych komórek do dalszej hodowli i regeneracji rośliny. Etap ten może obejmować testowanie hodowli bezpośrednio pod względem śladu możliwego do skriningu lub przez ekspozycję zbombardowanych hodowli wobec czynnika lub czynników selekcji.
Przykładem śladu markera możliwego do selekcji jest czerwony pigment wytwarzany pod kontrolą lokusa R u kukurydzy. Pigment ten można wykrywać przez hodowlę komórek na stałym podłożu, zawierającym pożywki umożliwiające podtrzymanie wzrostu na tym etapie, inkubację komórek w tem-2 -1 peraturze np. 18°C i ponad 180 μΕm- s- , oraz selekcji komórek z kolonii (widoczne agregaty komórkowe), które są pigmentowane. Te komórki można hodować dalej, albo w zawiesinie albo na pożywkach stałych.
PL 212 113 B1
Przykładową postacią realizacji metod identyfikacji transformowanych komórek jest ekspozycja zbombardowanych hodowli wobec czynnika selekcji, takiego jak inhibitor metaboliczny, antybiotyk, herbicyd lub inne. Komórki, które zostały transformowane i mają stabilnie zintegrowany gen markerowy nadający oporność wobec czynnika selekcji, będą rosły i dzieliły się w hodowli. Komórki wrażliwe będą niezdolne do dalszej hodowli.
Stosowanie systemu selekcji bar-bialaphos, zbombardowane komórki na filtrach zawiesza się ponownie z nieselektywnej pożywce płynnej, hoduje (np. przez jeden do dwóch tygodni) i przenosi na filtry, nad którymi znajduje się stała pożywka zawierająca 1-3 mg/l bialaphos. Mimo, że zaleca się zakres 1-3 mg/l, sugeruje się, że zakres 0,1-50 mg/l znajdzie wykorzystanie w praktyce wynalazku. Rodzaj filtru do wykorzystania przy bombardowaniu nie uważa się za szczególnie decydujący i może obejmować każde stałe, porowate, obojętne podłoże.
Komórki, które przeżyją ekspozycję wobec czynnika selekcji, można hodować w pożywkach, które podtrzymują regenerację roślin. Tkanki utrzymuje się na pożywkach podstawowych z hormonami, przez około 2-4 tygodnie, następnie przenosi do pożywek bez hormonów. Po 2-4 tygodniach, rozwój kiełków zasygnalizuje czas przeniesienia do następnej pożywki.
Regeneracja zwykle wymaga progresji pożywek, których skład został zmodyfikowany w celu zapewnienia odpowiednich składników odżywczych i sygnałów hormonalnych podczas kolejnych etapów rozwojowych od transformowanej tkanki kalusowej do bardziej dojrzałej rośliny. Rozwijające się roślinki przenosi się do gleby i hartuje, np. w komorze o kontrolowanym środowisku przy około 85%
-2 -1 wilgotności względnej, 600 ppm CO2, oraz 250 μΕ m-2s-1 światła. Rośliny dojrzewają korzystnie albo w komorze wzrostowej albo w szklarni. Regeneracja trwa zwykle około 3-12 tygodni. Podczas regeneracji, komórki hoduje się na stałych pożywkach w naczyniach do hodowli tkankowej. Ilustracyjną postacią realizacji takiego naczynia jest płytka Petriego. Regenerujące się rośliny hoduje się korzystnie w temperaturze około 19°C do 28°C. Po osiągnięciu przez regenerujące rośliny stadium kiełka i rozwoju korzenia, można je przenieść do szklarni w celu dalszej hodowli i testowania.
Genomowy DNA można izolować z linii komórek kallusa i roślin w celu określenia obecności genu egzogenicznego przez stosowanie technik dobrze znanych fachowcom, takich jak PCR i/lub Southern blotting.
Istnieje kilka technik wprowadzania informacji genetycznej, przy czym dwie główne zasady stanowią bezpośrednie wprowadzanie informacji genetycznej i wprowadzanie informacji genetycznej z użyciem układu wektorowego. Przegląd ogólnych technik można znaleźć w artykułach Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) oraz Christou (Agro-Food-Industry HiTech marzec/kwiecień 1994 17-24).
Tak więc, niniejszy opis odnosi się także do układu wektorowego, który niesie konstrukcję kodującą wariant polipeptydu ksylanazowego według niniejszego wynalazku oraz który umożliwia wprowadzenie konstrukcji do genomu rośliny.
Układ wektorowy może obejmować jeden wektor, lecz może on obejmować co najmniej dwa wektory. W przypadku dwóch wektorów, układ wektorowy przytacza się zwykle jako binarny układ wektorowy. Binarne układy wektorowe są opisane bardziej szczegółowo u Gynheung An i innych (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.
Jeden z szeroko wykorzystywanych układów do transformowania komórek roślinnych z danym promotorem lub sekwencją nukleotydową albo konstrukcją opiera się o stosowanie plazmidu Ti z Agrobacterium tumefaciens lub plazmidu Ri z Agrobacterium rhizogenes (An i inni (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 i Butcher D.N. i inni (1980) Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, wydawcy: D.S. Ingrams and J.P Helgeson, 203-208).
Skonstruowano kilka różnych plazmidów Ti i Ri, które są odpowiednie do konstrukcji konstrukcji dla roślin lub komórek roślinnych opisanych powyżej.
B. Zastosowania
W ogólnym znaczeniu, wariant ksylanazy według wynalazku można stosować do zmiany np. zmniejszenia, lepkości otrzymanej z obecności hemicelulozy lub arabinoksylanu w roztworze lub układzie zawierającym materiał ściany komórkowej rośliny. Zwykle wymieniony materiał ściany komórkowej rośliny zawiera jeden lub więcej inhibitorów ksylanazy.
Konkretnie, wariant ksylanazy według wynalazku można stosować przy obróbce materiałów roślinnych do stosowania jako pokarmy, takie jak pasza dla zwierząt, przy produkcji skrobi, przy pieczeniu i przy obróbce miazgi drzewnej w celu wytworzenia papieru.
PL 212 113 B1
Wytwarzanie pokarmów
Wariant ksylanazy według wynalazku można stosować do obróbki materiałów roślinnych, takich jak zboża, które stosuje się przy pokarmach obejmujących pasze dla zwierząt. Jak stosuje się w niniejszym, określenie „zboża oznacza jakikolwiek rodzaj ziarna stosowany do paszy i/lub jakąkolwiek trawę produkującą to ziarno, tak jak, lecz bez ograniczanie się do jakiegokolwiek, pszenica, jęczmień, kukurydza, sorgo, żyto, owiec, pszenżyto i ryż lub ich kombinacje. W jednej zalecanej postaci realizacji, zbożem jest pszenica.
Ksylan w dodatku paszowym i/lub pokarmowym, jest modyfikowany przez zetknięcie ksylanu z wariantem ksylanazy według niniejszego wynalazku.
Jak stosuje się w niniejszym, określenie „zetknięcie obejmuje, lecz bez ograniczania, zraszanie, powlekanie, impregnowanie lub kładzenie warstwy na dodatku do paszy i/lub pokarmu, wariantu enzymu ksylanazowego według niniejszego wynalazku.
W jednej postaci realizacji, dodatek do paszy i/lub pokarmu, można wytworzyć przez mieszanie wariantu enzymu ksylanazowego bezpośrednio z dodatkiem do pokarmu i/lub paszy. Przykładowo, wariant enzymu ksylanazowego można zetknąć (np. przez zroszenie) z dodatkiem do pokarmu i/lub paszy na osnowie zboża, takiej jak mielona pszenica, kukurydza lub mączka sojowa.
Możliwe jest także wprowadzenie wariantu enzymu ksylanazowego do drugiego (i innego) pokarmu i/lub paszy lub wody do picia, którą następnie dodaje się do dodatku do pokarmu i/lub paszy według niniejszego wynalazku. W związku z tym, nie jest zasadnicze, aby wariant enzymu ksylanazowego podanego przez niniejszy wynalazek był wprowadzony do samego pokarmu i/lub paszy na osnowie zboża, chociaż takie wprowadzenie tworzy szczególnie zalecany aspekt niniejszego wynalazku.
W jednej postaci jak opisano w wynalazku, dodatek do pokarmu i/lub paszy można łączyć z innymi składnikami pokarmu i/lub paszy, tworząc pokarm i/lub paszę na osnowie zboża. Takie składniki innego pokarmu i/lub paszy mogą obejmować jeden lub więcej (korzystnie termostabi Ine) dodatki enzymatyczne, dodatki witaminowe do pokarmu i/lub paszy, dodatki mineralne do pokarmu i/lub paszy oraz dodatki aminokwasowe do pokarmu i/lub paszy. Otrzymany (łączony) dodatek do pokarmu i/lub paszy obejmujący możliwie kilka różnych rodzajów związków, można potem mieszać w odpowiedniej ilości z innymi składnikami pokarmu i/lub paszy, takimi jak dodatki zbożowe i białkowe, tworząc pokarm dla człowieka i/lub paszę dla zwierząt.
W jednej zalecanej postaci, dodatek do pokarmu i/lub paszy, można wytworzyć przez wymieszanie różnych enzymów mających odpowiednią aktywność, tworząc mieszankę enzymatyczną. Przykładowo, dodatek do pokarmu i/lub paszy na osnowie zboża utworzony z np. mielonej pszenicy lub kukurydzy, można zetknąć (np. przez rozpryskanie) równoczesne lub kolejne z enzymem ksylanazowym mającym odpowiednią aktywność. Enzymy te mogą obejmować, lecz bez ograniczenia, jedną lub więcej amylazę, glukoamylazę, mannazę, galaktozydazę, fitazę, lipazę, glukanazę, arabinofuranozydazę, pektynazę, proteazę, glukooksydazę, oksydazę heksozową oraz ksylanazę. Enzymy mające żądaną aktywność można np. mieszać z polipeptydem o aktywności ksylanazy według niniejszego wynalazku, albo przed zetknięciem tych enzymów z dodatkiem do pokarmu i/lub paszy na osnowie zboża, albo alternatywnie, takie enzymy można zetknąć równocześnie lub kolejno z takim dodatkiem na osnowie zboża. Dodatek do pokarmu i/lub paszy miesza się potem ponownie z pokarmem i/lub paszą na osnowie zboża, otrzymując ostateczny pokarm i/lub paszę. Możliwe jest także opracowanie dodatku do pokarmu i/lub paszy w postaci roztworu o aktywności poszczególnego enzymu, a następnie mieszanie tego roztworu z materiałem pokarmu i/lub paszy, przed obróbkę dodatku do pokarmu i/lub paszy do postaci grudek lub jako granulatu.
Produkty piekarskie
Niniejszy wynalazek podaje zastosowanie wariantu polipeptydu ksylanazowego według wynalazku w procesie wytwarzania artykułów żywnościowych. Typowe produkty piekarnicze (pieczone) według niniejszego wynalazku, obejmują chleb, taki jak bochenki, bułki, słodkie bułki, podstawy do pizzy itd., precle, tortille, placki, ciastka, herbatniki, suchary itd. Wytwarzanie artykułów żywnościowych, takich jak produkty piekarnicze, jest dobrze znane w technice. Wytwarzanie ciasta np. jest opisane w przykładzie 2. Zastosowanie wariantów ksylanazy według wynalazku do zmieniania lepkości zawiesiny mącznej, jest opisane w przykładzie 5.
Wytwarzanie skrobi
Wariant ksylanazy według wynalazku można także stosować przy wytwarzaniu skrobi z materiałów roślinnych pochodzących od zbóż i bulw, takich jak ziemniaki.
PL 212 113 B1
Obrabianie miazgi drzewnej
Wariant ksylanazy według wynalazku można także stosować przy obrabianiu miazgi drzewnej, np. przy wytwarzaniu papieru.
Jak omówiono powyżej, wykazaliśmy, że główną determinantą funkcjonalności ksylanazy jest obecność endogenicznych inhibitorów w materiale roślinnym. W konsekwencji, chociaż jedną z metod zmiany funkcjonalności ksylanazy jest modyfikacja ksylanazy w celu zmiany jej wrażliwości wobec endogenicznych inhibitorów, inną metodą byłoby zmienianie ilości i/lub rodzaju inhibitora obecnego w materiale roślinnym. Tak więc niniejszy wynalazek opisuje także zastosowanie inhibitora ksylanazowego do zmieniania funkcjonalności ksylanazy i w konsekwencji zastosowanie inhibitora ksylanazowego w sposobach obrabiania materiału roślinnego, opisanych powyżej.
Wynalazek został zilustrowany w następujących przykładach wykonania.
P r z y k ł a d 1. Oczyszczanie i charakterystyka endogennego inhibitora ksylanazowego pszenicy.
kg mąki pszennej (Danish Reform, partia 99056) ekstrahowano wodą, stosując stosunek mąka:woda wynoszący 1:2, w ciągu 10 minut mieszania. Rozpuszczalny endogeniczny inhibitor ksylanazy oddzielono z zawiesiny mąka-woda, przez wirowanie. Ekstrakcję i wirowanie przeprowadzono w temperaturze 4°C. Inhibitor oczyszczono z ekstraktu wodnego przez następujące techniki chromatograficzne i techniki zatężania: HPLC-SEC, HPLC-CIEC, odparowywanie na wyparce obrotowej, HPLC-HIC, HPLC-SEC i odparowywanie na wyparce obrotowej. Inhibitor ksylanazowy mógł być monitorowany i oceniany ilościowo w czasie oczyszczania, przy użyciu następującej metody oceny ilościowej.
Metoda oceny ilościowej inhibitora
XIU (jednostka inhibitora ksylanazowego) jest określona jako ilość inhibitora, jaka zmniejsza 1 TXU do 0,5 TXU w warunkach opisanych poniżej.
Ksylanazą stosowaną w tym teście jest ksylanaza dzikiego typu Bacillus subtilis.
250 μΐ roztworu ksylanazy, zawierającego 12 TXU/ml, około 100 μΐ roztworu inhibitora ksylanazy i kwasu cytrynowego (0,1 M) - bufor wodorofosforanu disodowego (0,2 M), pH 5, do przereagowania objętości reakcyjnej wynoszącej 1000 μl inkubuje się wstępnie przez 5 minut w temperaturze 40°C. O czasie t = 5 minut, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 1 tabletkę Xylazyme (Megazyme, Irlandia). O czasie t = 15 minut, reakcję kończy się przez dodanie 10 ml 2% TRIS/NaOH, pH 12. Roztwór filtruje się i mierzy absorbancję supernatantu przy 590 nm. Wybierając kilka różnych stężeń inhibitora w powyższym teście, możliwe jest utworzenie wykresu OD w stosunku do stężenia inhibitora. Stosując nachylenie (a) i punkt przecięcia (b) z tego wykresu oraz stężenie ksylanazy, możliwe jest obliczenie ilości XIU w danym roztworze inhibitora (równanie 1).
Równanie 1 ilość XIU w roztworze = ((b/2)-a)/TXU
Z oczyszczania endogenicznego inhibitora ksylanazowego, odzyskano inhibitor z następującą wydajnością (tabela 1).
T a b e l a 1
Odzysk endogenicznego inhibitora ksylanazowego pszenicy po oczyszczaniu
Próbka Ilość XIU XIU, całość Odzysk %
Mąka 2000 g 590/g 1,180000 100
Oczyszczony inhibitor 90 ml 4658/ml 419,220 35,5
Próbka inhibitora była czysta i pozbawiona pszennych endogenicznych aktywności ksylanowitycznych
P r z y k ł a d 2. Frakcjonowanie i rekonstrukcja mąki pszennej pozbawionej inhibitora ksylanazowego oraz funkcjonalność ksylanaz w tej mące jako funkcja dodanego inhibitora ksylanazy.
Frakcjonowanie i rekonstytucja mąki
Stosowaną mąką była: mąka Danish Reform, partia 99056. Frakcjonowanie, inaktywacja inhibitora i rekonstytucja były następujące:
Wykonano zwykłe ciasto przez wymieszanie 1600 gramów mąki, dodanie optymalnej ilości wody, zgodnie z absorpcją piekarską przy 500 BU i czas mieszania zgodnie z wynikami Farinografu. Uzyskano 2512 gramów ciasta. Gluten wymyto ręcznie z ciasta, stosując stosunek wody do ciasta wynoszący około 5:1. Stosowana woda była wstępnie schłodzona do 4°C, aby zapobiec dodatkowej aktywności enzymu w cieście. Uzyskana woda po myciu zawierała rozpuszczalne białka (łącznie z inhibitorem ksylanazowym), lipidy, polisacharydy nie będące skrobią oraz skrobię, skrobię i inne nierozpuszczalne składniki oddzielono od wody z mycia, przez wirowanie (5000 g, 10 minut, tempera18
PL 212 113 B1 tura 10°C). Aby inaktywować endogeniczny inhibitor ksylanazowy w wodzie po myciu, supernatant z wirowania gotowano przez trzy minuty przy użyciu gorącej wyparki.
Wszystkie trzy frakcje (gluten, skrobię i substancje rozpuszczalne) zamrożono w kolbach i umieszczono w urządzeniu do liofilizacji. Po wysuszeniu, frakcje zważono, rozdrobniono z użyciem moździerza i tłuczka, młynka do kawy i przesiano przez sito o oczku wielkości 250 μm. Wszystkie frakcje zważono ponownie i mąkę rekonstytuowano, na podstawie stosunków otrzymanych po frakcjonowaniu.
Enzymy
W badaniu użyte zostały ksylanazy wymienione w tabeli 2. Ksylanazy oczyszcza się, co oznacza, że nie ma żadnej innej aktywności ksylolitycznej w próbce.
T a b e l a 2
Ksylanazy stosowane w badaniu, oraz aktywność, TXU
ID Pochodzenie TXU
B. sub B.subtilis 5100
A. nig A.niger 8800
Test ksylanazy (aktywność endo-e-1,4-ksylanazy)
Próbki ksylanazy rozcieńcza się w kwasie cytrynowym (0,1 M) - bufor wodorofosforanu disodowego (0,2 M), pH 5, otrzymując w przybliżeniu OD = 0,7 w teście końcowym. Trzy rozcieńczenia próbki oraz standard wewnętrzny o określonej aktywności, utrzymuje się w stałej temperaturze 40°C przez 5 minut. O czasie = 5 minut, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 1 tabletkę Xylazyme (usieciowany, barwiony substrat ksylanowy). O czasie t = 15 minut (lub w pewnych przypadkach dłużej w zależności od aktywności ksylanazy obecnej w próbce) reakcję kończy się przez dodanie 10 ml 2% TRIS. Mieszaninę reakcyjną wiruje się i mierzy absorbancję supernatantu przy 590 nm. Biorąc pod uwagę rozcieńczenia i ilość ksylanazy, można obliczyć aktywność w próbce(TXU, jednostki całkowitej ksylanazy), w stosunku do standardu.
Próby pieczenia
Wykonano próby pieczenia, odpowiednio z (1,44 x początkowym poziomem inhibitora w mące Danish Reform, partia nr 99056) oraz bez dodatku oczyszczonego endogenicznego inhibitora ksylanazowego do rekonstytuowanej mąki. Próby pieczenia przeprowadzono przy użyciu ksylanaz wymienionych w tabeli 2 i składników wymienionych w tabeli 3.
T a b e l a 3
Skład ciasta wykonanego w ciągu prób pieczenia
Ciasto nr ID TXU Dodany inhibitor, XIU/50 g
1 Kontrola 0 0
23 B. sub 7500 0
4 A. nig 7500 0
5 B. sub 7500 850
6 A. nig 7500 850
Kontrola 0 850
Analiza ciasta
Ciasto analizowano ze względu na:
Kleistość
Kleistość ciasta mieszono z użyciem systemu ΤΧ-ΧΤ2 (Stable Micro Systems) przy użyciu SMS Dough Stickiness Cell zgodnie z metoda opisaną przez Chen i Hoseney (Lebensmittel Wiss u.-Technol., 28, 467-473, 1995).
PL 212 113 B1
Analiza lepkości płynnego ciasta
Lepkość ekstrahowanego płynnego ciasta mierzono przy użyciu lepkościomierza Brookfield, po ekstrakcji
Analiza pentozanowa płynnego ciasta
Rozpuszczony pentozan mierzono w płynnym cieście, przy użyciu metody Rouoa i Surget (Carbohydrate polymers, 24, 123-132, 1994).
Wyniki
Frakcjonowanie i rekonstytucja mąki
Frakcjonowanie i rekonstytucja ciasta dała 168,15 gramów liofilizowanego glutenu, 111,13 gramów liofilizowanej rozpuszczalnej frakcji oraz 1143,56 gramów liofilizowanej skrobi.
Ocena ilościowa inhibitora w mące
Stosując metodę oceny ilościowej inhibitora, można było wykryć poziom inhibitora w mące 99056 oraz mące rekonstytuowanej. Wyniki tych analiz są wymienione w tabeli 4.
T a b e l a 4
Wyniki oceny ilościowej inhibitora w rodzimej mące (99056) i mące rekonstytuowanej
Mąka Stężenie inhibitora, XIU/g mąki
99056 590
Mąka rekonstytuowana 42
Porównując poziom inhibitora w dwóch porcjach mąki, ukazany jest 93% (100-(42XIU/590XIU) x 100%) spadek poziomu inhibitora w mące rekonstytuowanej.
Próby pieczenia
Wyniki z próby pieczenia są wymienione w tabelach 5 i 6.
T a b e l a 5
Dane prób pieczenia z mąką rekonstytuowaną, ksylanaza oraz +/- dodatek inhibitora ksylanazy. Std.dev.% oznacza odchylenie standardowe w ciągu dwóch dni pieczenia
ID TXU Inhibitor, XIU/50 g Średnia objętość gatunku ml/gram Std.dev%
Kontrola 0 42 3,04 4,06
B. sub 7500 42 3,23 12,51
A. nig. 7500 42 3,44 5,24
B. sub 7500 850 3,22 4,26
A. nig. 7500 850 3, 38 0,70
Kontrola 0 850 2, 94 0,05
Odchylenie standardowe ukazane w tabeli 5 odzwierciedla właściwości wyrabiania dla testowanego ciasta. Ciasto wykonane bez inhibitora ksylanazowego (42 XIU) było bardzo trudne do wyrobienia. Odchylenie standardowe dla tych ciast znajdują się w obszarze wynoszącym 3 do 12,5%. W porównaniu z ciastem z dodatkiem inhibitora, jest ono całkiem wysokie. Jeśli te odchylenia standardowe porównuje się z właściwymi zmianami objętości chleba, widać, że cyfry mają w przybliżeniu taką samą wartość. Oznacza to, że nie możemy wywnioskować nic o braku wpływu inhibitora na objętość chleba. Jeśli spojrzymy na ciasto wykonane z dodatkiem endogenicznego inhibitora ksylanazy (850 XIU) w tabeli 5, widzimy, że mogliśmy wytwarzać chleb z mąki rekonstytuowanej w sposób powtarzalny przez okres dwóch dni. Odchylenie standardowe znajdowało się w obszarze 0,05 do 4,2%, jaki jest dopuszczalny. Z tabeli 6 widać, że wszystkie ksylanazy zwiększały objętość pieczonego chleba.
PL 212 113 B1
T a b e l a 6
Zwiększanie objętości chleba pieczonego z mąki rekonstytuowanej jako funkcja ksylanazy i dodatku inhibitora ksylanazy
ID TXU Inhibitor XIU/50 g Średnia objętość gatunku ml/gram Wzrost objętości jako funkcja ksylanazy,%
Kontrola 0 42 3,04 0,0
B. sub 7500 42 3,23 6,2
A. nig. 7500 42 3,44 13,3
B. sub 7500 850 3,22 9,7
A. nig. 7500 850 3,38 15,0
Kontrola 0 850 2,94 0,0
Z tabeli 5 i tabeli 6 można wywnioskować, że brak inhibitora ksylanazowego w mące czyniło wyrabianie ciasta bardzo trudnym. Zatem, to, co może się wydawać pozytywną odpowiedzią objętości na dodatek inhibitora w tabeli 6, prawdopodobnie można wytłumaczyć przez wysokie odchylenie standardowe w cieście bez inhibitora, z powodu właściwości trudnego wyrabiania. Ponadto, można wywnioskować, że wszystkie testowane ksylanazy istotnie zwiększyły objętość chleba w porównaniu z kontrolną próbą ślepą.
Kleistość
To samo ciasto, które wykorzystano w próbach pieczenia, wykorzystano do pomiarów kleistości. Wyniki są wymienione w tabeli 7.
T a b e l a 7
Dane przedstawiające kleistość jako funkcja czasu, ksylanazy, dodatku inhibitora ksylanazowego do mąki rekonstytuowanej
ID TXU Inhibitor XIU/50 g Sr.kleistość po 10 min, g x s Śr. kleistość po 60 min,g x s
Kontrola 0 42 4,71 4,79
B. sub 7500 42 12,20 13,39
A. nig. 7500 42 9,22 12,58
B. sub 7500 850 2,51 3,66
A.nig. 7500 850 5,24 6,45
Kontrola 0 850 4,10 4,15
Wyniki w tabeli 7 wyraźnie wskazują wpływ inhibitora, jaki obserwowano w tym doświadczeniu. Ciasto o niskim poziomie inhibitora ksylanazowego w połączeniu z ksylanazą, było bardzo trudne do wyrobienia i uformowania. Jednakże gdy dodano inhibitor, ciasto stało się suche i bardzo łatwe do wyrobienia. Jak widać w tabeli 7, dodanie ksylanazy 990202 w połączeniu z inhibitorem zmniejszyło kleistość. Ciasto stało się bardziej suche.
Tabela 7 ukazuje także, że istnieje jedynie mały wpływ czasu na kleistość. Wydaje się, że ksylanazy działają bardzo szybko. W ciągu pierwszych 10 minut większość arabinoksylanu ulega modyfikacji po dodaniu pierwszej ksylanazy (B. sub). Druga testowana ksylanaza (A. nig) wydaje się działać wolniej. Funkcję czasu łatwo można zaobserwować stosując tę ksylanazę. Jest to także ksylanaza, która wykazuje mniejszy wpływ jako funkcję poziomu inhibitora przy analizowaniu kleistości.
Lepkość ciasta
Lepkość ciasta oraz wyniki analizy pentozanu otrzymano od tego samego ekstraktu ciasta wytworzonego z rekonstytuowanej mąki z dodatkiem ksylanazy i inhibitora ksylanazy. Ciasto to analizowano po dwóch okresach impregnacji, 30 i 120 minut.
Wyniki analizy lepkości przestawiono w tabeli 8.
PL 212 113 B1
T a b e l a 8
Dane reprezentujące lepkość płynu ciasta jako funkcja czasu, dodatek ksylanazy i inhibitora ksylanazy do mąki rekonstytuowanej
ID TXU Inhibitor XIU/50 g Śr. lepkość ciasta, cP, 30 min impregnacji Śr. lepkość ciasta, cP, 120 min impregnacji
Kontrola 0 42 5,21 5,56
B. sub 7500 42 5,07 4,55
A. nig. 7500 42 5,78 4,14
B. sub 7500 850 9,03 11,09
A. nig. 7500 850 8,44 8,55
Kontrola 0 850 5,96 6,95
Jak widać z tabeli 8, inhibitor ma istotny wpływ na funkcjonalność ksylanaz. Bez dodatku inhibitora, arabinoksylan jest depolimeryzowany do arabinoksylanu o niskim ciężarze cząsteczkowym (LMW) o niskiej lepkości. Dodatek inhibitora zapobiega tej bardzo szerokiej depolimeryzacji arabinoksylanu.
Analiza pentozanowa płynu ciasta
Wyniki z analizy pentozanowej (arabinoksylanowej) płynu ciasta są przedstawione w tabeli 9.
T a b e l a 9
Dane reprezentujące rozpuszczanie pentozanu jako funkcję czasu, dodatek ksylanazy i inhibitora ksylanazowego do mąki rekonstytuowanej.
ID TXU Inhibitor XIU/50 g Śr. % pentozanu 30 minut impregnacji Śr. % pentozanu 100 minut impregnacji
Kontrola 0 42 0,387 0,458
B. sub 7500 42 0,766 0,819
A. nig. 7500 42 0,719 0,798
B. sub 7500 850 0,410 0,544
A. nig. 7500 850 0,560 0,673
Kontrola 0 850 0,400 0,528
Jak widać z wyników w tabeli 9, dodatek endogenicznego inhibitora zmniejszało rozpuszczalność arabinoksylanu. Oceniając po 30 mintach impregnacji, ilość arabinoksylanu rozpuszczonego przy braku inhibitora jest prawie dwukrotnie większa niż ilość w obecności inhibitora. Obliczona na podstawie pokrewnych próbek kontrolnych, rozpuszczalność arabinoksylanu przy użyciu ksylanazy Bacillus, 30 minut impregnacji oraz +/- inhibitor.
P r z y k ł a d 3. Miejscowo skierowana mutageneza ksylanaz.
Specyficzne mutanty ksylanazy Bacillus subtilis można otrzymać przez miejscowo skierowana mutagenezę enzymu dzikiego typu, przez stosowanie licznych dostępnych na rynku zestawów do mutagenezy. Przykład, jak otrzymać mutanta D11F stosując zestaw Quick Exchange, dostępny od Stratagene Cloning Systems, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA, jest podany poniżej:
Sekwencję DNA kodującą ksylanazę A Bacillus subtilis opublikowano przez Paice i innych, 1986.
Sekwencja regionu kodujące jest następująca, przy czym sekwencja kodująca dojrzałe części białka, jest ukazana dużymi literami:
PL 212 113 B1 catatgtttaagtttaaaaagaatttcttagttggattatcggcagctttaatgagtatt agcttgttttcggcaaccgcctctgcaGCTAGCACAGACTACTGGCAAAATTGGACTGAT
GGGGGCGGTATAGTAAACGCTCTCAATGGGTCTGGCGGGAATTACAGTGTTAATTGGTCT
AATACCGGAAATTTTGTTGTTGGTAAAGGTTGGACTACAGGTTCGCCATTTAGGACGATA
AACTATAATGCCGGAGTTTGGGCGCCGAATGGCAATGGATATTTAACTTTATATGGTTGG
ACGAGATCACCTCTCATAGAATATTATGTAGTGGATTCATGGGGTACTTATAGACCTACT
GGAACGTATAAAGGTACTGTAAAAAGTGATGGGGGTACATATGACATATATACAACTACA
CGTTATAACGCACCTTCCATTGATGGCGATCGCACTACTTTTACGCAGTACTGGAGTGTT
CGCCAGTCGAAGAGACCAACCGGAAGCAACGCTACAATCACTTTCAGCAATCATGTGAAC
GCATGGAAGAGCCATGGAATGAATCTGGGCAGTAATTGGGCTTACCAAGTCATGGCGACA
GAAGGATATCAAAGTAGTGGAAGTTCTAACGTAACAGTGTGGTAA
Część genu kodująca dojrzałą część enzymu dzikiego typu można poddawać wewnątrzkomórkowej ekspresji w E.coli, metodami znanymi przez fachowców z dziedziny biologii molekularnej. Przykładowo:
1. Utworzenie kopii części opisanej dużymi literami wyżej opisanego genu przez stosowanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z dodaniem miejsca dla enzymu restrykcyjnego Ndel (CATATG) przed GCTATCACAi dodaniem miejsca restrykcji HindIII (AAGCTT) po GTGTGGTAA.
2. Wprowadzenie otrzymanej modyfikowanej kopii genu, stosując wyżej wymienione enzymy, do wektora ekspresji pET24a(+), który można otrzymać od Novagen Inc.601 Science Drive, Madison, WI 53711 USA.
3. Transformowanie do odpowiedniego szczepu E.coli i ekspresja przez fermentację, jak opisano, przez wektor pET24a(+).
Nasz zmutowany enzym D11F można otrzymać stosując zestaw do mutagenezy ,,Quick Exchange zgodnie z producentem, i stosując wyżej opisaną konstrukcję ksylanaza dzikiego typu Bacillus subtilis-pET24a(+) oraz następujące primery mutagenezy PCR:
Primer sensowny:
CTACTGGCAAAATTGGACTTTTGGAGGAGGTATAGTAAACGCTG
Primer antysensowny:
CAGCGTTTACTATACCTCCTCCAAAAGTCCAATTTTGCCAGTAG
Zmutowany enzym ulega ekspresji i jest oczyszczany przy użyciu takich samych protokołów jak dla enzymu dzikiego typu.
P r z y k ł a d 4 - Badania inhibicji mutantów ksylanazy.
Mutanty ksylanazy w E.coli (patrz przykład 3) uzyskano w wyniku fermentacji i oczyszczono (co oznacza brak innej aktywności ksylolitycznej w oczyszczonym preparacie) przy użyciu etapu odsalania i etapu chromatografii wymiany kationu.
Te czyste preparaty mutanta ksylanazy rozcieńczono do 12 TXU/ml stosując 0,1 M kwas cytrynowy - 0,2 M bufor wodorofosforan dwusodowy, pH 5,0, i stosowano w następującym teście.
Wykonano stabilny preparat inhibitora zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1. Ten stabilny preparat stosowano jako wyjściowy do wszystkich badań ksylanaza-inhibitor ksylanazowy. Stosując metodę oceny ilościowej inhibitora opisaną w przykładzie 1, uzyskano zawartość preparatu inhbitora wynoszącą 126 XIU/ml.
Test
Do 250 μ! rozcieńczonych preparatów zmutowanej ksylanazy dodaje się odpowiednio 0, 10, 25, 50 lub 100 μl preparatu inhibitora. Do tych mieszanin inhibitor-ksylanaza dodano 0,1 M kwas cytrynowy - 0,2 M bufor wodorofosforan disodowy, pH 5,0 uzyskując końcową objętość wynoszącą 1000 pl. Te mieszaniny reakcyjne inkubowano wstępnie przez 5 minut w temperaturze 40°C. Następnie do wszystkich mieszanin inhibitor-ksylanaza dodano 1 tabletkę Xylazyme (Megazyme, Irlandia). Po 10 minutach inkubacji w temperaturze 40°C, reakcje zakończono dodając 10 ml 2% Tris/NaOH, pH 12,0. Mieszaniny wirowano i niebieską barwę uwolnioną z substratu mierzono przy 590 nm.
PL 212 113 B1
Wyniki są przedstawione w tabeli 10.
T a b e l a 10
Względna inhibicja mutantów ksylanazy i pierwotnej ksylanazy (tutaj enzym dzikiego typu) jako funkcja inhibitora ksylanazowego
ID mutanta 0 1,26 3,15 6,3 12,6
Względna inhibicja, %
Typ dziki 100 77 48 29 23
D11Y 100 120 114 126 124
D11N 100 93 72 53 32
D11F 100 114 119 116 115
D11K 100 109 112 113 116
D11S 100 98 81 60 38
D11W 100 101 88 70 50
G34D 100 94 83 70 53
G34F 100 76 53 34 29
G34T 100 99 99 93 86
Y113A 100 96 80 62 43
Y113D 100 96 81 63 45
Y113K 100 103 85 63 47
N114A 100 80 49 28 22
N114D 100 84 57 39 29
N114F 100 84 54 39 34
N114K 100 87 56 33 24
D121N 100 80 36 16 14
D121K 100 104 95 85 75
D121F 100 101 89 72 60
D121A 100 81 50 27 21
R122D 100 85 59 41 28
R122F 100 93 74 58 58
R122A 100 78 46 33 26
Q175E 100 87 59 40 31
Q175S 100 88 59 30 19
Q17 5L 100 78 42 25 23
G12F 100 110 106 100 92
G13F 100 104 95 87 84
I15K 100 84 47 28 23
N32K 100 82 42 19 14
PL 212 113 B1 cd. tabeli 10
G120K 100 85 52 29 22
G120D 100 84 47 24 18
G120F 100 71 35 18 15
G120Y 100 81 40 18 16
G120N 100 84 49 29 23
D119K 100 94 67 40 26
D119Y 100 87 50 28 22
D119N 100 91 74 44 22
T123K 100 80 46 30 25
T123Y 100 80 47 28 27
T123D 100 83 36 20 17
T124K 100 110 92 73 57
T124Y 100 101 76 49 33
T124D 100 87 52 32 25
N17K 100 88 48 31 26
N17Y 100 79 42 23 19
N17D 100 90 81 50 22
N29K 100 83 50 30 23
N29Y 100 85 49 30 24
N29D 100 74 44 26 20
S31K 100 77 42 23 23
S31Y 100 83 50 27 22
S31D 100 79 52 30 24
D11F/R122 D 100 709 111 110 109
D11F/G34D 100 704 106 103 104
Z wyników w tabeli 10 widać, że mutanty ksylanazy D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D i D11F/G34D nie są inhibitowane przez endogeniczny inhibitor ksylanazy pszennej. Te mutanty ksylanazy, jak się oczekuje, działają bardziej agresywnie/specyficznie na rozpuszczalny arabinoksylan w porównaniu z innymi mutantami ksylanazy lub innymi ksylanazami. Będą one zatem lepsze w zastosowaniach, w których pożądana jest mniejsza lepkość (jako funkcja arabinoksylanu HMW).
P r z y k ł a d 5. Badania funkcjonalności mutantów ksylanazy.
Mutanty ksylanazy o ekspresji w E.coli (patrz przykład 3) uzyskano w wyniku fermentacji i oczyszczono (co oznacza brak innej aktywności ksylanolitycznej obecnej w oczyszczonym preparacie).
Te czyste preparaty mutantów rozcieńczono do 400 TXU/ml przy użyciu wody i wykorzystano w następującym teście.
Test
Sporządzono 200 ml 30% (wagowo) zawiesiny mąki przy użyciu wody (utrzymywanej w temperaturze 25°C), przez mieszanie przez 5 minut. 60,0 ml tej zawiesiny wylewa się do miseczki Ford i mierzy się czas potrzebny do odprowadzenia 50,0 ml. Ten pomiar jest pomiarem pustym. 60,0 ml zawiesiny wlewa się z powrotem i do zawiesiny dodaje się przy mieszaniu 1000 μl rozcieńczonego preparatu mutanta ksylanazy. Po 2, 5, 10 i 20 minutach do miseczki Ford wlewa się 60,0 ml i zapisuje czas odprowadzania dla 50,0 ml. Każdy pomiar wykonywano potrójnie.
Wyniki są przedstawione w tabeli 11.
PL 212 113 B1
T a b e l a 11
Względna lepkość zawiesiny mąki jako funkcja mutanta ksylanazy i ksylanazy macierzystej (tutaj ksylanazy dzikiego typu)
Czas inkubacji, minuty
ID mutanta 0 2 5 10 20
Względna zmiana lepkości, %
Typ dziki 100 112 120 131 141
D11Y 100 97 93 83 75
D11N 100 112 125 130 136
D11F 100 93 87 78 69
D11K 100 105 95 88 78
D11S 100 102 110 113 117
D11W 100 106 115 121 122
G34D 100 110 120 128 124
G34F 100 111 126 128 146
G34T 100 100 108 111 106
Y113A 100 118 129 130 124
Y113D 100 116 127 124 114
Y113K 100 118 123 121 115
N114A 100 117 128 127 131
N114D 100 125 144 162 170
N114F 100 113 119 131 150
N114K 100 119 129 141 147
D121N 100 104 103 106 104
D121K 100 122 132 141 162
D121F 100 107 117 128 147
D121A 100 101 102 103 107
R122D 100 120 119 124 115
R122F 100 127 144 150 160
R122A 100 123 138 144 153
Q175E 100 116 134 142 149
Q175S 100 110 113 121 129
Q175L 100 111 111 119 126
G12F 100 127 132 122 101
G13F 100 106 119 124 113
I15K 100 109 108 113 118
Ν32Κ 100 97 98 101 101
G120K 100 103 111 115 121
PL 212 113 B1 cd tabeli 11
G120D 100 112 122 120 126
G120F 100 103 111 117 130
G120Y 100 106 106 108 126
G120N 100 119 123 130 141
D119K 100 118 119 127 125
D119Y 100 102 102 111 110
D119N 100 126 137 145 146
Τ123Κ 100 106 109 121 120
Τ123Υ 100 101 106 108 116
T123D 100 113 123 125 126
Τ124Κ 100 117 131 128 127
Τ124Υ 100 112 123 132 135
T124D 100 103 110 111 118
Ν17Κ 100 114 119 119 132
Ν17Υ 100 102 102 108 108
N17D 100 120 131 135 143
Ν29Κ 100 98 100 100 104
Ν29Υ 100 115 117 132 143
N29D 100 104 104 113 111
S31K 100 119 115 124 134
S31Y 100 110 118 122 137
S31D 100 99 103 109 110
D11F/R12 2D 100 91 89 82 77
D11F/G34 D 100 96 93 84 80
P r z y k ł a d 6. Miejscowo skierowana mutacja w miejscu aktywnym ksylanazy A Bacillus subtilis nie wpływa na interakcję ksylanaza:inhibitor ksylanazy.
Resztę w aktywnym miejscu dzikiego typu enzymu ksylanazy A Bacillus subtilis, zmieniono przez miejscowo skierowaną mutagenezę (patrz przykład 3). W zmutowanej reszcie (Y166F) potencjalne wiązanie wodorowe jest utracone. Zmutowaną ksylanazę, która ulegała ekspresji w E.coli, poddano fermentacji i oczyszczono. Następnie, mutanta badano pod względem interakcji z inhibitorem ksylanazowym (patrz przykład 4).
Jak można zauważyć poniżej (tabela 12), wymiana aminokwasu w miejscu aktywnym, niespodziewanie nie miała żadnego wpływu na interakcje z inhibitorem ksylanazowym, w porównaniu z dzikiego typu enzymem ksylanazowym Bacillus subtilis .
T a b e l a 12
Względna inhibicja dzikiego typu ksylanazy Bacillus subtilis oraz zmutowanej ksylanazy Y166F.
XIU/ml
ID ksylanazy 0 1,26 3,15 6,3 12,6
Względna inhlibicja %
Typ dziki 100 75 40 24 20
Y166F 100 75 39 22 20
PL 212 113 B1
Skutkiem tego w podsumowaniu, wyżej opisane doświadczenie ukazuje miejscowo skierowaną mutację w miejscu aktywnym ksylanazy A Bacillus subtilis, która to mutacja nie ma wpływu na interakcje ksylanazy z inhibitorem ksylanazowym.
P r z y k ł a d 7. Mutacja skierowana miejscowo w ksylanazach rodziny 11 innych niż ksylanaza A Bacillus subtilis, wpływająca na interakcje ksylanaza-inhibitor ksylanazowy.
Resztę D19 enzymu ksylanazy A Thermomyces lanuginosus zmutowano do F19 przez mutagenezę skierowaną miejscowo. D19 odpowiada reszcie Dll w ksylanazie Bacillus subtilis (SEQ ID nr 1). Gen ksylanazy A Thermomyces lanuginosus jest opisany jako SEQ ID nr 9.
Primery do konstruowania PCR mutanta D19F mogą być następujące:
Primer sensowny:
GGTTATTACTATTCCTGGTGGAGTTTTGGAGGAGCGCAGGCCACG
Primer antysensowny:
CGTGGCCTGCGCTCCTCCAAAACTCCACCAGGAATAGTAATAACC
Otrzymaną zmutowaną ksylanazę (D19F) poddawano ekspresji w E.coli, fermentowano i oczyszczono. Następnie, zmutowaną i dzikiego typu ksylanazę A Thermomyces lanuginosus badano pod względem interakcji z inhibitorem ksylanazowym (patrz przykład 4) . Jak widać z wyników w tablicy 13, mutant D19F ksylanazy A Thermomyces lanuginosus jest znacznie mniej inhibitowana przez inhibitor ksylanazy w porównaniu z ksylanazą A Thermomyces lanuginosus dzikiego typu.
T a b e l a 13
Względna inhibicja dzikiego typu ksylanazy A Thermomyces lanuginosus (TLX) oraz zmutowanej ksylanazy Thermomyces lanuginosus, D19F (D19F)
XIU/ml
ID ksylanazy 0 1,26 3,15 6,3 12,6
Względna inhibicja %
TLX 100 45 24 17 14
D19F 100 73 38 24 20
Skutkiem tego w podsumowaniu, wyżej opisane doświadczenie ukazuje mutację skierowaną miejscowo, w ksylanazie A Thermomyces lanuginosus. Wyniki ukazują, że mutacja wprowadzająca substytucję aminokwasową na powierzchni cząsteczki ksylanazy (analogiczna do D11F u B.subtilis) zmienia interakcje ksylanaza:inhibitor ksylanazy. Tak więc, nasz wynalazek (czyli, że reszty powierzchniowe kontrolują poziom inhibicji ksylanazy) podtrzymują prawidziwość twierdzenia dla ksylanaz, które są homologiczne w stosunku do ksylanazy B.subtilis.
Podsumowanie
W podsumowaniu, niniejszy wynalazek podaje sposoby zmieniania wrażliwości enzymu ksylanazowego wobec inhibitora ksylanazowego.
Odniesienia
Courtin, C., Roelants, A. oraz Delcour, J., (1999). Fractionation-reconstitution experiments provide insight into the role of endoxylanases in bread-making. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 1870-1877.
D'Appolonia, B.L. i MacArthur, L.A. (1976), Comparison of bran and endosperm pentosans in immature and mature wheat. Cereal Chem. 53, 711-718.
Debyser, W. i Delcour, J.A. (1998). Inhibitors of cellolytic, xylanolytic and β-glucanolytic enzymes. W098/4 927 8.
Hazlewood, G.P. i Gelbert, H.J. (1993). Recombinant xylanases. Zgłoszenie PCT WO 93/25693.
Ingelbrecht, J.A., Verwimp, T. i Delcour, J.A. (1999). Endoxylanases in durum wheat semolina processing: solubilisation of arabinoxylans, action of endogenous inhibitors and effects on rheological properties. J. Agri. Food Chem.
Jacobsen, T.S., Heldt-Hansen, H.P., Kofod, L.V., Bagger, C. i Mϋllertz, A. (1995). Processing plant materiał with xylanase. Zgłoszenie PCT WO 95/23514.
Kormelink, F.J.M. (1992). Characterisation and mode of action of xylanase and some accesory enzymes.
Ph.D.Thesis, Agricultural University Wageningen, Holandia (strona 175, angielskie i duńskie podsumowania).
PL 212 113 B1
McLauchlan, R., Garcia-Conesa, M.T., Williamson, G., Roza, M., Ravestein, P. i MacGregor, A.W., (1999a). A novel class of protein from wheat which inhibits xylanases. Biochem. J., 338, 441-446.
McLauchlan, R., Flatman, R i inni (1999) Poster Presentation from meeting at University of Newcastle (1999) 11-17 kwiecień. Xylanase inhibitors, a novel class of proteins from cereals.
Montgomery, R. i Smith, F. (1995). The Carbohydrates of the Gramineae. VIII. The constitution of a water soluble hemicellulose of the endosperm of wheat (Triticum vulgare). J. Am. Chem. Soc. 77, 3325-3328.
Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M., Jurasek, L. i Yaguchi, M. (1986): A Xylanase Gene from Bacillus subtilis: Nucleotide Sequence and Comparison with
B.pumilis Gene. Arch. Microbiol. 144, 201-206)
Rouau, X. (1993). Investigations into the effets of an enzyme preparation for baking on wheat flour dough pentosans. J.Cereal Science. 18, 145-157.
Rouau, X., E1-Hayek, M-L i Moreau, D. (1994) Effect of an enzyme preparation containing pentosanes on the bread quality of flour in relation to changes in pentosan properties. J.Cereal Science. 19,259-272.
Slade, L., Levine, H., Craig, S., Arciszewski, H i Saunders, S. (1993). Enzyme treated Iow moisture content comestible products. US 5200215 przez Nabisco.
Soerensen, J.F., i Sibbensen, 0 (1999). Bacterial xylanase. UK A 9828599.2
PL 212 113 B1
Lista sekwencji
Sekwencja aminokwasowa dojrzalej ksylanazy Bacillus subtilis (SEQ ID nr 1)
10 11 20 21. 30 31 40 41 50 51 60
ASTDYWQNWT DGGGIVNAVN GSGGNYS7NW SNTGNFWGK GWTTGSPFRT INYNAGWAP ?0 31 80 81 90 91 100 101 110 111 120
NGNGYLTLYC WTRSPLIEYY WDSWGTYRP TGTYKGTYKS DGGTYDIYTT TRYNAPSIDG
121 130 131 140 141 150 151 160 161 170 171 180
DRTTFTQYWS VRQSKR?TGS NAIITFSNHV NAWKSHGMNL GSNWAYQVMA TEGYQSSGSS
181
NVTVW
Sekwencje aminokwasowe pochodzące od inhibitora ksylanazy mąki pszennej Łańcuch A inhibitora
N-terminalny:
GAPVARAVEAVAPFGVCYDTKTLGNNLGGYAVPNV (35aa) SEQ ID nr 2
C-termianlny:
KRLGFSRLPHFTGCGGL (17aa) SEQ ID nr 3
Łańcuch B inhibitora
N-terminalny:
LPVPAPVTKDPATSLYTIPFH (21 aa) SEQ ID nr 4
Łańcuch B trawiony Lys-C:
LLASLPRGSTGVAGLANSGLALPAQVASAQK (31aa) SEQ ID nr 5 GGSPAHYISARFIEVGDTRVPSVE <24aa) SEQ IN nr 6 VNVGVLAACAPSK (13aa) SEQ ID nr 7
VANRFLLCŁPTGGPGVAIFGGGPVPWPQFTQSMPYTLWVK SEQ ID nr 8 Gen ksylanazy A Thermomyces lanuginosus (SEQ ID nr 9)
10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60
ATGCAGACAA CCCCCAACTC GGAGGGCTGG CACGATGGTT ATTACTATTC CTGGTGGAGT
70 71 80 81 90 91 100 101 100 111 120
GACGGTGGAG CGCAGGCCAC GTACACCAAC CTGGAAGGCG GCACCTACGA GATCAGCTGG
PL 212 113 B1
121 130 131 140 141 150
GGAGATGGCG GTAACCTCGT CGGTGGAAAG
181 190 191 200 201 210 ATCCACTTTG AGGGTGTTTA CCAGCCAAAC
241 250 251 260 261 270 ACCCGCAACC CGCTGGTCGA GTATTACATC
301 310 311 320 321 330 TCCGGTGCTA CCGATCTAGG AACTGTCGAG
361 670 371 380 381 390 ACCACTCGCG TCAACGCACC TAGCATCGAC
481 490 491 500 501 510 GCTCGCGCTG GTTTGAATGT CAACGGTGAC
541 550 551 560 561 570 TACTTCAGCA GCGGCTATGC TCGCATCACC
151 160 161 170 171 180
GGCTGGAACC CCGGCCTGAA CGCAAGAGCC
211 220 221 230 231 240
GGCAACAGCT ACCTTGCGGT CTACGGTTGG
271 280 281 290 291 300
GTCGAGAACT TTGGCACCTA TGATCCTTCC
331 340 341 350 351 360 TGCGACGGTA GCATCTATCG ACTCGGCAAG
391 400 401 410 411 420 GGCACCCAAA CCTTCGACCA ATACTGGTCG
511 520 521 530 531 540 CACTACTACC AGATCGTTGC AACGGAGGGC
571 580 581 588
GTTGCTGACG TGGGCTAA
PL 212 113 B1
Lista sekwencji <110> Danisco AZS
Sibbesen, Ole Sorensen, Jens <120> Enzym <130> p8526wo <140> PCT/IBO1/00426 <141> 2001-03-08 ' <150> GB 0005585.5 <151> 2000-03-00 <150> GB 0015751.1 <151> 2000-06-27 <1SQ> 66 . .
<170> PatentIrv wersja 3.0 <210> 1. ' ' <211> 185 ; . : .
<212> PRT .
‘Bacillus-subtilis < 4 0 0 > 1
Ala Ser Thr Tyr Trp Gin Aśn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ile Val
1 5 10 15
Asn Ala Val Asń Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn
20 25 30
Thr Gly Asń Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe
35 40 45
Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly
50 55 60
Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tvr
65 70 75 30
PL 212 113 B1
Val Val Asp Ser Trp 85 Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly
. 90 95
Thr Val Lys Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg
100 105 110
Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gin Tyr
115 120 125
Trp Ser Val Arg Gin Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr, Ile
130 135 140
Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu
145 150 155 160
Gly Ser Asn Trp A 1 Tyr G.lń Val Met I. Thr Glu Gly Tyr Gin Ser
165 170 175
Ser Gly Ser Ser flsn Val Thr Val Trp 180 185 <210> 2 <211> 35. · ..
<212> PRT <213> pszenica <4 Ó0> 2 . .......
Gly 1 Ćł Pro val Ala Arg Aia Val Glu Ala Val Ala Pro Phe Gly val
1 5 1Q 15
cys Tyr Asp Thr Lys Thr Leu' Gly Asn Asn Leu Gly Gly Tyr Ala Val
25- 30
Pró Asn Val
<210> 35 3
<211> 17
<212> PRT
<213> Pszenica
<400> 3 :
Lys Arg Leu Gly Phe Ser Arg Leu Pro His Phe Thr Gly Cys Gly Gly
1
Leu
<210> 4
<211 > 21
<212> PRT
PL 212 113 B1 <213> Pszenica <400> 4 .
Leu Pro Val Pro Ala Pro Val Thr Lys Asp Pro Ala Thr Ser Leu Tyr 1 5 10 15 '
Thr Ile Pro Phe His
-20
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> Pszenica
<400> 5
Leu 1 . Leu 7\l3 Ser Leu 5 Pro Arg Gly Ser Thr 10 Gly Val Ala Gly Leu Ala 15
Asn Ser Gly Leu 20 Ala Leu Pro Ala Gin 25 Val Ala Ser Ala Gin 30 Lys
<210> S .
<211> 24 <212> PR?
<213> Pszenica <400> 6
Gly .Gly .Ser Pro Ala His Tyr Ile Ser Ala Arg Phe Ile Glu Val Gly i 5 10 15
Asp Thr Arg Val Pro Ser Val Glu 20 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Pszenica
PL 212 113 B1
Ala Ile Phe Gly 20 Gly Gly Pro Val Pro Trp 25 Pro Gin Phe Thr Gin Ser 30
Met Pro Tyr Thr Leu Val Val Val Lys
35 40
<210> 9 <21ł> 588 <212> DNA <thermomyces lanuginosus <400> 9
atgcagacaa cccccaactc ggagggctgg cacgatggtt attactattc ctggtggagt 60
gacggtggag cgcaggccac gtacaccaac ctggaaggcg gcacctacga gatcagctgg 120
ggagatggcg gtaacctcgt cggtggaaag ggctggaacc ccggcctgaa cgcaagagcc 180
atccactttg agggtgttta ccagccaaac ggcaacagct accttgcggt ctacggttgg 240
acccgcaacc cgctggtcga gtattacatc gtcgagaact ttggcaccta tgatccttcc' 300
tccggtgcta ccgatctagg aactgtcgag tgcgacggta gcatctatcg actcggcaag 360
accactcgcg tcaacgcacc tagcatcgac ggcacccaaa ccttcgacca atactggtcg 420
gtccgccagg acaagcgcac cagcggtacc gtccagacgg gctgccactt. cgacgcctgg 480
gctcgcgctg gtttgaatgt caacggtgac cactactacc agatcgttgc aacggagggc 540
tacttcagca gcggctatgc tcgcatcacc gttgctgacg tgggctaa 588
<210> 10 <211> 645 ' <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400 10
catatgttta agtttaaaaa gaatttctta gttggattat cggcagcttt aatgagtatt 60
agcttgtttt cggcaaccgc ctctgcagct agcacagact actggcaaaa ttggactgat 120
gggggcggta tagtaaacgc tgtcaątggg tctggcggga attacagtgt taattggtct 180
aataccggaa attttgttgt tggtaaaggt tggactacag gttcgccatt taggaogata 240
aactataatg ccggagtttg ggcgccgaat ggcaatggat atttaacttt atatggttgg 300
acgagatcac ctctcataga atattat-gta gtggattcat ggggtactta tagacctact 3 60
ggaacgtata aaggtactgt aaaaagtgat gggggtacat atgaoatata tacaactaca 420
cgttataacg caccttccat tgatggcgat cgcactactt ttacgcagta ctggagtgtt 480
cgccagtcga agagaccaac cggaagcaac gctacaatca ctttcagcaa tcatgtgaac 540
PL 212 113 B1
gcatggaaga gccatggaat gaaggatatc aaagtagtgg gaatctgggc aagttctaac agtaattggg gtaacagtgt cttaccaagt ggtaa catggcgaca 600 645
<210> 11
<211> 657 -
<212> DNA
<213> Sztuczny
<220>
<223> Opis sztucznej sekwencj i: sekwencja ksylanazy A 0. subtilis z
dodanym miejscem restrykcyjnym <400> 11
catatgttta agtttaaaaa gaatttctta gttggattat cggcagcttt aatgagtatt 60
agcttgtttt cggcaaccgc ctctgcacat atggctagca cagactactg gcaaaattgg' 120
actgatgggg gcggtatagt aaacgctgtc aatgggtctg gcgggaatta cagtgttaat 180
tggtctaata ccggaaattt tgttgttggt aaaggttgga ctacaggttc gccatttagg 240
acgataaact ataatgccgg agtttgggcg ccgaatggca atggatattt aactttatat 300
ggttggacga gatcacctct catagaatat tatgtagtgg attcatgggg tacttataga 360
cctactggaa cgtataaagg t c λ. t a .a a agtgatgggg gtacatatga catatataca 420
actacacgtt ataacgcacc ttccattgat ggcgatcgca ctacttttac gcagtactgg 480
agtgttcgcc agtcgaagag accaaccgga agcaacgcta caatcacttt cagcaatcat 540
gtgaacgcat ggaagagcca tggaatgaat ctgggcagta attgggctta ccaagtcatg 600
gcgacagaag gatatcaaag tagtggaagt tctaacgtaa cagtgtggta aaagctt 657
<210> 12 < 2 11 > 4 4 <212> DNA <213> Sztuczny <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: primer sensowny ' <400> 12 ctactggcaa aattggactt ttggaggagg tatagtaaac gctg 44 <210> 13 <211> 44
PL 212 113 B1
<212> DNA
<213> Sztuczny
<220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: primer antysensowny
<400> 13
cagcgtttac tatacctcct ccaaaagtcc aattttgcca gtag 44
<210 14
<211> 45
<212> DNA
<213> Sztuczny '
<220
<223> Opis sztucznej sekwencji: Primer sensowny
<400 14 ' '
ggttattact attcctggtg gagttttgga ggagcgcagg ccacg ' 45
<210 15
<211> 45
<212> DNA
<213> Sztuczny
<220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: primer antysensowny
<400 15
egtggcctgc gctcctccaa aactccacca ggaatagtaa taacc 45
<210> 16
<211> 213
<212> PRT
<213> Baciilus subtilis
<400 16
PL 212 113 B1
Met 1 Phe Lys Phe Lys 5 Lys Asn Phe Leu Val 10 Gly Leu Ser Ala Ala 15 Leu
Met Ser Ile Ser Leu Phe Ser Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ser Thr Asp
20 25 30
Tyr Trp Gin Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ile Vai Asn Ala Val Asn
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn Thr Gly Asn Phe
50 55 60
Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe Arg Thr I le Asn
65 70 75 80
Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu
85 90 95
Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser
100 105 110
Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Lys Ser
115 120 125
Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro
130 135 140
Ser Ile Asp Gly Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gin Tyr Trp Ser Val Arg
145 150 155 160
Gin Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile Thr Phe Ser Asn
165 170 175
His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu Gly Ser Asn Trp
180 185 190
Ala Tyr Gin Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ser
195 200 205
Asn Val Thr Val Trp
210
<210> : L 7
<2ii> ; 213
<212> i ?RT
<213> i Sacillus circulans
<400> 17 Lys Phe Lys 5 Lys Asn Phe Leu Val 10 Gly Leu Sfer Ala Ala 15 Ls u
Met 1 Phe
Met Ser Ile Ser 20 Leu Phe Ser Ala Thr 25 Ala Ser Ala Ala Ser 30 Thr Asp-
Tyr Trp Gin 35 Asn Trp Thr Asp Gly 40 Gly G1 y Ile Vał Asn Ala 45 Val Asn
Gly Ser 50 Gly Gly Asn Tyr Ser 55 Val Asn Trp Ser Asn Thr Gly 60 Asn Phe
Val 65 Val Gly Lys Gly Trp 70 Thr Thr Gly Ser Pro Phe Arg Thr 7 5 Ile Asn 30
PL 212 113 B1
Tyr Asn Ala Gly Val 85 Trp 1 a Pro Asn Gly 90 Asn Gly Tyr Leu Thr 95 Leu
Tyr Gly Trp Thr 100 Arg Ser Pro Leu Ile 105 Glu Tyr Tyr Val Val 110 Asp Ser
Trp Gly Thr 115 Tyr Arg Pro Thr Gly 120 Thr Tyr Lys Gly Thr 125 Val Lys Ser
Asp Gly 130 Gly Thr Tyr Asp Ile 135 Tyr Thr Thr Thr Arg 140 Tyr Asn Ala Pro
Ser 145 Ile Asp Gly Asp Arg 150 Thr Thr Phe Thr Gin 155 Tyr Trp Ser Vai Arg 160
Gin Ser Lys Arg Pro 165 Thr Gly Ser Asn Ala 170 Thr Ile Thr Phe Thr 175 Asn
His Val Asn Ala 180 Trp Lys S e r His Gly 185 Met Asn Leu Gly Ser 190 Asn Trp
Ala Tyr Gin 195 Val Met Ala Thr Glu 200 Gly Tyr Gin Ser Ser 205 Gly Ser Ser
Asn Val 210 Thr Val Trp
<210> ' 18
<211 > : 211
<212> : PRT
<213> ] Bacillus stearothermophilus
<400> : 18
Met I ' Lys Leu Lys Lys 5 Lys Met Leu Thr Leu 10 Leu Leu Thr Ala Ser 1 < Met
Ser Phe Gly Leu 20 Phe Gly Ala Thr Ser 25 Ser Ala Ala Thr Asp 30 Tyr Trp
Gin Tyr Trp 35 Thr Asp Gly Gly Gry 40 Met Val Asn Ala Val 45 Asn Giy Pro
Gly Gly 50 Asn Tyr Ser Val Thr 55 Trp Gin Asn Thr Gly 60 Asn Phe Val Val
Gly 65 Lys Gly Trp Thr Val 70 Gly Ser Pro Asn Arg 7 5 Va.l Ile Asn Tyr Asn 80
Ala Gly Ile Trp Glu 85 Pro Ser Gly Asn Gly 90 Tyr Leu Thr Leu Tyr 95 Gly
Trp Thr Arg Asn 100 Ala Leu Ile G.lu Tyr 105 Tyr Vai Val Asp Ser 110 Trp Gly
Thr Tyr Arg Ala Thr Gly Asn Tyr 120 Glu Ser Gly Thr Val 125 Asn Ser Asp
Gly Gly 130 Thr Tyr Asp Ile Tyr 135 Thr Thr Met Arg Tyr 14 0 Asn Ala Pro Ser
PL 212 113 B1
Ile Asp Gly 145 Thr Gin Thr 150 Phe Gin Gin Phe Trp 155 Ser Val Arg Gin Ser 160
Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Val Ser Ile Thr Phe Ser Asn His Val
165 170 175
Asn Ala Trp Arg Ser Lys Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ala Tyr
180 185 190
Gin Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Arg Ser Asn Val
195 200 205
Thr Val Trp
210
<210> 19
<211> 211
<212> PRT
<213> A. caviae
<400> 19
Met Phe Lys Phe Gly Lys Lys Leu Met Thr Val Val Leu Ala Ala Ser
1 5 10 15
Met Ser Phe Gly Val Phe Ala Ala Thr Ser Ser Ala Ala Thr Asp Tyr
20 25 30’
Trp Gin Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn Ala Vai Asn Gly
35 40' 45
Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Ser Trp Gin Asn Thr Gly Asn Phe Val
50 55 60
Val Gly Lys Gly Trp Thr Tyr Gly Thr Pro Asn Arg Val Val Asn Tyr
65 70 7 5 80
Asn Ala Gly Val .Phe Ala Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Phe Tyr
85 90 95
Gly Trp Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp
100 105 110
Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Asn Ser Asp
115 120 125
Gly Gly Thr Tyr Asp I le Tyr Thr Thr Met Arg Tyr Asn Ala Pro Ser
130 135 140
Ile Asp Gly Thr Gin Thr Phe Pro Gin Tyr Trp Ser Val Arg Gin Ser
145 150 155 160
Lys Arg Pro Thr Gly Val Asn Ser Thr Ile Thr Phe Ser Asn His Val
165 no 17 5
Asn Ala Trp Pro Ser Lys Gly Met Tyr Leu Gly Asn Ser Trp Ser Tyr
180 185 190
Gin Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Asn Ala Asn Val
195 200 205
Thr Val Trp
210
PL 212 113 B1
<210> 20
<211> 221
<212> PRT
<213> C. carbonum
<400> 20 .
Met Val Ser Phe Thr Ser Ile Ile Thr Ala Ala Val Ala Ala Thr Gry
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Ala Thr Asp Val Ser Leu Val Ara Arg Gin Asn
20 25 30
Thr Pro Asn Gl y Glu Gly Thr His Asn Gly Cys Phe Trp Ser Trp Trp
35 40 4S
Ser Asp Gly Gly Ala Arg Ala Thr Tyr Thr Asn Gly Ala 'Gly Gly Ser
50 55 60
Tyr Ser Val Ser Trp Gly Ser Giy Gly Asn Leu Val Gl-y Gly Lys Gly
55 70 75 50
Trp Asn Pro Gly Thr Ala Arg Thr Ile Thr Tyr Ser Gly Thr Tyr Asn
85 90 95
Tyr Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro
100 105 110
Leu Val Glu Tyr Tyr Val Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr Asp Pro
115 120 125
Ser Gin Ser Gin Asn Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Ser Ser Tyr
130 135 140
Lys Ile Ala Gin Ser Thr Arg Thr Asn Gin Pro Ser Ile Asp Gly Thr
145 150 155 160
Arg Thr Phe Gin Gin Tyr Trp Ser Val Arg Gin Asn Lys Arg Ser Ser
165 170 175
Gly Ser Val Asn Met Lys Thr His Phe Asp Ala Trp Ala Ser Lys Gly
180 135 190
Met Asn Leu Gly Gin His Tyr Tyr Gin Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr
195 200 205
Phe Ser Thr Gly Asn Ala Gin Ile Thr Val Asn Cys Pro
210 215 220
<210> 21
<21i> 227
<212> PRT
<2 13> H.
<400> 21
PL 212 113 B1
Met 1 Val Ser Phe Thr 5 Ser Ile Ile Thr Ala Ala 10 Val Ala Ala Thr C. X _ Gly
Ala Leu Ala Ala Pro Al a Thr Asp Ile Ala Ala Arg Ala Pro Ser Asp
20 25 30
Leu Val Ala Arg Gin Ser Thr Pro Asn Gly Glu Gly Thr His Asn Gly
35 40 45
Cys Phe Tyr Ser Trp Trp Ser Asp Gly Gly Al a Arg Al a Thr Tyr Thr
50 55 60
As η Gly Ala Gly Gly Ser Tyr Ser Val Ser Trp Gly Thr Gly Gly Asn
65 70 75 80
Leu Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Thr Ala Arg Thr Ile Thr
85 90 95
Tyr Ser Gly Gin Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu il I le Tyr
100 105 110
Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Val Glu Asn Phe
115 120 125
Gly Thr Tyr Asp Pro Ser Ser Gin Ala Gin Asn Lys Gly Thr Val Thr
130 135 140
Ser Asp Gly Ser Ser Tyr Lys Ile Ala Gin Ser Thr Arg Thr Asn Gin
.145. 150 155 160
Pro Ser Ile Asp Gly Thr Arg Thr Phe Gin Gin Tyr Trp Ser Val Arg
165 170 175
Gin Asn Lys Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Met Lys Thr -His Phe Asp
180 185 190
Ala Trp Ala Ser Lys Gly Met Asn Leu Gly Ser His Tyr Tyr Gin ΐ Ls
195 200 205
Val Ala Thr Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Yal
210 215 220
Asn Cys Pro
225 <210> 22 <211> 227..
<212> PRT <213> A. pisi <400> 22
Met 1 Yal Ser Phe Thr 5 Ser Ile Phe Thr Ala 10 Ala Val Ala Ala Thr i 5 Gly
Ala Leu Ala Val 20 Pro Yal Thr Asp Leu 25 Ala Thr Arg Ser Leu 30 Gly Ala
Leu Thr Ala 35 Arg Ala Gly Thr Pro 40 Ser Ser Gin Gly Thr 45 His Asn Gly
Cvs . Phe Tyr Ser Trp Trp Thr Asp Gly Gly Ala Gin Ala Thr Tyr Thr
55 60
PL 212 113 B1
Asn 65 Gly Ala Gly Gly Ser 70 Tyr Ser Val Asn Trp 75 Lys Thr Gly Gly Asn 80
Leu Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ala Ala Arg Thr Ile Thr
85 90 95
Tyr Ser Gly Thr Tyr Ser Pro Ser Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Glu Asn Phe
115 120 125
Gly Thr Tyr Asp Pro Ser Ser Gin Ala Thr Val Lys Gly Ser Val Thr
130 135 140
Ala Asp Gly Ser Ser Tyr Lys Ile Ala Gin Thr Gin Arg Thr Asn Gin
145 150 155 160
Pro Ser Ile Asp Gly Thr Gin Thr Phe Gin Gin Tyr Trp Ser Val Arg
165 170 175
Gin Asn Lys Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Met Lys Thr His Phe Asp
180 185 190
Ala Trp Ala Ala Lys Gly Met Lys Leu Gly Thr His Asn Tyr Gin Ile
195 200 205
Val Ala Thr Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser ^tl cl Gin Ile Thr Val
210 215 220
Asn Cys Ala
225
<210> 23
<2r L> . 201
<212> PRT
<213> S. commune
<400> : 23
Ala Ala Ser Gly Thr Pro Ser Ser Thr Gly Thr Asp Gly Gly Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Ser Trp Trp Thr Asp Gly Ala Gly Asp Ala Thr Tyr Gin Asn Asn
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Leu Thr Trp Ser Gly Asn Asn Gly Asn Leu
3 5 40 45
Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ala Ala Ser Arg Ser Ile Ser
50 55 60
Tyr Ser Gly Thr Tyr Gin Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr
65 70 75 50
Gly Trp Thr Arg Ser Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr
85 90 95
Gly Ser Tyr Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ser His Lys Gly Ser Val Thr
100 105 110
PL 212 113 B1
Cys Asn Gly 115 Ala Thr Tyr Asp Ile 120 Leu Ser Thr Trp Arg 125 Tyr Asn Ala
Pro Ser Ile Asp Gly Thr Gin Thr Phe Glu Gin Phe Trp Ser Vai Arg
130 135 140
Asn Pro Lys Lys Ala Pro Gly Gly Ser Ile Ser Gly Thr Val Asp Val
145 150 155 160
Gin Cys His Phe Asp Ala Trp Lys Gly Leu Gly Met Asn Leu Gly Ser
165 170 175
Glu His Asn Tyr Gin Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly
180 185 190
Thr Ala Thr Ile Thr Val Thr Ala Ser
195 200
<210> 24
<211> 225
<212> PRT
<213> 1 T. lanuginosus
<400> 24
Met Val Gly Phe Thr Pro Val Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ala Phe Pro Ala Gly Asn Ala Thr Glu Leu Glu Lys Arg Gin
20 25 30
Thr Thr Pro Asn Ser Glu Gly Trp His Asp Gly Tyr Tyr Tyr Ser Trp
35 40 45
Trp Ser .Asp Gly Gly Ala Gin Ala Thr Tyr Thr Asn Leu Glu Gly Gly
50 55 60
Thr Tyr Glu Ile Ser Trp Gly Asp Gly Gly Asn Leu Val Gly Gly Lys
65 “70 75 80
Gly Trp Asn Pro Gly Leu Asn Ala Arg Ala Ile His Phe Glu Gly Val
85 90 95
Tyr Gin Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Arg
100 105 110
Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr Asp
115 120 12 5
Pro Ser Ser Gly Ala Thr Asp Leu Gly Thr Val Glu Cys Asp Gly Ser
130 135 140
Ile Tyr Arg Leu Gly Lys Thr Thr Arg Val Asn Ala Pro Ser Ile Asp
145 150 155 160
Gly Thr Gin Thr Phe Asp Gin Tyr Trp Ser Val Arg Gin Asp Lys Arg
165 170 17 5
Thr Ser Gly Thr Val Gin Thr Glv Cys His Phe Asp Ala Trp Ala Arg
180 185 190
Ala Gly Leu Asn Val Asn Gly Asp His Tyr Tyr Gin Ile Val Ala Thr
195 200 205
PL 212 113 B1
Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Tyr Ala Arg Ile Thr Val, Ala Asp Val 210 215 220
Gly
225 <210> 25 <211> 231 <212> PRT <213> C. carbonum
<400> 25
Met Val Ser Phe Lys Ser Leu Leu Łeu Ala Ala Val Ala Thr Thr Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala Ala Pro Phe Asp Phe Leu Arg Glu Arg Asp Asp Val Asn
20 25 30
Ala Thr Ala Leu Leu Glu Lys Arg Gin Ser Thr Pro Ser Ala Glu Gly
35 40 45
Tyr His Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser Trp Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Ala Gin Tyr Thr Met Gly Glu Gly Śer Arg Tyr Ser Val Thr Trp Arg
65 70 75 8 0
Asn Thr Gly Asn Phe Val Gly Gly Łys Gly Trp Asn Pro Gly Ser Gly
85 90 95
Arg Val Ile Asn Tyr Gly Gly Ala Phe Asn Pro Gin Gly Asn Gly Tyr
100 105 110
Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Arg Aśn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val
115 120 125
Ile Glu Ser Tyr Gly Thr Tyr Asn Pro Ser Ser Gly Ala Gin Ile Lys
130 135 140
Gly Ser Phe Gin Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Asn Val Ais Val Ser Thr
145 150 155 160
Arg Tyr Asn Gin Pro Ser Ile Asp Gly Thr Arg Thr Phe Gin Gin Tyr
165 170 175
Trp Ser Vai Arg Thr Gin Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Asn Met Gin
180 185 190
Asn His Phe Asn Ala Trp Ser Arg Tyr Gly Leu Asn Leu Gly Gin His
195 200 205
Tyr Tyr Gin Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ser
210 215 220
Asp Ile Tyr Val Gin Thr Gin
225 230
<210> 26 <211> 231
PL 212 113 B1 <212> PRT <213> C. sativus <400> 25
Met 1 Val Ser Phe Lys 5 Ser L(3U Leu Le u ^\1 a 10 A1. a Val Al a Thr Thr 15 Ser
Vai Leu Ala Ala Pro Phe Asp Phe Leu Arg Glu Arg Asp Asp Gly Asn
20 25 30
Ala Thr Ala Leu Leu Glu Lys Arg Gin Ser Thr Pro Ser Ser Glu Gly
35 40 45
Tyr His Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser Trp Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Ala Gin Tyr Thr Met Gly Glu Gly Ser Arg Tyr Ser Val Thr Trp Arg
65 70 75 80
Asn Thr Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Thr Gly
85 90 95
Arg Val Ile Asn Tyr Gly Gly Al a Phe Asn Pro Gin GI v Asn Gly Tyr
100 105 110
Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Va 1 Glu Tyr Tyr Val
115 120 125
Ile Glu Ser Tyr Gly Thr Tyr Asn Pro Ser Ser Gly Ala .Gin Val Lys
130 135 140
Gly Ser Phe Gin Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Asn Val Ala Va 1 Ser Thr
145 150 155 160
Arg Tyr Asn. Gin Pro Ser Ile Asp G1 y Thr Arg Thr Phe Gin Gin Tyr
165 170 175
Trp Ser Val Arg Gin Gin Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Asn Met Gin
180 185 190
Asn His Phe Asn Ala Trp Ser Arg Tyr Gly Leu Asn Leu Gly Gin His
195 200 205
Tyr Tyr Gin Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ser
210 215 220
Asp Ile Tyr Val Gin Thr Gin
225 230
<210> 27
<211> 227
<212> PRT
<213> H. insolens
<400> 27
Met Val Ser Leu Lys Ser Val Leu Ala Al a Ala Thr Ala Val ger Ser
1 5 10 ł 3
PL 212 113 B1
Ala Ile Ala Ala 20 Pro Phe Asp Phe Val 25 Pro Arg Asp Asn Ser 30 Thr Ala
Leu Gin Ala Arg Gin Val Thr Pro Asn Al a Glu Gly Trp His Asn Gly
35 40 45
Tyr Phe Tyr Ser Trp Trp Ser Asp Gly Gly Gly Gin Val Gin Tyr Thr
50 55 60
Asn Leu Glu. Gly Ser Arg Tyr Gin Val Arg Trp Arg Asn Thr Gly Asn
65 70 75 80
Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Asn
85 90 95
Tyr Gly Gly Tyr Phe Asn Pro Gin Gly Asn Gly Tyr Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr
115 120 125
Gly Thr Tyr Asn Pro Gly Ser Gin Ala Gin Tyr Lys Gly Thr Phe Tyr
130 135 140
Thr Asp Gly Asp Gin Tyr Asp Ile Phe Val Ser Thr Arg Tyr Asn Gin
145 150 155 160
Pro Ser Ile Asp Gly Thr Arg Thr Phe Gin Gin Tyr Trp Ser Ile Arg
165 170 175
Lys Asn Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Asn Met Gin Asn His Phe Asn
180 185 190
Ala Trp Gin Gin His Gly Met Pro Leu Gly Gin His Tyr Tyr Gin Val
195 200 205
Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Glu Ser Asp Ile Tyr Val
210 215 220
Gin Thr His
225
<210> .28
<211> 233
<212> PRT
<213> M. grisea
<400> 28
Met 1 Val Ser Phe Thr 5 Ser Ile Val Thr Ala 10 Val Val Ala Leu Ala 15 Gly
Ser Ais Leu Ala 20 Ile Pro Ala Pro Asp 25 Gly Asn Met Thr Gly 30 Phe Pro
Phe Glu Gin 35 Leu Met Arg Arg Gin 40 Ser Thr Pro Ser Ser 4 5 Thr Gly Arg
His Asn 50 Gly Tyr Tyr Tyr Ser 55 Trp Trp Thr Asp Glv 60 Ala Ser Pro Val
PL 212 113 B1
Gin 65 Tyr Gin Asn Gly Asn Gly Gly Ser Tyr Ser Vai Gin Trp Gin Ser 80
70 75
Gly Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Met Pro Gly Gly Ser Lys
85 90 95
Ser Ile Thr Tyr Ser Gly Thr Phe Asn Pro Val Asn Asn Gly Asn Ala
100 105 110
Tyr Leu Cys Ile Tyr Gly Trp Thr Gin Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr
115 120 125
Ile Leu Glu Asn Tyr Giy Glu Tyr Asn Pro Gly Asn Ser Ala Gin Ser
130 135 140
Arg Gly Thr Leu Gin Ala A .1 ct Gly Gly Thr Tyr Thr Leu His Glu Ser
145 150 155 160
Thr Arg Val Asn Gin Pro Ser Ile Glu Gly Thr Arg Thr Phe Gin Gin
165 170 175
Tyr Trp Ala Ile Arg Gin Gin Lys Arg Asn Ser «y Thr Val Asn Thr
180 185 190
Gly Glu Phe Phe Gin Ala Trp Glu Arg Ala Gly Met Arg Met Gly Asn
195 200 205
His Asn Tyr Met Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr Arg Ser Ala Gly Ąsn
210 215 220
Ser Asn Ile Asn Val Gin Thr Pro Aj. a
225 230
<210> 29
<2ii> : 219
< 212 > PRT
<213> ( 2. gracile
<400> : 29
Met Val Ser Phe Lys Ala Leu Leu Leu Gly Ais Ala 1 y Ala Leu Ala
1 5 10 15
Phe Pro Phe Asn Val Thr Gin Met Asn Glu Leu Val Ala Arg Ala Gly
20 25 30
Thr Pro Ser Gly Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser Phe T isp
35 40 45
Thr Asp dy Gly Gly Thr Val Asn Tyr Gin Asn Glv Ala Gly Gly Ser
50 55 60'
Tyr Ser Val Gin Trp Gin Asn Cys Gly Asn Phe Vai Gly Gly Lys Giy
65 70 75 80
Trp Asn Pro Gly Ala Ala Arg Thr Ile Asn Phe Ser Gly Thr Phe Ser
85 90 95
Pro Gin Gly Asn Gly Tyr Leu Ala I le Tyr Gly Trp Thr Gin Asn Pro
100 105 110
Leu Vai Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Phe Gly Thr Tyr Asp Pro Ser
115 120 125
PL 212 113 B1
Ser Gin 130 Ala Ser Lys Phe Gly 135 Thr Ile Gin Gin Asp 140 Giy Ser Thr Tyr
Thr Ile 145 Ala Lys Thr Thr 150 Arg Val Asn Gin Pro 155 Ser Ile Glu Gly Thr 160
Ser Thr Phe Asp Gin 165 Phe Trp Ser Val Arg 170 Gin Asn His Arg Ser 175 Ser
Gly Ser Val Asn 180 Val Ala Ala His Phe 185 Asn Ala Trp Ala Gin 190 Ala Gry
Leu Lys Leu 195 Gly Ser His Asn Tyr 200 Gin Ile Val Ala Thr 205 Glu Gly Tyr
Gin Ser 210 Ser Gly Ser Ser Ser 215 Ile Thr Val Ser
<210> 30
<211> 223
<212> PRT
<213> T. reesei
<400> 30
Met 1 Val Ser Phe Thr 5 Ser Leu Leu Ala Gly 10 Val Ala Ala Ile Ser 15 Gly
Val Leu Ala Ala 20 Pro Ala Ala Glu Val 25 Glu Pro Val Ala Val 30 Glu Lys
Arg Gin Thr 35 Ile Gin Pro Gly Thr 40 Gly Tyr Asn Asn Giy 45* Tyr Phe His
Ser Tyr 50 Trp Asn Asp Gly His 55 Gly Gly Val Thr Tyr 60 Thr Asn Gly Pro
Gly 65 Gly Gin Phe Ser Val 70 Asn Trp Ser Asn Ser 7 5 Gly Asn Phe Val Gly 30*
Gly Lys Gly Trp Gin 85 Pro Gly Thr Lys Asn 90 Lys Val Ile Asn Phe 95 Ser
Gly Ser Tyr Asn 100 Pro Asn Gly Asn Ser 105 Tyr Leu Ser Vai Tyr 110 Gly Trp
Ser Arg Asn 115 Pro Leu Ile Glu Tyr 120 Tyr Ile Val Gly Asn 125 Phe Gly Thr
Tyr Asn 130. Pro Ser Thr Gly Ala 135 Thr Lys Leu Gly Glu 140 Val Thr Ser Asp
Gl y 145 Ser Val Tyr Asp Ile 150 Tyr Arg Thr Gin Arg 155 Val Asn Gin Pro Ser 160
Ile Ile Gly Thr Ala 165 Thr Phe Tyr Gin Tyr 170 Trp Ser Val Arg Arg IGS Asn
His Arg Ser Ser 180 dy Ser Val Asn Thr 185 Ala Asn His Phe Asn 190 Ala Trp
PL 212 113 B1
Ala Gin Gin Gly Leu Thr 1, Gly Thr Met Asp Tyr Gin Ile Val Ala
195 200 205
Val Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser
210 215 220
<210> 31
<211> 223
<212> PRT
<213> T. reesei
<40 0> 31
Met Val Ser Phe Thr Ser Leu Leu Ala Gly Val Ala Ala Ile Ser Gly
1 5 10 15
Val Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Val Glu Ser Val Aid Val Glu Lys
20 25 30
Arg Gin Thr Ile Gin Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr
35 40 4 5.
Ser Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro
50 55 60
Gly Gly Gin Phe Ser Val Asn Trp t Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly
65 70 75 30
Gly Lys Gly Trp Gin Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp
100 105 110
Ser Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr
115 120 125
Tyr Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp
130 135 140
Gly Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gin Arg Val Asn Gin Pro Ser
145 150 155 160
Ile Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gin Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn
165 170 175
His Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp
180 135 190
Ala Gin Gin Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gin Ile Val Ala
195 200 205
Val Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Giy Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser
210 215 . 220
<2I0> 32
<21i> 222
<212> PRT
<213> T .
PL 212 113 B1 <400> 32
Met 1' Val Ser Phe Thr 5 Ser Leu Leu Ala Ala 10 Ser Pro Pro Ser Arg 15 Ala
Ser Cys Arg Pro Ala Ala Glu Val Glu Ser Val Ala Yal Glu Lys Arg
20 25 30
Gin Thr Ile Gin Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser
35 40 45
Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Va x Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly
50 55 60
Gly Gin Phe Ser Vał Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly
65 70 75 80
Łys Gly Trp Gin Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly
85 90 95
Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser
100 105 110
Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr
115 120 12 5
Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Glv Glu Val Thr Ser Asp Gly
130 135 140
Ser Yal Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gin Arg Val Asn Gin Pro Ser Ile
145 150 155 160
Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gin Tyr Trp Ser Val Arg Arg .Asn His
165 170 i 7 c
Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala
180 18S 190
Gin Gin Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gin Ile Val Al 5 Yal
195 200 205
Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Yal Ser
21Ó 215 220
<210> 33
<21 i>; 190
<212> PRT
<213> T. harzianum
<400> 33
Gin Thr Ile Gly Pro Gly Thr Gly Tyr Ser Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser
I 5 10 15
Tyr Trp Asn Asp Gly His Ala Gly Yal Thr Tyr Thr Asn Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Phe Thr Yal Asn Trp Ser Asn Ser Giy Asn Phe Yal Al a Gly
40 4
PL 212 113 B1
Lys Gly 50 Trp Gin Pro Gly Thr 55 Lys Asn Lys Val Ile 60 Asn Phe Ser Gly
Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Ile Tyr Gly Trp Ser
65 70 75 80
Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr
35 90 95
Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Giy
100 105 l 10
Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr 1 n Arg Val Asn Gin Pro Ser Ile
115 120 125
Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gin Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His
130 135 140
Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Al a Asn His Phe Asn Ala Trp Ala
145 150 155 160
Ser His Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gin Ile Val Ala Val
165 170 175
Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr vai Ser
180 185 190
<210> 34
<211> 223
<212> PRT
<213> T. viride
<400> : 34
Met Val Ser Phe Thr Thr Leu Leu Ala Gly Phe Val Ala Vał Thr Giy
1 c 10 15
Val Leu Ser Ala Pro Thr Glu Thr Val Glu Val Val Asp Val Glu Lys
20 25 30
Arg Gin Thr Ile Gly Pro Gly Thr Gly Phe Asn Asn Gly Tyr Tyr Tyr
35 40 45
Ser Tyr Trp Asn Asp Gly His Ser Gly Vai Thr Tyr Thr Asn Gly Ala
50 55 60
Gly Gly Ser Phe Ser Val Asn Trp Ala Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly
65 70 75 80
Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ser Ser Arg Val Ile Asn Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Ąsn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Giy Trp
100 105 110
Ser Lys Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe G1 y Thr'
115 120 125
Tyr Asn Pro Ser Thr Gly Thr Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp
130 135 14 0
PL 212 113 B1
Gly Ser 145 Val Tyr Asp Ile 150 Tyr Arg Thr Gin Arg 155 Val Asn Gin Pro Ser 160
Ile Ile Gly Thr Al a Thr Phe Tyr Gin Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn
165 170 175
His Ala Pro Al a Ala Arg Ser Arg Leu Arg Thr Thr Ser Asn Ala Trp
.180 185 190
Arg Asn Leu dy Leu Thr Leu Giy Thr Leu Asp Tyr Gin Ile Ile Ala
195 200 205
Val Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Asn Ala Asn Ile Asn Val Ser
210 215 220
<210> 35
<211> 241
<212> PRT
<213> C. gracile
<4oo> : 35
Met Val Asn Phe Ser Ser Leu Phe Łeu Ala Ala Ser Ala Ala Val Vai
1 5 10 15
Ala Val Ala Ala Pro Gly Glu Leu Pro Gly Met His Lys Arg Gin Thr
20 25 30
Leu Thr Ser Ser Gin Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Tyr .Tyr Ser Phe
35 40 45
Trp Thr Asp Gly Gin Gly Asn Val Gin Tyr Thr Asn Glu Ala Gly Gly
50 55 60
Gin Tyr Ser Val Thr Trp Ser Gly Asn Gly Asn Trp Val Gly Gly Lys
65 70 75 80
Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ala Arg Thr Ile Asn Tyr Thr Ala Asn Tyr
85 90 95
Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn
100 105 110
Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr Asn Pro
115 120 125
Ser Thr Gly Ala Thr Arg Leu Gly Ser Val Thr Thr ASp Giy Ser Cys
130 135 140
Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gin Arg Val Asn Gin Pro Ser I ie i j i Łi Gly
145 150 155 160
Thr Ser Thr Phe Tyr Gin Phe Trp Ser Val Arg Gin Asn Lys Arg Ser
165 170 ' *7
Gly Gly Ser Val Asn Met Ala Ala His Phe Asn Ala Trp Ala Ala Ala
180 '185 190
Gly Leu Gin Leu Gly Thr His Asp Tyr Gin Ile V a I Ara Thr 1 sj Gly
195 200 205
Tyr Tyr Ser Ser Gly Ser Ala Thr Val Asn Val Gly Ala Ser Ser Asp
PL 212 113 B1
210 215 220
Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asn Val Ser 225 230 235 240
Phe <210> 36 <211> 225 <212>- PRT <213> A. niger <400 36
Met 1 Leu Thr Lys Asn 5 Leu Leu Leu Cys Phe 10 Ala Ala Ala Lys Ala 15 Ala
Leu Ala Val Pro His Asp Ser Val Ala Gin Arg Ser Asp Ala Leu His
20 25 30
Met Leu Ser Glu Arg Ser Thr Pro Ser Ser Thr Gly Glu Asn Asn Gly
35 40 45
Phe Tyr Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Gly Gly Gly Asp Vał Thr Tyr Thr
50- 55 60
Ash Gly Asp Ala Giy Ala Tyr Thr Val Glu Trp Ser Asn Val Gly Asn
65 70 75 80
Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ala Gin Asp Ile
85 90 95
Tyr Ser Gly Thr Phe Thr Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ser Val Tyr
100 105 110
Gly Trp Thr Thr Asp Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr
115 120 125
Gly Asp Tyr Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr
130 135 140
Ser Asp Gly Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Thr Ala Thr Arg Thr Asn Ala
145 150 155 160
a Ser Ile Gin Gly Thr Ala Thr Phe Thr Gin Tyr Trp Ser val Arg
165 170 175
Gin Asn Lys Arg Val Gly Gly Thr Val Thr Thr Ser Asn His Phe Asn
180 185 190
Ala Trp Ala Lys Leu Gly Met Asn Leu Gly Thr His Asn Tyr Gin Ile
195 200 205
Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Thr Val
210 215 220
Gin
225 <210> 37
PL 212 113 B1
<2łl> 221
<212> PRT
<213> Penicillium sp 40
<400> 37
Met 1 Lys Ser Phe Ile 5 Ala Tyr Leu Leu Ala 10 Ser Vai Ala Val Thr 15 Gly
Val Met Ala Val Pro Gly Glu Tyr His Lys Arg His Asp Lys Arg Gin
20 25 30
Thr Ile Thr Ser Ser Gin Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser
35 40 45
Phe Trp Thr Asn Gly Gly Gly Thr Val Gin Tyr Thr Asn Gly Al a Ala
50 55 60
Gly Glu Tyr Ser Val Thr Trp Glu Asn Cys Gly Asp Phe Thr Ser Gly
65 70 75 80
Lys Gly Trp Ser Thr Gly Ser Ala Arg Asp Ile Thr Phe Glu Gly Thr
85 90 95_
Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Thr
100 105 110
Ser Pro Leu Val Glu ψ V2? gyr Ile Leu Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn
115 120 125
Pro Gly Asn Ser Met Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Ser
130 135 140
Val Tyr Asp Il.e Tyr Glu His Gin Gin Val Asn Gin Pro S θ 17 1 i β Ser
145 150 155 160
Gly Thr Aia Thr Phe Asn Gin Tyr Trp Ser Ile Arg Gin Asn Thr Arg
165 170 . 175
Ser Ser Gly Thr Val Thr Thr Ala Asn His Phe Asn Al a Trp Ala Lys
180 ' 185 190
Leu Gly Met Asn Leu Gly Ser Phe Asn Tyr Gin Ile Val Ser Thr Glu
195 200 205
Gly Tyr Glu Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Thr Val Ser
210 215 220
<210> 38
<211> 24 0 .
<212> PRT
<213> Streptomyces
<400> 38
Met Gin Gin Asp Gly Lys Arg Gin Asp Gin Asn Gin Gin Asn Pro Ala 1 5 10 15
PL 212 113 B1
Pro Phe Ser Gly Leu Ser Arg Arg Gly Phe Leu Gly Gly Ala Gly Thr
20 25 30
Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Gly Leu Leu Leu Pro Ser Thr Ala His
35 40 45
Ala Ala Thr Thr Ile Thr Thr Asn Gin Thr Gly Tyr Asp Gly Met Tyr
50 55 60
Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Gly siy Gly Ser Val Ser Met Thr Leu Asn
65 70 7 7 80
Gly Gly Gly Ser Tyr Ser Thr Gin Trp Thr Asn Cys Gly Asn Phe Vai
85 90 95
Ala Gly Lys Gly Trp Gly Asn Gly Gly Arg Arg Thr Val Arg Tyr Ser
100 105 110
Gly Tyr Phe Asn Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Gly Cys Leu Tyr Gly Trp
115 120 125
Thr Ser Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Ser
130 135 140
Tyr Arg Pro Thr Gly Glu Tyr Arg Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Gly
145 150 155 160
Thr Tyr Asp Ile Lys Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Val Glu
165 170 ps
Giy Thr Arg Thr Phe Asp Gin Tyr Trp Ser Val Arg Gin Ser Lys Val
ISO 185 '190
Ile Gly Ser Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp -Ala Trp Al a
195 200 205
Arg Ala Gly Met Asn Łeu Gl y Gin Phe Gin Tyr Tyr Met Ile Met Ala
210 215 220
Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ser Asn Σ1Θ Thr Val Ser Giy
225 230 235 240
<210> 39 <211> 228 <212> PRT
<213> Streptomyces SP
<400> 39
Met Thr Lys Asp Asn Thr Pro Ile Arg Pro Val Ser Arg Arg Gly ' Phe
1 5 10 15
Ile Gly Arg Ala Gly Ala Leu Ala Leu Ala Thr Ser Gly Leu Met Leu
20 25 30
Pro Gly Thr Ala Arg Ala Asp Thr Val Ile Thr Thr Asn Gin Thr G i y
35 40 45
Thr Asn Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Gly G1 v Gly Ser
50 55 60
Val Ser Met Asn Leu Ala Ser Gly Gly Ser Tyr Gly Thr Ser Trp Thr
65 70 75 30
PL 212 113 B1
Asn Cys Gly Asn Phe Val Ala Gly Lys Gly Trp Ala Asn Gly Ala Arg
85 90 95
Arg Thr Val Asn Tyr Ser Gly Ser Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr
100 105 110
Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Ala Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile
115 120 125
Val Asp Asn Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr
130 135 140
Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Val Tyr Gin Thr Thr Arg Val
145 150 155 160
Asn Ala Pro Ser Val Glu Gly Thr Łys Thr Phe Asn Gin Tyr Trp Ser
165 no 175
Val- Arg Gin Ser Lys Arg Thr G1 y Gly Ser Ile Thr Ala Gly Asn His
180 185 190
Phe Asp Ala Trp Ala Arg Tyr Gly Met Pro Leu Gly Ser Phe Asn Tyr
195 200 205
Tyr Met Ile Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ser Ser
210 215 220
Ile Ser Val Ser
225
<21C )> 4 0
<211 .> 2 39
<212 :> p !RT
<212 !> S thermocyaneoviolaceus
<400> 40
Met Asn Thr Leu Val His Pro Gin Gly Arg Ala Gly Gly Leu Arg Leu
1 5 10 15
Leu Val Arg Ala Ala Trp Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Met
20 25 30
Mąt Phe Gly Gly Thr Ala Arg Ala Asp Thr Ile Thr Ser Asn Gin Thr
35 40 45
Gly Thr His Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Ala Pro Gly
, 50 55 60
Thr Val Thr Met Asn Thr Gly Ala Gly Gly Asn Tyr Ser Thr Gin Trp
65 70 75 80
Ser Asn Thr Gly Asn Phe Val Ala Gly Lys Gly Trp Ai a Thr Gly Gly
S5 90 95
Arg Arg Thr Val Thr Tyr Ser Gly Thr Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala
100 105 110
Tyr Leu Ala Leu Tyr ciy Trp Ser Gin Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr
115 . 120 125
PL 212 113 B1
Ile Val Asp Asn Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Giy Thr Tyr Lys Gly
130 135 140
Thr Val Tyr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Met Thr Thr Arg
145 150 155 160
Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Thr Lys Thr Phe Asn Gin Tyr Trp
165 170 175
Ser Val Arg Gin Asn Lys Arg Thr Gly Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn
180 185 190
His Phe Asp Ala Trp Ala Ala His Gly Met Pro Leu Gly Thr Phe Asn
195 200 205
Tyr Met Ile Leu Al a Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ser Asn
210 215 220
Ile Thr Val Gly Asp Ser Gly Gly Asp Asn Gly Gly Gly Gly Gly
225 230 235
<210> 41
<211> 242
<212> PRT
<213> . S. viridosporus
<400> 41 '
Met .Asn Ala Phe Ala His Pro Arg Gly Arg Arg His Gly Arg Ser Ala
1 5 10 15
Pro Męt Ser Pro Arg Ser Thr Trp Ala Val Leu Leu Ala Ala Leu Ala
20 25 30
Vai Met Leu Leu Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ala Pro Val Ile Thr Thr
35 40 45
Asn· Gin Thr Gly Thr Asn Asn Gly Trp Trp Tyr Ser Phe Trp Thr Asp
' 50 55 60
Ala Gin Gly Thr Val Ser Met Asp Leu Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Ser
65. 70 75 80
Thr Gin Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Vał Ala Gly Lys Gly Trp Ser
85 90 95
Thr Gly Gly Arg Lys Thr Val Asn Tyr Ser Gly Thr Phe Asn Pro Ser
100 105 110
Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Thr Gly Pro Leu Ile
115 120 125
Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Lys
130 135 140
Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys
145 150 155 160·
Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Thr Lys Thr Phe Asp
165 170 175
Gin Tyr Trp Ser Val Arg Gin Ser Lys Arg Thr Gly Gly Thr Ile Thr
180 185 190
PL 212 113 B1
Ser Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg Asn Gly Met Asn Leu Gly
195 200 205
Asn His Asn Tyr Met Ile Met ił Thr Glu Giy Tyr Gin Ser Ser Gly
210 215 220
Ser Ser Thr Tle Thr Val Ser Glu Ser Gly Ser Gly Giy Gly Gly Gly
225 230 235 240
Giy Gly
< 210 > 42
<2U> 240
<212> PRT
<213> T. fusca
<4 Oi 3> 42
Met Asn His Ala Pro Ala Ser Leu Lys Ser Arg Arg Apg Phe Arg Pro
1 5 10 - c
Arg Leu Leu Ile Gly Lys Ais Phe Ala Ala Ala Leu Val Ala V a .t V 51
20 25 30
Thr Met Ile Pro Ser Thr Ala Ala His Ala Ala Val Thr Ser Asn Glu
35 40 4 5
Thr Gly Tyr His Asp Gly Tyr Phe Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Ala Pro
50 55 60
Giy Thr Val Ser Met Glu Leu Gly Pro Gly Gly Asn Tyr Ser Thr Ser
65 70 75 80
Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val Ala Gly Lys Gly Trp Ala Thr Gly
85 90 95
Gly Arg Arg Thr Val Thr Tyr Ser Ala Ser Phe Asn Pro Ser Gly Asn
100 105 110
Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Vai Glu Tyr
115 120 125
Tyr Ile Val Glu Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Met
130 135 140
Gly Thr Val Thr Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Asp i l. Tyr Lys Thr Thr
145 150 155 160
Arg Tyr Asn. Ala Pro Ser I le Glu Gly Thr Arg Thr Phe Asp Gin Tyr
165 170 175
Trp Ser Val Arg Gin Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Thr Ala Gly
180 185 190
Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg His Gly Met His Leu Gly Thr His
195 200 205
Asp Tyr Met Ile Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Giy Ser Ser
'210 215 220
PL 212 113 B1
Asn Val Thr Leu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Asn Pro Gly Gly Gly Asn 225 . 230 235 240 <210> 43 <211> 241 <212> PRT <213> C. pachnodae <400> 43
Met 1 Thr Arg Thr I le 5 Ser Arg Ala Ala His 10 Arg Pro Pro Ala Gly L5 Gly
Arg Tle Ala Arg Ala Leu Ala Ala Ala Gly Ala Thr Val Ala Met Val
20 25 30
Ile Ala Gly Val Ala Ala Ala Gin Pro Ala Ala Ala Val Asp Ser Asn
35 40 45
Ser Thr Gly Ser Ser Gly Gly Tyr Phe Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Ala
50 55 60
Pro Gly Thr Val Ser Met Asn Leu Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Thr
65 30 75 80
Ser Trp Ser Asn Thr Gly Asn Phe Val Ais Gly Lys Gly Trp Ser Thr
85 90 95 .
Gly Ser Ala Arg Thr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Phe Asn Pro Se r G r y
100 105 110
As ii Ala Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Ser His Asp Pro Leu Val Glu
115 120 125
Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Phe
130 135 140
Met Gly Thr Val Asn Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Thr Ala Thr Phe Thr Gin
165 170 175
Tyr Trp Ser Vai Arg Gin Ser Lys Arg Val Gly Gly Thr Tle Thr Thr
180 185 190
Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Ser His Gly Met Asn Leu Gly Arg
195 200 205
His Asp Tyr Gin Ile Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser
210 215 220
Ser Asn Ile Thr Ile Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly <210> 44
221
PL 212 113 B1 <212> PRT <213> A. oryzae <400> 44
Met 1 Val Ser Phe Ser 5 Ser Leu Leu Leu Ala 10 Val Ser Ala Val Ser 15 Gly
Ala Leu Ala Ala Pro Gly Asp Ser Thr Leu Val Glu Leu Ala Lys Arg
20 25 30
Ala Ile Thr Ser Ser Glu Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser
35 40 45
Phe Trp Thr Asn Gly Gly Gly Asp Val Glu Tyr Thr Asn Gly Asn Gly
50 55 60
Gly Gin Tyr Ser Val Lys Trp Thr Asn Cys Asp Asn Phe Val Ala Gly
65 70 75 80
Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ala Lys Thr Val Thr Tyr Ser Gly Glu
85 90 95
Trp Glu·' Ser Asn Ser Asn Ser Tyr Val Ser Leu Tyr Gly Trp Thr Gin
100 105 110
Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Lys Tyr Gly Asp Tyr Asp
115 120 125
Pro Ser Thr Gly Ala Thr Glu Leu Gly Thr Val Glu Ser Asp Gly Gly
130 135 140
Thr Tyr Lys Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Glu Asn Ala Pro Ser Ile Glu
14 5 150 155 160
Gly Thr Ser Thr Phe Asn Gin Tyr Trp Ser Val Arg Gin Ser Gly Arg
165 170 17 5
Val Gly Gly Thr Ile Thr Ala Gin Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Asn
180 185 190
Val Gly Leu Gin Leu Gly Thr His Asn Tyr Met Ile Leu Al a Thr Glu
195 200 205
Gly 'Tyr Lys Ser Ser Gly Ser Ala Thr Ile Thr Val Glu
210 215 220
<210 45.
<211> 2 ‘16-
<212> PRT
<213> C :. purpurea
<400> 45
Met Phe Leu Thr Ser Val Val Ser Leu Val Val Giy Ala Ile Ser Cys
1 5 10 ' 15
Val Ser Ala Ala Pro .1 ci Ala Ais Ser Glu Leu Met Gin Met Thr Pro
25 30
PL 212 113 B1
Arg Asn Ser 35 Cys Tyr Gly Gly Gly Leu Tyr 40 Ser Ser Tyr 45 Trp Ala Asp
Tyr Gly Asn Thr Arg Tyr Ser Cys Gly Al a Gly Gly His Tyr Asp Leu
50 55 60
Ser Trp Gly Asn Gly Gly Asn Val Val Ala Gly Arg Gly Trp Lys Pro
65 70 75 80
Ala Ser Pro Arg Ala Val Thr Tyr Ser Gly Ser Trp Gin Cys Asn Gly
85 90 95
Asn Cys Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Thr I le Asn Pro Leu Vai Glu
100 105 110
Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Tyr Gly Asn Tyr Asn Pro Ser Ala Gly Ais
115 120 125
Gin Arg Arg Gly Gin Val Thr Ala Asp Gly Ser Ile Tyr Asp Ile Tyr
130 135 140
Ile Ser Thr Gin His Asn Gin Pro Ser Ile Leu Gly Thr Asn Thr Phe
145 150 155 160
His Gin Tyr W Ser Ile Arg Arg Asn Lys Arg Val Gly Gly Thr Val
165 170 175
Ser Thr Gly Val His Phe Asn Ala Trp Arg Ser Leu Gly Met Pro Leu
180 185 190
Gly Thr Tyr Asp Tyr Met Ile Val Ala Thr Glu Gly Phe Arg Ser Ser
195 200 205
Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser
210 215
<210> 46
<211> 236 .
<212> PRT
<213> C. mixtus
<400> 46
Met 1 Lys Phe Pro Leu 5 Ile Gly Lys Ser Thr 10 Leu Ala Ala Leu Phe 15 Cys
Ser Al a Leu Leu Gly Val Asn Aśn Thr Gin Ala Gin Thr Leu Thr Asn
20 25 30
Asn Ala Thr Gly Thr His Asn Gly Phe Tyr Tyr Thr Phe Trp Lys Asp
35 40 45
Ser Gly Asp Ala Ser Met Gly Leu Gin Ala Gly Gly Arg Tyr Thr Ser
50 55 60
Gin Trp Ser Asn Gly Thr Asn Asn Trp Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn
65 70 75 80
Pro Gly Gly Pro Lys Val Val Thr Tyr Ser Gly Ser Tyr Asn Val Asp
85 90 95
PL 212 113 B1
Asn Ser Gin Asn 100 Ser Tyr Leu Ala Leu 105 Tyr Gly Trp Thr Arg 110 Ser Pro
Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr Gly Ser Tyr Asn Pro Ala
115 120 125
Ser Cys Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Gly Ser Phe Gin Ser As? Gly Ala
130 135 140
Thr Tyr Asn Val Arg Arg Cys Gin Arg Val Gin Gin Pro Ser Ile Asp
145 150 155 160
Gly Thr Gin Thr Phe Tyr Gin Tyr Phe Ser Val Arg Ser Pro Lys Lys
165 170 175
Gly Phe Gly Gin Ile Ser Gly Thr I le Thr Thr Ala Asn His Phe Asn
180 185 190
Phe Trp Ala Ser Lys Gly Leu Asn Leu Gly Asn His Asp Tyr Met Val
195 200 205
Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Arg Gly Ser Ser Asp Ile Thr Val
210 215 220
Ser Glu Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ser Ser Ser Val
225 230 235
<210> 47
<211> 237
<211 PRT
< 213> P. fluorescens cellulosa
<4 00> 47
Met Lys Leu Pro Thr Leu Gly Lys Cys Val Val Arg Thr Leu Met Gly
1 5 10 15
Ala Val Ala 1, C Li Gly Ala Ile Ser Val Asn Ala Gin Thr Leu Ser Ser
20 25 30
Asn Ser Thr Gly Thr Ąsn Asn Gly Phe Tyr Tyr Thr Phe TtP Asp
35 40 45
Ser Gly Asp Al a Ser Met Thr Leu Leu Ser Gly Gly Arg Tyr Gin Ser
50 55 60
Ser Trp Gly Asn Ser Thr Asn Asn Trp Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn
65 70 75 80
Pro Gly Asn As n Ser Arg Val Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Tyr Gly Va 1
85 90 95
Asp Ser Ser Gin Asn Ser Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser
100 105 110
Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr Gxv Ser Tyr Aśn Pro
115 120 125
Ala Ser Cys Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Gly Ser Phe Gin Ser Asp Gly
130 135 140
Ala Thr Tyr Asn Val Arg Arg Cys Gin Arg Val Asn Gin Pro Ser 1 L €
145 150 155 160
PL 212 113 B1
Asp Gly Thr Gin Thr 165 Phe Tyr Gin Tyr Phe 170 Ser Val Arg Asn Pro 17 5 Lys
Lys Gly Phe Gly Asn Ile Ser Gly Thr Ile Thr Phe Ala Asn His Val
180 185 190
Asn Phe Trp Ala Ser Lys Gly Leu Asn Leu Gly Asn His Asn Tyr Gin
195 200 205
Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Arg Gly Ser Ser Asp ile Thr
210 215 220
Val Ser Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Thr Ser Ser Val
225 230 235
<210> 49
<211> 217
<212> PRT
<213> P. cochleariae .
<400>. - ie
Met Gin Phe Leu Ile Pro Val Val Ile Leu Cys Val Ser Leu Val Asp
1' 5 ' 10 15
Ser Gin Lys Val Leu Tyr Asn Asn Glu Ile Gly Phe Asn Asn Gly Phe
20 25 3Ό
Tyr Tyr Ala Phe Trp Lys Asp Ser Gly Ser Ala Thr Phe Thr Leu Glu
35 40 45
Ser Gly Gly Arg Tyr· Ala Gly Asn Trp Thr Thr Ser Thr Asn Asr, Trp
50 55 60
Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Asn Ser Trp Arg Thr Val Asn
65 70 75 80
Tyr Ser Gly Tyr Tyr dy Ile Asn Glu Tyr Ala Asn Ser Tyr Leu Ser
85 90 95
Leu Gly Trp Thr Thr Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Glu
100 105 no
Ser Tyr Gly Ser Tyr Ser Pro Leu Asn Cys Pro Gly dy Thr Asp Glu
115 120 125
Gly Ser Phe Thr Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Gin Val Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Arg Thr Asn Ala Pro Ser Tle Ile Gly Thr Gin Ser Phe Asp Gin Tvr
145 150 155 160
Phe Ser Val Arg Thr Pro Lys Lys Gly Phe Gly Gin Val Ser Gly Ser
165 170 175
Vał Asn Phe Ala Asp His Val Gin Tyr Trp Ala Ser Lys Gly Leu Pro
180 185 190
Leu Gly Thr His Ala His Gin Ile Phe Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser
195 200 205
PL 212 113 B1
Ser Gly Phe Ala Asp Ile Thr Val Ser 210 215
<210> 49
<211> 182
<212> PRT
<213> A.
<400> 49
Ala 1 Gly Ile Asn Tyr 5 Val Gin Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp Phe
10 15
Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp Gly
20 2 5 30
Val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser
35 40 45
Asn Ala ' Ile Thr Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ser Ser
50 55 60
Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gin Ala Glu Tyr Tyr
65 70 75 80
Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr Ser
35 90 95
Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp dy Ser Thr Tyr Gin Val. .Cys Thr Asp
100 105 no
Thr Arg Thr Asn Glu- Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr Gin
115 120 125
Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val
130 135 140
Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala Gin His Gly Phe Gly Asn Ser Asp
145 150 155 160
Phe Asn Gin Val Met Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala Gly Ser
165 170 175
Ala Ser Val Thr Ile Ser
180
<210> ! 50
<211> , 211
<212> : PRT
<213> i A. niger
<400> ! 50
Met Lys Val Thr Ala Ala Phe Ala Giy Leu Leu val Thr Ala Phe Ala
1 5 10 15
Ala Pro Val Pro Glu Pro Val Leu Val Ser Arg Ser Ala Gly Ile Asn
20 25 30
PL 212 113 B1
Tyr Val Gin 35 Asn Tyr Asn Gly Asn 40 Leu Gly Asp Phe Thr 45 Tyr Asp Glu
Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp Gly Val Ser Ser Asp
50 55 60
Phe Val Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Lys Ala Ile Thr
65 70 75 80
Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Vai
85 90 95
Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro G1 n Ala Glu Tyr Tyr i Val Glu Asp
100 105 110
Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr Ser Leu Gly Thr Val
115 120 125
Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Val Cys Thr Asp Thr Arg Thr Asn
130 135 140
Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr Gin Tyr Phe Ser Val
145 ' 150 155 160
Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Ara Asn His Phe
165 170 175
Asn Phe Trp Ala Gin His Gly Phe Gly Asn Ser Asp Phe Asn Tyr Gin
180 185 190
Val Met Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala Gly Ser Ala Ser Val Thr
195 200 205
Ile Ser Ser
210
<210> 51
<211> 210
<212> PRT
<213> . A .tubigensis ,:
<400> 51
Met Lys Val Thr Ala Ala Phe Ala Gly Leu Leu Val Thr Ala Phe Ala
1 5 10 1 5
Ala Pro Ala Pro Glu Pro Asp Leu Val Ser Arg Ser Ala Gly Ile Asn
20 25 30
Tyr Val Gin Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp Phe Thr Tyr Asp Glu
35 40 45
Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp Gly Val Ser Ser Asp
50 55 60
Phe Val val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Thr Ile Thr Tyr
65 70 75 80
Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Leu Ala Val Tyr
85 90 95
PL 212 113 B1
Gly Trp Val Asn Tyr 100 Pro Gin Ala Glu 105 Tyr Tyr Ile Val Glu 110 Asp Tyr
Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr Ser Leu Gly Thr Val Tyr
115 120 125
Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gin val Cys Thr Asp Thr Arg Thr Asn Glu
130 135 140
Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr Gin Tyr Phe Ser Val Arg
145 150 155 160
Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Ala Asn His Phe Asn
165 170 175
Phe Trp Ala His His Gly Phe Gly Asn Ser Asp Phe Asn Tyr Gin Val
180 185 190
Val Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala Gly Ser Al a Ser Val Thr Ile
195 200 205
Ser Ser
210
<210> 52
<2il> 206
<21; >> PRT
<213> P, purpurogenum
<400> 52
Met Lys Val Thr Ala Ala Phe Ala Gly Leu Leu Ala Arg His Ser Pro
7 5 10 15
Pro Leu Ser Thr Glu Leu Val Thr Arg Ser Ile Asn Tyr Val Gin Asn
20 25 30
Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Ala Phe Ser Tyr Asn Glu Gly Ala Gly Thr
35 40 45
Phe Ser Met Tyr Trp Gin Gin Giy val Ser Asn Asp Phe Val Val Gly
50 55 60
Leu Gly Arg Ser Thr Giy Ser Ser Asn Pro Ile Thr Tyr Ser Ala Ser
65 70 75 80
Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Giy Trp Val Asn
35 90 95
Ser Pro Gin Ala Glu Tyr Tyr Val Val Glu Ala Tyr Gly Asn Tyr Asn
100 105 110
Pro Cys Ser Ser Gly Ser Ala Thr Asn Leu Giy Thr Val Ser Ser Asp
115 120 125
Gly Gly Thr Tyr Gin Val Cys Thr Asp Thr Arg Val Asn Gin Pro Ser
130 135 140
Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr Gin Phe Phe Ser Val Arg Gin Gly
14 5 150 155 160
Ser Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Ile Ala Asn His Phe Asn Phe Trp
165 170 175
PL 212 113 B1
Ala Asn Asp Gly Phe Gly 180 Asn Ser Asn 185 Phe Asn Tyr Gin Val 190 val Ala
Val Glu Ala 195 Trp Ser Gly Thr Gly 200 Thr Ala Ser Val Thr 205 Val Ser Ala
<210> 53
<211> 233
<212> PRT
<213> P. purpurogenum
<40C !> ! 53
Met Lys Val Thr Ala Ala Phe Ala Gly Leu Leu Ala Arg His Ser Pro
1 £ 10 15
Pro Leu Ser Thr Glu Leu Val Thr Arg Ser Ile Asn Tyr Val Gin Asn
20 25 30
Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Ala Phe Ser Tyr Asn Glu Giy Ala Gly Thr
35 40 45
Phe Ser Met Tyr Trp Gin Gin Gly Val Ser Asn Asp Phe Val Val Gly
50 55 60
Leu Gly Arg Ser Thr Gly Ser Ser Asn Pro Ile Thr Tyr Ser Ala Ser
65 70 75 80
Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn
85 90 95
Ser Pro Gin Ala Glu Tyr Tyr Val Val Glu Ala Tyr Giy Asn Tyr Asn
100 105 110
Pro Cys Ser Ser Gly Ser Ala Thr Asn Leu Gly Thr Val Ser Ser Asp
115 i 2 0 125
Gly Gly Thr Tyr Gin Val Cys Thr Asp Thr Arg Val Asn Gin Pro Ser
130 135 140
Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr Gin Phe Phe Ser Vai Arg Gin Giv
145 150 155 160
Ser Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Ile Ala Asn His Phe Asn Phe Trp
165 170 17 5
Ala Asn Asp Gly Phe Gly Asn Ser Asn Phe Asn Tyr Gin Val Val Ala
130 185 190
Val Glu Ala Trp Ser Gly Thr Gly Thr Ala Ser Val Thr Val Ser Ala
195 200 205
Asn Phe Asn Tyr Gin Val Leu Ala Val Glu Gly Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Asn Ala Asn Met Lys Leu Ile Ser Gly
225 230
'-.z. 10 i* . 54
<211> . 229
PL 212 113 B1 <212> PRT <213> Τ. reesei <400> 54
Met 1 Val Ala Phe Ser 5 Ser Leu Ile Cys Ala 10 Leu Thr Ser Ile Ala 15 Ser
Thr Leu Ala Met Pro Thr Gly Leu Glu Pro Glu Ser Ser Yal Asn Val
20 25 30
Thr Glu Arg Gly Met Tyr Asp Phe Val Leu Gly Ala His Asn Asp His
35 40 45
Arg Arg Arg Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gin Asn Gin Thr Gly Gly
50 55 60
Gin Val Ser Tyr Ser Pro Ser Asn Thr Gly Phe Ser Val Asn Trp Asn
65 70 75 80
Thr Gin Asp Asp Phe Val Yal Gly Val Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser
85 90 95
Ala Pro Ile Asn Phe Gly Gly Ser Phe Ser Val Asn Ser Gly Thr Gly
100 105 110
Leu Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser Thr Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr
115 120 125
Ile Met Glu Asp Asn His Asn Tyr Pro Ala Gin Gly Thr -Yal Lys Gly
130 135 14Ó
Thr Val Thr Ser Asp Gly Al a Thr Tyr Thr Ile Trp Glu Asn Thr Arg
145 150 155 160
Yal Asn Glu Pro Ser Ile Gin Gly Thr Ala Thr Phe Asn Gin Tyr Ile
165 170 175
Ser Val Arg Asn Ser Pro Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Gin Asn
180 185 190
His Phe Asn Ala Trp Ala Ser Leu Gly Leu His Leu Gly Gin Met Asn
195 200 205
Tyr Gin Yal Yal Ala Yal Glu Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser
210 215 220
Gin Ser Val Ser Asn 225 .
<210> 55 <211> 227 <212> PRT <213> B. pumilus <400> 55
Met Asn Leu Lys Arg Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys Ile Gly Phe 1 5 10 15
PL 212 113 B1
Val Leu Thr Leu 20 Thr Ala Val Pro Ala 25 His Ala Glu Thr Ile 30 Tyr Asp
Asn Arg Ile Gly Thr His Ser Gly Tyr Asp Phe Glu Leu Trp Lys Asp
35 40 45
Tyr Gly Asn Thr Ser Met Thr Leu Asn Asn Gly Gly Ala Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Trp Asn Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys Phe
65 70 75 80
Asp Ser Thr Lys Thr His His Gin Leu Gly Asn Ile Ser 11 e Asn Tyr
85 90 95
Asn Ala Ala Phe Asn Pro Gly Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Val Tyr Gly
100 105 110
Trp Thr Gin Ser Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Trp Gly
115 . 120 125
Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Ser Phe Tyr Ala Asp Gly
130 135 140
Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu Arg Val Asn Gin Pro Ser r le
145 150 155 160
Ile Gly Asp ^31 Thr Phe Lys Gin Tyr Trp Ser Val Arg Gin Thr Lys
165 170 175
Arg Thr Ser Gly Thr Ala Ser Val Ser Glu His Phe Lys Lys Trp Glu
180 185 190
Ser Leu Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu Thr Ala Leu Thr Val
195 200 205
Glu Gly Tyr Arg Ser Asn Gly Ser Al a Asn Val Met Thr Asn Gin Leu
210 215 220
Met Ile Arg
225
<2io> : 36 '
<211> 228
<212> PRT
<213> B. pumilus
<400> 56
Met Asn Leu Arg Lys Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys Ile Gly Leu
1 Cl 10 15
Thr Leu Ile Leu Thr Ala Val Pro Ala His Al 3 Arg Thr Ile Thr Asn
20 25 30
Asn Glu Met Gly Asn His Ser Gly Tyr Asp Tyr Glu Leu Trp Lys Asp
35 40 45
Tyr Gly Asn Thr Ser Met Thr Leu Asn Asn Gly dy Ala Phe Ser Ala
55 60
PL 212 113 B1
Gly 65 Trp Asn Asn Ile Gly Asn Ala 70 Leu Phe Arg 75 Lys Gly iys Lys Phe 90
Asp Ser Thr Arg Thr His His Gin Leu Gly Asn I le Ser Ile Asn Tyr
85 90 95
Asn' Ala Ser Phe Asn Pro Gly Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Val Tyr Gly
100 105 110
Trp Thr Gin Ser Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp Gly
115 120 125
Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Ala Tyr Lys Gly Ser Phe Tyr Ala Asp Gly
130 135 140
Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Thr Arg Val Asn Gin Pro Ser Ile
145 150 155 160
Ile Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp Ser Val Arg Gin Thr Lys
165 170 17 5
Arg Thr Ser Gly Thr Val Ser Val Ser Ala His Phe Arg Lys Trp Glu
180 185 190
Ser Leu Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu Thr Ala Phe Thr Val
195 200 20,5
Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Met Thr Asn Gin Leu
210 215 220
Phe Ile Gly Asn
225 <210> 57 <211> 261 <212> PRT <213> C. acetobutylicum
<400> 57
Met Leu Arg Arg Lys Val Ile Phe Thr Val Leu Ala Thr Leu Val Met
1 5 10 15
Thr Ser Leu Thr Ile Val Asp Asn Thr Ala Phe Ala Ala Thr Asn Leu
20 25 30
Asn Thr Thr Glu Ser Thr Phe Ser Lys Glu Val Leu Ser Thr Gin Lys
35 40 45
Thr Tyr Ser Ala Phe Asn Thr Gin Ala Ala Pro Lys Thr Ile Thr Ser
50 55 60
Asn Glu Ile Gly Val Asn Gly Gly Tyr Asp Tyr Glu Leu Trp Lys Asp
65 70 75 80
Tyr Gly Asn Thr Ser Met Thr Leu Lys Asn Gly Gly Ala Phe Ser C vs
85 90 95
Gin Trp Ser Asn I le Gly Asn 1 ci Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys Phe
100 105 110
Asn Asp Thr Gin Thr Tyr Lys Gin Leu Gly Asn Ile Ser Val Asn Tyr
115 120 125
PL 212 113 B1
Asp Cys 130 Asn Tyr Gin Pro Tyr 135 Gly Asn Ser Tyr Le u 140 Cys Val Tyr Gly
Trp 145 Thr Ser Ser Pro Leu 150 Val Glu Tyr Tyr I le 155 Va 1 Asp Ser Trp Gly 160
Ser Trp Arg Pro Pro 165 Gly Gly Thr Ser Lys 170 Gly Thr Ile Thr Val 175 Asp
Gly Gly Ile Tyr 130 Asp Ile Tyr Glu Thr 185 Thr Arg Ile Asn Gin 190 Pro Ser
Ile Gin Gly 195 Asn Thr Thr Phe Lys 200 Gin Tyr Trp Ser Val 205 Arg Arg Thr
Lys Arg 210 Thr Ser Gly Thr Ile 215 Ser Val Ser Lys His 220 Phe Ala Ala Trp
Glu 225 Ser Lys Gly Met Pro 230 Leu Gly Lys Met His 235 Glu Thr Ala Phe Asn 240
Ile Glu Gly Tyr Gin 245 Ser Ser Gly Lys Ala 250 Asp Val Asn Ser Met 255 Ser
Ile Asn Ile Gly 2S0 Lys
<210> : 58
<2ii> ; 234
<212> : PRT
<213> i 3. ' thermocellum
<400> 58
Met Lys Gin Lys Leu Leu Val Thr Phe Leu Ile Leu Ile Thr Phe Thr
1 5 10 15
Val Ser Leu Thr Leu Phe Pro Val Asn Val Arg Ala Asp Val Val Ile
20 25 30
Thr Ser Asn Gin Thr Gly Thr Gly Gly Gly Tyr Asn Phe Glu Tyr Trp
35 40 45
Lys Asp Thr Gly Asn Gly Thr Met Val Leu Lys Asp Gly Gly Ala Phe
50 55 60
Ser .Cys Glu Trp Ser Asn Ile Asn Asn Ile Leu Phe Arg Lys Gly Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Asp Glu Thr Lys Thr His Asp Gin Leu Gly Tyr Ile Thr Val
85 90 95
Thr Tyr Ser Cys Asn Tyr Gin Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Gly Val
100 105 110
Tyr Gly Trp Thr Ser Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Ser
115 120 125
Trp Gly Thr Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pró Lys Gly Thr Ile Thr
130 135 140
PL 212 113 B1
Val 145 Asp Gly Gly Thr Tyr 150 Glu Ile Tyr Glu Thr 155 Thr Arg Val Asn Gin 160
Pro Ser Ile Lys Gly Thr Ala Thr Phe Gin Gin Tyr Trp Ser Val Arg
165 170 175
Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Thr Glu His Phe Lys
180 185 190
Ala Trp Glu Arg Leu Gly Met Lys Met Gly Lys Met Tyr Glu Val Ala
195 200 205
Leu Val Val Glu Gly Tyr Gin Ser Ser dy Lys Ala Asp Val Thr Ser
210 215 220
Met Thr Ile Thr Val Gly Asn Ala Pro Ser
225 230
<210 59
<211> 230
<212> PRT
<213> Bacillus sp 41M-: L
<400> 59
Met Lys Gin Val Lys Ile Met Phe Leu Met Thr Met Phe Leu Gly Ile
1 5 10 15
Gly Leu Leu Phe Phe Ser Glu Asn Al zi Glu Ala Ala Ile Thr Ser Asn
20 25 .30
Glu Ile Gly Thr His Asp Gly Tyr Asp Tyr Gru Phe Trp Lys Asp Ser
35 40 4 5
Gly Gly Ser Gly Ser Met Thr Leu Asn Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ala
50 55 60
Gin Trp Ser Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys Phe
65 70 75 80
Asp Glu Thr Gin Thr His Gin Gin Ile Gly Asn Met Ser Ile Asn Tyr
85 90 95
Gly Ala Thr Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Thr Val Tyr Gly
100 105 110
Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Phe Tyr Ile Val Asp Ser Trp Gly
115 120 125
Thr Trp Arg Pro Pro Gly dy Thr Pro Lys Gly Thr Ile Asn Val Asp
130 135 140
Gly Gly Thr Tyr Gin I le Tyr Glu Thr Thr Arg Tyr Asn Gin Pro Ser
145 150 155 160
Ile Lys Gly Thr Ala Thr Phe Gin Gin Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser
165 170 175
Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser Glu His Phe Arg Ala Trp
180 185 190
Glu Ser Leu Gly Met Asn Met Gly Asn Met Tyr Glu Val Ala Leu Thr
195 200 205
PL 212 113 B1
Val Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly 215 Ser Ala Asn Val Tyr Ser Asn Thr 220
210
Leu Thr Ile Gly Gly Gin
225 230
<210> 60 <211> 217 <212> PRT <213> Ρ. mułtivesiuulatum <400> 60
Glu Lys 1 Val Ile Cys 5 Leu Leu 11© Als Leu Phe Gly Leu Ile 10 ' Glu 15 Ala
Gin Thr Phe Tyr Asn As n Ala Gin Gly Gin Ile Asp Gly Leu Asp Tyr
20 25 30
Glu Leu Trp Lys Asp Thr Gly Thr Thr Ser Met Thr Leu Leu Gly Giy
35 40 4 5
Giy Lys Phe Ser Cys Ser Trr Ser Asn Ile Asn Asn Cys Leu Phe Arg
50 55* 60
Ile Gly Lys Lys Trp Asn Cys Gin Tyr Glu Trp Trp Glu Leu Gly Thr
65 70 75 80
Val Leu Val Asn Tyr Asp Val Asp Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr
85 90 95
Leu Cys Ile Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile
100 105 110
Val Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Gly Ser Pro Met Asn
115 120 125
Thr Met Tyr Val Asp Asp Gly Gin Tyr Asp Val Tyr Val Thr Asp Arg
130 135 140
Ile Asn Gin Pro Ser Ile Asp Gly Asn Thr Asn Phe Lys Gin Tyr Trp
145 150 155 160
Ser Val Arg Thr Gm Lys Lys Thr Arg Gly Thr Val His Val Asn His
165 170 175
His Phe Tyr Asn Trp Gin Glu Met Gly Leu Lys Vai Giy Lys Val Tyr
180 185 190
Glu Ala Ser Leu Asn Ile Glu Gly Tyr Gin Ser Ala Gly Ser Ala Thr
195 200 205
Val Asn Lys Asn Glu Val Val Gin Thr
210 215
<210> 61
<211> 175
<212> PRT
PL 212 113 B1 <213> Ρ multivesiculatura <400> 61
Met 1 Thr Leu Leu Gly 5 Gly dy Lys Phe Ser Cys Asn Trp Ser Asn Ile
10 15
Gly Asn Ala Leu Phe Arg I le Gly Lys Lys Trp Α®Ρ cys Thr Lys Thr
20 25 30
Trp Gin Gin Leu Gly Thr Ile Ser Val Ala Tyr Asn Val Asp Tyr Arg
35 40 45
Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Met Cys Val Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro
50 55 60
Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro
65 70 75 80
Gly Ser Asn Ser Met Gly Thr Ile Asn Val Asp Giy Gly Thr Tyr Asp
85 90 95
Ile Tyr Val Thr Asp Arg Ile Asn Gin Pro Ser Ile Asp Gly Thr Thr
100 105 110
Thr Phe Lys Gin Phe Trp Ser Val Arg Thr Gin Lys Lys Thr Ser Gly
115 120 125
Val Ile Ser Val Ser Lys His Phe Glu Ala Trp Thr Ser Lys Gly Leu
130 135 140
Aśn Leu Gly Leu Met Tyr Glu Ala Ser Leu Thr Ile Glu Gly Tyr Gin
145 150 155 160
Ser Ser Gly Ser Ala Thr Val Asn Gin Asn Asp Val Thr Gly Gly
165 170 17 5
<210> 62
<2U> : 265
<212> PRT
<213> 1 R. albus
<4 00> 62
Met Arg Asn Asn Phe Lyś Met Arg Val Met Ala Gly Val Ala Ala Val
1 5 10 15
Ile cys Leu Ala Gly Val Leu Gly Ser Cys Gly Asn Ser Ser Asp Lys
20 ' 25 30
Asp Ser Ser Ser Lys Lys Ser Ala Asp Ser Ala Lys Al a Asp Ser Asn
35 40 45
Lys Asp Ser Lys Asn Gly Gin Val Phe Thr Lys Asn Ala Arg Gly Thr
50 55 60
Ser Asp Gly Tyr Asp Tyr Gł u Leu Trp Lys Asp Lys Gly Asp Thr 1 U
65 70 7 5 50
Met Thr Ile Asn Glu Gly Giy Thr Phe Ser Cys Lys Trp Ser Asn I le
85 90 95
PL 212 113 B1
Asn Asn Ala Leu 100 Phe Arg Arg Gly Lys 105 Lys Phe Asp Cys Thr 110 Lys Thr
Tyr Lys Glu Leu Gly Asn Ile Ser Val Lys Tyr Gly Val Asp Tyr Gin
115 120 125
Pro Asp Gly Asn Ser Tyr Met Cys Val Tyr Gly Trp Thr Ile Asp Pro
130 135 140
Leu Val Glu Phe Tyr Ile Val Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro
145 150 155 160
Gly Ala Ala Glu Ser Leu Gly Thr Val Thr Val Asp Gly Gly Thr Tyr
165 no 175
Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Tyr Glu Gin Pro Ser Ile Asp Gly Thr
180 185 190
Lys Thr Phe Asp Gin Tyr Trp Ser Val Arg Gin Asp Lys Pro Thr Gry
195 200 205
Asp Gly Thr Lys Ile Glu Gly Thr Ile Ser Ile Ser Lys His Phe Asp
210 215 220
Ais Trp Glu Gin Val Gly Leu Thr Leu Giy Asn Met Tyr Glu Val Ala
225 230 235 240
Ljfiti Asn Ile Glu Gly Tyr Gin Ser Asn Gly Gin Ala Thr Ile Tyr Glu
245 250 255
Asn Glu Lsu Thr Val Asp Giy Asn Tyr
260 265
<210> 63
<211 226
<212 :> PRT
<213> i Caldieellulosiruptor sp
<400 )> 63
Met Cys Val Val Leu Ala Asn Pro Phe Tyr Ala Gin Ala Ala Met Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ser Asn Ala Thr Gly Thr Tyr Asp Gly Tyr Tyr Tyr Glu Leu
20 25 30
Trp Lys Asp Thr Gly Asn Thr Thr Met Thr Val Asp Thr Glv Gly Arg
35 40 45
Phe Ser Cys Gin Trp Ser Asn Ile Asn Asn Ala Leu Phe Arg Thr Gly
50 55 60
Lys Lys Phe Ser Thr Ala Trp Asn Gin Leu Gly Thr Val Lys Ile Thr
65 70 75 80
Tyr Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Ile T yr
85 90 95
Gly Trp . Ser Arg Asn Pro Leu Val Glu Phe Tyr Ile Val Glu Ser Trp
100 105 110
PL 212 113 B1
Gly Ser Trp 115 Arg Pro Pro Gly Ala 120 Thr Ser Leu Gly Thr 125 Val Thr Ile
Asp Gly Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Val Asn Gin Pro
130 135 140
Ser Ile Glu Gly Thr Arg Thr Phe Asp Gin Tyr Trp Ser Val Arg Thr
145 150 155 160
Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Asp His Phe Lys Ala
165 170 1T5
Trp Ala Ala Lys Gly Leu Asn Leu Gly Thr Ile Asp Gin Ile Thr Leu
180 185 190
Cys Val Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ala Asn Ile Thr Gin Asn
195 200 205
Thr Phe Thr Ile Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser Ser Asn Gly Ser Asn
210 215 220
Asn Gly
225
<210> 64
<211> 232
<212> PRT
<213>' ' D. thermophilum'
<400> 64
Met Phe Leu Lys Lys Leu Ser Lys Leu Leu Leu Val Val Leu Leu Val
1 ' 5 10 15
Ala Val Tyr Thr Gin Val Asn Ala Gin Thr Ser Ile Thr Leu Thr Ser
20 25 30
Asn Ala Ser Gly Thr Phe Asp Gly Tyr Tyr Tyr Glu Leu Trp Lys Asp
35 40 45
Thr Gly Asn Thr Thr Met Thr Val Tyr Thr Gin Gly Arg Phe Ser Cys
50 55 60
Gin Trp Ser Asn Ile Asn Asn Ala Leu Phe Arg Thr Gly Lys Lys Tyr
65 70 75 80
Asn Gin Asn Trp Gin Ser Leu Gly Thr Ile Arg Ile Thr Tyr Ser Ala
35 90 95
Thr Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Ile Tyr Giy Trp Ser
100 105 110
Thr Asn Pro Leu Val Glu Phe Tyr Ile Val Glu Ser Trp Gly Asn Trp
115 120 125
Arg Pro Pro Gly Ala Thr Ser Leu Gly Gin Va 1 Thr Ile Asp Gly Gly
130 135 140
Thr Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Thr Arg Val Asn Gin Pro Ser Ile Val
145 150 155 160
Gly Thr Ala Thr Phe Asp Gin Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg
165 170 ]_ 7 ς
PL 212 113 B1
Thr Ser Gly Thr 180 Val Thr Val Thr Asp 185 His Phe Arg Ala Trp 190 Ala Asn
Arg Gly Leu 195 Asn Leu Gly Thr Ile 200 Asp Gin Ile Thr Leu 205 Cys Yal Glu
Gly Tyr 210 Gin Ser Ser Gly Ser 215 Ala Asn Ile Thr Gin 220 Asn Thr Fhe Ser
Gin 225 Gly Ser Ser Ser Gly 230 Ser Ser
<210> 55
<211 > 255
<212> PRT
<213> R. flatefaciens
<40( 0> S5
Met Lys Leu Ser Lys Ile Łys Lys val Leu Ser Gly Thr Yal Ser Ala
i 5 10 15
Leu Met Ile Ala Ser Ala Ala Pro Val Val Ala Ser Ala Ala .Asp Gin
20 25 30
Gin Thr Arg Gly Asn Yal Gly Gly Tyr Asp Tyr Glu Met Trp Asn Gin
35 40 45
Asn Gly Gin Gly Gin A1 a Ser Met Asn Pro Gly Ala Gly Ser Phe Thr
50 55 60
Cys Ser Trp Ser Asn Ile Glu Asn Phe Leu Ala Arg Met Gly Lys Asn
65 70 75 80
Tyr Asp Ser Gin Łys Lys Asn Tyr Lys Ala Phe Gly Asn I le Val Leu
85 90 95
Thr Tyr Asp Yal Glu Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Tyr Met Cys Val
100 105 110
Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Met Glu Tyr Tyr Ile Yal Glu Gly
115 120 125
Trp Gly Asp Trp Arg Pro Pro Gly Asn Asp Gly Glu Val Lys Gly Thr
130 135 140
Val Ser Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Asp Ile Arg Lys Thr Met Arg Tyr
.145 150 155 160
Asn Gin Pro Ser Leu Asp Gly Thr Ala Thr Phe Pro Gin Tyr Trp Ser
165 170 175
Val Arg Gin Thr Ser Gly Ser Ala Asn Asn Gin Thr Asn Tvr Met Lys
180 185 190
Gly Thr Ile Asp Val Thr Lys His Phe Asp Ala Trp Ser Ala Ala Gly
195 200 205
Leu Asp Met Ser Gly Thr Leu Tyr Glu Yal Ser Leu Asn Ile Glu .l y
210 215 220
PL 212 113 B1
Tyr Arg Ser Asn 225 Gly Ser 230 Ala Asn Val Lys Ser Val 235 Ser Val Thr Gin 240
Gly Gly Ser Ser Asp Asn Gly Gly Gin Gin Gin Asn Asn Asp Trp
245 250 255
<210> 66
<21I> 280
<212> PRT
<213> P. .
<400> 66
Met Thr Val Tyr Lys Arg Lys Ser Arg Val Leu Ile Ala Val Val Thr 15 10 15
Leu Leu His Val 20 Leu Ser His Ala Pro 25 Thr Lys Met Leu Thr 30 Thr Asp
Val Leu Leu 35 Thr Arg Cys Met His 40 lSU Cys His Phe Arg 45 Thr Ser Asp
Ser Val 50 Tyr Thr Asn Glu Thr 55 Ser Glu Glu Arg Ser 60 Met Ser Asp Arg
Leu 65 Asn Ile Thr Arg Val 70 Met Ser Tyr Asp Arg 7 A Trp Thr Asp Leu Vai 80
Gly Glu Leu Glu Val Arg Glu Leu Lys His Val Met Ser His Arg Thr
90 95
Tyr Ser.Leu Cys Asp Leu Ser Cys Ser Thr Val Leu Asp Ser Asn Ser 100 105 110
Met Phe Ser Leu Gly Lys Gly Trp Gin Ala Ile Ser Ser Arg Gin Gly
115 120 125
Val Gly Ala Thr Val Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Leu Ile Glu
130 135 140
Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Ser Tyr His Pro Ser Asn Thr I it!
145 150 155 160
Thr Gly Thr Phe Val Thr Val Lys Cys Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile
165 170 175
Tyr Thr Ala Val 180 Arg Val Asn Ala Pro 185 Ser Ile Glu Gly Thr 190 Thr Phe
Thr Gin Tyr 195 Trp Ser Val Arg Gin 200 Ser Ala Thr Ile Gin 205 Leu Ala Vai
Ile Lys 210 Pro Leu Thr Leu Gin 215 Asn Ala Thr Ile Thr 220 Phe Thr Phe Ser
Asn His Phe Asp Ala Trp Lys Thr Met Thr Leu Glu Ala Thr His Ser
225 230 23.5 240
Thr Glu Gly Tyr Phe 245 Ser Ser Gly Ile Thr 250 Tyr Glu Gin Pro His Gin 255
Pro His Arg Asn Thr Trp Ala Thr Ser Leu Thr Ser Gin Thr Lys His
260 265 270
Thr Ala Arg Ser Leu Pro Ile Asn

Claims (12)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wariant polipeptydu lub jego fragment posiadający aktywność ksylanazy zawierający mutację wybraną spośród: D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D i D11F/G34D w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1, lub równoważnej (ych) pozycji(ach) w innych ksylanazach rodziny 11 tak, że wariant polipeptydu lub jego fragmentu ma zredukowaną wrażliwość na inhibitor ksylanazy w porównaniu z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej ukazanej jako SEQ ID Nr 1.
  2. 2. Wariant polipeptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera mutację D11F.
  3. 3. Wariant polipeptydu według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera mutację D11F/R122D.
  4. 4. Wariant polipeptydu według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że wspomnianym inhibitorem jest inhibitor naturalnie znajdujący się w tkankach roślinnych.
  5. 5. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera wariant polipeptydu zdefiniowanego w jednym z zastrz. 1 do 4.
  6. 6. Sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, znamienny tym, że kontaktuje się wspomnianą roślinną ścianę komórkową z polipeptydem zdefiniowanym w jednym z zastrz. 1 do 4 lub z kompozycją zdefiniowaną w zastrz. 5.
  7. 7. Sposób obróbki materiału roślinnego, znamienny tym, że kontaktuje się ten materiał roślinny z polipeptydem zdefiniowanym w jednym z zastrz. 1 do 4 lub z kompozycją zdefiniowaną w zastrz. 5.
  8. 8. Sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, że koduje wariant polipeptydu jak zdefiniowano w jednym z zastrz. 1 do 4.
  9. 9. Konstrukt, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 8.
  10. 10. Zastosowanie wariantu polipeptydu zdefiniowanego w jednym z zastrz. 1 do 4 w sposobie modyfikowania materiału roślinnego.
  11. 11. Zastosowanie wariantu polipeptydu zdefiniowanego w jednym z zastrz. 1 do 4 w jednym lub więcej spośród: pieczenia, pasz dla zwierząt, wytwarzania skrobi, oddzielania mąki (mielenie na mokro) oraz wytwarzania papieru i miazgi drzewnej.
  12. 12. Zastosowanie wariantu polipeptydu zdefiniowanego w jednym z zastrz. 1 do 4 w jednym lub więcej spośród: obróbki zbóż, w obróbce drewna i we wzmacnianiu procesu bielenia miazgi drzewnej.
PL362558A 2000-03-08 2001-03-08 Wariant polipeptydu, kompozycja zawierająca wariant tego polipeptydu, sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, sposób obróbki materiału roślinnego, sekwencja nukleotydowa, konstrukt zawierający tą sekwencję nukleotydową i zastosowania wariantu polipeptydu PL212113B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0005585A GB0005585D0 (en) 2000-03-08 2000-03-08 Enzyme
GB0015751A GB0015751D0 (en) 2000-06-27 2000-06-27 Enzyme
PCT/IB2001/000426 WO2001066711A1 (en) 2000-03-08 2001-03-08 Xylanase variants having altered sensitivity to xylanase inhibitors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL362558A1 PL362558A1 (pl) 2004-11-02
PL212113B1 true PL212113B1 (pl) 2012-08-31

Family

ID=26243816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL362558A PL212113B1 (pl) 2000-03-08 2001-03-08 Wariant polipeptydu, kompozycja zawierająca wariant tego polipeptydu, sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, sposób obróbki materiału roślinnego, sekwencja nukleotydowa, konstrukt zawierający tą sekwencję nukleotydową i zastosowania wariantu polipeptydu

Country Status (15)

Country Link
US (3) US7611881B2 (pl)
EP (3) EP2295558B1 (pl)
JP (1) JP4795604B2 (pl)
AT (1) ATE491024T1 (pl)
AU (1) AU785107C (pl)
BR (1) BR0108750A (pl)
CA (1) CA2399700C (pl)
DE (1) DE60143606D1 (pl)
DK (2) DK2295558T3 (pl)
ES (1) ES2656440T3 (pl)
MX (1) MXPA02008817A (pl)
NZ (1) NZ520659A (pl)
PL (1) PL212113B1 (pl)
PT (1) PT1263941E (pl)
WO (1) WO2001066711A1 (pl)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
DE69835111T2 (de) 1997-04-09 2007-01-04 Danisco A/S Verwendung von Lipase zur Verbesserung von Teigen und Backwaren
US6764699B2 (en) * 2000-12-05 2004-07-20 Roberto Gonzalez Barrera Corn tortillas with improved texture retention using an enzyme blend in nixtamalized corn flour
NZ528260A (en) 2001-05-18 2005-09-30 Danisco Method of improving dough and bread quality with the addition of an enzyme that hydrolyses a glycolipid and a phospholipid and incapable of hydrolysing a triglyceride or monoglyceride
GB0121387D0 (en) * 2001-09-04 2001-10-24 Danisco Modified hydrolases
US7510860B1 (en) * 2001-11-21 2009-03-31 National Research Council Of Canada Xylanases with enhanced thermophilicity and alkalophilicity
NZ537597A (en) 2002-06-14 2008-07-31 Diversa Corp Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2004029084A2 (en) * 2002-09-27 2004-04-08 Danisco A/S Lipase inhibitors and uses thereof
DE602004030000D1 (de) 2003-01-17 2010-12-23 Danisco Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel
CA2538837C (en) * 2003-09-15 2016-02-09 Genencor International, Inc. Modified xylanases having increased thermostability and alkaline stability
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
MX2007000626A (es) 2004-07-16 2007-03-07 Danisco Enzima lipolitica; usos de la misma en la industria alimenticia.
DE602005025038D1 (de) 2004-12-22 2011-01-05 Novozymes As Seaminosäuresequenz und einem kohlenhydratbindenden modul als zweiter aminosäuresequenz
EP1752533A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-14 Institut National de la Recherche Agronomique Fusion proteins between plant cell-wall degrading enzymes, and their uses
DK1989302T3 (en) 2006-02-14 2018-07-23 Bp Corp North America Inc XYLANASES, NUCLEIC ACID CODING THEM AND PROCEDURES FOR THEIR PREPARATION AND USE
WO2007115391A1 (en) * 2006-04-12 2007-10-18 National Research Council Of Cananda Modification of xylanases to increase thermophilicity, thermostability and alkalophilicity
US20110053195A1 (en) * 2006-06-16 2011-03-03 Syngenta Participations Ag Catalytically inactive proteins and method for recovery of enzymes from plant-derived materials
WO2008037757A1 (en) 2006-09-29 2008-04-03 Novozymes A/S Xylanases for animal feed
USRE46733E1 (en) 2007-10-03 2018-02-27 Bp Corporation North America Inc. Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2010072225A1 (en) * 2008-12-23 2010-07-01 Danisco A/S Polypeptides with xylanase activity
CN102317451A (zh) * 2008-12-23 2012-01-11 丹尼斯科公司 具有木聚糖酶活性的多肽
DK3037528T3 (en) * 2008-12-23 2018-12-10 Dupont Nutrition Biosci Aps POLYPEPTIDES
US20130071884A1 (en) 2009-11-06 2013-03-21 Agrivida, Inc. Plants expressing cell wall degrading enzymes and expression vectors
CN102884182A (zh) * 2010-03-03 2013-01-16 诺维信股份有限公司 木聚糖酶变体及编码其的多核苷酸
EP2683799B1 (en) 2011-03-07 2016-11-02 Agrivida, Inc. Consolidated pretreatment and hydrolysis of plant biomass expressing cell wall degrading enzymes
WO2016073610A1 (en) * 2014-11-07 2016-05-12 Novozymes A/S Xylanase based bleach boosting
CN120060230A (zh) 2015-02-24 2025-05-30 诺维信公司 木聚糖酶颗粒
CN107404915A (zh) 2015-03-04 2017-11-28 杜邦营养生物科学有限公司 谷粒加工
CN109071615A (zh) 2016-03-04 2018-12-21 丹尼斯科美国公司 用于在微生物中产生蛋白质的工程化核糖体启动子
EP3703661A1 (en) 2017-11-02 2020-09-09 Danisco US Inc. Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes
EP3728578A1 (en) 2017-12-20 2020-10-28 DSM IP Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
AU2019341519A1 (en) 2018-09-17 2021-03-18 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
CN110079512A (zh) * 2019-03-19 2019-08-02 天津科技大学 一种高温耐盐耐酸碱木聚糖酶Xyn22、基因、重组载体和菌株、制备方法和应用
AU2022384583A1 (en) 2021-11-09 2024-05-02 Ab Enzymes Gmbh Improved xylanases
CN114350642B (zh) * 2022-03-18 2022-05-31 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高木聚糖酶的木二糖产量的方法及突变体和应用
CN116396953B (zh) * 2022-11-22 2023-12-19 天典(广东)生物科技有限公司 木聚糖酶突变体及其应用和重组枯草芽孢杆菌
CN120738142B (zh) * 2025-08-29 2025-12-12 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种漆酶融合蛋白及发酵制备方法、在真菌毒素脱毒中的应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US575984A (en) * 1897-01-26 Robert pierpont
US5200215A (en) 1988-04-20 1993-04-06 Nabisco, Inc. Enzyme treated low moisture content comestible products
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
NL9001388A (nl) 1990-06-19 1992-01-16 Unilever Nv Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
NZ253280A (en) 1992-06-17 1997-09-22 Univ Newcastle Recombinant truncated xylanases derived from anaerobic fungi
DE4226528A1 (de) 1992-08-11 1994-02-17 Roehm Gmbh Batterien-Xylanase, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie dafür geeigneter Bakterienstamm, Plasmid mit zugehörigem Strukturgen, sowie Backmittel und Backverfahren zur Herstellung von Brot und Backwaren unter Verwendung der Xylanase
DE69533473T2 (de) 1994-03-02 2005-01-20 Novozymes A/S Verarbeitung von pflantzlichem material mit xylanase
JP3435946B2 (ja) 1994-12-21 2003-08-11 王子製紙株式会社 耐熱性キシラナーゼ
US5759840A (en) * 1996-09-09 1998-06-02 National Research Council Of Canada Modification of xylanase to improve thermophilicity, alkalophilicity and thermostability
CA2287505C (en) 1997-04-30 2010-12-07 K.U. Leuven Research & Development Inhibitors of cellulolytic, xylanolytic and .beta.-glucanolytic enzymes
US6253168B1 (en) * 1998-05-12 2001-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Generation of virtual combinatorial libraries of compounds
EP0979830A1 (en) * 1998-08-12 2000-02-16 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno A novel class of xylanase inhibitors
GB2362386B (en) 1998-12-23 2004-02-04 Danisco Endo-beta-1 4-xylanase inhibitor from wheat flour and its effect on different xylanases
US6682923B1 (en) * 1999-05-12 2004-01-27 Xencor Thermostable alkaliphilic xylanase
EP1179075A2 (en) 1999-05-12 2002-02-13 Xencor, Inc. Bacillus circulans xylanase mutants

Also Published As

Publication number Publication date
US20090155413A1 (en) 2009-06-18
PL362558A1 (pl) 2004-11-02
CA2399700C (en) 2013-10-01
AU4098401A (en) 2001-09-17
AU785107B2 (en) 2006-09-14
WO2001066711A1 (en) 2001-09-13
EP2295558A1 (en) 2011-03-16
JP2003525629A (ja) 2003-09-02
MXPA02008817A (es) 2003-02-12
DE60143606D1 (de) 2011-01-20
CA2399700A1 (en) 2001-09-13
US7611881B2 (en) 2009-11-03
BR0108750A (pt) 2002-12-24
EP2295558B1 (en) 2017-11-01
US7527957B2 (en) 2009-05-05
EP1263941B1 (en) 2010-12-08
ES2656440T3 (es) 2018-02-27
US20050271769A1 (en) 2005-12-08
DK1263941T3 (da) 2011-03-14
AU785107C (en) 2007-05-03
US20030180895A1 (en) 2003-09-25
ATE491024T1 (de) 2010-12-15
WO2001066711A8 (en) 2001-11-01
EP1263941A1 (en) 2002-12-11
PT1263941E (pt) 2011-01-20
NZ520659A (en) 2005-06-24
EP3339434A1 (en) 2018-06-27
DK2295558T3 (en) 2018-01-22
JP4795604B2 (ja) 2011-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL212113B1 (pl) Wariant polipeptydu, kompozycja zawierająca wariant tego polipeptydu, sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, sposób obróbki materiału roślinnego, sekwencja nukleotydowa, konstrukt zawierający tą sekwencję nukleotydową i zastosowania wariantu polipeptydu
CN102766613B (zh) Talaromyces emersonii的β-葡聚糖酶
CN100558898C (zh) 篮霉菌木聚糖酶
CA2747223C (en) Polypeptides with xylanase activity
CA2747224C (en) Polypeptides with xylanase activity
WO2007146944A2 (en) Catalytically inactive proteins and method for recovery of enzymes from plant-derived materials
EP2382311A1 (en) Polypeptides with xylanase activity
WO2003020923A1 (en) Xylanase variants
WO2002018561A2 (en) Modified fungal xylanases
ES2354533T3 (es) Variantes de xilanasa que presentan una sensibilidad alterada a los inhibidores de xilanasa.
AU2006203392A1 (en) Xylanase variants having altered sensitivity to xylanase inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification