PL209129B1

PL209129B1 - Nowe związki przeciwnowotworowe

Info

Publication number: PL209129B1
Application number: PL377056A
Authority: PL
Inventors: Glynn Thomas Faircloth; Mariano Elices; Halina Sasak; Marin Pablo Manuel Avilés; Marchante Maria Del Carmen Cuevas
Original assignee: Pharma Mar; Pharma Mar Sau
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2003-10-20
Publication date: 2011-07-29
Also published as: AU2003285911A1; NO20052379L; PL377056A1; DE60335292D1; IL167724A; SI1572726T1; DK1572726T3; ATE490975T1; KR101149095B1; NO20052379D0; PT1572726E; CY1111319T1; KR20110114690A; KR20050070056A; AU2003285911B2; NO333448B1; HK1082261A1

Description

Wynalazek dotyczy nowych kahalalidowych związków przeciwnowotworowych, zwłaszcza analogów kahalalidu F, w których alifatyczny kwas 5-metyloheksanowy zastąpiono kwasem 4-metyloheksanowym, farmaceutycznych kompozycji zawierających te związki oraz ich zastosowania jako środków przeciwnowotworowych.

Związki kahalalidowe są to peptydy, wydzielane z hawajskiej, trawożernej, morskiej odmiany mięczaka, Elysia rufescens, i jego pożywienia, którym jest zielenica Bryopsis sp. Kahalalidy A-F ujawniono w artykule Hammana i współpr., J. Am. Chem. Soc, 1993, 115, 5825-5826.

Kahalalidy A-G ujawniono w artykule Hamanna, M. i współpr., J. Org. Chem., 1996, 61, 6594-6600: „Kahalalides: bioactive peptides from a marine mollusk Elysia rufescens and its algal diet Bryopsis sp.”. Kahalalid H oraz J ujawniono w pracy Scheuera, PJ. i współpr., J. Nat. Prod., 1997, 60, 562-567: „Two acyclic kahalalides from the sarcoglossan mollusk Elysia rufescens”. Kahalalid O ujawniono w pracy Scheuera, P.J. i współpr., J. Nat. Prod., 2000 63(1), 152-4: „A new desipeptyde from the sarcoglossan mollusk Elysia ornata and the green alga Bryopsis species”. Kahalalid K ujawniono w pracy Kana, Y. i współpr., J. Nat. Prod., 1999 62(8), 1169-72: „Kahalalide K: A new cyclic depsipeptide from the Hawaiian green alga Bryopsis species”.

Oprócz wymienionych doniesień zobacz także następujące artykuły: Goetz i współpr., Tetrahedron, 1999, 55, 7739-7746: „The absolute stereochemistry of Kahalalide F”; Albericio, F. i współpr., Tetrahedron Letters, 2000, 41, 9765-9769: „Kahalalide B. Synthesis of natural cyclodepsipeptide”, Beccero i współpr., J. Chem. Ecol., 2001, 27(11), 2287-99: „Chemical defenses of the sarcoglossan mollusk Elysia rufescens and its host Alga bryopsis sp.”

Wśród związków kahalalidowych najbardziej obiecujący jest kahalalid F z uwagi na jego działanie przeciwnowotworowe. Jego struktura jest złożona i zawiera sześć aminokwasów we fragmencie cyklicznym oraz łańcuch egzocykliczny, złożony z siedmiu aminokwasów z końcową grupą kwasu tłuszczowego. Jego działanie in vitro przeciw hodowlom komórkowym ludzkich komórek raka płuc A-549 i ludzkich komórek raka okrężnicy HT-29 ujawniono w EP 610 078. Kahalalid F wykazuje również własności przeciwirusowe i przeciwgrzybicze.

W przedklinicznych badaniach in vivo określono, że maksymalna tolerowana dawka (MTD) kahalalidu F u samic myszy po podaniu jednorazowej dużej dawki przez wstrzykiwanie dożylne wynosi

280 μg/kg. O ile pojedyncze dawki nieco powyżej MTD podawane dożylnie były niezwykle toksyczne, przy czym zwierzęta wykazywały objawy neurotoksyczności, a potem umierały, to 280 μg/kg kahalalidu F można podawać w powtarzalnych porcjach według schematu pięć razy raz na dzień bez widocznych oznak ostrej toksyczności. Zobacz Supko, F. i współpr., Proceedings of the 1999 AACR NCI EORTC International Conference, streszczenie 315: „Preclinical pharmacology studies with the marinę natural product Kahalalide F”.

WO 02 36145 ujawnia farmaceutyczne kompozycje zawierające kahalalid F oraz nowe zastosowania tego związku do leczenia raka i włącza sieje tutaj przez powołanie się na jego całość.

WO 03 33012, z którego zastrzegamy pierwszeństwo, ujawnia kliniczne zastosowanie związków kahalalidowych w onkologii i włącza sieje tutaj przez powołanie się na jego całość.

GB 0304367, z którego również zastrzegamy pierwszeństwo, ujawnia zastosowanie związków kahalalidowych do leczenia łuszczycy oraz pokrewnych chorób i włącza się go tutaj przez powołanie się na jego całość.

Syntezę oraz cytotoksyczne działanie naturalnych i syntetycznych związków kahalalidowych ujawniono w WO 01 58934, który włącza się tutaj przez powołanie się na jego całość. WO 01 58934 ujawnia syntezę kahalalidu F, a także związków o podobnej strukturze, w których końcowy łańcuch kwasu tłuszczowego został zamieniony na inne kwasy tłuszczowe.

Nadal istnieje zapotrzebowanie na inne związki przeciwnowotworowe, a zwłaszcza na inne związki kahalalidowe o lepszych własnościach.

Nieoczekiwanie odkryliśmy, że jeden ze związków będących analogami kahalalidowymi wykazuje obiecujące działanie i lepszą skuteczność działania przeciwnowotworowego na modelach in vivo.

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 1:

PL 209 129 B1

lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli.

Związek ten odpowiada kahalalidowi F z końcowym łańcuchem 4-metyloheksanowego kwasu tłuszczowego i będzie tu dalej zwany 4-metyloheksanowym KF. Korzystnie, gdy wynalazek dotyczy związku stanowiącego (4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli.

Korzystnie związek o wzorze 1 charakteryzuje się tym, że zawiera, co najwyżej 25% każdego innego kahalalidu.

Korzystnie związek o wzorze 1 charakteryzuje się tym, że zawiera, co najwyżej 10% każdego innego kahalalidu.

Korzystnie, gdy związek charakteryzuje się tym, że zawiera, co najwyżej 5% każdego innego kahalalidu.

Korzystnie, gdy związek charakteryzuje się tym, że zawiera, co najwyżej 2% każdego innego kahalalidu.

Korzystnie, gdy związek charakteryzuje się tym, że zawiera, co najwyżej 1% każdego innego kahalalidu.

Korzystnie, gdy związek charakteryzuje się tym, że zawiera co najwyżej 0,5% każdego innego kahalalidu.

Korzystnie, gdy związek charakteryzuje się tym, że zawiera mniej niż 0,5% jakiegokolwiek innego kahalalidu.

Korzystnie, gdy inny kahalalid stanowi kahalalid F mający boczny łańcuch 5-metyloheksylowy.

Korzystnie, gdy związek jest w czystej postaci.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest farmaceutyczna kompozycja, zawierająca związek określony powyżej oraz farmaceutycznie tolerowany nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie uprzednio opisanego związku do wytwarzania leku.

Korzystnie, gdy zastosowanie dotyczy wytwarzania leku do leczenia ssaków chorych na raka. Korzystnie, gdy ssakiem dotkniętym rakiem jest człowiek. Korzystnie, gdy rak stanowi raka opornego na leczenie, który nie reaguje pozytywnie na inne sposoby leczenia. Korzystnie, gdy dotyczy raka gruczołu krokowego, raka sutka, nowotworu komórkowego wątroby, czerniaka, raka okrężnicoodbytniczego, raka nerek, raka jajnika, raka płuc niedrobnokomórkowe (NSCL), raka nabłonkowego szyjki macicy, leukemii, raka trzustki oraz nowotworów, które wykazują nadmierną ekspresję onkogenu Her2/neu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw zawierający osobne pojemniki zawierające farmaceutyczną kompozycję, zawierającą opisany powyżej związek oraz środek odtwarzający.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wyżej określonego związku.

Korzystnie, gdy stosuje kwas 4-metyloheksanowy, jako materiał wyjściowy. Korzystnie, gdy realizacji kwas 4-metyloheksanowy stanowi kwas (4S)-metyloheksanowy. Korzystnie, gdy sposób ten polega na syntezie w fazie stałej.

PL 209 129 B1

Rozpoznaliśmy analogi kahalalidu F, które wykazują znaczne polepszenie działania w stosunku do kahalalidu F. W przykładach porównawczych udowodniono, że 4-metyloheksanowy KF wykazuje nieoczekiwanie znacznie lepszą skuteczność działania na modelach raka in vivo. Jest to jeszcze bardziej niespodziewane z uwagi na małą różnicę strukturalną między 4-metyloheksanowym KF i 5-metyloheksanowym KF.

Związek według wynalazku stanowi kahalalid F z łańcuchem 4-metyloheksanowego kwasu tłuszczowego zamiast 5-metyloheksanowego i ma strukturę według wzoru 1:

W szczególności korzystnie wyróżniamy ten związek o stereochemii określonej wzorem 2:

Niemniej jednak związki według wynalazku mają asymetryczne centra i dzięki temu występują w różnych postaciach enancjomerycznych i diastereomerycznych. Wynalazek dotyczy zastosowania wszystkich izomerów i stereomerów optycznych zwiążków według wynalazku oraz ich mieszanin i wszystkich farmaceutycznych kompozycji oraz sposobów leczenia, które mogą je stosować lub zawierać.

Dla udogodnienia związki według wynalazku, w szczególności związki 1 i 2, nazywamy związkami 4-metyloheksyło-kahalalidowymi F lub związkami 4-mehexKF. Korzystnie związki 4-mehexKF według wynalazku są w dużym stopniu wolne, zasadniczo wolne lub całkowicie wolne od innych związków kahalalidowych. Na przykład 4-mehexKF według wynalazku jest korzystnie wolny od kahalalidu F, mającego boczny łańcuch 5-metyloheksylowy. W szczególności 4-mehexKF według wynalazku korzystnie zawiera

PL 209 129 B1 najwyżej 25%, 10%, 5%, 2%, 1% lub 0,5%, albo mniej 0,5% dowolnego innego kahalalidu, zwłaszcza kahalalidu F. W pokrewnym aspekcie 4-mehexKF według wynalazku występuje w zasadniczo czystej postaci. Taki związek 4-mehexKF wolny w pewnym stopniu od innych kahalalidów szczególnie nadaje się do farmaceutycznych kompozycji i do sposobów leczenia według wynalazku.

Wynalazek obejmuje związki według tego wynalazku oraz ich farmaceutycznie akceptowalne sole, gdzie jeden lub większą liczbę atomów wodoru, węgla lub innych atomów zastępują ich izotopy. Takie związki mogą być użyteczne, jako narzędzia badawcze i diagnostyczne w badaniach farmakokinetyki metabolizmu i w testach wiązania.

Używane tutaj określenie związków według wynalazku, oznaczające związki o wzorach 1 i 2, obejmuje też ich farmaceutycznie tolerowane pochodne lub prekursory leków. „Farmaceutycznie akceptowalna pochodna lub prekursor leku” oznacza farmaceutycznie akceptowalną sól, ester, sól estru lub inną pochodną związku według wynalazku, która po podaniu jej biorcy jest zdolna do wytworzenia (bezpośrednio lub pośrednio) związku według wynalazku albo jego metabolitu lub jego reszty. Szczególnie korzystne są takie pochodne i prekursory leków, które podwyższają dostępność biologiczną związków według wynalazku, gdy takie związki podaje się choremu (np. umożliwiając, aby doustnie podawany związek był łatwiej wchłaniany do krwi), przyspieszają dostarczanie macierzystego związku do danego przedziału biologicznego, podwyższają rozpuszczalność umożliwiając podawanie przez wstrzykiwanie, zmieniają metabolizm lub zmieniają prędkość wydalania.

Sole związków według wynalazku mogą stanowić sole addycyjne z kwasami, pochodzące od azotu w związku o wzorze 1 lub 2. Lecznicze działanie spoczywa na części pochodzącej od określonego tutaj związku według wynalazku, zaś tożsamość drugiego składnika jest mniej istotna, chociaż dla celów terapeutycznych i profilaktycznych korzystne jest, aby był on farmaceutycznie tolerowany przez chorego. Przykłady farmaceutycznie akceptowalnych soli addycyjnych z kwasami obejmują pochodne kwasów mineralnych, takich jak kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, fosforowy, meta-fosforowy, azotowy i siarkowy, oraz kwasów organicznych, takich jak kwas winowy, octowy, trifluorooctowy, cytrynowy, jabłkowy, mlekowy, fumarowy, benzoesowy, glikolowy, glukonowy, bursztynowy oraz metanosulfonowy i arylosulfonowy, np. kwas p-toluenosulfonowy. Korzystną solą jest sól kwasu trifluorooctowego.

Związki według wynalazku można wytwarzać sposobem syntezy ujawnionym w WO 01 58934, np. dodając odpowiedni kwas 4-metyloheksanowy, (S) lub (R), zamiast 5-metyloheksanowego w przykładzie 3 WO 01 58934. Dlatego też wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania związku o wzorze 1 lub 2. W sposobie tym korzystnie stosuje się kwas 4-metyloheksanowy jako materiał wyjściowy. Najkorzystniej wyjściowym materiałem jest kwas (4S)-metyloheksanowy. Synteza jest korzystnie procesem syntezy w fazie stałej. Dalsze szczegóły tej syntezy podano w przykładach.

Proces według wynalazku można prowadzić z wyjściowych materiałów w sposób kontrolowany enancjonerycznie i stereomerycznie, wykorzystując zalety metodologii syntezy w fazie stałej, gdzie budowana cząsteczka jest związana z nierozpuszczalnym podłożem podczas wszystkich operacji syntezy.

Farmaceutyczne kompozycje związków według wynalazku można przystosowywać do podawania dowolnym odpowiednim sposobem, np. doustnie (włącznie z podawaniem policzkowym lub podjęzykowym), odbytniczo, nosowo, miejscowo (w tym policzkowo, podjęzykowo lub przezskórnie), dopochwowo lub pozajelitowo (w tym podskórnie, domięśniowo, dożylnie lub śródskórnie). Takie kompozycje można wytwarzać dowolnym sposobem, znanym w dziedzinie farmacji, np. kojarząc czynny składnik z nośnikiem (nośnikami) lub zaróbką (zarobkami).

Korzystnie farmaceutyczne kompozycje związków według wynalazku stanowią ciecze (roztwory, zawiesiny lub emulsje) o składzie odpowiednim do podawania dożylnego i mogą one zawierać czysty związek lub jego mieszaninę z dowolnym nośnikiem lub innymi farmakologicznie czynnymi związkami. Dalsze informacje, dotyczące farmaceutycznych kompozycji, można znaleźć w WO 02 36145, które włącza się tutaj przez powołanie się na jego całość.

Mieszanina niejonowego środka powierzchniowo czynnego i kwasu organicznego nadaje się do zastosowania wraz ze środkiem spęczniającym do wytwarzania liofilizowanej postaci związku według wynalazku, nadającej się do odtwarzania. Odtwarzanie wykonuje się korzystnie z zastosowaniem mieszaniny emulgującego solubilizatora, alkanolu i wody.

Liofilizowana kompozycja korzystnie zawiera głównie środek spęczniający, np. przynajmniej 90% lub przynajmniej 95% środka spęczniającego. Przykłady środków spęczniających są powszechnie znane i obejmują sukrozę oraz mannitol. Można stosować też inne środki spęczniające.

PL 209 129 B1

Niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym liofilizowanej kompozycji korzystnie jest ester sorbitolu, a jeszcze korzystniej ester poli(etylenosorbitolu), taki jak np. alkanian poli(oksyetylenosorbitolu), zwłaszcza monooleinnian poli(oksyetylenosorbitolu), np. polisorbat 80. Niejonowy środek powierzchniowo czynny najczęściej stanowi kilka procent kompozycji, jak np. od 0 do 5% kompozycji, np. od 2 do 3 lub 4% kompozycji.

Kwas organiczny w liofilizowanej kompozycji jest to najczęściej kwas alifatyczny, korzystnie kwas hydroksykarboksylowy, a jeszcze korzystniej kwas hydroksypolikarboksylowy, zwłaszcza kwas cytrynowy. Ten kwas organiczny najczęściej stanowi kilka procent kompozycji, jak np. od 0 do 5% kompozycji, np. od 2 do 3 lub 4% kompozycji.

Zawartość związku według wynalazku w liofilizowanej kompozycji najczęściej wynosi poniżej 1% lub często mniej niż 0,1%) mieszaniny. Odpowiednia ilość zawiera się w zakresie od 50 do 200 μg, np. 100 μg, na 100 mg kompozycji.

Emulgujący solubilizator dla środka odtwarzającego korzystnie stanowi ester glikolu polietylenowego (PEG), zwłaszcza ester kwasu tłuszczowego, a jeszcze korzystniej oleinian PEG, taki jak np. oleinian PEG-35. Emulgujący solubilizator korzystnie stanowi od 0 do 10% środka odtwarzającego, najczęściej od około 3 do około 7%, np. około 5%. Alkanolem zwykle jest etanol, który korzystnie stanowi od 0 do 10% środka odtwarzającego, najczęściej od około 3 do około 7%, np. około 5%. Resztę środka odtwarzającego stanowi woda i tworzy ona odtworzony roztwór, nadający się do wstrzykiwania dożylnego.

Dalsze rozcieńczanie odtworzonego roztworu 0,9% roztworem soli kuchennej może być odpowiednie dla wlewania związku kahalalidowego. Odpowiednie urządzenie do wlewu korzystnie oznacza szklany pojemnik zamiast polietylenowego. Przewód korzystnie wykonuje się z silikonu.

Korzystny środek odtwarzający zawiera, zatem od 2 do 7%, np. około 5%, emulgującego solubilizatora; od 2 do 7%, np. około 5%, alkoholu, a resztę stanowi woda.

Kompozycje mogą występować w jednodawkowych i wielodawkowych pojemnikach, np. w zamkniętych ampułkach i fiolkach, i można je przechowywać w liofilizowanym stanie, co wymaga tylko dodania sterylnego ciekłego nośnika, np. wody do zastrzyków, bezpośrednio przed użyciem.

Wynalazek dotyczy, więc ponadto zestawów, złożonych z osobnych pojemników, zawierających liofilizowaną kompozycję i środek odtwarzający. Dotyczy także sposobów odtwarzania.

Podawanie związków lub kompozycji według wynalazku odbywa się przez wlew dożylny. Można stosować czasy trwania wlewu do 72 godzin, bardziej korzystnie od 1 do 24 godzin, a najkorzystniej około 1 godziny lub około 3 godzin. Szczególnie pożądane są krótkie czasy trwania wlewu, które umożliwiają prowadzenie leczenia bez całonocnego pobytu w szpitalu. Jednakże w razie potrzeby wlew może trwać około 24 godzin lub nawet dłużej.

Podawanie prowadzi się cyklami, a w korzystnym sposobie podawania wlew dożylny związku według wynalazku stosuje się chorym przez pierwszy tydzień każdego cyklu i pozwala chorym powracać do normalnego stanu przez pozostałą część cyklu. Korzystny czas trwania każdego cyklu wynosi 1, 3 albo 4 tygodnie; w razie potrzeby można stosować wielokrotne cykle. W alternatywnym sposobie dawkowania związek według wynalazku podaje się np. przez okres około 1 godziny w ciągu kolejnych 5 dni, co 3 tygodnie. Inne sposoby postępowania można wymyślać, jako ich odmiany.

W razie potrzeby stosuje się opóźnienie dawek i/lub zmniejszenie dawek oraz dostosowywanie schematu leczenia w zależności od indywidualnej tolerancji chorego na leczenie, a zwłaszcza zaleca się zmniejszenie dawek u chorych z wyższymi od normalnego poziomami aminotransferazy lub zasadowej fosfatazy w surowicy krwi wątroby.

W jednym z aspektów wynalazek dotyczy sposobu leczenia chorego człowieka cierpiącego na raka, polegającego na podawaniu wymienionemu choremu związku według wynalazku w dawce poniżej 1200 μg/m²/dzień, korzystnie poniżej 930 μg/m²/dzień, a jeszcze korzystniej poniżej 800 μg/m²/dzień. Odpowiednia dawka wynosi przynajmniej 320 μg/m²/dzień. Korzystnie dawka ta zawiera się w zakresie 400-900 μg/m²/dzień, bardziej korzystnie 500-800 μg/m²/dzień, a jeszcze korzystniej 600-750 μg/m²/dzień. Szczególnie korzystne są dawki około 650-700 μg/m²/dzień.

W innym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu leczenia chorego człowieka cierpiącego na raka, polegającego na podawaniu wymienionemu choremu związku według wynalazku codziennie przez 5 dni w dawce poniżej 930 μg/m²/dzień, a następnie przez pozostały okres czasu wynoszący od 1 do 4 tygodni nie podaje się związku kahalalidowego. Dawka korzystnie wynosi 650-750 μg/m²/dzień, a bardziej korzystnie około 700 μg/m²/dzień. Okres czasu wlewu korzystnie wynosi od 1 do 24 godzin, a jeszcze korzystniej od 1 do 3 godzin. Szczególnie korzystny jest okres czasu wlewu wynoszący

PL 209 129 B1 około 1 godziny lub około 3 godzin. Okres czasu odpoczynku wynosi korzystnie 2-3 tygodnie, a jeszcze korzystniej około 2 tygodni.

Wynalazek dotyczy również sposobu leczenia chorego człowieka cierpiącego na raka, polegającego na podawaniu wymienionemu choremu związku według wynalazku raz na tydzień w dawce poniżej 800 μg/m²/dzień. Dawka korzystnie wynosi 600-700 μg/m²/dzień, a jeszcze korzystniej 650 μg/m²/dzień. Okres czasu wlewu korzystnie wynosi od 1 do 24 godzin, a jeszcze korzystniej od 1 do 3 godzin. Szczególnie korzystny jest okres czasu wlewu wynoszący około 1 godziny.

Wprawdzie wyżej podano informacje o dawkowaniu, ale prawidłowe dawkowanie tego związku będzie zmieniało się w zależności od poszczególnych kompozycji, sposobu podawania oraz konkretnego miejsca, gospodarza i leczonego nowotworu. Powinny być brane pod uwagę również inne czynniki, takie jak wiek, waga ciała, płeć, dieta, czas podawania, prędkość wydalania, stan gospodarza, mieszaniny leków, wrażliwość reakcji oraz ciężkość choroby. Podawanie można prowadzić w sposób ciągły lub periodyczny w granicach maksymalnej tolerowanej dawki.

Wynalazek w szczególności dotyczy leczenia chorych dotkniętych rakiem gruczołu krokowego, rakiem sutka, nowotworem komórkowym wątroby, czerniakiem, rakiem okrężniczo-odbytniczym, rakiem nerek, rakiem jajników, rakiem płuc niedrobno-komórkowym, rakiem nabłonkowym, rakiem trzustki i nowotworami, które wykazują nadmierną ekspresję onkogenu Her2/neu. Najkorzystniej dotyczy on leczenia raka komórkowego wątroby, czerniaka, raka sutka i raka gruczołu krokowego.

Związki i kompozycje według wynalazku można stosować wraz z innymi lekami w celu prowadzenia leczenia skojarzonego. Inne leki mogą tworzyć część tej samej kompozycji, albo mogą być dostarczane w postaci osobnej kompozycji do podawania w tym samym lub innym czasie. Tożsamość tych innych leków nie jest szczególnie ograniczona, ale przewiduje się łączenie z innymi środkami chemioterapeutycznymi, hormonalnymi oraz będącymi przeciwciałami. Ilości związku według wynalazku i innego farmaceutycznie czynnego środka (lub środków) oraz synchronizacje czasów podawania będą dobierane w celu osiągnięcia pożądanych skutków działania tego leczenia skojarzonego.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku rozwiązanie przedstawiono w przykładowych realizacjach wykonania.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie (4S)-metyloheksanowego KF

Ogólne sposoby postępowania i początkowe etapy procesu ujawniono w WO 01 58934.

Żywica (4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl:

Usunięto grupę Fmoc i do wyżej wymienionej żywicy peptydowej (przykład 3) dodawano kolejno w ciągu 90 minut Fmoc-Val-OH (678 mg, 2 mmol, 4 równoważniki), Fmoc-Thr(tBu)-OH (992 mg, 2,5 mmol, 5 równoważników), Fmoc-D-Val-OH (678 mg, 2 mmol, 4 równoważniki) i (4S)-MeHex-OH (195 mg, 1,5 mmol, 3 równoważniki) z zastosowaniem DIPCDI (0,233 cm³ w celu uzyskania 1,5 mmol i 3 równoważników; 0,310 cm w celu uzyskania 2 mmol i 4 równoważników oraz 0,388 cm w celu uzyskania 2,5 mmol i 5 równoważników) oraz HOBt (230 mg w celu uzyskania 1,5 mmol i 3 równoważników; 307 mg w celu uzyskania 2 mmol i 4 równoważników oraz 395 mg w celu uzyskania 2,5 mmol i 5 równoważników). We wszystkich przypadkach po 90 min sprzęgania wynik testu ninhydrynowego był ujemny. Usuwanie grupy Fmoc i przemywania prowadzono tak, jak to opisano w ogólnych sposobach postępowania.

Żywica (4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl:

Usunięto grupę Alloc z zastosowaniem Pd(PPh3)4 (58 mg, 0,05 mmol, 0,1 równoważnika) w obecności PhSiH3 (0,617 cm³, 5 mmol, 10 równoważników) w atmosferze argonu oraz rozpuszczono Alloc-Phe-Z-Dhb-OH (666 mg, 2 mmol, 4 równoważniki) i HOAt (273 mg, 2 mmol, 4 równoważniki) w DMF (1,25 cm³) i dodano je do żywicy peptydowej, a następnie dodano DIPCDI (0,310 cm³, 2 mmol, 4 równoważniki) i mieszano tę mieszaninę przez 5 godz., poczem wynik testu ninhydrynowego był ujemny. Po przemywaniu z użyciem DMF i CH2CI2 porcję żywicy peptydowej poddano działaniu TFA-H2O (1:99) przez 1 min i produkt charakteryzowano spektroskopią masową MALDI-TOF-MS; obliczono dla C88H146N14O21: 1736,18. Znaleziono: m/z 1758,67 [M+Na]⁺, 1774,62, 1618,2 [M+K]⁺.

(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-H)-D-allo-Ile-D-Val-OH:

Po przemywaniach z użyciem DMF i CH2CI2 usunięto grupę Alloc z zastosowaniem Pd(PPh3)4 (58 mg, 0,05 mmol, 0,1 równoważnika) w obecności PhSiH3 (0,617 cm³, 5 mmol, 10 równoważników)

PL 209 129 B1 w atmosferze argonu. Zabezpieczony peptyd od-szczepiono od żywicy z użyciem TFA-CH2CI2 (1:99) (pięciokrotnie przez 30 s). Przesącz zebrano w H2O (4 cm³) i usunięto częściowo H2O w wyparce obrotowej. Następnie dodano ACN w celu rozpuszczenia ciał stałych, które pojawiły się podczas usuwania H₂O, i liofilizowano roztwór, uzyskując 639 mg (387 μmol, wydajność 77%) tytułowego związku o czystości >95%, potwierdzonej przez HPLC (warunki A, tR 10,5 min).

(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-Ile-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) = (4S)metyloheksanowy KF

Zabezpieczony peptyd (przykład 6) (639 mg, 387 μmol) rozpuszczono w CH₂CI₂ (390 cm³, 1 mM) i dodano HOBt (237 mg, 1,55 mmol) rozpuszczony w objętości DMF minimalnej do rozpuszczenia HOBt, DIEA (0,203 cm³, 1,16 mmol, 3 równoważniki) oraz DIPCDI (0,240 cm³, 1,55 mmol, 4 równoważniki). Mieszaninę tę mieszano przez 1 godz., a następnie przebieg etapu cyklizacji potwierdzono przez HPLC. Usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Zabezpieczony cykliczny peptyd rozpuszczono w TFA-H2O (19:1, 85 cm³) i mieszaninę tę mieszano przez 1 godz. Usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano dioksan (30 cm³) i usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem (proces ten powtarzano trzykrotnie), potem dodano H2O (40 cm³) i przeprowadzono liofilizację. Surowy produkt oczyszczono przez HPLC (Kromasil Cs 5 μm, 205x50 mm) z zastosowaniem elucji izokratycznej 44% acetonitrylem (+0,05%> TFA) w wodzie (+0,05%) TFA) z przepływem 55 cm³/godz. i detekcji przy 220 nm, uzyskując tytułowy produkt (192 mg, 0,13 mmol, wydajność 26%>, 92,3%). Stosowano MALDI-TOFMS, obliczono dla C75H124N,4016: 1477,9. Znaleziono: m/z 1500,12 [M+Na]⁺, 1515,97 [M+K]⁺. Widmo ¹H-NMR (2.5 mM; 500 MHz, H2O-D2O (9:1)) tego związku przedstawiono w tablicy 1.

T a b l i c a 1

Reszta	N-H	Ha	He	Inne
(Z)-Dhb	9,59 (s)	-	6,63(q, J = 7,5Hz)	1,19 (d, γ-CHa)
D-allo-Ile 1	8,82 (d, J = 9,0 Hz)	4,42	1,87	1,25; 1,09; 0,82 (Y-CH2, γ-CHa, δ-CHs)
L-Phe	8,75 (d, J = 5,5 Hz)	4,63	3,08 (m)	7,31 (2HAr,t) 7,25 (3HAr,d)
D-allo-Thr	8,67 (d, J = 9,0 Hz)	4,64	5,05 (m)	1,21 (γ-CHa)
D-Val 3	8,13 (d, J = 7,5 Hz)	4,33	2,01	0,90(2y-CHs)
L-Om	8,29 (d, J = 7,5 Hz)	4.31	1,66 (2H)	1,88 (y-CH2), 2,96 (bs, 8-CH2), 7,56 ^-NHa+)
D-allo-Ile 2	7,92 (d)	4,18	1,80	1,25,1,09,0,81 (yCH2, yCHs, δ-CHs)
D-Val 5	8,01 (d)	4,08	2,07	0,87(2y-CH3)
L-Thr	8,19 (d, J = 7,5Hz)	4,29	4,19 (m)	1,13(y-CH3)
D-Val 2	7,89 (d, J = 7,5Hz) 4,32	2,11	0,78 (y-CH3)
L-Val 4	8,04 (d)	4,10	2,07	0,90 (2y-CH3)
L-Val 1	7,19 (d, J = 9Hz)	4,02	1,52	0,75 (y-CHs), 0,65 (d,Y-CHs)
D-Pro	-	4,36	2,23, 1,99 (m, P-CH2), 1,85 (m, Y-CH2), 3,83 (1H, m, δ-C^), 3,64 (1H, m, δ-C^)
4(S) MeHex	-	2,26 (2H)	1,57(b-CH2), 1,26,1,10,1,33, 079 (d-CH2, δ-CHs, γ-CH, ε-CHa)

Spektroskopię ¹H-NMR [1H, NOESY, TOCSY w 278 K] wykonywano na urządzeniu Varian Unity Plus (500 MHz). Przesunięcia chemiczne (d) wyrażano w częściach na milion w polu w dół od TMS. Stałe sprzężenia wyrażano w hercach.

PL 209 129 B1

P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie (4R)-metyloheksanowego KF

Procedury doświadczalne prowadzono tak, jak to opisano w przykładzie 1, wychodząc z 1 g żywicy, z tym jedynie wyjątkiem, że w odpowiednim etapie (4S)-MexHex zastąpiono przez (4R)-MexHex. Produkt (220 mg, 0,15 mmol, 30%, czystość 92,3%) charakteryzowano przez ES-MS; C75H124N14O16: 1477,9. Znaleziono: m/z 1499,07 [M+Na]⁺, 1514,94 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 3. Cytotoksyczne działanie in vitro

Celem tych prób jest przerywanie wzrostu hodowli komórek nowotworowych „in vitro przez ciągłe wystawianie tych komórek na działanie testowanej próbki.

Linie komórek

Nazwa	NrATCC	Odmiana	Tkanka	Charakterystyka
P-388	CCL-46	Mysia	Płyn wodobrzusza	Nowotwór chłoniakowy
K-562	CCL-243	Ludzka	Białaczka	Choroba di Gugliemo (wysięk opłucnowy)
A-549	CC1-185	Ludzka	Płuca	Rak płuc niedrobnokomórkowy
SK-MEL-28	HTB-72	Ludzka	Czerniak	Czerniak złośliwy
HT-29	HTB-38	Ludzka	Okrężnica	Gruczolakorak okrężnicy
LoVo	CCL-229	Ludzka	Okrężnica	Gruczolakorak okrężnicy
LoVo-Dox		Ludzka	Okrężnica	Gruczolakorak okrężnicy (MDR)
SW620	CCL-228	Ludzka	Okrężnica	Gruczolakorak okrężnicy (przerzut do węzła chłonnego)
DU-145	HTB-81	Ludzka	Gruczoł krokowy	Rak gruczołu krokowego, receptory nieandrogenowe
LNCaP	CRL-1740	Ludzka	Gruczoł krokowy	Gruczolakorak gruczołu krokowego, z receptorami androgenowymi
SK-BR-3	HTB-30	Ludzka	Sutek	Gruczolakorak sutka, Her2/neu+, (wysięk opłucnowy)
MCF-7	HTB-22	Ludzka	Sutek	Gruczolakorak sutka, (wysięk opłucnowy)
MDA-MB-231	HTB-26	Ludzka	Sutek	Gruczolakorak sutka, Her2/neu+, (wysięk opłucnowy)
IGROV-1		Ludzka	Jajnik	Gruczolakorak jajnika
IGROY-		Ludzka	Jajnik	Gruczolakorak jajnika, określany jako
ET				oporne komórki ET-743
SK-0V-3	HTB-77	Ludzka	Jajnik	Gruczolakorak jajnika (złośliwe wodobrzusze)
0VCAR-3	HTB-161	Ludzka	Jajnik	Gruczolakorak jajnika
HeLa	CCL-2	Ludzka	Szyjka macicy	Rak nabłonka szyjki macicy
HeLa-APL	CCL-3	Ludzka	Szyjka macicy	Rak nabłonka szyjki macicy, określany jako komórki oporne na aplidynę
A-498	HTB-44	Ludzka	Nerka	Rak nerek
PANC-1	CRL-1469	Ludzka	T rzustka	Rak nabłonka trzustki
HMEC-1		Ludzka	Sródbłonek

Do ilościowego pomiaru wzrostu i żywotności komórek przystosowano próby typu kolorymetrycznego z zastosowaniem reakcji sulforodaminy B (SRB) (według techniki ujawnionej przez Philipa Skehana i współpr. (1990), New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening, J. Natl. Cancer Inst., 82, 1107-1112).

PL 209 129 B1

W tej postaci prób stosuje się mikropł ytki do hodowli komórek z 96 wgłębieniami o ś rednicy 9 mm (Faircloth, 1988; Mosmann, 1983). Wi ę kszość linii komórek otrzymuje się z American Type Culture Collection (ATCC), które pochodzą z różnych rodzajów raka ludzkiego.

Komórki utrzymuje się w pożywce RPMI 1640 10% FBS (płodowa surowica wołowa), uzupełnionej 0,1 g/dm³ penicyliny i 0,1 g/dm³ siarczanu streptomycyny, a następnie inkubuje w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2 i 98% wilgotności. W celu wykonania doświadczeń komórki zbierano z podzrastają cych się hodowli z zastosowaniem trypsyny i ponownie tworzono z nich zawiesinę w świeżej pożywce przed ich posiewaniem na stałej pożywce.

₃

Komórki posiewa się na płytkach do mikromiareczkowania z 96 wgłębieniami w liczbie 5 x 10³komórek na wgłębienie do porcji pożywki o objętości 0,195 cm³ i pozwala im umocowywać się na powierzchni płytek w ciągu 18 godzin przez wzrastanie w pożywce wolnej od leku. Następnie dodaje się próbki w porcjach 0,005 cm³, zawierających od 10 do 10^-8 μg/cm³, rozpuszczonych w mieszaninie DMSO/EtOH/PBS (0,5:0,5:99). Po wystawieniu na ich działanie przez 48 godzin mierzy się skutek działania przeciwnowotwo-rowego metodą SRB: komórki utrwala się przez dodanie 0,05 cm³ zimnego 50% (wagowo-objętościowo) kwasu trichlorooctowego (TCA) i inkubowanie przez 60 minut w 4°C. Płytki przemywa się dejonizowaną wodą i suszy. Do każdego wgłębienia do mi-kromiareczkowania dodaje się 0,1 cm³ roztworu SRB (0,4% wagowo-objętościowo w 1% kwasie octowym) i inkubuje przez 10 minut w pokojowej temperaturze. Niezwiązaną SRB usuwa się przez przemywanie 1% kwasem octowym. Płytki suszy się na powietrzu i solubilizuje związany barwnik z użyciem buforowego roztworu tris. Odczytuje się absorbancję na automatycznym czytniku spektrofotometrycznym przy jednej długości fali, wynoszącej 490 nm.

Oblicza się średnie wartości ± odchylenie standardowe z danych dla trzech równoległych wgłębień. Można obliczyć niektóre parametry reakcji komórek: GI - powstrzymywanie wzrostu, TGI - ogólne powstrzymywanie wzrostu (efekt cytostatyczny) i LC - zabijanie komórek (efekt cytotoksyczny).

Wyniki podano w tablicy 2, gdzie nie występują znaczne różnice między związkami:

T a b l i c a 2. Dane o skutkach działania (molowe)

Linia komórek		5-methex KF	(4S)-methex KF	(4R)-methex KF
1	2	3	4	5
DU-145	GI50	7,51 E-07	2,37E-07	1,20E-06
TGI	1,64E-06	6,97E-07	2,14E-06
LC50	3,50E-06	2,49E-06	3,82E-06
LN-caP	GI50	9,61 E-07	l,12E-06	1,50E-06
TGI	2,31 E-06	2,58E-06	2,46E-06
LC50	5,57E-06	5,93E-06	4,40E-06
SKOV-3	GI50	-	-	-
TGI	-	-	-
LC50	-	-	-
IGROV	GI50	4,20E-07	2,92E-07	9,4E-07
TGI	1,40E-06	7,5lE-07	1,81 E-06
LC50	3,80E-06	2,62E-06	3,50E-06
IGROV-ET	GI50	4,47E-07	2,25E-07	8,05E-07
TGI	9,54E-07	4,79E-07	1,62E-06
LC50	3,09E-06	2,82E-06	3,26E-06
SK-BR-3	GI50	3,98E-07	L81E-07	1,25E-06
TGI	4,48E-06	3,32E-07	2,20E-06
LC50	6,77E-06	6,06E-07	3,86E-06

PL 209 129 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5
MEL-28	GI50	6,90E-07	1,43E-06	1,14E-06
	TGI	1,56E-06	2,60E-06	2,09E-06
LC50	3,55E-06	4,72E-06	3,80E-06
H-MEC-l	GI50	-	-	-
TGI	-	-	-
LC50	-	-	-
A-549	GI50	8,66E-07	2,67E-07	1,20E-06
TGI	1,81E-06	7,17E-07	2,26E-06
LC50	3,78E-06	3,09E-06	4,24E-06
K-562	GI50	1,54E-06	2,52E-06	3,73E-06
TGI	2,95E-06	6.77E-06	6,77E-06
LC60	5,66E-06	6.77E-06	6,77E-06
PANC-1	GI50	1,38E-06	6,77E-06	4,70E-06
TGI	2,89E-06	6,77E-06	4,24E-06
LC50	6,07E-06	6,77E-06	4,24E-06
HT-29	GI50	1,41 E-07	3,01 E-07	7,38E-07
TGI	2,81 E-07	7,51 E-07	1,54E-06
LC50	5,62E-07	2,71 E-06	3,22E-06
LOVO	GI50	1,20E-07	1,63E-07	2,48E-07
TGI	2,26E-07	3,08E-07	7,78E-07
LC50	4,27E-07	5,80E-07	2,28E-06
LOVO-DOX	GI50	1,62E-07	1,57E-07	2,88E-07
TGI	3,17E-07	3,25E-07	7,71 E-07
LC50	6,20E-07	6,77E-07	2,19E-06
HELA	GI50	8,39E-07	1,18E-06	1,05E-06
TGI	1,89E-06	2,42E-06	1,93E-06
LC50	4,26E-06	4,97E-06	3,55E-06
HELA-APL	GI50	1.06E-06	1,04E-06	1,56E-06
TGI	2,17E-06	2,13E-06	3,47E-06
LC50	4,43E-06	4,39E-06	6,77E-06

P r z y k ł a d 4. Toksyczność in vitro

W celu oceny cytotoksyczności leków w stosunku do normalnych komórek stosowaliśmy płytki z 96 wgłębieniami z liczbą 5000 komórek na jedno wgłębienie z wykorzystaniem linii normalnych komórek według instrukcji ATCC: AML-12, normalnych komórek wątroby myszy, i NRK-52E, normalnych komórek nerek szczura. Komórki te mogły osadzać się przez noc na każdej płytce przed dodaniem badanego leku.

Do każdego wgłębienia (0,1 cm³ pożywki) dodawano 0,01 cm³ leku w pożywkach w różnych

-10 3 stężeniach (1 x 10^-10-0,01 mg/cm³ w końcowym stężeniu) i dalej inkubowano przez noc w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Wszystkie doświadczenia powtarzano przynajmniej trzykrotnie i były testowane w duplikatach. Po upływie 24 godz. wykonywano test MTS (CellTiter 96 aqueous) według

PL 209 129 B1 instrukcji producenta (Promega) (dla wszystkich rodzajów komórek). Żywotność komórek (aktywność mitochondrialną) oznaczano przez enzymatyczną konwersję substratu formazanowego.

Wyniki zamieszczone w tablicy 3 wskazują, że nie ma istotnej różnicy między związkami 5-metyloheksanowym KF i (4S)-metyloheksanowym KF.

T a b l i c a 3

	ALM wątroby IC50 (μΜ)	NRK nerek IC50 (μΜ)
5-metyloheksanowy KF	3,4	2,7
(4S)-metyloheksanowy KF	5,4	2,7

P r z y k ł a d 5. MTD in vivo u myszy CD-1 i u zwierząt z brakiem grasicy Maksymalną tolerowaną dawkę (MTD) oznaczano u myszy CD-1 i u myszy z brakiem grasicy (osobników obu płci) dla każdego leku po podawaniu jednorazowej dużej dawki i po 5 dziennych dawkach (5DD). Wyniki podano w tablicy 4. Nie ma istotnej różnicy między związkami 5-metyloheksanowym KF i (4S)-metyloheksanowym KF.

T a b l i c a 4

	5-metyloheksanowy KF	(4S)-metyloheksanowy KF
Samiec myszy CD-1 MTD jednorazowa duża dawka	300	300

Samica myszy CD-1 MTD jednorazowa duża dawka	200	200

Samiec myszy CD-1 MTD 5DD	175-350	175-350

Samica myszy CD-1 MTD 5DD	175-350	175-350

Samiec myszy bez grasicy MTD jednorazowa duża dawka	350	350

Samica myszy bez grasicy MTD jednorazowa duża dawka	325	325

Samiec myszy bez grasicy MTD 5DD	350	350

Samica myszy bez grasicy MTD 5DD	325	325

P r z y k ł a d 6. Skuteczność działania in vivo na heteroprzeszczepy sutka (5DD)

Skuteczność działania 5-metyloheksanowego KF i (4S)-metyloheksanowego KF, w obu przypadkach na poziomie trzech czwartych maksymalnej tolerowanej dawki (MTD), analizowano na heteroprzeszczepach sutka po przeprowadzeniu trybu podawania przez pięć kolejnych dni (tj. QDx5) przez dożylne wstrzykiwanie jednej dawki (dni 0-4) samicom myszy bez grasicy. Związki wprowadzano w postaci świeżo sporządzonych z fiolki roztworów w zaróbce [Cremophor-EL/etanol/woda (5:5:90)]. Każdą dzienną dawkę (ze schematu QDx5), podawano dożylnie we wstrzykiwanej objętości wynoszącej 0,2 cm³ na 20 g wagi zwierzęcia.

Ocena wzrostu netto guza nowotworowego w odpowiedniej leczonej grupie w odniesieniu do grupy kontrolnej otrzymującej zaróbkę (tj. %AT/AC) wskazuje, że najniższa (optymalna) wartość występuje w trzecim dniu po rozpoczęciu terapii lekowej dla wszystkich grup. Ponadto statystyczna analiza par (z zastosowaniem nieparametrycznej metody Manna-Whitneya) wykazała, nieoczekiwanie

PL 209 129 B1 z uwagi na bardzo podobną strukturę tych dwóch związków i w związku z poprzednimi przykładami, że istnieje istotna różnica w skuteczności działania tych związków.

Na podstawie opisanych tu badań skuteczności działania i doświadczeń nad toksycznością przeprowadzonych wcześniej (przykład 4) (4S)-metyloheksanowemu KF można przypisać terapeutyczny wskaźnik, wynoszący przynajmniej 1,33 (1xMTD/0,75xMTD, tj. stosunek dawki, w której lek jest toksyczny, do dawki, w której lek jest skuteczny). Ponadto poczyniono biologicznie istotną obserwację, iż przeciwnowotworowe działanie (4S)-metyloheksanowego KF w przypadku heteroprzeszczepu sutka trwało dłużej niż w przypadku heteroprzeszczepu gruczołu krokowego (przykład 7) przy tej samej względnej dawce MTD. W sumie okazuje się wyraźnie, że (4S)-metyloheksanowy KF jest skuteczniejszym izomerem w przypadku heteroprzeszczepów sutka, a czas trwania jego biologicznego działania sugeruje, że wywiera on długotrwałe działanie na nowotwór tego rodzaju.

T a b l i c a 5

	Dawka, pg/kg	Wzrost guza netto, mm³, n=9	%ΔΤ/ΔΟ
Grupa kontrolna	-	167	100
5-metyloheksanowy KF 245	108	65
(4S)-metyloheksanowy KF 245	74	44

P r z y k ł a d 7. Skuteczność działania in vivo na heteroprzeszczepy gruczołu krokowego (5DD)

Skuteczność działania 5-metyloheksanowego KF i (4S)-metyloheksanowego KF, każdego w jednej dawce, analizowano na heteroprzeszczepach gruczołu krokowego po przeprowadzeniu trybu podawania przez pięć kolejnych dni (tj. 5DD) na poziomie trzech czwartych MTD przez dożylne wstrzykiwanie jednej dawki (dni 0-4) samcom myszy bez grasicy. Związki wprowadzano w postaci świeżo sporządzonych z fiolki roztworów w zaróbce [Cremophor-EL/etanol/woda (5:5:90)]. Każdą dzienną dawkę (ze schematu QDx5) podawano dożylnie we wstrzykiwanej objętości wynoszącej 0,2 cm³ na 20 g wagi zwierzęcia.

Ocena wzrostu netto guza nowotworowego w odpowiedniej leczonej grupie w odniesieniu do grupy kontrolnej otrzymującej zaróbkę (tj. %ΔΤ/Δφ wskazuje, że najniższa (optymalna) wartość występuje w trzecim dniu po rozpoczęciu terapii lekowej dla wszystkich grup. Ponadto statystyczna analiza par (z zastosowaniem nieparametrycznej metody Manna-Whitneya) wykazała, że uzyskiwano znacznie większą skuteczność działania z zastosowaniem (4S)-metyloheksanowego KF w dawce 262 μg//kg/dzień. Na podstawie opisanych tu badań skuteczności działania i doświadczeń nad toksycznością przeprowadzonych wcześniej (przykład 4) (4S)-metyloheksanowemu KF można przypisać terapeutyczny wskaźnik, wynoszący przynajmniej 1,33 (1xMTD/0,75xMTD, tj. stosunek dawki, w której lek jest toksyczny, do dawki, w której lek jest skuteczny. Wyniki przedstawiono niżej w tablicy 6.

T a b l i c a 6

	Dawka, pg/kg	Wzrost guza netto, mm³, n=10	%ΔΤ/ΔΟ
Grupa kontrolna	-	236	100
5-metyloheksanowy KF 245	262	126	53
(4S)-metyloheksanowy KF 245	262	62	26

P r z y k ł a d 8. Przeciwnowotworowe działanie analogów kahalalidu F we włóknie kanalikowym z zastosowaniem zespołu ludzkich nowotworowych linii komórkowych

Omówione wyżej przeciwnowotworowe działanie analogów kahalalidu F badano w układzie włókien kanalikowych (HF) z zastosowaniem zespołu ludzkich nowotworowych linii komórkowych, mianowicie SK-Hep-1 (wątrobiak), HepG2 (nowotwór wątroby komórkowy), Panc-1 (rak trzustki) i Mel-28 (czerniak). Ludzkie komórki nowotworowe kapsułkowano w HF in vitro, a później wszczepiano samicom myszy bez grasicy in vivo.

PL 209 129 B1

Dawki 5-metyloheksanowego KF i (4S)-metyloheksanowego KF wybierano na podstawie wcześniejszych doświadczeń nad MTD, prowadzonych na myszach bez grasicy, co dało w wyniku dawkowanie 325 μg/kg/dzień (zobacz przykład 5). Pięć kolejnych dziennych dawek podawano wewnątrzotrzewnowo (ip) we wstrzykiwanej objętości, wynoszącej 0,2 cm³ na 20 g wagi zwierzęcia.

W ogólności KF-4(S)-Met wykazuje statystycznie istotne działanie przeciwnowotworowe przeciw wątrobiakowi (podawanie podskórne, sc), przeciw nowotworowi wątroby komórkowemu (podawanie zarówno ip, jak i sc), raka trzustki (podawanie ip) i wykazuje tendencję w kierunku istotności (tj. P = 0,059) przy podawaniu sc w obszarze trzustki oraz w przypadku czerniaka. Natomiast KF-5-Met działa w przypadku mniejszej liczby rodzajów nowotworu, mianowicie tylko w przypadku raka trzustki (podawanie zarówno ip, jak i sc) i czerniaka (podawanie sc), ale nie działa w przypadku żadnego badanego rodzaju raka wątroby. Podsumowanie wyników przedstawiono niżej w tablicy, które wyraźnie wykazują różnice między tymi związkami.

Lek	Rodzaj raka/umiejscowienie HF (arbitralna liczba komórek/HF)
	SK-Hep-1	HepG2	Panc-1	Med-28
	'P	sc	ip	sc	'P	sc	ip	sc
Zaróbka	0,575	0,872	0,576	0,509	0,200	0,392	2,078	1,77
KF-4(S)-Met	0,485	0,525*	0,335*	0,319*	0,129*	0,237§	1,906	1,51
KF-5-Met	0,693	0,686	0,475	0,361	0,149*	0,192*	1,771	1,56

* Statystycznie istotne, P<0,05.

^§ Tendencja w kierunku istotnoś ci, tj. P=0,059.

Claims

lub jego farmaceutycznie akceptowalna sól.
2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że związek stanowi (4S)-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-a//o-lle-cyc/o(D-a//o-Thr-D-a//o-lle-D-Val-L-Phe-Z-Dhb-L-Val) lub jego farmaceutycznie akceptowalna sól.
3. Związek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że związek zawiera co najwyżej 25% każdego innego kahalalidu.
4. Związek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że związek zawiera co najwyżej 10% każdego innego kahalalidu.
5. Związek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że związek zawiera co najwyżej 5% każdego innego kahalalidu.

PL 209 129 B1
6. Związek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że związek zawiera co najwyżej 2% każdego innego kahalalidu.
7. Związek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że związek zawiera co najwyżej 1% każdego innego kahalalidu.
8. Związek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że związek zawiera co najwyżej 0,5% każdego innego kahalalidu.
9. Związek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że związek zawiera mniej niż 0,5% jakiegokolwiek innego kahalalidu.
10. Związek według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że inny kahalalid stanowi kahalalid F mający boczny łańcuch 5-metyloheksylowy.
11. Związek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że związek jest w czystej postaci.
12. Farmaceutyczna kompozycja, znamienna tym, że zawiera związek określony zastrzeżeniami 1 do 11 oraz farmaceutycznie tolerowany nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik.
13. Zastosowanie związku określonego w zastrzeżeniach 1-11 do wytwarzania leku.
14. Zastosowanie związku określonego w zastrzeżeniach 1-11, do wytwarzania leku do leczenia ssaków chorych na raka.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, w którym ssakiem dotkniętym rakiem jest człowiek.
16. Zastosowanie według zastrz. 14 albo 15, w którym rak stanowi raka opornego na leczenie, który nie reaguje pozytywnie na inne sposoby leczenia.
17. Zastosowanie według zastrz. 14 albo 15, albo 16, w którym rak jest wybrany spośród raka gruczołu krokowego, raka sutka, nowotworu komórkowego wątroby, czerniaka, raka okrężniczoodbytniczego, raka nerek, raka jajnika, raka płuc niedrobnokomórkowego (NSCL), raka nabłonkowego szyjki macicy, leukemii, raka trzustki oraz nowotworów, które wykazują nadmierną ekspresję onkogenu Her2/neu.
18. Zestaw zawierający osobne pojemniki zawierające farmaceutyczną kompozycję, która zawiera związek określony w zastrzeżeniach 1 do 11 oraz środek odtwarzający.
19. Sposób wytwarzania związku określonego zastrzeżeniami 1 do 11, znamienny tym, że jako substancję wyjściową stosuje się kwas 4-metyloheksanowy.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się kwas (4S)-metyloheksanowy.
21. Sposób według zastrz. 19 albo 20, znamienny tym, że polega na syntezie w fazie stałej.