PL211018B1

PL211018B1 - Krystaliczny związek laktamowy, kompozycja farmaceutyczna i sposób wytwarzania krystalicznego związku laktamowego

Info

Publication number: PL211018B1
Application number: PL360991A
Authority: PL
Inventors: Thomas Mitchell Koenig; James Edmund Audia; David Mitchell; Stacey Leigh Mcdaniel; Lynne Ann Buccilli; Gary Lowell Engel; James Abraham Aikins
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2001-11-02
Publication date: 2012-03-30
Also published as: MXPA03004250A; WO2002040451A3; AR031356A1; CN100516047C; JP4116431B2; NO325217B1; US20040248878A1; ZA200303411B; CN1575282A; NO20032215L; CN101624372A; IL155275A0; ES2286162T3; CZ20031340A3; PT1353910E; SV2003000741A; MY141607A; CA2425497C; ATE362919T1; HRP20030385A2

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy nowego krystalicznego dihydratu N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu, kompozycji go zawierającej, i sposobu jego wytwarzania. Według niniejszego wynalazku krystaliczny dihydrat jest użyteczny do hamowania uwalniania i/lub syntezy peptydu β-amyloidu i zgodnie z tym, jest użyteczny w leczeniu choroby Alzheimera.

Niektóre laktamy, które hamują uwalnianie i/lub syntezę peptydu β-amyloidu, przydatne są zatem do leczenia choroby Alzheimera, jak opisano w zgłoszeniu PCT nr PCT/US97/22986.

Ponieważ N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on jest użyteczny w leczeniu choroby Alzheimera, konieczne jest jego wytworzenie w czystej, trwałej i krystalicznej postaci w celu spełnienia wymagań i specyfikacji farmaceutycznych. Nowy krystaliczny dihydrat według wynalazku odznacza się odpowiednimi właściwościami do dogodnego komponowania na skalę przemysłową, np. na tabletki do podawania doustnie.

Ponadto konieczne jest także, aby sposób, według którego wytwarza się N-(((S)-2-hydroksy-3metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on był odpowiedni do stosowania na skalę przemysłową. Ponadto, produkt powinien być w postaci, którą łatwo się przesącza, łatwo osusza i dogodnie przechowuje. Ponadto, przedstawiony krystaliczny dihydrat powinien odznaczać się odpowiednimi właściwościami przetwarzania i przechowywania.

N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on można wytworzyć w formie hydratu o korzystnych właściwościach, przy czym proces wytwarzania nowej postaci spełnia pożądane cechy opisane powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest krystaliczny dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylo-butyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu:

scharakteryzowany przez proszkowy dyfraktogram promieni X obejmujący piki przy 8,36, 12,43, 15,34, 19,22, 20,50 lub 20,63 (2θ ± 0,2°) oraz którego widmo ¹³C jądrowego magnetycznego rezonansu w stanie stałym wykazuje przesunięcia chemiczne (ppm) 75,6, 35,3, 21,4 lub 16,6.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera związek według wynalazku i farmaceutycznie akceptowalny rozcieńczalnik.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania krystalicznego dihydratu N-(((S)-2-hydroksy-3-metylo-butyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu według wynalazku, charakteryzujący się tym, że prowadzi się krystalizację N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu

z wodnego rozpuszczalnika.

PL 211 018 B1

Korzystnie w sposobie według wynalazku wodny rozpuszczalnik zawiera aceton i wodę.

Stosowane tu poniższe terminy mają następujące znaczenia:

Termin „ee lub „nadmiar enancjomeryczny odnosi się do procentu, odpowiadającego nadmiarowi jednego enancjomeru E1 w mieszaninie obu enancjomerów (E1+E2), co obliczono według i równania ((E1-E2) + (E1+E2)) x 100% = ee. Fachowcy w dziedzinie wiedzą, że nadmiar enancjomeryczny można określić metodą kapilarnej elektroforezy i chiralnej HPLC dla związków lub ich pochodnych.

W celu określenia specyficznych izomerów stosuje się według Cahn-Prelog-Ingold'a oznaczenia (R)- i (S)- oraz oznaczenia 1- i D- w przypadku stereochemii w odniesieniu do izomerów aldehydu glicerynowego.

Niniejszy wynalazek obejmuje dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu i w szczególności krystaliczny dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu.

Do charakteryzowania krystalicznych postaci związków organicznych dostępnych jest wiele metod. Np. metody obejmują różnicową kalorymetrię skaningową, spektrometrię NMR w stanie stałym, spektroskopię w podczerwieni i proszkową rentgenografię dyfrakcyjną. Spośród tych metod bardzo przydatne do identyfikacji i rozróżniania krystalicznych postaci są dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego metodą proszkową i spektroskopia NMR w stanie stałym.

Dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego metodą proszkową przeprowadzono następująco. Próbkę zmielono stosując agatowy moździerz i tłuczek lub nie ucierano, po czym proszek wprowadzono do naczynia na próbki w celu pomiaru dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego metodą proszkową.

Proszkowy rentgenogram dyfrakcyjny promieniowania rentgenowskiego zarejestrowano na proszkowym dyfraktometrze Siemens zaopatrzonym w źródło promieniowania CuK_a (λ,=1, 54056A) pracujące przy 50 kV i 40 mA stosując zmienną szczelinę o wymiarze 1 mm, odbiorczą szczelinę 1 mm i szczelinę detektora 0,1 mm. Każdą próbkę skanowano od 4° do 35° (2θ) przy zmianie kąta o 0,02° i z maksymalną szybkością skanowania 3 sekundy/etap. Dane zebrano stosując detektor krzemowo-litowy typu Kevex w stanie stałym. Optymalnie, rutynowo przeprowadzono analizę dla wzorca krzemowego w celu sprawdzenia wzorcowania urządzenia.

W dziedzinie krystalografii wiadomo, że dowolna postać krystaliczna, względne intensywności i szerokości piku dla pików dyfrakcyjnych mogą zmieniać się z uwagi na wiele czynników, obejmujących wpływy korzystnej orientacji i/lub wymiaru cząstki. Jeśli występują wpływy korzystnej orientacji i/lub wymiaru cząstki, intensywności piku mogą zmieniać się, lecz charakterystyczne pozycje piku polimorfu nie ulegają zmianie. Patrz, np. The United States Pharmacopoeia #24, National Formulary #19, str. 1843-1844, 2000.

W przypadku ujawnionych tutaj dyfraktogramów, niektóre próbki zmielono w celu zmniejszenia intensywności zmiany pod względem intensywności piku. Jednakże jeśli zmielenie spowodowało znaczną zmianę dyfraktogramu lub zmianę stanu krystalicznego próbki, wówczas należy stosować dyfraktogram dla niezmielonej próbki. Mielenie przeprowadzono stosując mały agatowy moździerz i tłuczek. Podczas mielenia moździerz utrzymywano, zaś tłuczek stosowano pod niewielkim ciśnieniem.

Pozycję piku otrzymano dla kąta 2θ i intensywności najbardziej charakterystycznego piku (względne intensywności powyżej 20%) zmierzono wykorzystując metodę drugiej pochodnej pod powierzchnią piku.

Zgodnie z tym, przedmiotem wynalazku jest krystaliczny dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu, który charakteryzuje proszkowy rentgenogram dyfrakcyjny przedstawiony w tabeli 1, który obejmuje wartości 2θ i względne intensywności (l0/l100) powyżej 20%, zmierzone dla niezmielonej próbki oraz dla próbki po 5 i 10 minutach mielenia i z zastosowaniem metodologii opisanej powyżej z zastosowaniem źródła promieniowania CuK_a:

T a b e l a 1

bez mielenia	5 minut mielenia	10 minut mielenia
2Θ (°)	l0/l100 (%)	2Θ (°)	l0/l100 (%)	2Θ (°)	l0/l100 (%)
1	2	3	4	5	6
8,361	100	8,349	87,6	8,367	88,7
12,433	51,4	12,429	78,5	12,424	91,6

PL 211 018 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6
		13,24	27,9	13,254	30,4
15,344	49,8	15,336	100	15,352	100
		16,858	28,5	16,88	28,3
19,224	27,9	19,233	47,8	19,24	52
20,495	27,5	20,48	44,4
20,63	38,8	20,644	43	20,601	48,9
		22,254	19,5	22,045	21,6
		22,63	27,6	22,654	34,9
		24,388	26,4	23,388	19,7
				24,387	28,2
				27,744	19
				22,237	21,2

Intensywności próbek mielonych przez 5 i 10 minut stanowią bardziej reprezentatywne dyfraktogramy, dla których przeprowadzono próby minimalizacji wpływów korzystnej orientacji i/lub wymiaru cząstki. Należy także wskazać, że w tabeli wymieniono obliczone komputerowo niezaokrąglone liczby.

Tak więc, właściwie przygotowaną próbkę krystalicznego dihydratu N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu można charakteryzować dyfraktogramem promieniowania rentgenowskiego dla wartości 2θ stosując źródło promieniowania CuK_a o pikach dla odległości międzypłaszczyznowych opisanych w tabeli 1 i w szczególności pikach przy 8,36, 12,43, 15,34, 19,22, 20,50, lub 20,63; dokładniej pikach przy 8,36, 12,43, lub 15,34; pikach przy 8,36 i 12,43; 8,36 i 15,34; 8, 36, 12, 43 i 15,34; lub przy 8,36, 12,43, 15,34, 19,22, 20,50 i 20,63 L.

Krystaliczny dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu można także oznaczać metodą spektroskopii NMR w stanie stałym. Przesunięcie chemiczne dla spektroskopii ¹³C stanie stałym odzwierciedla nie tylko budowę cząsteczki, lecz także elektronowe otoczenie cząsteczki w krysztale.

Analizę NMR (¹³C) w stanie stałym można prowadzić stosując metodę ¹³C cross polarization/magic kąt spinning (CP/MAS). Widma NMR (NMR lub SSNMR w stanie stałym) zarejestrowano na spektrometrze Varian Unity 400 MHz pracującym przy częstotliwości dla atomu węgla 100,580 MHz, zaopatrzonym w dodatkowe stałe wyposażenie i sondę typu Varian 7 mm VT CP/MAS. Zastosowano następujące parametry: 90° w zakresie częstości jąder ¹H- 4,0 μs, czas kontaktu 1,0 ms, czas powtarzania impulsu 5 sekund, częstotliwość MAS 7,0 kHz, szerokość widmowa 50 kHz i czas skanowania 50 ms. Przesunięcia chemiczne odniesiono do grupy metylowej wzorca zewnętrznego heksametylobenzenu (δ=17,3 ppm), obserwując to przesunięcie dla próbki heksametylobenzenu.

Dane chemicznego przesunięcia dla dihydratu N-(((S)-2-hydroksy-S-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo)-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu (na podstawie przypisania pików poniżej) przedstawiono w tabeli 2.

PL 211 018 B1

Pozycja	Roztwór w DMSO	Dihydrat (stały)
2, 13, 16	169,27, 171,73, 172,89	169,9, 174,1, 176,7*
3, 11, 14	51,45, 47,05, 47,72	46,9, 51,3
4	134,14	134,8*
5, 6	124,18, 125,99	124,0
7	127,19	127,9, 128,9
8	130,38	132,1
9	135,32	136,9*
10, 18	30,73, 31,29	31,1
17	75,01	75,6
19, 20, 22	15,99, 18,66, 19,13	16,6, 21,4
21	34,18	35,3*

Gwiazdki (*) oznaczają piki uzyskane po odsprzęganiu widma.

Tak więc, krystaliczny dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu można charakteryzować metodą jądrowego magnetycznego rezonansu ¹³C w stanie stałym o charakterystycznym przesunięciu chemicznym (ppm): 16,6; 176,7, 174,1, 169,9, 136,9, 134,8,132,1, 127,9, 128,9, 124,0, 75,6, 51,3, 46,9, 35,3, 31,1, 21,4, lub 16,6; dokładniej, 75,6, 35,3, 21,4, lub 16,6; dowolnych dwóch 75,6, 35,3, 21,4 i 16,6; 75,6, 35,3, 21,4 i 16,6; lub przy 176,7, 174,1, 169,9, 136,9, 134,8, 132,1, 127,9, 128,9, 124,0, 75,6, 51,3, 46,9, 35,3, 31,1, 21,4 i 16,6 ppm.

W innym rozwią zaniu przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dihydratu N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu obejmujący krystalizację N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu z wodnych rozpuszczalników w warunkach, które prowadzą do dihydratu N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu.

Dokładne warunki, w których powstaje dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu można określić empirycznie i w praktyce możliwe jest stosowanie tylko niektórych odpowiednich metod.

Tak więc, np. dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu można wytworzyć metodą krystalizacji w kontrolowanych warunkach. Krystalizacje z roztworu i techniki w zawiesinie są objęte zakresem przestawionej metody. W szczególności, dihydrat według wynalazku można wytworzyć metodą krystalizacji z wodnego rozpuszczalnika. Odpowiedni rozpuszczalnik zawiera wystarczającą ilość wody przy stosowanym stężeniu, umożliwiając wytworzenie przedstawionego dihydratu. Korzystne rozpuszczalniki obejmują ciecze mieszalne z wodą, takie jak aceton, niższe alkohole (jak metanol, etanol i izopropanol), kwas octowy i acetonitryl. Stwierdzono w praktyce, że korzystny jest wodny roztwór acetonu. Dla danego wodnego rozpuszczalnika, wodę stosuje się w ilości zależnej od względnej rozpuszczalności N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu w rozpuszczalniku w porównaniu z wodą oraz od tego czy stosuje się krystalizację lub technikę w zawiesinie.

Krystalizację na ogół prowadzi się przez rozpuszczenie N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu w wodnym rozpuszczalniku i następnie oziębienie roztworu, z dodatkiem lub bez dodatkowej ilości wody, prowadzące do uzyskania ciała stałego. Typowo, krystalizację prowadzi się od początkowej temperatury 40°C do temperatury wrzenia wybranego wodnego rozpuszczalnika. Mieszaninę następnie ochładza się uzyskując krystaliczny dihydrat. Korzystne może być szczepienie krystalizacji. Korzystnie roztwór krystalizujący ochładza się powoli. Krystalizację dogodnie prowadzi się od temperatury otoczenia do -20°C.

PL 211 018 B1

Poniżej opisano sposoby wytwarzania laktamów, obejmujących N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-4,5,6,7-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on i sposoby wytwarzania związków pośrednich.

Opisano sposób wytwarzania laktamów o wzorze I

w którym

R1 oznacza alkil, alkenyl, alkinyl, cykloalkil, cykloalkenyl, podstawiony alkil, podstawiony alkenyl, podstawiony alkinyl, podstawiony cykloalkil, podstawiony cykloalkenyl, aryl, heteroaryl i heterocykl;

R2 oznacza alkil, podstawiony alkil, alkenyl, podstawiony alkenyl, alkinyl, podstawiony alkinyl, cykloalkil, aryl, heteroaryl i heterocykl;

R3 oznacza alkil,

X1 oznacza atom wodoru, hydroksy lub fluoro,

X2 oznacza atom wodoru, hydroksy lub fluoro albo

X1 i X2 razem tworzą okso; i

V oznacza od 1 do 3 grup niezależ nie wybranych z grupy obejmują cej takie jak atom wodoru, hydroksy, acyl, acyloksy, alkil, podstawiony alkil, alkoksy, podstawiony alkoksy, alkenyl, podstawiony alkenyl, alkinyl, podstawiony alkinyl, amino, aminoacyl, alkaryl, aryl, arylooksy, karboksy, karboksyalkil, cyjano, atom fluorowca, nitro, heteroaryl, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy i trifluorowcometyl;

obejmujący:

(a1) wydzielanie laktamu o wzorze (4)

W którym R3 i V opisano dla zwią zku o wzorze I, metodą krystalizacji frakcjonowanej jego dibenzoilowinianu, kwasu (R)-(-)-10-kamforosulfonowego i soli kwasu (D)-(-)-migdałowego prowadzącej do związku o wzorze (10)

PL 211 018 B1 (b) sprzęganie z odpowiednim aminokwasem z zabezpieczoną grupą aminową o wzorze PgNHCHR2-C(O)-A, w którym R2 zdefiniowano dla związku o wzorze I i A oznacza grupę aktywującą, np. -OH, -Br, lub -Cl i Pg oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową, z wytworzeniem związku o wzorze (11)

(c) odbezpieczenie związku o wzorze (11) z wytworzeniem związku o wzorze (12); i

(d) sprzęganie związku o wzorze (12) z odpowiednim związkiem o wzorze R1CX1X2-C (O)A1, w którym R1, X1 i X2 opisano dla zwią zku o wzorze I i A1 oznacza grupę aktywują c ą , np. -OH, -Br, lub -Cl; lub (a2) sprzęganie związku o wzorze (10) ze związkiem o wzorze R1CX1X2-C(O)NH-CHR2-C(O)-A, w którym R1, R2, X1 i X2 mają znaczenia zdefiniowane dla związku o wzorze I i A oznacza grupę aktywującą, np. -OH, -Br, lub -Cl.

Stosowane tu poniższe terminy mają następujące znaczenia:

„Alkil odnosi się do jednowartościowych grup alkilowych korzystnie zawierających od 1 do 10 atomów węgla i korzystniej 1 do 6 atomów węgla. Termin ten przykładowo oznacza grupy takie jak metyl, etyl, n-propyl, izo-propyl, n-butyl, izo-butyl, n-heksyl itp.

Termin „C1-C4alkil odnosi się do jednowartościowych grup alkilowych korzystnie zawierających od 1 do 4 atomów węgla. Termin ten przykładowo oznacza grupy takie jak metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, izo-butyl, sec-butyl i tert-butyl.

„Podstawiony alkil odnosi się do grupy alkilowej, korzystnie obejmującej od 1 do 10 atomów węgla, zawierającej od 1 do 5 podstawników i korzystnie 1 do 3 podstawników, wybranych z grupy obejmującej alkoksy, podstawiony alkoksy, cykloalkil, podstawiony cykloalkil, cykloalkenyl, podstawiony cykloalkenyl, acyl, acyloamino, acyloksy, amino, aminoacyl, aminoacyloksy, cyjano, atom fluorowca, hydroksy, karboksy, keto, tioketo, karboksyalkil, tiol, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy, aryl, arylooksy, heteroaryl, heteroarylooksy, heterocykl, hydroksyamino, alkoksyamino, nitro, -SO-alkil, -SO-podstawiony alkil, -SO-aryl, -SO-heteroaryl, -SO2-alkil, -SO2-podstawiony alkil, -SO2-aryl, -SO2-heteroaryl oraz mono- i di-alkiloamino, mono- i di-(podstawiony alkilo)amino, mono- i di-aryloamino, mono- i di-heteroaryloamino, mono- i di-heterocykloamino i niesymetrycznie di-podstawione aminy noszące różne podstawniki wybrane z grupy obejmującej takie jak alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl i heterocykl.

„Alkilen odnosi się do dwuwartościowych grup alkilenowych korzystnie zawierających od 1 do 10 atomów węgla i korzystniej 1 do 6 atomów węgla. Termin ten przykładowo oznacza grupy takie jak metylen (-CH2-), etylen (-CH2CH2-), izomery propylenu (np. -CH2CH2CH2- i -CH(CH3)CH2-) itp.

„Podstawiony alkilen odnosi się do grupy alkilenowej, korzystnie obejmującej od 1 do 10 atomów węgla, zawierającej od 1 do 3 podstawników wybranych z grupy obejmującej takie jak alkoksy, podstawiony alkoksy, acyl, acyloamino, acyloksy, amino, aminoacyl, aminoacyloksy, cyjano, atom fluorowca, hydroksy, karboksy, keto, tioketo, karboksyalkil, tiol, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy,

PL 211 018 B1 aryl, heteroaryl, heterocykl, nitro oraz mono- i di-alkiloamino, mono- i di-(podstawiony alkilo)amino, mono- i di-aryloamino, mono- i di-heteroaryloamino, mono- i di-heterocykloamino i niesymetrycznie di-podstawione aminy noszące różne podstawniki wybrane w grupy obejmującej takie jak alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl i heterocykl. Ponadto, takie podstawione grupy alkilenowe obejmują grupy, w których 2 podstawniki na grupie alkilenowej są skondensowane z wytworzeniem jednego lub więcej cykloalkili, aryli, heterocykli lub heteroaryli skondensowanych z grupą alkilenową. Korzystnie takie skondensowane grupy cykloalkilowe zawierają od 1 do 3 skondensowanych pierścieni.

„Alkenylen odnosi się do dwuwartościowych grup alkenylenowych korzystnie zawierających od 2 do 10 atomów wę gla i korzystniej 2 do 6 atomów wę gla. Termin ten przykł adowo oznacza grupy takie jak etenylen (-CH=CH-), izomery propenylenu (np. -CH2CH=CH- i -C(CH3)=CH-) itp.

„Podstawiony alkenylen odnosi się do grupy alkenylenowej, korzystnie obejmującej od 2 do 10 atomów węgla, zawierającej od 1 do 3 podstawników wybranych z grupy obejmującej takie jak alkoksy, podstawiony alkoksy, acyl, acyloamino, acyloksy, amino, aminoacyl, aminoacyloksy, cyjano, atom fluorowca, hydroksy, karboksy, keto, tioketo, karboksyalkil, tiol, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy, aryl, heteroaryl, heterocykl, nitro i mono- i di-alkiloamino, mono- i di-(podstawiony alkilo)amino, monoi di-aryloamino, mono- i di-heteroaryloamino, mono- i di-heterocykloamino i niesymetrycznie dipodstawione aminy noszące różne podstawniki wybrane z grupy obejmującej takie jak alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl i heterocykl. Ponadto, takie podstawione grupy alkilenowe obejmują grupy, w których 2 podstawniki na grupie alkilenowej są skondensowane z wytworzeniem jednego lub wię cej cykloalkili, aryli, heterocykli lub heteroaryli skondensowanych z grupą alkilenową.

„Alkaryl odnosi się do grup alkilenoarylowych korzystnie zawierających od 1 to 8 atomów węgla w grupie alkilenowej i od 6 do 10 atomów wę gla w grupie arylowej. Takie grupy alkarylowe przykł adowo obejmują benzyl, fenetyl itp.

„Alkoksy odnosi się do grupy „alkilo-O-. Korzystne grupy alkoksylowe obejmują przykładowo grupy takie jak metoksy, etoksy, n-propoksy, izo-propoksy, n-butoksy, tert-butoksy, sec-butoksy, n-pentoksy, n-hexoksy, 1,2-dimetylobutoksy itp.

„Podstawiony alkoksy odnosi się do grupy „podstawiony alkil-O-, gdzie podstawiony alkil ma znaczenie zdefiniowane powyżej.

„Alkiloalkoksy odnosi się do grupy „-alkileno-O-alkilowej, obejmującej przykładowo grupy takie jak metylenometoksy (-CH2OCH3), etylenometoksy (-CH2CH2OCH3), n-propyleno-izo-propoksy (-CH2CH2CH2OCH(CH3)2), metyleno-t-butoksy (-CH2-O-C(CH3)3) itp.

„Alkilotioalkoksy odnosi się do grupy „-alkileno-S-alkilowej, obejmującej przykładowo grupy takie jak metylentiometoksy (-CH2SCH3), etylenotiometoksy (-CH2CH2-SCH3), n-propyleno-tio-izo-propoksy (-CH2CH2CH2SCH (CH3)2), metylenotio-t-butoksy (-CH2SC(CH3)3) itp.

„Alkenyl odnosi się do grup alkenylowych korzystnie obejmujących od 2 do 10 atomów węgla i korzystniej 2 do 6 atomów wę gla i zawierających co najmniej 1 i korzystnie 1-2 alkenylowych miejsc nienasyconych. Korzystne grupy alkenylowe obejmują etenyl (-CH=CH2), n-propenyl (-CH2CH=CH2), izopropenyl (-C(CH3)=CH2) itp.

„Podstawiony alkenyl odnosi się do zdefiniowanej powyżej grupy alkenylowej, zawierającej od 1 do 3 podstawników wybranych z grupy obejmującej takie jak alkoksy, podstawiony alkoksy, acyl, acyloamino, acyloksy, amino, aminoacyl, aminoacyloksy, cyjano, atom fluorowca, hydroksy, karboksy, keto, tioketo, karboksyalkil, tiol, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy, aryl, heteroaryl, heterocykl, nitro, -SO-alkil, -SO-podstawiony alkil, -SO-aryl, -SO-heteroaryl, -SO2-alkil, -SO2-podstawiony alkil, -SO2aryl, -SO2-heteroaryl i mono- i di-alkiloamino, mono- i di-(podstawiony alkilo)amino, mono- i di-aryloamino, mono- i di-heteroaryloamino, mono- i di-heterocykloamino i niesymetrycznie di-podstawione aminy noszące różne podstawniki wybrane z grupy obejmującej takie jak alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl i heterocykl.

„Alkinyl odnosi się do grup alkinylowych korzystnie obejmujących od 2 do 10 atomów węgla i korzystniej 2 do 6 atomów węgla i zawierających co najmniej 1 i korzystnie 1-2 alkinylowe miejsca nienasycone. Korzystne grupy alkinylowe obejmują etynyl (-CH=CH2), propargil (-CH2C=CH) itp.

„Podstawiony alkinyl odnosi się do zdefiniowanej powyżej grupy alkinylowej, zawierającej od 1 do 3 podstawników wybranych z grupy obejmują cej takie jak alkoksy, podstawiony alkoksy, acyl, acyloamino, acyloksy, amino, aminoacyl, aminoacyloksy, cyjano, atom fluorowca, hydroksy, karboksy, keto, tioketo, karboksyalkil, tiol, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy, aryl, heteroaryl, heterocykl, nitro,

PL 211 018 B1

-SO-alkil, -SO-podstawiony alkil, -SO-aryl, -SO-heteroaryl, -SO2-alkil, -SO2-podstawiony alkil, -SO2-aryl, -SO2-heteroaryl i mono- i di-alkiloamino, mono- i di-(podstawiony alkilo)amino, mono- i di-aryloamino, mono- i di-heteroaryloamino, mono- i di-heterocykloamino i niesymetrycznie di-podstawione aminy noszące różne podstawniki wybrane z grupy obejmującej takie jak alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl i heterocykl.

„Acyl odnosi się do grupy alkilo-C(O)-, podstawiony alkilo-C(O)-, cykloalkilo-C(O)-, podstawiony cykloalkilo-C(O)-, arylo-C(O)-, heteroarylo-C(O)- i heterocyklo-C(O)-, przy czym alkil, podstawiony alkil, cykloalkil, podstawiony cykloalkil, aryl, heteroaryl i heterocykl mają zdefiniowane tu znaczenia.

„Acyloamino odnosi się do grupy -C(O)NRR, gdzie każdy R niezależnie oznacza atom wodoru, alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl, lub heterocykl, przy czym alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl i heterocykl mają zdefiniowane tu znaczenia.

„Aminpacyl odnosi się do grupy -NRC(O)R, gdzie każdy R niezależnie oznacza atom wodoru, alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl, lub heterocykl, przy czym alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl i heterocykl mają zdefiniowane tu znaczenia.

„Aminoacyloksy odnosi się do grupy -NRC(O)OR, gdzie każdy R niezależnie oznacza atom wodoru, alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl, lub heterocykl, przy czym alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl i heterocykl mają zdefiniowane tu znaczenia.

„Acyloksy odnosi się do grupy alkilo-C(O)O-, podstawiony alkilo-C(O)-, cykloalkilo-C(O)O-, arylo-C(O)O-, heteroarylo-C(O)O- i heterocyklo-C(O)0-, przy czym alkil, podstawiony alkil, cykloalkil, aryl, heteroaryl i heterocykl mają zdefiniowane tu znaczenia.

„Aryl odnosi się do nienasyconej aromatycznej grupy karbocyklicznej o 6 do 14 atomach węgla w pojedynczym pierścieniu (np. fenyl) lub wielokrotnie skondensowanych (skondensowanych) pierścieni (np. naftyl lub antryl). Korzystne aryle obejmują fenyl, naftyl itp.

Jeśli nie wskazano w definicji podstawnika arylowego, takie aryle mogą ewentualnie być podstawione przez od 1 do 5 podstawników wybranych z grupy obejmującej takie jak acyloksy, 1 do 5 oraz korzystnie 1 do 3 podstawników wybranych z grupy obejmującej takie jak hydroksy, acyl, alkil, alkoksy, alkenyl, alkinyl, podstawiony alkil, podstawiony alkoksy, podstawiony alkenyl, podstawiony alkinyl, amino, aminoacyl, acyloamino, alkaryl, aryl, arylooksy, azydo, karboksy, karboksyalkil, cyjano, atom fluorowca, nitro, heteroaryl, heterocykl, aminoacyloksy, oksyacyloamino, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy, tioarylooksy, tioheteroarylooksy, -SO-alkil, -SO-podstawiony alkil, -SO-aryl, -SO-heteroaryl, -SO2-alkil, -SO2-podstawiony alkil, -SO2-aryl, -SO2-heteroaryl, trifluorowcometyl, mono- i di-alkiloamino, mono- i di-(podstawiony alkilo)amino, mono- i di-aryloamino, mono- i di-heteroaryloamino, mono- i di-heterocykloamino i niesymetrycznie di-podstawione aminy noszące różne podstawniki wybrane z grupy obejmującej takie jak alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl i heterocykl itp. Korzystne podstawniki obejmują alkil, alkoksy, atom fluorowca, cyjano, nitro, trifluorowcometyl i tioalkoksy.

„Arylooksy odnosi się do grupy arylo-O-, gdzie grupa arylowa ma znaczenie zdefiniowane powyżej i obejmuje ewentualnie podstawione grupy arylowe określone powyżej.

„Karboksyalkil odnosi się do grupy „-C(O)Oalkil, gdzie alkil ma znaczenie zdefiniowane powyżej.

„Cykloalkil odnosi się do cyklicznych grup alkilowych o 3 do 12 atomach węgla obejmujących pojedynczy pierścień cykliczny lub wielokrotnie skondensowane pierścienie, obejmujące skondensowane, zmostkowane i spiro bicykliczne lub multicykliczne związki. Takie grupy cykloalkilowe przykładowo obejmują pojedyncze pierścienie takie jak cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklooktyl itp., lub wielokrotne pierścienie takie jak adamantanyl itp.

„Podstawiony cykloalkil odnosi się do grup cykloalkilowych zawierających od 1 do 5 (korzystnie 1 do 3) podstawników wybranych z grupy obejmują cej takie jak hydroksy, acyl, acyloksy, alkil, podstawiony alkil, alkoksy, podstawiony alkoksy, alkenyl, podstawiony alkenyl, alkinyl, podstawiony alkinyl, amino, aminoacyl, alkaryl, aryl, arylooksy, keto, tioketo, karboksy, karboksyalkil, cyjano, atom fluorowca, nitro, heteroaryl, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy, trifluorowcometyl itp.

„Cykloalkenyl odnosi się do cyklicznych grup alkenylowych o 4 do 8 atomach węgla obejmujących pojedynczy pierścień cykliczny i co najmniej jedno miejsce wewnętrznego nienasycenia. Przykłady odpowiednich grup cykloalkenylowych obejmują cyklobut-2-enyl, cyklopent-3-enyl, cyklookt-3-enyl itp.

PL 211 018 B1 „Podstawiony cykloalkenyl odnosi się do grup cykloalkenylowych zawierających od 1 do 5 podstawników wybranych z grupy obejmującej takie jak hydroksy, acyl, acyloksy, alkil, podstawiony alkil, alkoksy, podstawiony alkoksy, alkenyl, podstawiony alkenyl, alkinyl, podstawiony alkinyl, amino, aminoacyl, alkaryl, aryl, arylooksy, karboksy, keto, tioketo, karboksyalkil, cyjano, atom fluorowca, nitro, heteroaryl, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy, trifluorowcometyl itp.

„Fluorowco lub „atom fluorowca odnosi się do atomu fluoru, chloru, bromu i jodu i korzystnie oznacza atom fluoru lub atom chloru.

„Heteroaryl odnosi się do aromatycznej grupy karbocyklicznej zawierającej od 1 do 15 atomów węgla i 1 do 4 heteroatomów wybranych w grupy obejmującej takie jak atom tlenu, azotu i siarki w co najmniej jednym pierścieniu (jeśli występuje więcej niż jeden pierścień).

Jeśli nie wskazano w definicji podstawnika heteroarylowego, takie heteroaryle mogą być ewentualnie podstawione przez 1 do 5 podstawników wybranych z grupy obejmującej takie jak alkil, podstawiony alkil, alkoksy, podstawiony alkoksy, aryl, arylooksy, atom fluorowca, nitro, heteroaryl, tiol, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy, tioarylooksy, trifluorowcometyl itp. Takie heteroaryle mogą obejmować pojedynczy pierścień (np. pirydyl lub furyl) lub wielokrotnie skondensowane pierścienie (np. indolizynyl lub benzotienyl), a w tym skondensowane, zmostkowane i spirobicykliczne lub multicykliczne związki. Korzystne heteroaryle obejmują pirydyl, pirolil i furyl.

„Heterocykl lub „heterocykliczny odnosi się do jednowartościowej nasyconej lub nienasyconej grupy obejmującej pojedynczy pierścień lub wielokrotnie skondensowane pierścienie, a w tym skondensowane, zmostkowane i spirobicykliczne lub multicykliczne związki, zawierające od 1 do 15 atomów węgla i od 1 do 4 heteroatomów wybranych w grupy obejmującej takie jak atom azotu, siarki lub tlenu w pierścieniu.

Jeśli nie wskazano w definicji podstawnika heterocyklicznego, takie grupy heterocykliczne mogą być ewentualnie podstawione przez 1 do 5 podstawników wybranych z grupy obejmującej takie jak alkil, podstawiony alkil, alkoksy, podstawiony alkoksy, aryl, arylooksy, atom fluorowca, nitro, heteroaryl, tiol, tioalkoksy, podstawiony tioalkoksy, tioarylooksy, trifluorowcometyl itp. Takie heterocykle mogą obejmować pojedynczy pierścień lub wielokrotnie skondensowane pierścienie. Korzystne heterocykle obejmują morfolino, piperydynyl itp.

Przykłady heterocykli i heteroaryli zawierających atom azotu obejmują między innymi grupy takie jak pirol, imidazol, pirazol, pirydyna, pirazyna, pirymidyna, pirydazyna, indolizyna, izoindol, indol, indazol, puryna, chinolizyna, izochinolina, chinolina, ftalazyna, naftylopirydyna, chinoksalina, chinazolina, cynnolina, pterydyna, karbazol, karbolina, fenantridyna, akrydyna, fenantrolina izotiazol, fenazyna, izoksazol, fenoksazyna, fenotiazyna imidazolidyna, imidazolina, piperydyna, piperazyna, indolina, morfolina, piperydynyl, tetrahydrofuranyl itp. jak również heterocykle zawierające ugrupowanie N-alko-ksylo-azot.

„Oksyacyloamino odnosi się do grupy -OC(O)NRR, w której każdy R niezależnie oznacza atom wodoru, alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl, lub heterocykl, przy czym alkil, podstawiony alkil, aryl, heteroaryl i heterocykl mają zdefiniowane tu znaczenia.

„Tiol odnosi się do grupy -SH.

„Tioalkoksy odnosi się do grupy -S-alkil.

„Podstawiony tioalkoksy odnosi się do grupy -S-podstawiony alkil.

„Tioarylooksy odnosi się do grupy arylo-S-, gdzie grupa arylowa ma znaczenie zdefiniowane powyżej i obejmuje ewentualnie podstawione grupy arylowe także określone powyżej.

„Heteroarylooksy odnosi się do grupy heteroarylo-O-, gdzie grupa heteroarylowa ma znaczenie zdefiniowane powyżej i obejmuje ewentualnie podstawione grupy arylowe także określone powyżej.

Poniżej przedstawiono sposoby wytwarzania związku o wzorze (4), wskazane na schematach 1 i 2. Na poniższych schematach, wszystkie podstawniki, jeśli nie określono tego inaczej, mają uprzednio podane znaczenie i wszystkie reagenty są dobrze znane i docenione w dziedzinie.

PL 211 018 B1

Według Schematu 1, w etapie 1, odpowiednią N-alkilofenetyloaminę o wzorze (1) acyluje się odpowiednim bisalkoksykarbonylooctanowym czynnikiem przenoszącym z wytworzeniem związku o wzorze (2). Odpowiednia N-alkilofenetyloamina o wzorze (1) zawiera grupy V i R3 pożądane w koń cowym produkcie o wzorze I. Takie N-alkilofenetyloaminy można łatwo wytworzyć na drodze reakcji 2-bromo lub 2-chloroetylobenzenu z aminą o wzorze H2N-R3 w warunkach dobrze znanych i docenionych w dziedzinie. Odpowiednim bisalkoksykarbonylooctanowym czynnikiem przenoszącym jest związek, w którym R4 oznacza C1-C4alkil, oraz który przenosi grupę bisalkoksykarbonyloacetylową do związku o wzorze (1), obejmujący związki takie jak kwasy bisalkoksykarbonylooctowe i chlorki bisalkoksy-karbonyloacetylowe. (Patrz Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439-450 (1987)).

Np. odpowiednią N-alkilofenetyloaminę o wzorze (1) łączy się z odpowiednim kwasem bisalkoksykarbonylooctowym z wytworzeniem związku o wzorze (2). Takie reakcje sprzęgania są powszechnie znane w syntezie peptydów i można stosować przedstawione tutaj metody syntetyczne. Np. w celu ułatwienia acylowania można stosować dobrze znany reagent sprzęgający taki jak karbodiimidy z lub bez wprowadzeniem dobrze znanych dodatków takich jak N-hydroksysukcynoimid, 1-hydroksybenzotriazol itp. W takich reakcjach sprzęgania często stosuje się odpowiednią zasadę w celu usuwania kwasu wytwarzanego podczas reakcji. Odpowiednie zasady przykładowo obejmują związki takie jak trietyloamina, N,N-diizopropyloetyloamina, N-metylomorfolina itp. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w obojętnym aprotonowym polarnym rozcieńczalniku takim jak dimetyloformamid, chlorek metylenu, chloroform, acetonitryl, tetrahydrofuran itp. Zazwyczaj reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od 0°C do 60°C i w ogólności w czasie od 1 do 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (2) odzyskuje się typowymi metodami obejmującymi takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Alternatywnie, np. odpowiednią N-alkilofenetyloaminę o wzorze (1) łączy się z odpowiednim chlorkiem bisalkoksykarbonyloacetylu z wytworzeniem związku o wzorze (2). Takie chlorki kwasowe można łatwo wytworzyć z odpowiednich kwasów metodami dobrze znanymi w dziedzinie, takimi jak działanie trichlorkiem fosforu, oksychlorkiem fosforu, pentachlorkiem fosforu, chlorkiem tionylu lub chlorkiem oksalilu, z dodatkiem lub bez dimetyloformamidu w małej ilości, w obojętnym rozpuszczalniku takim jak toluen, chlorek metylenu, lub chloroform; w zakresie temperatur 0-80°C. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w okresie czasu od, 1 godziny do 24 godzin. Chlorek kwasowy można wydzielić i oczyścić lub też można stosować bezpośrednio, tj. z lub bez oddzielania i/lub oczyszczania. W takich reakcjach acylowania na ogół stosuje się odpowiednią zasadę w celu usuwania kwasu wytwarzanego podczas reakcji. Odpowiednie zasady obejmują przykładowo związki takie jak pirydyna, trietyloamina, N,N-diizopropyloetyloamina, N-metylomorfolina itp. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w obojętnym aprotonowym polarnym rozcieńczalniku takim jak chlorek metylenu, chloroform, tetrahydrofuran itp.

PL 211 018 B1

Zazwyczaj reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od -20°C do 80°C i na ogół w okresie czasu od 1 do 24 godzin. Po zakoń czeniu reakcji, produkt o wzorze (2) odzyskuje się typowymi metodami obejmującymi metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Według Schematu 1, w etapie 2, związek o wzorze (2) cyklizuje się z wytworzeniem związku o wzorze (3).

Np. związek o wzorze (2) łączy się z kwasem takim jak kwas trifluorometanosulfonowy lub kwas siarkowy. Reakcję zazwyczaj prowadzi się stosując wybrany kwas jako rozpuszczalnik. Na ogół reagenty wstępnie miesza się w zakresie temperatur od -20°C do 0°C i następnie pozostawia do ogrzania od temperatury otoczenia do 60°C. Reakcję cyklizacji na ogół prowadzi się w okresie czasu od 12 do 72 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (2) odzyskuje się typowymi metodami obejmującymi metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Według Schematu 1, w etapie 3, związek o wzorze (3) odbezpiecza się uzyskując związek o wzorze (4).

Usuwanie takich alkoksykarbonylowych zabezpieczających grup aminowych jest dobrze znane i docenione w dziedzinie: Np. patrz. Protecting Groups in Organic Synthesis, Theodora Greene (Wydanie 1 i 2, Wiley-Interscience) i Ben-Ishai, Tetrahedron, 43, 439-450 (1987).

PL 211 018 B1

Według Schematu 2, w etapie 1, odpowiednią pochodną kwasu fenylooctowego o wzorze (5) sprzęga się z odpowiednim acetalem o wzorze (6) z wytworzeniem związku o wzorze (7). Odpowiednią pochodną kwasu fenylooctowego o wzorze (5) stanowi związek, w którym w pożądanym końcowym produkcie o wzorze I występuje V i A2 oznacza grupę aktywującą, np. -OH, -Cl, lub -Br. Odpowiedni acetal o wzorze (6) zawiera w pożądanym końcowym produkcie o wzorze I grupę R3 i R5 oznaczający C1-C4alkil. Takie reakcje sprzęgania są powszechnie znane w syntezie peptydów i można stosować opisane tutaj metody syntetyczne przedstawione na Schemacie 1, w etapie 1.

Także, reakcje sprzęgania przedstawione na Schemacie 2, w etapie 2, można prowadzić według Schotten-Baumann'a stosując halogenek kwasowy odpowiedniego kwasu fenylooctowego o wzorze (5) i odpowiedni acetal o wzorze (6) w mieszanym rozpuszczalniku takim jak eter metylo-t-butylowy, octan etylu, tetrahydrofuran, aceton lub eter dietylowy i woda. Reakcje tego typu prowadzi się stosując odpowiednią zasadę, taką jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, węglan sodu, węglan potasu, wodorowęglan sodu lub wodorowęglan potasu. Typowo mieszaninę reakcyjną miesza się lub dodatkowo miesza się energicznie i reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od -20°C do 80°C i na ogół w okresie czasu od 1 do 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (7) odzyskuje się typowymi metodami obejmującymi metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Według Schematu 2, w etapie 2, związek o wzorze (7) cyklizuje się z wytworzeniem związku o wzorze (8). Takie reakcje cyklizacji prowadzi się w kwasie takim jak kwas siarkowy. Zazwyczaj kwas stosuje się jako rozpuszczalnik. Typowo, reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od -20°C do 150°C i na ogół w okresie czasu od 1 do 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (8) odzyskuje się typowymi metodami obejmującymi metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Według Schematu 2, w etapie 3, związek o wzorze (8) ulega reakcji przeniesienia grupy aminowej z wytworzeniem związku o wzorze (9). Na Schemacie 2 przedstawiono wytwarzanie oksymów (oksymowanie). Takie oksymowanie obejmuje kontaktowanie enolanu związku o wzorze (8) z czynnikiem oksymującym, takim jak azotyn alkilu. Enolan związku o wzorze (8) można wytworzyć poprzez poddanie reakcji związku o wzorze (8) z odpowiednią zasadą taką jak t-butanolan potasu, diizopropyloamidek litu, heksametylodisilazydek litu, heksametylodisilazydek sodu, heksametylodisilazydek potasu itp. Takie reakcje oksymowania są przykładowo przedstawione przez Wheeler'a i in., Organic Syntheses, Coll. tom VI, str. 840, gdzie jest opisana reakcja azotynu izoamylu z zastosowaniem ketonu w celu przygotowania pożądanego oksymu. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w rozpuszczalniku takim jak tetrahydrofuran. Typowo, reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od -20°C do 50°C i na ogół w okresie czasu od 1 do 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (8) odzyskuje się typowymi metodami obejmującymi metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Alternatywnie, takie reakcje przeniesienia aminy można przeprowadzić stosując azydek. Azydek można otrzymać na drodze reakcji enolanu związku o wzorze (8) z czynnikiem azydującym, takim jak azydek toluenosulfonylu i azydek triizopropylobenzenosulfonylu. Reakcje tego typu są przykładowo przedstawione przez Evans'a i in., J. Am. Chem. Soc, 112:4011-4030 (1990)41. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w rozpuszczalniku takim jak tetrahydrofuran. Typowo, reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od -20°C do 50°C i na ogół w okresie czasu od 1 do 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (8) zawierający azydek zamiast oksymu odzyskuje się typowymi metodami obejmującymi metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Jak to przedstawiono na Schemacie 2, w etapie 4, oksym redukuje się do związku o wzorze (4). Takie reakcje redukcji obejmują traktowanie atomem wodoru i odpowiednim katalizatorem, takim jak Nikiel Raney'a lub katalizatory palladowe, takie jak pallad na węglu. Reakcję zazwyczaj prowadzi się w rozpuszczalniku takim jak tetrahydrofuran, octan etylu lub ni ż sze alkohole, takie jak metanol, etanol i izopropanol, kwas octowy, woda, wodny roztwór amoniaku itp. oraz ich mieszaniny. Reakcj ę na ogół prowadzi się pod ciśnieniem wodoru w zakresie od ciśnienia atmosferycznego do (600 psi) 4137 kPa. Typowo, reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od 20°C do 100°C i na ogół w okresie czasu od 1 do 24 godzin. Po zakończeniu reakcji, produkt o wzorze (4) odzyskuje się typowymi metodami obejmującymi metody takie jak ekstrakcja, wytrącanie, chromatografia, filtracja, rozcieranie, krystalizacja itp.

Alternatywnie, jeśli aminę przenosi się poprzez azydek, wówczas redukuje się grupę azydową. Takie reakcje redukcji prowadzi się przez uwodornienie, jak opisano powyżej.

PL 211 018 B1

Poniżej opisano stereospecyficzne sposoby wytwarzania laktamów, związków o wzorze I, obejmujących N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on i sposoby wytwarzania chiralnych związków pośrednich. Takie metody przedstawiono na Schemacie A.

Schemat A

Schemat A, w etapie 1, przedstawia stereochemiczne wydzielanie odpowiedniego laktamu o wzorze (4) prowadzą ce do laktamu o wzorze (10). Fachowcy w dziedzinie docenią , ż e przedstawione metody nie są koniecznie ograniczone do wytwarzania pojedynczego izomeru. Raczej, przedstawione metody umożliwiają wytwarzanie specyficznych enancjomerów laktamów i są szczególnie odpowiednie do otrzymywania izomerów 1-amino-3-alkil-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onów.

Większą aktywność biologiczną wykazuje (S)-izomer grupy 2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu.

Stosowany tu termin „zasadniczo czysty odnosi się do czystości enancjomerycznej (R)- lub (S)-laktamu i szczególnie (R)- i (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu. Można wytworzyć zasadniczo czysty (S)-1-amino-3-alkilo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on zawierający (S)-enancjomer w ilości powyżej 80%, korzystnie powyżej 90%, korzystniej powyżej 95%, najkorzystniej powyżej 97%.

Np. pojedyncze izomery związku o wzorze (4) można rozdzielać metodą krystalizacji frakcjonowanej dibenzoilowinianu, kwasu (R)-(-)-10-kamforosulfonowego i soli kwasu (D)-(-)-migdałowego. Oczekuje się, że do tego celu odpowiednie są rozmaite dibenzoilowiniany. W szczególności, korzystne są estry dibenzoilowe zawierające podstawnik w pozycji para wybrany z grupy obejmującej atom wodoru, atom fluorowca, C1-C4 alkil i C1-C4 alkoksy, przy czym bardziej korzystne są di-p-toluoilowiniany. W celu wytworzenia (S)-izomeru stosuje się di-p-toluoilo-1-winian.

PL 211 018 B1

W korzystnym rozwiązaniu według Schematu A, w etapie 1, związek o wzorze (4) zawiera grupę V stanowiącą atom wodoru i R3 oznacza C1-C4alkil, obejmujący metyl, etyl, propyl, izo-propyl, butyl, izo-butyl i sec-butyl; i najbardziej korzystne jest stosowanie związków o wzorze (4), w którym V oznacza atom wodoru i R3 oznacza metyl.

Według przedstawionej metody, związek o wzorze (4) łączy się z wybranym kwasem. Na ogół, można stosować od 0,4 równoważników molowych do dużego nadmiaru wybranego kwasu, przy czym korzystnie stosuje się od 0,4 do 1,5 równoważników molowych i jeszcze bardziej korzystnie od 0,5 do 1,1 równoważników molowych.

Operację typowo prowadzi się metodą krystalizacji soli addycyjnej kwasu z roztworu. W szczególności, odpowiednie są rozpuszczalniki takie jak niższe alkohole, obejmujące metanol, etanol, n-propanol, izopropanol, butanol, sec-butanol, izo-butanol, t-butanol, alkohol amylowy, alkohol izo-amylowy, alkohol t-amylowy, heksanol, cyklopentanol i cykloheksanol, przy czym korzystne są metanol, etanol i izopropanol. Korzystnie można stosować rozpuszczalnik o przeciwnych właściwościach.

Stosowany tu termin „rozpuszczalnik o przeciwnych właściwościach odnosi się do rozpuszczalnika, w którym sól jest znacznie słabiej rozpuszczalna w porównaniu z rozpuszczalnikiem. Korzystnie, stosuje się rozpuszczalnik o przeciwnych właściwościach, który łatwo miesza się z wybranym rozpuszczalnikiem. Odpowiednie rozpuszczalnik o przeciwnych właściwościach i obejmują etery, takie jak eter dietylowy, eter metylo-t-butylowy itp. i niższe octany alkilu, takie jak octan metylu, octan etylu, octan izo-propylu, octan propylu, octan izo-butylu, octan sec-butylu, octan butylu, octan amylu, octan izo-amylu itp. oraz alkany, takie jak pentan, heksan, heptan, cykloheksan itp. Jeśli przedstawioną metodę prowadzi się przez krystalizację soli addycyjnej kwasu z mieszaniny racemicznej, należy zwracać szczególną uwagę przy stosowaniu rozpuszczalnika o przeciwnych właściwościach w celu uniknięcia krystalizacji niepożądanej soli diastereomerycznej.

Typowo, krystalizację prowadzi się od początkowej temperatury 40°C do temperatury wrzenia wybranego rozpuszczalnika (rozpuszczalników) i z początkowymi stężeniami od 0,05 stężenia molowego do 0,25 molowego. Mieszaninę następnie ochładza się uzyskując sól. Korzystne może być zaszczepianie krystalizacji. Ponadto korzystnie miesza się początkowy osad przez od 4 do 48 godzin. Korzystnie krystalizujący roztwór ochładza się powoli. Krystalizację najbardziej dogodnie prowadzi się w temperaturze od temperatury otoczenia do -20°C. Sól moż na zbierać stosują c techniki dobrze znane w dziedzinie, obejmujące metody takie jak filtracja, dekantacja, odwirowywanie, odparowanie, suszenie itp. Związek o wzorze (10) można stosować bezpośrednio jako sól addycyjną wybranego kwasu. Alternatywnie, przed użyciem związek o wzorze (10) można wydzielić jako inną sól addycyjną kwasu po wymianie kwasu lub można też wydzielić jako zasadę metodą ekstrakcji w warunkach zasadowych, co jest dobrze znane i docenione w dziedzinie.

Dynamiczne wydzielanie (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu o znacznej czystości enancjomerycznej polega na krystalizacji 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu jako jego soli addycyjnej kwasu, przy czym kwas jest wybrany z grupy obejmującej kwas di-p-tolilo-L-winowy, kwas (R)-(-)-10-kamforosulfonowy i kwas (D)-(-)-migdałowy, w obecności aromatycznego aldehydu. Metoda dynamiczna daje tę korzyść, że podczas krystalizacji 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on ulega konwersji do pojedynczego izomeru, tak więc, umożliwia polepszenie wydajności i uniknięcie odpadowego strumienia z niepożądanym izomerem.

Oczekuje się, że w przedstawionej metodzie odpowiednie są rozmaite aldehydy, przy czym stwierdzono, że w praktyce niektóre aldehydy są szczególnie odpowiednie. Specyficznie, stwierdzono, że korzystne są kwasy salicylowe i aldehyd salicylowy, aldehyd 5-nitrosalicylowy i aldehyd 3,5-dichlorosalicylowy są bardziej korzystne w przedstawionej metodzie dynamicznego rozdzielania.

Zgodnie z tym, gdy przedstawioną metodę realizuje się jako dynamiczne wydzielanie, 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on łączy się z wybranym kwasem w obecności aldehydu. Na ogół, w dynamicznym rozdzielaniu stosuje się od 0,9 do 1,2 równoważników molowych kwasu, przy czym korzystny jest około 1 równoważnik molowy. Aldehyd zazwyczaj wykorzystuje się w katalitycznej iloś ci. Typowo, stosuje się od 0,5 do 0,001 równoważ ników molowych aldehydu, przy czym korzystne jest od 0,1 do 0,01 równoważników molowych.

Metodę dynamiczną typowo realizuje się w przedstawionym powyżej rozpuszczalniku lub rozpuszczalniku bez rozpuszczalnika o przeciwnych właściwościach. Mieszaninę 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetra-1H-3-benzazepin-2-onu, wybranego kwasu i aldehydu miesza się w celu umożliwienia konwersji do pożądanego izomeru. Na ogół konwersję prowadzi się w zakresie temperatur od temperatury otoczenia do temperatury wrzenia rozpuszczalnika. Na ogół konwersja wymaga od 6 do 48 godzin.

PL 211 018 B1

Fachowcy w dziedzinie docenią, że, gdy przedstawioną metodę prowadzi się jako dynamiczne wydzielanie, zastosowanie soli addycyjnej kwasu (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu możne być utrudnione ze względu na obecność w wydzielonym produkcie aldehydu, w małej ilości. Tak więc, po dynamicznym rozdzielaniu korzystne jest przed stosowaniem lub otrzymywaniem zasady, wydzielenie (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu przez wytworzenie soli, korzystnie w postaci chlorowodorku.

Fachowcy w dziedzinie zauważą, że związki o wzorze (10) można stosować w rozmaitych metodach w celu przygotowania związków przydatnych do leczenia choroby Alzheimera. Metody te przedstawiono w zgłoszeniu PCT nr PCT/US97722986, złożonym 22 grudnia 1997 i opisane poniżej. Metody tu opisane charakteryzującą się tym, że prowadzą do związków o wzorze I umożliwiając korzystne rozdzielanie, jak przedstawiono na Schemacie A, w etapie 1.

Schemat A, w etapie 2, przedstawia reakcję sprzęgania odpowiedniego aminokwasu z zabezpieczoną grupą aminową o wzorze PgNH-CHR2-C(O)-A i odpowiedniego laktamu o wzorze (10). Odpowiedni aminokwas z zabezpieczoną grupą aminową to taki związek, w którym Pg oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową, w pożądanym końcowym produkcie o wzorze I występuje R2 i A oznacza grupę aktywującą, np. -OH lub -Cl, umożliwiającą sprzęganie grupy aminowej związku o wzorze (10). Takie aminokwasy z zabezpieczoną grupą aminową są łatwo dostępne dla fachowców w dziedzinie.

Korzystny aminokwas z zabezpieczoną grupą aminową o wzorze PgNH-CHR2-C(O)-A to taki, w którym Pg oznacza t-butoksykarbonyl i benzyloksykarbonyl, R2 oznacza metyl i który ma stereochemię 1-aminokwasu.

Reakcje sprzęgania przedstawione na Schemacie reakcji A, w etapie 2 obejmują reakcję typowo stosowaną w syntezie peptydu i można także stosować przedstawione tutaj metody syntetyczne. Metody te przedstawiono szczegółowo na Schemacie 1, w etapie 1.

Schemat reakcji A, w etapie 3, przedstawia odbezpieczenie związku o wzorze (11) z wytworzeniem związku o wzorze (12). Takie odbezpieczanie grup zabezpieczających grupę aminową jest dobrze znane i docenione w dziedzinie.

Schemat reakcji A, w etapie 4, przedstawia reakcję sprzęgania odpowiedniego związku o wzorze (13), R1CX1X2-C (O) A1 i związku o wzorze (12) z wytworzeniem związku o wzorze I. Odpowiednie związki o wzorze (13) obejmują związki, w których R1, X1 i X2 są pożądane w końcowym produkcie o wzorze I i są dobrze znane w dziedzinie, opisane w zgł oszeniu POT nr PCT/US97722986, z ł oż onym 22 grudnia 1997 i tam przedstawione. Odpowiedni związek o wzorze (13) może także mieć stereochemię pożądaną w końcowym związku o wzorze I. Reakcję sprzęgania przedstawioną według etapu 3 prowadzi się stosując kwas o wzorze (13) (związki, w których A1 oznacza -OH) lub pochodzący od niego halogenek kwasowy (związki, w których A1 oznacza -Cl lub -Br), podobnym sposobem do przedstawionego na Schemacie 1, w etapie 1.

Alternatywny sposób otrzymywania związków o wzorze I przedstawiono na Schemacie A, w etapie 5, który wskazuje reakcję sprzęgania odpowiedniego związku o wzorze (10) i odpowiedniego związku o wzorze (14), R1CX1X2-C(O)-NH-CHR2-C(O)A2, bezpośrednio do związku o wzorze I. Odpowiedni związek o wzorze (10) przedstawiono w etapie 2. Odpowiednim związkiem o wzorze (14) jest taki związek, w którym występują grupy R1, X1, X2 i R2 pożądane w końcowym produkcie o wzorze I. Odpowiednim związkiem o wzorze (14) jest także związek, który ma stereochemię pożądaną w końcowym produkcie o wzorze I.

Związki o wzorze (14) można łatwo wytworzyć przez sprzęganie aminokwasów z zabezpieczoną grupą karboksylową, H2N-CHR2-C(O)OPg1, ze związkami o wzorze (13), przedstawionymi powyżej. Reakcje sprzęgania tego typu są dobrze znane w dziedzinie i prowadzą do produktu, który po odbezpieczeniu, daje związek o wzorze (14).

Poniżej zamieszczono przykłady i opisy preparatywne.

Terminy stosowane w przykładach i opisach preparatywnych mają normalne znaczenia, jeśli nie wskazano tego inaczej. Np. „°C odnosi się do stopni Celsjusza; „mmol odnosi się do milimola lub milimoli; „g odnosi się do grama lub gramów; „ml odnosi się mililitra lub mililitrów; „solanka odnosi się do nasyconego wodnego roztworu chlorku sodu; „THF odnosi się do tetrahydrofuranu; „HPLC odnosi się do wysokociśnieniowej, chromatografii cieczowej; itp.

PL 211 018 B1

P r z y k ł a d 1

Synteza 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu

Do zawiesiny wodorku sodu (1,1 równoważnika w 15 ml suchego DMF dodano 2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (0,0042 moli) w postaci roztworu w 10 ml DMF. Następnie dodano jodek etylu (około 2 równoważniki). Gdy metodą TLC stwierdzono zakończenie reakcji, mieszaninę reakcyjną wylano na lód i ekstrahowano octanem etylu. Warstwę organiczną przemyto wodą, następnie solanką. Warstwę organiczną osuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą HPLC (LC 2000), eluując układem octan etylu/heksan, uzyskując 3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on.

3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (1 równoważnik) rozpuszczono w THF i dodano azotyn izoamylu (1,2 równoważnika). Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C w łaźni lodowej. Dodano kroplami NaHMDS (1,1 równoważnika, 1M w THF). Po wymieszaniu przez 1 godzinę lub po zakończeniu reakcji, mieszaninę zatężono, zakwaszono 1N wodnym roztworem kwasu chlorowodorowego i ekstrahowano octanem etylu. Organiczną część osuszono i zatężono uzyskując surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym, uzyskując 1-hydroksyimino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on: Spektroskopia masowa (M+H)⁺, 205,1.

1-hydroksyimino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on rozpuszczono w EtOH/NH3 (20:1) i uwodorniano w autoklawie pod ciśnieniem stosując nikiel Raney'a i wodór (500 psi/3447 kPa) w temperaturze 100°C przez 10 godzin. Uzyskaną mieszanin ę przesą czono i zatężono, uzyskują c olej, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym, uzyskując tytułowy związek.

P r z y k ł a d 2

Synteza 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu

Do 20 1 kolby Morton'a dodano MTBE (5,52 1, 7 objętości) i dimetyloacetal (N-metyloamino)acetaldehydu (614 g, 5 moli), uzyskując roztwór w temperaturze pokojowej. Roztwór wodorowęglanu sodu wytworzono przez dodanie wodorowęglanu sodu (546 g, 6,5 mola) i wody (6,31 1, 8 objętości) do kolby reakcyjnej Morton'a. Mieszaninę ochłodzono do temperatury poniżej 10°C i do tej ochłodzonej mieszaniny reakcyjnej kroplami dodawano przez 1 godzinę roztwór MTBE (789 ml) w chlorku fenyloacetylu (789 g, 5 moli). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Na tym etapie metodą analizy HPLC wykazano zakończenie reakcji. Ekstrahowano MTBE (4 objętości), osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i zatężono w wyparce obrotowej, uzyskując 1,187 kg (98%) N-metylo-N-(2,2-dimetoksyetylo)fenyloacetamidu w postaci cieczy, (M+H)⁺ = 237,9.

Do 5 l kolby Morton'a w atmosferze azotu dodano H2SO4 (1,42 l). Kroplami do kolby reakcyjnej dodano N-metylo-N-(2,2-dimetoksyetylo)fenyloacetamid (712 g, 3 mole), co wywołało silną reakcję egzotermiczną (22 do 78°C). Uzyskaną mieszaninę ogrzewano następnie w temperaturze 110°C przez 3 godziny, po czym ochłodzono do temperatury pokojowej i przeniesiono do 20 l kolby Morton'a. W temperaturze poniż ej 10°C reakcję zatrzymano wodnym roztworem wodorotlenku sodu (9,18 l, 5N). Ekstrahowano octanem etylu (2 X 2,85 l), osuszono siarczanem sodu, następnie zatężono, uzyskując 3-metylo-6,7-dihydro-1H-3-benzazepin-2-on w postaci ciała stałego (520 g) (73,5%). Tę substancję można krystalizować ponownie z MTBE w celu zwiększeniu czystości, uzyskując ciało stałe, temperatura topnienia = 81-82°C; (M+H)⁺ = 174,2.

Roztwór THF (0,5 l) w 3-metylo-6,7-dihydro-1H-3-benzazepin-2-onie (113,8 g, 0,657 mola) ochłodzono do temperatury 0°C i dodano kroplami azotyn izoamylu (100,75 g, 0,86 mola). Do uzyskanej mieszaniny dodano LiHMDS (1N roztwór THF, 854 ml, 0,854 mola) tak, aby temperaturę utrzymać poniżej 10°C. Następnie mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2-3 godziny i przebieg reakcji monitorowano metodą HPLC. Po zakoń czeniu reakcji, mieszaninę ochł odzono do temperatury 0°C i pH uregulowano od 12 do 2-3, stosując wodny roztwór HCl (2N). Uzyskany osad mieszano przez 12-16 godzin, po czym przefiltrowano, osuszono, uzyskując 1-hydroksyimino-3-metylo-6,7-dihydro-1H-3-benzazepin-2-on 86,3 g (64,9%), temperatura topnienia = 225-226°C; (M+H)⁺ = 203,0.

Roztwór etanolu (525 ml) w 1-hydroksyimino-3-metylo-6,7-dihydro-1H-3-benzazepin-2-onie (35 g, 0,173 mola) dodano do autoklawu wraz z palladem na węglu (10%, 3,5 g) w postaci rozcieńczonej w HCl (zatężony wodny roztwór, 17,5 g w 17 ml wody) zawiesiny. Uzyskaną mieszaninę uwodorniano w temperaturze 50°C i 250 pod ciś nieniem 1723 kPa do zakończenia reakcji. Mieszanin ę reakcyjną przesączono przez warstwę Celitu, stosując etanol jako rozpuszczalnik i przesącz zatężono do objętości 90 ml. Dodano wodę (350 ml) do koncentratu i uzyskany roztwór następnie zatężono do 200 ml.

PL 211 018 B1

Do roztworu dodano wodny roztwór dichlorometanu (350 ml), pH uregulowano do 11-11,5 wodnym roztworem wodorotlenku sodu (1N). Organiczną część oddzielono i wodną część ekstrahowano dichlorometanem (175 ml). Połączone ekstrakty zatężono do pozostałości, która krystalizowała po odstaniu, uzyskując tytułowy związek: temperatura topnienia = 69-81°C; (M+H)⁺ = 191,0.

P r z y k ł a d 3

Synteza 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu

Do 22 l kolby Morton'a dodano dichlorometan (4,73 l, 8 objętości), N-metylofenetyloaminę (591 g, 4,33 mola) i wodny roztwór wodorowęglanu sodu (436,7 g, 5,2 mola w 4,73 l wody). Mieszaninę ochłodzono do temperatury poniżej 5°C i roztwór dichlorometanu (88 7 ml) w chlorku chloroacetylu (513,7 g, 4,55 mol) dodawano kroplami do ochłodzonej mieszaniny reakcyjnej przez 70 minut. Metodą analizy HPLC wykazano zakończenie reakcji. Warstwy oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano dichlorometanem. Połączone warstwy organiczne osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i zatężono w wyparce obrotowej, uzyskując 915,7 g (99,8%) N-metylo-N-(2-fenyloetylo)-1-chloroacetamid: (M+H) = 212,1.

Do kolby o pojemności 12 l, w atmosferze azotu dodano N-metylo-N-(2-fenyloetylo)-1-chloroacetamid (883,3 g, 4,17 mola) i orto-dichlorobenzen (6,18 l). Dodano chlorek glinu (1319 g, 10,13 mola), który spowodował reakcję egzotermiczną (22 do 50°C). Uzyskaną mieszaninę ogrzewano następnie w temperaturze 165°C przez 2,5 godziny, pozostawiono w temperaturze pokojowej przez 14 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 0°C i dodano do zimnej wody (8,86 l, 5°C) w czterech porcjach w celu utrzymania reakcji egzotermicznej w temperaturze 40°C. Warstwy oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano dichlorometanem (7,07 l), po czym warstwy rozdzielono. Warstwy organiczne połączono i ekstrahowano wodnym roztworem kwasu chlorowodorowego (8,83 l, 1N) i nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (7,07 l), osuszono nad siarczanem magnezu, połączono z żelem krzemionkowym (883 g) i zastosowano kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym (3,53 kg, w lejku ze spiekanego szkła, upakowanie w postaci zawiesiny w dichlorometanie). Kolumnę eluowano dichlorometanem aż do zebrania 25 l, po czym eluowano octanem etylu, uzyskując produkt. Produkt zawierający frakcję odparowano, uzyskując 3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on w postaci brązowego ciała stałego, 608 g (83%).

W kolbie o objętości 22 l, w atmosferze azotu umieszczono 3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (606 g, 3,46 mola) i azotyn izoamylu (543 g, 4,5 mola) w THF (7,88 l). Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C. Dodawano porcjami LiHMDS (1N roztwór THF, 4,5 l, 4,5 mola) tak, aby temperaturę utrzymać poniżej 7°C. Po dodaniu, mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Reakcję monitorowano metodą HPLC. Po zakończeniu reakcji, mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C i pH uregulowano od 12 do od 2 do 1, stosując wodny roztwór HCl (2N). Osad mieszano przez 6 godzin, po czym oddzielono przez filtrację i osuszono, uzyskując 1-hydroksyimino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on 604,7 g (85,6%).

1-hydroksyimino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (625 g, 3,06 mola) i 3A etanol (15,6 1), w postaci rozcieńczonej w HCl (stężony wodny roztwór kwasu chlorowodorowego (312 g w 320 ml wody)) zawiesiny dodano do autoklawu wraz z palladem na węglu (10%, 120 g). Uzyskaną mieszaninę uwodorniano w temperaturze 50°C i pod ciśnieniem (250 psi) 1723 kPa, mieszając energicznie do zakończenia reakcji (4 godzin). Mieszaninę reakcyjną przesączono przez warstwę Celitu, stosując etanol jako rozpuszczalnik i przesącz zatężono uzyskując ciało stałe. Ciało stałe potraktowano dichlorometanem (6 l) i dodawano 1N wodny roztwór wodorotlenku sodu aż pH warstwy wodnej uregulowano pomiędzy 11-11,5. Mieszaninę mieszano, warstwy oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano dichlorometanem (2 l). Warstwy organiczne osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono, i odparowano w wyparce obrotowej, uzyskując tytułowy związek 477 g (81,9%).

P r z y k ł a d 4

Synteza (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu

1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (1,544 g, 8,12 mmola) ogrzewano łagodnie w 15 ml metanolu, uzyskując roztwór. W innej kolbie rozpuszczono kwas di-p-toluoil-1-winowy (3,12 g, 8,08 mmola) w 15 ml metanolu i dodano pipetą do gorącego roztworu aminy. Mieszaninę ogrzewano i wytrąciły się części stałe. Dodatkowo dodano 30 ml metanolu w celu utworzenia roztworu, który ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 30-40 minut i następnie powoli ochłodzono do temperatury otoczenia, uzyskując ciało stałe. Po wymieszaniu przez 18 godzin, ciało stałe zebrano przez filtrację i przepłukano niewielką ilością zimnego metanolu, uzyskując 2,24 g

PL 211 018 B1 soli kwasu di-p-toluoilo-L-winowego (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu (wydajność 96%, 94,7% ee (nadmiar enancjomeryczny)).

Sól kwasu di-p-toluoilo-L-winowego (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu (11,83 g, 20 mmoli) rozpuszczono w 45 ml wodnego 1,0 N roztworu wodorotlenku sodu i ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 X 25 ml). Połączone warstwy chlorku metylenu przemyto 35 ml wodnym 1,0 N roztworem wodorotlenku sodu, następnie roztworem solanki i osuszono nad bezwodnym MgSO4. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując tytułowy związek (3,38 g) w postaci bezbarwnego oleju (wydajność 87%, 93,2% ee).

P r z y k ł a d 5

Synteza (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu

1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (6,0 g, 31,5 mmola) ogrzewano łagodnie w 75 ml metanolu, uzyskując roztwór, połączono z roztworem kwasu di-p-toluoil-L-winowego (12,2 g, 31,5 mmola) w 75 ml gorącym metanolu. Roztwór zaszczepiono i otrzymano ciało stałe. Dodatkowo dodano 100 ml metanolu i mieszaninę mieszano. Po wymieszaniu przez 18 godzin, ciało stałe zebrano przez filtrację i przepłukano niewielką ilością zimnego metanolu, uzyskując 6,7 g ciała stałego. Ciało stałe połączono z metanolem (200 ml) i mieszano. Po 18 godzinach, ciało stałe zebrano, uzyskując sól kwasu di-p-toluoilo-L-winowego (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu (4,4 g). Oddzielenie zasady metodą opisaną w przykładzie 4 dało tytułowy związek (96% ee).

P r z y k ł a d 6

Synteza (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu

W kolbie o obję tości 22 l, w atmosferze azotu, ogrzewano (temperatura 40°C) 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (438 g, 2,3 mola), uzyskując roztwór w metanolu (4,38 ml). W innej kolbie, kwas di-p-toluoilo-L-winowy (889,7 g, 2,3 mola) rozpuszczono w 4,38 l metanolu i ogrzewano w temperaturze 40°C, po czym dodano roztwór 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu. Ogrzewanie kontynuowano i dodatkowo dodano 6,13 l metanolu, następnie mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 45 minut, a następnie powoli ochłodzono do temperatury otoczenia, uzyskując ciało stałe. Po wymieszaniu przez 18 godzin, ciało stałe zebrano przez filtrację i przepłukano niewielką ilością ługów macierzystych, i po osuszeniu powietrzem, łącznie 2 litrami octanu etylu, uzyskując 56 l, 6 g soli kwasu di-p-toluoilo-L-winowego (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu. Połączono sól kwasu di-p-toluoilo-L-winowego (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu, dichlorometan (6,57 l) i 1N wodny roztwór wodorotlenku sodu (6,57 l) oraz mieszano. Warstwy oddzielono i warstwę organiczną ekstrahowano dwukrotnie i 1N wodnym roztworem wodorotlenku sodu (3,28 l), jednokrotnie solanką (2,46 l), po czym roztwór osuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i odparowano w wyparce obrotowej, uzyskując tytułowy związek 250 g (57,4%, 94,1% ee).

P r z y k ł a d 7

Synteza chlorowodorku (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu

1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on (31,9 g, 168 mmoli) przeprowadzono w zawiesinę (objętość 300 ml) w octanie izopropylu i ogrzewano w temperaturze 45°C. W oddzielnej kolbie, kwas (R)-(-)-D-migdałowy (25,0 g, 164 mmoli) ogrzewano w 130 ml alkoholu izopropylowego do utworzenia roztworu, który dodano do otrzymanej powyżej zawiesiny 1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onon/octan izopropylu, uzyskując roztwór, w którym szybko utworzył się osad. Mieszaninę mieszano w temperaturze 45°C przez 3 godziny. Do gorącego roztworu dodano aldehyd 5-nitrosalicylowy (2-hydroksy-5-nitrobenzaldehyd) (1,40 g, 8,38 mmola, 5 mol% molowych) i mieszaninę mieszano w temperaturze 45°C. Po 14 godzinach rzadką zawiesinę ochłodzono do temperatury otoczenia i mieszano przez 2 godziny, po czym ciało stałe zebrano przez filtrację i przepłukano 70 ml zimnego octan izopropylu i osuszono w piecu próżniowym, w temperaturze 40°C, uzyskując 46,62 g sól kwasu (R)-migdałowego (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu (wydajność 82,9%, 98,4% ee).

Sól kwasu (R)-migdałowego (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu (2,42 g, 7,06 mmola, 98,4% ee) przeprowadzono w zawiesinę w 25 ml octanu etylu w temperaturze otoczenia. Mieszaninę zatężono dodano wodny roztwór kwasu chlorowodorowego (1,1 ml, około 11,2 mmola) i ogrzewano w temperaturze 50°C energicznie mieszając przez 3,5 godziny. Rzadką zawiesinę ochłodzono do temperatury otoczenia, przesączono i przepłukano eterem metylo-t-butyl (10 ml), uzyskując 1,48g tytułowego związku (wydajność 92,5%, 97,9% ee).

PL 211 018 B1

P r z y k ł a d 8

Synteza N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu

Okrągłodenną kolbę napełniono w atmosferze azotu N-t-Boc-1-alaniną (1,0 równoważnika), hydrat hydroksybenzotriazolu (około 1,1 równoważnika) i (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onem (1,0 równoważnika) w THF. Do silnie mieszanej mieszaniny dodano zasadę Hunig'a (N,N-diizopropyloetyloamina, 1,1 równoważnika), a następnie EDC (1,1 równoważnika). Po wymieszaniu od 4 do 17 godzin w temperaturze otoczenia, rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i wodzie, przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, 1N wodnym roztworem HCl, solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 1-(N-tBoc-1-alaninylo)amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on: spektroskopia masowa (M+H)⁺, 362,3.

Strumień bezwodnego gazowego HCl przepuszczono przez mieszany roztwór 1-(N-t-Boc-1-alaninylo)amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu w 1,4-dioksanie (0,03-0,09 M), chłodzono w łaźni lodowej do 10°C w atmosferze azotu przez 10-15 minut. Roztwór zamknięto, następnie łaźnię chłodzącą usunięto i roztwór pozostawiono do ogrzania do temperatury otoczenia, mieszając przez 2-8 godzin, monitorując 1,0 metodą TLC zużycie substancji wyjściowej. Roztwór zatężono, uzyskując 1-(L-alaninylo)-(S)-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on, który użyto bez dalszego oczyszczania.

1-(L-alaninylo)-(S)-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-3-metylo-1H-3-benzazepin-2-on (1,0 równoważnika), hydrat hydroksybenzotriazolu (1,1 równoważnika) i kwas (S)-2-hydroksy-3-metylomasłowy (1,0 równoważnika) umieszczono w THF w atmosferze azotu. Do starannie mieszanej mieszaniny dodano zasadę Hunig'a (N,N-diizopropyloetyloamina, 1,1 równoważnika), następnie EDC (1,1 równoważnika). Po wymieszaniu od 4 do 17 godzin w temperaturze otoczenia rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (lub podobnym rozpuszczalniku) i wodzie, przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, 1N HCl, solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując tytułowy związek.

P r z y k ł a d 9

Synteza N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on

Okrągłodenną kolbę napełniono N-t-Boc-1-alaniną (249,5 g, 1,32 mola), hydrat hydroksybenzotriazolu (232,2 g, 1,52 mola) i (S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onem (250, 8 g, 1,32 mola) w THF (3,76 l) w atmosferze azotu. Mieszaninę ochłodzono do temperatury poniżej 5°C, po czym dodano zasadę Hunig'a (N,N-diizopropyloetyloaminę, 188,4 g, 1,45 mola) następnie EDC (283,7 g, 1,45 mola). Po wymieszaniu przez 6 godzin mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury otoczenia i mieszano przez 14 godzin. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (3,76 l) i wodzie (1,76 l), warstwy oddzielono, warstwę organiczną ekstrahowano wodą (1,76 l), warstwę wodną połączono i ekstrahowano octanem etylu (1,76 l). Warstwy organiczne połączono, ekstrahowano nasyconym, wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (1,76 l), osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i odparowano w wyparce obrotowej, uzyskując 1-(N-t-Boc-1-alaninylo)amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on 463 g (97,2%).

Roztwór octanu etylu w HCl wytworzono przepuszczając bezwodny gazowy HCl, z zastosowaniem podpowierzchniowej rurki dyspersyjnej, przez octan etylu (1,76 l) ochłodzony do temperatury 0°C. Wytworzony roztwór octanu etylu w HCl dodano do energicznie mieszanej zawiesiny 1-(N-t-Boc-alaninylo)amino-3-metyło-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu (462 g, 1,28 mola) w octanie etylu (3,7 l). Dodatkowo dodano octan etylu (1 l) i mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano przez 22 godziny. Mieszaninę reakcyjną przesączono, uzyskując ciało stałe. Ciało stałe przeprowadzono w zawiesinę w acetonitrylu (5 l), ogrzano do temperatury wrzenia i następnie ochłodzono do temperatury 60°C, przesączono i osuszono, uzyskują c 1-(L-alaninylo)-(S)-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on 389,8 g (94,7%).

1-(L-alaninylo)-(S)-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-3-metylo-1H-3-benzazepin-2-on (369,5 g, 1,18 mola), hydrat hydroksybenzotriazolu (207, 6 g, 1,36 mola), zasadę Hunig'a (N,N-diizopropyloetyloamina, 352,2 g, 2,71 mola), i kwas (S)-2-hydroksy-3-metylomasłowy (140,6 g, 1,18 mol) w THF (4,8 l) połączono w atmosferze azotu i ochłodzono do temperatury poniżej 5°C. Dodano ĘDC (253,7 g,

PL 211 018 B1

1,3 mola) i mieszaninę reakcyjną pozostawiono, mieszając, do ogrzania do temperatury otoczenia. Po 25 godzinach mieszaninę reakcyjną rozcieńczono dichlorometanem (5,54 l) i ekstrahowano wodą (2,22 l). Warstwę organiczną ekstrahowano wodą (2,22 l), warstwy wodne połączono i ekstrahowano dichlorometanem (5,54 l). Warstwy organiczne połączono, ekstrahowano dwukrotnie wodą (2,22 l), nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2,22 l), osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono, i odparowano w wyparce obrotową, uzyskując tytułowy związek 428 g (100%).

P r z y k ł a d 10

Synteza dihydratu N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu

Stały N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-on rozpuszczono w acetonie (3,42 l) i wodzie (0,856 l), po czym mieszaninę słabo ogrzewano (40°C). Roztwór podzielono na ~2 l porcje i do każdej dodawano wodę (7,19 l), podczas gdy ogrzewano mętny roztwór do temperatury 50°C. Po dodaniu całej ilości wody, mętny roztwór pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej uzyskując ciało stałe, które w postaci zawiesiny mieszano w temperaturze otoczenia przez 14 godzin, a następnie przesączono i suszono z wytworzeniem 310,6 g (66,2%) tytuł owego zwią zku.

W przemyśle farmaceutycznym niniejszy wynalazek zazwyczaj stosuje się w postaci kompozycji farmaceutycznej. Tak więc, w innym rozwiązaniu, niniejszy wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne zawierające krystaliczny dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu w skutecznej ilości oraz farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik. Takie kompozycje stosuje się w celu hamowania uwalniania i/lub syntezy peptydu β-amyloidu, w tym leczenia choroby Alzheimer'a. Krystaliczny dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu stosuje się do wytwarzania leku w celu hamowania uwalniania i/lub syntezy peptydu β-amyloidu, korzystnie do leczenia choroby Alzheimera.

Krystaliczny dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu można podawać różnymi sposobami. Przedstawiony związek można podawać w dowolnej postaci lub dowolnym sposobem, który zapewnia biodostępność związku w skutecznej ilości, obejmujących podawanie doustne i pozajelitowe. Np. przedstawiony związek można podawać doustnie, inhalacyjnie, podskórnie, domięśniowo, dożylnie, przezskórnie, donosowo, doodbytniczo, do oczu, miejscowo, podjęzykowo, podpoliczkowo itp.

W kompozycjach według wynalazku, aktywny składnik zazwyczaj miesza się z rozczynnikiem, rozcieńcza rozczynnikiem lub zamyka w takim nośniku jak kapsułka, torebka, bibułka lub inny pojemnik. Związek według wynalazku można podawać sam lub jako kompozycję farmaceutyczną tj. związek połączony z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami, takimi jak nośniki lub rozczynniki, których ilość i własności określa się w odniesieniu do rozpuszczalności i chemicznych właściwości przedstawionego związku, wybranego sposobu podawania i farmaceutycznego zastosowania praktycznego. (Remington's Pharmaceutical Sciences, Wydanie 18, Mack Publishing Co. (1990)).

Przedstawione kompozycje farmaceutyczne wytwarza się sposobem dobrze znanym w przemyśle farmaceutycznym. Nośnik lub rozczynnik mogą być ciałem stałym, ciałem półstałym lub cieczą, i które mogą służyć jako rozczynnik lub otoczenie aktywnego składnika. Odpowiednie nośniki lub rozczynniki są dobrze znane w dziedzinie. Kompozycja farmaceutyczna może być przystosowana do stosowania doustnie, inhalacyjnie, pozajelitowo lub miejscowo i można ją podawać pacjentowi w postaci tabletek, kapsułek, aerozoli, środków do inhalacji, czopków, roztworu, zawiesiny lub podobnych.

W przypadku podawania doustnego, związek można wprowadzać z rozczynnikami i stosować w postaci tabletek, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków, gumy do żucia itp. Preparaty te powinny zawierać co najmniej 4% związku według wynalazku, lecz ilość aktywnego składnika może zmieniać się zależnie od stosowanej postaci i korzystnie mieści się pomiędzy 2% i 90% jednostkowej masy. Ilość związku występującego w kompozycjach dobiera się tak, aby umożliwiać odpowiednie dawkowanie. Korzystne kompozycje i preparaty według wynalazku mogą określać fachowcy w dziedzinie.

Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki itp. mogą także zawierać jeden lub więcej następujących środków wspomagających: spoiwa takie jak mikrokrystaliczna celuloza, guma tragakantowa lub żelatyna; rozczynniki takie jak skrobia lub laktoza, substancje dezintegrujące takie jak kwas alginowy, Primogel, skrobia kukurydziana itp.; lub rikanty takie jak stearynian magnezu, olej silikonowy lub Sterotex; środki poślizgowe takie jak koloidalny ditlenek krzemu oraz można także dodawać środki sło22

PL 211 018 B1 dzące takie jak sacharoza lub sacharyna lub środki smakowe takie jak mięta pieprzowa, salicylan metylu lub smak pomarańczowy. Gdy dawkę jednostkową stanowi kapsułka, może ona zawierać oprócz powyższych substancji, ciekły nośnik taki jak glikol polietylenowy lub olej tłuszczowy. Inne dawki jednostkowe mogą zawierać różne inne materiały modyfikujące fizyczne postaci dawki jednostkowej jak np. powłoki. Tak więc, tabletki lub pigułki mogą być pokryte cukrem, szelakiem lub innymi środkami powlekającymi. Syrop może zawierać, oprócz przedstawionych związków, sacharozę jako środek słodzący oraz środki konserwujące, barwniki i pigmenty, a także środki smakowe. Materiały stosowane do przygotowania różnych kompozycji powinny być farmaceutycznie czyste i nietoksyczne w stosowanych ilościach.

Do podawania pozajelitowego, związek według wynalazku można wprowadzać do roztworu lub zawiesiny. Preparaty te zazwyczaj zawierają co najmniej 0,1% związku według wynalazku, lecz ilość ta może się zmieniać w zakresie od 0,1 do 90% całkowitej masy. Ilość związku występującego w takich kompozycjach dobiera się tak, aby umożliwiać odpowiednie dawkowanie. Roztwory lub zawiesiny mogą także obejmować jeden lub więcej następujących środków wspomagających: sterylne rozcieńczalniki takie jak woda w przypadku zastrzyku, roztwór solanki, oleje roślinne, glikole polietylenowe, gliceryna, glikol propylenowy lub inne syntetyczne rozpuszczalniki; środki przeciwbakteryjne takie jak alkohol benzylowy lub metyloparaben; antyutleniacze takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodu; środki chelatujące takie jak kwas etylenodiaminatetraoctowy; bufory takie jak octany, cytryniany lub fosforany i środki do dopasowania toniczności roztworu takie jak chlorek sodu lub dekstroza. Preparat pozajelitowy można zamknąć w ampułkach, jednorazowych strzykawkach lub fiolkach z wielokrotnymi dawkami wykonanych ze szkła lub plastiku. Korzystne kompozycje i preparaty mogą określić fachowcy w dziedzinie.

Związek według wynalazku można także podawać miejscowo i tak wprowadzany nośnik może odpowiednio obejmować roztwór, maść lub żel. Podłoże może obejmować jeden lub więcej następujących typów: wazelina żółta, lanolina, glikole polietylenowe, wosk pszczeli, olej mineralny, rozcieńczalniki takie jak woda i alkohol oraz emulgatory, a także stabilizatory. Preparat do miejscowego podawania może zawierać związek o wzorze I lub jego farmaceutyczną sól w ilości od 0,1 do 10% w/v (masa na jednostkę objętości).

Inne korzystne preparaty obejmują materiały do podawania przezskórnego („opatrunki). Takie przezskórne opatrunki można stosować przez ciągły lub nieciągły wlew związku według wynalazku w kontrolowanych ilościach. Budowa i zastosowanie przezskórnych opatrunków dla zapewnienia środków farmaceutycznych są dobrze znane w dziedzinie. Patrz, np. patent Stanów Zjednoczonych Ameryki Płn. nr 5023252, udzielony 11 czerwca, 1991. Takie opatrunki mogą umożliwiać dostarczanie środków farmaceutycznych na sposób ciągły, pulsacyjny lub na żądanie.

W celu lepszego zilustrowania wynalazku, poniż ej przedstawiono typowe kompozycje farmaceutyczne.

Przykładowy preparat 1

Twarde kapsułki żelatynowe zawierające następujące składniki przygotowuje się następująco:

Składnik Ilość (mg/kapsułkę)

Aktywny składnik 30,0

Skrobia 305,0

Stearynian magnezu 5,0

Powyższe składniki miesza się i wprowadza do twardych kapsułek żelatynowych w ilości 340 mg.

Przykładowy preparat 2

Tabletkę przygotowuje się stosując poniższe składniki:

Składnik Ilość (mg/tabletkę)

Aktywny składnik 25,0

Mikrokrystaliczna celuloza 200,0

Koloidalny ditlenek krzemu 10,0

Kwas stearynowy 5,0

Składniki miesza się i prasuje na tabletki, każda o masie 240 mg.

Przykładowy preparat 3

Suchy proszkowy preparat do inhalacji przygotowuje się z następujących składników: Składnik Masa %

Aktywny składnik 5

PL 211 018 B1

Laktoza 95

Aktywny składnik miesza się z laktozą i mieszaninę dodaje się do inhalatora suchego proszku. Przykładowy preparat 4

Tabletki, każdą zawierającą 30 mg aktywnego składnika, przygotowuje się następująco: Składnik Ilość (mg/tabletkę)

Aktywny składnik 30,0 mg

Skrobia 45,0 mg

Mikrokrystaliczna celuloza 35,0 mg

Poliwinylopirolidon (jako 10% roztwór w sterylnej wodzie) 4,0 mg

Sól sodowa karboksymetyloskrobii 4,5 mg

Stearynian magnezu 0,5 mg

Talk 1,0 mg

Całkowita ilość 120 mg

Aktywny składnik, skrobię i celulozę przepuszcza się przez oczka sita nr 20 i starannie miesza.

Roztwór poliwinylopirolidonu miesza się z uzyskanymi proszkami, a następnie przepuszcza przez oczka sita nr 16. Wytworzone tak granulki osusza się w temperaturze 50° do 60°C i przepuszcza przez oczka sita nr 16. Następnie sól sodową karboksymetyloskrobii, stearynian magnezu i talk, uprzednio przepuszczone przez oczka sita o nr 30, wprowadza do granulek, które po wymieszaniu prasuje się w tabletkarce z wytworzeniem tabletek, każda o masie 150 mg.

Przykładowy preparat 5

Kapsułki, każdą zawierającą 40 mg leku przygotowuje się następująco:

Składnik Ilość(mg/kapsułkę)

Aktywny składnik 40,0 mg

Skrobia 109,0 mg

Stearynian magnezu 1,0 mg

Całkowita ilość 150,0 mg

Aktywny składnik, skrobię i stearynian magnezu miesza się, przepuszcza przez oczka sita o nr 20 i wprowadza do twardych kapsułek żelatynowych w ilości 150 mg.

Przykładowy preparat 6

Czopki, każdy zawierający 25 mg aktywnego składnika przygotowuje się następująco:

Składnik Ilość

Aktywny składnik 25 mg

Glicerydy nasyconych kwasów tłuszczowych 2000 mg

Aktywny składnik przepuszcza się przez oczka sita nr 60 i zawiesza w uprzednio stopionych glicerydach nasyconych kwasów tłuszczowych przy minimalnym ogrzewaniu. Mieszaninę następnie odlewa się do postaci czopka o nominalnej zawartości 2,0 g i pozostawia do ochłodzenia.

Przykładowy preparat 7

Zawiesiny, każda zawierająca 50 mg leku w dawce 5,0 ml przygotowuje się następująco:

Składnik Ilość

Aktywny składnik 50,0 mg

Guma ksantanowa 4,0 mg

Sól sodowa karboksymetylocelulozy (11%)

Mikrokrystaliczna celuloza (89%) 50,00 mg

Sacharoza 1,75 g

Benzoesan sodu 10,0 mg

Środek smakowy i barwiący dowolna ilość Oczyszczona woda do 5,0 ml

Aktywny składnik, sacharozę i gumę ksantanową miesza się, przepuszcza przez oczka sita nr 10 i następnie miesza z uprzednio przygotowanym roztworem mikrokrystalicznej celulozy i soli sodowej karboksymetylocelulozy w wodzie. Benzoesan sodu, środek smakowy i barwiący rozcieńcza się w niewielkiej iloś ci wody i po dodaniu miesza. Nastę pnie dodaje się wodę w wystarczającej iloś ci do uzyskania wymaganej objętości.

PL 211 018 B1

Przykładowy preparat 8

Kapsułki, każda zawierająca 15 mg leku przygotowuje się następująco:

Składnik Ilość(mg/kapsułkę)

Aktywny składnik 15,0 mg

Skrobia 407,0 mg

Stearynian magnezu 3,0 mg

Całkowita ilość 425,0 mg

Aktywny składnik, skrobia i stearynian magnezu miesza się, przepuszcza przez oczka sita nr 20 i wprowadza do twardych kapsułek żelatynowych w ilości 560 mg.

Przykładowy preparat 9

Preparat podskórny można wytworzyć następująco:

Składnik Ilość

Aktywny składnik 1,0 mg

Olej kukurydziany 1 ml

Zależnie od rozpuszczalności aktywnego składnika w oleju kukurydzianym, do 5,0 mg lub więcej aktywnego składnika, jeśli to pożądane, można w tym preparacie stosować.

Przykładowy preparat 10

Preparat do miejscowego podawania można przygotować następująco:

Składnik Ilość

Aktywny składnik 1-10 g

Wosk emulgujący 30 g

Ciekła parafina 20 g

Biała miękka parafina do 100 g

Białą miękką parafinę ogrzewa się aż do stopienia. Wprowadza się ciekłą parafinę i wosk emulgujący, po czym miesza aż do rozpuszczenia. Dodaje się aktywny składnik i miesza, aż do rozproszenia. Mieszaninę następnie ochładza się aż do uzyskania ciała stałego.

Fachowcy w dziedzinie wiedzą, że na chorobę Alzheimera można wpływać lecząc pacjenta już dotkniętego chorobą lub przez leczenie profilaktycznie pacjenta podejrzanego o możliwość rozwoju choroby. Tak więc, terminy „leczenie i „stosowanie leczenia odnoszą się do wszystkich sposobów pozwalających na spowolnienie, przerwanie, zatrzymanie, kontrolę lub wstrzymanie rozwoju choroby Alzheimera, lecz nie koniecznie umożliwiają wyeliminowanie wszystkich objawów. Przedstawione metody obejmują zapobieganie początkowemu rozwojowi choroby Alzheimera u pacjenta, hamowanie rozwoju choroby Alzheimera i leczenie zaawansowanej choroby Alzheimera.

Stosowany tu termin „pacjent odnosi się do ciepłokrwistego zwierzęcia, w szczególności ssaka i człowieka, który cierpi na zaburzenie związane ze zwiększonym uwalnianiem i/lub syntezą peptydu β-amyloidu, obejmujące chorobę Alzheimera. Zrozumiałe jest, że świnki morskie, psy, koty, szczury, myszy, konie, bydło, owca stanowią przykłady zwierząt objętych zakres tego terminu. Pacjentów potrzebujących takiego leczenia diagnozuje się łatwo.

Stosowany tu termin związek „w skutecznej ilości odnosi się do ilości, skutecznej w hamowaniu uwalniania i/lub syntezy peptydu β-amyloidu i specyficznie, w leczeniu choroby Alzheimera.

Skuteczną ilość może łatwo określić leczący diagnosta czyli fachowiec w dziedzinie, przez stosowanie typowych technik i obserwowanie objawów w analogicznych przypadkach. Określając dawkę krystalicznego dihydratu N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu w skutecznej ilości, leczący diagnosta rozważa wiele czynników obejmujących, lecz nie ograniczających się do: mocy i właściwości N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu; danego pacjenta; jego budowy, wieku i ogólnego stanu zdrowia; stopnia rozwoju lub stanu zaawansowania choroby; reagowania na lek przez danego pacjenta; sposobu podawania; biodostępności podawanego preparatu; wybranego reżimu dawkowania; stosowania innych towarzyszących lekarstw; oraz innych towarzyszących okoliczności.

Skuteczna ilość krystalicznego dihydratu N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu zmienia się od 0,1 miligrama na kilogram masy ciała dziennie (mg/kg/dzień) do 100 mg/kg/dzień. Korzystne ilości mogą określić fachowcy w dziedzinie.

PL 211 018 B1

Dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylobutyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu według wynalazku można badać w różnych układach biologicznych, w tym w nastę pują cymi sposobami.

P r z y k ł a d A

Komórkowy test przesiewowy do wykrywania inhibitorów produkcji β-amyloidu

Liczne związki testowano pod względem ich zdolności do hamowania produkcji β-amyloidu w linii komórkowej posiadającej mutację szwedzką. W tym badaniu przesiewowym stosowano komórki (K293 = linia komórkowa nerki ludzkiej), które stabilnie transfekowano genem dla białka prekursorowego amyloidu 751 (APP751) zawierającym podwójną mutację Lys651Met652 na Asn651Leu652 (numeracja dla APP751) w sposób opisany w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym, publikacja nr 94/105698 i Citron i in. Ta mutacja jest powszechnie nazywana mutacją szwedzką i komórki, wskazane jako „293 751 SWE, posiano na 96-studzienkowych płytkach Corning w ilości 2-4 x 10⁴ komórek na studzienkę w minimalnie zasadniczym ośrodku Dulbecco's (Sigma, St. Louis, MO) plus 10% płodowa surowica bydlęca. Liczba komórek jest ważna, aby osiągnąć wyniki ELISA β-amyloidu w liniowym zakresie testu (-0,2 do 2,5 ng na ml).

Po inkubacji przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze zrównoważonym 10% ditlenkiem węgla, ośrodek usunięto i zastąpiono 200 DL związku (lek) zawierającego ośrodek na studzienkę przez dwugodzinny okres wstępny i komórki inkubowano jak powyżej. Zapasy leku wytworzono w 100% sulfotlenku dimetylu tak, aby końcowe stężenie sulfotlenku dimetylu w leku stosowanym w leczeniu nie przekraczało 0,5% i, właściwie, a zazwyczaj było równe 0,1%.

Pod koniec okresu wstępnego, ośrodek ponownie usunięto i zastąpiono świeżym lekiem zawierającym ośrodek jak powyżej i komórki inkubowano jeszcze przez dwie godziny. Po traktowaniu płytki odwirowywano w urządzeniu Beckman GPR przy 1200 obrotów na minutę przez pięć minut w temperaturze pokojowej aby wypeletkować pozostałości komórek z kondycjonowanego ośrodka. Z każdej studzienki, 100 μl kondycjonowanego ośrodka lub odpowiedniego jego rozcieńczenia przeniesiono do płytki ELISA uprzednio pokrytej przeciwciałem 266 [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327] przeciw aminokwasom 13-28 białka β-amyloidu jak opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym, publikacja nr 94/105698 i przechowywano w temperaturze 4°C przez noc. Test ELISA z zastosowaniem znakowanego przeciwciała 3D6 [P.Seubert, Nature (1992) 359:325-327] przeciw aminokwasom 1-5 białka β-amyloidu prowadzono następnego dnia, aby zmierzyć ilość wytwarzanego białka β-amyloidu.

Efekty cytotoksyczne związków zmierzono stosując modyfikacje metody Hansena, i in. Do komórek pozostałych na płytce do hodowli tkankowej dodano 25 μl roztworu podstawowego bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolilowego (MTT) (Sigma, St. Louis, MO) (5 mg/ml) do końcowego stężenia 1 mg/ml. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, i aktywność komórkową zatrzymano przez dodanie równej objętości buforu do lizy MTT (20% wagowo/objętość dodecylosiarczanu sodu w 50% dimetyloformamidzie, pH 4,7). Całkowitą ekstrakcję osiągnięto przez wytrząsanie w ciągu nocy w temperaturze pokojowej. Różnicę pomiędzy OD562nm i OD650nm jako wskaźnik żywotności komórek zmierzono w czytniku mikropłytkowym Molecular Device UVmax.

Wyniki testu ELISA białka β-amyloidu dopasowano do standardowej krzywej i wyrażono jako ng/ml białka β-amyloidu. W celu znormalizowania do cytotoksyczności, te wyniki podzielono przez wyniki MTT i wyrażono jako zawartość procentową wyników z kontroli bez leku. Wszystkie wyniki oznaczają średnią i standardowe odchylenie z co najmniej sześciu równoległych testów.

P r z y k ł a d B

Hamowanie in vivo uwalniania i/lub syntezy β-amyloidu

Ten przykład ilustruje jak można badać związki według wynalazku na hamowanie in vivo uwalniania i/lub syntezy β-amyloidu. Do tych doświadczeń stosuje się 3- do 4-miesięczne myszy PDAPP [Games i in., (1995) Nature 373:523-527]. Zależnie od tego, który związek jest badany, zazwyczaj komponuje się go w ilości od 1 do 10 mg/ml. Ze względu na niskie współczynniki rozpuszczalności związków, można je komponować z różnymi rozczynnikami, takimi jak olej kukurydziany (Safeway, South San Francisco, CA); 10% etanol w oleju kukurydzianym; 2-hydroksypropylo-β-cyklodekstryna (Research Biochemicals International, Natick MA); i karboksymetyloceluloza (Sigma Chemical Co., St. Louis MO).

Lek podaje się myszom podskórnie za pomocą igły nr 26 i 3 godziny później zwierzęta zabija się metodą narkozy CO2 i pobiera się krew metodą nakłucia serca stosując strzykawkę/igłę tuberkulinową 1 cm³ 25G 5/8 pokryte roztworem 0,5 M EDTA, pH 8,0. Krew umieszcza się w pojemniku próż26

PL 211 018 B1 niowym Becton-Dickinson zawierającym EDTA i odwirowuje się przez 15 minut przy 1500 x g w temperaturze 5°C. Następnie mózgi myszy usuwa się oraz korę i hipokamp wypreparowuje się i umieszcza na lodzie.

1. Badanie mózgu

W celu przygotowania tkanki hipokampa i kory do testów immunoabsorpcji enzymozależnej (ELISA) każdy obszar mózgu homogenizuje się w 10 objętościach oziębionego lodem buforu guanidyny (5,0 M guanidyna-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) stosując tłuczek napędzany silnikiem Kontes (Fisher, Pittsburgh PA). Homogenaty łagodnie kołysze się na obrotowej platformie przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej i przechowuje przed oznaczeniem ilościowym β-amyloidu w temperaturze -20°C.

Homogenaty mózgu rozcieńcza się 1:10 oziębionym lodem buforem kazeiny [0,25% kazeina, buforowana fosforanem solanka (PBS), 0,05% azydek sodu, 20 μm/ml aprotyniny, 5 mM EDTA, wartość pH 8,0, 10 μg/ml leupeptyny], tym samym zmniejszając końcowe stężenie guanidyny do 0,5 M, przed odwirowaniem przy 16000 X g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Następnie próbki rozcieńcza się, jeśli to konieczne, aby osiągnąć optymalny zakres dla pomiarów ELISA przez dodanie buforu kazeiny z dodaniem 0,5 M chlorowodorku guanidyny. Wzorce dla β-amyloidu (1-40 lub 1-42 aminokwasów) wytworzono tak, aby końcowa kompozycja była równa 0,5 M guanidyny w obecności 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).

Wielowarstwowy test ELISA całkowitego β-amyloidu, oznaczający ilościowo zarówno β-amyloid (aa 1-40) jak i β-amyloid (aa 1-42) składa się z dwu monoklonalnych przeciwciał (mAb) dla β-amyloidu. Przeciwciało wychwytujące, 266 [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327], jest specyficzne dla aminokwasów 13-28 β-amyloidu. Przeciwciało 3D6 [Johnson-Wood i in., PNAS USA (1997) 94:15501555], które jest specyficzne dla aminokwasów 1-5 β-amyloidu, jest biotynylowane i służy jako przeciwciało reporterowe w teście. W procedurze biotynylacji 3D6 stosuje się protokół wytwórcy (Pierce, Rockford -IL) oznaczania biotyną NHS immunoglobulin, z tym wyjątkiem, że stosuje się 100 mM buforu wodorowęglanu sodu, pH 8,5. Przeciwciało 3D6 nie rozpoznaje wydzielanego białka prekursorowego amyloidu (APP) lub pełnej długości APP ale wykrywa tylko postacie β-amyloidu z kwasem asparaginowym przy końcu aminowym. Test ma dolną granicę czułości -50 pg/ml (11 pM) i nie wykazuje reaktywności krzyżowej na endogenne mysie białko β-amyloidu w stężeniach aż do 1 ng/ml.

W konfiguracji wielowarstwowego ELISA oznaczającego ilościowo poziom β-amyloidu (aa 1-42) stosuje się mAb 21F12 [Johnson-Wood i in., PNAS USA (1997) 94:1550-1555] (które rozpoznaje aminokwasy 33-42 β-amyloidu) jako przeciwciało wychwytujące. Biotynylowane 3D6 jest także przeciwciałem reporterowym w tym teście, który ma dolną granicę czułości -125 pg/ml (28 pM).

Wychwytujące mAb 266 i 21F12 nakłada się w ilości 10 pg/ml do 96-studzienkowych płytek do testu immunologicznego (Costar, Cambidge MA) przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie płytki aspiruje się i blokuje 0,25% albuminą osocza ludzkiego w buforze PBS przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej, następnie przechowuje się je osuszone w temperaturze 4°C aż do zastosowania. Płytki przed użyciem są ponownie uwodnione buforem do przemywania (solanka buforowana Tris, 0,05% Tween 20). Próbki i standardy dodaje się do płytek i inkubuje przez noc w temperaturze 4°C. Płytki przemywa się 3 razy buforem do przemywania pomiędzy poszczególnymi etapami testu, Biotynylowane 3D6, rozcieńczone do 0,5 ng/ml w kazeinowym buforze do inkubacji (0,25% kazeina, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) inkubuje się w studzience przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Do studzienki dodaje się awidynę-HRP (Vector, Burlingame CA) rozcieńczoną 1:4000 w kazeinowym buforze do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaje się substrat kolorymetryczny. Slow TMB-ELISA (Pierce, Cambridge MA), i pozostawia do przereagowania przez 15 minut, po czym reakcję enzymatyczną zatrzymuje się przez dodanie 2N H2SO4. Produkt reakcji ocenia się ilościowo stosując urządzenie Molecular Devices Vmax (Molecular Devices, Menlo Park CA) mierzące różnicę absorbancji przy 450 nm i 650 nm.

2. Badanie krwi

Osocze EDTA rozcieńcza się 1:1 w rozcieńczalniku próbek (0,2 g/l fosforanu sodu-H₂O (jednozasadowy), 2,16 g/l fosforanu sodu 7H2O (dwuzasadowy), 0,5 g/l timerozalu, 8,5 g/l chlorku sodu, 0,5 ml Tritonu X-405, 6,0 g/l pozbawionej globulin albuminy surowicy bydlęcej; i woda). Próbki i wzorce w rozcieńczalniku próbek testuje się stosując test całkowitego β-amyloidu (266 wychwytujące/3D6 reporterowe) opisany powyżej dla badania mózgu z tym wyjątkiem, że zamiast opisanych rozcieńczalników kazeinowych użyto rozcieńczalnik próbek.

Claims

1. Krystaliczny dihydrat N-(((S)-2-hydroksy-3-metylo-butyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu o wzorze:

scharakteryzowany przez proszkowy dyfraktogram promieni X obejmujący piki przy 8,36, 12,43, 15,34, 19,22, 20,50 lub 20, 63 (2θ ± 0,2°).

2. Związek według zastrz. 1, dla którego proszkowy dyfraktogram promieni X obejmuje piki przy 8,36 i 15,34 (2θ ± 0,2°).

3. Związek według zastrz. 1, dla którego proszkowy dyfraktogram promieni X obejmuje piki przy 8,3 6 i 12,43 (2θ ± 0,2°).

4. Związek według zastrz. 1, dla którego proszkowy dyfraktogram promieni X obejmuje piki przy 8,36, 12,43, i 15,34 (2θ ± 0,2°).

5. Związek według zastrz. 1, którego widmo ¹³C jądrowego magnetycznego rezonansu w stanie stałym wykazuje przesunięcia chemiczne (ppm) 75,6, 35,3, 21,4 lub 16,6.

6. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera związek określony w zastrz. 1 i farmaceutycznie akceptowalny rozcień czalnik.

7. Sposób wytwarzania krystalicznego dihydratu N-(((S)-2-hydroksy-3-metylo-butyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się krystalizację N-(((S)-2-hydroksy-3-metylo-butyrylo)-1-(L-alaninylo))-(S)-1-amino-3-metylo-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin-2-onu z wodnego rozpuszczalnika.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wodny rozpuszczalnik zawiera aceton i wodę.