[go: up one dir, main page]

PL202887B1 - Pochodne peptydowe, środek farmaceutyczny i zastosowanie pochodnych peptydowych - Google Patents

Pochodne peptydowe, środek farmaceutyczny i zastosowanie pochodnych peptydowych

Info

Publication number
PL202887B1
PL202887B1 PL351483A PL35148300A PL202887B1 PL 202887 B1 PL202887 B1 PL 202887B1 PL 351483 A PL351483 A PL 351483A PL 35148300 A PL35148300 A PL 35148300A PL 202887 B1 PL202887 B1 PL 202887B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
compound
general formula
group
formula
disease
Prior art date
Application number
PL351483A
Other languages
English (en)
Other versions
PL351483A1 (en
Inventor
Hans Ulrich Stilz
Martin Gerl
Gary A. Flynn
Magda Stankova
Robert A. Binnie
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis Deutschland filed Critical Sanofi Aventis Deutschland
Publication of PL351483A1 publication Critical patent/PL351483A1/xx
Publication of PL202887B1 publication Critical patent/PL202887B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Wynalazek dotyczy pochodnych peptydowych o ogólnym wzorze (I), w którym R1, R2, R5, X, n i q mają znaczenie podane w opisie, zdolnych do działania jako inhibitory oddziaływania lamina/nidogen, środka farmaceutycznego zawierającego te pochodne oraz zastosowania tych pochodnych peptydowych do wytwarzania leku do leczenia choroby związanej ze zwiększoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych.
PL 202 887 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są pochodne peptydowe o małej masie cząsteczkowej, środek farmaceutyczny i zastosowanie pochodnych peptydowych do wytwarzania leków. Związki według wynalazku są zdolne do działania jako inhibitory oddziaływania pomiędzy lamininą i nidogenem (oddziaływanie laminina/nidogen).
Pochodne peptydowe o małej masie cząsteczkowej są zdolne do działania jako inhibitory oddziaływania pomiędzy lamininą i nidogenem (oddziaływania laminina/nidogen).
Połączenie lamininy (glikoproteiny o 800 kDa) i nidogenu (glikoproteiny o 160 kDa) uważa się za kluczowy biocząsteczkowy mechanizm w syntezie i stabilizacji błon podstawnych (Mayer U. i Timpl R. (1994) w: Extracellular Matrix Assembly and Structure (P. D. Yurchenco, D. Birk i R. P. Mecham, red.) str. 389-416, Academic Press, Orlando, FL). Zdolność nidogenu do tworzenia trójskładnikowych kompleksów z wszystkimi głównymi składnikami błony podstawnej, takimi jak np. izoformy lamininy zawierające γ1 (nomenklatura patrz: Burgeson R. E.; Chiquet M.; Deutzmann R.; Ekblom P.; Engel J.; Kleinmann H.; Martin G. R.; Meneguzzi G.; Paulsson M.; Sanes J.; Timpl R.; Tryggvasson K.; Yamada Y.; Yurchenco P.D. (1994) Matrix Biology 14; 209-211), kolagen IV, perlekan i fibulina, oraz z asocjacyjnymi strukturami każdego z tych składników, co oznacza, że spełnia on rolę łącznika, który łączy ze sobą, organizuje przestrzennie i stabilizuje niezależne makrostruktury (Fox J. W.; Mayer U.; Nischt R.; Aumailley M.; Reinhardt D.; Wiedemann H.; Mann K.; Timpl R.; Krieg T.; Engel J.; i Chu M.-L. (1991) EMBO J. 10, 3137-3146).
Błony podstawne stanowią wysoce wyspecjalizowane struktury pozakomórkowe, którym przypisuje się ważne funkcje w regulowaniu działania komórek i tkanek, struktury tkanek, oddziaływań tkanek, wzrostu komórek, przemian komórek, migracji komórek i tkankowo specyficznej ekspresji genu (Adams J. C. i Watt F. M. (1993) Development 117, 1183-1198). Doświadczenia z poliklonalnymi przeciwciał ami przeciwlamininowymi wyraźnie potwierdził y centralną funkcję oddziaływania laminina/nidogen w syntezie funkcjonalnej błony podstawnej. Opisane przeciwciała otrzymano drogą immunizacji królików lamininą P1 lub rekombinacyjnie wytworzoną, wiążącą nidogen domeną lamininy (γ1 III 3-5). Przeciwciała zatężone drogą chromatografii powinowactwa na matrycach z lamininy P1 lub lamininy γ1 III 3-5 wykazały całkowite hamowanie połączenia laminina/nidogen w testach hamowania. Jednakże jest ono oparte na sterycznej blokadzie dostępu nidogenu do lamininy przez przeciwciała, których obszary wiązania są zlokalizowane w sąsiedztwie wiążących nidogen sekwencji lamininy (Mayer U.; Nischt R.; Poschl E.; Mann K.; Fukuda K.;
Gerl M.; Yamada Y.; Timpl R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885).
W hodowlach embrionalnych narządów opisane przeciwciała hamują rozwój kanalików nerkowych, powstawanie pęcherzyków płucnych i morfogenezę embrionalnego gruczołu ślinowego. Te trzy modele są reprezentatywne dla programów ontogenezy, które zależą od niezakłóconej syntezy nowej błony podstawnej (Ekblom P.; Ekblom M.; Fecker L.; Klein G.; Zhang H.-Y.; Kadoya Y.; Chu M.-L; Mayer U.; Timpl R. (1994) Development 120; 2003 - 2014).
Przeciwciała skierowane przeciw obszarowi sekwencji łańcucha γ1 lamininy, niezbędnemu w wiązaniu nidogenu, mogą również hamować połączenie laminina/nidogen. Hamowanie to jest jednak konkurencyjne, w przeciwieństwie do przeciwciał przeciwlamininowych opisanych powyżej, gdyż konkurują one bezpośrednio z nidogenem w stosunku do miejsca wiązania na lamininie (WO 98/31709).
Monoklonalne przeciwciało z podklasy IgM (przeciwlaminina P1 A6/2/4 - DSM ACC2327; patrz WO 98/31709) hamuje oddziaływanie laminina/nidogen in vitro, przy czym wartość IC50 wynosi 30 nM. Podobnie jak opisany powyżej preparat poliklonalnego przeciwciała przeciwlamininowego, zapobiega ono morfogenezie embrionalnego gruczołu ślinowego w hodowli narządów. Potwierdza to specyficzność oddziaływania laminina/nidogen oraz znaczenie modułu LE-4 i zidentyfikowanego obszaru sekwencji w domenie γ1 III 4 lamininy w tym oddziaływaniu.
Wiążąca nidogen domena lamininy została jednoznacznie zidentyfikowana i scharakteryzowana pod względem położenia, sekwencji i struktury przestrzennej (metodami rentgenografii strukturalnej i NMR) (Gerl M.; Mann K.; Aumailley M.; Timpl R. (1991) Eur. J. Biochem. 202; 167-174. Mayer U.; Nischt R.; Po chl E.; Mann K.; Fukuda K.; Gerl M.; Yamada Y.; Timpl, R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885. Baumgartner R.; Czisch M.; Mayer U.; Poschl E.; Huber R.; Timpl R.; Holak T.A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668. Stetefeld J.; Mayer U.; Timpl R.; Huber R. (1996) J. Mol. Biol. 257; 644-657). Jest ona zlokalizowana w „module LE (podobnym do naskórkowego czynnika wzrostu typu lamininy) krótkiego łańcucha γ1 laminy, w domenie γ1 III 4. „Moduły LE stanowią motywy strukturalne o 50-60 resztach aminokwasów, o złożonym ukłaPL 202 887 B1 dzie składania, analogicznym do EGF, z 4 mostkami disulfidowymi (Bairoch, A.; (1995) Nomenclature of extracellular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank. release 310. Engel, J. (1989) FEBS Letters 251; 1-7).
Wysokie powinowactwo wiązania nidogenu z dopełniającą domeną lamininy wykryto dla lamininy P1 z nowotworu EHS myszy, lamininy 2 i lamininy 4 z ludzkiego łożyska oraz lamininy z muszki owocowej. Przyczyną tej rozciągającej się na różne gatunki specyficzności wiązania jest wyjątkowo duża identyczność sekwencji obecnych w domenie γ1 III 4 zbadanych gatunków. Wynosi ona 97% dla domeny ludzkiej i mysiej, 61% dla myszy i muszki owocowej oraz, co jest zaskakujące, 51% dla myszy i Caenorhabditis elegans, przy uwzględnieniu całej domeny (Pikkarinen T.; Kallunki T.; Tryggvasson K.
(1987) J. Biol. Chem. 263; 6751-6758. Chi H.-C; Hui C.-F. (1989) J. Biol. Chem. 264; 1543-1550. Wilson R. i inni (1994) Nature 368: 32-38. Poschl E.; Mayer U.; Stetefeld J.; Baumgartner R.; Holak T.A.; Huber R.; Timpl R. (1996) EMBO J. 15: 5154-5159).
Poza zależnością wiązania nidogenu od nienaruszonej trójwymiarowej struktury, jednoznacznie zidentyfikowano regiony sekwencji zlokalizowane w stabilizowanych wiązaniami S-S pętlach a i c domeny γ1 III 4. Zidentyfikowano 5 podstawowych aminokwasów, cztery zlokalizowane wewnątrz złożonej z 7 aminokwasów sekcji w pętli a, oraz boczny łańcuch tyrozyny w pętli c (Mann K.; Deutzmann R.; Timpl R. (1988) Eur. J. Biochem. 178; 71-80).
Syntetyczne peptydy, które mogą pochodzić z odpowiednich regionów domeny γ1 III 4 i są zdolne do całkowitego hamowania wiązania laminina/nidogen w specyficznych testach wiązania, ujawnili J.W. Fox i R. Timpl (US 5493008).
Sądzi się, że wiązanie z wysokim powinowactwem z wiążącym lamininę miejscem w nidogenie wymaga oddziaływania z tyrozyną lub histydyną z pętli (pętli c) sąsiadującą z rzeczywistą sekwencją wiązania. Postulowano, że to oddziaływanie aromatyczne stanowi wstępny warunek hamowania w zakresie wartości IC50 < 500 nM, na podstawie trójwymiarowej struktury domeny γ1 III 3-5 lamininy oraz zależności struktura/działanie, opisanych w opisie patentowym US 5493008. Nie jest jednak jasne, czy pętla c oddziaływuje bezpośrednio z nidogenem, czy przyczynia się ona do stabilizacji odpowiedniej przestrzennej struktury regionu sekwencji NIDPNAV (Poschl, E.; Fox J.W.; Block D.; Mayer U.; Timpl R, (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. Baumgartner R.; Czisch M.; Mayer U.; Poschl E.; Huber R.; Timpl R.; Holak T.A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668. Stetefeld J.; Mayer U.; Timpl R.; Huber R. (1996) J. Mol. Biol. 257; 644-657).
Na oddziaływanie laminina/nidogen wpływa silny składnik konformacyjny (Mayer U.; Nischt R.; Po chl E.; Mann K.; Fukuda K.; Gerl M.; Yamada Y.; Timpl R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885. Mann K.; Deutzmann R.; Timpl R. (1988) Eur. J. Biochem. 178; 71-80). Syntetyczne peptydy, które mogą pochodzić od miejsca wiązania nidogenu w lamininie, nie są zdolne do tworzenia układu połączeń disulfidowych, występującego w modułach LE, ale ich aktywność w testach hamowania jest około 400 -10000 razy słabsza w porównaniu z nienaruszoną lamininą P1 lub lamininą γ1 III 3-5 (Poschl E.; Fox J.W.; Block D.; Mayer U.; Timpl R, (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. J.W. Fox i R. Timpl; US 5493008). Ten spadek aktywności nie jest czymś niezwykłym, gdyż wiadomo, że peptydy mogą przyjmować niezliczoną ilość różnych konformacji w roztworze wodnym, a tylko pewien procent peptydów występuje w biologicznie czynnej konformacji. Najaktywniejszy z dotychczas opisanych peptydów (IC50 22 nM) ma masę cząsteczkową około 2700 Da (= około 50% modułu LE). Zawiera on nienaruszoną pętlę S-S, która prawdopodobnie stabilizuje strukturę kluczowego obszaru sekwencji NIDPNAV (Poschl E.; Fox J.W.; Block D.; Mayer U.; Timpl R, (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. J.W. Fox i R. Timpl; US 5493008).
Wzór chemiczny sekwencji NIDPNAV (Asn-Ile-Asp-Pro-Asn-Ala-Val) jest następujący:
Inhibitory oddziaływania laminina/nidogen powinny nadawać się do wytwarzania leków stosowanych w chorobach, które są związane ze zwiększoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych.
Do takich chorób należą np. wszystkie typy późnych powikłań cukrzycowych, którym towarzyszy pogrubienie błon podstawnych (zwłaszcza w nerkach, oku, układzie naczyniowym), zwłóknienie wą4
PL 202 887 B1 troby, zwłaszcza zwłóknienie wątroby związane z alkoholizmem, charakteryzujące się syntezą ciągłej błony podstawnej w zatokach i wywołanym na skutek tego włosowaceniem, wszelkiego rodzaju zwłóknienia (przewlekłe lub jatrogenne), w których można zaobserwować nasiloną syntezę błony podstawnej lub składników błony podstawnej (nerek, płuc, skóry), miażdżyca tętnic charakteryzująca się ograniczeniem regulacji metabolizmu lipidów, co może być spowodowane między innymi zakłóconą filtracją lipoprotein przez częściowo zwłóknione zatoki nerek (zmiany patologiczne w układzie naczyniowym, które można zaobserwować w przypadku miażdżycy tętnic, można również częściowo przypisać modyfikacją składu i budowy błon podstawnych w naczyniach), choroby, w których angiogeneza przyczynia się do zniszczenia w obrazie klinicznym, np. raki, w których nowotworzenie naczyń jest niezbędne do wzrostu guza, retynopatia cukrzycowa, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, zaburzenia z silnym skł adnikiem zapalnym (np. reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie stawów i ko ś ci, zapalenie naczyń), naczyniaki krwionośne, łuszczyca i wiele innych.
Zastosowanie peptydów, takich jak te opisane w US 5493008, jako leków jest jednak w znaczącym stopniu ograniczone z uwagi na ich elastyczność konformacyjną, brak odporności na proteazy oraz nieodpowiednią biodostępność i farmakodynamikę (Milner-White E. J. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10; 70-74. Verber D.F.; Freidinger R.M.; (1985) Trends Neurosci. 8; 392-396. Hruby V.J. (1994) w: Peptides, Proc. Thirteenth American Peptide Symposium; (Hodges R. S.; Smith J. A.; red.) str. 3-17; ESCOM: Leiden, Holandia).
Celem niniejszego zgłoszenia było zatem wynalezienie pochodnych peptydowych o małej masie cząsteczkowej, które są zdolne do specyficznego oddziaływania z miejscem wiązania lamininy w nidogenie oraz do konkurencyjnego hamowania połączenia pomiędzy lamininą i nidogenem, w małym stężeniu.
Tak więc wynalazek dotyczy pochodnych peptydowych o ogólnym wzorze I
w którym
R1 oznacza grupę o jednym z następujących wzorów
PL 202 887 B1 w których
R3 oznacza -A, -NH2, -NHR, -NR2, A2, -NHR1,
a R4 oznacza -(CH2)1COOA, -(CH2)1CONH2, -(CH2)1NH2 lub -(CH2)1-SO3H,
ΝΗ ^ch2Vn i
Η
NR, lub
O v 21 N NFL i 2
H
w których
Y oznacza O, S, -N(A)-CO- lub -(CH2)r,
D oznacza (CH2)r, O, S, NH, NR, (CH2)r-O, (CH2)rS, (CH2)rNH lub (CH2)rNR, a R2 oznacza -A, -E-OH, -E-COOH lub -E-CONH2,
PL 202 887 B1 gdzie E oznacza liniowy lub rozgałęziony łańcuch C1-C10-alkilowy, który jest niepodstawiony lub podstawiony grupą -A, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-C(O)NA2 lub C5-C10-cykloalkilem, albo
E oznacza C5-C10-cykloalkil, który jest niepodstawiony lub podstawiony grupą -A, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-C(O)NA2 lub C5-C10-cykloalkilem,
R5 oznacza liniowy lub rozgałęziony C1-C10-alkil, który jest niepodstawiony lub podstawiony grupą -A, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-C(O)NA2 lub C5-C10-cykloalkilem, albo
R5 oznacza C5-C10-cykloalkil, który jest niepodstawiony lub podstawiony grupą -A, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-C(O)NA2 lub C5-C10-cykloalkilem, a R oznacza C5-C10-cykloalkil, Het lub Ar, które są ewentualnie podstawione grupą C1-C6-alkilo-Het, -C1-C6-alkilo-Ar, -O-C1-C6-alkilo-Het, -O-C1-C6-alkilo-Ar, Het lub Ar, gdzie
Het oznacza monocykliczny lub bicykliczny 5- do 10-członowy pierścień aromatyczny lub niearomatyczny, zawierający jako człony pierścienia 1 lub 2 takie same lub różne heteroatomy, wybrane z grupy obejmują cej atom azotu, tlenu i siarki, który jest niepodstawiony lub podstawiony jedną lub większą liczbą grup hydroksylowych lub karboksylowych,
Ar oznacza monocykliczny lub bicykliczny 5- do 10-członowy pierścień aromatyczny, który jest niepodstawiony lub podstawiony jedną lub większą liczbą grup hydroksylowych lub karboksylowych, a
Z oznacza (CH2)m, O, S, NH, NR, N-C(O)-R lub NSO2R,
A oznacza H lub C1-C4-alkil, l, m i r oznaczają liczby całkowite 0-3, n i k oznaczają liczbę całkowitą 1 lub 2, p oznacza liczbę cał kowitą 0 lub 1, a q oznacza liczbę cał kowitą 1-3, w postaci wszystkich dowolnych stereoizomerów i ich mieszanin w dowolnych stosunkach, a także ich fizjologicznie tolerowanych soli.
Fizjologicznie tolerowanymi solami są np. sole kwasów nieorganicznych i organicznych, np. kwasu chlorowodorowego, kwasu siarkowego, kwasu octowego, kwasu cytrynowego lub kwasu p-toluenosulfonowego, albo sole zasad nieorganicznych i organicznych, takich jak NH4OH, NaOH, KOH, Ca(OH)2, Mg(OH)2, dietanoloamina lub etylenodiamina, lub sole aminokwasów, takich jak arginina, lizyna, lizyno-lizyna lub kwas glutaminowy.
Korzystnymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym n oznacza 1.
Innymi korzystnymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym R w grupie X oznacza Het.
Korzystniejszymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym Het oznacza grupę o wzorze
Innymi korzystnymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym R w grupie X oznacza Ar, który jest ewentualnie podstawiony -C1-C6-alkilo-Ar, -O- C1-C6-alkilo-Ar lub Ar. Korzystnie R w grupie X oznacza Ar.
Korzystniejszymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym Ar oznacza grupę o wzorze
PL 202 887 B1
Innymi korzystniejszymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym R w grupie X oznacza grupę o wzorze
Innymi korzystnymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym X
Korzystnie w powyższych związkach według wynalazku Y oznacza -(CH2)r-, gdzie r korzystnie oznacza 0 lub 1, a k korzystnie oznacza 1 lub 2.
Jeszcze innymi korzystnymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym X oznacza grupę o następującym wzorze
Korzystnie w powyższych związkach według wynalazku D oznacza -(CH2)r-, gdzie r korzystnie oznacza 0 lub 1.
Ponadto innymi korzystnymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym R1 oznacza grupę o następującym wzorze
PL 202 887 B1
Korzystnie w powyższych związkach według wynalazku Z oznacza (CH2)m, gdzie m korzystnie oznacza 0 lub 1. Korzystnie R4 oznacza -(CH2)l-COOA, gdzie A korzystnie oznacza H, albo R4 oznacza -(CH2)1-COONH2, gdzie l korzystnie oznacza 0. Korzystnie R3 oznacza -NH2 lub -A, gdzie A korzystnie oznacza H, albo R3 korzystnie oznacza -NHR1, gdzie -NHR1 korzystnie oznacza grupę o wzorze
w którym R4 korzystnie oznacza
Ponadto innymi korzystnymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym R1 oznacza grupę o następującym wzorze
Korzystnie w powyższych związkach według wynalazku Z oznacza -(CH2)m-, gdzie m korzystnie oznacza 1, R3 korzystnie oznacza -NH2, R4 korzystnie oznacza -(CH2)l-COOA, gdzie l korzystnie oznacza 0, a A korzystnie oznacza H.
Jeszcze innymi korzystnymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym R1 oznacza grupę o następującym wzorze
Korzystnie w powyższych związkach według wynalazku R4 oznacza -(CH2)l-COOA, gdzie l korzystnie oznacza 0, a A korzystnie oznacza H.
Innymi korzystnymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym R2 oznacza A, korzystnie R2 oznacza -CH3, albo R2 oznacza -E-COOH, korzystnie R2 oznacza -CH2-COOH, albo R2 oznacza -E-OH, korzystnie R2 oznacza -CH2-OH.
Innymi korzystnymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym R5 oznacza rozgałęziony C1-C10-alkil, korzystnie R5 oznacza -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CH(CH3)CH2-CH3 lub -CH2-CH(CH3)2.
Korzystniejszymi związkami według wynalazku są związki o ogólnym wzorze I, w którym q oznacza 2.
Wynalazek dotyczy ponadto środka farmaceutycznego zawierającego substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, którego cechą jest to, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden związek zdefiniowany powyżej i/lub jego fizjologicznie tolerowaną sól.
Wynalazek dotyczy ponadto pochodnych peptydowych zdefiniowanych powyżej i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli do stosowania jako leku.
PL 202 887 B1
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania pochodnych peptydowych zdefiniowanych powyżej i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli do wytwarzania leku do leczenia choroby związanej ze zwiększoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych.
W korzystnym zastosowaniu według wynalazku chorobę stanowią późne powikłania cukrzycowe.
W korzystnym zastosowaniu wedł ug wynalazku chorobę stanowi zwł óknienie, któremu towarzyszy zwiększona synteza błon podstawnych lub ich składników, w szczególności chorobę stanowi zwłóknienie wątroby.
W korzystnym zastosowaniu według wynalazku chorobę stanowi miażdżyca tę tnic.
W korzystnym zastosowaniu według wynalazku chorobę stanowi rak.
W korzystnym zastosowaniu według wynalazku chorobę stanowi retynopatia cukrzycowa.
W korzystnym zastosowaniu wedł ug wynalazku chorobę stanowi pozasoczewkowy rozrost włóknisty.
W korzystnym zastosowaniu według wynalazku choroba jest związana z silną składową zapalną, w szczególności chorobę stanowi reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie stawów i kości i/lub zapalenie naczyń.
W korzystnym zastosowaniu według wynalazku choroba jest związana z naczyniakami krwionośnymi.
W korzystnym zastosowaniu wedł ug wynalazku chorobę stanowi ł uszczyca.
Związki według wynalazku są nienaturalnymi (czyli nie występującymi w przyrodzie) pochodnymi peptydowymi o małej masie cząsteczkowej, zdolnymi do hamowania oddziaływania laminina/nidogen w nanomolowym zakresie stężeń. Nieoczekiwanie stwierdzono, że takie struktury o małej masie cząsteczkowej są zdolne do wiązania się z wysokim powinowactwem z miejscem wiązania lamininy w nidogenie, bez wymogu oddziaływania z tyrozyną lub histydyną z pętli (pętli c) sąsiadującą z wł a ś ciwą sekwencją wią zania.
Jeszcze bardziej zaskakujące jest to, że pochodne peptydowe o małej masie cząsteczkowej, o masie cząsteczkowej od 550 do 800 Da, opisane w niniejszym opisie, wykazują zdolność hamowania takiego samego rzędu jak najaktywniejszy z dotychczas opisanych peptydów (IC50 22 nM) o masie cząsteczkowej około 2700 Da (= około 50% modułu LE), zawierający nienaruszoną pętlę S-S, która prawdopodobnie stabilizuje strukturę podstawowego regionu sekwencji NIDPNAV (J.W. Fox i R. Timpl; US 5493008).
Cel ten osiągnięto przeprowadziwszy w specyficzny sposób syntezę, w oparciu o zależności pomiędzy budową i działaniem oraz opublikowaną trójwymiarową strukturę miejsca wiązania nidogenu, pochodnych peptydowych na nośnikach żywicznych. Bloki strukturalne do syntez peptydu zmieniano zgodnie z odpowiednimi kryteriami, aby zapewnić dużą różnorodność struktury i wbudowanie nienaturalnych bloków strukturalnych. Odpowiedni czuły test przesiewowy zastosowano do zbadania i porównania otrzymanych pochodnych peptydowych pod względem działania hamującego, po odszczepieniu od żywicy stanowiącej nośnik.
Jak już wspomniano powyżej, związki według wynalazku można stosować do wytwarzania leków do leczenia choroby, która jest związana ze zwiększoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych.
Zatem do możliwych dziedzin zastosowania terapeutycznego pochodnych peptydowych według wynalazku i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli należą:
1. Wszystkie typy późnych powikłań cukrzycowych, którym towarzyszy pogrubienie błon podstawnych (zwłaszcza w nerkach, oku, układzie naczyniowym).
2. Zwłóknienie wątroby, zwłaszcza zwłóknienie wątroby związane z alkoholizmem, charakteryzujące się syntezą ciągłej błony podstawnej w zatokach i wywołanym na skutek tego włosowaceniem.
3. Wszelkiego rodzaju zwłóknienia (przewlekłe lub jatrogenne), w których można zaobserwować nasiloną syntezę błony podstawnej lub składników błony podstawnej (nerek, płuc, skóry).
4. Miażdżyca tętnic charakteryzująca się ograniczeniem regulacji metabolizmu lipidów, co może być spowodowane między innymi zakłóconą filtracją lipoprotein przez częściowo zwłóknione zatoki wątroby. Zmiany patologiczne w układzie naczyniowym, które można zaobserwować w przypadku miażdżycy tętnic, można również częściowo przypisać modyfikacjom składu i budowy błon podstawnych w naczyniach.
5. Choroby, w których angiogeneza przyczynia się do zniszczenia w obrazie klinicznym, np. raki, w których nowotworzenie naczyń jest niezbędne do wzrostu guza, retynopatia cukrzycowa, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, zaburzenia z silnym składnikiem zapalnym (np. reumatoidalne zapale10
PL 202 887 B1 nie stawów, zapalenie stawów i kości, zapalenie naczyń), naczyniaki krwionośne, łuszczyca i wiele innych.
Związki o ogólnym wzorze I i ich fizjologicznie tolerowane sole i pochodne można według wynalazku podawać istotom żywym, korzystnie ssakom, a zwłaszcza ludziom, jako leki do stosowania w terapii lub profilaktyce. Można je podawać pojedynczo, w postaci mieszanin jednego związku z drugim, albo w postaci środków farmaceutycznych, umożliwiających podawanie dojelitowe lub pozajelitowe, które to środki jako substancję czynną zawierają skuteczną dawkę co najmniej jednego związku o ogólnym wzorze I i/lub jego fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych, oprócz zwykłych farmaceutycznie nieszkodliwych zaróbek i/lub dodatków.
Środki farmaceutyczne można podawać doustrojowo lub miejscowo. Można je podawać np. w postaci pigułek, tabletek, tabletek z powłoczką, tabletek powleczonych cukrem, granulatów, twardych i miękkich kapsułek żelatynowych, proszków, roztworów, syropów, emulsji, zawiesin lub w innych postaciach farmaceutycznych. Jednakże można również je podawać dopochwowo lub doodbytniczo, np. w postaci czopków, albo pozajelitowo albo przez wszczepienie, np. w postaci roztworów do iniekcji lub roztworów do infuzji, mikrokapsułek lub pręcików, albo miejscowo albo przezskórnie, np. w postaci maści, roztworów lub nalewek, albo w inny sposób, np. w postaci sprejów do nosa lub mieszanin aerozolowych albo w postaci preparatów w formie suchego proszku do wdychania. Gdy roztwory podaje się pozajelitowo, można je podawać np. dożylnie, domięśniowo, podskórnie, dostawowo, wewnątrzmaziówkowo lub w inny sposób, np. przez wdychanie wilgotnych aerozoli lub preparatów w postaci suchego proszku.
Środki farmaceutyczne według wynalazku wytwarza się w znany sposób, przy czym można stosować farmaceutycznie obojętne zaróbki nieorganiczne i/lub organiczne oprócz związku (związków) o ogólnym wzorze I i/lub jego/ich fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych. Do wytwarzania pigułek, tabletek, tabletek powlekanych cukrem i twardych kapsułek żelatynowych można stosować np. laktozę, skrobię kukurydzianą lub jej pochodne, talk, kwas stearynowy lub jego sole itp. Jako zaróbki miękkich kapsułek żelatynowych stosuje się np. tłuszcze, woski, półstałe i ciekłe poliole, glikole polietylenowe, naturalne lub utwardzone oleje itp. Jako odpowiednie zaróbki do wytwarzania roztworów, np. roztworów do iniekcji, albo emulsji lub syropów stosuje się np. wodę, alkohole, glicerynę, diole, poliole, sacharozę, cukier inwertowany, glukozę, oleje roślinne itp. Jako odpowiednie zaróbki w przypadku mikrokapsułek, implantów lub pręcików stosuje się np. kopolimery kwasu glikolowego i kwasu mlekowego. Preparaty farmaceutyczne zawierają zazwyczaj 0,5 - 90% wag. związków o ogólnym wzorze I i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych.
Oprócz substancji czynnych i zaróbek, środki farmaceutyczne mogą dodatkowo zawierać środki pomocnicze, lub dodatki, takie jak np. wypełniacze, środki rozsadzające, środki wiążące, środki poślizgowe, środki zwilżające, stabilizatory, emulgatory, środki konserwujące, środki słodzące, środki barwiące, środki zapachowe lub aromatyzujące, środki zagęszczające, rozcieńczalniki, substancje buforujące, rozpuszczalniki lub solubilizatory, środki zapewniające przedłużone działanie, sole zmieniające ciśnienie osmotyczne, środki powłokowe lub przeciwutleniacze. Mogą one również zawierać dwa lub większą liczbę związków o ogólnym wzorze I i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych. Mogą one ponadto zawierać dwa lub większą liczbę substancji terapeutycznie lub profilaktycznie czynnych oprócz co najmniej jednego związku o ogólnym wzorze I i/lub jego fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych. Środki farmaceutyczne zazwyczaj zawierają 0,2 - 500 mg, korzystnie 1 - 100 mg, substancji czynnej o ogólnym wzorze I i/lub jej fizjologicznie tolerowanych soli i pochodnych, w przeliczeniu na dawkę .
Gdy związki o ogólnym wzorze I lub zawierające je preparaty farmaceutyczne podaje się w postaci aerozoli, np. jako aerozole do nosa lub jako wilgotne aerozole lub suchy proszek do wdychania, można je podawać np. z użyciem odpowiednio rozpylacza, rozpylacza aerozolu, rozpylacza z pompką, urządzenia do inhalacji, inhalatora dozującego lub inhalatora do suchego proszku. Postacie farmaceutyczne do podawania związków o ogólnym wzorze I w postaci aerozolu można wytwarzać sposobem znanym fachowcom. W celu ich otrzymania przydatne są np. roztwory lub dyspersje związków o wzorze I w wodzie, mieszaninach wody z alkoholem lub w odpowiednich roztworach soli, z u życiem zwykłych dodatków, np. alkoholu benzylowego lub innych odpowiednich środków konserwujących, środków wzmagających wchłanianie dla zwiększenia biodostępności, solubilizatorów, dyspergatorów i innych środków, oraz, w razie potrzeby, zwykłych propelentów, np. chlorofluorowęglowodorów i/lub fluorowęglowodorów; natomiast preparaty związków o ogólnym wzorze I i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli, w postaci suchego proszku, można otrzymać przez liofilizację, albo, korzystnie, suszenie
PL 202 887 B1 rozpryskowe wodnych roztworów związków o ogólnym wzorze I i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli oraz odpowiednich dodatków rozpuszczalnych w wodzie, takich jak cukry lub pochodne cukrów i aminokwasy.
Dawka związków o ogólnym wzorze I może zmieniać się w szerokich granicach i zazwyczaj będzie dostosowywana do poszczególnych warunków w każdym indywidualnym przypadku, w sposób znany lekarzowi. Zależy ona np. od charakteru i ostrości leczonej choroby, od stosowanego związku lub od tego, czy leczy się ostry, czy też przewlekły stan chorobowy lub związek stosuje się zapobiegawczo, albo od tego, czy oprócz związków o ogólnym wzorze I stosuje się inne substancje czynne. Zazwyczaj, przy podawaniu doustnym, dzienna dawka wynosząca od około 0,01 do 100 mg/kg, korzystnie 0,1 - 10 mg/kg, a zwłaszcza 0,3-2 mg/kg (w każdym przypadku na kilogram wagi ciała) jest odpowiednia w przypadku dorosłej osoby dla osiągnięcia korzystnych wyników. W przypadku podawania dożylnego dzienna dawka zwykle wynosi 0,01 - 50 mg/kg, korzystnie 0,01 - 10 mg/kg wagi ciała. W szczególności, przy podawaniu stosunkowo dużych ilości, dzienną dawkę można podzielić na pewną liczbę, np. 2, 3 lub 4 częściowe dawki. W razie potrzeby, w zależności od indywidualnej odpowiedzi, konieczne może być podawanie dawek większych lub mniejszych do wskazanej dawki dziennej.
Ponadto związki o wzorze I i ich sole według wynalazku można stosować jako związki pośrednie do wytwarzania innych związków, a zwłaszcza innych związków farmaceutycznie czynnych, które można wytworzyć ze związków o ogólnym wzorze I, np. przez modyfikację albo wprowadzenie grup lub grup funkcyjnych, np. drogą estryfikacji, redukcji, utleniania lub innych przemian grup funkcyjnych.
Stwierdzono, że pochodne peptydowe według wynalazku można stosować bezpośrednio jako środki terapeutyczne, ale mogą one także stanowić podstawę do syntezy pokrewnych struktur, które są również przydatne do stosowania jako środki terapeutyczne do leczenia chorób związanych ze wzmożoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych.
Związki według wynalazku znajdują zastosowanie w sposobie identyfikacji związku hamującego oddziaływanie lamininy z nidogenem, zgodnie z którym związek według wynalazku stosuje się jako konkurencyjny inhibitor. Sposób ten może ponadto obejmować formułowanie zidentyfikowanego związku w postać farmaceutycznie dopuszczalną.
Sposób wytwarzania środka farmaceutycznego obejmuje identyfikację związku, który hamuje oddziaływanie lamininy z nidogenem, przy czym związek według wynalazku stosuje się jako konkurencyjny inhibitor, oraz ponadto zmieszanie zidentyfikowanego związku i/lub jego fizjologicznie tolerowanych soli z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Związki o ogólnym wzorze I według wynalazku można wytworzyć zgodnie z poniższym sposobem.
Związek o ogólnym wzorze I
O R2
Ο R5
Ο '2
ΝΗ (I) według wynalazku wytwarza się drogą kondensacji związku o wzorze II
R1
(Π) ze związkiem o wzorze III
PL 202 887 B1
O R2
Ο
Η2Ν
Ο R5
Ο (CN ϊ
Ο (III) w których R1, X, n i R2 mają wyż ej podane znaczenie, przy czym zwią zki o wzorach II i III mogą być zabezpieczone przy grupach funkcyjnych określonych powyżej grupami zabezpieczającymi znanymi w chemii peptydów (patrz np. Houben-Weyl, Metoden der Organischen Chemie, tom 15/1 i 15/2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Odpowiednie sposoby kondensacji są dobrze znane (Houben-Weyl, Metoden der Organischen Chemie, tom 15/1 i 15/2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Do odpowiednich środków kondensujących lub środków sprzęgających należą np. karbonylodiimidazole, karbodiimidy, takie jak dicykloheksylokarbodiimid lub diizopropylokarbodiimid, albo tetrafluoroboran O-((cyjano(etoksykarbonylo)metyleno)amino)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy (TOTU) albo bezwodnik kwasu pirofosforowego (PPA). Reakcje kondensacji prowadzi się w zwykłych warunkach. Zazwyczaj podczas kondensacji peptydów trzeba zabezpieczać grupy aminowe, które nie mają brać udziału w reakcji sprzęgania, odpowiednimi grupami zabezpieczającymi, które łatwo usuwa się w warunkach odmiennych od tych, w których zachodzi sprzęganie. Odnosi się to również do grup karboksylowych, które nie mają brać udziału w reakcji sprzęgania, które korzystnie zabezpiecza się jako estry C1-C6-alkilowe, estry benzylowe lub estry t-butylowe podczas reakcji sprzęgania. Zabezpieczanie grup aminowych nie jest konieczne w przypadku gdy grupy aminowe występują w postaci prekursorów grup aminowych, np. w postaci grup nitrowych lub cyjanowych. Grupy aminowe można następnie uwolnić w etapie hydratacji po reakcji kondensacji. Po etapie kondensacji grupy zabezpieczają ce usuwa się dowolnymi odpowiednimi sposobami; np. grupy benzyloksykarbonylowe i benzylowe można usunąć przez hydratację estrów benzylowych; grupy zabezpieczające typu t-butylu zazwyczaj odszczepia się w środowisku kwaśnym; grupę 9-fluorenylometyloksykarbonylową usuwa się z uż yciem amin drugorzędowych.
Związek o ogólnym wzorze I według wynalazku można również wytworzyć przez stopniowe dodawanie odpowiednich składników, np. naturalnych lub nienaturalnych aminokwasów i ich pochodnych, do fazy stałej, przy czym te składniki można dodawać w różnej kolejności.
W celu wytworzenia związku o ogólnym wzorze I dogodnie moż na nie prowadzić bezpoś redniego sprzęgania związków o wzorach I i II drogą stopniowej kondensacji, ale sprzęgać ich odpowiednie dogodne prekursory dla otrzymania związku pośredniego, który można przeprowadzić w związek o ogólnym wzorze I, np. wytwarzając jego pochodną.
Wyżej opisany sposób wprowadzania grup funkcyjnych nie bezpośrednio, ale poprzez ich odpowiednie prekursory, do cząsteczki, dla otrzymania związków pośrednich, z których łatwo można otrzymać produkt końcowy przeprowadzając grupy prekursorowe w odpowiednie grupy funkcyjne po reakcji kondensacji, można także zastosować w odniesieniu do różnych części cząsteczki związku o ogólnym wzorze I, np. do bocznego łańcucha związku o ogólnym wzorze I, odpowiednio R1- lub R1-X-.
P r z y k ł a d y
Stosowane skróty mają następujące znaczenie.
Środki i rozpuszczalniki
AcOH kwas octowy aq wodny
BSA albumina surowicy bydlęcej
DCC N,N'-dicykloheksylokarbodiimid
DCM dichlorometan
DIPEA N,N-diizopropyloetyloamina
DMAP 4-dimetyloaminopirydyna
DMF N,N-dimetyloformamid
DMSO dimetylosulfotlenek
Et2O eter dietylowy
EtOAc octan etylu (ester etylowy kwasu octowego)
PL 202 887 B1
EtOH etanol
Fmoc-OSucc
HOBT
KHMDS n-BuLi
MeOH
MTBE
TEA
TFA
THF
TMEDA
TMSCl
TOTU
Fmoc-O-sukcynoimid
1-hydroksybenzotriazol heksametylodisilazydek potasu n-butylolit metanol eter metylowo-t-butylowy trietyloamina kwas trifluorooctowy tetrahydrofuran tetrametyloetylenodiamina chlorek trimetylosililu tetrafluoroboran O-((cyjano(etoksykarbonylo)metyleno)amino)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy azydek trisililu
TrisN3
Grupy chemiczne
Me metyl CH3-
Et etyl CH3-CH2-
nPr n-propyl CH3-CH2CH2-
iPr izopropyl (CH3)2CH-
nBu n-butyl CH3CH2CH2CH2-
iBu izobutyl (CH3)2CHCH2-
tBu t-butyl (CH3)3C-
Ph fenyl C6H5-
Fmoc 9-fluorenylometoksykarbonyl
Z benzyloksykarbonyl C6H5-CH2-O-CO-
BOC t-butoksykarbonyl (CH3)3C-O-CO-
1. Przesiewanie biblioteki inhibitorów oddziaływania laminina/nidogen
Bibliotekę zaprojektowano aby znaleźć mniejsze, silniej działające i bardziej metabolicznie trwałe peptydy, w porównaniu ze znanym heptapeptydem NIDPNAV (Poschl E.; Fox J. W.; Block D.; Mayer U.; Timpl R., (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. Poschl E.; Mayer U.; Stetefeld J.; Baumgartner R.; Holak T. A.; Huber R.; Timpl R. (1996) EMBO J. 15: 5154-5159. Baumgartner R.; Czisch M.: Mayer U.; Poschl E.; Huber R.; Timpl R.; Holak T. A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668). Bibliotekę zsyntetyzowano i przesiewano jako 3 podbiblioteki; pentamerów, heksamerów i heptamerów. Poniżej opisano strategię przesiewania dla podbiblioteki pentamerów. Sposób jest reprezentatywny dla metod stosowanych w przypadku pozostałych dwóch podbibliotek, z tym, że do przesiewania heksamerów w pierwszym etapie stosowano około 50 perełek/studzienkę, a w przypadku heptamerów do przesiewania użyto około 100 perełek/studzienkę.
1.1 Przesiewanie biblioteki pentamerów
Biblioteka pentamerów zawierała 2160 różnych związków.
1) Wytworzono zawiesinę około 8800 pojedynczych perełek w 0,1% HCl i rozprowadzono na dno z filtrem nr 7 w 96 studzienkowych płytkach do mikromianowania, w ilości około 14 perełek/studzienkę.
2) Perełki przemyto dwukrotnie porcjami po 200 μΐ dejonizowanej wody, a następnie dodano 50 μΐ 500 mM HEPES o pH 7,0. Łącznik zastosowany w bibliotece uwalniał jedną porcję związku gdy wartość pH podwyższono do 7,0; ten etap rozszczepiania prowadzono przez noc.
3) Płytki nałożono na płytki filtracyjne z dnem w kształcie litery U i odwirowano. Mieszaniny związków uwolnionych z perełek zbierały się na spodniej płytce, podczas gdy odpowiadające im perełki pozostawały na wyjściowej płytce filtracyjnej.
4) Do perełek dodano DMSO w ilości 25 μl/studzienkę, w celu wymycia reszty wolnego związku z perełek i płytki ponownie odwirowano w celu oddzielenia związków w roztworze od perełek. Otrzymany roztwór podstawowy zawierał związek w stężeniu 27 μM w 333 mM HEPES, 33% DMSO.
PL 202 887 B1
5) Roztwory podstawowe związku inkubowano z nidogenem (10 μΐ roztworu podstawowego i 90 μΐ roztworu nidogenu) i próbę przeprowadzono zgodnie z załączonym opisem procedury, przy czym uzyskano końcowe stężenie przesiewowe 2,7 μΜ na związek.
6) W 25 studzienkach pomiarowych, w których wystąpiło powtarzalne hamowanie > 62%, odpowiednie perełki z wyjściowych płytek filtracyjnych zdyspergowano w 0,05% HCl, 0,1% Tween-20 i odpipetowano do 5 nowych płytek filtracyjnych w ilości 1 perełka/studzienkę. Do każdej płytki dodano w celu kontroli 2 perełki kontrolne ze związkiem macierzystym z takim samym łącznikiem.
7) Perełki przemyto dwukrotnie 200 μΐ dejonizowanej wody, po czym do każdej studzienki dodano 25 μΐ 50 mM NaOH. Łącznik zastosowany w bibliotece uwalniał drugą równomolową porcję związku gdy wartość pH podwyższono z 7,0 do 10,0 lub powyżej. Ten etap rozszczepiania prowadzono przez 3 godziny.
8) Płytki nałożono na płytki filtracyjne z dnem w kształcie litery U i odwirowano. Mieszaniny związków uwolnionych z perełek zbierały się na spodniej płytce, podczas gdy odpowiadające im perełki pozostawały na wyjściowej płytce filtracyjnej.
9) Perełki przemyto 20 μl 50 mM HEPES (wyjściowe pH 7,0) z dodatkiem 50 mM HCl i roztwór odwirowano na dolną płytkę, a następnie połączono z pierwszym uwolnionym roztworem.
10) Perełki przemyto po raz trzeci 25 μl DMSO, który pozostawiono z perełkami na 10 minut przed odwirowaniem w celu osiągnięcia równowagi.
11) Badano otrzymane roztwory uwolnionych związków w 1/10 objętości, jak w punkcie 5.
12) Roztwory, które zapewniały hamowanie takie same lub lepsze niż perełki kontrolne (hamowanie w około 50%) uznawano za trafione. Oddzielono 23 trafione perełki wraz z dwiema innymi potencjalnymi trafionymi perełkami w pojedynczych studzienkach, których aktywność przypisano dodatkowym słabym inhibitorom.
13) Trafione roztwory poddano spektrometrii masowej dla oznaczenia masy cząsteczkowej.
14) Odpowiednie pojedyncze trafione perełki poddano analizie Edmana dla ustalenia sekwencji peptydów.
15) Połączone dane MS i Edmana poddano analizie dla ustalenia budowy trafionych związków.
Struktury i częstość ich odzysku przedstawiono poniżej. G-Hopa = hydroksypropyloamid glicyny, reszta łącznika.
Częstość IC50, μM
6 D Nal2 N D V G-Hopa 0,43
4 D Nal2 N A V G-Hopa 0,37
4 D Nal2 N D I G-Hopa 0,64
4 D Nal2 N S V G-Hopa 0,49
3 D Nal2 N S I G-Hopa 0,81
2 D Nal2 N A I G-Hopa 0,47
Legenda
Nal2 = L-3-(2-naftylo)alanyl:
G-Hopa = glicyno-3-hydroksypropyloamid:
PL 202 887 B1
D = ASP (aspartyl), P = pro (prolil), N = Asn (asparaginyl). A = Ala (alanyl, V = Val (walinyl), S = Ser (seryl), I = Ile (izoleucyl).
1.2 Procedury: Wytwarzanie biblioteki peptydów
Biblioteki peptydów zsyntetyzowano drogą syntezy z rozszczepianiem/mieszaniem (Lam K. S., Salmon S. E., Hersh E. M., Hruby V. J., Kazmierski W. M. i Knapp R. J. (1991) Nature 354, 82; Furka A., Sebestyen F., Asgedom M. i Dibo G. (1991) Int. J. Pept. Protein Res. 37, 487) z zastosowaniem standardowej syntezy peptydów w fazie stałej z chemizmem Fmoc (Stewart J. M. i Young J. D. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., Rockford, IL.; Atherton E. i Sheppard R. C. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis. IRL Press Oxford). Każ d ą z pereł ek ż ywicy wystawiano na działanie tylko jednego aminokwasu w każdym cyklu sprzęgania. Z tego względu po zakończeniu syntezy biblioteki na każdej perełce żywicy znajdował się tylko jeden rodzaj peptydu. Z uwagi na to, że nie jest możliwe osobne zbadanie wszystkich związków, zbudowano taką samą strukturę na każdej perełce żywicy w dwóch kopiach, poprzez zastosowanie dającego się różnie rozszczepiać łącznika, fig. 1 (Kocis P., Krchnak V. i Lebl M. (1993) Tetr. Lett. 34, 7251; Lebl M., Krchnak V., Salmon S. E. i Lam K. S. (1994) A Companion to Methods in Enzymology 6, 381). Peptyd można następnie uwolnić z perełki żywicy w kolejnych etapach, w oparciu o różne mechanizmy rozszczepiania. Pierwszą część peptydu z grupą hydroksypropyloamidową uwalniano w buforze o pH 7-9. Drugą część peptydu uwalniano w warunkach wyższej wartości pH (schemat 1).
W bibliotekach peptydów zastosowano pereł ki z polistyrenu szczepionego glikolem polietylenowym lub TentaGel®S NH2. W zasadzie można stosować perełki dowolnej żywicy nadające się do syntezy i przesiewania peptydów w środowisku wodnym.
Otrzymano biblioteki penta-, heksa- i heptamerów z jedną ustaloną pozycją (L-asparaginy). Hydroksypropyloamid glicyny na końcu C stanowi część łącznika:
H-X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH (2160 peptydów)
H-X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH (25920 peptydów)
H-X6X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH (311040 peptydów)
X1: N-Fmoc-L-aminokwasy (9) stosowane w pierwszej randomizacji: walina, izoleucyna, treonina, fenyloalanina, e-(2-naftylo)alanina, kwas 2-azetydynokarboksylowy, prolina, cykloheksyloglicyna, fenyloglicyna.
X2: N-Fmoc-L-aminokwasy (4) stosowane w drugiej randomizacji: alanina, glicyna, seryna, kwas asparaginowy.
X3=X5=X6: N-Fmoc-L-aminokwasy (12) stosowane w trzeciej, piątej i szóstej randomizacji: kwas pipekolinowy, e-(2-naftylo)alanina, kwas glutaminowy, lizyna, kwas 2-azetydynokarboksylowy, treonina, prolina, asparagina, izoleucyna, 3,5-dijodotyrozyna, cytrulina, arginina.
X4: N-Fmoc-L-aminokwasy (5) stosowane w czwartej randomizacji: kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, kwas 2-aminoadypinowy, O-siarczan tyrozyny, kwas γ-karboksyglutaminowy.
Żywicę (PEG-PS-HCl, Millipore®, 20 g, obciążenie 0,58 mmola/g, średnia wielkość cząstek 220 nm) spęczniano w N,N-dimetyloformamidzie przez 2 godziny, po czym zobojętniano 10% N,N-diizopropyloetyloaminą w dichlorometanie. Żywicę przemyto dichlorometanem i N,N-dimetyloformamidem. Łącznik (fig. 1, 3 równoważniki) sprzęgnięto z użyciem 1,3-diizopropylokarbodiimidu i 1-hydroksybenzotriazolu (po 3 równoważniki) w N,N-dimetyloformamidzie w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Reakcję kontrolowano metodą z błękitem bromofenolowym (Krchnak V., Vagner J., Safar P. i Lebl M. (1988) Collec. Czech. Cem. Commun. 53, 2542). Zakończenie reakcji sprzęgania następnie ustalano na podstawie próby ninhydrynowej (Kaiser E., Colescott R. L, Bossinger C. D. i Cook P. I. (1969) Anal. Biochem. 34, 595). Po przemyciu N,N-dimetyloformamidem grupę zabezpieczającą Fmoc usunięto podziaławszy 50% piperydyna w N,N-dimetyloformamidzie przez 15 minut. Żywicę następnie przemyto N,N-dimetyloformamidem i ilość uwolnionego adduktu fulwen-piperydyna oznaczano ilościowo metodą spektrometrii UV (302 nm). Poziom trwałego obciążenia żywicy (mmol/g), oznaczany w ten sposób przez cały czas syntezy bibliotek, służył jako jeden ze środków kontroli jakości.
Żywicę podzielono na 9 równych porcji. Do każdej porcji żywicy dodano jeden z 9 Fmoc-zabezpieczonych aminokwasów (X1) i prowadzono sprzęganie w opisany sposób przez 2 godziny. Żywicę następnie zebrano w walcowym szklanym naczyniu z dnem ze spiekanego szkła. Przez mieszaninę żywicy przepuszczano pęcherzykami suchy azot. Grupę zabezpieczającą Fmoc usunięto w sposób opisany powyżej.
PL 202 887 B1
Żywicę podzielono na 4 równe porcje. Do każdej porcji żywicy dodano jeden z 4 Fmoc-zabezpieczonych aminokwasów (X2) i prowadzono sprzęganie w opisany sposób. Grupę zabezpieczającą Fmoc usunięto i oznaczono stopień obciążenia żywicy. W następnym cyklu L-asparaginę sprzęgnięto w sposób opisany powyżej. Żywicę następnie podzielono na porcje do kolejnego cyklu sprzęgania. Po zakończeniu wszystkich etapów randomizacji, grupę Fmoc usunięto i odszczepiono grupy zabezpieczające łańcuchy boczne za pomocą mieszaniny kwasu trifluorooctowego (82,5%), anizolu (5%), wody (5%), tioanizolu (5%), etanoditiolu (2,5%) w ciągu 2,5 godziny. Żywicę przemyto następnie kwasem trifluorooctowym, dichlorometanem, N,N-dimetyloformamidem i metanolem. Biblioteki przechowywano w stanie wysuszonym w 4°C.
W celu zweryfikowania jako ś ci bibliotek kilka przypadkowo wybranych pere ł ek poddano sekwencjonowaniu metodą degradacji Edmana analizie metodą spektrometrii masowej.
1.3 Wyniki (patrz również fig. 2-8)
PL 202 887 B1
PL 202 887 B1
PL 202 887 B1
PL 202 887 B1
PL 202 887 B1
PL 202 887 B1
PL 202 887 B1
PL 202 887 B1
PL 202 887 B1
PL 202 887 B1
PL 202 887 B1
2. Synteza w dużej skali
2.1. Synteza N-Fmoc-trans-3-(2'-naftylo)-L-proliny (A8)
Schemat syntezy: N-Fmoc-trans-3-(2'-naftylo)-L-prolinę (A8) otrzymano w 10 etapach:
2.1.1. trans-3-(2'-Naftylo)propenian etylu (A1)
Do roztworu 2-naftaldehydu (7,8 g, 50 mmoli) w 50 ml etanolu w trakcie mieszania dodano (karboetoksymetyleno)trifenylofosforanu (18,3 g, 52,5 mmola). Stwierdzono nieznacznie egzotermiczną reakcję. W trakcie mieszania przez noc wytrącił się osad. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono Et2O (500 ml) i przemyto 1 M H3PO4 (2 x 100 ml), nasyconym roztworem NaHCO3 (1 x 100 ml), wodą (100 ml) i solanką (100 ml). Frakcję organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość przepuszczono przez wkład z SiO2, z elucją mieszaniną 9:1 heksan:EtOAc. Po zatężeniu pod próżnią odzyskano z wydajnością prawie ilościową produkt w postaci mieszaniny 85:15 izomerów geometrycznych (na korzyść izomeru trans według NMR). Produkt ten poddano rekrystalizacji z mieszaniny heksan/EtOAc (bogatej w heksan) i otrzymano 4,5 g żądanego produktu w postaci mieszaniny izomerów 97:3 (NMR). Roztwór macierzysty zatężono i poddano rekrystalizacji jak powyżej, w wyniku czego otrzymano dodatkowo 2,9 g produktu (łącznie 7,4 g, 33 mmole, 65%
PL 202 887 B1 wydajności). NMR (CDCl3) δ 7,93 (s, 1 H); 7,88-7,83 (c, 4 H); 7,67 (dd, 1H, J = 1,6, 8,6 Hz); 7,53-7,50 (c, 2 H); 6,55 (d, 1 H, J = 16,0 Hz); 4,30 (q, 2 H, J = 7,1 Hz); 1,42 (t, 3 H, J = 7,1 Hz).
2.1.2. Kwas trans-3-(2'-naftylo)propenowy (A2)
Do roztworu estru A1 (4,24 g, 18,8 mmola) w THF (75 ml) dodano LiOH^H2O (2,36 g, 56,3 mmola) w wodzie (19 ml). Początkowo niejednorodną mieszaninę intensywnie mieszano przez noc, w wyniku czego stała się ona jednorodna. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono stężonym HCl (do pH = 2), przy czym wytrącił się osad. Niejednorodną mieszaninę przeniesiono do rozdzielacza i wyekstrahowano EtOAc (3 x 150 ml). Połączone ekstrakty wysuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, w wyniku czego otrzymano kwas karboksylowy w postaci białej substancji stałej (3,66 g, 98% wydajności). NMR (CDCl3) δ 7,97 (d, 1 H, J = 15,7 Hz); 7,90 (d, 1 H, J = 15,3 Hz): 7,90-7,83 (c, 3 H); 7,70 (dd, 1 H, J = 1,6, 8,6 Hz); 7,57-7,50 (c, 2 H); 6,58 (d, 1 H, J = 16,0 Hz).
2.1.3. trans-(4S)-3-(3'-(2-Naftylo)propenoilo)-4-fenylo-2-oksazolidynon (A3)
Roztwór kwasu karboksylowego A2 (3,66 g, 18,5 mmola) i trietyloaminy (1,87 g, 2,56 ml, 18,5 mmola) w bezwodnym THF (74 ml) ochłodzono do -78°C. Chlorek piwaloilu (2,35 g, 2,40 ml, 19,4 mmola) dodano w ciągu 2 minut, przy czym wytrącił się biały osad. Po 10 minutach kolbę umieszczono w łaźni o temperaturze 0°C na 10 minut, po czym kolbę ponownie chłodzono do -78°C w ciągu
I, 5 godziny. W oddzielnej kolbie oksazolidion pochodzący od L-fenyloglicynolu (3,31 g, 20,3 mmola) w bezwodnym THF (74 ml) ochłodzono do -78°C. Dodano roztworu n-BuLi (1,6 M w heksanie,
II, 6 ml, 18,5 mmola) i mieszanie kontynuowano przez około 1 godzinę, czemu towarzyszyło wytrącenie się metalowanego oksazolidynonu z roztworu THF/heksan. Mieszany bezwodnik dodano przez rurkę do metalowanego oksazolidynonu i mieszaninę reakcyjną umieszczono w łaźni o temperaturze 0°C. Po 1 godzinie łaźnię usunięto i mieszaninę pozostawiono na noc do ogrzania się do temperatury pokojowej. Reakcję przerwano dodawszy 50 ml nasyconego roztworu NH4Cl. THF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i, po przeniesieniu do rozdzielacza, mieszaninę wyekstrahowano CH2Cl2 (3 x 75 ml). Połączone frakcje organiczne przemyto 1M NaOH (2 x 50 ml), wysuszono (MgSO)4 i zatężono. Pozostałość poddano rekrystalizacji z EtOAc/heksanu i otrzymano białą substancję stałą (3,87 g, 11,2 mmola, 61% wydajności). NMR (CDCl3) δ 8,05 (d, 1 H, J = 15,7 Hz); 7,94 (d, 1 H, J = 15,4 Hz); 7,87-7,81 (c, 3 H); 7,76 (dd, 1 H, J = 1,5, 8,6 Hz); 7,53-7,47 (c, 2 H); 7,41-7,34 (c, 5 H); 5,58 (dd, 1 H, J = 8,7, 3,9 Hz); 4,76 (t, 1 H, J = 8,7 Hz); 4,33 (dd, 1 H, J = 8,8, 3,9 Hz).
2.1.4. (3'R4S)-3-(3'-(2-Naftylo)-4'-pentenoilo)-4-fenylo-2-oksazolidynon (A4)
Do roztworu Cul (3,96 g, 20,9 mmola) i TMEDA (2,66 g, 3,46 ml, 22,9 mmola) w bezwodnym THF (92 ml) w -78°C dodano bromku winylomagnezu (1,0 M w THF, 20,9 ml, 20,9 mmola). Mieszaninę mieszano przez 15 minut. W osobnej kolbie do roztworu nienasyconego imidu A3 (3,87 g, 11,3 mmola) w bezwodnym THF (42 ml) dodano chlorku trimetylosililu (5,69 g, 6,64 ml, 52,2 mmola). Z uwagi na nierozpuszczalność imidu, wyjęto korek z przegrodą z kolby zawierającej reagent miedzianowy usunięto i zawiesinę imidu dodano w jednej porcji, szybko przemywając kolbę małą ilością THF. Temperaturę łaźni podwyższono do -30°C i mieszanie kontynuowano przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną wlano do 250 ml mieszaniny 3:2 nasyconego roztworu NH4Cl:stężonego NH4OH. Warstwy rozdzielono i frakcję wodną wyekstrahowano EtOAc (3 x 200 ml). Połączone frakcje organiczne przemyto kolejno nasyconym roztworem NH4Cl (1 x 100 ml) i wodą (1 x 100 ml). Frakcję organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono przez przepuszczenie przez wkład z SiO2, z elucją mieszaniną 4:1 heksan:EtOAc. Eluat zatężono pod próżnią i otrzymano białą substancję stałą (3,64 g, 9,81 mmola, 87% wydajności). NMR (CDCl3) δ 7,87-7,82 (c, 3 H); 7,72 (s, 1 H); 7,54-7,27 (c, 8 H); 6,11 (ddd, 1 H, J = 6,7, 10,4, 17,0 Hz); 5,34 (dd, 1H, J = 8,6, 3,5 Hz); 5,10 (d, 1H, J = 8,2 Hz); 5,08 (d, 1 H, J = 17,2 Hz); 4,56 (t, 1 H, J = 8,8 Hz); 4,26 (dd, 1H, J = 8,8, 3,5 Hz); 4,16 (ddd, 1 H, J = 8,1, 7,0, 6,9 Hz); 3,68 (dd, 1 H, J = 8,4, 16,5 Hz); 3,50 (dd, 1H, J = 6,5, 16,5 Hz).
2.1.5. (2'S3'R4S)-3-(2'-Azydo-3'-(2-naftylo)-4'-pentenoilo)-4-fenylo-2-oksazolidynon (A5)
Do bezwodnego THF (34 ml) w -78°C dodano w jednej porcji heksametylodisilazydku potasu (0,5 M w toluenie, 25,5 ml, 12,8 mmola). Imid A4 (3,64 g, 9,81 mmola) w postaci zawiesiny w THF (34 ml) dodano przez rurkę, z przemywaniem THF (2 x 11 ml) dla zapewnienia całkowitego przeniesienia. Po 30 minutach azydek trisililu (4,40 g, 14,2 mmola) rozpuszczono w THF (34 ml), ochłodzono do -78°C i dodano przez rurkę. Po kolejnych 30 minutach dodano AcOH (1,41 g, 1,34 ml, 23,4 mmola) w celu przerwania reakcji. Mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę rozdzielono pomiędzy CH2Cl2 (300 ml) i rozcieńczony roztwór soli (150 ml). Warstwy rozdzielono i fazę wodną wyekstrahowano CH2Cl2 (3 x 150 ml). Połączone frakcje organiczne wysuszono (MgSO4) i zatężono
PL 202 887 B1 pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii rzutowej i otrzymano produkt (3,41 g, 8,28 mmola, 84% wydajności). NMR (CDCl3) δ 7,85-7,82 (c, 3 H); 7,72 (s, 1 H); 7,53-7,47 (c, 2 H); 7,42 (dd, 1 H, J = 1,7, 8,5 Hz); 7,37-7,31 (c, 3 H); 7,18-7,15 (c, 2 H); 6,28 (ddd, 1 H, J =
8,2, 10,2, 17,1 Hz); 5,63 (d, 1 H, J = 10,2 Hz); 5,37 (d, 1 H, J = 17,0 Hz); 5,34 (d, 1 H, J = 10,2 Hz); 4,83 (dd, 1 H, J = 3,0, 8,3 Hz); 4,14 (t, 1 H, J = 7,2 Hz); 4,07 (dd, 1 H, J = 9,3, 17,9 Hz); 3,94 (dd, 1 H, J = 3,0, 5,8 Hz); 3,68 (t, 1 H, J = 8,6 Hz).
2.1.6. (2S3R)-2-Azydo-3-(2'-naftylo)-4-pentenian metylu (A6)
Do roztworu imidu A5 (3,41 g, 8,28 mmola) w THF (62 ml) dodano wody (21 ml), 35% H2O2 (2,7 ml) i LiOH^H2O (695 mg, 16,6 mmola). Po 2 godzinach dodano Na2SO3 (4,17 g, 33,1 mmola) w postaci roztworu w wodzie (41 ml). Mieszaninę mieszano przez 15 minut i THF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Wodny roztwór zakwaszono z użyciem HCl i wyekstrahowano EtOAc (2 x 150 ml). Połączone ekstrakty wysuszono (MgSO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość przepuszczono przez kolumnę z wkładem SiO2, z elucją mieszaniną 1:1 heksan:EtOAc, w wyniku czego otrzymano po zatężeniu białą substancję stałą, którą stanowiła przede wszystkim mieszanina kwasu karboksylowego i chiralnego środka pomocniczego. Po rekrystalizacji z heksanu/EtOAc otrzymano chiralny środek pomocniczy w postaci igieł. Roztwór macierzysty zatężono i zastosowano w etapie estryfikacji. Pozostałość zawierającą surowy kwas karboksylowy rozpuszczono w bezwodnym MeOH (46 ml) i ochłodzono do 0°C. Dodano chlorku tionylu (1,18 g, 725 gl, 9,94 mmola) i po 10 minutach mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 2 godziny. Do mieszaniny dodano wody (1,0 ml), całość mieszano przez 10 minut i zawartość kolby zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozdzielono pomiędzy EtOAc (150 ml) i solankę (100 ml). Warstwy rozdzielono, po czym frakcję organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii rzutowej (19:1 heksan:EtOAc) i otrzymano ester metylowy (1,54 g, 5,48 mmola, 66% wydajności). NMR (CDCl3) δ 7,84-7,80 (c, 3 H); 7,71 (s, 1 H); 7,50-7,46 (c, 2 H); 7,39 (dd, 1 H, J = 1,8, 8,5 Hz); 6,23 (ddd, 1 H, J = 8,3, 10,9, 17,6 Hz); 5,30 (d, 1 H, J = 9,9 Hz); 5,28 (d, 1 H, J = 17,7 Hz); 4,22 (d, 1 H, J = 7,5 Hz); 4,06 (t, 1 H, J = 7,9 Hz).
2.1.7. Ester metylowy trans-3-(2'-naftylo)-L-proliny (A7)
Kompleks borowodór-sulfid metylowy (2,0 M w THF, 6,57 ml, 13,1 mmola) rozcieńczono bezwodnym THF (26 ml) i ochłodzono do 0°C. Cykloheksen (2,16 g, 2,66 ml, 26,3 mmola) dodano ostrożnie za pomocą strzykawki. Po 30 minutach wytrącił się biały osad. Mieszanie kontynuowano przez 3 godziny. Zawartość kolby zatężono pod próżnią. Przygotowano zawiesinę odczynnika w CH2Cl2 (36 ml) i ochłodzono do 0°C. Azydek winylu A6 (1,23 g, 4,38 mmola) rozpuszczono w CH2Cl2 (9 ml) i dodano przez rurkę. Mieszanina reakcyjna stała się bladożółta i widoczne było wywiązywanie się gazu. Mieszaninę pozostawiono na noc do ogrzania się do temperatury pokojowej. Dodano MeOH (26 ml) i mieszanie kontynuowano przez 15 minut. Mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość roztworzono w Et2O (25 ml) i wyekstrahowano 0,1M HCl (5 x 25 ml). Wodne ekstrakty zalkalizowano nasyconym roztworem NaHCO3 i wyekstrahowano CH2Cl2 (3 x 100 ml). Ekstrakty organiczne wysuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, w wyniku czego otrzymano cyklizowany produkt wraz z pewną ilością zanieczyszczeń pochodzących od dicykloheksyloborowodoru (974 mg, 3,82 mmola, 87% wydajności surowego produktu). NMR (CDCl3) δ 7,84-7,78 (c, 3 H); 7,71 (s, 1 H); 7,49-7,41 (c, 3 H); 3,91 (d, 1 H, J = 6,9 Hz); 3,69 (s, 3 H); 3,63 (m, 1 H), 3,48 (dd, 1 H, J =
8,2, 15,4 Hz); 3,27 (d, 1 H, J = 7,8 Hz); 3,25 (d, 1 H, J = 7,8 Hz); 2,33 (m, 1 H), 2,09 (m, 1 H).
2.1.8. N-Fmoc-trans-3-(2'-naftylo)-L-prolina (A8)
Porcję 510 mg (2 mmole) estru metylowego (A7) w 12 ml 6N HCl ogrzewano w 100°C przez 10 godzin. Roztwór reakcyjny zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość przeprowadzono w stan zawiesiny w 15 ml acetonu. Odczyn zawiesiny doprowadzono do pH 9-10 z użyciem 2N roztworu Na2CO3. Następnie powoli dodano 742 mg (2,2 mmola) Fmoc-O-sukcynimidu. Następnie odczyn mieszaniny następnie doprowadzono do pH 9-10 i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, po czym odstawiono ją na noc w temperaturze pokojowej. Następnie odczyn mieszaniny doprowadzono do pH 2 z użyciem stężonego HCl i mieszaninę zmieszano z octanem etylu. Wytrącony produkt (560 mg) odsączono pod próżnią. Fazę wodną wyekstrahowano 3 razy octanem etylu, a następnie zmieszano z chlorkiem metylenu. Tak otrzymano dodatkowo 185 mg produktu w postaci osadu. Wydajność: 745 mg (80,4%). NMR (d6-DMSO) δ 7,95-7,80 (c, 6 H); 7,68 (d, 1 H, J = 7,3 Hz; 7,60 (d, 1 H, J = 7,4 Hz); 7,50-7,34 (c, 6 H); 7,25 (m, 1 H), 4,39-4,15 (c, 4 H); 3,70-3,48 (c, 3 H); 2,29 (m, 1 H); 2,14 (m, 1 H).
PL 202 887 B1
2.2. N-Sukcynylo-L-(2-naftylo)alaninylo-L-asparaginylo-L-serynylo-L-walinyloglicyno-3-hydroksypropyloamid (22)
2.2.1. Benzyloksykarbonyloglicyno-(3-propanolo)amid (B1)
Porcję 627 g (30 mmoli) benzyloksykarbonyloglicyny, 2,45 ml 3-amino-1-propanolu i 4,05 g HOBt rozpuszczono w 60 ml DMF. W temperaturze 0°C dodano 6,6 g DCC. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 godzinę i w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, po czym odstawiono na noc w temperaturze pokojowej. Osad odsączono pod próżnią i przesącz zatężono pod wysoką próżnią. Pozostałość rozdzielono pomiędzy octan etylu i roztwór NaHCO3. Fazę organiczną następnie przemyto roztworem NaHCO3 i H2O/NaCl, wysuszono Na2SO4 i zatężono. Pozostałość roztarto z eterem dietylowym. Wydajność: 7,05 g (88,2%).
2.2.2. Benzyloksykarbonyloglicyno-(3-t-butoksypropylo)amid (B2)
Porcję 7 g (26,28 mmola) benzyloksykarbonyloglicyno-(3-propanolo)amidu (B1) rozpuszczono w 60 ml dioksanu. W niskiej temperaturze (ciekły CO2) powoli dodano 6 ml H2SO4. Następnie dodano 60 ml stężonego izobutylenu. Mieszaninę wytrząsano w autoklawie w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem azotu około 2 MPa (20 barów) przez 3 dni. Mieszaninę następnie zmieszano z eterem dietylowym i trzykrotnie wyekstrahowano 2N roztworem Na2CO3. Roztwór wodny przemyto eterem dietylowym. Fazy organiczne połączono, przemyto wodą, wysuszono Na2SO4 i zatężono. Wydajność; 7,98 g (94,2%).
2.2.3. Chlorowodorek glicyno-(3-t-butoksypropylo)amid (B3)
Porcję 7,98 g (24,75 mmola) benzyloksykarbonyloglicyno -(3-t-butoksypropylo)amidu (B2) rozpuszczono w 80 ml MeOH, zmieszano z Pd na węglu i uwodorniano w aparacie do automatycznego miareczkowania z użyciem metanolowego HCl i H2. Katalizator następnie odsączono pod próżnią i przesącz zatężono. Pozostałość wysuszono pod wysoką próżnią. Wydajność: 4,7 g (84,5%).
2.2.4. Benzyloksykarbonylo-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amid (B4)
Porcję 5,13 g (20,43 mmola) benzyloksykarbonylo-Val-OH, 4,59 g (20,43 mmola) chlorowodorku glicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B3) i 2,75 g HOBt rozpuszczono w 60 ml DMF. W temperaturze 0°C, dodano 2,65 ml N-etylomorfoliny i 4,5 g DCC. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mieszaninę odstawiono na noc w temperaturze pokojowej, po czym zatężono pod wysoką próżnią. Pozostałość rozdzielono pomiędzy lodowaty kwas octowy i roztwór NaHCO3. Fazę lodowatego kwasu octowego następnie przemyto roztworem NaHCO3, roztworem KHSO4 i H2O/NaCl, wysuszono Na2SO4 i zatężono. Stałą pozostałość roztarto z eterem dietylowym i odsączono pod próżnią.
Wydajność: 7,32 g (85%).
2.2.5. Chlorowodorek L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B5)
Porcję 7,29 g (17,3 mmola) benzyloksykarbonylo-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B4) rozpuszczono w 90 ml MeOH, zmieszano z Pd na węglu i uwodorniano w aparacie do automatycznego miareczkowania z użyciem metanolowego HCl. Katalizator następnie odsączono pod próżnią i przesącz zatężono. Pozostałość (bezpostaciową) wysuszono pod wysoką próżnią, roztarto z eterem dietylowym i odsączono pod próżnią. Wydajność: 5,22 g (93,2%).
2.2.6. Benzyloksykarbonylo-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amid (B6)
PL 202 887 B1
Porcję 5,46 g (18,5 mmola) Z-Ser(But)OH, 6 g (18,5 mmola) chlorowodorku L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B5) i 2,5 g HOBt rozpuszczono w 60 ml DMF. W temperaturze 0°C dodano 2,4 ml N-etylomorfoliny i 4,07 g DCC. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 godzinę i w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Mieszaninę odstawiono na noc w temperaturze pokojowej, po czym zatężono pod wysoką próżnią. Stałą pozostałość rozdzielono pomiędzy lodowaty kwas octowy i roztwór NaHCO3. Fazę lodowatego kwasu octowego przemyto roztworem NaHCO3, roztworem KHSO4 i H2O/NaCl, wysuszono Na2SO4 i zatężono. Pozostałość roztarto z eterem dietylowym i odsączono pod próżnią. Wydajność: 9,74 g (93,2%).
2.2.7. Chlorowodorek L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B7)
Porcję 9,74 g (17,25 mmola) benzyloksykarbonylo-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B6) rozpuszczono w około 100 ml MeOH, zmieszano z Pd na węglu i uwodorniano w aparacie do automatycznego miareczkowania z użyciem metanolowego HCl. Katalizator następnie odsączono pod próżnią i przesącz zatężono. Pozostałość (bezpostaciową) wysuszono pod wysoką próżnią, roztarto z eterem dietylowym i odsączono pod próżnią. Wydajność: 8,02 g (99,6%).
2.2.8. Benzyloksykarbonylo-L-asparagino-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amid (B8)
Porcję 4,53 g (17 mmoli) Z-Asn-OH, 7,94 g chlorowodorku L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B7) i 2,3 g HOBt rozpuszczono w 60 ml DMF. W temperaturze 0°C dodano 2,21 ml N-etylomorfoliny i 3,74 g DCC. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 godzinę i w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, po czym zatężono pod wysoką próżnią. Pozostałość rozdzielono pomiędzy pentanol i roztwór NaHCO3. Fazę pentanolu przemyto roztworem NaHCO3, roztworem KHSO4 i H2O/NaCl, wysuszono nad Na2SO4 i odsączono pod próżnią, po czym przesącz zatężono pod wysoką próżnią. Pozostałość roztarto z eterem dietylowym, ochłodzono i odsączono pod próżnią. Produkt wysuszono w eksykatorze nad P2O5. Wydajność: 10,8 g (93,6%).
2.2.9. Chlorowodorek L-asparagino-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B9)
Porcję 10,8 g (15,9 mmola) benzyloksykarbonylo-L-asparagino-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-butoksypropylo)amidu (B8) rozpuszczono w około 160 ml ciepłego MeOH, zmieszano z Pd na węglu i uwodorniano w aparacie do automatycznego miareczkowania z użyciem metanolowego HCl. Katalizator następnie odsączono pod próżnią i przesącz zatężono. Bezpostaciową pozostałość wysuszono pod wysoką próżnią, roztarto z eterem dietylowym i odsączono pod próżnią. Wydajność: 8,96 g (97%).
2.2.10. Benzyloksykarbonylo-L-2-naftyloalanino-L-asparagino-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amid (B10)
Porcję 5,24 g (15 mmoli) benzyloksykarbonylo-2-Nal-OH, 8,72 g (15 mmoli) chlorowodorku L-asparagino-L-(t-butoksykabonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B9) i 2,04 g HOBt rozpuszczono w 60 ml DMF. W temperaturze 0°C dodano 1,95 ml N-etylomorfoliny i 3,3 g DCC. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 godzinę i w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Mieszaninę odstawiono następnie na noc w temperaturze pokojowej, rozcieńczono DMF i nieznacznie ogrzano. Wytrącony osad następnie odsączono pod próżnią i przesącz zatężono pod wysoką próżnią. Pozostałość roztarto z roztworem NaHCO3, przesączono pod próżnią, a następnie roztarto z roztworem KHSO4, odsączono pod próżnią, roztarto z H2O, odsączono pod próżnią i przemyto H2O i wysuszono w eksykatorze nad P2O5. Wydajność: 13,25 g (>99%).
2.2.11. Chlorowodorek L-2-naftyloalanino-L-asparagino-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B11)
Porcję 8,85 g (10,1 mmola) benzyloksykarbonylo-L-2-naftyloalanino-L-asparagino-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B10) częściowo rozpuszczonego w 270 ml MeOH, zmieszano z Pd na węglu i uwodorniano w aparacie do automatycznego miareczkowania z użyciem metanolowego HCl. Zawiesinę rozcieńczono DMF. Po około 6 godzinach mieszaninę zatężono do połowy wyjściowej objętości. Substancja stała całkowicie rozpuściła się. Mieszaninę odstawiono na noc w temperaturze pokojowej. Katalizator następnie odsączono pod próżnią i przesącz rozcieńczono taką samą objętością MeOH, zmieszano z nową porcją katalizatora (Pd na węglu) i dalej uwodorniano w aparacie do automatycznego miareczkowania. Po 7 godzinach mieszaninę odstawiono na noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę następnie uwodorniano przez 4 godziny,
PL 202 887 B1 katalizator odsączono pod próżnią i przesącz zatężono. Pozostałość (bezpostaciową) wysuszono pod wysoką próżnią, a następnie roztarto z eterem dietylowym i odsączono pod próżnią.
Wydajność: 7,56 g (96,2%).
2.2.12. N-t-Butylosukcynylo-L-2-naftyloalanino-L-asparagino-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-propanolo)amid (B12)
Porcję 523 mg (3 mmole) chlorowodorku L-2-naftyloalanino-L-asparagino-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-t-butoksypropylo)amidu (B11), 2,33 g bursztynianu mono-t-butylu i 405 mg HOBt rozpuszczono w 20 ml DMF. W temperaturze 0°C dodano 0,39 ml N-etylomorfoliny i 660 mg DCC. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 godzinę i w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, po czym odstawiono na noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę zatężono pod wysoką próżnią i stałą pozostałość roztarto z roztworem NaHCO3 i przesączono pod próżnią. Produkt roztarto następnie z roztworem KHSO4 i przesączono pod próżnią, przemyto H2O i wysuszono w eksykatorze nad P2O5. Wydajność: 3,04 g (surowy produkt).
2.2.13. N-Sukcynylo-L-2-naftyloalanino-L-asparagino-L-seryno-L-walinoglicyno-(3-propanolo)amid (22)
Porcję 3 g (surowego produktu), N-t-butylosukcynylo-L-2-naftyloalanino-L-asparagino-L-(t-butoksykarbonylo)seryno-L-walinoglicyno-(3-propanolo)amidu (B12) rozpuszczono w 30 ml 90% kwasu trifluorooctowego i odstawiono w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Mieszaninę następnie zatężono i pozostałość roztarto z eterem dietylowym, po czym przesączono pod próżnią. Otrzymano 2,6 g surowego produktu. W celu oczyszczenia 250 mg surowego produktu rozpuszczono w ciepłym lodowatym kwasie octowym i poddano chromatografii na Sephadex LH20 z użyciem mieszaniny butanol/lodowaty kwas octowy/woda.
Wydajność: 103 mg m/z: 730,341246 (M+H)+ (widmo masowe wysokiej rozdzielczości).
Dane NMR dla związku 22
Patrz powyższy wzór 1H 13C
1 2 3
But-1 - 173,71
But-2 2,29 28,99
But-3 2,32/2,26 29,91
But-4 - 171,15
Nap-NH 8,19 -
Nap-α 4,60 53,92
Nap-C' - 171,20
Nap-β 3,19/2,91 37,56
Nap-1 - 135,62
Nap-2 7,42 127,85
Nap-3 7,80 127,30
PL 202 887 B1 ciąg dalszy
1 2 3
Nap-3a - 131,75
Nap-4 7,85 127,38
Nap-5 7,44 125,31
Nap-6 7,47 125,83
Nap-7 7,82 127,38
Nap-7a - 132,91
Nap-8 7,73 127,38
Asn-NH 8,35 -
Asn-α 4,60 49,73
Asn-C' - 170,92
Asn-β 2,60/2,49 37,03
Asn-Y-C' - 171,73
Asn^-NH2 7,44/6,99 -
Ser-NH 7,89 -
Ser-α 4,33 55,15
Ser-C' - 170,13
Ser-β 3,66/3,56 61,52
Ser-OH 4,93 -
Val-NH 7,82 -
Val-a 4,10 58,37
Val-C' - 171,02
Val-e 2,04 29,91
Val-Y 0,86 19,17
Val-Y' 0,86 18,11
Gly-NH 8,06 -
Gly-α 3,65 41,97
Gly-C' - 168,45
Xxx-NH 7,63 -
Xxx-2' 3,10 35,78
Xxx-3' 1,54 32,24
Xxx-4' 3,40 58,33
Xxx-4'-OH 4,40 -
3. Hamowanie oddziaływania laminina/nidogen i działanie biologiczne O ile nie podano inaczej, stosowane chemikalia nabyto z firmy Merck (Darmstadt), Sigma (Monachium) lub Riedel de Haen (Seelze).
Izolowanie lamininy P1 z ludzkiego łożyska, ludzkiego nidogenu z transfekowanych komórek HEK-293 i mysiej lamininy γ1 III 3-5 z komórek HEK-293 opisano w WO 98/31709.
P r z y k ł a d 3.1. Próby hamowania - hamowanie wiązania laminina/nidogen z użyciem opracowanych pochodnych peptydowych
3.1.1. Próba przesiewania HTS (bardzo wrażliwy wariant próby)
PL 202 887 B1
Szybka próba fluorescencyjna
Powlekanie probówek
Płytki do mikromianowania (np. FluoroNunc®) powleczono 75 μl 0,1 μg/ml roztworu lamininy P1 (w 0,159 g Na2CO3, 0,293 g NaHCO3, 0,02 g NaN3/litr, pH 9,2) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Roztwór następnie odpipetowano i wolne miejsca wiązania zablokowano przez inkubację z 0,5% BSA (w 7,9 g NaCl, 1,2 g Na2HPO4, 0,31 g KCl, 0,23 g NaH2PO4, 0,04% Tween 20/litr, pH 7,2) w temperaturze pokojowej przez 0,5 godziny. Po zakończeniu reakcji blokowania roztwór zdekantowano i przeprowadzono jednorazowe przemywanie 250 μl buforu do przemywania (PBS/0,04% Tween).
Hamowanie sekwencyjne
Równolegle z powłoką przeprowadzono wstępną inkubację 85-100 μl 0,25 nM roztworu nidogen (ludzkiego nidogenu otrzymanego rekombinacyjnie) z inhibitorem lub wzorcem, w odrębnym naczyniu reakcyjnym (1 godzina w temperaturze pokojowej, w 7,9 g NaCl, 1,2 g Na2HPO4, 0,31 g KCl, 0,23 g NaH2PO4, 0,04% Tween 20/litr, 0,5% BSA, pH 7,2).
Porcję 75 μl mieszaniny preinkubacyjnej (nidogen + inhibitor lub wzorzec) przeniesiono do powlekanych studzienek na płytce do mikromianowania i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie przeprowadzono dwukrotne przemywanie PBS/0,04% Tween. Związany nidogen wykrywano drogą inkubacji (w temperaturze pokojowej) przez 1 godzinę z 75 μl preparatu specyficznych przeciwciał, otrzymanego z żółtek jaja od kur immunizowanych ludzkim nidogenem. Frakcję IgY zastosowano w rozcieńczeniu 1:500 w PBS/0,04% Tween. Kompleks nidogenu i specyficznie związanego przeciwciała, po dwukrotnym przemyciu PBS/0,04% Tween, wykryto przez dodanie przeciw-kurczęcej IgY-biotyny (75 μl w rozcieńczeniu 1:2500; Promega, Madison, WI 53711, 608-274-4330). W tym celu po trwającej 1 godzinę inkubacji i dwukrotnym przemyciu PBS/0,04% Tween przeprowadzono inkubację ze streptawidyną-europem (Wallac; 1 godzina w temperaturze pokojowej) i dwukrotne przemywanie PBS/0,04% Tween. Na koniec, po dodaniu 100 μl roztworu wzmacniającego (Wallac) i wytrząsaniu przez 5 minut, zmierzono sygnał fluorescencji w wieloznacznikowym liczniku Victor, z zastosowaniem procedury dla europu. Ustalono zależność między ilością związanego nidogenu w roztworach z inhibitorem i ilością nidogenu bez inhibitora.
3.1.2. Trzydniowa próba równowagi
W tym wariancie próby zbadano hamujące działanie wybranych inhibitorów. Próbę tę opisano w patencie US 5493008.
W poniższej tabeli porównano wartości IC50 dla wybranych substancji z wynikami próby przesiewowej HTS. Wyraźnie widać, że w próbie trzydniowej uzyskuje się nieznacznie niższe zmierzone wartości, oraz, zgodnie z oczekiwaniem, że jest ona czulsza niż próba przesiewowa. Jednakże z tego porównania również wynika, że struktury hamujące można w sposób wiarygodny identyfikować w opracowanym teście przesiewowym.
T a b e l a 2. Charakterystyka określonych inhibitorów połączenia laminina/nidogen: wartości IC50 (ąM) w różnych wariantach próby
Struktura Próba HTS Trzydniowa próba równowagi
NIDPNAV 3,9 1,2
DPNAV 7,7 5,0
Związek 22 0,36 0,09
P r z y k ł a d 3.2 (hipotetyczny)
Badanie działania biologicznego pochodnych peptydowych.
Do badania działania biologicznego pochodnych peptydowych można stosować szereg modeli szczegółowo opisanych w literaturze.
Pewne reprezentatywne modele wymieniono poniżej:
Tworzenie się kanalików w hodowlach embrionalnych nerek.
Grobstein C.; (1956) Exp. Cell Res. 10: 424-440.
Ekblom P. i inni; (1994) Development 120: 2003-2014 Morfologia rozgałęziania w embrionalnych płucach.
Ekblom P. i inni (1994) Development 120: 2003-2014 Morfologia rozgałęziania w embrionalnych gruczołach ślinowych.
Grobstein C. (1953) J. Exp. Zool, 124: 383-413
Kadoya Y. I inni. (1997) Development 124: 683-691
PL 202 887 B1
Składanie błony podstawnej w organotypowej hodowli skóry.
Smola H.; Stark H.-J.; Thiekotter G.; Mirancea N.; Krieg T.; Fusenig N.E. (1998) Exp. Cell Res.
239: 399-410
Odtwarzanie hydry z rozbitych komórek.
Yang Y. G.; Mayura K.; Spainhour C. B.; Edwards Jr. J. F.; Phillips T. D. (1993) Toxicology 85: 179-198
Pogrubianie błon podstawnych u hydry po hodowli przy podwyższonym stężeniu glukozy. Zhang X.; Huff J. K.; Hudson B. G.; Sarras Jr. M. P. (1990) Diabetologia 33: 704-707
Wszystkie typy prób ilościowej oceny angiogenezy zestawiono w artykule przeglądowym Jain R.K. i inni, w Nature Medicine (1997) tom 3, nr 11, np.:
Wywoływanie naczyniaków krwionośnych u myszy przez wszczepianie komórek spontanicznych naczyniaków krwionośnych z komórek śródbłonkowych.
O'Reilly M. S.; Brem M. S.; Folkman J. (1995) J. Pediatr. Surg. 30:2; 325-329 Wzrost mikronaczyń w wolnej od surowicy hodowli aorty szczura.
Nicosia R. F.; Ottinetti A. (1990) Lab. Invest, 63, nr. 1, 115-122
Tworzenie się kapilar komórek śródbłonkowych na mikronośnikach po osadzeniu w żelu fibrynowym.
Nehls V.; Drenckhahn D. (1995) Microvascular Research 50: 311-322.

Claims (80)

R1 oznacza grupę o jednym z następujących wzorów PL 202 887 B1 w których R3 oznacza -A, -NH2, -NHR, -NR2, A2, -NHR1, a R4 oznacza (CH2^COOA, (CH2ICONH2, -(CH2INH2 lub -(CH2I-SO3H w których Y oznacza O, S, -N(A)-CO- lub -(CH2)r, D oznacza (CH2)r, O, S, NH, NR, (CH2)r-O, (CH2)rS, (CH2)rNH lub (CH2)rNR, a R2 oznacza -A, -E-OH, -E-COOH lub -E-CONH2, gdzie E oznacza liniowy lub rozgałęziony łańcuch C1-C10-alkilowy, który jest niepodstawiony lub podstawiony grupą -A, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-C(O)NA2 lub C5-C10-cykloalkilem, albo E oznacza C5-C10-cykloalkil, który jest niepodstawiony lub podstawiony grupą -A, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-C(O)NA2 lub C5-C10-cykloalkilem, PL 202 887 B1 R5 oznacza liniowy lub rozgałęziony C1-C10-alkil, który jest niepodstawiony lub podstawiony grupą -A, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-C(O)NA2 lub C5-C10-cykloalkilem, albo R5 oznacza C5-C10-cykloalkil, który jest niepodstawiony lub podstawiony grupą -A, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-C(O)NA2 lub C5-C10-cykloalkilem, a R oznacza C5-C10-cykloalkil, Het lub Ar, które są ewentualnie podstawione grupą C1-C6-alkilo-Het, C1-C6-alkilo-Ar, -O-C1-C6-alkilo-Het, -O-C1-C6-alkilo-Ar, Het lub Ar, gdzie Het oznacza monocykliczny lub bicykliczny 5- do 10-członowy pierścień aromatyczny lub niearomatyczny, zawierający jako człony pierścienia 1 lub 2 takie same lub różne heteroatomy, wybrane z grupy obejmującej atom azotu, tlenu i siarki, który jest niepodstawiony lub podstawiony jedną lub większą liczbą grup hydroksylowych lub karboksylowych, Ar oznacza monocykliczny lub bicykliczny 5- do 10-członowy pierścień aromatyczny, który jest niepodstawiony lub podstawiony jedną lub większą liczbą grup hydroksylowych lub karboksylowych, a Z oznacza (CH2)m, O, S, NH, NR, N-C(O)-R lub NSO2R, A oznacza H lub C1-C4-alkil,
1, w którym R5 oznacza -CH(CH3)CH2-CH3. 1, w którym R5 oznacza -CH2-CH(CH3)2.
według jednego z zastrz. 59 - 63, w którym q oznacza 2.
PL 202 887 B1
1, w którym R5 oznacza -C(CH3))3.
1, w którym R5 oznacza -CH(CH3)2.
1 - 52, w którym R2 oznacza -E-OH.
1 - 52, w którym R2 oznacza -E-COOH. 55, w którym R2 oznacza -CH2-COOH.
1 - 16, w którym X oznacza grupę o następują-
1. m i r oznaczają liczby całkowite 0-3, n i k oznaczają liczbę całkowitą 1 lub 2, p oznacza liczbę całkowitą 0 lub 1, a q oznacza liczbę całkowitą 1-3, w postaci wszystkich dowolnych stereoizomerów i ich mieszanin w dowolnych stosunkach, a także ich fizjologicznie tolerowanych soli.
2. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 1, w którym n oznacza 1.
3. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 1 albo 2, w którym R w grupie X oznacza Het.
4. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 3, w którym Het oznacza grupę o wzorze .Ν
5. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 3, w którym Het oznacza grupę o wzorze
6. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 3, w którym Het oznacza grupę o wzorze
7. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 3, w którym Het oznacza grupę o wzorze
8. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 3, w którym Het oznacza grupę o wzorze
PL 202 887 B1
9. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 1 albo 2, w którym R w grupie X oznacza Ar, który jest ewentualnie podstawiony -C1-C6-alkilo-Ar, -O-C1-C6-alkilo-Ar lub Ar.
10. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 9, w którym R w grupie X oznacza Ar.
11. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 10, w którym Ar oznacza grupę o wzorze
12. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 10, w którym Ar oznacza grupę o wzorze
13. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 10, w którym Ar oznacza grupę o wzorze
14. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 10, w którym Ar oznacza grupę o wzorze
15. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 9, w którym R w grupie X oznacza grupę o wzorze
16. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 9, w którym R w grupie X oznacza grupę o wzorze
17 - 20, w którym k oznacza 1.
17 - 20, w którym k oznacza 2.
17, w którym Y oznacza -(CH2)r-.
17. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 1- 16, w którym X oznacza grupę o następującym wzorze
PL 202 887 B1
18, w którym r oznacza 0.
18, w którym r oznacza 1.
18. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz.
19. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz.
20. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz.
21. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz.
22. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz.
23. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz cym wzorze
24. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 23, w którym D oznacza -(CH2)r-.
25. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 23, w którym r oznacza 0.
26. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 23, w którym r oznacza 1.
27. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 1 - 26, w którym R1 oznacza grupę o następującym wzorze
28. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 27, w którym Z oznacza (CH2)m.
29. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 28, w którym m oznacza 0.
30. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 28, w którym m oznacza 1.
31. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 27 - 30, w którym R4 oznacza -(CH2)l-COOA.
32. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 31, w którym A oznacza H.
33. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 27 - 30, w którym R4 oznacza -(CH2)l-COONH2.
34. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 30 - 33, w którym l oznacza 0.
35. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 27 - 34, w którym R3 oznacza -NH2.
36. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 27 - 34, w którym R3 oznacza -A.
37. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 36, w którym A oznacza H.
38. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 27 - 34, w którym R3 oznacza -NHR1.
39. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 38, w którym -NHR1 oznacza grupę o wzorze
40. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 39, w którym R4 oznacza NH '^n'^x'nh2
H
PL 202 887 B1
41. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 39, w którym R4 oznacza
42. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 39, w którym R4 oznacza -NH2.
43. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 1 - 26, w którym R1 oznacza grupę o następującym wzorze
44. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 43, w którym Z oznacza -(CH2)m-.
45. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 44, w którym m oznacza 1.
46. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 43 - 45, w którym R3 oznacza -NH2.
47. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 43 - 46, w którym R4 oznacza -(CH2)l-COOA.
48. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 47, w którym l oznacza 0.
49. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 47 albo 48, w którym A oznacza H.
50, w którym R4 oznacza -(CH2)l-COOA.
50. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 1 - 26, w którym R1 oznacza grupę o następującym wzorze
51, w którym l oznacza 0, a A oznacza H. 1 - 52, w którym R2 oznacza A.
51. Związek o ogólnym wzorze
52. Związek o ogólnym wzorze
53, w którym R2 oznacza -CH3.
53. Związek o ogólnym wzorze
54. Związek o ogólnym wzorze
55. Związek o ogólnym wzorze
56. Związek o ogólnym wzorze
57, w którym R2 oznacza -CH2-OH.
57. Związek o ogólnym wzorze
58. Związek o ogólnym wzorze według zastrz według zastrz według zastrz według zastrz według zastrz według zastrz według zastrz według zastrz
59. Związek o ogólnym wzorze I według zastrz. 1, w którym R5 oznacza rozgałęziony C1-C10-alkil.
60.
61.
62.
63.
64.
65. Środek farmaceutyczny zawierający substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden związek zdefiniowany w zastrz. 1-64 i/lub jego fizjologicznie tolerowaną sól.
66. Pochodne peptydowe zdefiniowane w zastrz. 1 - 64 i/lub ich fizjologicznie tolerowane sole do stosowania jako lek.
67. Zastosowanie pochodnych peptydowych zdefiniowanych w zastrz. 1 - 64 i/lub ich fizjologicznie tolerowanych soli do wytwarzania leku do leczenia choroby związanej ze zwiększoną lub niepożądaną syntezą błon podstawnych.
68. Zastosowanie według zastrz. 67, w którym chorobę stanowią późne powikłania cukrzycowe.
Związek o ogólnym wzorze Związek o ogólnym wzorze Związek o ogólnym wzorze Związek o ogólnym wzorze Związek o ogólnym wzorze według zastrz. według zastrz. według zastrz. według zastrz.
69. Zastosowanie według zastrz. 67, w którym chorobę stanowi zwłóknienie, któremu towarzyszy zwiększona synteza błon podstawnych lub ich składników.
70. Zastosowanie według zastrz. 69, w którym chorobę stanowi zwłóknienie wątroby.
71. Zastosowanie według zastrz. 67, w którym chorobę stanowi miażdżyca tętnic.
72. Zastosowanie według zastrz. 67, w którym chorobę stanowi rak.
73. Zastosowanie według zastrz. 67, w którym chorobę stanowi retynopatia cukrzycowa.
74. Zastosowanie według zastrz. 67, w którym chorobę stanowi pozasoczewkowy rozrost włóknisty.
75. Zastosowanie według zastrz. 67, w którym choroba jest związana z silną składową zapalną.
76. Zastosowanie według zastrz. 75, w którym chorobę stanowi reumatoidalne zapalenie stawów.
77. Zastosowanie według zastrz. 75, w którym chorobę stanowi zapalenie stawów i kości.
78. Zastosowanie według zastrz. 75, w którym chorobę stanowi zapalenie naczyń.
79. Zastosowanie według zastrz. 67, w którym choroba jest związana z naczyniakami krwionośnymi.
80. Zastosowanie według zastrz. 67, w którym chorobę stanowi łuszczyca.
PL351483A 1999-03-01 2000-02-19 Pochodne peptydowe, środek farmaceutyczny i zastosowanie pochodnych peptydowych PL202887B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99103869A EP1070727A1 (en) 1999-03-01 1999-03-01 Low molecular weight peptide derivatives as inhibitors of the laminin/nidogen interaction
PCT/EP2000/001386 WO2000052051A1 (en) 1999-03-01 2000-02-19 Low molecular weight peptide derivatives as inhibitors of the laminin/nidogen interaction

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL351483A1 PL351483A1 (en) 2003-04-22
PL202887B1 true PL202887B1 (pl) 2009-08-31

Family

ID=8237658

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL385359A PL208356B1 (pl) 1999-03-01 2000-02-19 Pochodne peptydowe, środek farmaceutyczny, zastosowanie pochodnych peptydowych do wytwarzania leków i sposób identyfikacji związku, który hamuje oddziaływanie pomiędzy lamininą i nidogenem
PL351483A PL202887B1 (pl) 1999-03-01 2000-02-19 Pochodne peptydowe, środek farmaceutyczny i zastosowanie pochodnych peptydowych

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL385359A PL208356B1 (pl) 1999-03-01 2000-02-19 Pochodne peptydowe, środek farmaceutyczny, zastosowanie pochodnych peptydowych do wytwarzania leków i sposób identyfikacji związku, który hamuje oddziaływanie pomiędzy lamininą i nidogenem

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6365572B1 (pl)
EP (4) EP1070727A1 (pl)
JP (1) JP4542272B2 (pl)
CN (2) CN100441594C (pl)
AT (2) ATE370969T1 (pl)
AU (1) AU779779B2 (pl)
BR (1) BR0008647A (pl)
CA (1) CA2363958C (pl)
CY (1) CY1106967T1 (pl)
CZ (1) CZ300736B6 (pl)
DE (2) DE60044832D1 (pl)
DK (1) DK1157040T3 (pl)
ES (1) ES2288844T3 (pl)
HU (1) HU228993B1 (pl)
ID (1) ID30183A (pl)
PL (2) PL208356B1 (pl)
PT (1) PT1157040E (pl)
RU (2) RU2380371C2 (pl)
TR (2) TR200800782T2 (pl)
WO (1) WO2000052051A1 (pl)
ZA (1) ZA200106972B (pl)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1070727A1 (en) * 1999-03-01 2001-01-24 Aventis Pharma Deutschland GmbH Low molecular weight peptide derivatives as inhibitors of the laminin/nidogen interaction
US20080241835A1 (en) * 1999-11-01 2008-10-02 Genentech, Inc. Differentially expressed genes involved in angiogenesis, the polypeptides encoded thereby, and methods of using the same
WO2001032926A2 (en) * 1999-11-01 2001-05-10 Curagen Corporation Differentially expressed genes involved in angiogenesis, the polypeptides encoded thereby, and methods of using the same
US7407660B2 (en) 2003-04-16 2008-08-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for selective modulation of vascularization
FR2947452B1 (fr) * 2009-07-01 2012-04-20 Fabre Pierre Dermo Cosmetique L-serine et/ou l-asparagine et/ou l-valine pour prevenir et/ou au traiter des reactions inflammatoires de la peau.
RU2622018C1 (ru) * 2016-06-16 2017-06-08 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Быстро растворяющаяся трансбуккальная плёнка для лечения депрессивных расстройств, тревоги и расстройств адаптации
CA3045887A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Celtaxsys, Inc. Pendant amines and derivatives as inhibitors of leukotriene a4 hydrolase

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8821785D0 (en) * 1988-09-16 1988-10-19 Nycomed As Peptide compounds
RU2145233C1 (ru) * 1990-07-02 2000-02-10 Дзе Аризона Борд оф Риджентс Неупорядоченная библиотека пептидов, способ ее получения и способ идентификации пептида, синтезированного твердофазным синтезом
US5493008A (en) * 1994-08-15 1996-02-20 The University Of Virginia Patent Foundation Two non-contiguous regions contribute to nidogen binding to a single EGF-like motif of the laminin γ1 chain
DE19622489A1 (de) * 1996-06-05 1997-12-11 Hoechst Ag Salze des 3-(2-(4-(4-(Amino-imino-methyl)-phenyl)-4- methyl-2,5-dioxo-imidazolidin-1-yl)-acetylamino)-3- phenyl-propionsäure-ethylesters
DE19701607A1 (de) 1997-01-17 1998-07-23 Hoechst Ag Anitkörper, die an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, deren Herstellung und Verwendung
EP1070727A1 (en) * 1999-03-01 2001-01-24 Aventis Pharma Deutschland GmbH Low molecular weight peptide derivatives as inhibitors of the laminin/nidogen interaction

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200106972B (en) 2002-08-07
JP4542272B2 (ja) 2010-09-08
EP1070727A1 (en) 2001-01-24
HUP0200192A2 (en) 2002-06-29
WO2000052051A1 (en) 2000-09-08
EP1845106A1 (en) 2007-10-17
DK1157040T3 (da) 2007-12-03
CY1106967T1 (el) 2012-01-25
CA2363958C (en) 2012-04-17
PL208356B1 (pl) 2011-04-29
ATE477271T1 (de) 2010-08-15
RU2262509C2 (ru) 2005-10-20
HUP0200192A3 (en) 2002-09-30
AU779779B2 (en) 2005-02-10
RU2380371C2 (ru) 2010-01-27
DE60044832D1 (de) 2010-09-23
HU228993B1 (en) 2013-07-29
EP1157040B1 (en) 2007-08-22
US6365572B1 (en) 2002-04-02
RU2005114905A (ru) 2006-11-20
EP2239270A3 (en) 2011-01-12
CN1342167A (zh) 2002-03-27
CN1775801A (zh) 2006-05-24
HK1087126A1 (zh) 2006-10-06
TR200102560T2 (tr) 2002-01-21
PT1157040E (pt) 2007-09-25
PL351483A1 (en) 2003-04-22
DE60036087D1 (de) 2007-10-04
ID30183A (id) 2001-11-08
HK1042499A1 (en) 2002-08-16
AU3157700A (en) 2000-09-21
CZ20013063A3 (cs) 2001-11-14
JP2002539092A (ja) 2002-11-19
CN100441594C (zh) 2008-12-10
EP1845106B1 (en) 2010-08-11
ATE370969T1 (de) 2007-09-15
BR0008647A (pt) 2002-01-22
EP2239270A2 (en) 2010-10-13
TR200800782T2 (tr) 2008-08-21
DE60036087T2 (de) 2008-05-15
EP1157040A1 (en) 2001-11-28
ES2288844T3 (es) 2008-02-01
CA2363958A1 (en) 2000-09-08
CZ300736B6 (cs) 2009-07-29
CN1237075C (zh) 2006-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6034056A (en) Fibronectin adhesion inhibitors
EP0502926B1 (en) Anti-thrombotic peptides and pseudopeptides
RU2195462C2 (ru) Производные доластатина 15
JPH05508860A (ja) 細胞接着制御環状化合物
HRP960257A2 (en) New compounds, their preparation and use
KR20000022075A (ko) 세포 접착 억제 화합물
JP2002524571A (ja) ＶＩＩａ因子阻害剤
EP1077218B1 (en) Peptido-mimetic compounds containing RGD sequence useful as integrin inhibitors
PL202887B1 (pl) Pochodne peptydowe, środek farmaceutyczny i zastosowanie pochodnych peptydowych
JPH0331298A (ja) プロリルエンドペプチターゼ阻害ペプチド
JP2918746B2 (ja) ペプチド誘導体およびその用途
JP2003089700A (ja) ペプチド
JPH06306096A (ja) ペプチド誘導体及びその用途
HK1087126B (en) Low molecular weight peptide derivatives as inhibitors of the laminin/nidogen interaction
MXPA01008337A (en) Low molecular weight peptide derivatives as inhibitors of the laminin/nidogen interaction
Zanella SYNTHESIS OF PEPTIDOMIMETIC LIGANDS TARGETING CELL-SURFACE RECEPTORS INVOLVED IN TUMOR ANGIOGENESIS

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification