PL200426B1

PL200426B1 - Związek przeciwbakteryjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie związku, sposób wytwarzania związku, Streptomyces griseus oraz zastosowanie szczepu Streptomyces

Info

Publication number: PL200426B1
Application number: PL345403A
Authority: PL
Inventors: Masatoshi Inukai; Masakatsu Kaneko; Toshio Takatsu; Hitoshi Hotoda; Masatoshi Arai; Shunichi Miyakoshi; Masaaki Kizuka; Yasumasa Ogawa
Original assignee: Sequella
Priority date: 1998-07-09
Filing date: 1999-07-09
Publication date: 2009-01-30
Also published as: ID27955A; CA2337225C; ES2284260T3; RU2209210C2; DE69935513T2; HK1053063A1; EP1095947B1; US20030069204A1; DE69935513D1; KR100729196B1; PL345403A1; CA2337225A1; BR9911965A; IL140731A; PT1095947E; US6844173B2; NO20010105D0; HUP0103711A2; KR20060011919A; IL140731A0

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest zwi azek o wzorze (Ia), lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w którym R 1 oznacza atom wodoru lub grup e metylow a, R 2 a oznacza atom wodoru lub grup e metylow a, R 3 oznacza atom wodoru, grup e C 7 -C 16 alkiloilow a, grup e oleilow a, linolilow a, linolinoilow a, 3,3-difenylopropionylow a, 3-(3,4,5-trimetoksyfenylo)propiony- low a, 2-(4-nitrofenylo)propionylow a, oktyloksykarbonylow a, nonyloksykarbonylow a, 2-metylododeka- noilow a, 2,2-dimetylododekanoilow a lub grup e C 6 -C 10 alkilow a, R 4 a oznacza atom wodoru, grup e hy- droksylow a lub grup e C 7 -C 10 alkiloiloksylow a, R 5 oznacza atom wodoru lub grup e C 7 -C 16 alkiloilow a, za s X oznacza grup e metylenow a lub atom siarki, przy czym grupa karbamoilowa we wzorze (Ia) jest ewentualnie podstawiona przez C 1 -C 12 alkil, pod warunkiem, ze je sli X oznacza grup e metylenow a, R 1 oznacza atom wodoru, R 2 a oznacza grup e metylow a i R 3 oznacza atom wodoru, to R 4 a jest inne ni z grupa hydroksylowa, gdy R 5 oznacza atom wodoru. Przedmiotem wynalazku jest te z kompozycja far- maceutyczna, zawieraj aca skuteczn a ilosc ww. zwi azków, zastosowanie ww. zwi azków do wytwarza- nia leku do leczenia lub zapobiegania infekcji bakteryjnej, zwi azki po srednie, Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420), sposób wytwarzania zwi azków po srednich obejmuj acy hodowl e szczepu mikroorganizmu rodzaju Streptomyces, oraz zastosowanie szczepu Streptomyces do wytwa- rzania zwi azków po srednich. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest związek przeciwbakteryjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie związku, sposób wytwarzania związku, Streptomyces griseus oraz zastosowanie szczepu Streptomyces. W szczególności, przedmiotem wynalazku są nowe związki o wzorach wzorze (l), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) lub (XVI), które mają doskonałą aktywność antybiotyczną lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Antybiotyk β-laktamowy, aminoglikozyd, izoniazyd lub ryfampicyna są zwykle stosowane w leczeniu lub profilaktyce infekcji bakteryjnych, łącznie z tuberculle bacillus. Ostatnio pojawia się wiele bakterii opornych na te antybiotyki. Pożądane jest opracowanie nowych związków, które byłyby środkami przeciwbakteryjnymi innego rodzaju, niż te tradycyjne.

Z drugiej strony wiadomo, że kapuramycyna o wzorze przedstawionym poniżej, wykazuje czynność przeciw tuberculle bacillus (J. Antibiotics, 29 (8), 1047-1053 (1986)).

Związki posiadające strukturę podobną do struktury kapuramycyny, takie jak związek znany z JP-5-148293, jak też związek znany z publikacji Spencer Knapp i wsp. „Synthesis of Capuramycin” (J. Org. Chem., 1994, 59, 281-283), nie posiadają zadowalających właściwości.

Według wynalazku, związek przeciwbakteryjny stanowi związek o wzorze (l) lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól

w którym

R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza grupę metylową, R⁴ oznacza grupę hydroksylową i X oznacza grupę metylenową;

R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza atom wodoru, R⁴ oznacza grupę hydroksylową i X oznacza grupę metylenową;

R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza grupę metylową, R⁴oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R¹ oznacza atom wodoru, r2 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę hydroksylową i X oznacza grupę metylenową; lub

R oznacza grupę metylową, R oznacza grupę metylową, R oznacza grupę hydroksylową i X oznacza atom siarki.

Korzystnie, R¹ oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, r4 oznacza grupę hydroksylową, zaś X oznacza grupę metylenową lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

PL 200 426 B1

Ponadto, według wynalazku związek przeciwbakteryjny stanowi związek o wzorze (la) lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól

w którym

R¹ oznacza atom wo^doru ^lu^{b g}ru^pę metytową

RTj oznacza atom wo^doru ^lu^{b g}ru^pę metylową ^r3 oznacza atom wotorą ^gru^pę C7-C16 aMoHową ^gru^pę oteHową HnoHtową HnoHnoHową, 3^,3-difenylopropionylową, 3-(3,4,5-trimetoksyfenylo)propionylową, 2-(4-nitrofenylo)propionylową, oktyloksykarbonylowa, nonyloksykarbonylową, 2-metylododekanoilową, 2,2-dimetylododekanoilową lub grupę C6-C10 alkilową, ^r4j oznacza atom wotorą ^gru^pę h^ydro^ks^ytow^{ą l}u^{b g}ru^pę Cy-C-io aMoHoksytową zaś ^r5 oznacza atom wo^doru ^lu^{b g}ru^pę ct-cks aMtoHową, za^śX oznacza grupę metylenową lub atom siarki, przy czym grupa karbamoilowa we wzorze (la) jest ewentualnie podstawiona przez C1-C12 alkil, pod warunkiem, że je^{śli χ} oznacza atom stor^ ^r1 oznacza ^gru^pę metytową ^r2ć, oznacza ^gru^pę metytow^{ą i r4}j oznacza grupę hydroksylową lub grupę Cy-C-o alkiloiloksylową lub je^{śli χ} oznacza ^gru^pę metytonową ^r1 oznacza ^gru^pę metytową ^r2; oznacza atom wotorą ^r4j oznacza grupę hydroksylową lub grupę Cy-C-o alkiloiloksylową lub je^{śli χ} oznacza ^gru^pę metytonową ^r1 oznacza atom wotorą ^r2; oznacza ^gru^pę metytową ^{i r4}j oznacza grupę hydroksylową lub grupę Cy-C-o alkiloiloksylową oraz pod warunkiem, że je^{śli χ} oznacza ^gru^pę metytonową ^r1 oznacza atom wotorą ^r2; oznacza ^gru^pę metytową ^{i r3}oznacza atom wodoru, to ^r4j jes^{t i}nne n^{iż g}ru^pa ^hydro^ks^y|owa^{, gdy r5} oznacza atom wo^doru.

Związek przeciwbakteryjny stanowi związek o wzorze (Ib) lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól

wybrany z grupy obejmującej związek, w którym ^r1 oznacza ^gru^pę metytową ^r2 oznacza ^gru^pę metytową ^R3a oznacza atom wotorą ^r4j oznacza ^gru^{pę hyd}ro^ks^ytową ^R5_; oznacza atom wo^doru ^{i χ} oznacza ^gru^pę metytonową ^r1 oznacza ^gru^pę metytową ^r2 oznacza atom wotorą ^r3; oznacza atom wotorą ^r4j oznacza ^gru^{pę hyd}ro^ks^ytową ^R5_; oznacza atom wo^doru ^{i χ} oznacza ^gru^pę metytonową ^r1 oznacza ^gru^pę metytową ^r2 oznacza ^gru^pę metytową ^r3; oznacza atom wotorą ^r4j oznacza atom wotorą ^R5_; oznacza atom wo^doru ^{i χ} oznacza ^gru^pę metytonową

PL 200 426 B1

R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza grupę metylową, R³a oznacza grupę dekanoilową, R⁴a oznacza ^gru^pę h^ydro^ks^ylow^ą, ^R5a oznacza atom wo^doru ⁱ X oznacza ^gru^pę metytenową

R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza grupę metylową, R³a oznacza grupę lauroilową, R⁴a oznacza grupę hydroksylową, R5a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R³a oznacza grupę mirystoilową, R⁴, oznacza grupę hydroksylową, R'a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

Ri oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, r3, oznacza grupę pentadekanoilow^{ą r4}j oznacza ^gru^pę ^roteyową ^R5a oznacza atom wo^doru ^{i χ} oznacza ^gru^pę me^tylenow^ą;

Ri oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, r3, oznacza grupę palmitoilową, R⁴a oznacza grupę hydroksylową, R''. oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

Ri oznacza atom wodoru, r2 oznacza atom wodoru, r3, oznacza atom wodoru, r4, oznacza grupę hydroksylową, R'a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

Ri oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, r3, oznacza grupę dekanoilową, r4, oznacza ^gru^pę ty^oteyową ^R5a oznacza atom wo^doru ^{i X} oznacza ^gru^pę metytenow^ą;

Ri oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, r3, oznacza grupę lauroilową, r4, oznacza grupę hydroksylową, R''. oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

Ri oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, r3, oznacza grupę mirystoilową, r4, oznacza grupę hydroksylową, R'a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

Ri oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, r3, oznacza grupę pentadekanoilową, ^r4j oznacza ^gru^pę ^roteyową ^R5a oznacza atom wo^doru ^{i X} oznacza ^gru^pę metytenow^ą;

Ri oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, r3, oznacza grupę palmitoilową, r4, oznacza grupę hydroksylową, R''. oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

Ri oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, r3, oznacza atom wodoru, r4, oznacza grupę hydroksylową, R'a oznacza grupę palmitoilową i X oznacza grupę metylenową;

^r1 oznacza ^gru^pę metytową ^r2 oznacza ^gru^pę metytową R³a oznacza ^gru^pę o^ktylo^ks^ykarbon^ytową ^r4j oznacza ^gru^pę ^roteyową ^R5a oznacza atom wo^doru ^{i X} oznacza ^gru^pę metytenow^ą;

Ri oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, r3, oznacza grupę nonyloksykarbonylową, r4, oznacza grupę hydroksylową, R''. oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową; oraz

R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza grupę metylową, R³a oznacza grupę decylową, R⁴a oznacza grupę hydroksylową, R'a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową.

Związek przeciwbakteryjny stanowi związek o wzorze (Ik) lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól

wybrany z grupy obejmującej związek, w którym

Ri oznacza grupę metylową, Ri oznacza grupę metylową, r3 oznacza atom wodoru i r5 oznacza atom wodoru; oraz

Ri oznacza grupę metylową, oznacza grupę dodecylową, r3 oznacza atom wodoru i r5 oznacza atom wodoru;

Według wynalazku, kompozycja farmaceutyczna, zawierająca skuteczną ilość związku farmakologicznie aktywnego łącznie z nośnikiem lub rozcieńczalnikiem, charakteryzuje się tym, że jako związek farmakologicznie aktywny zawiera związek określony powyżej lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

Według wynalazku, związek określony powyżej lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól stosuje się do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji bakteryjnej.

PL 200 426 B1

Według wynalazku, związek określony powyżej lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól ma zastosowanie jako lek.

Według wynalazku, środek zawierający związek określony powyżej lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól ma zastosowanie w leczeniu lub zapobieganiu infekcji bakteryjnej.

Według wynalazku, szczep Streptomyces jest szczepem Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420).

Ponadto, związkiem według wynalazku jest związek A-500359E o wzorze (XI) lub jego sól.

Związkiem według wynalazku jest związek A-500359F o wzorze (XII) lub jego sól.

Związkiem według wynalazku jest pochodna amidowa związku A-500359F o wzorze (XIII) lub jej sól.

PL 200 426 B1

Związkiem według wynalazku jest związek A-500359H o wzorze (XIV) lub jego sól.

Związkiem według wynalazku jest związek A-500359J o wzorze (XV) lub jego sól.

Związkiem według wynalazku jest związek o wzorze A-500359M-3 o wzorze (XVI) lub jego sól.

PL 200 426 B1

Według wynalazku, sposób wytwarzania związku określonego powyżej, o wzorach XI, XII lub XIV, charakteryzuje się tym, że prowadzi się procedurę hodowlaną, która obejmuje i) hodowlę szczepu mikroorganizmu rodzaju Streptomyces oraz ii) izolowanie związku z produktów hodowli.

Korzystnie, mikroorganizmem jest Streptomyces griseus (SANK 60196; FERMBP-5420).

Według wynalazku, sposób wytwarzania związku powyżej określonego o wzorze XV, charakteryzuje się tym, że prowadzi się procedurę hodowlaną, która obejmuje i) hodowlę szczepu mikroorganizmu rodzaju Streptomyces oraz ii) izolowanie związku z produktów hodowli.

Według wynalazku, szczep Streptomyces stosuje się do wytwarzania związku określonego powyżej o wzorach XI, XII lub XIV.

Według wynalazku, szczep Streptomyces stosuje się do wytwarzania związku określonego o wzorze XV.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że nowe pochodne kapuramycyny, tj. związki o wzorze (l), (XI), (XII), (XIV), (XV) lub (XVI), nie wykazują żadnej krzyżowej oporności względem konwencjonalnych lekarstw, w produktach pochodzących z hodowli mikroorganizmu.

Stwierdzono też (badając aktywność fizjologiczną ww związków), że pochodne te wykazują doskonałe działanie antybiotyczne.

Związki według niniejszego wynalazku nadają się do skutecznego leczenia i zapobiegania chorobom infekcyjnym łącznie z tymi wywoływanymi przez bakterie oporne na konwencjonalne antybiotyki. Związki o wzorze (l), (XI), (XII), (XIV), (XV) lub (XVI) są również użytecznymi materiałami wyjściowymi do otrzymywania związków według niniejszego wynalazku, mających doskonałe działanie antybiotyczne.

Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek ujawniony powyżej jako składnik aktywny nadaje się do skutecznego leczenia lub zapobiegania chorobom infekcyjnym.

W szczególności, dzięki wynalazkowi jest możliwe skuteczne leczenie lub zapobieganie chorobom infekcyjnym u zwierząt ciepłokrwistych, które obejmuje podawanie im farmakologicznie skutecznej ilości związku ujawnionego powyżej.

Związki o wzorze (l) są wytwarzane przez mikroorganizm zdolny do ich wytwarzania.

W powyższych wzorach, jeśli występuje zabezpieczona grupa hydroksylowa, np. R²a i tym podobne, grupa zabezpieczająca może być usunięta sposobem chemicznym, takim jak wodoroliza, hydroliza, elektroliza lub fotoliza lub może być usunięta sposobem biologicznym, takim jak hydroliza in vivo (pod warunkiem, że nie jest resztą grupy estrowej, takiej jak grup acylowa).

Grupa zabezpieczająca, która może być usunięta sposobem biologicznym, takim jak hydroliza in vivo może być rozszczepiona sposobem biologicznym, takim jak w organizmie ludzkim, dostarczając odpowiedni wolny kwas lub jego sól. To, czy związek ma grupę zabezpieczającą usuwalną in vivo jest określane poprzez wykrywanie odpowiedniego związku macierzystego lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli w płynach z organizmu szczura lub myszy, po podaniu związku poprzez iniekcję dożylną.

Reszta alkilowa pochodnych N-alkilokarbamilowych jest wybrana z grupy zawierającej grupę C1-C12 alkilową o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, taką jak grupy: metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, izopentyl, 2-metylobutyl, neopentyl, 1-etylopropyl, heksyl, izoheksyl, 4-metylopentyl, 3-metylopentyl, 2-metylopentyl, 1-metylopentyl, 3,3-dimetylobutyl, 2,2-dimetylobutyl, 1,1-dimetylobutyl, 1,2-dimetylobutyl, 1,3-dimetylobutyl, 2,3-dimetylobutyl, 2-etylobutyl, heptyl, 1-metyloheksyl, 2-metyloheksyl, 3-metyloheksyl, 4-metyloheksyl, 5-metyloheksyl, 1-propylobutyl, 4,4-dimetylopentyl, oktyl, 1-metyloheptyl, 2-metyloheptyl, 3-metyloheptyl, 4-metyloheptyl, 5-metyloheptyl, 6-metyloheptyl, 1-propylopentyl, 2-etyloheksyl, 5,5-dimetyloheksyl, nonyl, 3-metylooktyl, 4-metylooktyl, 5-metylooktyl, 6-metylooktyl, 1-propyloheksyl, 2-etyloheptyl, 6,6-dimetyloheptyl, decyl, 1-metylononyl, 3-metylononyl, 8-metylononyl, 3-etylooktyl, 3,7-dimetylooktyl, 7,7-dimetylooktyl, undecyl, 4,8-dimetylononyl, dodecyl.

Bardziej korzystna reszta alkilowa pochodnych N-alkilokarbamoilowych jest wybrana z grupy zawierającej grupę C6-C12 alkilową.

W związku (la) znajduje się kilka grup funkcyjnych, do których mogą być dołączone grupa zabezpieczająca hydroksyl oraz reszty estrowa, eterowa i alkilowa. A zatem, wskutek ewentualnych kombinacji tych grup zabezpieczających i reszt mogą niezależnie występować mnogie grupy zabezpieczające i reszty.

PL 200 426 B1

Korzystną farmaceutycznie dopuszczalną pochodną estrową (la) jest pochodna, która ma jedną lub dwie z reszt estrowych w R², R³ i/lub R⁵. Bardziej korzystną pochodną estrową jest pochodna, która ma jedną lub dwie z reszt estrowych w r3 i/lub r5.

Jeszcze bardziej korzystną pochodną estrową jest pochodna, która ma jedną z reszt estrowych w R^{3 l}u^b w ^r5.

Najbardziej korzystną pochodną estrową jest pochodna, która ma jedną z reszt estrowych w R³.

Korzystną farmaceutycznie dopuszczalną pochodną eterową (la) jest pochodna, która ma jedną lub dwie z reszt eterowych w r2, r3 i/lub r5.

Bardziej korzystną pochodną eterową jest pochodna, która ma jedną lub dwie z reszt eterowych w r3 i/lub r5. Jeszcze bardziej korzystną pochodną eterową jest pochodna, która ma jedną z reszt eterowych w r3 lub w r5.

Najbardziej korzystną pochodną eterową jest pochodna, która ma jedną z reszt eterowych w R³.

Korzystną farmaceutycznie dopuszczalną pochodną N-alkilokarbamoilową jest pochodna mająca jedną z reszt alkilowych.

Termin „farmaceutycznie dopuszczalna sól” odnosi się do soli, która jest użytecznym lekarstwem pozbawionym znaczącej toksyczności.

Jeśli związek (l), (la) i farmaceutycznie dopuszczalna pochodna N-alkilowa związku (la) ma grupę zasadową, taką jak grupa aminowa, to związki te mogą być przekształcone w kwasowe sole addycyjne, typowo w wyniku działania kwasem.

Takie kwasowe sole addycyjne obejmują sole kwasów nieorganicznych, takie jak chlorowodorek, bromowodorek, siarczan i fosforan; sole kwasów organicznych, takie jak octan, benzoesan, szczawian, maleinian, fumaran, winian i cytrynian; i sole kwasów sulfonowych, takie jak metanosulfonian, benzenosulfonian i p-toluenosulfonian.

Jeśli związek (l) i farmaceutycznie dopuszczalna pochodna związku (la) jest pozostawiona na powietrzu atmosferycznym, to związki te mogą wychwytywać wodę z utworzeniem hydratów. Niniejszy wynalazek obejmuje takie hydraty.

Związek (l) i farmaceutycznie dopuszczalna pochodna związku (la) mogą absorbować rozpuszczalnik z utworzeniem solwatu. Niniejszy wynalazek obejmuje takie solwaty.

Związek (l) i farmaceutycznie dopuszczalna pochodna związku (la) ma kilka asymetrycznych węgli i dlatego też może występować w postaci kilku stereoizomerów, takich jak enancjomery i diastereomery, w których każdy węgiel ma konfigurację R lub S.

Związek według niniejszego wynalazku obejmuje indywidualne enancjomery i diastereomery oraz mieszaniny tych stereoizomerów we wszelkich proporcjach.

Korzystna konfiguracja związku według niniejszego wynalazku jest przedstawiona poniżej:

Poniższe tabele 1 i 2 są przytoczone w celu zilustrowania typowych związków (l) i (la) według niniejszego wynalazku.

PL 200 426 B1

T a b e l a 1

Przykład związku nr	X	R¹	R²	R³a	R⁴a	R⁵a
1	2	3	4	5	6	7
1	CH2	Me	Me	H	OH	H
2	CH2	Me	H	H	OH	H
3	CH2	Me	Me	H	H	H
5	CH2	Me	Me	A8	OH	H
6	CH2	Me	Me	A9	OH	H
7	CH2	Me	Me	A10	OH	H
8	CH2	Me	Me	A12	OH	H
9	CH2	Me	Me	A14	OH	H
10	CH2	Me	Me	A15	OH	H
11	CH2	Me	Me	A16	OH	H
16	CH2	Me	Me	OLE	OH	H
17	CH2	Me	Me	LE	OH	H
18	CH2	Me	Me	LEN	OH	H
21	CH2	Me	Me	DPP	OH	H
22	CH2	Me	Me	TMPP	OH	H
23	CH2	Me	Me	NPP	OH	H
45	CH2	H	H	H	OH	H
46	CH2	H	Me	A7	OH	H
48	CH2	H	Me	A9	OH	H
49	CH2	H	Me	A10	OH	H
50	CH2	H	Me	A12	OH	H
51	CH2	H	Me	A14	OH	H
52	CH2	H	Me	A15	OH	H
53	CH2	H	Me	A16	OH	H
135	CH2	H	Me	H	OH	A16
280	CH2	H	Me	H	AO7	A7
282	CH2	H	Me	H	AO9	A9
283	CH2	H	Me	H	AO10	A10

PL 200 426 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7
396	S	Me	Me	H	OH	H
539	CH2	Me	Me	C8OC	OH	H
540	CH2	Me	Me	C9OC	OH	H
545	CH2	Me	Me	MMA12	OH	H
548	CH2	Me	Me	DMA12	OH	H
571	CH2	H	Me	MMA12	OH	H
574	CH2	H	Me	DMA12	OH	H
590	CH2	Me	Me	C6	OH	H
594	CH2	Me	Me	C10	OH	H

T a b e l a 2

Przykład związku nr	R¹	R¹¹	R³	R⁵
891	Me	Me	H	H
1091	Me	C12	H	H

W tabelach 1 i 2:

Przykład związku nr oznacza przykładowy związek oznaczony numerem, CH2 oznacza grupę metylenową,

Me oznacza grupę metylową,

OH oznacza grupę hydroksylową,

A7 oznacza grupę heptanoilową,

A8 oznacza grupę oktanoilową,

A9 oznacza grupę nonanoilową,

A10 oznacza grupę dekanoilową,

A12 oznacza grupę lauroilową,

A14 oznacza grupę mirystoilową,

A15 oznacza grupę pentadekanoilową,

A16 oznacza grupę palmitoilową,

OLE oznacza grupę oleilową,

LE oznacza grupę linoleilową,

LEN oznacza grupę linolenylową,

DPP oznacza grupę 3,3-difenylopropionylową,

TMPP oznacza grupę 3-(3,4,5-trimetoksyfenylo)propionylową,

NPP oznacza grupę 2(4-nitrofenylo)propionylową,

C6 oznacza grupę heksylową,

C10 oznacza grupę decylową,

C12 oznacza grupę dodecylową,

C8OC oznacza grupę oktyloksykarbonylową,

PL 200 426 B1

C9OC oznacza grupę nonyloksykarbonylową,

MMA10 oznacza grupę 2-metylodekanoilową,

MMA12 oznacza grupę 2-metylododekanoilową,

DMA12 oznacza grupę 2,2-dimetylododekanoilową.

W związku o wzorze (l):

związek, którym R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza grupę metylową, R³a oznacza atom wodoru, R⁴a oznacza grupę hydroksylową, R5_a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową, ma symbol A-500359A (przykładowy związek nr 1);

związek, którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza atom wodoru, R3_a oznacza atom wodoru, R⁴a oznacza grupę hydroksylową, R5_a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową, ma symbol A-500359C (przykładowy związek nr 2);

związek, którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza atom wodoru, R⁴a oznacza atom wodoru, R5_a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową, ma symbol A-500359D (przykładowy związek nr 3);

związek, którym R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza atom wodoru, R3_a oznacza atom wodoru, R'7 oznacza grupę hydroksylową, oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową, ma symbol A-500359G (przykładowy związek nr 45); i związek, którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza atom wodoru, R'7 oznacza grupę hydroksylową, R5_a oznacza atom wodoru i X oznacza atom siarki, ma symbol A-500359M-2 (przykładowy związek nr 396).

W tabelach 1 i 2:

korzystne związki obejmują przykładowe związki oznaczone nr 1 do 3, 7 do 11, 45, 49 do 53, 135, 396, 539, 540, 594, 891, 1091, bardziej korzystne związki obejmują przykładowe związki oznaczone nr 1 do 3, 7 do 11,45, 49 do 53, 135, 539, 540, 594, 891, 1091, to znaczy:

przykład związku nr 1 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza atom wodoru, R'7 oznacza grupę hydroksylową, R5_a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 2 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza atom wodoru, R3_a oznacza atom wodoru, R'7 oznacza grupę hydroksylową, oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 3 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza atom wodoru, R'7 oznacza atom wodoru, R5_a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 7 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę dekanoilową, R'7 oznacza grupę hydroksylową, R5_a oznacza atom wodoru i oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 8 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, oznacza grupę lauroilową, R'7 oznacza grupę hydroksylową, R5_a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 9 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę mirystoilową, R'7 oznacza grupę hydroksylową, R5_a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 10 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę pentadekanoilową, R'7 oznacza grupę hydroksylową, R5_a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 11 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę palmitoilową, R'7 oznacza grupę hydroksylową, R5_a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 45 stanowi związek, w którym R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza atom wodoru, R3_a oznacza atom wodoru, R'7 oznacza grupę hydroksylową, oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 49 stanowi związek, w którym R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę dekanoilową, R'7 oznacza grupę hydroksylową, oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

PL 200 426 B1 przykład związku nr 50 stanowi związek, w którym R¹ oznacza atom wodoru, R² oznacza grupę metylową, R³a oznacza grupę lauroilową, R'4_; oznacza grupę hydroksylową, R⁵a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 51 stanowi związek, w którym R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę mirystoilową, R⁴a oznacza grupę hydroksylową, R⁵a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 52 stanowi związek, w którym R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę pentadekanoilową, R'4_; oznacza grupę hydroksylową, R⁵a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 53 stanowi związek, w którym R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę palmitoilową, R''4_; oznacza grupę hydroksylową, R⁵a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 135 stanowi związek, w którym R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza atom wodoru, R4. oznacza grupę hydroksylową, R⁵a oznacza grupę palmitoilową oraz X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 539 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę oktyloksykarbonylową, R4. oznacza grupę hydroksylową, R⁵a oznacza atom wodoru oraz X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 540 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę nonyloksy-karbonylową, R'4. oznacza grupę hydroksylową, R⁵a oznacza atom wodoru oraz X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 594 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_a oznacza grupę decylową, R'4. oznacza grupę hydroksylową, R⁵a oznacza atom wodoru oraz X oznacza grupę metylenową;

przykład związku nr 891 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, R¹¹ oznacza grupę metylową, r3 oznacza atom wodoru i R⁵ oznacza atom wodoru; i przykład związku nr 1091 stanowi związek, w którym R1 oznacza grupę metylową, R¹¹ oznacza grupę dodecylową, r3 oznacza atom wodoru oraz r5 oznacza atom wodoru.

Związki według niniejszego wynalazku przedstawione wzorem (l) lub (la) mogą być otrzymane sposobem poniżej ujawnionym.

Związki A-500359A (przykł. związek nr 1), A-500359C (przykł. związek nr 2), A-500359D (przykł. związek nr 3), A-500359G (przykł. związek nr 45) i A-500359M-2 (przykł. związek nr 396) według niniejszego wynalazku, z których każdy jest przedstawiony wzorem (l), są dostępne poprzez hodowlę mikroorganizmu zdolnego do wytwarzania wyżej ujawnionych związków, należącego do Streptomyces griseus, w odpowiednim środowisku, a następnie poprzez wydzielenie związku z bulionu hodowlanego. Szczep Streptomyces griseus SANK60196 (który niniejszym będzie nazywany „szczep SANK60196”), korzystny mikroorganizm zdolny do wytwarzania związków A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2 został pobrany i wydzielony z gleby Mt. Tsukuba/lbaraki-ken sposobem znanym specjalistom w dziedzinie.

Właściwości mykologiczne szczepu SANK60196 są następujące.

1) Wygląd morfologiczny

Szczep SANK60196 wykazywał wygląd morfologiczny, ujawniony poniżej, po 14 dniach hodowli w 28°C w środowisku wyszczególnionym przez International Streptomyces Project (niniejszym w skrócie „ISP”) [patrz Shirling, E. B. i Gottlieb, D., Int. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340 (1996)]. Obserwacja przez mikroskop optyczny pozwala stwierdzić, że grzybnia substratu SANK60196 korzystnie rozwija się i rozgałęzia, i wykazuje żółtawoszary, żółtawobrązowy lub bladooliwkowy kolor, ale w przeciwieństwie do szczepu należącego do Nocardia spp., nie wykazuje rozszczepienia lub zygzakowatych wydłużeń. Grzybnia powietrzna wykazuje proste rozgałęzienia. Postać łańcucha spory jest liniowa lub zakrzywiona, a jej łańcuch jest utworzony z 10 do 50 dużych spor. Obserwacja za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wykazuje, że spora ma kształt owalny i ma gładką strukturę powierzchniową. Wymiary spory wynoszą 0,6-0,8 x 0,7-1,2 mm. Spora jest tworzona tylko na grzybni powietrznej. Tworzenie się sporangium, podział osiowy grzybni powietrznej, rozszczepienie grzybni powietrznej i sclerotium nie zostały zauważone.

2) Charakterystyka rozwoju na różnych środowiskach

Charakterystyki rozwoju szczepu SANK60196 na środowisku agarowym, po 14 dniach w 28°C, są ujawnione w tabeli 3. W tabeli skład środowiska dołączonego z nr ISP jest taki sam jak wyspecyfiPL 200 426 B1 kowany przez ISP. W kolejnych pozycjach skróty G, AM, R i SP oznaczają, odpowiednio, rozwój, grzybnię powietrzną, barwę wsteczną i rozpuszczalny pigment. Odcień barwy jest ujawniony stosownie do „Colour Standards”, ed. przez Japan Colour Laboratory. Wskazanie odcienia barwy w nawiasach oznacza liczbę zabarwienia zgodną z systematyką barw Munsell'a. Wytworzony w środowisku wodno-agarowym bladożółty rozpuszczalny pigment zmienia się na bezbarwny pod działaniem 0,05 N kwasu solnego, ale nie zmienia się pod działaniem 0,05 N wodorotlenku sodu.

[Tabela 3]

Rodzaj środowiska;

Pozycje: charakterystyki.

Agar, ekstrakt drożdżowy - ekstrakt słodowy (ISP 2);

G: doskonały, płaski, żółtawo-brązowy (10 YR 5/6)

AM: wytworzona obficie, miękka, jasnobrązowa (2,5 Y 8/2)

R: żółto-brązowy (10 YR 5/8)

SP: żółto-brązowa (10 YR 6/8).

Agar, owies spożywczy (ISP 3);

G: doskonały, płaski, żółtawo-brązowy (2,5 YR 6/6)

AM: wytworzona obficie, miękka, bladożółto-pomarańczowa (5 Y 9/2)

R: ciemnożółty (2,5 YR 8/8)

SP: nie wytworzony.

Agar skrobia-sól nieorganiczna (SIP 4);

G: dobry, płaski, żółtawo-brązowy (2,5 YR 6/4)

AM: wytworzona obficie, miękka, żółtawo-szara (7,5 Y 9/2)

R: żółtawo-brązowy (2,5 Y 6/4).

Agar, gliceryna-asparagina (ISP 5);

G: doskonały, płaski, bladożółtawo-brązowy (2,5 YR 7/6)

AM: wytworzona obficie, miękka, żółtawo-szara (5 Y 8/2)

R: bladożółto-brązowy (2,5 YR 8/6)

SP: nie wytworzony.

Agar, pepton-ekstrakt drożdżowy-żelazo (ISP 6);

G: doskonały, płaski, bladooliwkowy (5 Y 8/3)

AM: słabo wytworzona obficie, miękka, żółtawo-szara (5 Y 9/1)

R: bladożółty (5 Y 8/6)

SP: nie wytworzony.

Agar, tyrozyna (ISP 7);

G: dobry, płaski, szarawo-żółto-brązowy (2,5 Y 5/4)

AM: wytworzona obficie, miękka, lekko oliwkowo-szara (7,5 Y 8/2)

R: żółtawo-brązowy (10 YR 5/4)

SP: szarawo-żółto-brązowy (2,5 Y 4/3).

Agar, sukroza-azotan;

G: niezbyt dobry, płaski, bladożółty (5 Y 8/6)

AM: wytworzona obficie, miękka, lekko oliwkowo-szara (7,5 Y 8/2)

R: ciemnożółty (5 Y 8/8)

SP: bladożółty (5 Y 9/6).

Agar, glukoza-asparagina;

G: dobry, płaski, bladożółty (5 Y 9/3)

AM: niezbyt dobra, miękka, żółtawo-szara (5 Y 9/1)

R: bladożółtawo-szary (7,5 YR 9/3)

SP: nie wytworzony.

Agar żywieniowy (produkt Difco Laboratories);

G: dobry, płaski, bladożółtawo-brązowy (2,5 YR 8/3)

AM: dobra, miękka, żółtawo-szara (5 Y 9/1)

R: żółtawo-szary (5 Y 9/4)

SP: nie wytworzony.

Agar, ekstrakt ziemniaczany-ekstrakt marchwiowy;

G: niezbyt dobry, płaski, żółtawo-szary (7,5 YR 9/2)

AM: niezbyt dobra, miękka, żółtawo-szara (5 Y 9/2)

PL 200 426 B1

R: żółtawo-szary (7,5 YR 9/3)

SP: żółtawo-szary (7,5 YR 9/3).

Agar wodny;

G: niezbyt dobry, płaski, żółtawo-szary (5 Y 9/1)

AM: niezbyt dobra, miękka, żółtawo-szara (5 ZY 9/1)

R: żółtawo-szary (7,5 Y 9/4)

SP: bladożółty (5 Y 9/6).

3) Charakterystyki fizjologiczne

Charakterystyki fizjologiczne niniejszego szczepu, obserwowane przez 2 do 21 dni po hodowli w 28°C, przedstawiono w tablicy 4. W tabeli środowiskiem 1 jest środowisko agarowym (ekstrakt drożdżowy-ekstrakt słodowy) (ISP 2).

[Tabela 4]

Hydroliza skrobi o°yyty^wna

Przemiana żelatyny w ciecz ozytywnaa

Redukcja azotanów ozyytywna

Koagulacja mleka nggttwwna

Peptonizacja mleka nggytywna

Tworzenie pigmentu pseudo-melaminowego ozyytywna

Rozkład substratu: aaeeiny o^yt^w^vvna tyrozyny ozytywnaa ksantyny negatywna

Zakres temperatur rozwoju (środowisko 1) 6 do 55°C

Optymalna temperatura rozwoju (środowisko 1) 18 do 30°C Rozwój w obecności soli (środowisko 1) 10%

Wykorzystanie źródła węgla przez szczep SANK60196, obserwowane po hodowli w 28°C przez 14 dni na środowisku agarowym Pridham-Gottlieb'a (ISP 9), ujawniono w tabeli 5. W tabeli „+” oznacza wykorzystanie, natomiast „-” oznacza brak wykorzystania.

[Tabela 5]

D-glukoza +

L-arabinoza D-ksyloza +

Inozytol D-mannitol +

D-fruktoza +

L-ramnoza Sukroza Rafinoza 4) Właściwości chemotaksonomiczne

Badano ściankę komórkową niniejszego szczepu według sposobu Hasegawa, et al. [patrz Hasegawa T., et al., The Journal of General and Applied Microbiology, 29, 319-322(1983)], co doprowadziło do wykrycia kwasu LL-diaminopimelinowego. Główny składnik cukrowy całych komórek niniejszego szczepu badano według sposobu M. P. Lechevalier [patrz Lechevalier, M. P., Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, 934-944(1968)]. W rezultacie nie wykryto żadnego charakterystycznego składnika.

Wyżej ujawnione właściwości mykologiczne wykazały, że niniejszy szczep należy do Streptomyces spp. wśród actinomycetes. Stało się oczywiste, że niniejszy szczep jest znacząco zbliżony do Streptomyces griseus, co wynika z porównania z mikroorganizmem ujawnionym wśród szczepów ISP przez Shirling i Gottlieb [patrz Shirling, E. B. i Gottlieb, D., International Journal of Systematic Bacteriology, 18, 68-189 and 279-392 (1968); 19, 391-512 (1969); 22, 265-394 (1972)], mikroorganizmem ujawnionym w The actinomycełes, vol. 2, autorstwa Waksman'a [patrz Waksman, S. A., The actinomycetes 2 (1961)], mikroorganizmem ujawnionym w Bergey's Manual, ed. Buchanan i Gibbons [patrz R. E. Buchanan i N. E. Gibbons, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8e wydanie (1974)], mikroorganizmem ujawnionym w Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, ed. Williams [patrz Williams, S. T., et al., Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 4 (1989)] i mikroorganizmem ujawnionym w aktualnej literaturze dotyczącej actinomycetes należących do Streptomyces spp. Jednakże zauważono, że jest odmienny od Streptomyces griseus, ponieważ wytwarza żółtawo-szary rozpuszPL 200 426 B1 czalny pigment na środowisku agarowym - gliceryna-asparagina oraz bladożółtawo-brązowy rozpuszczalny pigment na środowisku agarowym, pepton-ekstrakt drożdżowy-żelazo, ale nie wytwarza rozpuszczalnego pigmentu na środowisku agarowym, ekstrakt ziemniaczano-ekstrakt marchwiowy, jak i na środowisku agarowym wodnym; maksymalną temperaturą rozwoju jest 40°C; i rozwija się w obecności 7% soli.

Niniejszy szczep o takich charakterystykach mykologicznych jest uważany za nowy szczep odmienny od Streptomyces griseus, ale nie jest możliwe rozróżnienie ich tylko na podstawie wyżej wymienionych różnic. Zgłaszający niniejszy wynalazek oznaczyli zatem niniejszy szczep jako Streptomyces griseus SANK60196.

Szczep został zdeponowany zgodnie z międzynarodowymi zasadami w Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japonia) 22 lutego, 1996, z numerem dostępu FERM BP-5420.

A zatem scharakteryzowano szczep SANK60196. Wiadomo, że rozmaite właściwości actinomycetes nie są niezmienne, ale łatwo ulegają zmianom naturalnym lub sztucznym. Użyteczny szczep według niniejszego wynalazku obejmuje wszystkie takie warianty. Innymi słowy, niniejszy wynalazek obejmuje wszystkie szczepy należące do Streptomyces spp. i zdolne do wytwarzania związków A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2.

Jakiekolwiek syntetyczne lub naturalne środowisko może być zastosowane do hodowli mikroorganizmów zdolnych do wytwarzania związków A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2 według niniejszego wynalazku, o ile zawiera, jeśli konieczne, substancje wybrane spośród źródeł węgla, źródeł azotu, źródła jonów nieorganicznych i organicznych składników żywieniowych.

Znane źródła węgla, źródła azotu i soli nieorganicznych tradycyjnie wykorzystywane do hodowli szczepu eumycetes i actinomycetes, wykorzystywane przez mikroorganizm, mogą być użyte jako takie źródła składników żywieniowych.

Konkretne przykłady źródła węgla obejmują glukozę, fruktozę, maltozę, sukrozę, mannitol, glicerol, dekstrynę, owies, żyto, skrobię kukurydzianą, ziemniaki, mączkę kukurydzianą, mączkę sojową, olej bawełniany, zagęszczony syrop słodowy, theriac, olej sojowy, kwas cytrynowy i kwas winowy. Mogą one być użyte indywidualnie lub w kombinacji. Ilość dodanego źródła węgla zwykle mieści się w zakresie, nie ograniczając zakresu, od 1 do 10% wagowych.

Jako źródło azotu zwykle mogą być wykorzystywane substancje zawierające proteiny lub ich hydrolizaty. Korzystne przykłady źródła azotu obejmują mączkę sojową, otręby pszenne, mączkę orzechową, mączkę z nasion bawełny, hydrolizat kazeinowy, Farmamine, mączkę rybną, kukurydziany płyn namokowy, pepton, ekstrakt mięsny, prasowane drożdże, suche drożdże, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt słodowy, ziemniaki, siarczan amonu, azotan amonu i azotan sodu. Korzystne jest użycie źródła azotu indywidualnie lub w kombinacji w ilości w zakresie od 0,2 do 6% wag. ilości środowiska.

Jako źródło soli nieorganicznych mogą być używane zwykle stosowane sole, które uwalniają jony, takie jak sole sodu, sole amonowe, sole wapnia, fosforany, siarczany, chlorki i węglany. W dodatku metale śladowe, takie jak potas, wapń, kobalt, mangan, żelazo i magnez są użyteczne.

Do wytwarzania związku A-500359A dodatek kobaltu lub ekstraktu drożdżowego jest szczególnie efektywny.

W trakcie hodowli mikroorganizmu zdolnego do wytwarzania związku A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2, inhibitor biosyntezy antybiotyków może być dodany celem wytworzenia użytecznych związków pokrewnych. Związek A500359M-2 może być wytworzony, na przykład przy użyciu, jako środowiska dodatkowego, S-(2-aminoetylo)-L-cysteiny lub jej soli, która jest inhibitorem kinazy asparaginowej. Dodatek może być dodany do jego finalnego stężenia w zakresie od 1 do 100 mM. Korzystnie, zastosowanie go w finalnym stężeniu 10 nM umożliwia korzystne wytwarzanie związku A-500359M-2.

Do hodowli płynnej mogą być dodane jako środki przeciwpieniące olej silikonowy, olej roślinny lub surfaktant.

Środowisko stosowane do hodowli szczepu SANK60196 wytwarzającego związek A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2 korzystnie winno mieć pH w zakresie od 5,0 do 8,0.

Temperatura, która umożliwia rozwój szczepu SANK60196 znajduje się w zakresie od 12 do 36°C. Korzystna jest hodowla szczepu w 18 do 28°C celem wytworzenia związku A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2, bardziej korzystnie w 19 do 23°C.

PL 200 426 B1

Związek A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2 jest dostępny z aerobowej hodowli szczepu SANK60196. Jako metoda hodowli mogą być zastosowane typowo stosowane: hodowla stała, hodowla wytrząsana oraz hodowla pobudzana powietrznie.

Do hodowli w małej skali pobudzanie hodowli przez kilka dni w 19 do 23°C jest korzystne. Hodowlę rozpoczyna się od rozwoju posianej hodowli w procesie jedno- lub dwuetapowym w kolbie Erlenmeyera zaopatrzonej w przegrodę (ścianka korygująca przepływ wody) lub zwykłej kolbie Erlenmeyera. Źródło węgla i źródło azotu mogą być użyte łącznie jako środowisko dla posianej hodowli. Kolba lub posiana hodowla może być wytrząsana w 19 do 23°C przez 5 dni aż posiana hodowla zacznie się dostatecznie rozwijać w termostatowanym inkubatorze. Posiane, rozwinięte hodowle mogą być użyte do inokulacji drugiego środowiska hodowlanego lub środowiska produkcyjnego. Jeśli posiane hodowle są używane w pośrednim etapie rozwojowym, to są one hodowane zasadniczo w ten sam sposób, a następnie cześć ich użyta do inokulacji środowiska produkcyjnego. Kolba, do której inokulowano posiane hodowle, jest poddawana hodowli z wytrząsaniem w stałej temperaturze przez kilka dni, a po zakończeniu hodowli, środowisko hodowlane jest wirowane lub sączone.

Z drugiej strony, do hodowli w dużej skali korzystne jest prowadzenie hodowli w fermentorze lub w zbiorniku zaopatrzonym w mieszadło i aparat napowietrzający. Przed rozpoczęciem hodowli w takim zbiorniku, środowisko hodowlane jest ogrzewane do 125°C celem sterylizacji. Po ochłodzeniu, posiane hodowle, które uprzednio rozwijały się, są inokulowane na sterylizowanym środowsiku. Następnie hodowla jest prowadzona z napowietrzaniem i mieszaniem w 19 do 23°C. Sposób ten jest odpowiedni dla otrzymania dużych ilości związków.

Związek A-500359M-2 może być wytwarzany po dodaniu jako inhibitora kinazy asparaginowej wodnego roztworu S-(2-aminometylo)-L-cysteiny lub jej soli, którą wcześniej sterylizowano filtracyjnie, do sterylizowanego środowiska w momencie rozpoczęcia hodowli lub podczas hodowli.

Ilość wytworzonego związku A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2 może być oznaczona poprzez pobranie próbki bulionu hodowlanego i poddanie go wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Miano związku A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2 zwykle osiąga maksimum po 3 do 9 dniach.

Po zakończeniu hodowli komponent komórkowy jest oddzielany od bulionu hodowlanego drogą separacji z zastosowaniem ziemi okrzemkowej lub drogą wirowania. Związek A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2, obecny w przesączu lub supernatancie jest oczyszczany z wykorzystaniem swych właściwości fizyko-chemicznych z indeksowaniem analitycznymi danymi z HPLC. Związek A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2, obecny w przesączu, może być oczyszczany z użyciem adsorbentów, indywidualnie lub w kombinacji, takich jak węgiel aktywowany (produkt Wako Pure Chemical) i żywic adsorpcyjnych, takich jak Amberlite XAD-2 lub XAD-4 (nazwa handlowa, produkt Rohm & Haas) oraz Diaion HP-10, HP-20, CHP-20P lub HP-50, Sepabeads SP205, SP206 lub SP207 (nazwa handlowa, produkt Mitsubishi Chemical). Związek A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2 w roztworze może być oddzielony od zanieczyszczeń poprzez przepuszczenie roztworu, który go zawiera, przez warstwę takich adsorbentów lub poprzez wyeluowanie zaadsorbowanych związków z warstwy wodnym metanolem, wodnym acetonem lub wodnym normalnym butanolem.

Otrzymane związki A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2 mogą być oczyszczane za pomocą adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej z użyciem adsorbenta, takiego jak żel krzemionkowy, „Florisil” (nazwa handlowa) lub „Cosmosil” (nazwa handlowa, produkt Nacalai Tesque); chromatografia podziałowa z użyciem „Sephadex LH-20” (nazwa handlowa, produkt Pharmacia Biotech); filtracyjna chromatografia żelowa z użyciem „Toyopearl HW40F” (nazwa handlowa, produkt TOSOH Corp); lub wysokosprawna chromatografia cieczowa z użyciem kolumny do faz normalnych lub odwróconych; lub podobnych.

Związki A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2 według niniejszego wynalazku mogą być rozdzielone i oczyszczone z użyciem wyżej wymienionych środków do separacji i oczyszczania, indywidualnie lub w kombinacji jeśli konieczne lub w niektórych przypadkach poprzez wielokrotne użycie jednego z nich.

Tak otrzymane związki A-500359A, A-500359C, A-500359D, A-500359G lub A-500359M-2 według niniejszego wynalazku są związkami nowymi, nie opublikowanymi w literaturze, ale ich aktywność przeciwbakteryjna może być oznaczona sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie.

PL 200 426 B1

Każda z pochodnych estrowych, pochodnych eterowych i pochodnych N-alkilokarbamoilowych może być łatwo otrzymana z wykorzystaniem jednego z poniżej ujawnionych sposobów A do F, z łącznym ich wykorzystaniem jeśli konieczne.

(Sposób A)

Sposób A stosuje się do otrzymywania pochodnej estrowej związku (la) i za pomocą tego sposobu może być otrzymany związek (Ic), w którym R² oznacza grupę metylową.

Sposób A

w którym: R¹ i X mają te same znaczenia ujawnione jak powyżej; R³b oznacza atom wodoru lub grupę zabezpieczającą hydroksyl, r3c oznacza atom wodoru, grupę zabezpieczającą hydroksyl lub resztę estrową, R⁴b oznacza atom wodoru, grupę zabezpieczającą hydroksyl lub resztę estrową, R⁵b oznacza atom wodoru lub grupę zabezpieczającą hydroksyl i R% oznacza atom wodoru, grupę zabezpieczającą hydroksyl lub resztę estrową, pod warunkiem, że R3_b i R⁵b nie oznaczają jednocześnie atomu wodoru i wszystkie r3_c, R⁴b i R⁵C nie oznaczają jednocześnie atomu wodoru lub grupy zabezpieczającej hydroksyl.

Etap A1 stosuje sią do otrzymywania związku mającego wzór (III) i jest realizowany drogą zabezpieczenia grupy hydroksylowej związku o wzorze (III).

Aczkolwiek etap zabezpieczania hydroksylu różni się w zależności od rodzaju grupy zabezpieczającej, to jest przeprowadzany według sposobu ogólnie znanego w syntetycznej chemii organicznej.

PL 200 426 B1

Jeśli grupą zabezpieczającą hydroksyl jest „grupa sililowa”, „grupa alkoksymetylowa”, „podstawiona grupa etylowa”, „grupa aralkilowa”, „grupa alkoksykarbonylowa”, „grupa alkenyloksykarbonylowa”, „grupa aralkiloksykarbonylowa”, „grupa 1-(alifatyczna acyloksy)-niższa alkilowa”, „grupa 1-(alifatyczna acylotio)-niższa alkilowa”, „grupa 1-(cykloalkilokar-bonyloksy)-niższa alkilowa”, „grupa 1-(aromatyczna acyloksy)-niższa alkilowa”, „grupa 1-(niższa alkoksykarbonyloksy)-niższa alkilowa”, „grupa 1-(cykloalkiloksykarbonyloksy)-niższa alkilowa”, „grupa ftalidylowa”, „grupa oksodioksolenylometylowa”, „grupa karbamoilowa podstawiona przez 2 niższe grupy alkilowe”, „grupa 1-(niższa alkoksykarbonyloksy)-niższa alkilowa”, „grupa niższa alkilo-ditioetylowa” lub „grupa 1-(acyloksy)-alkoksykarbonylowa”, to etap ten jest przeprowadzany poddając reakcji związek (II) z żądanym halogenkiem zabezpieczającym hydroksyl w obojętnym rozpuszczalniku w obecności zasady.

Przykłady halogenków zabezpieczających hydroksyl użytecznych w powyższej reakcji obejmują chlorek trimetylosililu, chlorek trietylosililu, chlorek t-butylodimetylosililu, bromek t-butylodimetylosililu, chlorek metylodi-t-butylosililu, bromek metylodi-t-butylosililu, chlorek difenylometylosililu, bromek difenylometylosililu, chlorek metoksymetylu, chlorek 2-metoksyetoksymetylu, chlorek 2,2,2-trichloroetoksymetylu, chlorek 1-etoksyetylu, chlorek benzylu, bromek benzylu, chlorek α-naftylometylu, chlorek difenylometylu, bromek difenylometylu, chlorek trifenylometylu, chlorek 4-metylobenzylu, chlorek 4-metoksybenzylu, chlorek 4-nitrobenzylu, chlorek 4-chlorobenzylu, chlorek metoksykarbonylu, chlorek etoksykarbonylu, chlorek 2,2,2-trichloroetoksykarbonylu, chlorek winyloksykarbonylu, chlorek alliloksykarbonylu, chlorek benzyloksykarbonylu, bromek benzyloksykarbonylu, chlorek 4-metoksybenzyloksykarbonylu, chlorek 4-nitrobenzyloksykarbonylu, chlorek acetoksymetylu, chlorek propionyloksymetylu, chlorek butyryloksymetylu, chlorek piwaloiloksymetylu, bromek piwaloiloksymetylu, chlorek waleryloksymetylu, chlorek 1-acetoksyetylu, chlorek butyryloksyetylu, chlorek 1-piwaloiloksyetylu, chlorek cyklopentylokarbonyloksymetylu, chlorek cykloheksylokarbonyloksymetylu, chlorek 1-cyklopentylokarbonyloksyetylu, chlorek 1-cykloheksylokarbonyloksyetylu, chlorek metoksykarbonyloksymetylu, bromek metoksykarbonyloksymetylu, chlorek etoksykarbonyloksymetylu, chlorek propoksykarbonyloksymetylu, chlorek izopropoksykarbonyloksymetylu, chlorek butoksykarbonyloksymetylu, chlorek izobutoksykarbonyloksymetylu, chlorek 1-(metoksykarbonyloksy)etylu, bromek 1-(metoksykarbonyloksy)etylu, chlorek 1-(etoksykarbonyloksy)etylu, chlorek 1-(izopropoksykarbonyloksy)etylu, chlorek cyklopentyloksykarbonyloksymetylu, chlorek cykloheksyloksykarbonyloksymetylu, chlorek 1-(cyklopentyloksykarbonyloksy)etylu, chlorek, 1-(cykloheksyloksykarbonyloksy)etylu, chlorek ftalidylu, bromek ftalidylu, chlorek (5-fenylo-2-okso-1,3-dioksolen-4-ylo)metylu, chlorek [5-(4-metylofenylo)-2-okso-1,3-dioksolen-4-ylo]metylu, chlorek (5-metylo-2-okso-1,3-dioksolen-4-ylo)metylu, bromek (5-metylo-2-okso-1,3-dioksolen-4-ylo)metylu, chlorek (5-etylo-2-okso-1,3-dioksolen-4-ylo)metylu, chlorek dimetylokarbamoilu, chlorek dietylokarbamoilu, chlorek metyloditioetylu, chlorek etyloditioetylu i chlorek piwaloiloksymetyloksykarbonylu, spośród których korzystne są chlorek trietylosililu, chlorek t-butylodimetylosililu, bromek t-butylodimetylosililu, chlorek benzylu, bromek benzyl, chlorek trifenylometylu, chlorek 4-metoksybenzylu, chlorek 2,2,2-trichloroetoksykarbonylu, chlorek alliloksykarbonylu, chlorek benzyloksykarbonylu, bromek benzyloksykarbonylu, chlorek acetoksymetylu i chlorek piwaloiloksymetylu.

Przykłady zasad obejmują wodorotlenki metali alkalicznych, takie jak wodorotlenek litu, wodorotlenek sodu i wodorotlenek potasu, węglany metali alkalicznych, takie jak węglan litu, węglan sodu i węglan potasu, kwaśne węglany metali alkalicznych, takie jak kwaśny węglan sodu i kwaśny węglan potasu, alkoksylany metali alkalicznych, takie jak meta-nolan litu, metanolan sodu, etanolan sodu i t-buanolan potasu oraz aminy organiczne, takie jak trietyloamina, tributyloamina, N-metylomorfolina, pirydyna, 4-dimetyloaminopirydyna, pikolina, lutydyna, kolidyna, 1,5-diazabicyklo[4.3.0]-5-nonen i 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-7-undecen. Spośród nich korzystne są organiczne aminy, a z nich szczególnie korzystne trietyloamina, tributyloamina, pirydyna i lutydyna. Jeśli jest zastosowana amina w postaci ciekłej, to również może służyć jako rozpuszczalnik, jeśli jest użyta w znacznym nadmiarze.

Nie ma szczególnego ograniczenia co do obojętnego rozpuszczalnika stosowanego w powyższej reakcji, pod warunkiem, że jest nie reaktywny względem reakcji. Przykłady obejmują węglowodory, takie jak heksan, benzen i toluen, halogenowane węglowodory, takie jak dichlorometan, chloroform, czterochlorek węgla i 1,2-dichloroetan, etery, takie jak eter, tetrahydrofuran i dioksan, ketony, takie jak aceton i keton metylowoetylowy, nitryle, takie jak acetonitryl, amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid, N.N-dimetyloacetamid, N-metylo-2-pirolidon i heksametyloamid kwasu fosforowego oraz sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; oraz ich mieszaniny. Spośród nich korzystne są węglowodory i amidy.

PL 200 426 B1

Aczkolwiek temperatura reakcji jest zróżnicowana w zależności od rodzaju związku wyjściowego (II), halogenku i rozpuszczalnika, to zwykle wynosi od -10°C do 100°C (korzystnie 0 do 50°C). Aczkolwiek czas reakcji jest zróżnicowany w zależności od temperatury i tym podobnych, to wynosi od 30 minut do 5 dni (korzystnie 1 do 3 dni).

Jeśli grupą zabezpieczającą hydroksyl jest „grupa tetrahydropiranylowa lub tetrahydrotiopiranylowa” lub „grupa tetrahydrofuranylowa lub tetrahydrotiofuranylowa”, to związek (II) jest poddawany reakcji z cyklicznym eterem, takim jak dihydropiran, 3-bromodihydropiran, 4-metoksydihydropiran, dihydrotiopiran, 4-metoksydihydrotiopiran, dihydrofuran lub dihydrotiofuran w obojętnym rozpuszczalniku w obecności kwasu.

Przykłady kwasu użytecznego w powyższej reakcji obejmują kwasy nieorganiczne, takie jak chlorowodór, kwas azotowy, kwas solny i kwas siarkowy oraz kwasy organiczne, takie jak kwas octowy, kwas trifluorooctowy, kwas metanosulfonowy i kwas p-toluenosulfonowy, spośród których chlorowodór, kwas solny, kwas siarkowy i kwas trifluorooctowy są korzystne, chlorowodór i kwas solny są szczególnie korzystne.

Przykłady obojętnych rozpuszczalników użytecznych w powyższej reakcji (które są niereaktywne względem reakcji) obejmują węglowodory, takie jak heksan, benzen i toluen, halogenowane węglowodory, takie jak dichlorometan, chloroform, czterochlorek węgla i 1,2-dichloroetan, etery, takie jak eter, tetrahydrofuran i dioksan, ketony, takie jak aceton i keton metylowoetylowy, nitryle, takie jak acetonitryl, amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid, N,N-dimetyloacetamid, N-metylo-2-pirolidon i heksametyloamid kwasu fosforowego, oraz sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; oraz ich mieszaniny. Spośród nich korzystne są węglowodory i etery.

Aczkolwiek temperatura reakcji jest zróżnicowana w zależności od rodzaju związku wyjściowego (II), cyklicznego eteru i rozpuszczalnika, to zwykle wynosi od -10°C do 100°C (korzystnie 0 do 50°C). Aczkolwiek czas reakcji jest zróżnicowany w zależności od temperatury i tym podobnych, to wynosi od 30 minut do 5 dni (korzystnie 1 do 3 dni).

Jeśli grupą zabezpieczającą hydroksyl jest „grupa karbamoilowa” lub „grupa karbamoilowa podstawiona przez jedną niższą grupę alkilową”, to związek (II) jest poddawany reakcji z izocyjanianem lub izocyjanianem niższego alkilu, takim jak izocyjanian metylu lub izocyjanian etylu w obojętnym rozpuszczalniku w obecności lub nieobecności zasady.

Korzystne przykłady zasad użytecznych w powyższej reakcji obejmują wyżej podane aminy organiczne, przy czym trietyloamina, tributyloamina, pirydyna i lutydyna są szczególnie korzystne.

Nie ma szczególnego ograniczenia co do obojętnego rozpuszczalnika stosowanego w powyższej reakcji, pod warunkiem, że jest nie reaktywny względem reakcji. Przykłady obejmują węglowodory, takie jak heksan, benzen i toluen, halogenowane węglowodory, takie jak dichlorometan, chloroform, czterochlorek węgla i 1,2-dichloroetan, etery, takie jak eter, tetrahydrofuran i dioksan, ketony, takie jak aceton i keton metylowoetylowy, nitryle, takie jak acetonitryl, amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid, N,N-dimetyloacetamid, N-metylo-2-pirolidon i heksametyloamid kwasu fosforowego oraz sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; oraz ich mieszaniny. Spośród nich korzystne są węglowodory i etery.

Po zakończeniu reakcji żądany związek w każdej z reakcji jest wydzielany z mieszaniny reakcyjnej sposobem znanym specjalistom w dziedzinie, żądany związek może być otrzymany na przykład poprzez odsączenie jakichkolwiek nierozpuszczalnych materiałów, jeśli konieczne, a następnie oddestylowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem; lub poprzez oddestylowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, dodanie wody do pozostałości, ekstrahowanie mieszaniny rozpuszczalnikiem nie mieszającym się z wodą, takim jak octan etylu, wysuszenie siarczanem magnezu lub podobnym, a następnie oddestylowanie rozpuszczalnika. Jeśli konieczne, uzyskany produkt może być dalej oczyszczany sposobem znanym specjalistom w dziedzinie, na przykład drogą krystalizacji, chromatografii kolumnowej lub tym podobnych.

Etap A2 stosuje się do otrzymywania związku mającego wzór (Ic). Etap ten może być realizowany poprzez estryfikowanie związku (III) i, jeśli żądane, poprzez usuwanie grupy zabezpieczającej hydroksyl ze zestryfikowanego związku.

PL 200 426 B1

Estryfikacja jest przeprowadzana poprzez poddanie reakcji związku (III) z halogenkiem kwasowym lub bezwodnikiem kwasowym, mającym żądaną resztę estrową, w obojętnym rozpuszczalniku w obecności zasady.

Przykłady halogenków kwasowych lub bezwodników kwasowych używanych w powyższej rea^kcjⁱ o^bejmuj^ą zw^iąz^{ki p}rze^dstówtóne je^dn^ym z wzorów R⁶CO-Y, R⁶CO₂CO₂R^9, R⁶CO-O-COR⁶i R6OCO-Y [w których r6 ma to samo znaczenie jak ujawnione powyżej, Y oznacza atom halogenu, korzystnie chlor lub brom, r9 oznacza grupę C1-4 alkilową (korzystnie etyl lub izopropyl)]; mieszane bezwodniki kwasu mrówkowego i octowego, cykliczne bezwodniki kwasowe, takie jak bezwodnik kwasu bursztynowego, bezwodnik kwasu glutarowego i bezwodnik kwasu adypinowego; oraz środki wprowadzające estry fosforanowe, takie jak związki przedstawione wzorem (R⁷O)2PO-Y (w którym Y ma to samo znaczenie jak ujawnione powyżej i R⁷ oznacza niższą grupę alkilową), spośród których zw^iąz^{ki p}rze^ds^tawⁱone którymkolwiek ze wzorów ^r6c°-Y ^r6c°^2C°^{2r9, r6c}°-°-^c°^{r6 r6}°^co-^y(w których R⁶, Y i r9 mają te same znaczenia jak ujawnione powyżej) są korzystne.

Przykłady zasad, użytecznych w powyższej reakcji, obejmują wodorotlenki metali alkalicznych, takie jak wodorotlenek litu, wodorotlenek sodu i wodorotlenek potasu, węglany metali alkalicznych, takie jak węglan litu, węglan sodu i węglan potasu, kwaśne węglany metali alkalicznych, takie jak kwaśny węglan sodu i kwaśny węglan potasu, alkoksylany metali alkalicznych, takie jak metanolan litu, metanolan sodu, etanolan sodu i t-butanolan potasu oraz aminy organiczne, takie jak trietyloamina, tributyloamina, N-metylomorfolina, pirydyna, 4-dimetyloaminopirydyna, pikolina, lutydyna, kolidyna, 1,5-diazabicyklo[4.3.0]-5-nonen i 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-7-undecen. Spośród nich korzystne są organiczne aminy, a z nich szczególnie korzystne trietyloamina, tributyloamina, pirydyna i lutydyna. Jeśli jest zastosowana amina w postaci ciekłej, to również może służyć jako rozpuszczalnik, jeśli jest użyta w znacznym nadmiarze.

Jeśli reakcją estryfikowania jest reakcja wprowadzania estru fosforanowego, to może być również przeprowadzana poprzez poddanie reakcji związku (III) z fosforynem mającym żądaną resztę estrową w obojętnym rozpuszczalniku w obecności kwasu lub zasady i utlenienie mieszaniny reakcyjnej do odpowiedniego estru fosforanowego reagentem utleniającym.

Jako fosforyn może być użyty związek przedstawiony wzorem (R⁷O)2-P-Z, w którym r7 oznacza grupę C6.20 alkilową, a Z oznacza atom halogenu lub związek przedstawiony wzorem -N(R⁸)2 (w którym R⁸ oznacza niższą grupę C₆-20 alkilową).

Jeśli w powyższym wzorze Z oznacza atom halogenu, stosowana jest zasada jako katalizator, a przykłady użytecznych zasad są podobne do tych zilustrowanych powyżej. Z drugiej strony jeśli Z nie oznacza atomu halogenu, kwas jest stosowany jako katalizator. Jakikolwiek kwas może być użyty, pod warunkiem, że wykazuje kwasowość tak wysoką jak kwas octowy. Korzystny jest tetrazol.

Przykłady reagentów utleniających użytecznych w powyższej reakcji obejmują kwas metachloronadbenzoesowy, wodoronadtlenek t-butylu i kwas nadoctowy, z których kwas metachloronadbenzoesowy jest korzystny.

Nie ma szczególnego ograniczenia co do obojętnego rozpuszczalnika stosowanego w powyższej reakcji, pod warunkiem, że jest nie reaktywny względem reakcji. Przykłady obejmują węglowodory, takie jak heksan, benzen i toluen, halogenowane węglowodory, takie jak dichlorometan, chloroform, czterochlorek węgla i 1,2-dichloroetan, etery, takie jak eter, tetrahydrofuran i dioksan, ketony, takie jak aceton i keton metylowoetylowy, nitryle, takie jak acetonitryl, amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid, N,N-dimetyloacetamid, N-metylo-2-pirolidon i heksametyloamid kwasu fosforowego oraz sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu oraz ich mieszaniny. Spośród nich korzystne są węglowodory i amidy.

Aczkolwiek temperatura reakcji jest zróżnicowana w zależności od rodzaju związku wyjściowego (III), fosforynu i rozpuszczalnika, to zwykle wynosi od -10°C do 100°C (korzystnie 0 do 50°C). Czas reakcji jest zróżnicowany w zależności od temperatury i tym podobnych, ale wynosi od 10 minut do 2 dni (korzystnie 30 minut do 10 godzin).

Estryfikowanie może być również przeprowadzone poprzez poddanie reakcji związku (III) z kwasem karboksylowym mającym żądaną resztę estrową w obojętnym rozpuszczalniku w obecności reagenta kondensującego.

Przykłady reagenta kondensującego użytecznego w powyższej reakcji obejmują karbodiimidy, takie jak dicykloheksylokarbodiimid, karbonylodiimidazol i chlorowodorek 1-(N,N-dimetyloaminopropylo)-3-metylo-karbodiimidu, z których korzystny jest dicykloheksylokarbodiimid.

PL 200 426 B1

Nie ma szczególnego ograniczenia co do obojętnego rozpuszczalnika stosowanego w powyższej reakcji, pod warunkiem, że jest nie reaktywny względem reakcji. Przykłady obejmują węglowodory, takie jak heksan, benzen i toluen, halogenowane węglowodory, takie jak dichlorometan, chloroform, czterochlorek węgla i 1,2-dichloroetan, etery, takie jak eter, tetrahydrofuran i dioksan, ketony, takie jak aceton i keton mety-lowoetylowy, nitryle, takie jak acetonitryl, amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid, N,N-dimetyloacetamid, N-metylo-2-pirolidon i heksametyloamid kwasu fosforowego oraz sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu, oraz ich mieszaniny. Spośród nich korzystne są halogenowane węglowodory i amidy.

Aczkolwiek temperatura reakcji jest zróżnicowana w zależności od rodzaju związku wyjściowego (III), kwasu karboksylowego i rozpuszczalnika, to zwykle wynosi od -10°C do 100°C (korzystnie 0 do 50°C). Czas reakcji jest zróżnicowany w zależności od temperatury i tym podobnych, ale wynosi zwykle od 10 minut do 2 dni (korzystnie 30 minut do 10 godzin).

Po zakończeniu reakcji żądany związek w każdej z reakcji jest wydzielany z mieszaniny reakcyjnej sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Żądany związek może być otrzymany na przykład poprzez odsączenie jakichkolwiek nierozpuszczalnych materiałów, jeśli konieczne, a następnie oddestylowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem lub poprzez oddestylowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, dodanie wody do pozostałości, ekstrahowanie mieszaniny rozpuszczalnikiem nie mieszającym się z wodą, takim jak octan etylu, wysuszenie siarczanem magnezu lub podobnym, a następnie oddestylowanie rozpuszczalnika. Jeśli konieczne, uzyskany produkt może być dalej oczyszczany sposobem znanym specjalistom w dziedzinie, na przykład drogą krystalizacji, chromatografii kolumnowej lub tym podobnych.

Aczkolwiek żądane odbezpieczenie grupy zabezpieczającej hydroksyl jest zróżnicowane w zależności od rodzaju grupy zabezpieczającej, to jest przeprowadzane sposobem ogólnie znanym w syntetycznej chemii organicznej.

Jeśli grupą zabezpieczająca hydroksyl jest „grupa aralkilowa” lub „grupa aralkiloksykarbonylowa”, odbezpieczenie jest przeprowadzane poprzez zetknięcie odpowiedniego związku z reagentem redukującym (łącznie z redukcją katalityczną) lub reagentem utleniającym w obojętnym rozpuszczalniku.

Nie ma szczególnego ograniczenia co do obojętnego rozpuszczalnika stosowanego w usuwaniu drogą redukcji katalitycznej, pod warunkiem, że jest nie reaktywny względem reakcji.

Przykłady obejmują alkohole, takie jak metanol i etanol, etery, takie jak eter dietylowy, tetrahydrofuran i dioksan, węglowodory aromatyczne, takie jak toluen benzen i ksylen, węglowodory alifatyczne, takie jak heksan i cykloheksan oraz estry, takie jak octan etylu i octan propylu oraz kwasy alifatyczne, takie jak kwas octowy, oraz mieszaniny wyżej podanych rozpuszczalników i wody, z których alkohole są korzystne.

Aczkolwiek nie ma szczególnego ograniczenia co do katalizatora użytecznego w powyższej reakcji (pod warunkiem, że jest zwykle stosowany do redukcji katalitycznej), to przykłady obejmują pallad na węglu, nikiel Raneya, tlenek platyny, czerń platynową, rod na tlenku glinu, trifenylofosfinachlorek rodu i pallad na siarczanie baru, z których korzystny jest pallad na węglu.

Aczkolwiek nie ma szczególnego ograniczenia co do ciśnienia wodoru, to zwykle ono jest większe od 1 do 10 razy od ciśnienia atmosferycznego (korzystnie 1 do 3 razy od ciśnienia atmosferycznego).

Aczkolwiek temperatura reakcji jest zróżnicowana w zależności od rodzaju substancji wyjściowej, rozpuszczalnika i katalizatora, to zwykle temperatura reakcji wynosi od -20°C do 100°C (korzystnie 0 do 50°C), a czas reakcji zwykle wynosi od 30 minut do 10 godzin (korzystnie 1 do 5 godzin).

Nie ma szczególnego ograniczenia co do obojętnego rozpuszczalnika stosowanego w trakcie odbezpieczania reagentem utleniającym, pod warunkiem, że jest nie reaktywny względem reakcji. Przykłady obejmują ketony, takie jak aceton, halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu, chloroform i czterochlorek węgla, nitryle, takie jak acetonitryl, etery, takie jak eter dietylowy, tetrahydrofuran i dioksan, amidy, takie jak dimetyloformamid, dimetyloacetamid i heksametyloamid kwasu fosforowego, oraz sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; oraz ich mieszaniny. Spośród nich korzystne są amidy i sulfotlenki.

Nie ma szczególnego ograniczenia dotyczącego reagenta utleniającego użytecznego w powyższej reakcji, pod warunkiem, że może być wykorzystywany do utleniania. Przykłady obejmują nadsiarczany metali alkalicznych, takie jak nadsiarczan potasu i nadsiarczan sodu, azotan cerowo-amonowy (CAN) i 2,3-dichloro-5,6-dicyjano-p-benzochinon (DDQ), z których azotan cerowo-amonowy (CAN) i 2,3-dichloro-5,6-dicyjano-p-benzochinon (DDQ) są korzystne.

PL 200 426 B1

Aczkolwiek temperatura reakcji i czas reakcji są zróżnicowane w zależności od rodzaju substancji wyjściowej, rozpuszczalnika i katalizatora, to zwykle temperatura reakcji wynosi od -10°C do 150°C (korzystnie 0 do 50°C), a czas reakcji zwykle wynosi od 10 minut do 24 godzin (korzystnie 30 minut do 10 godzin).

Jeśli grupą zabezpieczającą hydroksyl jest grupa t-butylowa, grupa t-butoksykarbonylowa, „grupa alkoksymetylowa”, „grupa tetrahydropiranylowa lub tetrahydrotiopiranylowa” lub „grupa tetrahydrofuranylowa lub tetrahydrotiofuranylowa”, odbezpieczenie jest przeprowadzane poprzez poddanie reakcji odpowiedniego związku z kwasem w obojętnym rozpuszczalniku.

Nie ma szczególnego ograniczenia co do obojętnego rozpuszczalnika stosowanego w powyższej reakcji, pod warunkiem, że jest nie reaktywny względem reakcji.

Przykłady obejmują węglowodory, takie jak heksan i benzen, halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu, chloroform i czterochlorek węgla, estry, takie jak octan etylu, ketony, takie jak aceton i keton metylowoetylowy, alkohole, takie jak metanol i etanol, etery, takie jak eter, tetrahydrofuran i dioksan; i ich mieszaniny z wodą. Spośród nich korzystne są estry, etery i halogenowane węglowodory.

Przykłady kwasu użytecznego w powyższej reakcji obejmują kwasy nieorganiczne, takie jak chlorowodór, kwas azotowy, kwas solny i kwas siarkowy oraz kwasy organiczne, takie jak kwas octowy, kwas trifluorooctowy, kwas metanosulfonowy i kwas p-toluenosulfonowy oraz kwasy Lewisa, takie jak trifluorek boru; kwasy nieorganiczne i kwasy organiczne są korzystne, a kwas solny, kwas siarkowy i kwas trifluorooctowy są szczególnie korzystne.

Temperatura reakcji zwykle wynosi od -10°C do 100°C (korzystnie -5 do 50°C). Aczkolwiek czas reakcji jest zróżnicowany w zależności od temperatury reakcji i tym podobnych, to wynosi zwykle od 5 minut do 48 godzin (korzystnie 30 minut do 10 godzin).

Jeśli grupą zabezpieczająca hydroksyl jest „grupa sililowa”, odbezpieczenie może być przeprowadzone poprzez poddanie reakcji odpowiedniego związku ze związkiem zawierającym anion fluorkowy, takim jak fluorek tetrabutyloamoniowy, w obojętnym rozpuszczalniku.

Nie ma szczególnego ograniczenia co do obojętnego rozpuszczalnika stosowanego w powyższej reakcji, pod warunkiem, że jest nie reaktywny względem reakcji. Przykłady obejmują węglowodory, takie jak heksan i benzen, halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu, chloroform i czterochlorek węgla, estry, takie jak octan etylu, ketony, takie jak aceton i keton metylowoetylowy i etery, takie jak eter, tetrahydrofuran i dioksan; oraz ich mieszaniny z wodą. Spośród nich korzystne są etery.

Aczkolwiek nie ma szczególnych ograniczeń dotyczących temperatury reakcji, to temperatura reakcji zwykle wynosi od -10°C do 50°C (korzystnie 0 do 30°C), a czas reakcji zwykle wynosi od 2 godzin do 24 godzin (korzystnie 10 do 18 godzin).

Po zakończeniu reakcji żądany związek z tej reakcji jest wydzielany z mieszaniny reakcyjnej sposobem znanym specjalistom w dziedzinie.

Żądany związek może być otrzymany na przykład poprzez zobojętnienie mieszaniny reakcyjnej, jeśli konieczne, odsączenie jakichkolwiek nierozpuszczalnych materiałów, dodanie do przesączu rozpuszczalnika nie mieszającego się z wodą, takiego jak octan etylu, przemycie uzyskanej mieszaniny wodą i oddestylowanie rozpuszczalnika. Jeśli konieczne, uzyskany produkt może być dalej oczyszczany sposobem znanym specjalistom w dziedzinie, na przykład drogą krystalizacji, chromatografii kolumnowej lub tym podobnych.

Jeśli żądane, grupa hydroksylowa uzyskanego związku może być estryfikowana lub zabezpieczana.

Estryfikowanie związku (II) z użyciem 1 do 3 równoważników molowych reagenta estryfikującego może wytworzyć mieszaninę związki mającego 1 do 3 zestryfikowanych grup hydroksylowych. Poprzez wydzielenie związku z mieszaniny za pomocą chromatografii kolumnowej lub podobnej, a następnie zabezpieczenie jego grupy hydroksylowej, jeśli żądane, dostępny jest również związek (Ic).

(Sposób B)

Sposób B stosuje się do otrzymywania pochodnej estrowej związku (la). Za pomocą tego sposobu może być otrzymany związek (Id), w którym R² oznacza grupę metylową, reszta estrowa -O- jest obecna w pozycji 2', grupa hydroksylowa lub reszta estrowa -O- jest obecna w pozycji 2 i grupa hydroksylowa lub reszta estrowa -O- jest obecna w pozycji 3.

PL 200 426 B1

w którym R¹ i X mają te same znaczenia jak ujawnione powyżej, R³d oznacza resztę estrową, R⁴b oznacza atom wodoru lub resztę estrową i R5d oznacza atom wodoru lub resztę estrową.

Etap B1 stosuje się do otrzymywania związku o wzorze (IIla). Etap ten jest przeprowadzany poddając reakcji związek o wzorze (lla) z reagentem acetonidowym w obojętnym rozpuszczalniku w obecności katalizatora kwasowego.

Przykłady reagenta acetonidowego użytecznego w powyższej reakcji obejmują aceton, metoksyizopropen i 2,2-dimetoksypropan, z których aceton i 2,2-dimetoksypropan są korzystne.

Przykłady kwasu użytecznego w powyższej reakcji obejmują kwasy nieorganiczne, takie jak chlorowodór, kwas azotowy, kwas solny i kwas siarkowy oraz kwasy organiczne, takie jak kwas octowy, kwas trifluorooctowy, kwas metanosulfonowy i kwas p-toluenosulfonowy, oraz kwasy Lewisa, takie jak trifluorek boru, oraz żywice kwaśne, takie jak Amberlyst 15, z których kwasy organiczne i żywice kwaśne są korzystne, a kwas p-toluenosulfonowy i Amberlyst 15 są bardziej korzystne.

Temperatura reakcji zwykle wynosi od -10°C do 100°C (korzystnie 0 do 50°C). Aczkolwiek czas reakcji jest zróżnicowany w zależności od temperatury reakcji i tym podobnych, to wynosi zwykle od 1 godziny do 7 dni (korzystnie 10 godzin do 3 dni).

Po zakończeniu reakcji żądany związek z tej reakcji jest wydzielany z mieszaniny reakcyjnej sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Żądany związek może być otrzymany na przykład poprzez zobojętnienie mieszaniny reakcyjnej, jeśli konieczne, odsączenie jakichkolwiek nie rozpuszczal24

PL 200 426 B1 nych materiałów, dodanie do przesączu rozpuszczalnika nie mieszającego się z wodą, takiego jak octan etylu, przemycie uzyskanej mieszaniny wodą i oddestylowanie rozpuszczalnika. Jeśli konieczne, uzyskany produkt może być dalej oczyszczany sposobem znanym specjalistom w dziedzinie, na przykład drogą krystalizacji, rozpuszczenia i wytrącenia, chromatografii kolumnowej lub tym podobnych.

Etap B2 stosuje się do otrzymywania związku przedstawionego wzorem (Id). Etap ten jest realizowany poprzez estryfikowanie związku (Ula), usunięcie grupy izopropylidenowej z estryfikowanego związku, a następnie estryfikowanie grupy hydroksylowej, jeśli żądane.

Estryfikowanie jest przeprowadzane jak w odpowiadającej reakcji ujawnionej w etapie A2, natomiast reakcja usuwania grupy izopropylidenowej jest przeprowadzana poprzez poddanie reakcji odpowiedniego związku z kwasem w etapie B1, stosując jako obojętny rozpuszczalnik wodę, alkohol, taki jak metanol lub etanol lub wodny alkohol.

(Sposób C)

Sposób C stosuje się do otrzymywania pochodnej estrowej związku (la). Za pomocą tego sposobu może być otrzymany związek (le), w którym R² oznacza grupę metylową, zabezpieczona lub nie zabezpieczona grupa hydroksylowa lub reszta estrowa -O- jest obecna w pozycji 2 i zabezpieczona lub nie zabezpieczona grupa hydroksylowa lub reszta estrowa -O- jest obecna w pozycji 3.

Sposób C

w którym R¹ i X mają te same znaczenia jak ujawnione powyżej, R³e oznacza atom wodoru, grupę zabezpieczająca hydroksyl lub resztę estrową i R5_e oznacza atom wodoru, grupę zabezpieczającą hydroksyl lub resztę estrową, pod warunkiem, że R3_e i R5_g nie oznaczają jednocześnie atomu wodoru ani grupy zabezpieczającej hydroksyl.

Etap C1 stosuje się do otrzymywania związku (le) i etap ten jest realizowany poprzez estryfikowanie związku o wzorze (llb) i, jeśli żądane, zabezpieczenie grupy hydroksylowej.

Estryfikacja jest przeprowadzana jak w odpowiadającej reakcji ujawnionej w etapie A2. Mieszanina monoestrów może być otrzymana z użyciem reagenta estryfikującego w ilości około 1 równoważnika molowego. Zastosowanie reagenta estryfikującego w ilości około 2 równoważników molowych dostarcza diester.

Reakcja zabezpieczania hydroksylu jest przeprowadzana w sposób podobny do ujawnionego w etapie A1.

(Sposób D)

Sposób D stosuje się do otrzymywania pochodnej estrowej związku (la). Za pomocą tego sposobu może być otrzymany związek (If) mający zabezpieczoną lub nie zabezpieczoną grupę hydroksyPL 200 426 B1 lową lub resztę estrową w pozycji 2', zabezpieczoną lub nie zabezpieczoną grupę hydroksylową lub resztę estrową w pozycji 3', zabezpieczoną lub nie zabezpieczoną grupę hydroksylową lub resztę estrową -O- w pozycji 2 i zabezpieczoną lub nie zabezpieczoną grupę hydroksylową lub resztę estrową-O- w pozycji 3.

Sposób D

w którym R¹ i X mają te same znaczenia jak ujawnione powyżej, R²a oznacza atom wodoru, grupę zabezpieczającą hydroksyl lub resztę estrową, R³f oznacza atom wodoru, grupę zabezpieczającą hydroksyl lub resztę estrową, R⁴C oznacza atom wodoru, grupę zabezpieczającą hydroksyl lub resztę estrową i R⁵f oznacza atom wodoru, grupę zabezpieczającą hydroksyl lub resztę estrową, pod warunkiem, że wszystkie R _a, R 3, R _a i R _f nie oznaczają jednocześnie atomu wodoru ani grupy zabezpieczającej hydroksyl.

Etap D1 stosuje się do otrzymywania związku (If). Może być realizowany poprzez zabezpieczenie fragmentu diolowego związku mającego wzór (lic) grupą izopropylidenową, estryfikowanie uzyskanego związku, usuniecie grupy izopropylidenowej z estryfikowanego związku, a następnie estryfikowanie lub zabezpieczanie grupy hydroksylowej, jeśli żądane.

Zabezpieczenie fragmentu diolowego grupą izopropylidenową jest przeprowadzane w podobny sposób do tego w etapie B1. Zastosowanie około 1 równoważnika molowego dostarcza mieszaninę związku zabezpieczonego w pozycjach 2' i 3' oraz związku zabezpieczonego w pozycjach 2 i 3. Mieszanina może być łatwo rozdzielona na przykład za pomocą chromatografii kolumnowej.

Estryfikacja jest przeprowadzana w podobny sposób do odpowiadającej reakcji w etapie A2. Zastosowanie reagenta estryfikującego w ilości około 1 równoważnika molowego dostarcza mieszaninę monoestrów. Mieszanina ta może być łatwo rozdzielona na przykład za pomocą chromatografii kolumnowej. Zastosowanie reagenta estryfikującego w ilości około 2 równoważników molowych dostarcza diester.

Reakcja usuwania grupy izopropylidenowej jest przeprowadzana w podobny sposób do odpowiadającej reakcji w etapie B2.

Estryfikowanie uzyskanego związku, które jest przeprowadzane, jeśli żądane, jest przeprowadzane w podobny sposób do odpowiadającej reakcji w etapie A2. Zastosowanie reagenta estryfikującego w ilości około 1 równoważnika molowego dostarcza mieszaninę monoestrów. Mieszanina ta może być łatwo rozdzielona na przykład za pomocą chromatografii kolumnowej. Zastosowanie reagenta estryfikującego w ilości około 2 równoważników molowych dostarcza diester. Reakcja zabez26

PL 200 426 B1 pieczania hydroksylu w związku tak otrzymanym jest przeprowadzana w podobny sposób jak w etapie A1. Zastosowanie reagenta estryfikującego w ilości około 1 równoważnika molowego dostarcza mieszaninę związków, z których każdy ma jedną zabezpieczoną grupę hydroksylową. Mieszanina ta może być łatwo rozdzielona na przykład za pomocą chromatografii kolumnowej. Zastosowanie reagenta estryfikującego w ilości około 2 równoważników molowych dostarcza związek mający dwie zabezpieczone grupy hydroksylowe.

Związek (If) jest również dostępny poprzez estryfikowanie związku o wzorze (IIc) 1 do 4 równoważników molowych reagenta estryfikującego, rozdzielenie mieszaniny na przykład za pomocą chromatografii kolumnowej i, jeśli żądane, zabezpieczenie grupy hydroksylowej.

(Sposób E)

Sposób E stosuje się do otrzymywania pochodnej eterowej o wzorze (Ig) i (Ih) związku (la).

Sposób E

PL 200 426 B1 w którym R¹ i X mają te same znaczenia jak ujawnione powyżej, R¹⁰ oznacza wyżej ujawnioną resztę eterową i L oznacza grupę zabezpieczającą atom azotu reszty uracylowej.

Etap E1 stosuje się do otrzymywania związku przedstawionego wzorem (IV) poprzez poddanie reakcji związku o wzorze (IIla) z alkilującym reagentem zabezpieczającym przedstawionym wzorem LY (w którym L i M mają te same znaczenia jak ujawnione powyżej) w obojętnym rozpuszczalniku w obecności zasady.

Przykłady alkilujących reagentów zabezpieczających (LY) użytecznych w powyższej reakcji obejmują chlorek 4-metoksybenzyloksymetylu, chlorek piwaloiloksymetylu i chlorek acetoksymetylu, z których chlorek 4-metoksybenzyloksymetylu jest korzystny.

Przykłady zasad użytecznych w powyższej reakcji obejmują aminy trzeciorzędowe, takie jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-7-undecen (DBU) i 1,5-diazabicyklo[4.3.0]-5-nonen (DBN) oraz wodorki metali alkalicznych, takie jak wodorek sodu i wodorek potasu, z których korzystny jest 1,8-diazabicyklo-[5.4.0]-7-undecen (DBU).

Przykłady rozpuszczalników użytecznych w powyższej reakcji obejmują etery, takie jak eter dietylowy, tetrahydrofuran i dioksan oraz amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid i N,N-dimetyloacetamid, z których korzystny jest N.N-dimetyloformamid.

Temperatura reakcji zwykle wynosi od -30 do 100°C (korzystnie -10 do 30°C). Aczkolwiek czas reakcji zmienia się z temperaturą reakcji i tym podobnymi, to zwykle wynosi od 30 minut do 1 dnia (korzystnie 1 godzina do 5 godzin).

Po zakończeniu reakcji żądany związek z tej reakcji jest wydzielany z mieszaniny reakcyjnej sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Żądany związek może być otrzymany na przykład poprzez zobojętnienie mieszaniny reakcyjnej, jeśli konieczne, odsączenie jakichkolwiek nie rozpuszczalnych materiałów, dodanie do przesączu rozpuszczalnika nie mieszającego się z wodą, takiego jak octan etylu lub chlorek metylenu, przemycie uzyskanej mieszaniny rozcieńczonym roztworem kwasu solnego, wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu lub nasyconą solanką, wysuszenie bezwodnym siarczanem magnezu lub bezwodnym siarczanem sodu i oddestylowanie rozpuszczalnika. Jeśli konieczne, uzyskany produkt może być dalej oczyszczany sposobem znanym specjalistom w dziedzinie, na przykład drogą krystalizacji, rozpuszczenia i wytrącenia, chromatografii kolumnowej lub tym podobnych.

Etap E2 stosuje się do otrzymywania związku o wzorze (V) poprzez poddanie reakcji związku o wzorze (IV) z reagentem alkilującym mającym żądaną resztę eterową w obojętnym rozpuszczalniku w obecności zasady.

Przykłady środków alkilujących użytecznych w powyższej reakcji obejmują halogenki alkilowe i triflany alkilowe, z których jodek alkilowy jest korzystny.

Przykłady rozpuszczalników użytecznych w powyższej reakcji o-bejmują etery, takie jak eter dietylowy, tetrahydrofuran i dioksan oraz amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid i N,N-dimetyloacetamid, z których korzystny jest N,N-dimetyloformamid.

Temperatura reakcji zwykle wynosi od -30 do 100°C (korzystnie -10 do 30°C). Aczkolwiek czas reakcji zmienia się z temperaturą reakcji i tym podobnymi, to zwykle wynosi od 1 godziny do 2 dni (korzystnie 1 godzina do 10 godzin).

Po zakończeniu reakcji żądany związek z tej reakcji jest wydzielany z mieszaniny reakcyjnej sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Żądany związek może być otrzymany na przykład poprzez zobojętnienie mieszaniny reakcyjnej, jeśli konieczne, odsączenie jakichkolwiek nierozpuszczalnych materiałów, dodanie do przesączu rozpuszczalnika nie mieszającego się z wodą, takiego jak octan etylu lub chlorek metylenu, przemycie uzyskanej mieszaniny rozcieńczonym roztworem kwasu solnego, wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu lub nasyconą solanką, wysuszenie bezwodnym siarczanem magnezu lub bezwodnym siarczanem sodu i oddestylowanie rozpuszczalnika. Jeśli konieczne, uzyskany produkt może być dalej oczyszczany sposobem znanym specjalistom w dziedzinie, na przykład drogą krystalizacji, rozpuszczenia i wytrącenia, chromatografii kolumnowej lub tym podobnych.

Etap E3 stosuje się do otrzymywania związku o wzorze (Ig) poprzez poddanie reakcji związku o wzorze (V) z reagentem zdolnym do odbezpieczenia zabezpieczonej reszty uracylowej w obojętnym rozpuszczalniku.

PL 200 426 B1

Jeśli grupą zabezpieczającą zawartą w reszcie uracylowej we wzorze (V) jest grupa 4-metoksybenzyloksymetylowa, to przykłady reagenta odbezpieczającego użytecznego w tej reakcji obejmują 2,3-dichloro-5,6-dicyjano-1,4-benzochinon (DDQ) lub azotan cerowo-(IV)-amonowy (CAN) [korzystnie 2,3-dichloro-5,6-dicyjano-1,4-benzochinon (DDQ)], a natomiast przykłady użytecznych rozpuszczalników obejmują wodę, alkohole, takie jak metanol i etanol oraz halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu i chloroform, oraz ich mieszaniny (korzystnie mieszanka rozpuszczalników chlorku metylenu i wody).

Temperatura reakcji zwykle wynosi od 0 do 150°C (korzystnie 10 do 100°C). Aczkolwiek czas reakcji zmienia się z temperaturą reakcji i tym podobnymi, to zwykle wynosi od 1 godziny do 2 dni (korzystnie 1 godzina do 10 godzin).

Jeśli grupą zabezpieczającą zawartą w grupie uracylowej we wzorze (V) jest grupa piwaloiloksymetylowa lub acetoksymetylowa, to przykłady reagentów odbezpieczających użytecznych w tej reakcji obejmują wodorotlenki metali alkalicznych, takie jak wodorotlenek sodu i potasu, węglany metali alkalicznych, takie jak węglan sodu i węglan potasu, wodny amoniak oraz aminy, takie jak metyloamina i etyloamina (korzystnie wodorotlenek sodu lub węglan potasu).

Przykłady rozpuszczalników obejmują wodę, alkohole, takie jak metanol i etanol, etery, takie jak dioksan i tetrahydrofuran oraz ich mieszaniny (korzystnie mieszanki rozpuszczalników - alkoholi i eterów z wodą). Temperatura reakcji zwykle wynosi od 0 do 100°C (korzystnie 10 do 50°C). Aczkolwiek czas reakcji zmienia się z temperaturą i tym podobnymi, to zwykle wynosi od 10 minut do 1 dnia (korzystnie 1 godzina do 10 godzin).

Po zakończeniu reakcji żądany związek z tej reakcji jest wydzielany z mieszaniny reakcyjnej sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Żądany związek może być otrzymany na przykład poprzez zobojętnienie mieszaniny reakcyjnej, jeśli konieczne, odsączenie jakichkolwiek nierozpuszczalnych materiałów, dodanie do przesączu rozpuszczalnika nie mieszającego się z wodą, takiego jak octan etylu lub chlorek metylenu, przemycie uzyskanej mieszaniny rozcieńczonym roztworem kwasu solnego, wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu lub nasyconą solanką, jeśli konieczne, wysuszenie bezwodnym siarczanem magnezu lub bezwodnym siarczanem sodu i oddestylowanie rozpuszczalnika. Jeśli konieczne, uzyskany produkt może być dalej oczyszczany sposobem znanym specjalistom w dziedzinie, na przykład drogą krystalizacji, rozpuszczenia i wytrącenia, chromatografii kolumnowej lub tym podobnych.

Etap E4 stosuje się do otrzymywania związku o wzorze (lh) poprzez poddanie reakcji związku o wzorze (Ig) z katalizatorem kwasowym w obojętnym rozpuszczalniku.

Przykłady katalizatora kwasowego obejmują kwasy nieorganiczne, takie jak kwas solny, kwas siarkowy i kwas azotowy, kwasy organiczne, takie jak kwas octowy, kwas trifluorooctowy, kwas trichlorooctowy, kwas metanosulfonowy i kwas p-toluenosulfonowy, kwasy Lewisa, takie jak trifluorek boru oraz żywice kwaśne, takie jak Amberlyst 15, z których kwas octowy, kwas trifluorooctowy, kwas p-toluenosulfonowy i Amberlyst 15 są korzystne.

Przykłady rozpuszczalników obejmują wodę, alkohole, takie jak metanol i etanol, oraz etery, takie jak dioksan i tetrahydrofuran i mieszanki rozpuszczalników - alkoholu lub eteru z wodą, z których korzystny jest metanol.

Temperatura reakcji zwykle wynosi od 0 do 150°C (korzystnie 10 do 80°C). Aczkolwiek czas reakcji jest zróżnicowany w zależności od temperatury reakcji i tym podobnych, to wynosi zwykle od 1 godziny do 2 dni (korzystnie 3 godziny do 1 dnia).

Po zakończeniu reakcji żądany związek z tej reakcji jest wydzielany z mieszaniny reakcyjnej sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Żądany związek może być otrzymany na przykład poprzez zobojętnienie mieszaniny reakcyjnej, jeśli konieczne, odsączenie jakichkolwiek nierozpuszczalnych materiałów, dodanie do przesączu rozpuszczalnika nie mieszającego się z wodą, takiego jak octan etylu lub chlorek metylenu, przemycie uzyskanej mieszaniny rozcieńczonym roztworem kwasu solnego, wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu lub nasyconą solanką i następnie oddestylowanie rozpuszczalnika. Jeśli konieczne, uzyskany produkt może być dalej oczyszczany sposobem znanym specjalistom w dziedzinie, na przykład drogą krystalizacji, rozpuszczenia i wytrącenia, chromatografii kolumnowej lub tym podobnych.

Związek (Ih) tak otrzymany może być przekształcony w odpowiedni związek hydroksyzabezpieczony, pochodną estrową lub pochodną N-alkilokarbamoilową według któregokolwiek ze sposobów A do D oraz ujawnionego poniżej sposobu F.

PL 200 426 B1 (Sposób F)

Sposób F stosuje się do otrzymywania pochodnej N-alkilokarbamoilowej związku (la) według wynalazku.

Sposób F

w którym R¹ i X mają te same znaczenia jak ujawnione powyżej, każdy R¹¹ i R¹² niezależnie oznacza resztą N-alkilową wyżej ujawnionej grupy N-alkilokarbamoilowej i Bz oznacza grupą benzoilową.

Etap F1 stanowi etap otrzymywania związku o wzorze (VI) poprzez poddanie reakcji związku o wzorze (II) w reagentem benzoilującym w obojętnym rozpuszczalniku w obecności zasady.

Przykłady reagentów benzoilujących obejmują chlorek benzoilu, bromek benzoilu i bezwodnik benzoilowy, z których bezwodnik benzoilowy jest korzystny.

Przykłady zasad użytecznych w powyższej reakcji obejmują aminy organiczne, takie jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-7-undecen (DBU) i 1,5-diazabicyklo[4.3.0]-5-nonen (DBN), pirydyna i 4-dimetyloaminopirydyna oraz wodorki metali alkalicznych, takie jak wodorek sodu i wodorek potasu, z których korzystne są pirydyna i 4-dimetyloaminopirydyna.

PL 200 426 B1

Przykłady rozpuszczalników użytecznych w powyższej reakcji obejmują etery, takie jak eter dietylowy, tetrahydrofuran i dioksan, amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid i N,N-dimetyloacetamid, halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu i chloroform oraz pirydynę, z których korzystna jest pirydyna.

Temperatura reakcji zwykle wynosi od -30 do 100°C (korzystnie -10 do 30°C). Aczkolwiek czas reakcji zmienia się z temperaturą reakcji i tym podobnymi, to zwykle wynosi od 30 minut do 1 dnia (korzystnie 1 godzina do 10 godzin).

Po zakończeniu reakcji żądany związek z tej reakcji jest wydzielany z mieszaniny reakcyjnej sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Żądany związek może być otrzymany na przykład poprzez zobojętnienie mieszaniny reakcyjnej, jeśli konieczne, odsączenie jakichkolwiek nierozpuszczalnych materiałów, dodanie do przesączu rozpuszczalnika nie mieszającego się z wodą, takiego jak octan etylu lub chlorek metylenu, przemycie uzyskanej mieszaniny rozcieńczonym roztworem kwasu solnego, wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu lub nasyconą solanką, jeśli konieczne, wysuszenie bezwodnym siarczanem magnezu lub bezwodnym siarczanem sodu, a następnie oddestylowanie rozpuszczalnika.

Jeśli konieczne, uzyskany produkt może być dalej oczyszczany sposobem znanym specjalistom w dziedzinie, na przykład drogą krystalizacji, rozpuszczenia i wytrącenia, chromatografii kolumnowej lub tym podobnych.

Etap F2 stanowi etap otrzymywania związku o wzorze (VII) poprzez poddanie reakcji związku o wzorze (VI) z kwasem nitrozylosiarkowym w 0 do 30°C w obojętnej mieszance rozpuszczalników, chlorku metylenu i wody, a następnie poddanie reakcji diazometanu z mieszaniną reakcyjną w 0 do 30°C w chlorku metylenu.

Etap F3 stanowi etap otrzymywania związku o wzorze (li) poprzez poddanie reakcji związku o wzorze (VII) z aminą w obojętnym rozpuszczalniku.

Przykłady rozpuszczalników użytecznych w powyższej reakcji obejmują wodę, alkohole, takie jak metanol i etanol oraz amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid i N,N-dimetyloacetamid, z których alkohole są korzystne.

Temperatura reakcji zwykle wynosi od 0 do 100°C (korzystnie 10 do 60°C). Aczkolwiek czas reakcji zmienia się z temperaturą reakcji i tym podobnymi, to zwykle wynosi od 30 minut do 1 dnia (korzystnie 1 godzina do 10 godzin).

Tak otrzymany związek (li) może być przekształcony w odpowiedni związek hydroksyzabezpieczony, pochodna estrową lub pochodną eterową według któregokolwiek z wyżej ujawnionych sposobów A do E.

PL 200 426 B1

Niniejszy wynalazek również dostarcza:

(1) związek A-500359A przedstawiony następującym wzorem (XI):

lub jego sól;

(2) związek A-500359F przedstawiony następującym wzorem (XII):

lub jego sól;

(3) pochodną amidową związku A-500359F przedstawioną następującym wzorem (XIII):

lub jego sól;

PL 200 426 B1 (4) związek A-500359Hprzedstawionynastępującym wzorem

lub jmgn sól;

(5) zziązmA A-50035HJ urzmSstsoinay następującym ozorem (XV):

lub jmgn sól;

(6) zziązmA A-50035HM-3 urzkSstsoinan następującym ozorem

lub jmgn sól;

PL 200 426 B1 (7) sposób otrzymywania związku ujawnionego w (1), (2), (4) lub (5) poprzez hodowanie mikroorganizmu zdolnego do wytwarzania wymienionego związku, należącego do Streptomyces spp. i wydzielanie związku z bulionu hodowlanego;

(8) sposób ujawniony w (7), w którym mikroorganizm należący do spp. i zdolny do wytwarzania związku stanowi Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) i jest zdolny do wytwarzania związków ujawnionych w (1), (2) (4) lub (5);

(9) mikroorganizm, który należy do Streptomyces spp. i jest zdo^y do wytwarzania związku ujawnionego w (1), (2), (4) lub (5);

(10) mikroorganizm uja^wni^ny w (9), którym jest Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420);

(11) sposób otrzymywania związku ujawnionego w (1), (2), (4) lub (5) poprzez hodowanie mikroorganizmu (który należy do Streptomyces spp. i jest zdolny do wytwarzania związku) z użyciem, indywidualnie lub w kombinacji, S-(2-aminoetylo)-L-cysteiny, jej soli i L-alliloglicyny jako dodatku do środowiska i wydzielanie związku ujawnionego w (1), (2), (4) lub (6) z bulionu hodowlanego;

(12) kompozycja do leczenia lub zapobiegania chorobom infekcyjnym, która zawiera związek ujawniony w (1), (2), (3), (4), (5) lub (6) lub jego farmakologicznie dopuszczalną sól jako składnik aktywny;

(13) zastosowanie z\^i^^ł^i^u uuawnionegow (1), (2), (33, (4), (5) lub(6) lub jego farmakoiogicznie dopuszczalnej soli do otrzymywania lekarstwa do leczenia lub zapobiegania chorobom infekcyjnym; i (14) sposób leczenia lub zapobiegania chorobom lri^i^(^'^jrn^rm który ot^i^jrmue podawanie zwierzęciu ciepłokrwistemu farmakologicznie skutecznej ilości związku ujawnionego w (1), (2), (3), (4), (5) lub (6) lub jego farmakologicznie dopuszczalnej soli.

Związki według niniejszego wynalazku przedstawione którymkolwiek ze wzorów (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) i (XVI) są wytwarzane w bulionie hodowlanym Streptomyces griseus szczep SANK60196, który należy do Streptomyces spp. i został wyizolowany z gleby pobranej od Mt. Tsukuba/lgaraki-ken; lub wytwarzane poprzez konwersję mikrobiologiczną w procesie hodowlanym lub konwersje chemiczną w sposobie izolowania i oczyszczania.

Związek A-500359E o wzorze (XI), związek A-500359F o wzorze (XII), pochodna amidowa związku A-500359F o wzorze (XIII), związek A-500359H o wzorze (XIV), związek A-500359J o wzorze (XV) i związek A-500359M-3 o wzorze (XVI) według niniejszego wynalazku - każdy z nich zawiera asymetryczne węgle, a zatem każdy może występować w postaci różnych izomerów optycznych. W niniejszym wynalazku izomery każdego z nich: związku A-500359E, związku A-500359F, pochodnej amidowej związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J i związku A-500359M-3 są przedstawione tym samym wzorem, ale niniejszy wynalazek obejmują wszystkie izomery łącznie ze związkami racemicznymi i również ich mieszaninami. Jeśli zastosowana jest synteza stereospecyficzna lub związek optycznie aktywny jest wykorzystywany jako związek wyjściowy, izomer każdego związku A-500359E, związku A-500359F, pochodnej amidowej związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J i związku A-500359M-3 może być otrzymany bezpośrednio lub jeśli jest otrzymany w postaci mieszaniny, każdy izomer może być otrzymany sposobem znanym specjalistom w dziedzinie.

Związek A-500359F, związek A-500359H, związek A-500359J i związek A-500359M-3 według niniejszego wynalazku - każdy z nich może być przekształcony w odpowiednią sól sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Niniejszy wynalazek obejmuje takie sole związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J i związku A-500359M-3. Nie ma szczególnych ograniczeń co do rodzaju soli któregokolwiek związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J i związku A-500359M-3, pod warunkiem, że jest wykorzystywana medycznie i jest farmakologicznie dopuszczalna. Jeśli sól związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J lub związku A-500359M-3 jest wykorzystywana do celu innego niż leczniczy, na przykład wykorzystywana jako półprodukt, ograniczenie to nie ma zastosowania. Korzystne przykłady takich soli obejmują sole metali alkalicznych, takie jak sól sodu, sól potasu lub sól litu, sole metali ziem alkalicznych, takie jak sól wapnia i sól magnezu, sole metali, takie jak sól glinu, sól żelaza, sól cynku, sól miedzi, sól niklu lub sól kobaltu, sole nieorganiczne, takie jak sól amonowa, sole amin organicznych, takie jak sól t-oktyloaminy, sól dibenzyloaminy, sól morfoliny, sól glukozoaminy, sól estru alkilowego fenyloglicyny, sól etylenodiaminy, sól N-metyloglukaminy, sól guanidyny, sól dietyloaminy, sól trietyloaminy, sól dicykloheksyloaminy, sól N,N'-bibenzyloetylenodiaminy, sól chloroprokainy, sól prokainy, sól dietanoloaminy, sól N-benzylofenetyloaminy, sól piperazyny i sól tetrametyloamoniowalub sól tris(hydroksymetylo)ami34

PL 200 426 B1 nometanu oraz sole aminokwasów, takie jak sól glicyny, sól lizyny, sól argininy, sól ornityny lub sól asparaginy. Bardziej korzystne są sole korzystnie użyteczne jako sole farmakologicznie dopuszczalne, takie jak sól sodu, sól potasu i sól amonowa.

Związek A-500359E, związek A-500359F, pochodna amidowa związku A-500359F, związek A-500359H, związek A-500359J i związek A-500359M-3 według niniejszego wynalazku oraz ich sole każdy z nich może istnieć w postaci solwatu. Na przykład, jeśli są pozostawione na powietrzu lub poddane krystalizacji absorbują wodą lub mogą tworzyć hydraty. Taki solwat jest również zawarty w niniejszym wynalazku.

Niniejszy wynalazek również obejmuje wszystkie związki, tak zwane proleki, które mogą być przekształcone w związek A-500359E, związek A-500359F, pochodną amidową związku A-500359F, związek A-500359H, związek A-500359J i związek A-500359M-3 drogą metaboliczną in vivo.

Związek A-500359E, związek A-500359F, związek A-500359H, związek A-500359J i związek A-500359M-3 według niniejszego wynalazku, które są przedstawione wzorami, odpowiednio, (XI), (XII), (XIV), (XV) i (XVI) są dostępne poprzez hodowanie w odpowiednim środowisku mikroorganizmu należącego do Streptomyces spp. i wydzielanie z bulionu hodowlanego. Streptomyces griseus szczep SANK 60196 (który niniejszym jest nazywany szczep SANK60196), korzystny jako mikroorganizm wytwarzający związek A-500359E, związek A-500359F, związek A-500359H, związek A-500359J i związek A-500359M-3 został jak ujawniono powyżej, pobrany i wyizolowany z gleby Ttsukuba-san/lbaraki Prefecture w tradycyjny sposób. Szczep SANK60196 ma chrakterystyki biologiczne ujawnione powyżej.

Rozmaite charakterystyki actinomycetes należących do Streptomyces spp., takie jak szczep SANK60196, nie są niezmienne, ale jak wiadomo łatwo ulegają zmianom naturalnym lub sztucznym. Użyteczny szczep według niniejszego wynalazku obejmuje wszystkie takie warianty. Niniejszy wynalazek obejmuje wszystkie szczepy należące do Streptomyces spp. i zdolne do wytwarzania związku A-500359E, związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J lub związku A-500359M-3.

Jakiekolwiek syntetyczne lub naturalne środowisko może być zastosowane do hodowli mikroorganizmów zdolnych do wytwarzania związku A-500359E, związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J lub związku A-500359M-3, o ile zawiera źródła wybrane spośród źródeł węgla, źródeł azotu, źródeł jonów nieorganicznych i organicznych składników żywieniowych.

Przykłady źródła żywieniowego tu użytecznego obejmują znane źródła węgla, źródła azotu i soli nieorganicznych, które są tradycyjnie wykorzystywane do hodowli grzybów lub szczepu actinomycetes i są wykorzystywane przez mikroorganizmy.

Konkretne przykłady źródła węgla obejmują glukozę, fruktozę, maltozę, sukrozę, mannitol, glicerol, dekstrynę, owies, żyto, skrobię kukurydzianą, ziemniaki, mączkę kukurydzianą, mączkę sojową, olej bawełniany, zagęszczony syrop słodowy, syrop, olej sojowy, kwas cytrynowy i kwas winowy. Mogą one być użyte indywidualnie lub w kombinacji. Ilość dodanego źródła węgla zwykle mieści się w zakresie, nie ograniczając zakresu, od 1 do 10% wagowych ilości środowiska.

Jako źródło azotu zwykle mogą być wykorzystywane substancje zawierające proteiny lub ich hydrolizaty. Korzystne przykłady źródła azotu obejmują mączkę sojową, otręby pszenne, mączkę orzechową, mączkę z nasion bawełny, odtłuszczone mleko, hydrolizat kazeinowy, Pharmamine (produkt Sheffield Chemical), mączkę rybną, kukurydziany płyn namokowy, pepton, ekstrakt mięsny, prasowane drożdże, suche drożdże, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt słodowy, ziemniaki, siarczan amonu, azotan amonu i azotan sodu.

Korzystne jest użycie wyżej podanego źródła azotu indywidualnie lub w kombinacji w ilości w zakresie od 0,2 do 6% wag. ilości środowiska.

Jakiekolwiek zwykle stosowane sole zawierające taki jon jak sodu, amonu, wapnia, fosforanowy, siarczanowy, chlorkowy i węglanowy, mogą być użyte jako źródło soli nieorganicznej. W dodatku metale śladowe, takie jak potas, wapń, kobalt, mangan, żelazo i magnez są użyteczne.

Dodatek kobaltu, odtłuszczonego mleka lub ekstraktu drożdżowego jest szczególnie efektywny podczas wytwarzania związku A-500359E, związku A-500359F, związku A-500359H lub związku A-500359J.

W trakcie hodowli mikroorganizmu może być dodany inhibitor biosyntezy antybiotycznej celem wytworzenia związku A-500359E, związku A-500359F i związku A-500359H. Związek A-500359E, związek A-500359F i związek A-500359H może być wytworzony, na przykład, przy użyciu S-(2-aminoetylo)-L-cysteiny lub jej soli, która jest inhibitorem kinazy asparaginowej, indywidualnie lub w kombinacji z kobaltem, odtłuszczonym mlekiem i ekstraktem drożdżowym jako dodatkiem do środowiska.

PL 200 426 B1

Na przykład zastosowanie wyżej ujawnionego dodatku w kombinacji z odtłuszczonym mlekiem zwiększa wytwarzanie związku A-500359E, związku A-500359F i związku A-500359H.

Dodatek może być dodany do jego finalnego stężenia w zakresie od 1 do 100 mM. Do wytwarzania związku A-500359E, związku A-500359F i związku A-500359H finalne stężenie 10 mM jest korzystne.

Użycie wyżej ujawnionego dodatku w kombinacji z aminokwasem lub jego solą czyni możliwym wytwarzanie użytecznych związków pokrewnych związkowi A-500359F i związkowi A-500359H. Zwłaszcza dzięki zastosowaniu w kombinacji z L-alliloglicyną lub jej solą dostępny jest związek A-500359M-3 (XVI). L-alliloglicyna może być dodana do finalnego stężenia w zakresie od 1 do 100 mM. Substancja A-500359M-3 może być korzystnie wytwarzana przy finalnym stężeniu 10 mM.

Do hodowli płynnej mogą być dodane jako środki przeciwpieniące: olej silikonowy, olej roślinny lub surfaktant lub tym podobne.

Środowisko stosowane do hodowli szczepu SANK60196 wytwarzającego związek A-500359E, związek A-500359F, związek A-500359H lub związek A-500359J korzystnie winno mieć pH w zakresie od 5,0 do 8,0.

Aczkolwiek temperatura, która umożliwia rozwój szczepu SANK60196, znajduje się w zakresie od 12 do 36°C, to szczep korzystnie jest hodowany w 18 do 28°C, bardziej korzystnie w 19 do 23°C, celem wytworzenia związku A-500359E, związku A-500359F, związku A-500359H lub związku A-500359J.

W celu otrzymania związku A-500359E, związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J lub związku A-500359M-3 może być zastosowana aerobowa hodowla szczepu SANK60196. Przykłady takich metod hodowli obejmują zwykle wykorzystywane hodowle aerobowe, takie jak hodowla stała, hodowla wytrząsana oraz hodowla pobudzana powietrznie.

Do hodowli w małej skali wytrząsanie hodowli przez kilka dni w 19 do 23°C jest korzystne. Hodowlę rozpoczyna się od rozwoju posianej hodowli w procesie jedno- lub dwuetapowym w kolbie Erlenmeyera zaopatrzonej w przegrodę (zaopatrzonej w ścianą korygującą przepływ wody) lub zwykłej kolbie Erlenmeyera. Źródło wągla i źródło azotu mogą być użyte łącznie jako środowisko dla posianej hodowli. Kolba lub posiana hodowla może być wytrząsana w 19 do 23°C przez 5 dni, aż posiana hodowla zacznie się dostatecznie rozwijać w termostatowanym inkubatorze lub wytrząsana aż posiana hodowla rozwinie się wystarczająco.

Posiane, rozwinięte hodowle mogą być użyte do inokulacji drugiego środowiska hodowlanego lub środowiska produkcyjnego. Jeśli posiane hodowle są używane w pośrednim etapie rozwojowym, to są one hodowane zasadniczo w ten sam sposób, a następnie cześć ich użyta do inokulacji środowiska produkcyjnego. Kolba, do której inokulowano posiane hodowle, jest poddawana hodowli z wytrząsaniem w stałej temperaturze przez kilka dni, a po zakończeniu hodowli, środowisko hodowlane jest wirowane lub sączone.

Z drugiej strony, do hodowli w dużej skali korzystne jest prowadzenie hodowli w fermentorze lub w zbiorniku zaopatrzonym w mieszadło i aparat napowietrzający. Przed rozpoczęciem hodowli w takim zbiorniku, środowisko hodowlane jest ogrzewane w 121 do 130°C celem sterylizacji.

Po ochłodzeniu, posiane hodowle, które uprzednio rozwijały się z zastosowaniem wyżej ujawnionego sposobu, są inokulowane na sterylizowanym środowisku. Następnie hodowla jest prowadzona z napowietrzanem i mieszaniem w 19 do 23°C. Sposób ten jest odpowiedni dla otrzymania dużych ilości związków.

Związek A-500359E, A-500359F lub A-500359H może być wytwarzany po dodaniu jako inhibitora kinazy asparaginowej wodnego roztworu S-(2-aminometylo)-L-cysteiny lub jej soli, którą wcześniej sterylizowano filtracyjnie, do sterylizowanego środowiska w momencie rozpoczęcia hodowli lub podczas hodowli.

Związek A-500359M-3 może być wytwarzany oddzielnie lub jednocześnie po dodaniu jako inhibitora kinazy asparaginowej wodnego roztworu S-(2-aminometylo)-L-cysteiny lub jej soli oraz L-alliloglicyny lub jej soli, które wcześniej sterylizowano filtracyjnie, do sterylizowanego środowiska w momencie rozpoczęcia hodowli lub podczas hodowli.

Ilość wytworzonego w trakcie hodowli związku A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J i A-500359M-3 może być oznaczona poprzez pobranie próbki bulionu hodowlanego i poddanie go analizie HPLC. Miano związku A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J i A-500359M-3 zwykle osiąga maksimum po 3 do 15 dniach.

PL 200 426 B1

Po zakończeniu hodowli komponent komórkowy jest oddzielany od bulionu hodowlanego drogą separacji z zastosowaniem ziemi okrzemkowej lub drogą wirowania i związek A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J i A-500359M-3, obecny w przesączu lub supernatancie, jest oczyszczany z wykorzystaniem swych właściwości fizykochemicznych z indeksowaniem analitycznymi danymi z HPLC. Jako ziemia okrzemkowa korzystny jest Celite 545 (produkt Celite Corporation).

Związek A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J oraz A-500359M-3, obecny w przesączy, może być oczyszczany z użyciem adsorbentów, indywidualnie lub w kombinacji, na przykład takich jak węgiel aktywowany lub żywica adsorpcyjna, taka jak Amberlite XAD-2 lub XAD-4 (produkt Rohm & Haas) oraz Diaion HP-10, HP-20, CHP-20P, HP-50 lub SP207 (produkty Mitsubishi Chemical). Związek A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J i A-500359M-3 może być oddzielony od zanieczyszczeń poprzez przepuszczenie roztworu, który zawiera związek A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J i A-500359M-3, przez warstwą takich adsorbentów jak ujawnionych powyżej i usunięcie zanieczyszczeń z roztworu wskutek zaadsorbowanialub poprzez wyeluowanie zaadsorbowanego związku A-500359E, A-500359F, A-500359H, A-500359J i A-500359M-3 wodnym metanolem, wodnym acetonem, wodnym n-butanolem, wodnym amoniakiem, wodnym metanolem zawierającym amoniak lub wodnym acetonem zawierającym amoniak. Jeśli roztwór zawierający amoniak jest stosowany jako eluent, to zdarza się, że pochodna amidowa związku A-500359F tworzy się w trakcie elucji z kolumny lub w trakcie zatężania.

Otrzymany związek A-500359E, związek A-500359F, pochodna amidowa związku A-500359F, związek A-500359H, związek A-500359J i związek A-500359M-3 może być oczyszczany za pomocą adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej z użyciem adsorbenta, takiego jak żel krzemionkowy, „Florisil”, „Cosmosil” (produkt Nacalai Tesque) lub „Diaion CHP-20P lub SP207” (produkt Mitsubishi Chemical); filtracyjnej chromatografii żelowej z „Sephadex G-10” (produkt Pharmacia Biotech) lub „Toyopearl HW40F” (produkt TOSOH Corp); chromatografii anionowy-miennej z „Dowex 1 lub SBR-P” (produkt Dow Chemical) lub „Diaion PA316” (produkt Mitsubishi Chemical); lub HPLC w fazach normalnych lub odwróconych; lub podobnych.

Związek A-500359E, związek A-500359F, pochodna amidowa związku A-500359F, związek A-500359H, związek A-500359J i związek A-500359M-3 według niniejszego wynalazku może być wyizolowany i oczyszczony z użyciem wyżej wymienionych środków do izolacji i oczyszczania, indywidualnie lub w kombinacji stosownie do potrzeb lub w niektórych przypadkach z wielokrotnym użyciem jednego z nich.

Związek A-500359F może być otrzymany poprzez hydrolizę związku A-500359E. Na przykład hydroliza jest korzystnie przeprowadzana w warunkach zasadowych, korzystnie w zasadowym środowisku wodnym.

Przykłady związków zasadowych mających zastosowanie do hydrolizy obejmują wodorotlenki metali alkalicznych i ich sole ze słabymi kwasami, takie jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek litu, octan sodu, węglan sodu, węglan potasu i kwaśny węglan sodu; wodorotlenki metali ziem alkalicznych ich sole ze słabymi kwasami, takie jak wodorotlenek wapnia, wodorotlenek magnezu i octan magnezu; nieorganiczne związki zasadowe i ich zasadowe sole, takie jak amoniak; aminy organiczne i ich zasadowe sole, takie jak t-oktyloamina, dibenzyloamina, morfolina, glukozoamina, ester alkilowy fenyloglicyny, etyleno-diamina, N-metyloglukamina, guanidyna, dietyloamina, trietyloamina, dicykloheksyloamina, N,N'-benzyloetylenodiamina, chloroprokaina, prokaina, dietanoloamina, N-benzylofenetyloamina, piperazyna, wodorotlenek tetrametyloamoniowy i tris(hydroksymetylo)aminometan. Może być również użyty zasadowy bufor zawierający jony metalu alkalicznego, jony metalu ziemi alkalicznej, jony nieorganiczne, takie jak amonowy lub jony organicznej aminy, pochodzące od wyżej wymienionych związków zasadowych. Zwłaszcza hydroliza związku A-500359E z użyciem wodorotlenki sodu z łatwością dostarcza związek A-500359F.

Stężenie związku zasadowego użytego w wyżej ujawnionej reakcji korzystnie znajduje się w zakresie od 0,001 do 1N, bardziej korzystnie 0,3 do 0,1N. Temperatura reakcji wynosi korzystnie -20 do 40°C, bardziej korzystnie 0 do 30°C. Czas reakcji wynosi korzystnie 30 sekund do 15 godzin, bardziej korzystnie 30 minut do 2 godzin.

Użycie jako zasady wodnego amoniaku prowadzi głównie do pochodnej amidowej związku A-500359F łącznie ze związkiem A-500359F, ale związki te mogą być rozdzielone i oczyszczone z zastosowaniem wyżej ujawnionego sposobu,

Pochodna amidowa związku A-500359F może być wytworzona w reakcji związku A-500359E z amoniakiem w rozpuszczalniku.

PL 200 426 B1

Przykłady rozpuszczalników obejmują wodę i alkohole, takie jak etanol i metanol, z których woda i metanol są korzystne,

Do roztworu związku może być wprowadzany gazowy amoniak, ale zwykle jest stosowany roztwór amoniaku w wodzie lub alkoholu, takim jak metanol lub etanol. Korzystnie jest stosowany roztwór wodny lub metanolowy.

Jeśli stosowany jest wodny amoniak, to jego stężenie korzystnie znajduje się w zakresie od 0,1 do 1N, bardziej korzystnie 0,3 do 0,7N. Temperatura reakcji wynosi korzystnie -20 do 40 °C, bardziej korzystnie O do 30°C. Czas reakcji wynosi korzystnie 30 minut do 15 godzin, bardziej korzystnie 1 do 4 godzin.

Jeśli stosowany jest wodny amoniak, poza żądaną pochodną amidową związku A-500359F, tworzy się związek A-500359F wskutek hydrolizy estru. Związki te jednakże mogą być rozdzielone i oczyszczone za pomocą wyżej ujawnionych sposobów.

Pochodna amidowa związku A-500359F może być również wytworzona poprzez poddanie reakcji związku A-500359F z reagentem metylującym w rozpuszczalniku, przekształcającym go w pochodną - ester metylowy, czyli związek A-500359E, a następnie poddając uzyskany związek reakcji z amoniakiem, tak jak ujawniono powyżej.

Przykłady reagentów metylujących obejmują diazometan i kwas dimetylosiarkowy, z których diazometan jest korzystny. Reagent metylujący do konwersji związku A-500359F do związku A-500359E jest korzystnie dodawany w ilości 1 do 5 równoważników, korzystnie 1,5 do 2 równoważników.

Przykłady rozpuszczalników użytecznych w powyższej reakcji obejmują wodę i alkohole, takie jak metanol i etanol, z których woda i metanol są korzystne.

Temperatura reakcji korzystnie wynosi -20 do 40°C, bardziej korzystnie 0 do 30°C. Czas reakcji korzystnie wynosi 30 minut do 15 godzin, najbardziej korzystnie 1 do 2 godzin.

Po zakończeniu reakcji związek A-500359F, związek A-500359E i pochodna amidowa związku A-500359F mogą być wyizolowane z mieszaniny reakcyjnej za pomocą środków wybranych stosownie do potrzeb spośród tych ujawnionych powyżej w środkach do izolowania i oczyszczania dla związku A-500359E, związku A-500359F, pochodnej amidowej związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J i związku A-50359M-3.

Typowe sposoby otrzymywania związku A-500359F, pochodnej amidowej związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J i związku A-50359M-3 są ujawnione powyżej, niemniej sposoby otrzymywania nie są ograniczone tylko do nich i inne sposoby znane specjalistom w dziedzinie mogą być również wykorzystane.

Tak otrzymane: związek A-500359E, związek A-500359F, pochodna amidowa związku A-500359F, związek A-500359H, związek A-500359J i związek A-500359M-3 według niniejszego wynalazku są związkami nowymi, które nie zostały ujawnione w literaturze. Ich działanie inhibitujące rozwój, ogólnie, bakterii gram dodatnich lub bakterii gram ujemnych może być oznaczone z użyciem metody dyskowej z zastosowaniem zwykłego środowiska agarowego (produkt Eiken Chemical) lub agarowego środowiska do infuzji serca (produkt Difco Laboratories). Działanie inhibitujące rozwój Mycobacteria, bakterii gram dodatnich należących do Actinomycetales, może być oznaczony podobnie na wyżej ujawnionym środowisku z dodatkiem gliceryny.

Typowe sposoby oceny aktywności biologicznej związku A-500359E, związku A-500359F, pochodnej amidowej związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J i związku A-500359M-3 zostały ujawnione, ale sposoby oceny nie są do nich ograniczone i inne sposoby oceny znane specjalistom w dziedzinie również mogą być wykorzystane.

Związki według niniejszego wynalazku lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole mogą być podawane różnymi drogami. Przykłady obejmują podawanie doustne z wykorzystaniem tabletek, kapsułek, granulek, proszków, syropów lub podobnych; i podawanie pozajelitowe z wykorzystaniem iniekcji (dożylnych, domięśniowych lub podskórnych), kropli, czopków lub podobnych. Preparaty te mogą być otrzymane w tradycyjny sposób poprzez do danie do lekarstwa zwykle stosowanych nośników, znanych w dziedzinie techniki preparatyki farmaceutycznej, takich jak zaróbka, lepiszcze, środek dezintegrujący, środek poślizgowy, środki korygujące smak, adiuwanty wspomagające solubilizację, środek zawieszający, środek barwiący i/lub podobne.

W przypadku formowania tabletek, mogą być wykorzystane rozmaite nośniki tradycyjnie stosowane w tej dziedzinie. Przykłady obejmują zarobki, takie jak laktoza, sukroza, chlorek sodu, glukoza, mocznik, skrobia, węglan wapnia, kaolin, krystaliczna celuloza i kwas krzemowy; środki wiążące, takie jak woda, etanol, propanol, zwykły syrop, roztwór glukozy, roztwór skrobi, roztwór żelatyny, karboksy38

PL 200 426 B1 metyloceluloza, szelak, metyloceluloza, fosforan potasu i poliwinylopirolidon, środki dezintegrujące, takie jak skrobia, alginian sodu, proszek agarowy, proszek laminaranowy, kwaśny węglan sodu, węglan wapnia, ester kwasu tłuszczowego i polioksyetylenowanego sorbitanu, laurylosiarczan sodu, monogliceryd stearynowy, skrobia i laktoza; środki opóźniające dezintegrację, takie jak sukroza, stearyna, masło kakaowe i uwodorniony olej; aktywatory absorpcji, takie jak czwartorzędowe sole amoniowe i laurylosiarczan sodu; środki utrzymujące wilgoć, takie jak gliceryna i skrobia; adsorbenty, takie jak skrobia, laktoza, kaolin, bentonit i koloidalny kwas krzemowy; oraz środki poślizgowe, takie jak oczyszczony talk, stearyniany, proszek kwasu borowego i glikol polietylenowy. Tabletki mogą być formowane z typową powłoczką, stosownie do potrzeb, takie jak tabletki z otoczką cukrową, tabletki kapsułkowane w żelatynie, tabletki powlekane dojelitowo, tabletki powlekane filmem lub tabletki z warstwą podwójną lub wielokrotną.

Do formowania pigułek mogą być zastosowane rozmaite nośniki tradycyjnie znane w tej dziedzinie. Przykłady obejmują zaróbki, takie jak glukoza, laktoza, masło kakaowe, skrobia, utwardzany olej roślinny, kaolin i talk; lepiszcza, takie jak proszek gumy arabskiej, proszek tragakanty, żelatyna i etanol; oraz środki dezintegrujące, takie jak agar laminaranowy.

Do formowania czopków mogą być wykorzystywane rozmaite nośniki znane w tej dziedzinie. Przykłady obejmują glikol polietylenowy, masło kakaowe, wyższe alkohole i ich estry, żelatyna oraz półsyntetyczne glicerydy.

Do preparowania iniekcji korzystnie roztwory i zawiesiny winny być sterylizowane i czynione izotonicznymi z krwią. Roztwory, emulsje lub zawiesiny mogą być tworzone z użyciem jakiegokolwiek rozcieńczalnika stosowanego w tej dziedzinie. Przykłady obejmują wodę, etanol, glikol propylenowy, oksyetylenowany alkohol izostearylowy, estry kwasów tłuszczowych i polioksyetylenowanego alkoholu izostearylowego oraz polioksyetylenowanego sorbitanu. Możliwe jest również dołączenie do preparatu farmaceutycznego soli, glukozy lub gliceryny w ilości wystarczającej do przygotowania roztworu izotonicznego lub dodanie zwykle stosowanego adiuwanta wspomagającego solubilizacją, buforu, środka wygładzającego i/lub tym podobnych.

Jeśli konieczne, może być dołączony środek barwiący, konserwujący, smakowy, słodzik lub inne lekarstwa.

Nie ma szczególnego ograniczenia co do zawartości związku dodanego jako składnik aktywny do wyżej ujawnionego preparatu farmaceutycznego. Może być stosownie dobrany w szerokim zakresie. Na ogól pożądana jest zawartość 1 do 70% wag., korzystnie 1 do 30% wag. całości kompozycji.

Nie ma szczególnego ograniczenia co do sposobu podawania wyżej ujawnionego preparatu farmaceutycznego, który to sposób jest określany w zależności od postaci dawki lub wieku, płci lub innych cech danego pacjenta lub powagi stanu chorobowego pacjenta.

Na przykład tabletki, pigułki, roztwory, zawiesiny, emulsje, granulki lub kapsułki są podawane doustnie. Iniekcje są podawane dożylnie, indywidualnie lub jako mieszaniny z typowo stosowanymi płynnymi środkami uzupełniającymi, takimi jak glukoza lub aminokwas. Jeśli konieczne, są indywidualnie podawane domięśniowo, podskórnie, śródskórnie lub dootrzewnowe. Czopek jest podawany doodbytniczo.

Aczkolwiek dawka kompozycji farmaceutycznej jest zróżnicowana w zależności od stanu, wieku i wagi pacjenta, drogi podawania lub postaci dawki, to dzienna dawka zwykle znajduje się w zakresie od 2000 mg (korzystnie 100 mg) jako górny limit do 0,1 mg (korzystnie 1 mg, bardziej korzystnie 10 mg) jako dolny limit, dla dorosłego. Może być podawana raz dziennie lub w kilku porcjach stosownie do uwarunkowań.

[Korzystny sposób praktycznej realizacji wynalazku]

Niniejszy wynalazek zastanie dalej ujawniony bardziej szczegółowo w przykładach, testach i przykładach preparatów.

Należy jednak uwzględnić, że niniejszy wynalazek nie ogranicza się tylko do nich. Następnie zostanie ujawniony sposób otrzymywania kapuramycyny, substancji znanej.

Przykład preparatywny 1: Kapuramycyna

1) Hodowla Streptomyces griseus szczepu SANK 60196 (FERM BP-5420)

Do każdej z czterech 21 kolb Erlenmeyera (kolby do posiewu), z których każda zawiera 400 ml środowiska hodowlanego o niżej ujawnionym składzie, dodano celem inokulacji cztery pełne pętliczki szczepu SANK 60196, a następnie wytrząsano na wytrząsarce rotacyjnej w 28°C przy 210 obrotach/min, (obroty na minutę; dalej zastąpiono skrótem rpm). Hodowlę posiewową prowadzono następnie przez 5 dni.

PL 200 426 B1

Środowisko hodowlane do posiewu:

maltoza	30 g
ekstrakt mięsny	5 g
polipepton	5 g
chlorek sodu	5 g
CaCO3	3 g
woda wodociągowa	100 ml
pH przed sterylizacją	7,4
sterylizacja w 121°C	30 minut

Hodowlę prowadzono tak jak ujawniono poniżej. Dokładniej, hodowlę posiewową inolulowano 2% (obj/obj.) w każdym z czterech 30 l fermentorów, z których każdy zawierał 15 l sterylizowanego środowiska głównego o niżej ujawnionym składzie, a następnie hodowano z napowietrzaniem i mieszaniem w 28°C przez 8 dni.

Główne środowisko hodowlane:

glukoza 30 g ekstrakt mięsny 5 g polipepton 5 g chlorek sodu 50 g

CoCl2 · 6H2O 50 g

CaCO3 3 g środek przeciwpieniący („CB442”; produkt NOF Corporation) 50 ml woda wodociągowa 1000 ml pH przed sterylizacją 7,4 sterylizacja w 121°C 30 minut

2) Izolacja i oczyszczanie kapuramycyny

Po zakończeniu hodowli bulion hodowlany (52 l) otrzymany powyżej w 1) przesączono przez „Celite 545” (produkt Celite Co.) dodany w 4% (obj./obj.). Przesącz (50 L) załadowano na kolumnę „Diaion HP-20” (produkt Mitsubishi Chemical; 12 l). Uzyskaną kolumnę przemyło 18 l destylowanej wody, a zaadsorbowaną substancją eluowano 50 l 10% wodnego acetonu. Eluat zatążono za pomocą „Evapor” dostarczając 15 l koncentratu.

W trakcie oczyszczania, dalej ujawnionego, substancja aktywna w każdej frakcji była monitorowana za pomocą HPLC w następujących warunkach.

Kolumna: „Senshu Pak ODS-H-2151” 6 φ x 150 mm (produkt Senshu Scientific Co., Ltd.).

Rozpuszczalnik: 8% acetonitryl - 0,04% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,0 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Uzyskany koncentrat załadowano na kolumnę „Diaion CHP-20P” (produkt Mitsubishi Chemical; 8 l). Kolumnę przemywano sukcesywnie, po 16 l, 10% wodnym metanolem i 205 wodnym metanolem, a następnie stopniowo eluowano aktywne substancje 16 l 30% wodnego metanolu i 24 l 40% wodnego metanolu.

Na kolumnie chromatograficznej „Diaion CHP-20P” pik o czasie retencji 17,1 minuty według wyżej ujawnionego HPLC rejestrowano głównie dla porcji od 0 do 8 l (która dalej będzie nazywana „frakcją A”) eluatu z 30% wodnym metanolem; piki o czasie retencji 13,7 minuty, 17, 1 minuty i 22,6 minuty według wyżej ujawnionego HPLC rejestrowano głównie dla porcji od 8 do 16 l (która dalej będzie nazywana „frakcją B”) eluatu z 30% wodnym metanolem; i pik o czasie retencji 22,6 minuty według wyżej ujawnionego HPLC rejestrowano głównie dla porcji od 0 do 12 l (która dalej będzie nazywana „frakcją C”) eluatu z 40% wodnym metanolem. Frakcje te zatężono za pomocą „Evapor” otrzymując odpowiednio 8,5 l frakcji A, 8,5 l frakcji B i 12,5 l frakcji C, każdej w postaci koncentratu.

Porcję 16 do 24 l (która dalej będzie nazywana „frakcją D”) eluatu z 40% wodnym metanolem zatężono za pomocą „Evapor” i liofilizowano, otrzymując 4,7 g frakcji D w postaci surowego sproszkowanego produktu.

Frakcję B ponownie naniesiono na kolumną „Diaion CHP-20P” (1,5 l). Po przemyciu kolumny 3 l 10% wodnego metanolu, zaadsorbowany materiał eluowano stopniowo, po 3 l, 20% wodnym metanolem, 30% wodnym metanolem i 40% wodnym metanolem. W łącznej frakcji (która dalej będzie nazywana „frakcją E”) 0,5 do 3 l porcji eluatu z 20% wodnym metanolem i 0 do 1 l porcji eluatu z 30% wod40

PL 200 426 B1 nym metanolem, rejestrowano głównie pik o czasie retencji 17,1 minuty, według wyżej ujawnionego HPLC; w łącznej frakcji (która dalej będzie nazywana „frakcją F”) 1 do 3 l porcji eluatu z 30% wodnym metanolem i 0 do 0,5 l porcji eluatu z 40% wodnym metanolem, rejestrowano głównie pik o czasie retencji 13,7 minuty, według wyżej ujawnionego HPLC; i w porcji 0,5 do 3 l (która dalej będzie nazywana „frakcją E”) eluatu z 40% wodnym metanolem, rejestrowano głównie pik o czasie retencji

22,6 minuty.

Frakcję A połączono z frakcją E (połączone dalej będą nazywane „frakcją H”), natomiast frakcję C połączono z frakcją G (połączone dalej będą nazywane „frakcją l”). Frakcje F, H i l zatążono za pomocą „Evapor” i liofilizowano, otrzymując odpowiednio 16,2 g frakcji H, 33,6 frakcji l i 8,6 g frakcji F, każdej w postaci surowego sproszkowanego produktu.

Uzyskany surowy sproszkowany produkt frakcji H (16,2 g) rozpuszczono w 250 ml dejonizowanej wody. Uzyskany roztwór naniesiono na kolumnę „Toyopearl HW-40F” (produkt TOSOH Corporation; 4 l), a następnie rozwijano dejonizowaną wodą. Eluat frakcjonowano w porcje po 75 ml i substancję aktywną mającą czas retencji 17,1 minuty, według wyżej ujawnionej HPLC, wyeluowano we frakcjach nr 41 do 63. Frakcje te połączono i zatężono za pomocą „Evapor” do 820 ml, a uzyskany koncentrat liofilizowano dostarczając 6,4 g surowego sproszkowanego produktu.

Tak otrzymany surowy sproszkowany produkt rozpuszczono w 40 ml wody. Każdą z 80 ml porcji uzyskanego roztworu naniesiono na kolumną HPLC (YMC-Pack ODS R-3105-20 (100 φ x 500 mm; produkt YMC Co., Ltd.)) równowagowaną 6% wodnym roztworem acetonitrylu, a nastąpnie rozwijano kolumnę przy szybkości przepływu 200 ml/min. Rejestrowano absorpcją w nadfiolecie substancji aktywnej przy 210 nm i zebrano wyeluowany pik o czasie retencji 105 do 120 minut w pięciu frakcjach, każdej po 400 ml.

Uzyskane frakcje połączono i zatężono za pomocą „Evapor” do 330 ml, a następnie liofilizowano dostarczając 3,6 g substancji w postaci czystej. Substancję zidentyfikowano jako kapuramycynę, znany antybiotyk, na podstawie analizy strukturalnej.

P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie A-500359A (przykładowy związek oznaczony nr 1)

Surowy sproszkowany produkt (33,6 g) z frakcji 1, otrzymanej w przykładzie preparatywnym 1, rozpuszczono w 450 ml dejonizowanej wody. Uzyskany roztwór naniesiono na kolumną „Toyopearl HW-40F” (8 l), a następnie rozwijano dejonizowaną wodą. Eluat frakcjonowano w porcje po 150 ml i substancję aktywną mającą czas retencji 22,6 minuty, według HPLC, wyeluowano we frakcjach nr 47 do 73. Frakcje te połączono i zatężono za pomocą „Evapor do 1,5 l, a następnie liofilizowano dostarczając 25 g surowego sproszkowanego produktu.

Uzyskany surowy sproszkowany produkt rozpuszczono w 300 ml dejonizowanej wody. Uzyskany roztwór naniesiono na kolumnę „Cosmosil 140C18-OPN” (produkt Nacalai Tesque; 1,5 l). Po przemyciu kolumny 3 l dejonizowanej wody i 12 l 1% wodnego acetonitrylu, związek aktywny eluowano 6 l 10% wodnego acetonitrylu. Eluat zatężono za pomocą „Evapor do 840 ml i materiał nierozpuszczalny odsączono od reszty koncentratu. Przesącz liofilizowano dostarczając 20 g substancji A-500359A w postaci czystej. Poniższe dane są właściwościami fizykochemicznymi uzyskanej substancji.

1) Wygląd substancji: biały proszek.

2) Rozpuszczalność: rozpuszczalna w wodzie i metanolu, w normalnym heksanie i chloroformie.

3) Wzór sumaryczny: C14H33N₅O12.

4) Ciężar cząsteczkowy: 583 (oznaczony przez spektrometrię masową FAB).

5) Dokładna masa [M+H]⁺, zrm^i^^c^ma ρΓζβζερβΜΓΟΓηβύ^ masową FAB wyso^ee rozdzielczości jest następująca: znaleziono: 584,2189; obliczono: 584,2205.

6) Widmoabsorpcyjne w nadfiolecie: widmoabsorpcyjne w nadfiolecie zmieezone w kazuje następujące maksimum absorpcji: 257 nm (ε 10300).

7) Skręcalność optyczna: skręcalność optyczna zmierzona w metanolu wykazuje następującą warto^ść: [a+D^2CI:+ ^94,70 (c 1,00, ^Me^OH).

8) Widmo absorpcyjne w podczerwienii widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3380, 2940, 1690, 1520, 1460^, 1430^, 1390^, 1270^, 1110^, 1060 cm^-1.

9) Widmo [H magneeycznego rezonansu[ądrowego zmierzono w deuterowanymmetanolu z [etrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 1,22 (3H,d,J = 6,7 Hz), 1,29 (1H, m), 1,49 (1H, m), 1,78 (1H, m), 1,87 (1H, m), 1,92 (1H, m), 2,01 (1H, m), 3,44 (3H, s), 3,58 (1H, m), 3,86 (1H, br ,t ,J = 4,6 Hz), 3,96 (1H, ddd, J = 0,7, 4|5, 5,7

PL 200 426 B1

Hz), 4,30 (1H. t, J = 5,2Hz), 4,37 (1H, t ,J = 4,1 Hz), 4,56 (1H, dd, J = 2,0, 11,9 Hz), 4,58 (1H, dd, J = 2,0 ,4,3 Hz), 4,67 (1H, d, J = 2,0 Hz), 5,23 (1H, d, J = 5,8 Hz), 5,72 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,88 (1H, d, J = 5,2 Hz), 6,02 (1H, br, dd, J = 0,7, 3,9 Hz), 7,91 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.

10) Widmo ¹³C magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹³C magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 22,2 (q), 28,4 (t), 32,1 (t), 37,9 (t), 50,1 (d), 53,5 (d), 58,8 (q), 63,6 (d), 68,8 (d), 74,6 (d), 79,2 (d), 81,1 (d), 83,6 (d), 90,4 (d), 101,3 (d), 102,9 (d), 109,3 (d), 142,0 (d), 144,4 (s), 152,4 (s),

161,9 (s), 1^65,1 (s), 177,5 (s), 177,3 (s) ppm.

11) Wysokosprawna chromatografia cieczowa.

Kolumna: „Senshu Pak ODS-H-2151”, 6 φ x 150 mm (produkt Senshu ScientificCo., Ltd.).

Rozpuszczalnik: 8% acetonitryl - woda.

Szybkość przepływu: 1,0 ml/min.

Detekcja: DV 210 nm.

Czas retencji: 20 minut.

P r z y k ł a d 2. Otrzymywanie A-500359C (przykładowy związek oznaczony nr 2)

Surowy sproszkowany produkt (8,6 g) z frakcji F rozpuszczono w 500 ml dejonizowanej wody. Uzyskany roztwór naniesiono na kolumnę „Toyopearl HW-40F” (8,5 l), a następnie rozwijano dejonizowaną wodą. Eluat frakcjonowano w porcje po 150 ml i substancję aktywną mającą czas retencji

13,7 minnuy, weeług HPLC,wyyluowano we frakcjaah pr44 dd 82. Prakcjete (połcczoGo zztęęooozz pomocą „Evapor” do 900 ml, a następnie liofilizowano dostarczając 2,2 g surowego sproszkowanego produktu.

Uzyskany surowy sproszkowany produkt (2,2 g) rozpuszczono w 150 ml dejonizowanej wody. Uzyskany roztwór naniesiono na kolumnę „Cosmosil 140C18-OLN” (produkt Nacalai Tesque; 1,5 l). Po przemyciu kolumny 3 l dejonizowanej wody, 3 l 0,5% wodnego acetonitrylu, 3 l 1% wodnego acetonitrylu i 15 l 2% wodnego acetonitrylu, substancję aktywną eluowano 10 l 4% wodnego acetonitrylu. Frakcję zatężono za pomocą „Evapor” do 500 ml i następnie liofilizowano otrzymując 550 g surowego sproszkowanego produktu.

Surowy sproszkowany produkt rozpuszczono w 80 ml dejonizowanej wody. Uzyskany roztwór naniesiono na kolumnę HPLC (YMC-Pack ODS R-3105-20 (100 φ x 500 mm; produkt YMC Co., Ltd.)) równowagowaną 6% wodnym roztworem acetonitrylu, a następnie rozwijano kolumnę przy szybkości przepływu 200 ml/min. Rejestrowano absorpcję w nadfiolecie substancji aktywnej przy 210 nm i, frakcjonując, zebrano wyeluowany pik o czasie retencji 167 do 180 minut.

Uzyskaną frakcję zatężono za pomocą „Evapor” do 50 ml, a następnie liofilizowano dostarczając 210 mg związku A-500359C w postaci czystej. Poniższe dane są właściwościami fizykochemicznymi uzyskanej substancji.

1) Wygląd substancji: biały proszek.

2) Rozpuszczalność: rozpuszczalna w wodzie, ssabo rozpuszczalna w metanolu, nierozpuszczalna w normalnym heksanie i chloroformie.

3) Wzór sumaryczny: C23H31N₅O12.

4) Ciężar cząsteczkowy: 569 (oznaczony przez spektrometrię masową FAB).

5) Dokłalno mć^^ć^ (M+H]'. zmietazna przee spekteameteię maaową FAB weso0iet rozZdielccości, jest następująca: znaleziono: 570,2034; obliczono: 570,2049.

6) Widmopasorapcjao w nGafioleeie:widmo pasorapcjao w noafioleeie zmietazoo w we0diewekazuje następujące maksimum absorpcji: 257 nm (ε 10700).

7) Skręcalność optyczna: skręcalność optyczna zmierzona w wodzie wykazuue warto^: [a+D²⁰: + ⁸⁹⁰ (c ^0,44 ^H2^O).

8) Widm o absorppcjno w ppddczrwieei: widmc abso^pcyjn w ppddczrwieei zmierzzno motedą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3390, 2930, 1690, 1520, 1460^, 1430^, 1390^, 1270^, 1110^, 1060 cm^-1.

9) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w tlenku z sygnałem wody jako 4,75 ppm. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 1,20 (3H, d, J = 6,7Hz), 1,29 (1H, m), 1,62 (1H, m), 1,72 (1H, m), 1,75 (1H, m), 1,90 (1H, m), 1,92 (1H, m), 3,65 (1H, m), 4,11 (1H, dd, J = 5,2, 6,3 Hz), 4,15 (1H, ddd,J = 1,4 ,4,2 ,4,3 Hz), 4,18 (1H, dd, J = 3,3, 5,2 Hz), 4,43 (1H, dd, J = 2,1,6,3 Hz), 4,49 (1H, dd, J = 3,0, 4,4 Hz), 4,62 (1H, dd, J = 1,7, 10, 8Hz), 4,76 (1H, d, J = 2,1 Hz), 5,36 (1H, d, J = 4,0 Hz), 5,77 (1H, d, J = 3,3 Hz), 5,84 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,98 (1H, br, dd, J = 1,3, 3,0 Hz), 7,72 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.

PL 200 426 B1

10) Widmo ¹³C magnetycznego rezonansujądrowego zmierzono w tlenku deuteru z 1,4-dioksanem (67,4 ppm) jnUn wonezum wgwaętenacm. Widmo ¹³C mgnagtczoszok egokogouu jdeunwunn jzut następujdzg: 21,0 (q), 26,8 (t), 29,4 (t), 35,4 (t), 48,9 (i), 52,6 (i), 61,9 (i), 65,3 (i), 69,4 (i), 73,8 (i),

76,7 (di, 18,1 tdi, 18,7 tdi, 100,1 tdi, 101,9 tdi, 100,1 tdi, 144,0 tdi, 144,8 ts), 151,6 18), 16137 ts), 166,4 (s), 173,5 (s), 175,8 (s) ppm.

11) WcsnUnspuawna chromatografia zigzokwa.

Knlumna: „Sgnshu PaU Θϋ8-Η-2151”, 6 φ x 150 mm (peniuUt Sgnshu Szigntifiz Cn., Lti.).

RnopusozoalniU: 8% azgtnnitecl - wnia.

SocbUnść peogpłcwu: 1,0 ml/min.

DgtgUzja: UV 210 nm.

Coas rotgnzji: 13 minut.

P z o c U ł a i 3. Oteocmcwanig A-500359D (peocUłainwc owidogU nonazonnc nu 3)

800 mg pnezję surowgon sprosoUkwangok peniuUtu, nteocmangon jaUn feaUzja D, roopusozoknk w 10 ml egjkniokwangj wnic. 500 μΙ pnezjg uocsUangon enotwneu nanigsiknk na Unlumnę HPLC („Sgnshu PaU Pgoasil ODS” (20 φ x 250 mm, peniuUt Sgnshu Szigntifiz)), Utózą eównnwaonwann enopusozoalniUigm enowijajdzcm oawigeajdzcm azgtnnitecl, mgtannl i 0,04% wningon Uwasu teiflunennztnd wgon (3:21:76) i Unlumnę enowijann tym samcm enopusozoalniUigm o socbUnśzid 9 ml/min. Rgjgstenwann absnepzję w naefinlgzig feaUzji aUtywngj peoc 210 nm i feaUzjnnujdz ogbeann piU wcglunwanc ni 35 in 38 minuty. Penzgiueę pnwtóeonnn 20 eaoc gluujdz owidogU w pnezjazh pn 10 ml.

PensogU (15 mo), nteocmanc pn oatężgniu feaUzji wcglunwanczh ni 35 in 38 minuty i linfilioazję Unnzgnteatu, pnnnwnig zhenmatnoeafnwann na tgj samgj Unlumnig HPLC, a następnig oatężnnn i linfilionwann, nteocmujdz 7 mo owidoUu A-500559D w pnstazi zocstgj.

Pnniżsog iang sd właśziwnśziami fiocUndzhgmizoncmi uocsUangj substanzji.

1) Wcoldi substanzji: białc pensogU.

2) Ronousuozolnekś: w wwcliie i w πο^πο^, nierenousuozolne w nermolnem hgUsanig i zhlnenfnemig.

3) Woóe sumaeczonc: C24H3₅N₅O11.

4) Ciężae zodstgzoUnwc: 567 (nonazonnc peogo spgUtenmgteię masnwd FAB).

5) 00^1^ maas 1 M+H]⁺, zmiereoke zueog zupU-remotrię moguwe FAB wesukU^t ron0eielczoc śzi, jgst następujdza: onalgoinnn: 568,2239; nblizonnn: 568,2254.

6) Widmo aasurppzjnew neaeoleeie:widmo aasurppzjnew neariolegiezmierzokew weneieweUaoujg następujdzg maUsimum absnepzji: 244 nm (ε 10000).

7) SkUęcalnoćć oppyczna: skUęcalnoćć oppyczna zmierzona w ν^ο^ίε wykazuj nassęputącą waetn^ść: [a]^D2CI: + ⁶⁸° (z ^^{69, H}2^O).

8) VWdmo zasucepzjąew zpnezotwieni: widmo aasucepzjąew zpnezotwienizmierzoke ζιοΖχΤ o pastclUd benmUu pntasu (KBe) wcUaoujg następujdzg maUsima absnepzji: 3397, 2925, 1683, 1514, 1461^,1432^, 1385^, 1265^, 1205^, 1095^, 1061 zm^-1.

9) VWdmo ¹H moanetycznego regokeaku 1ądrewego zmiereoko w nemkU z sucnełem wnic jaUn 4,75 ppm. Wiimn ¹H maongtyzongon egonnansu jdienwgon jgst następujdzg: 1,12 (3H, i, J = 8,1Ho), 1,17 (1H, m), 1,40 (1H, m), 1,67 (1H, m), 1,80 (1H, m), 1,88 (1H, m), 1,90 (1H,m), 2,33 (1H, m), 3,24 (3H, s), 3,50 (1H, m), 3,57 (1H, t, J = 4,7 Ho), 4,08 (1H, t, J = 4,8 Ho), 4,37 (m), 4,40 (m), 4,46 (1H, be. i, J = 10,7 Ho), 4,50 (1H, i, J = 2,0 Ho), 5,30 (1H, be. s), 5,64 (1H, i, J = 8,1 Ho), 5,73 (1H, i, J = 4,8 Ho), 5,97 (1H, i, J = 2,4 Ho), 7,77 (1H, i, J = 8,1 Ho) ppm.

10) Widmo i³C moanotycznogo regor^eaku 1ądrewego zmiereoko w dentereweaeno metanolu o sconałgm mgtannlu jaUn 49,15 ppm. Wiimn i³C maongtyzongon egonnansu jdienwgon jgst następujdzg: 22,3 (q), 28,6 (t), 32,3 (t), 35,8 (t), 38,0 (t), 50,2 (i), 53,6 (i), 58,8 (q), 60,7 (i), 74,7 (i), 77,7 (0),

80,9 (di, 88,8 1φ, 90,7 99,5 100,0 110,3 104,0 104,1 102,4 φ, 106,4 φ,

166,3 φ, 1 03,δ®, 1 07,δφ ppm.

11) WysnUnspeawna zhenmatnoeafia zigzonwa.

Knlumna: „Cnsmnsil 5C18-MS”, 4,6 φ x 150 mm (peniuUt Nazalai Tgsqug).

RnopusozoalniU: 3:21:76 migsoanina azgtnnitecl : mgtannl : 0,04% wninc Uwas teiflunennztnwc.

SocbUnść peogpłcwu: 1,0 ml/min.

DgtgUzja: UV 210 nm.

Coas egtgnzji: 9,2 minut.

PL 200 426 B1

P r z y k ł a d 4. Hodowla Streptomyces griseus szczepu SANK 60196 (FERM BP-5420)

Do każdej z trzech 21 kolb Erlenmeyera (kolby do posiewu), z których każda zawiera 500 ml środowiska hodowlanego o niżej ujawnionym składzie, dodano celem inokulacji, w warunkach sterylnych, cztery pełne pętliczki szczepu SANK 60196, a następnie wytrząsano na wytrząsarce rotacyjnej w 23°C przy 210 rpm. Hodowlę posiewową prowadzono następnie przez 5 dni.

Środowisko hodowlane do posiewu: maltoza 30 g

maltoza	30 g
ekstrakt mięsny	5 g
polipepton	5 g
chlorek sodu	5 g
CaCO3	3 g
środek przeciwpieniący (CB442)	50 g
woda wodociągowa	1000 ml
pH przed sterylizacją	7,4
sterylizacja w 121°C	30 minut

Hodowlę prowadzono tak jak ujawniono poniżej. Dokładniej, hodowlę posiewową inokulowano 3% (obj/obj.) w każdym z czterech 30 l fermentorów, z których każdy zawierał 15 l sterylizowanego środowiska o niżej ujawnionym składzie. Dnia 1 po rozpoczęciu hodowli w 23°C dodano sterylizowany filtracyjnie chlorowodorek S-(2-aminoetylo)-L-cysteiny do finalnego stężenia 8 mM, a następnie hodowle prowadzono z napowietrzaniem i mieszaniem 7 dni.

Środowisko hodowlane:

maltoza 30 g ekstrakt drożdżowy (produkt Difco Laboratories 5 g ekstrakt mięsny 5 g polipepton 5 g chlorek sodu 5 g heksahydrat chlorku kobaltawego 0,5 g

CaCO3 3 g środek przeciwpieniący (CB442) 50 g woda wodociągowa 1000 ml pH przed sterylizacją 7,4 sterylizacja w 121°C 00 miuut

P r z y k ł a d 5. Otrzymywanie A-500359G (przykładowy związek oznaczony nr 45)

Po zakończeniu hodowli bulion hodowlany (28 l) otrzymany w przykładzie 4 przesączono z użyciem „Celite 545”. W trakcie oczyszczania ujawnionego poniżej, frakcją aktywną monitorowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w poniżej przedstawionych warunkach.

Kolumna: Senshu Pak ODS-H-2151 6 φ x 150 mm (produkt Senshu Scientific Co., Ltd.).

Rozpuszczalnik: 8% acetonitryl - 0,04% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,5 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Czas retencji: 4,6 minut.

l uzyskanego przesączu naniesiono na kolumnę „Diaion HP-20” (5,5 l). Po przemyciu kolumny 1 l dejonizowanej wody, zaadsorbowaną substancję eluowano 11 l 10% wodnego acetonu. Eluat zatężono celem usunięcia acetonu. Pozostałość liofilizowano, otrzymując 40 g surowego sproszkowanego produktu.

Uzyskany surowy sproszkowany produkt rozpuszczono w 1 l destylowanej wody i naniesiono na kolumnę „Diaion CHP-20P” (3 l). Kolumnę następnie przemyło 6 l destylowanej wody i zaadsorbowaną substancję eluowano stopniowo, po 6 l, 5% wodnym metanolem, 10% wodnym metanolem i 15% wodnym metanolem. Eluat z 15% wodnym metanolem zatężono celem usunięcia metanolu. Pozostałość liofilizowano dostarczając 1,27 g proszku.

Uzyskany proszek rozpuszczono w 30 ml destylowanej wody i uzyskany roztwór naniesiono na kolumnę „Toyopearl HW40F” (500 ml), a następnie eluowano kolumnę destylowaną wodą. Zebrano eluat we frakcjach po 10 ml. Substancję aktywną mającą czas retencji 4,6 minuty, według wyżej ujawnionego HPLC, wyeluowano we frakcjach nr 41 do 46. Uzyskane frakcje zatężono i liofilizowano dostarczając 134 mg proszku.

PL 200 426 B1

Uzyskany proszek rozpuszczono w 3 ml wody i porcję 750 μΙ uzyskanego roztworu naniesiono na kolumnę HPLC („Senshu Pak ODS-H-5251”) (20 mm x 250 mm; produkt Senshu Scientific)) równowagowaną 4% wodnym acetonitrylem zawierającym 0,04% wodnego kwasu trifluorooctowego. Kolumnę rozwijano przy szybkości przepływu 10 ml/min. Rejestrowano absorpcję w nadfiolecie substancji aktywnej przy 210 nm i frakcjonując zebrano pik wyeluowany od 27 do 30 minuty. Procedurę powtórzono czterokrotnie.

Frakcje wyeluowane od 27 do 30 minuty zatężono i liofilizowano dostarczając 20 mg proszku. Uzyskany proszek rozpuszczono w 1,6 ml wody i 800 μl porcję uzyskanego roztworu naniesiono na wyżej ujawnioną kolumnę HPLC, z tym, że zastosowano jako rozpuszczalnik rozwijający 5% roztwór acetonitrylu zawierający 0,04% TFA. Kolumnę rozwijano z szybkością 10 ml/min. Rejestrowano absorpcję w nadfiolecie substancji aktywnej przy 210 nm i frakcjonując zebrano pik wyeluowany od 19 do 20 minuty. Frakcje zatężono i liofilizowano, otrzymując 14 mg związku A-500359G w postaci czystej. Substancja ma następujące właściwości fizyko-chemiczne:

1) Wygląd substancji: biały proszek.

2) Rozpuszczalność: rozpuszczalna w wodzie, słabo rozpuszczalna w metanolu, nierozpuszczalna w normalnym heksanie i chloroformie.

3) Wzór sumaryczny: C22H29N5O12.

4) Ciężar cząsteczkowy: 555 (oznaczony przez spektrometrię masową FAB).

5) Dokładna masa [M+H]⁺, zmierzona przez spektrometrię masową FAB wysokiej rozdzielczości, jest następująca: znaleziono: 556,1891; obliczono: 556,1890.

6) Widmo absorpcyjne w nadfiolecie: widmo absorpcyjne w nadfiolecie zmierzone w wodzie wykazuje następujące maksimum absorpcji: 257 nm (ε 10000).

7) Skrącalność optyczna: skręcalność optyczna zmierzona w wodzie wykazuje następującą warto^ść: [a]D^2CI: + ¹⁰⁹°(c ⁰J^{2, H}2^O).

8) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3367, 2931, 1684, 1518, 1482^, 1464^, 1436^, 1408^, 1385^, 1335^, 1272^, 1205^, 1177^, 11^ 1063 cm^-1.

9) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w tlenku deuteru z sygnałem wody jako 4,75 ppm. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 1,37 (1H, m), 1,65 (1H, m), 1,71 (1H, m), 1,79 (1H, m), 1,92 (1H, m), 1,98 (1H, m), 3,29 (1H, m), 3,36 (1H, m), 4,10 (1H, dd, J = 5,0, 6,5 Hz), 4,14 (1H, dt, J = 1,5, 4,4 Hz), 4,17 (1H, dd, J = 3,2, 5,0 Hz), 4,41 (1H, dd, J = 2,1,6,5 Hz), 4,47 (1 H, dd, J = 2,9, 4,4 Hz), 4,61 (1 H, dd, J = 1,8, 11,4 Hz), 4,78 (1H), 5,35 (1H, d, J =

4,1 Hz), 575 (1H, d, J = 3,2 Hz), 5,88 ( (H, d, J = 8,2 Hz), 5,99 (1H, dd, J = (,5, 2,9 Hz), 7,71 (1l·^, d, J = 8,2 Hz) ppm.

10) Widmo 1³C magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w tlenku deuteru z 1,4-dioksanem (67,4 ppm) jako wzorcem wewnętrznym. Widmo 1³C magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 28,2 (t), 28,4 (t), 30,5 (t), 42,2 (t), 53,3 (d), 62,7 (d), 66,1 (d), 70,2 (d), 74,5 (d), 77,5 (d),

83,9 (d). 99,, (d)) (00,9 (tl). (02,^-^ (c^). (00,9 (d). W,8 (c^). (44,7 (s^). (52,2 (s). (66,6 (s). 166,9 (s).

174,3 φ. 117,6 (^s (pm.

11) Wysokosprawna chromatografia cieczowa:

Kolumna: „Senshu Pak ODS-H-2151”, 6 φ x 150 mm (produkt Senshu Scientific Co., Ltd.).

Rozpuszczalnik: 8% acetonitryl - 0,04% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,5 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Czas retencji: 4,6 minut.

P r z y k ł a d 6. Hodowla Streptomyces griseus szczepu SANK 60196 (FERM BP-5420)

Do każdej z czterech 21 kolb Erlenmeyera (kolby do posiewu), z których każda zawiera 500 ml środowiska hodowlanego o niżej ujawnionym składzie, dodano celem inokulacji, w warunkach sterylnych, cztery pełne pętliczki szczepu SANK60196, a następnie wytrząsano na wytrząsarce rotacyjnej w 23°C przy 210 rpm. Hodowlą posiewową prowadzono następnie przez 3 dni.

Środowisko hodowlane do posiewu:

maltoza	30 g
ekstrakt mięsny	5 g
polipepton	5 g
chlorek sodu	5 g
CaCO3	3 g

PL 200 426 B1 środek przeciwpieniący (CB442) 50 g woda wodociągowa pH przed sterylizacją sterylizacja w 121°C

1000 ml 7,4 minut

Hodowlę prowadzono tak jak ujawniono poniżej. Dokładniej, hodowlę posiewową inolulowano 3% (obj/obj.) w każdym z dwóch 30 l fermentorów, z których każdy zawierał 15 l sterylizowanego środowiska o niżej ujawnionym składzie. Sześć godzin po rozpoczęciu hodowli w 23°C dodano sterylizowany filtracyjnie chlorowodorek S-(2-aminoetylo)-L-cysteiny do finalnego stężenia 10 mM, a następnie hodowlę prowadzono z napowietrzaniem i mieszaniem przez 6 dni.

Środowisko hodowlane: maltoza 30 g ekstrakt mięsny 5 g polipepton 5 g chlorek sodu 5 g

P r z y k ł a d 7. Otrzymywanie A-500359M-2 (przykładowy związek oznaczony nr 396)

Po zakończeniu hodowli bulion hodowlany (30 l) otrzymany w przykładzie 6 przesączono z użyciem „Celite 545”.

W trakcie oczyszczania ujawnionego poniżej, frakcję aktywną monitorowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej według poniższej metody.

Kolumna: Senshu Pak ODS-H-2151” 6 φ x 150 mm (produkt Senshu Scientific Co., Ltd.).

Rozpuszczalnik: 8% acetonitryl - 0,04% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,5 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Czas retencji: 13,6 minut.

l uzyskanego przesącza naniesiono na kolumnę „Diaion HP-20” (6 l). Po przemyciu kolumny 12 l dejonizowanej wody, zaadsorbowaną substancję eluowano 10% wodnym acetonem. Frakcję wyeluowaną w 12 do 24 l zatężono celem usunięcia acetonu. Pozostałość liofilizowano, otrzymując 12 g surowego sproszkowanego produktu.

Uzyskany surowy sproszkowany produkt rozpuszczono w 650 ml destylowanej wody. Uzyskany roztwór naniesiono na kolumnę „Diaion CHP-20P” (1 l). Kolumnę następnie przemyło 2 l destylowanej wody i zaadsorbowaną substancję eluowano 2 l 20% wodnego metanolu i 4 l 30% wodnego metanolu. Porcję wyeluowaną w 2 do 4 l 30% wodnego metanolu zatężono celem usunięcia metanolu. Pozostałość liofilizowano dostarczając 2,8 g proszku.

Uzyskany proszek rozpuszczono w 50 ml destylowanej wody i u-zyskany roztwór naniesiono na kolumnę „Toyopearl HW40F” (500 ml), a następnie eluowano kolumnę destylowaną wodą. Zebrano eluat we frakcjach po 12 ml. Substancję aktywną mającą czas retencji 13,6 minuty, według wyżej ujawnionego HPLC, wyeluowano we frakcjach nr 40 do 47. Uzyskane frakcje zatężono i liofilizowano dostarczając 841 mg proszku.

Uzyskany proszek rozpuszczono w 23 ml wody i porcję 1 ml uzyskanego roztworu naniesiono na kolumnę HPLC („Senshu Pak ODS-H-5251” (20 mm x 250 mm; produkt Senshu Scientific)) równowagowaną wodnym roztworem zawierającym 0,04% kwasu trifluorooctowego, 4% acetonitrylu i 10% metanolu. Kolumnę rozwijano przy szybkości przepływu 10 ml/min. Rejestrowano absorpcję w nadfiolecie substancji aktywnej przy 210 nm i frakcjonując zebrano pik wyeluowany od 23 do 26 minuty, przy czym procedurę preparatywną powtórzono 23 razy.

Frakcje wyeluowane od 23 do 26 minuty zatężono i liofilizowano dostarczając 421 mg proszku. Uzyskany proszek rozpuszczono w 40 ml wody i uzyskany roztwór naniesiono na wyżej ujawnioną kolumnę HPLC, z tym, że zastosowano jako rozpuszczalnik rozwijający 7% wodny roztwór acetonitrylu zawierający 0,04% TFA. Kolumną rozwijano z szybkością 10 ml/min. Rejestrowano absorpcją w nadfiolecie substancji aktywnej przy 210 nm i frakcjonując zebrano pik wyeluowany od 33 do 35 minuty,

PL 200 426 B1 przy czym proces przeprowadzono 40 razy. Frakcje zatężono i liofilizowano, otrzymując 190 mg substancji A-500359M-2 w postaci czystej. Substancja ma następujące właściwości fizyko-chemiczne:

1) Wygląd substancji: biały proszek.

2) Roozuuzzczlnośś: roozuuzzczlna w woodie i w metanolu, nieroozuuzzczlna w normalnym heksanie i chloroformie.

3) Wzór sumaryczny: C23H31N5O12S.

4) Ciężar cząsteczkowy: 601 (oznaczony przez spektrometrię masową FAB).

5) Dośłaado menz [ M+H]⁺, zmierzzśo przzeszpktrometrię menzwo FAB woszśiet rooZdielcczr ści, jest następująca: znaleziono: 602,1779; obliczono: 602,1769.

6) WWid^m a abzrppcjnow noafioleeie:widme aabzrppcjnow nnadfiojeleiz mierzzśow wo0diewokazuje następujące maksimum absorpcji: 244 nm (ε 14000).

7) Stcrę^ci^lr^c^^ći optycicm: skręcclnośś optycicm zmierozśo w wrodże wwkaauje naatępLijącą warto^ść: [a]D^2CI: + ⁵8° (c ^0,3Y ^H2^O).

8) Wdmeaaszrppcjnow pp0dczer/ieni: wiódm aabzrppcjnow pp0dczer/ienizmierzzśometo0ą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3390, 2937, 1683, 1510, 1461 1432^, 1411, 1344^, 1268^, 1206^, 1179^, 1135^, 1071 1023 cm^-1.

9) Wdrno ¹H meagotyycuoeg roezśonyz jeCrowoeg zmierozśo w Uennu ddutenj z szygołem wody jako 4,75 ppm. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 1,30 (3H, d, J = 6,8Hz), 2,63 (2H, m), 2,76 (1H, dd, J = 2,9, 14,4 Hz), 2,84 (1H, dd, J = 8,8, 14,4 Hz), 3,28 (3H, s), 3,73 (1H, dd, J = 5,0, 6,5 Hz), 3,98 (1H, m), 4,19 (1H, ddd, J = 1,5, 3,5, 4,4 Hz), 4,38 (1H, dd, J = 3,2, 5,0 Hz), 4,47 (1H, dd, J = 2,6, 6,5 Hz), 4,50 (1H, dd, 2,6, 4,4 Hz), 4,73 (1H, d, J = 2,6 Hz), 5,02 (1H, dd, J = 2,9, 8,8 Hz), 5,39 (1H, d, J = 3,5 Hz), 5,75 (1H, d, J = 3,2 Hz), 5,85 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,03 (1H, dd, J = 1)5, 2,6 Hz), 7,74 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.

10) Wdrnm ¹ C meanotyycuoeg roezśonyzj eCrowoeg Fmierzzśo w t lenyu Fe^em f l^dito sanem (67,4 ppm) jako wzorcem wewnętrznym. Widmo 1³C magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 21,3 (q), 30,0 (t), 36,3 (t), 53,2 (d), 55,9 (d), 58,6 (q), 62,7 (d), 65,7 (d), 72,7 (d), 76,5 (d),

78.9 (dd, 1224 1dd, F1/I FO, 110,3 (ód, 112,7 (ód, 111,6 (ód, 114^^ FO, 114,3 (sS, 112/1 (sS, 116,3 (sS,

166.9 (s), 1 1733 (s), 1 14^^<ss P pm.

11) Wksokosprawna chromatografia cieczowa.

Oozpuszczalnik: 8% acetonitryl - 0,04% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,5 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Czas retencji: 14,4 minut.

W poniższych przykładach Me, TBS, THF, TBAF, DMAP i WSC oznaczają, odpowiednio, grupę metylową, grupę tertbutylodimetylosililową, tetrahydrofuran, fluorek tetrabutyloamoniowy, 4-(dimetyloamino)pirydynę i chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu.

P r z y k ł a d 8. (przykładowy związek oznaczony nr 135)

(8-1)

Kapuramycynę (2 g) wysuszono azeotropowo dwukrotnie z pirydyną i rozpuszczono w 34 ml pirydyny. Do otrzymanego roztworu dodano 1,59 g chlorku tertbutylodimetylosililu, następnie mieszano w temperaturze pokojowej. Trzy dni później, rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 200 ml octanu etylu. Otrzymany roztwór przemyło 200 ml nasyconej soli i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Z otrzymanej pozostałości oddestylowano

PL 200 426 B1 rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem i naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (300 g), którą rozwijano mieszaniną chlorek metylenu-metanol (gradient stężenia od 97:3 do 90:10, który poniżej podano jako „97:3 do 90:10”), otrzymując 474,6 mg poniżej ujawnionego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,99 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 5,88 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 5,74 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 4,69 (s, 1H), 4,61 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,51 (d, J = 11 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 4,36 (t, J = 4,6 Hz, 1H), 3,90 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,47 (s, 3H), 3,30-3,20 (m, 2H), 2,02 (m, 2H), 1,84 (m, 2H), 1,54-1,28 (m, 2H), 0,86 (s, 9H), 0,05 (s, 6H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3368, 2931, 2858, 1687, 1510^, 1473^, 1463^, 1436^, 1385^, 1334^, 1266^, 1145^, 1101, 1064 cm^-1.

(8-2)

W 3 ml pirydyny rozpuszczono 100 mg związku otrzymanego w (8-1) i 2 mg DMAP. Do otrzymanego roztworu dodano 145 mg bezwodnika kwasu palmitynowego, następnie mieszano w temperaturze pokojowej. Czterdzieści minut później rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w 20 ml octanu etylu. Otrzymany roztwór przemyto 20 ml nasyconego wodnego kwaśnego węglanu sodu i wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu. Pozostałość, otrzymaną po oddestylowaniu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (14 g), rozwijając mieszaniną chlorek metylenu-metanol (98:2 do 95:5) i otrzymano 42,7 mg następującego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym chloroformie z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 9,17 (br s, 1 H), 7,88 (m, 2H), 7,47 (br s, 1 H), 6,58 (br s, 1 H), 6,04 (m, 2H), 5,78 (m, 2H), 5,58 (m, 1H), 5,12 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,64 (m, 1H), 4,60 (m, 1H), 4,50 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 3,88 (m, 1H), 3,46 (s, 3H), 3,27 (m, 3H), 2,37 (m, 2H), 2,16-1,10 (m, 32H), 0,88 (m, 12H), 0,06 (s, 6H) ppm.

(8-3)

W 53 pl THF rozpuszczono 41 mg związku otrzymanego w (8-2). 53 pl roztworu THF zawierającego 1M TBAF dodano do otrzymanego wcześniej roztworu i mieszaniną mieszano w temperaturze pokojowej. Cztery godziny później, oddestylowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość naniesiono na kolumną z żelem krzemionkowym (6 g), którą rozwijano mieszaniną chlo48

PL 200 426 B1 rek metylenu-metanol (96:4 do 94:6), otrzymując, zgodnie z oczekiwaniem, 16,3 mg poniżej ujawnionego związku według przykładu 8.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnątrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ =7,76 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,88 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 5,79 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 5,72 (d, J =

8,1 Hz, 1H), 5,44 (m, 1H), 5^21(d, J = 4/7 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 4,54-4,44 (m,22), 4,17 (m, 2H), 3,71 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,32 (s, 3H), 3,18 (m, 2H), 2,33 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,98-0,79 (m, 35H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3379,2925,2855, 1690, 1507^, 1462^, 1384^, 1334^, 1262^, 1115 ^cm_1.

P r z y k ł a d 9. (przykadowo związek oznaczony nr 280)

(9-1)

W 4,5 ml pirydyny rozpuszczono 150 mg związku otrzymanego w przykładzie (8-1), 69 μΙ bezwodnika kwasu heptanowego i 3 mg DMAP, W podobny sposób do ujawnionego w przykładzie (8-1), poddano reakcji otrzymany roztwór, otrzymując 286 mg następującego związku.

(9-2)

W 250 μl THF rozpuszczono 286 mg związku otrzymanego w przykładzie (9-1). Do otrzymanego roztworu dodano 250 μl roztworu THF zawierającego 1M TBAF. Otrzymaną mieszaninę poddano reakcji w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie (8-3) otrzymując, zgodnie z oczekiwaniem,

96,3 mg poniżżj ujawnionego związku według pokładu 9.

PL 200 426 B1

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,99 (m, 1H), 5,87 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,81 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 5,72 (m, 1H), 5,63 (m, 1H), 5,45 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,59 (m, 1H), 4,46 (m, 1H), 4,18 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,65 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 3,34 (s, 3H), 3,25 (m, 2H), 2,40-2,25 (m, 4H), 2,03 (m, 2H), 1,85 (m, 2H), 1,70-1,50 (m, 6H), 1,45-1,25 (m, 12H), 0,90 (m, 6H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3342, 2931, 2859, 1748, 1693^, 1508^, 1460^, 1383^, 1334^, 1270^, 1236^, 1142, 11^ 1068^, 990 cm^-1.

P r z y k ł a d 10. (przykładowy związek oznaczony nr 53)

zgłoszeniu patentowym Kokai Hei 5-148293. Dokładniej, 1 g kapuramycyny rozpuszczono w 175 ml acetonu. Do otrzymanego roztworu dodano 9,2 ml 2,2-dimetoksypropanu i 253 mg „Amberlyst 15 (H⁺)”. Otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej. Dwa dni później, „Amberlyst 15 (H⁺)” odparowano, a rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 7 ml chloroformu, następnie dodano 30 ml heksanu. Tak otrzymane białe kryształy zebrano przez odsączenie i naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (40 g), którą rozwijano mieszaniną chlorek metylenu-metanol (92:8) otrzymując 582,7 mg następującego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym chloroformie z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 9,69 (br s, 1H), 7,93 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,30 (br s, 1H), 7,03 (m, 1H), 6,34 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 6,12 (br s, 1H), 5,92 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,73 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,82 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,74 (m, 1H), 4,69 (m, 1H), 4,60 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,13 (t, J = 6,5 Hz, 1H), 4,02 (m, 1H), 3,69 (m, 1H), 3,50 (s, 3H), 3,28 (m, 2H), 2,18-1,70 (m, 6H), 1,49 (s, 3H), 1,45 (s, 3H) ppm.

(10-2)

W 3 ml pirydyny rozpuszczono 100 mg związku otrzymanego w 10-1), 243 mg bezwodnika kwasu palmitynowego i 2 mg DMAP. Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej. Jedną godzinę później dodano metanol kończąc reakcję. Następnie oddestylowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 100 ml octanu etylu. Po przemyciu 100 ml nasyconego wodnego kwaśnego węglanu sodu, wysuszono bezwodnym siarczanem sodu. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Z pozostałości usunięto azeotropowo pirydynę

PL 200 426 B1 toluenem, otrzymując mieszaninę zawierającą poniżej ujawniony związek. Mieszaninę użyto do kolejnej reakcji (10-3) bez oczyszczania.

roztworu dodano 100 mg „Arnberlyst 15 (H⁺)” i mieszaninę mieszano przez 47 godzin w temperaturze pokojowej i przez 4 godziny w 80°C. Po przesączeniu przez celit, rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (5 g), którą rozwijano mieszaniną chlorek metylenu-metanol (95:5 do 93:7) i otrzymano 84,9 mg, zgodnie z oczekiwaniem, poniżej ujawnionego związku według przykładu 10.

d

1) Widmo H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,94 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,42 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,05 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,38 (s, 3H), 3,25 (m, 2H),

2,37 (t, J = 7,3 Hz, 2ΗΧ 2,01 (m, 2ΗΧ 1,84 (m, 22^), 1,63-1,15 (m, 28H), 0,90 (t, J =6,8 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3380, 2925, 1854, 1686, 1509^, 1466^, 1384^, 1334^, 1270^, 1146^, 1112, 1062 ^cm'¹.

P r z y k ł a d 11. (przykładowy związek oznaczony nr 21)

PL 200 426 B1 (11-1)

W 1,5 l acetonu rozpuszczono 8,5 g A-500359A. Do otrzymanego roztworu dodano 72,7 ml 2,2-dimetoksypropanu i 2 g „Amberlyst 15 (H⁺)”· Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej. Trzy dni później, „Amberlyst 15 (H⁺)” odsączono, a rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 50 ml chloroformu, następnie dodano 200 ml heksanu. Tak strącone białe kryształy zebrano przez odsączenie i naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (400 g), którą rozwijano mieszaniną chlorek metylenu-metanol (91:9), otrzymując 8,83 g następującego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym chloroformie z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 9,90 (br s, 1H), 7,93 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,30 (br s, 1H), 6,63 (m, 1H), 6,33 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 6,14 (br s, 1H), 5,93 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 5,73 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,83 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,61 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,12 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 4,00 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,50 (s, 3H), 2,18-1,20 (m, 15H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3389, 2986, 2935, 1692, 1509^, 1458^, 1432^, 1383^, 1338^, 1269^, 1252^, 12^ 1167, 11^ 1080^, 1064^, 1012 ^cm_1.

(11-2)

W 2 ml THF rozpuszczono 125 mg związku otrzymanego w (11-1), 68 mg kwasu 3,3-difenylopropionowego, 6 mg DMAP i 58 mg WSC. Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej. Dwie godziny później, rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 20 ml chlorku metylenu. Otrzymany roztwór przemyło kolejno 20 ml wodnego kwaśnego węglanu sodu i 20 ml 0,01N kwasu solnego, po czym wysuszono bezwodnym siarczanem sodu. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując mieszaninę zawierającą poniżej ujawniony związek. Otrzymaną mieszaninę poddano kolejnej reakcji (11-3) bez oczyszczania.

(11-3)

W 5 ml metanolu rozpuszczono całą ilość mieszaniny otrzymanej w (11-2). Do otrzymanego roztworu dodano 120 mg „Amberlyst 15 (H⁺)” i otrzymaną mieszaninę mieszano w 80°C przez 3 godziny. Po przesączeniu przez celit, rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (16 g), którą rozwijano mieszaniną chlorek metylenu-metanol (94:6 do 92:8), otrzymując 107 mg, jak oczekiwano, poniżej ujawnionego związku według przykładu 11.

PL 200 426 B1

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,77 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,24 (m, 8H), 7,14 (m, 2H), 6,00 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 5,65 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,27 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 5,20 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,65 (d, J =

2,1 Hz, 1H), 4,50 (m, 3H), 4,38 ((, J = 4,0 Hz, 1H), 4,00 ((, J = 4,6 Hz, 1H), 3,93 ((, J = 4,9 Hz, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,18 (s, 3H), 3,14 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,48 (m, 1 H), 1,25 (m, 1 H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3380, 2930, 1690, 1510, 1455^, 1431 1384^, 1336^, 1267^, 1149^, 1108^, 1081 1062 ^cm_1.

P r z y k ł a d 12. (przykładowy związek oznaczony nr 22)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 11 używając 125 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1) i 72 mg kwasu 3-(3,4,5-trimetoksyfenylo)propionowego i otrzymano 113,6 mg, jak oczekiwano, poniżej ujawnionego związku według przykładu 12.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,92 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,53 (s, 2H), 6,01 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 5,91 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,45 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,67 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,52 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,01 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 3,81 (s, 6H), 3,71 (s, 3H), 3,57 (m, 1H), 3,29 (s, 3H), 2,87 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,72 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,48 (m, 1 H), 1,25 (m, 1 H), 1,21 (d, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3388, 2933, 1692, 1591, 1509^, 1458^, 1424^, 1384^, 1335^, 1268^, 1239^, 1127 ^cm_1.

P r z y k ł a d 13. (przykadowo związek oznaczony nr 23)

PL 200 426 B1

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 11 używając 125 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1) i 59 mg kwasu 2-(4-nitrofenylo)propionowego i otrzymano 121,4 mg, jak oczekiwano, poniżej ujawnionego związku według przykładu 13.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 8,22 (m, 2H), 7,92 (m, 1H), 7,55 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,97 (m, 2H), 5,72 (m, 1H), 5,43 (m, 1H), 5,22 (m, 1H), 4,68-4,38 (m, 4H), 4,08-3,90 (m, 3H), 3,57 (m, 1H), 3,33 (m, 1.5H), 3,12 (s, 1,5H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,48 (m, 4H), 1,30 (m, 1 H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3383, 2931, 1691, 1606, 1521 1458^, 1431 1384^, 1348^, 1269^, 1237^, 1205^, 1151, 1108^, 1077^, 1020 ^cm_1.

P r z y k ł a d 14. (przykładowy związek oznaczony nr 10)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 11 używając 125 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1), 145 mg kwasu pentadekanowego, 12 mg DMAP i 116 mg WSC i otrzymano 103,2 mg, jak oczekiwano, poniżej ujawnionego związku według przykładu 14.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,44 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,57 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,37 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,63-1,15 (m, 29H), 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3391, 2925, 2854, 1686, 1510^, 1460^, 1430^, 1384^, 1337^, 1270^, 1235^, 1^ 1109^, 1061 1021 978 ^cm_1.

P r z y k ł a d 15. (przykładowy związek oznaczony nr 46)

Reakcją przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 100 mg związku otrzymanego w przykładzie (10-1) i 129 (ii bezwodnika kwasu heptanowego i otrzymano 63,7 mg, jak oczekiwano, powyżej ujawnionego związku według przykładu 15.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo Ή magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,94 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,42 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,55 (m,

PL 200 426 B1

2H), 4,42 (t, J = 4,2 Hz, 1H), 4,04 (t, J = 4,8 Hz, 1 H), 3,98 (t, J = 4,9 Hz, 1 H), 3,37 (s, 3H), 3,25 (m, 2H),

2,37 ((, J = 7,3 Hz, 2l·^), 2,00 (m, 2H), 1,88 (m, 2H), 1 (m, 0,99 ((, J = 6,^ Hz, 0H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3382, 2930, 2858, 1687, 1510^, 1462^, 1384^, 1334^, 1269^, 1236^, 1156^, 1109^, 1062 cm'.

P r z y k ł a d 16. (przykładowy związek oznaczony nr 11)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 100 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1), 158 mg bezwodnika kwasu palmitynowego, 2 mg DMAP i 93,4 mg WSC i otrzymano 103,2 mg, jak oczekiwano, powyżej ujawnionego związku według przykładu 16.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,44 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,41 (t, J = 4,2 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,37 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,63-1,20 (m, 31H), 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3390, 2925, 2854, 1744, 1689^, 1509^, 1459^, 1432^, 1384^, 1337^, 1269^, 1235^, 1147^, 1111, 1062^, 1021 cm^-1.

P r z y k ł a d 17. (przykładowy związek oznaczony nr 7)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 100 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1), 177 jal bezwodnika kwasu dekanowego i otrzymano

62,2 mg, j ak oczekiwano, powyyżj ojawnioneeo owiązkuweeług przzkłaau 11.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,44 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,41 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,37 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,63-1,20 (m, 19H), 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3390, 2927, 2855, 1689, 1510^, 1459^, 1430^, 1384^, 1336^, 1269^, 1151, 1109^, 1062^, 1022 cm^-1.

PL 200 426 B1

P r z y k ł a d 18. (przykładowy związek oznaczony nr 6)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 100 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1), 160 μΙ bezwodnika kwasu pelargonowego i otrzymano 59,9 mg, jak oczekiwano, powyżej ujawnionego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,44 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,6 Hz, 1 H), 4,68 (d, J = 1,6 Hz, 1 H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,37 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,63-1,20 (m, 17H), 0,90 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3389, 2928, 2856, 1688, 1510^, 1459^, 1384^, 1336^, 1269^, 1153, 1108^, 1061 1023 ^cm_1.

P r z y k ł a d 19. (przykładowy związek oznaczony nr 9)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 100 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1) i 105 mg bezwodnika kwasu mirystynowego i otrzymano 81,6 mg związku przedstawionego powyżej.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,44 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,37 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,63-1,20 (m, 27H), 0,90 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3389, 2925, 2854, 1689, 1509^, 1459^, 1384^, 1337^, 1269^, 1148, 1110^, 1062^, 1022 ^cm_1.

P r z y k ł a d 20. (przykładowy związek oznaczony nr 8)

PL 200 426 B1

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 100 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1) i 91,8 mg bezwodnika kwasu laurowego i otrzymano 69,7 mg związku przedstawionego powyżej.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,44 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,69 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,07 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,37 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,63-1,20 (m, 23H), 0,90 (t, J = 7,0 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3389,2926,2855, 1689, 1509^, 1459^, 1384^, 1336^, 1269^, 1149, 1110^, 1062^, 1022 ^cm_1.

P r z y k ł a d 21. (przykładowy związek oznaczony nr 16)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 11 używając 100 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1) i 92,2 ml kwasu olejowego i otrzymano 70,9 mg związku przedstawionego powyżej.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,44 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,34 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 5,24 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,07 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,37 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,05-1,75 (m, 8H), 1,60 (m, 2H), 1,49 (m, 1 H), 1,33 (m, 21 H), 1,22 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3391, 2926, 2855, 1688, 1509^, 1459^, 1431 1384^, 1336^, 1269^, 1145, 1109^, 1061 1022 ^cm_1.

P r z y k ł a d 22. (przykładowy związek oznaczony nr 18)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 100 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1) i 259 mg bezwodnika kwasu linoleinowego i otrzymano 65 mg związku przedstawionego powyżej.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo Ή magnetycznego rezonansu jądrowego jest

PL 200 426 B1 następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,45 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,34 (m, 6H), 5,24 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,41 (t, J = 4,2 Hz, 1H), 4,07 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,81 (t, J = 5,9 Hz, 4H), 2,38 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,10-1,75 (m, 8H), 1,60 (m, 2H), 1,49 (m, 1 H), 1,32 (m, 9H), 1,22 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,97 (t, J = 7,5 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3389, 3011, 2928, 2855, 1688^, 1509^, 1459^, 1430^, 1385^, 1337^, 1269^, 1144, 1108^, 1061 1022 ^cm¹.

P r z y k ł a d 23. (przykładowy związek oznaczony nr 17)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 150 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1) i 326 mg bezwodnika kwasu linoleinowego i otrzymano

80,5 mg związkk przzestawioneeg ppotyżżj.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,45 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,35 (m, 4H), 5,24 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,9 Hz,

1H), 4,55 (m, 2H), 4,41 (t, J = 4,2 Hz, 1H), 4,07 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,58 (m,

1H), 3,38 (s, 3H), 2,77 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,38 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,10-1,75 (m, 8H), 1,60 (m, 2H),

1,49 (m, 1H), 1,32 (m, 15H), 1,22 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,97 (t, J = 6,9 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3388, 3009, 2928, 2856, 1687^, 1510^, 1459^, 1430^, 1384^, 1337^, 1270^, 1144, 1108^, 1061 1021 ^cm_1.

P r z y k ł a d 24. (przykładowy związek oznaczony nr 50)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 100 mg związku otrzymanego w przykładzie (10-1) i 125,5 mg bezwodnika kwasu linoleinowego i otrzymano

78,3 mej zwiąązk przzestawioneeg pw^że.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,72 (d,

PL 200 426 B1

J = 8,1 Hz, 1H), 5,42 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,04 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 3,25 (m, 2H),

2,37 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,84 (m, 2H), 1,64-1,25 (m, 20H), 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3381, 2926, 2855, 1689, 1509^, 1462^, 1436^, 1383^, 1333^, 1269^, 1149^, 1111, 1063 cm^-1.

P r z y k ł a d 25. (przykładowy związek oznaczony nr 49)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 150 mg związku otrzymanego w przykładzie (10-1) i 181 μΙ bezwodnika kwasu dekanowego i otrzymano

124,3 mg związku przzestawioneeo ppwyyżj.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,94 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,42 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,2 Hz, 1H), 4,04 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 3,25 (m, 2H),

2,37 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,84 (m, 2H), 1 (m, 1 6H), 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3378, 2927, 2856, 1689, 1509^, 1462^, 1436^, 1383^, 1333^, 1270^, 1151, 1111, 1063 cm^-1.

P r z y k ł a d 26. (przykładowy związek oznaczony nr 51)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 100 mg związku otrzymanego w przykładzie (10-1) i 181 mg bezwodnika kwasu mirystynowego i otrzymano

67,5 nm pwiąąku przzestawioneeo ppwyyżj.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,94 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,42 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,04 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 3,25 (m, 2H),

2,37 (t, J = 77^ HZz 2H), 2,00 (m, 2H), 1W (m, 2H)) 1,6641,25 (m, 22H) 0,99 (t, J = 6,8HZz 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3378, 2926, 2855, 1689, 1509^, 1464^, 1435^, 1383^, 1333^, 1269^, 1147^, 1111, 1063 cm^-1.

PL 200 426 B1

P r z y k ł a d 27. (przykładowy związek oznaczony nr 48)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 150 mg związku otrzymanego w przykładzie (10-1) i 163 μΙ bezwodnika kwasu pelargonowego i otrzymano

93,5 mg związkkprzeddtawionegg ppwyzżj.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,94 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,42 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,2 Hz, 1H), 4,04 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 3,25 (m, 2H),

2,37 (t, J = 7,3 Hz, 2 H), 2,00 ( m, 2 H), 1 ,^4 ( m, 2 H), 1 ,66-1 ,22 ( m, 1 4H), 0,99 ( t, J = 6,8Hz,3 H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3376, 2927, 2856, 1690, 1509^, 1461^, 1436^, 1379^, 1334^, 1264^, 1150^, 1108^, 1064 cm’¹.

P r z y k ł a d 28. (przykładowy związek oznaczony nr 282)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 9 używając 243 mg związku otrzymanego w przykładzie (8-1) i 130 μl bezwodnika kwasu pelargonowego i otrzymano

145,5 π, związku przedstawionedo powyZżj.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,99 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 5,88 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,81 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 5,72 (m, 1H), 5,64 (m, 1H), 5,45 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,58 (dd, J = 1,0 i 10,9 Hz, 1H), 4,46 (dd, J = 2,2 i 5,2 Hz, 1H), 4,18 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,65 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 3,34 (s, 3H), 3,25 (m, 2H), 2,37 (m, 4H), 2,03 (m, 2H), 1,85 (m, 2H), 1,62 (m, 5H), 1,32 (m, 21 H), 0,90 (m, 6H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3369, 2927, 2856, 1749, 1693^, 1508^, 1461 1380^, 1335^, 1270^, 1258^, 1143^, 1115, 1067 cm’¹.

Przykład 29. (przykładowy związek oznaczony nr 52)

PL 200 426 B1

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 11 używając

153.7 mg związku otrzymanego w przykładzie (10-1) i 122,2 mg kwasu pentadekanowego i otrzymano

102.8 mg związku przedstawionego powyżej.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,94 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,42 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,04 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 3,25 (m, 2H), 2,37 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,84 (m, 2H), 1,64-1,25 (m, 26H), 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3383, 2925, 2854, 1688, 1509^, 1465^, 1436^, 1384^, 1334^, 1270^, 1147, 11^ 1063 cm^-1.

P r z y k ł a d 30. (przykładowy związek oznaczony nr 283)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 9 używając bezwodnik kwasu dekanowego zamiast bezwodnika kwasu heptanowego i otrzymano 40,6 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,99 (m, 1H), 5,87 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,81 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,72 (m, 1H), 5,64 (m, 1H), 5,45 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,57 (m, 1H), 4,46 (dd, J = 2,1 i 5,4 Hz, 1H), 4,18 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,65 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,33 (s, 3H), 3,25 (m, 2H),

2,36 (m, 4H), 2,02 (m, 2H), 1,85 (m, 2H), 1,70-1,25 (m, 30H), 0,90 (t, J = 6,3 Hz, 6H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3375, 2926, 2854, 1747, 1691 1507^, 1463^, 1380^, 1334^, 1267^, 1247^, 1142, 11^ 1066 cm^-1.

P r z y k ł a d 31. (przykładowy związek oznaczony nr 5)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 10 używając 187 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1) i 267 μΙ bezwodnika kwasu oktanowego i otrzymano 115 mg oczekiwanego związku przedstawionego powyżej.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 5,72 (d,

PL 200 426 B1

J = 8,1 Hz, 1H), 5,44 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,56 (m, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 3,57 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,37 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,60 (m, 2H), 1,48 (m, 1H), 1,32 (m, 9H), 1,21 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,90 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3399, 2930, 2857, 1686, 1511,1459^, 1430^, 1385^, 1335^, 1268^, 1231 1152, 1107^, 1061 1022 cm^-1.

P r z y k ł a d 32. (przykładowy związek oznaczony nr 540)

W 3 ml pirydyny rozpuszczono 125 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1), 170 μΙ chloromrówczanu nonylu, 147 mg dimetyloaminopirydyny i 3 mg 4-pirydylopirydyny. Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej. Trzy godziny później, oddestylowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 60 ml octanu etylu. Po przemyciu, po 60 ml, nasyconym wodnym NaHCO3 i nasyconą solanką, wysuszono bezwodnym siarczanem sodu. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w 4 ml metanolu. Do otrzymanego roztworu dodano 200 mg „Arnberlyst 15”, następnie ogrzewano we wrzeniu. Trzy godziny później, ciała nierozpuszczalne odsączono, a rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (8 g) i eluowano mieszaniną 5% metanolem-chlorkiem metylenu i otrzymano 108 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,94 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,32 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,56 (m, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,41 (t, J = 4,2 Hz, 1H), 4,13 (m, 3H), 3,97 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,57 (m, 1H), 3,40 (s, 3H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,65 (m, 2H), 1,48 (m, 1 H), 1,32 (m, 13H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,90 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3385, 2929, 2855, 1753, 1691 1510^, 1458^, 1431 1393^, 1259^, 1144, 1101^,1076^,1021 cm^-1.

P r z y k ł a d 33. (przykładowy związek oznaczony nr 539)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 32 z wyjątkiem użycia 157 μl chloromrówczanu oktylu zamiast chloromrówczanu nonylu i otrzymano 91 mg oczekiwanego związku.

PL 200 426 B1

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,94 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,32 (t, J = 4,6 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,69 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,56 (m, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,41 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,13 (m, 3H), 3,97 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,57 (m, 1H), 3,40 (s, 3H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,65 (m, 2H), 1,48 (m, 1 H), 1,32 (m, 11 H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,90 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3387, 2929, 2856, 1752, 1689^, 1510^, 1458^, 1431 1392^, 1335^, 1260^, 1143, 1101^,1073^,1021 ^cm_1.

P r z y k ł a d 34. (przykładowy związek oznaczony nr 594)

W 50 ml dimetyloformamidu (DMF) rozpuszczono 4,57 g związku otrzymanego w przykładzie (11-1) i 2,2 ml 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-7-undecenu (DBU). Do otrzymanego roztworu dodano roztwór otrzymany przez rozpuszczenie 2,45 g eteru 4-metoksybenzylochlorometylowego w 50 ml DMF. Otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej. Po 2,5 godzinach rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 300 ml chlorku metylenu. Otrzymany roztwór przemyło kolejno, po 300 ml, 0,01N kwasem solnym, nasyconym wodnym kwaśnym węglanem sodu i nasyconą solanki, po czym wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (200 g), którą rozwijano 3% metanolem w chlorku metylenu, otrzymując 4,80 g oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym chloroformie z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,85 (m, 1H), 7,69 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,32 (m, 2H), 7,15 (m, 2H), 6,85 (d, J =

8,7 Hz, 2H), 6,37 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 6,06 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 5,82 (m, 1H), 5,75 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,70 (m, 1H), 5,44 (m, 2H), 4,73 (m, 3H), 4,61 (s, 2H), 4,57 (s, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,25 (m, 1H), 4,03 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 3,56 (s, 3H), 3,53 (m, 1H), 3,28 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 2,35 (s, 2H), 2,15 (m, 1H), 2,02-1,75 (m, 4H), 1,49 (s, 3H), 1,42 (s, 3H), 1,30 (m, 2H), 1,23 (d, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3387, 3105, 2984, 2935, 1669^, 16^ 15^ 1457^, 1383^, 1361 1300^, 1248^, 12^ 1169^1^ 1079^,1064^, 1012 ^cm_1.

PL 200 426 B1 (34-2)

W 5 ml DMF rozpuszczono 773 mg związku otrzymanego w przykładzie (34-1). Otrzymany roztwór mieszano w 0°C w strumieniu azotu. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 60 mg NaH (około 60%). Dwie minuty później, dodano 2,13 ml 1-jododekanu. Pięć minut później, pozwolono, aby temperatura wzrosła ponownie do temperatury pokojowej, przy czym mieszanie kontynuowano przez dalsze 25 minut. Następnie mieszaninę reakcyjną destylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, usuwając rozpuszczalnik. Pozostałość rozpuszczono w 250 ml chlorku metylenu. Otrzymany roztwór przemyło kolejno 300 ml 0,01N kwasu solnego, nasyconym wodnym kwaśnym węglanem sodu i nasyconą solanką, po czym wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (200 g), którą rozwijano 2% metanolem w chlorku metylenu, otrzymując 395 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym chloroformie z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,89 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,13 (br s, 1H), 6,86 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,37 (m, 1H), 5,95 (s, 1H), 5,75 (br s, 1H), 5,70 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,57 (m, 1H), 5,45 (s, 2H), 4,78 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 4,74 (m, 2H), 4,63 (s, 2H), 4,55 (s, 1 H), 4,46 (m, 1 H), 4,05 (m, 2H), 3,95 (m, 1H), 3,79 (s, 3H), 3,62 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 3,43 (s, 3H), 4,09 (m, 1 H), 1,98 (m, 1 H), 1,86 (m, 1 H), 1,77 (m, 1 H), 1,49 (s, 3H), 1,44 (s, 3H), 1,40-1,20 (m, 18H), 1,19 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,88 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3386, 3102, 2928, 2855, 1713, 1670^, 16^ 1587^, 15^ 1456^, 1382^, 1359^, 1338^, 1300^, 1271 1248^, 1220^, 1167, 11^ 1066^, 1013 ^cm1 (34-3)

W 5 ml chlorku metylenu rozpuszczono 390 mg związku otrzymanego w przykładzie (34-2). Do otrzymanego roztworu dodano 276 μΙ wody i 484 mg 2,3-dichloro-5,6-dicyjano-1,4-benzochinonu i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej. Po 75 minutach, nierozpuszczalne ciała odsączono. Przesącz rozcieńczono 200 ml chlorku metylenu, następnie przemyło kolejno, po 200 ml, nasyconym wodnym kwaśnym węglanem sodu i nasyconą solanką, po czym wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (50 g), którą rozwijano 5% metanolem w chlorku metylenu, otrzymując 278 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 9,30 (br s, 1H), 7,99 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,70 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,19 (br s, 1 H),

PL 200 426 B1

6,36 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,98 (br s, 1 H), 5,85 (br s, 1H), 5,81 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 5,69 (dd, J = 2,2 i 8,1 Hz, 1H), 4,74 (m, 2H), 4,60 (m, 2H), 4,28 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 4,12 (t, J = 6,2 Hz, 1H), 4,07 (t, J =

4,7 Hz, 1 H), 3,59 (m, 3H), 4,43 (s, 3H), 2,10-1,73 (m, 4H), 1,60 (m, 2H), 1,48 (s, 3H), 1,42 (s, 3H),

1,23 (m, 19H), 0,88 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3387, 3227, 3098, 2928, 2855, 1692, 1506, 1457, 1431, 1382, 1337, 1296, 1268, 1250, 1235, 1220, 1166, 1121, 1082,

W 15 ml metanolu rozpuszczono 273 mg związku otrzymanego w przykładzie (34-3). Do otrzymanego roztworu dodano 260 mg „Amberlyst 15” i otrzymaną mieszaninę mieszano w 80°C. Po 4 godzinach i 20 minutach, ciała nierozpuszczalne odsączono. Przesącz przedestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (15 g), którą rozwijano 5% metanolem w chlorku metylenu, otrzymując 176 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 5,92 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,67 (s, 1H), 4,59 (m, 1 H), 4,52 (m, 1 H), 4,38 (t, J = 4,2 Hz, 1 H), 4,08 (t, J = 4,6 Hz, 1 H), 3,98 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,94 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,58 (m, 3H), 3,40 (s, 3H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,52 (m, 3H), 1,25 (m, 18H), 0,89 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3391, 3099, 2927, 2854, 1686^, 1509^, 1458^, 1431 1385^, 1335^, 1269^, 113^2, 1099^,1063^, 1020 cm^-1.

P r z y k ł a d 35. (przykładowy związek oznaczony nr 590)

PL 200 426 B1

W podobny sposób do ujawnionego w przykładzie (34-2), z wyjątkiem użycia 1,48 ml 1-jodoheksanu zamiast 1-jododekanu, otrzymano 460 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,91 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,24 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 6,85 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 6,18 (d, J = 4,1 Hz, 1H), 5,92 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,74 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,11 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,80 (m, 1 H), 4,70 (m, 1H), 4,55 (m, 3H), 4,37 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 4,08 (t, J = 4,3 Hz, 1H), 3,94 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,60 (m, 3H), 3,41 (s, 3H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,55 (m, 3H), 1,43 (s, 6H), 1,25 (m, 8H), 1,19 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,88 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3381, 3103, 2933, 2871,2859, 1670, 1613, 1587, 1514, 1455, 1383, 1359, 1300, 1271, 1249, 1220, 1167, 1130, 1112, 1066^, 1013 ^cm_1.

(35-2)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie (34-3), używając 458 mg związku otrzymanego w przykładzie (35-1) i otrzymano 313 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym chloroformie z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 9,28 (brs, 1H), 7,99 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,19 (br s, 1H),

6,36 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,98 (br s, 1H), 5,85 (br s, 1H), 5,81 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 5,69 (dd, J = 2,2 i 8,1 Hz, 1H), 4,74 (m, 2H), 4,60 (m, 3H), 4,28 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 4,12 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 4,07 (t, J =

4,7 Hz, 1H), 3,59 (m, 3H), 4,42 (s, 3H), 2,10-1,73 (m, 4H), 1,60 (m, 2H), 1,48 (s, 3H), 1,42 (s, 3H),

1,23 (m, 11 H), 0,87 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3386, 3097, 2933, 2872, 2859^, 1692^, 1507^, 1457^, 1432^, 1383^, 1337^, 1268^, 1235^,1220^, 1^ 1^ 1082^, 1065^, 1012 ^cm_1.

(35-3)

W 15 ml metanolu rozpuszczono 273 mg związku otrzymanego w przykładzie (35-2). Do otrzymanego roztworu dodano 260 mg „Amberlyst 15”. Otrzymaną mieszaniną mieszano w 80°C. Po 4 godzinach i 20 minutach ciała nierozpuszczalne odsączono. Przesącz przedestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (15 g) i eluowano 5% metanolem w chlorku metylenu, otrzymując 176 mg oczekiwanego związku.

PL 200 426 B1

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansujądrowego w deuterowanymmetanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,92 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,66 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 4,59 (m, 1 H), 4,50 (m, 1 H), 4,38 (t, J = 3,9 Hz, 1H), 4,08 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,99 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 3,93 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,58 (m, 3H), 3,40 (s, 3H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,52 (m, 3H), 1,25 (m, 7H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3387, 3098, 2931, 2859, 1687^, 1509^, 1458^, 1431 1385^, 1335^, 1268^, 1131, 1098^, 1063^, 1020 cm^-1.

P r z y k ł a d 36. (przykładowy związek oznaczony nr 891)

W pirydynie rozpuszczono 300 mg związku A-500359A. Do otrzymanego roztworu dodano 696 mg bezwodnika kwasu benzoesowego i 6,4 mg dimetyloaminopirydyny. Otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej. Cztery godziny później rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w 200 ml octanu etylu. Otrzymany roztwór przemyło kolejno, po 200 ml, nasyconym wodnym kwaśnym węglanem sodu i nasyconą solanką, po czym wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (50 g), którą rozwijano 3% metanolem w chlorku metylenu, i otrzymano 423 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym chloroformie z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 9,40 (br s, 1H), 8,06 (m, 4H), 7,92 (m, 4H), 7,55 (m, 5H), 7,40 (m, 5H), 7,15 (br s, 1H), 6,45 (br s, 1H), 6,32 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 6,13 (m, 1H), 6,09 (br s, 1H), 5,96 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 5,83 (m, 2H), 5,62 (m, 2H), 4,69 (m, 1H), 4,61 (m, 1H), 4,56 (m, 1H), 4,36 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 3,54 (m, 1 H), 3,34 (s, 3H), 2,12 (m, 1H), 2,00-1,50 (m, 4H), 1,32 (m, 1H), 1,24 (d, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

(36-2)

PL 200 426 B1

W 6,3 ml chlorku metylenu rozpuszczono 418 mg związku otrzymanego w przykładzie (36-1). Do otrzymanego roztworu dodano 5 ml wody, następnie mieszano w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny reakcyjnej stopniowo dodawano, w ciągu 30 minut, 4,74 g kwasu nitrozylosiarkowego. Po mieszaniu przez dalsze 10 minut, otrzymaną mieszaninę rozcieńczono 30 ml chlorku metylenu. Oddzieloną warstwę organiczną przemyło, po 10 ml, wodą i nasyconą solanką, i rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 10 ml chlorku metylenu. Do otrzymanego roztworu dodano eterowy roztwór diazometanu, otrzymany przez zmieszanie 144 mg N-metylo-N-nitrozomocznika, 90 mg wodorotlenku potasu, 2,8 ml eteru i 2,8 ml wody i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej. Jedną godzinę później rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym (20 g), którą rozwijano 1,5% metanolem w chlorku metylenu, i otrzymano 99 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym chloroformie z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 8,28 (s, 1H), 8,06 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,99 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,95 (m, 3H), 7,60-7,32 (m, 11 H), 6,33 (s, 1H), 6,20 (t, J = 3,6 Hz, 1H), 6,06 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,94 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,88 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 5,70 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 5,54 (m, 2H), 4,79 (m, 1H), 4,63 (m, 1H), 4,17 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,80 (m, 1H), 3,72 (m, 1H), 3,35 (m, 1H), 3,30 (s, 3H), 2,19 (m, 1H), 2,02-1,75 (m, 3H), 1,52 (m, 1H), 1,32 (m, 1H), 1,24 (d, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3388, 3093, 3069, 2933, 2855, 1729^, 1697^, 1658^, 1602^, 1584^, 1551 1509^, 1452^, 1383^, 1336^, 13^ 1270^, 11^ 1070^, 1026 cm^-1.

(36-3)

W 2 ml roztworu 40% metyloaminy w metanolu rozpuszczono 98 mg związku otrzymanego w przykładzie (36-2). Otrzymany roztwór został szczelnie zamknięty, po czym mieszano go. Czterdzieści pięć minut później, rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość poddano preparatywnej HPLC w fazie odwróconej (Inertsil Prep-ODS), następnie eluowano mieszaniną 16% acetonitryl-woda i otrzymano 30 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznegorezonansu j ądrowegozmierzonow deuterowanymmetanoluz tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,98 (m, 1H), 5,83 (m, 1H), 5,74 (dd, J = 2,9 i 8,1 Hz, 1H),

5.24 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 4,73 (dd, J = 2,1 i 10,9 Hz, 1H), 4,50 (m, 2H), 4,38 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,25 (m, 1H), 4,04 (m, 2H), 3,75 (m, 1H), 3,39 (d, J = 2,8 Hz, 3H), 2,74 (d, J = 2,4 Hz, 3H), 1,65 (m, 1 H),

1.25 (m, 2H), 1,00 (m, 3H), 0,92 (m, 1H), 0,75 (m, 2H) ppm.

P r z y k ł a d 37. (przykładowy związek oznaczony nr 991)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie (36-3), używając 120 mg związku otrzymanego w przykładzie (36-2), 0,4 ml n-propyloaminy i 2 ml metanolu i otrzymano 16 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,91 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 5,89 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,16 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 4,67 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 4,55 (m, 2H), 4,37 (t, J = 4,3 Hz, 1H), 4,33 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 3,92 (m, 2H), 3,60 (m, 1H), 3,45 (s, 3H), 3,25 (m, 2H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,53 (m, 3H), 1,25 (m, 1H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3369, 3098, 2964, 2934, 2878^, 1683^, 15^ 1459^, 1432^, 1385^, 1335^, 1269^, 1080^, 1062^, 1022^, 981 cm^-1.

PL 200 426 B1

P r z y k ł a d 38. (przykładowy związek oznaczony nr 1091)

Reakcję przeprowadzono w podobny sposób do ujawnionego w przykładzie (36-3), używając 270 mg związku otrzymanego w przykładzie (36-2), 1,92 g dodecyloaminy i 6,9 ml metanolu i otrzymano 15 mg oczekiwanego związku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,92 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,91 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,73 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,15 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,67 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,36 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,32 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 3,92 (m, 2H), 3,60 (m, 1H), 3,47 (s, 3H), 3,35 (m, 1H), 3,20 (m, 1H), 2,05-1,75 (m, 4H), 1,50 (m, 3H), 1,28 (m, 19H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 6,6 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3351, 3098, 2926, 2854, 1685^, 15^ 1459^, 1432^, 1385^, 1335^, 1264^, 1139, 1090^, 1063^, 1022^, 993 cm’¹.

P r z y k ł a d 39. (przykładowy związek oznaczony nr 548)

W 4 ml pirydyny rozpuszczono 125 mg związku otrzymanego w przykładzie (11-1). W strumieniu azotu, do roztworu dodano 147 mg dimetyloaminopirydyny i 3,9 mg 4-pirolidynopirydyny. Po ochłodzeniu do 0°C, dodano 209,1 mg chlorku 2,2-dimetylododekanoilu (B. D. Roth, et al., Journal of Medicinal Chemistry, 35, 1609-1617 (1992)). Otrzymaną mieszaniną mieszano w temperaturze pokojowej przez 28 godzin. Po ochłodzeniu do 0°C, dodano do mieszaniny reakcyjnej 2 ml metanolu. Otrzymaną mieszaninę mieszano przez 10 minut, następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano 20 ml 0,02N kwasu solnego i 20 ml chlorku metylenu w celu rozdzielenia ich na warstwy. Tak otrzymaną warstwą organiczną przemyło trzy razy nasyconą solanką, wysuszono bezwodnym siarczanem sodu i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 307 mg surowego produktu. Produkt oczyszczano na kolumnie Lobara z żelem krzemionkowym (eluowano na początku mieszaniną 3:7 heksanu i octanu etylu, następnie octanem etylu) i otrzymano 132 mg oczekiwanego związku.

PL 200 426 B1

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,90 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,16 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 6,03 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,32 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,90 (m, 1H), 4,75 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,59-4,55 (m, 2H), 4,38 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 4,05 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 3,64-3,55 (m, 1H), 3,40 (s, 3H), 2,01-1,77 (m, 4H), 1,59-1,47 (m, 3H), 1,45 (s, 6H), 1,34-1,10 (m, 26H), 0,89 (t, J = 6,7 Hz, 3H) ppm.

(39-2)

Do 125 mg związku otrzymanego w przykładzie (39-1) dodano 50 ml roztworu 5% kwas trifluorooctowy-chlorek metylenu i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Mieszaninę reakcyjną zatężono i azeotropowano z toluenem, otrzymując 147 mg surowego produktu. Otrzymany produkt oczyszczano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (eluowanie 8% metanolem w chlorku metylenu), otrzymując 64,8 mg oczekiwanego związku w postaci białego proszku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 4,8 Hz, 1 H), 5,71 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 5,39 (t, J = 4,8 Hz, 1 H), 5,24 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,69 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,57-4,56 (m, 1H), 4,54-4,50 (m, 1H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 3,61-3,53 (m, 1H), 3,37 (s, 3H), 2,04-1,76 (m, 4H), 1,56-1,43 (m, 2H), 1,33-1,16 (m, 27H), 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3390, 2927, 2854, 1688, 15^ 1459^, 1387^, 1336^, 1269^, 1144, 1108, 1062 cm.

P r z y k ł a d 40. (przykładowy związek oznaczony nr 574)

PL 200 426 B1

W podobny sposób do ujawnionego w przykładzie (39-1), z wyjątkiem użycia 122 mg związku otrzymanego w przykładzie (10-1) zamiast związku otrzymanego w przykładzie (11-1), przeprowadzono reakcję, otrzymując 126,9 mg oczekiwanego związku w postaci białego proszku.

1) Widmo ¹H magnetycznego reeonansuj ądrowego zmierzono w deuterowanym metanoluz tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,90 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,16 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 6,03 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,30 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 5,15 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,90 (m, 1H), 4,75 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,59-4,57 (m, 2H), 4,39 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 4,03 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 3,39 (s, 3H), 3,31-3,28 (m, 2H), 2,02 (d, J = 11 Hz, 2H), 1,87-1,77 (m, 2H), 1,60-1,49 (m, 2H), 1,44 (s, 6H), 1,40-1,20 (m, 18H), 1,17 (s, 6H), 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwienii widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3377, 2929, 2856, 1695,

W podobny sposób do ujawnionego w przykładzie (39-2), z wyjątkiem użycia 95,3 mg związku otrzymanego w przykładzie (40-1) zamiast związku otrzymanego w przykładzie (39-1), przeprowadzono reakcję, otrzymując 72,4 mg oczekiwanego związku w postaci białego proszku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,37 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,57-4,52 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,04 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 3,27-3,22 (m, 2H), 2,04-1,89 (m, 2H), 1,86-1,77 (m, 2H), 1,58-1,46 (m, 2H), 1,43-1,19 (m, 18H), 1,16 (d, J = 6,2 Hz, 6H), 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo w podczerwienii widmo w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3369,2927,2854, 1689, 1509^, 1463^, 1389^, 1332^, 1269^, 1143, 11^ 1062 cm’¹.

P r z y k ł a d 41. (przykładowy związek oznaczony nr 545)

PL 200 426 B1

W podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 25, z wyjątkiem użycia chlorku 2-metylododekanoilu [otrzymanego przez chlorowanie kwasu 2-metylododekanoilowego, który został otrzymany w procesie o-pisanym w Organie Synthesis, 4, 616, według metody opisanej w B. D. Roth, et al., Journal of Medicinal Chemistry, 35, 1609-1617 (1992)], zamiast chlorku 2,2-dimetylododekanoilu otrzymano 82,5 mg oczekiwanego związku w postaci białego proszku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,96 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,98 (dd, J = 4,5 i 3,4 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,46-5,43 (m, 1H), 5,24 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,57 (dd, J =

4,8 i 1, Hz, 1H), 4,52 (dd, J = 11 i 1,5 Hz, 1H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,08-4,05 (m, 1 H), 3,97 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,61-3,54 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,53-2,48 (m, 1H), 2,04-1,37 (m, 6H), 1,28 (s, 18H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 1,15-1,13 (m, 3H), 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3389, 2927, 2854, 1689, 1510^, 1459^, 1384^, 1335^, 1269^, 1145^, 1108^, 1061 ^cm_1.

P r z y k ł a d 42. (przykładowy związek oznaczony nr 571)

W podobny sposób do ujawnionego w przykładzie 40, z wyjątkiem użycia chlorku 2-metylododekanoilu zamiast chlorku 2,2-dimetylododekanoilu otrzymano 77,5 mg oczekiwanego związku w postaci białego proszku.

1) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w deuterowanym metanolu z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: δ = 7,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 5,98 (dd, J = 4,5 i 3,6 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,44-5,40 (m, 1H), 5,24 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 4,57-4,52 (m, 2H), 4,42 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 4,04 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 3,29-3,23 (m, 2H), 2,23-2,48 (m, 1H), 2,03-1,99 (m, 2H), 1,89-1,76 (m, 2H), 1,67-1,32 (m, 2H), 1,28 (s, 18H), 1,15-1,13 (m, 3H), 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H) ppm.

2) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3369, 2927, 2854, 1689, 1509^, 1461 1382^, 1333^, 1269^, 1144^, 1110^, 1062 ^cm_1.

P r z y k ł a d 43. Hodowla Streptomyces griseus szczepu SANK 60196 (FERM BP-5420)

Do każdej z czterech 21 kolb Erlenmeyera (kolby do posiewu), z których każda zawiera 500 ml środowiska hodowlanego o niżej ujawnionym składzie, dodano celem inokulacji, w warunkach sterylnych, cztery pełne pętliczki szczepu SANK60196, a następnie wytrząsano na wytrząsarce rotacyjnej w 23°C przy 210 rpm i hodowlę posiewową prowadzono następnie przez 3 dni.

Środowisko hodowlane do posiewu zawiera następujące składniki w 1000 ml wody wodociągowej:

maltoza 30 g ekstrakt mięsny 5 g polipepton 5 g chlorek sodu 5 g węglan wapnia 3 g środek przeciwpieniący (CB442) (produkt NOF Corporation) 50 mg

Po skorygowaniu pH do 7,4, prowadzono sterylizację w 121°C przez 30 minut.

PL 200 426 B1

Hodowlę prowadzono tak, jak ujawniono poniżej. Dokładniej, hodowlę posiewową inolulowano 3% (objętościowo/objętościowo, dalej w skrócie obj./obj.) w dwóch 30 l fermentorach, z których każdy zawierał 15 l sterylizowanego środowiska. Sześć godzin po rozpoczęciu hodowli w 23°C dodano sterylizowany filtracyjnie chlorowodorek S-(2-aminoetylo)-L-cysteiny do finalnego stężenia 10 mM, a następnie hodowlę prowadzono z napowietrzaniem i mieszaniem przez 6 dni.

Środowisko hodowlane zawiera następujące składniki w 1000 ml wody wodociągowej:

maltoza 30 g ekstrakt drożdżowy (produkt Difco Laboratories) 5 g ekstrakt mięsny 5 g polipepton 5 g chlorek sodu 5 g węglan wapnia 3 g środek przeciwpieniący (CB442) produkt NOF Corporation 50 mg

Po skorygowaniu pH do 7,4, prowadzono sterylizację w 121°C przez 30 minut.

P r z y k ł a d 44. Oczyszczanie związku A-500359E

Bulion hodowlany (30 l) otrzymany w przykładzie 43 przesączono z użyciem „Celite 545” (produkt Celite Corporation).

W trakcie oczyszczania ujawnionego poniżej, frakcję aktywną monitorowano za pomocą HPLC stosując kolumną i warunki analizy ujawnione poniżej.

Kolumna: “Senshu Pak ODS-H-2151” 6 φ x 150 mm (produkt Senshu Scientific Co., Ltd.).

Rozpuszczalnik: 0,04% wodny kwas trifluorooctowy zawierający 4% acetonitrylu.

Szybkość przepływu: 1,0 ml/min.

Detekcja: DV 210 nm.

Czas retencji: 21,2 minuty.

l uzyskanego przesączu naniesiono na kolumną (6 l) zawierającą „Diaion HP-20” (produkt Mitsubishi Chemical). Po przemyciu kolumny 12 l dejonizowanej wody, frakcją nie zaadsorbowaną i frakcją z przemycia połączono (połączona frakcja bądzie dalej nazywana „nie zaadsorbowaną frakcją z przemycia”). Zaadsorbowaną substancję eluowano 12 l 10% wodnego acetonu. Eluat zatężono celem usunięcia acetonu i liofilizowano, otrzymując 39 g surowego sproszkowanego produktu.

Uzyskany surowy sproszkowany produkt rozpuszczono w 200 ml dejonizowanej wody i naniesiono na kolumną (2 l) zawierającą „Diaion CHP-20P” (produkt Mitsubishi Chemical). Kolumną następnie przemyło 4 l dejonizowanej wody i 4 l 10% wodnego metanolu, i zaadsorbowaną substancją eluowano 4 l 15% wodnego metanolu i 4 l 20% wodnego metanolu. Porcją wyeluowaną w 2 do 4 l 15% wodnego metanolu i eluat z 20% wodnym metanolem połączono, a następnie zatężono. Po usunięciu metanolu poprzez destylację, pozostałość liofilizowano dostarczając 8,9 g proszku.

Uzyskany proszek rozpuszczono w 200 ml dejonizowanej wody i uzyskany roztwór naniesiono na kolumnę (1 l) z „Toyopearl HW40F” (produkt TOSOH Corporation), a następnie eluowano kolumnę dejonizowaną wodą. Zebrano eluat we frakcjach po 100 ml, przy czym substancję aktywną mającą czas retencji 21,2 minuty, według wyżej ujawnionego HPLC, wyeluowano we frakcjach nr 5 do 10. Uzyskane frakcje zatężono i liofilizowano dostarczając 2,7 g proszku.

Uzyskany proszek rozpuszczono w 200 ml dejonizowanej wody i naniesiono na kolumnę HPLC („YMC-Pack ODS-1050-20-SR”: 100 φ x 500 mm; produkt YMC) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifluorooctowym zawierającym 4% acetonitrylu. Kolumnę rozwijano przy szybkości przepływu 208 ml/min. 0,04% wodnym kwasem trifluorooctowym zawierającym 4% acetonitrylu. Eluat frakcjonowano na porcje po 1 l, a aktywną substancję wueluowano we frakcji nr 6 i 7.

Frakcje połączono, a następnie zatężono do 200 ml za pomocą „Evapor” (produkt Okawara Seisakujo) i liofilizowano otrzymując 99 mg proszku. Uzyskany proszek zawieszono w 5 ml destylowanej wody i odsączono nierozpuszczalny materiał. Przesącz zatężono do 2 ml na wyparce rotacyjnej, a następnie liofilizowano, otrzymując 87 mg związku A-500359E w postaci czystej.

Związek A-500359E ma następujące właściwości fizykochemiczne:

1) Wygląd substancji: biały proszek.

2) Rozpuszczalność: rozpuszczalny w wodzie, słabo rozpuszczalny w metanolu, nierozpuszczalny w normalnym heksanie i chloroformie.

3) Wzór sumaryczny: C18H23N3O12.

4) Ciężar cząsteczkowy: 473 (oznaczony przez spektrometrię masową FAB).

PL 200 426 B1

5) Dokładna masa [M+H]+ zmierzona przez spektrometrię masową FAB wysokiej rozdzielczości, jest następująca: znaleziono: 474,1349; obliczono: 474,1359.

6) Widmo absorpcyjne w nadfiolecie: widmo absorpcyjne w nadfiolecie zmierzone w wodzie wykazuje następujące maksimum absorpcji: 251 nm (ε 10000).

7) Skręcalność optyczna: skręcalność optyczna zmierzona w wodzie wykazuje następującą warto^ść: [a]D^2CI: +¹¹⁵°(c ^0,28).

8) Widmo abborpcyjne w podccerwienii widmo abborpcyjne w podczerwieni zmierzzne metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3410,2955, 1683, 1464, 1441 1396^, 1309^, 1267^, 1206^, 138, 11^ 1088^, 1062^, 1023 cm^-1.

9) Wdmo ¹H maanetyczneeo reezneneu j ądrrweeo zmietzzno w ddujetzwanem sulforleneu dimetylowym z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 3,24 (3H, s), 3,52 (1H, dd, J = 4,5, 6,1 Hz), 3,72 (3H, s), 3,98 (1H, m), 4,10 (1H, m), 4,25 (1H, m), 4,29 (1H, d, J = 2,0 Hz), 4,33 (1H, dd, J = 2,0, 6,1 Hz), 5,05 (1H, d, J = 3,9 Hz), 5,16 (1H, d, J = 6,8Hz), 5,45 (1H, d, J = 4,2Hz), 5,54 (1H, d, J = 5,9 Hz), 5,61 (1H, d, J = 3,3 Hz), 5,61 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,93 (1H, dd, J = 1,3, 2,9 Hz), 7,56 (1H, br, s), 7,69 (1H, br, s), 7,74 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.

10) Widmo ¹³C magnetycznego rezonansu jądrowego ζι^ϊ^ιη^ε^ι^ετ w deuuerowanym sulfoUenku dimetylowym z tetrametylosilanem jako wzorcem wewnętrznym. Widmo 1³C magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 52,0 (q), 57,3 (q), 61,5 (d), 64,9 (d), 72,1 (d), 75,4 (d), 78,2 (d), 81,3 (d), 89,0 (d), 99,2 (d), 101,2 (d), 114,2 (d), 139,2 (s), 139,8 (d), 150,3 (s), 161,8 (s), 163,1 (s), 170,1 (s) ppm.

11) Wysokosprawna chromatografia cieczowa (dalej w skrócie jako „HPLC”)

Kolumna: „Senshu Pack ODS-H-2151” 6 φ x 150 mm (produkt Senshu Scientific Co., Ltd.).

Rozpuszczalnik: 0,04% wodny kwas trifluorooctowy zawierający 4% acetonitrylu.

Szybkość przepływu: 1,0 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Czas retencji: 21 minuty.

P r z y k ł a d 45. Oczyszczanie związków A-500359F i A-500359H

W trakcie oczyszczania ujawnionego poniżej frakcję aktywną monitorowano za pomocą HPLC z użyciem poniższej kolumny i warunków analitycznych.

Rozpuszczalnik: 0,04% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,5 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Czas retencji: 8 minut (związek A-500359H); 18 minut (związek A-500359F).

l nie adsorbowanej frakcji po przemyciu otrzymanej w przykładzie 44 doprowadzono do pH 9 za pomocą 6N wodorotlenku sodu i frakcją tą naniesiono na kolumną (8,5 l) zawierającą „Diaion PA316 (Cl'¹)” (produkt Mitsubishi Chemical). Kolumnę przemyło 27 l dejonizowanej wody i zaadsorbowaną substancję eluowano następnie 27 l 0,1N kwasu solnego.

Eluat skorygowano do pH 6N wodorotlenkiem sodu, a następnie naniesiono na kolumną z węglem aktywowanym (2 l). Kolumnę przemyto 8 l dejonizowanej wody, a substancje aktywną następnie wyeluowano 8 l 0,5N wodnego amoniaku zawierającego 10% acetonu. Zatężenie i liofilizacja uzyskanego eluatu dostarczyły 28 g proszku.

Uzyskany proszek rozpuszczono w 400 ml destylowanej wody. Po doprowadzeniu do pH 3,0, uzyskany roztwór naniesiono na kolumnę (2 l), którą kondycjonowano wodą i zawierającą „Diaion CHP-20P” (produkt Mitsubishi Chemical). Nie zaadsorbowaną ciecz i frakcje z przemycia zebrano, zatężono i liofilizowano, otrzymując 12 g lepkiej substancji.

Tą lepką substancję rozpuszczono w 200 ml destylowanej wody. Po doprowadzeniu do pH 3,3 za pomocą kwasu trifluorooctowego, uzyskany roztwór naniesiono na kolumnę (1 l) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifiuorooctowym i zawierającą „Diaion CHP-20P” (produkt Mitsubishi Chemical). Po rozwinięciu kolumny 2 l 0,04% wodnego kwasu trifluorooctowego i połączeniu frakcji (frakcja H) wyeluowanych pomiędzy 0,8 i 1,4 l, roztwór eluujący zamieniono na 2 l destylowanej wody. Zatężenie i liofilizacja 2 l frakcji (frakcja F) eluowanej destylowaną wodą dostarczyło 605 mg proszku.

600 ml frakcji H rozcieńczono destylowaną wodą do 1 l i jej pH skorygowano do 2,8 kwasem trifiuorooctowym, a uzyskany roztwór naniesiono ponownie na kolumnę (1 l) zawierającą „Diaion CHP20P” (produkt Mitsubishi Chemical) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifiuorooctowym. Frakcje 8 do 11, otrzymane wskutek dzielenia eluatu na porcje po 200 ml, zatężono i liofilizowano otrzymu74

PL 200 426 B1 jąc 233 mg proszku. 100 mg porcję uzyskanego proszku rozpuszczono w 5 ml wody i 1 ml porcję uzyskanego roztworu naniesiono na kolumnę HPLC („Senshu Pak ODS-H-5251”: 20 φ x 250 mm; produkt Senshu Scientific) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifiuorooctowym. Kolumnę rozwijano przy szybkości przepływu 10 ml/min. Zarejestrowano absorpcję frakcji aktywnej przy 210 nm i zebrano pik wyeluowany o czasie retencji 14 do 16 minut, przeprowadzając operację pięciokrotnie. Tak otrzymane frakcje zatężono na wyparce rotacyjnej, a następnie liofilizowano, otrzymując 23 mg związku A-500359H w postaci czystego produktu.

W 15 ml wody rozpuszczono 605 mg liofilizowanego proszku z frakcji F i 1 ml porcje uzyskanego roztworu nanoszono na kolumnę HPLC (Senshu Pak ODS-H-5251”: 20 φ x 250 mm; produkt Senshu Scientific) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifluorooctowym. Kolumnę rozwijano przy szybkości przepływu 10 ml/min. Zarejestrowano absorpcję frakcji aktywnej w rejonie nadfioletu przy 210 nm i frakcjonując zebrano pik wyeluowany o czasie retencji 29 do 31 minut, przeprowadzając operację 15 razy. Tak otrzymane frakcje zatężono na wyparce rotacyjnej, a następnie liofilizowano, otrzymując 134 mg związku A-500359F w postaci czystego produktu.

Związek A-500359F ma następujące właściwości fizykochemiczne:

1) Wygląd substancji: biały proszek.

2) Roozuszzczlnośś: roozuszzczlny w woddie, słaao roozuszzczlny w metanolu, nierzozuszczalny w normalnym heksanie i chloroformie.

3) Wzór sumaryczny: C17H21N3O12.

4) Ciężar cząsteczkowy: 459 (oznaczony przez spektrometrię masową FAB).

5) Dośłaany menz [ M+H]', zmierozśy przze szpktrometrię menzwo FAB woszśiet rooZdielcczści, jest następująca: znaleziono: 460,1201; obliczono: 460,1203.

6) Widme aaozrppcjnyw nyafioleeie:widme aaozrppcjnyw nyafioleeiezmierzzśyw wo0diewokazuje następujące maksimum absorpcji: 262 nm (ε 7000).

7) Sl^r^c^^lr^c^^ći optyczna: sl^r^^c^^lr^cj^ći optyczna zmierzona w wodzże wykazuje nassępującą warto^ść: [ajD²⁰: +¹¹¹° (c ^0,4Ί).

8) Wdn^m paozśopcjeyw pp0dczer/ieni: widme paozśopcjeyw ppOdczer/ienipmierzzśy mm^^oą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3391,2941, 1684, 1466, 1400¹ 1333¹ 1269^,1205^,1137^, 11^ 1062^, 1020 cm^-1.

9) Widmo [H meanytaycnyeo roezśynyu [edrowoeo zmierozśo w [lennu ddujaru z szyrιyłam wody jako 4,75 ppm. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 3,37 (3H, s), 3,79 (1H, dd, J = 5,1,6,4 Hz), 4,17 (1H, ddd, J = 1,6, 3,4, 4,6 Hz), 4,38 (1H, dd, J = 3,5, 5,1 Hz), 4,48 (1H, dd, J = 2,4, 6,4 Hz), 4,49 (1H, ddd, J = 0,6, 2,7, 4,6 Hz), 4,69 (1H, d, J = 2,4 Hz), 5,32 (1H, dd, J = 0,6, 3,4 Hz), 5,77 (1H, d, J = 3,5 Hz), 5,90 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,11 (1H, dd, J = 1,6, 2,7 Hz), 7,75 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.

10) Widmm [ ³C mć^ao^^^c^cn^eg poezśynyzj ednowoeg zmierozśy w [ ΙοπΟτ ódete™ ρ [,4-ό^ sanem (67,4 ppm) jako wzorcem wewnętrznym. Widmo 1³C magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 58,6 (q), 62,7 (d), 65,5 (d), 72,7 (d), 76,3 (d), 78,8 (d), 91,2 (d), 100,0 (d), 102,7 (d),

114,8 (d), 1 10,T®, 1 1 5221 W, 1 65^^-sł, 1 66,0®, 1 77,9(słppm.

11) Analiza HPLC

Oozpuszczalnik: 0,04% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,5 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Czas retencji: 18 minut.

Związek A-500359H ma następujące właściwości fizykochemiczne:

1) Wygląd substancji: biały proszek.

2) Oozpuszczalność: rozpuszczalny w wodzie, słabo rozpuszczalny w metanolu, nierozpuszczalny w normalnym heksanie i chloroformie.

3) Wzór sumaryczny: C16H19N3O12.

4) Ciężar cząsteczkowy: 445 (oznaczony przez spektrometrię masową FAB).

5) DośUaany mmas [ M++H', pmierozśy ρ^η pzpnrrometrię menzwo FAA woszśiej pooZdielcczści, jest następująca: znaleziono: 446,1025; obliczono: 446,1047.

6) Widdm aaozrppcjnyw nya)ioleeie:widąe aaozrppcjnyw nya)ioleeiezmierzzśyw wo0diewokazuje następujące maksimum absorpcji: 262 nm (ε 7400).

PL 200 426 B1

7) Skręcalność optyczna: skręcalność optyczna zmierzona w wodzie wykazuje następującą wartość: [ζ]_ο ²⁰: +115°(a 0,33).

8) VWdmoaZskrpuajnaw pudzaoirzieri: widmo aZstrpuajnow pudzaoirr/ierizmierzonomerodz o uzktciac bromku untatu (KBr) wcazouje azktcuujcae maksima zSkoruaji: 3361, 2934, 1683, 1467, 1403¹ 1336¹ 1270¹ 1206^, 11^ 1090^, 1058^, 1021 am^-1.

9) VWdmo ¹H moznarycanaeo rzeonazak jeCrowoeo zmierzono w tlerOu dzejerr z sycnałem woZc jzUo 4,75 uum. Widmo ¹H mzoaetcaoaeoo reooazaku jcZrowroo jrkt azktcuujcar: 4,13 (Sr, t, J = 5,4 Ho), 4,15-4,19 (2H), 4,43 (1H, ZZ, J = 2,5, 5,8 Ho), 4,48 (1 H, ZZ, J = 2,9, 4,7 Ho), 4,72 (1H, Z, J = 2,5 Ho), 5,31 (1H, Z, J = 4,0 Ho), 5,80 (1H, Z, J = 4,0 Ho), 5,89 (1H, Z, J = 8,3 Ho), 6,12 (1H, ZZ, J = 1,4, 2,9 Ho), 7,75 (1H, Z, J = 8,3 Ho) uum.

10) WidZm i ³C mozoorycanoeo tzeonozakj jCroworo zmierzono w t lerau dZrueru z t,4-diodr kzarm (67,4 uum) jzUo wooraem wewactroacm. WiZmo C mzoaetcaoaeoo reooazaku jcZrowego jekt azktcuujcae: 62,8 (Z), 65,8 (Z), 70,3 (Z), 74,6 (Z), 77,0 (Z), 84,2 (Z), 90,3 (Z), 100,3 (Z), 102,9 (Z),

113,9 (d), 1 14,2 25^ 1 1 122^, 1 16,9(s), 1 16,0(5), 1 14,22s)p um.

11) Aazlioz HPLC

Kolumaz: „Seakhu PzU ODS-H-2151” 6 φ x 150 mm (uroZuUt Seakhu Saieatifia Co., LtZ.).

RoouukoaozlaiU: 0,04% woZac Uwzk trifluorooatowc.

SocSUość uroeutywu: 1,5 ml/mia.

DeteUajz: UV 210 am.

Cozk reteaaji: 8 miaut.

P r o c U ł z Z 46. HoZowlz Streptomyces griseus koaoeuu SANK 60196 (FERM BP-5420)

Do UzżZej o troeah 21 UolS Erleamecerz, o Utórcah UzżZz ozwierz 500 ml śroZowikUz hoZowlzaeoo Zo uokiewu o aiżej ujzwaioacm kUłzZoie ZoZzao aelem iaoUulzaji, zkeutcaoaie, aoterc uełae uctliaoUi koaoeuu SANK60196. KolSc wctrockzao az wctrockzrae rotzacjaej w 23°C uroc 210 rum, z azktcuaie wktcuac hoZowlc uokiewowc urowzZooao uroeo 3 Zai.

ŚroZowikUo hoZowlzae Zo uokiewu ozwierz azktcuujcae kUłzZaiUi w 1000 ml woZc woZoaicoowej:

oluUooz 20 o roouukoaozlaz kUroSiz 10 o urzkowzae ZrożZże 9 o eUktrzUt mickac 5 o uoliueutoa 5 o ahloreU koZu 5 o wcolza wzuaiz 3 o śroZeU uroeaiwuieaicac (CB442) (uroZuUt NOF Coruorztioa) 50 mo

Po kUorcoowzaiu uH Zo 7,4, urowzZooao ktercliozajc w 121°C uroeo 20 miaut.

Pierwkoc hoZowlc uokiewowc, tzU otrocmzac, iaoUulowzao 3% w 60 l oSioraiUu ozwierzjcacm 30 l teoo kzmeoo śroZowikUz Zo hoZowli wktcuaej, z Zruoc hoZowle uokiewowc urowzZooao o azuowietrozaiem i miekozaiem w 23°C uroeo 24 ooZoiac.

HoZowlc urowzZooao tzU jzU ujzwaioao uoaiżej. DoUłzZaiej, Sulioa Zruoiej hoZowli uokiewowej iaoUulowzao 3% (oSj./oSj.) w Zwóah 600 l oSioraiUzah, o Utórcah UzżZc ozwierzł 400 l kterclioowzaeoo śroZowikUz, uoaiżej ujzwaioaeoo, i hoZowlc urowzZooao o azuowietrozaiem i miekozaiem w 23°C uroeo 6 Zai.

ŚroZowikUo Zo hoZowli ozwierz azktcuujcae kUłzZaiUi w 1000 ml woZc woZoaicoowej:

Po kUorcoowzaiu uH Zo 7,4, ZoZzao 3 o wcolzau wzuaiz i miekozaiac kterclioowzao w 125°C uroeo 20 miaut.

P r o c U ł z Z 47. Oaockoaozaie owicoUu A-500359E

Bulioa hoZowlzac 810 l) otrocmzac w urncUłzZoie 46 uroekcaooao o użcaiem „Celite 545” (uroZuUt Celite Coruorztioa).

PL 200 426 B1

W trakcie dalszego oczyszczania, frakcję aktywną monitorowano za pomocą HPLC stosując kolumnę i warunki analizy ujawnione poniżej.

Kolumna: „YMC-Pak ODS-A A-312” 6 φ x 150 mm (produkt YMC).

Rozpuszczalnik: 0,04% wodny kwas trifluorooctowy zawierający 4% acetonitrylu.

Szybkość przepływu: 1,0 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Czas retencji: 19,8 minuty.

Uzyskany przesącz (800 l) naniesiono na kolumnę (160 l) zawierającą „Diaion HP-20” (produkt Mitsubishi Chemical). Kolumnę przemyło 640 l dejonizowanej wody i frakcję nie zaadsorbowaną oraz frakcję z przemycia połączono (nie zaadsorbowaną frakcją z przemycia). Zaadsorbowaną substancję eluowano 348 110% wodnego acetonu.

Po zatężeniu wueluowanej frakcji do 10, pozostałość naniesiono na kolumnę (45 l) zawierającą „Diaion CHP-20P” (produkt Mitsubishi Chemical). Kolumnę następnie przemyło 90 l dejonizowanej wody, 100 l 10% wodnego metanolu i 100 l 15% wodnego metanolu. Zaadsorbowaną substancję wyeluowano 100 l 20% wodnego metanolu.

Po zatężeniu frakcji z 20% wodnym metanolem do 51, koncentrat naniesiono na kolumnę (22 l) zawierającą „Toyopearl HW40F” (produkt TOSOH Corporation). Kolumnę eluowano dejonizowaną wodą i zebrano eluat we frakcjach po 5 l. Substancję aktywną mającą czas retencji 19,8 minuty, według wyżej ujawnionego HPLC, wyeluowano we frakcjach nr 3 do 6. Uzyskane frakcje zatężono do 5,8 l i liofilizowano dostarczając 55,8 g proszku.

Uzyskany proszek rozpuszczono w 1,2 l dejonizowanej wody. 200 ml porcją uzyskanego roztworu naniesiono na kolumnę HPLC („YMC-Pack ODS-1050-20-SR”: 100 φ x 500 mm; produkt YMC) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifluorooctowym zawierającym 4% acetonitrylu. Kolumnę rozwijano przy szybkości przepływu 200 ml/min. 0,04% wodnym kwasem trifluorooctowym zawierającym 4% acetonitrylu. Substancja aktywna miała czas retencji 105 do 124 minut. Operacją tą powtórzono 6 razy. Uzyskane frakcje połączono, a następnie zatążono do 200 ml za pomocą „Evapor” i liofilizowano otrzymując 24,3 g związku A-500359E w postaci czystej.

P r z y k ł a d 48. Oczyszczanie związków A-500359F i A-500359H

W trakcie oczyszczania ujawnionego poniżej frakcją aktywną monitorowano za pomocą HPLC z użyciem poniższej kolumny i warunków analitycznych.

Kolumna: „YMC-Pak ODS-A A-312” 6 φ x 150 mm (produkt YMC).

Rozpuszczalnik: 0,04% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,5 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Czas retencji: 7,7 minuty (związek A-500359H); 16,6 minuty (związek A-500359F).

Nie adsorbowana frakcja po przemyciu (1370 l) otrzymana w przykładzie 47 została naniesiona na kolumną z węglem aktywowanym (65 l). Po przemyciu kolumny 260 l dejonizowanej wody, substancję aktywną eluowano 270 l 0,5N wodnego amoniaku zawierającego 10% acetonu. Po zatężeniu eluatu do 40 l i doprowadzeniu koncentratu do pH 2,4 za pomocą kwasu trifluorooctowego, naniesiono go na kolumnę (45 l) zawierającą „Diaion CHP-20P” (produkt Mitsubishi Chemical) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifluorooctowym. Kolumną rozwijano 0,04% wodnym kwasem trifluorooctowym dostarczając frakcję (frakcję H) wyeluowaną w 0 do 47 l oraz drugą frakcję (frakcję F) wyeluowaną w 47 do 91 l. Frakcję H zatężono do 1,5 l, natomiast frakcję F otrzymano w postaci 287 g proszku po zatężeniu i liofilizacji.

Koncentrat frakcji H rozcieńczono dejonizowaną woda do 3,2 l. Porcję 160 ml naniesiono na kolumnę HPLC („YMC-Pack ODS-1050-20-SR”: 100 φ x 500 mm; produkt YMC) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifluorooctowym, a następnie rozwijano przy szybkości przepływu 200 ml/min. Zarejestrowano absorpcję aktywnej frakcji przy 210 nm i frakcjonując, zebrano pik wyeluowany z czasem retencji 67 do 72 minut. Operację tą powtórzono 20 razy. Tak otrzymane frakcje zatężono za pomocą „Evapor” (produkt Okawara Seisakujo) i liofilizowano dostarczając 5,9 g związku A-500359H w postaci czystego produktu.

Porcję 277 g frakcji F w postaci proszku rozpuszczono w 50 l dejonizowanej wody i uzyskany roztwór doprowadzono do pH 2,2 za pomocą kwasu trifluorooctowego. Roztwór naniesiono ponownie na kolumnę (45 l) zawierającą „Diaion CHP-20P” (produkt Mitsubishi Chemical) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifluorooctowym. Po przemyciu kolumny 97 l 0,04% wodnego kwasu trifluPL 200 426 B1 orooctowego, substancję aktywną wyeluowano 120 l dejonizowanej wody. Wyeluowaną frakcję z dejonizowaną wodą zatężono i liofilizowano, otrzymując 75,6 g frakcji F w postaci liofilizowanego proszku.

Uzyskany liofilizowany proszek frakcji F rozpuszczono w 4 l wody. 150 ml porcję roztworu naniesiono na kolumnę HPLC („YMC-Pak ODS-1050-20-SR”, 100 φ x 500 mm; produkt YMC) równowagowaną mieszaniną 0,5% acetonitrylu i 0,04% wodnego kwasu trifluorooctowego, a następnie rozwijano tym samym układem rozpuszczalnikowym przy szybkości przepływu 200 ml/min. Rejestrowano absorpcją substancji aktywnej w rejonie nadfioletowym 210 nm i frakcjonując zebrano pik eluowany w czasie retencji 88 do 97 minut, Operację tą powtórzono 27 razy. Tak otrzymane frakcje zatężono i liofilizowano, otrzymując 19,2 g związku A-500359F w postaci czystego produktu.

P r z y k ł a d 49. Sposób otrzymywania związku A-500359F i pochodnej amidowej związku A-500359F (konwersja chemiczna związku A-500359E z użyciem wodnego amoniaku)

Związek A-500359E (75 mg) otrzymany w przykładzie 44 rozpuszczono w 2 ml 0,5N wodnego amoniaku. Uzyskany roztwór pozostawiono w temperaturze pokojowej na 2 godziny. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną liofilizowano dostarczając 78 mg proszku.

Uzyskany proszek rozpuszczono w 1 ml 0,04% wodnego TFA. 100 ul porcję uzyskanego roztworu naniesiono na kolumnę HPLC („Capcellpak UG 120L”, 20 φ x 250 mm; produkt Shiseido) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifiuorooctowym przy szybkości przepływu 10 ml/min. Rejestrowano absorpcję substancji aktywnej przy 210 nm i frakcjonując zebrano pik eluowany w czasie retencji 21 do 22 minut oraz w czasie retencji 31 do 33 minut, przy czym operację tą powtórzono 10 razy.

Frakcje wyeluowane w czasie retencji 21 do 22 minut zatężono na wyparce rotacyjnej i liofilizowano, otrzymując 14 mg pochodnej amidowej związku A-500359F w postaci czystej.

Frakcje wyeluowane w czasie retencji 31 do 33 minut zatężono na wyparce rotacyjnej i liofilizowano, otrzymując 50 mg związku A-500359F w postaci czystej.

Pochodna amidowa związku A-500359F ma następujące właściwości fizyko-chemiczne:

1) Wygląd substancji: biały proszek.

2) Rozpuszczalność: rozpuszczalny w wodzie, słabo rozpuszccalny w metanolu, nif^rc^z^f^i^^s^czalny w normalnym heksanie i chloroformie.

3) Wzór sumaryczny: C17H22N4O11.

4) Ciężar cząsteczkowy: 458 (oznaczony przez spektrometrię masową FAB).

5) Doołaana mass [M+H]⁺, zmierzzśa przze sppktrometrię masswą FAB wyszśiet rooZz:ielcz:zści, jest następująca: znaleziono: 459,1328; obliczono: 459,1364.

6) Widma aaszśzpc-naw naafioleeie:widma aaszśzpc-naw naanioleeiezmierzzśaw woodiewykazuje następujące maksimum absorpcji: 258 nm (ε 7500).

7) optyczna: skręcalność optyczna zmierzona w wodzże wykazuje nassępującą warto^ść: [ajD²⁵ +¹¹⁹°(c ^0,87)^.

8) VWdmo aaszśzpc-na w ppddczer/ieni: widmo aaszśzpc-na w ppddczer/ieni [1^0(^ z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3339,2943, 1686, 1598, 1495^, 1402^, 1337^, 1272^, 1205^, 1136^, 11^ 1060^, 1019 cm^-1.

9) Widmo ¹H magnetycznego rezonannu [ądrowego zmierzono w tlenku z sygnałem wody jako 4,75 ppm. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 3,30 (3H, s) 3,67 (1H, dd, J = 5,0, 6,8 Hz), 4,17 (1H, ddd, J = 1,8, 2,9, 4,4 Hz), 4,35 (1H, dd, J = 3,2, 5,0 Hz), 4,43 (1H, dd, J = 2,3, 6,8 Hz), 4,45 (1H, dd, J = 2,4, 4,4 Hz), 4,66 (1H, d, J = 2,3 Hz), 5,35 (1H, d, J = 2,9 Hz), 5,71 (1H, d, J = 3,2 Hz), 5,85 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,97 (1H, dd, J = 1,8, 2,4 Hz), 7,71 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.

10) Wdru [³C maanatyycnaeo reeonasau [ ądroweeo zmierzzśo w ttenku deujoru z 1,4-dioksanem (67,4 ppm) jako wzorcem wewnętrznym.

Widmo C magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 58,6 (q), 62,7 (d), 65,3 (d), 72,6 (d), 75,7 (d), 78,7 (d), 82,3 (d), 91,3 (d), 99,8 (d), 102,7 (d), 110,8 (d), 141,9 (d), 142,3 (s), 152,1 (s), 166,0 (s), 167,0 (s) ppm.

11) Analiza HPLC

Kolumna: „Senshu Pack ODS-H-2151”, 6 φ x 150 mm (produkt Senshu Scientific Co., Ltd.).

Rozpuszczalnik: 0,04% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,5 ml/min.

Detekcja: UV 210 nm.

Czas retencji: 11 minut.

PL 200 426 B1

P r z y k ł a d 50. Otrzymywanie związku A-500359F (hydroliza związku 500359E wodorotlenkiem sodu)

Związek A-500359E (4,4 mg) otrzymany w przykładzie 44 rozpuszczono w 0,5 ml destylowanej wody. Dodano kroplami 0,5 ml 0,02N wodnego wodorotlenku sodu, a następnie dodano kroplami 1 ml 0,1N wodnego wodorotlenku sodu. Uzyskaną mieszaninę pozostawiono w temperaturze pokojowej na 50 minut. Mieszaninę reakcyjną zobojętniono 1N kwasem solnym, a następnie naniesiono na 2 ml kolumnę z węglem aktywowanym. Kolumnę przemyło 8 ml destylowanej wody, a następnie produkt reakcji wyeluowano 8 ml 0,5N wodnego amoniaku zawierającego 10% acetonu.

Po zatężeniu eluatu do 700 μ|, koncentrat naniesiono na kolumnę HPLC („Senshu Pak ODS-H-4251”; 10 φ x 250 mm; produkt Senshu Scientific) równowagowaną 0,04% wodnym kwasem trifluorooctowym, a następnie eluowano przy szybkości przepływu 4 ml/min. Rejestrowano absorpcję substancji aktywnej przy 210 nm i frakcjonując zebrano pik eluowany w czasie retencji 25 do 30 minut. Operacją tą powtórzono trzy razy. Tak otrzymane frakcje zatężono na wyparce rotacyjnej i liofilizowano, otrzymując 2,6 mg związku A-500359F w postaci czystej.

P r z y k ł a d 51. Hodowla Streptomyces griseus szczepu SANK 60196 (FERM BP-5420)

Jedną pętliczkę szczepu SANK60196 wysterylizowano, a następnie inokulowano w 500 ml kolbie Erlenmeyera (kolba do posiewu) zawierającej 100 środowiska o składzie ujawnionym poniżej. Hodowlę posiewową prowadzono przez 3 dni wytrząsając na wytrząsarce rotacyjnej w 23°C przy 210 rpm.

maltoza 30 g ekstrakt mięsny 5 g polipepton 5 g chlorek sodu 5 g węglan wapnia 3 g środek przeciwpieniący (CB442) (produkt NOF Corporation) 50 m0

Po skorygowaniu pH do 7,4, prowadzono sterylizację w 121°C przez 30 minut.

Hodowlę prowadzono tak, jak ujawniono poniżej. Dokładniej, hodowlę posiewową inolulowano

3% (obj./obj.) w dwóch 500 ml kolbach Erlenmeyera, z których każda zawierała 100 ml sterylizowanego środowiska o składzie ujawnionym poniżej. Hodowlę prowadzono przez 11 dni wytrząsając na wytrząsarce rotacyjnej w 23°C przy 210 rpm.

glukoza 20 g ekstrakt mięsny 5 g polipepton 5 g mleko odtłuszczone 10 g kukurydziany płyn namokowy 10 g chlorek sodu 5 g środek przeciwpieniący (CB442) (produkt NOF Corporation) 50 m0

Po skorygowaniu pH do 7,4, prowadzono sterylizację w 125°C przez 30 minut.

P r z y k ł a d 52. Oczyszczanie związku A-500359J

W trakcie dalszego oczyszczania frakcję aktywną monitorowano za pomocą HPLC stosując poniższą kolumnę i warunki analityczne.

Kolumna: Pegasil ODS”, 6 φ x 150 mm (produkt Senshu Scientific Co., Ltd.).

Rozpuszczalnik: 0,04% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,0 ml/min.

Detekcja: DV 260 nm.

Czas retencji: 5,57 minuty.

Bulion hodowlany otrzymany w przykładzie 51 przesączono z użyciem „Celite 545” dodanym w 5% (wag./obj.). Otrzymany przesącz (1 l) naniesiono na kolumnę (200 ml) „Diaion HP-20”. Kolumnę następnie przemyło destylowaną wodą (500 ml). Po skorygowaniu pH do 9, 1,5 l nie zaadsorbowanej frakcji, za pomocą 6N wodorotlenku sodu, frakcję naniesiono na kolumnę (100 ml) „Dowex SBR-P (OH)”. Kolumnę przemyto destylowaną wodą (300 ml) i zaadsorbowaną substancję wyeluowano 300 ml 1N kwasu solnego.

Po skorygowaniu pH, po elucji, do 7 wodorotlenkiem sodu, eluat naniesiono na kolumną (50 ml) z węglem aktywowanym. Kolumną przemyło destylowaną wodą (100 ml) i substancją aktywną rozcieńczono 60% wodnym acetonem (200 ml). Zatężanie i liofilizacja eluatu dostarczyły 558 mg proszku.

PL 200 426 B1

Proszek rozpuszczono w 5 ml destylowanej wody i 500 μΙ porcje uzyskanego roztworu naniesiono na kolumną HPLC („Senshu Pack Pegasil ODS”; 20 φ x 250 mm; produkt Senshu Scientific) równowagowaną 0,05% wodnym kwasem trifluorooctowym. Rozwijano przy szybkości przepływu 10,0 ml/min. Rejestrowano absorpcją w nadfiolecie substancji aktywnej przy 260 nm i frakcjonując zebrano pik eluowany w czasie retencji 11,1 minuty, przy czym operacją tą powtórzono 10 razy. Tak otrzymane frakcje zatążono na wyparce rotacyjnej i liofilizowano, otrzymując 16,2 mg substancji A-500359J w postaci czystej.

Związek A-500359J ma następujące właściwości fizykochemiczne:

1) Wygląd substancji: biały proszek.

3) Wzór sumaryczny: C16H21N3O13.

4) Ciążar cząsteczkowy: 463 (oznaczony przez spektrometrią masową FAB).

5) Dokładna masa [M+H]+ zmierzona przez spektrometrią masową FAB wysokiej rozdzielczości, jest następująca: znaleziono: 462,0996; obliczono: 462,1006.

6) Widmo absorpcyjne w nadfiolecie: widmo absorpcyjne w nadfiolecie zmierzone w wodzie wykazuje następujące maksima absorpcji: 194 (ε 8800), 262 (ε 10000) nm.

7) Skręcalność optyczna: skręcalność optyczna zmierzona w wodzie wykazuje następującą warto^ść: [a]D²⁸: +⁸³°(c ^0,1,H2^O).

8) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3372, 2931, 1684, 1467, 1407^, 1273^, 1204^, 1107^, 1058 cm^-1.

9) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w tlenku deuteru z 1,4-dioksanem (3,53 ppm) jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 3,75 (1H, t, J = 3,4 Hz), 3,83 (1H, ddd, J = 1,4, 1,9, 3,4 Hz), 4,02 (1H, ddd, J = 1,4, 1,7, 3,4 Hz), 4,05 (1H, dd, J = 5,3, 5,6 Hz), 4,11 (1H, t, J = 5,6 Hz), 4,13 (1H, dd, J = 3,1, 5,6 Hz), 4,30 (1H, d, J = 5,3 Hz), 4,33 (1H, d, J = 1,7 Hz), 4,90 (1H, d, J = 1,9 Hz), 5,50 (1H, d, J = 3,1 Hz), 5,7 (1H,d, J = 8,2 Hz), 7,6 (1H, d, J = 8,2Hz) ppm.

10) Widmo 1³C magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w tlenku deuteru z 1,4-dioksanem (67,4 ppm) jako wzorcem wewnętrznym. Widmo 1³C magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 64,4 (d), 68,8 (d), 68,9 (d), 69,7 (d), 71,4 (d), 73,0 (d), 75,4 (d), 82,8 (d), 90,7 (d), 99,2 (d), 101,7 (d), 141,6 (d), 151,0 (s), 165,9 (s), 171,9 (s), 172,6 (s) ppm.

11) Analiza HPLC

Rozpuszczalnik: 0,05% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,0 ml/min.

Detekcja: UV 260 nm.

Czas retencji: 5,57 minut.

P r z y k ł a d 53. Hodowla Streptomyces griseus szczepu SAN K 60196 (FERM BP-5420)

Jedną pętliczkę szczepu SANK60196 wysterylizowano, a następnie inokulowano w 500 ml kolbie Erlenmeyera (kolba do posiewu) zawierającej 100 środowiska o składzie ujawnionym poniżej. Wstępną hodowlę prowadzono przez 3 dni wytrząsając na wytrząsarce rotacyjnej w 23°C przy 210 rpm.

Środowisko do hodowli wstępnej zawiera następujące składniki w 1000 ml wody wodociągowej:

maltoza 30 g ekstrakt mięsny 5 g polipepton 5 g chlorek sodu 5 g węglan wapnia 3 g środek przeciwpieniący (CB442) 50 m0

Po skorygowaniu pH do 7,4, prowadzono sterylizację w 121°C przez 30 minut.

Hodowlę prowadzono tak jak ujawniono poniżej. Dokładniej, hodowlę wstępną inolulowano

3% (objętościowo/objętościowo) w dziesięciu 500 ml kolbach Erlenmeyera, z których każda zawierała 100 ml sterylizowanego środowiska o składzie ujawnionym poniżej. Hodowlę prowadzono wytrząsając kolby na wytrząsarce rotacyjnej w 23°C przy 210 rpm. Sześć godzin po rozpoczęciu hodowli dodano sterylizowany filtracyjnie chlorowodorek S-(2-aminoetylo)-L-cysteiny i L-alliloglicynę do finalnego stężenia 10 mM. Hodowlę następnie kontynuowano przez 7 dni.

PL 200 426 B1

maltoza 30 g ekstrakt drożdżowy (produkt Difco Laboratories) 5 g ekstrakt mięsny 5 g polipepton 5 g chlorek sodu 5 g węglan wapnia 3 g środek przeciwpieniący (CB442) 50 mg

Po skorygowaniu pH do 7,4, prowadzono sterylizację w 125°C przez 30 minut.

P r z y k ł a d 54. Oczyszczanie substancji A-500359M-3

Bulion hodowlany (1 l) otrzymany w przykładzie 53 wirowano przy 3000 rpm przez 20 minut i oczyszczano uzyskany supernatant.

W trakcie dalszego oczyszczania frakcję aktywną monitorowano za pomocą HPLC z wykorzystaniem poniższej kolumny i warunków analitycznych.

Kolumna: „Pegasil ODS” 6 φ x 150 mm (produkt Senshu Scientific).

Rozpuszczalnik: 7,2% acetonitryl - 0,05% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,0 ml/min.

Detekcja: UV 260 nm.

Czas retencji: 10,1 minuty.

Po doprowadzeniu supernatantu do pH 3 za pomocą kwasu trifluorooctowego, uzyskany roztwór (1 l) naniesiono na kolumnę (200 ml) „Diaion HP-20” równowagowaną 0,05% kwasem trifiuorooctowym. Kolumnę przemyło 0,05% wodnym kwasem trifiuorooctowym (500 ml), a następnie eluowano destylowaną wodą (500 ml). Otrzymany eluat z destylowaną wodą (500 ml) zatężono o liofilizowano dostarczając 230 mg surowego sproszkowanego produktu.

Surowy sproszkowany produkt rozpuszczono w 2 ml destylowanej wody i 500 μΙ porcje uzyskanego roztworu naniesiono na kolumnę HPLC („Pegasil ODS”, nazwa handlowa; 20 φ x 250 mm; produkt Senshu Scientific) równowagowaną 0,05% wodnym kwasem trifluorooctowym zawierającym 7% acetonitrylu.

Kolumnę rozwijano tym samym rozpuszczalnikiem przy szybkości przepływu 10,0 ml/min i rejestrowano absorpcję w nadfiolecie przy 210 nm, eluując substancję aktywną z czasem retencji 28,0 minut. Operację tą powtórzono cztery razy, eluaty połączono, zatężono i liofilizowano, otrzymując 11,1 mg substancji A-500359M-3 w postaci czystej.

Związek A-500359M-3 ma następujące właściwości fizykochemiczne:

1) Wygląd substancji: biały proszek.

2) Rozpuszczalność: rozpuszczalny w wodzie i w metanolu, nierozpuszczalny w normalnym heksanie i chloroformie.

3) Wzór sumaryczny: C22H28N4O13.

4) Ciężar cząsteczkowy: 556 (oznaczony przez spektrometrię masową FAB).

5) Dokładna masa [M+H]⁺, zmierzona przez spektrometrię masową FAB wysokiej rozdzielczości, jest następująca: znaleziono: 557,1754; obliczono: 557,1731.

6) Widmo absorpcyjne w nadfiolecie: widmo absorpcyjne w nadfiolecie zmierzone w wodzie wykazuje następujące maksimum absorpcji: 236 nm (ε 10,000).

7) Skręcalność optyczna: skręcalność optyczna zmierzona w wodzie wykazuje następującą warto^ść: [a]D²⁶: +⁹²°(c ^0,1,H2^O).

8) Widmo absorpcyjne w podczerwieni: widmo absorpcyjne w podczerwieni zmierzone metodą z pastylką bromku potasu (KBr) wykazuje następujące maksima absorpcji: 3407, 2938, 1684, 1524, 1465^, 1399^, 1385^, 1335^, 1268^, 1205^, 1139, 11^ 1095^,1063^, 1021 cm^-1.

9) Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w tlenku deuteru z 1,4-dioksanem (3,53 ppm) jako wzorcem wewnętrznym. Widmo ¹H magnetycznego rezonansu jądrowego jest następujące: 2,44 (1H, ddd, J = 4,3, 7,3, 13,3 Hz), 2,52 (1H, ddd, J = 4,3, 7,5, 13,3 Hz), 3,27 (3H, s), 3,66 (1H, t, J = 5,5 Hz), 4,17 (1H, ddd, J = 1,1,2,5, 3,1 Hz), 4,32 (1H, dd, J = 3,7, 5,5 Hz), 4,33 (1H, t, J = 4,3 Hz), 4,45 (1H, m), 4,46 (1H, m), 4,73 (1H nakładający się z HDO), 5,07 (1H, d, J = 10,2 Hz), 5,36 (1H, d, J = 3,1 Hz), 5,51 (1H, d, J = 17,1 Hz), 5,58 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,73 (1H, m), 5,74 (1H, d, J = 3,7 Hz), 5,95 (1H, dd, J = 1,1, 1,9 Hz), 7,72 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.

10) Widmo 1³C magnetycznego rezonansu jądrowego zmierzono w tlenku deuteru z 1,4-dioksanem (67,4 ppm) jako wzorcem wewnętrznym. Widmo 1³C magnetycznego rezonansu jądrowego jest

PL 200 426 B1 następujące: 37,1 (t), 55,4 (d), 58,6 (q), 62,6 (d), 65,3 (d), 72,6 (d), 75,7 (d), 78,9 (d), 82,4(d), 90,6 (d), 99,8(d), 102,6 (d), 109,9 (d), 119,0 (t), 134,0 (d), 141,7 (d), 142,2 (s), 152,0 (s), 162,3 (s), 166,8 (s), 173,6 (s), 177,6 (s) ppm.

11) Analiza HPLC

Kolumna: „Pegasil ODS” 6 φ x 150 mm (produkt Senshu Scientific Co., Ltd.).

Rozpuszczalnik: 7,2% acetonitryl - 0,05% wodny kwas trifluorooctowy.

Szybkość przepływu: 1,0 ml/min.

Detekcja: UV 260 nm.

Czas retencji: 10,1 minuty.

Test 1. Aktywność przeciwbakteryjna (1) Minimalne stężenie inhibitujące.

Minimalne stężenie inhibitujące związków według wynalazku względem Mycobacterium smegmatis szczep SANK 75075 oznaczono według sposobu ujawnionego poniżej. Stężenie testowanego związku zostało zadane w czterech stadiach poprzez czterokrotne rozcieńczanie rozpoczynając od 1000 pg/ml (1000 pg/ml, 250 pg/ml, 62 pg/ml i 15 pg/ml). Porcję 1 ml rozcieńczonej próbki w każdym stadium nałożono na płytkę Petri'ego („Terumo Petri dish”, 90 x 20 mm).

Dodano żywieniowe środowisko agarowe (9 ml, produkt Eiken Chemical) zawierające 5% glicerolu i wymieszano otrzymując środowisko płytki. Testowy mikroorganizm Mycobacterium smegmatis SANK 75075 wstępnie hodowano przez noc w 37°C na środowisku bulionowym tryptosojowym (T.B.S) (produkt Eiken Chemical) zawierającym 5% glicerolu.

W dniu testu roztwór mikroorganizmu rozcieńczono 100-krotnie T.B.S. i jedną pętliczkę rozcieńczonej hodowli rozmazano na środowisku płytki. Po 18 godzinach hodowli w 37°C, oznaczono minimalne stężenie inhibitujące (MIC) substancji testowanej, inhibitujące rozwój mikroorganizmu. Wyniki przedstawiono w tabeli 6.

T a b e l a 6

Aktywność przeciwbakteryjna wzglądem Mycobacterium smegmatis SANK 75075

Przykład, związek oznaczony nr	Minimalne stężenie inhibitujące (pg/ml)
1	6,2
7	6,2
8	1,5
9	3,1
10	6,2
11	6,2
16	6,2
17	3,1
18	1,5
50	3,1
51	1,5
52	3,1
53	1,5
135	1,5
282	6,2
548	6,2
891	6,2
1091	6,2
Kapuramycyna	12,5

PL 200 426 B1

Oznaczono minimalne stężenie inhibitujące związku o wzorze (la) względem Mycobacterium avium, szczep NIHJ1605. Dokładniej, dodano Tween 80 (0,1%) do bulionu Middleblook 7H9. Po sterylizacji w autoklawie, dodano wzbogacony Middleblook ADC (20%). Do każdej mikroprobówki wlano porcje 0,8 ml uzyskanej mieszaniny. Do każdej probówki dodano porcję 0,1 ml każdego ze związków według wynalazku rozcieńczonych dwukrotnie (co dalej będzie w skrócie zwane „środowiskiem zawierającym lekarstwo”). Niezależnie, kolonię uzyskaną poprzez wstępne hodowanie Mycobacterium avium NIHJ1605 na środowisku jajecznym z Tween'em przez 10 do 14 dni wprowadzono do probówki zawierającej Tween 80 i perełki szklane.

Po odpowiednim wymieszaniu bulion Middleblook 7H9 dodano, tworząc jednorodny roztwór mikroorganizmu. Roztwór mikroorganizmu skorygowano do OD625 nm = 0,10 (zliczenie żywych komórek: około 1 x 10⁸ CFU/ml), a następnie rozcieńczono 100-krotnie. 0,1 ml porcję uzyskanego roztworu mikroorganizmu inokulowano na wyżej ujawnionym środowisku zawierającym lekarstwo (finalne zliczenie żywych komórek: około 1 x 10⁵ CFU/ml), a następnie hodowano aerobowo w 37°C przez 6 dni. Minimalna ilość lekarstwa, przy której nie zaobserwowano kolonii o średnicy 1 mm lub większej na dnie probówki, została oznaczona jako MIC (pg/ml). Wyniki przedstawiono w tabeli 7.

T a b e l a 7

Aktywność przeciwbakteryjna względem Mycobacterium avium NIHJ 1605

Przykład, związek oznaczony nr	Minimalne stężenie inhibitujące (pg/ml)
539	0,25
571	1
594	1
Kapuramycyna	8

(2) Oznaczenie krążkowe

Tak zwane oznaczenie krążkowe przeprowadzono z użyciem 40 ng substancji testowanej na 8 mm krążku papierowym. Związek A-500359M-2 (przykładowy związek oznaczony nr 396) wykazywał strefę inhibitowania o średnicy 14 mm względem Bacillus subtilis PCI 219, 30 mm względem Mycobacterium smegmatis SANK 75075 i 25 mm względem Klebsiella pneumoniae PCI 602.

Tak zwane oznaczenie krążkowe (Experimental Agricultural Chemistry, wyd. przez Agricultural Chemistry Class/Agriculture Dept./Tokyo Univ., 3 wydanie, vol. II, opublikowane przez Asakura Shoten w 1978) przeprowadzono z użyciem 40 pg substancji testowanej na 8 mm krążku papierowym. Związek A-500359E wykazywał strefę inhibitowania o średnicy 12 mm względem Mycobacterium smegmatis SANK 75075, pochodna amidowa związku A-500359F wykazywała strefę inhibitowania o średnicy 12 mm i związek A-500359M-3 również wykazywał strefę inhibitowania o średnicy 12 mm.

Przykład preparatu 1

Kapsułki

A-500359A lub C 100 mg

Laktoza 100 mg

Skrobia kukurydziana 148,8 mg

Stearynian magnezu 1,2 mg

Sumaryczna ilość 350 mg

Kapsułkę przygotowano mieszając proszki stosownie do wyżej ujawnionego przepisu, przesiewając uzyskaną mieszaninę przez sito 60 mesh, a następnie wprowadzając uzyskany proszek do kapsułki żelatynowej.

Przykład preparatu 2

Każdą z kapsułek przygotowano mieszając, odpowiednio, 100 mg związku A-500359E, związku A-500359F, pochodnej amidowej związku A-500359F, związku A-500359H, związku A-500359J lub związku A-500359M-3, 100 mg laktozy, 148,8 mg skrobi kukurydzianej i 1,2 mg stearynianu magnezu (w sumie 350 mg) w postaci sproszkowanej, przesiewając uzyskaną mieszaninę przez sito 60 mesh, a następnie wprowadzając uzyskany proszek do kapsułki żelatynowej.

PL 200 426 B1

Test toksyczności

Związek A-500359A według wynalazku nie wykazuje toksyczności przy podaniu dożylnym myszy w ilości 500 mg/kg.

Wyniki ujawnione powyżej dowodzą, że związki według wynalazku przedstawione wzorami, odpowiednio, (I), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) i (XVI), rozmaite pochodne związku przedstawionego wzorem (la) i ich farmakologicznie dopuszczalne sole wykazują doskonałe działanie przeciwbakteryjne względem różnych bakterii łącznie z Mycobacteria tak, że są one użyteczne do zapobiegania lub leczenia chorób infekcyjnych wywoływanych przez takie bakterie. Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) jest użytecznym mikroorganizmem wytwarzającym związek przedstawiony wzorem (l), (XI), (XII), (XIV), (XV) lub (XVI). Związki według wynalazku przedstawione wzorami (l), (XI), (XIII), (XIV), (XV) lub (XVI) są również użyteczne jako materiały wyjściowe do syntezy pochodnych, drogą konwersji chemicznej lub mikrobiologicznej, użytecznych jako preparaty do zapobiegania lub leczenia rozmaitych chorób infekcyjnych.

Claims

1. Związek o wzorze( I (lub jegofarmaceutycznied opuszczalnas ól w którym:

R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza grupę metylową, R⁴ oznacza grupę hydroksylową i X oznacza grupę metylenową

Ri oznacza grupę metylową, r2 oznacza atom wodoru, r4 oznacza grupę hydroksylową i X oznacza grupę metylenową

Ri oznacza grupę metylową, R2 oznacza grupę metylową, R4 oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

Ri oznacza atom wodoru, r2 oznacza atom wodoru, r4 oznacza grupę hydroksylową i X oznacza grupę metylenową; lub

Ri oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, r4 oznacza grupę hydroksylową i X oznacza atom siarki.

2. Związek wzgłubzestrz.1, w któn/m R¹ opnaccegrubuma(ylowąR² 2pnaccegrubuma(ylor wą, R4 oznacza grupę hydroksylową, zaś X oznacza grupę metylenową lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

3. Związek o wzorze (la) lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól w którym

Ri oznacza atom wodoru lub grupę metylową, r2| oznacza atom wodoru lub grupę metylową,

PL 200 426 B1

R³ oznacza atom wodoru, grupę C7-C₁₆ alkiloilową, grupę oleilową, linolilową, linolinoilową, 3,3-difenylopropionylową, 3-(3,4,5-trimetoksyfenylo)propionylową, 2-(4-nitrofenylo)propionylową, oktyloksykarbonylową, nonyloksykarbonylową, 2-metylododekanoilową, 2,2-dimetylododekanoilową lub grupę C₆-C10 alkilową,

R⁴a oznacza atom wodoru, grupę hydroksylową lub grupę C7-C10 alkiloiloksylową, zaś

R⁵ oznacza atom wodoru lub grupę C7-C16 alkiloilową, zaś

X oznacza grupę metylenową lub atom siarki, przy czym grupa karbamoilowa we wzorze (la) jest ewentualnie podstawiona przez C₁-C₁2 alkil, pod warunkiem, że jeśli X oznacza atom siarki, R¹ oznacza grupę metylową, R²a oznacza grupę metylową i R⁴a oznacza grupę hydroksylową lub grupę C7-C10 alkiloiloksylową lub jeśli X oznacza grupę metylenową, R¹ oznacza grupę metylową, R²a oznacza atom wodoru, R⁴a oznacza grupę hydroksylową lub grupę C7-C10 alkiloiloksylową lub jeśli X oznacza grupę metylenową, R¹ oznacza atom wodoru, R²a oznacza grupę metylową i R⁴a oznacza grupę hydroksylową lub grupę C7-C10 alkiloiloksylową oraz pod warunkiem, że jeśli X oznacza grupę metylenową, R¹ oznacza atom wodoru, R²a oznacza grupę metylową i R³oznacza atom wodoru, to R a jest inne niż grupa hydroksylowa, gdy R oznacza atom wodoru.

4. Związek o wzorze (Ib) lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól wybrany z grupy obejmującej związek, w którym:

R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza grupę metylową, R3a oznacza atom wodoru, R⁴a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza atom wodoru, R3a oznacza atom wodoru, R4a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3a oznacza atom wodoru, R4a oznacza atom wodoru, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3a oznacza grupę dekanoilową, R4a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3a oznacza grupę lauroilową, R4a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3a oznacza grupę mirystoilową, R4a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3a oznacza grupę pentadekanoilową, R4a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3a oznacza grupę palmitoilową, R4a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza atom wodoru, R3a oznacza atom wodoru, R4a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, R3a oznacza grupę dekanoilową, R4a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, R3a oznacza grupę lauroilową, R4a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, R3a oznacza grupę mirystoilową, R4a oznacza grupę hydroksylową, R4a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

PL 200 426 B1

R¹ oznacza atom wodoru, R² oznacza grupę metylową, R³a oznacza grupę pentadekanoilową, R⁴a oznacza grupę hydroksylową, R5a oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, R3_g oznacza grupę palmitoilową, R4_goznacza grupę hydroksylową, R⁵c oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza atom wodoru, r2 oznacza grupę metylową, R3_g oznacza atom wodoru, R4_g oznacza grupę hydroksylową, R⁵c oznacza grupę palmitoilową i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_g oznacza grupę oktyloksykarbonylową, R4_g oznacza grupę hydroksylową, R⁵c oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową;

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_g oznacza grupę nonyloksykarbonylową, R4_g oznacza grupę hydroksylową, R⁵c oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową; oraz

R1 oznacza grupę metylową, r2 oznacza grupę metylową, R3_g oznacza grupę decylową, R4_goznacza grupę hydroksylową, R⁵c oznacza atom wodoru i X oznacza grupę metylenową.

5. Związek o wzorze (Ik) lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól wybrany z grupy obejmującej związek, w którym

R1 oznacza grupę metylową, R¹¹ oznacza grupę metylową, r3 oznacza atom wodoru i r5 oznacza atom wodoru; oraz

R1 oznacza grupę metylową, R¹¹ oznacza grupę dodecylową, r3 oznacza atom wodoru i r5 oznacza atom wodoru;

6. Kompozycjafarmaceutyyzna.zawierająca s kktecznąil ośćzwiązkk farmakologigzmeaktywnego łącznie z nośnikiem lub rozcieńczalnikiem, znamienna tym, że jako związek farmakologicznie aktywny zawiera związek okrećlony w zastrz. 1 do 5 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

7. Zactośkmakiezwiącnk,oZreUlozacow zactrz. 1 d o5 lub jecośarmaceutyyzniedozoszzcalnej soli, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji bakteryjnej.

8. ZwiącaU oZreUlozaw zactkz. 1 óo5 fuu jecośarmaceutyczniedozobzczalnasól, dozactosowania jako lek.

9. Śr^de zawierający zwiąąee oZreUlćzyw zaatsz. . d o 5 fuu jecośarmaceutbczⁿia d ozobzczalną sól, do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcji bakteryjnej.

10. Streptomyces griseus SAN060196 (FERM BP-5420).

11. Związek A-500359E o wzorze (XI) lub jego sól.

PL 200 426 B1

12. Związek A-500359F o wzorze (XII) lub jego sól.

13. Pochodna amidowa związku A-500359F o wzorze (XIII) lub jej sól.

14. Związek A-500359H o wzorze (XIV) lub jego sól.

PL 200 426 B1

15. ZwiązekA-500359J o wzorze(XV)lub jegos ól.

16. ZwiązekA wzorzeA-500359M-3o wzorze(XVI) I ulu jegos ól.

17. Sposób wztwzrzaniazwiązkAoZreAlozeAO w zastrz. 111 ub 12, I ub 1 4,z namiennytym, ża przwrdki się procedurę hzdzwlnezi Atbrn zbejmbje:

i) hzdzzlę szczepu miArzzroneikmb rzdknjb Streptomyces zrnz ii) izz^^ie zzizkAb a przduAtóz hzdzwli.

18. Spozób b/zAłub oastrz. 1 1, z namienny tym, żemikrozrgoniemeA jeet Streetomyycegrirses (PANK 601M6; FERM BP-5420).

1M. Spozób w^^wz^^iani^zw^^zkA ozreAlozeeo w z astrz. 1 1,znamiennyt ym, żeprowznzi s is przcedbrę hzdzwlneąι Atbrn zbejmbje: i) hzdzwlę skckepb miArzzroneikmb rzdknjb Streptomyces zrnk ii) ikzlzwneie kwiąkAb a przdbAtbw hzdzwli.

20. Sppzób b/zAłub oantrz. . 1, z namienny tym, ZemikrozrgoniemeA jeet Streptomyccsgrisses (PANK 601M6; FERM BP-5420).

21. Zastosswznie ezczeep BStsettn^ycceSidwztwzrzanie nwiazkA o zreAlozeeow zantrz. . 1lub 12| lbb 14.

22. WastzszwaeiA szczapu Streptomyces dz wytwarkaeia kwiąkAb zAreślzeeoz z ζπ^ζ. 15.