PL198189B1

PL198189B1 - (R)-N-{[4-{[(2-metylofenyloamino)-karbonylo]amino}fenylo]acetylo}-L-prolilo-3-metylo]-ß-alanina, jej zastosowanie i kompozycja farmaceutyczna ją zawierająca

Info

Publication number: PL198189B1
Application number: PL344440A
Authority: PL
Inventors: Wen-Chemg Lee; Alan Gill
Original assignee: Biogen Idec Ma
Priority date: 1998-05-28
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2008-06-30
Also published as: IS5737A; IL139967A0; US6495525B1; KR100636713B1; ZA200007300B; TR200100190T2; PT1082302E; HUP0102255A2; DK1082302T3; CZ298413B6; EA200001236A1; EA002988B1; ES2211096T3; YU75500A; CZ20004425A3; EE04639B1; SK285280B6; NO20006023L; CA2333656A1; UA65623C2

Abstract

1. (R)-N-{[4-{[(2-metylofenyloamino)-karbonylo]amino}fenylo]acetylo}-L-prolilo-3-metylo]- ß-alani- na, stanowi aca zwi azek o wzorze PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest (R)-N-{[4-{[(2-metylofenyloamino)-karbonylo]amino}fenylo]acetylo}-L-prolilo-3-metylo]-e-alanina, jej zastosowanie i kompozycja farmaceutyczna ją zawierająca. Ten nowy związek jest przydatny do hamowania, zmiany albo zapobiegania adhezji komórkowej i patologii związanej z adhezją komórkową. Formulacje farmaceutyczne obejmujące ten związek mają zastosowanie do hamowania i zapobiegania adhezji komórkowej i patologii związanej z adhezją komórkową. Związek i kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można zastosować jako czynniki terapeutyczne albo profilaktyczne. Są one szczególnie przydatne do leczenia chorób zapalnych i autoagresyjnych.

Adhezja komórkowa jest procesem, dzięki któremu komórki wiążą się ze sobą, migrują do konkretnych miejsc albo lokalizują się w macierzy zewnątrzkomórkowej. Jako taka, adhezja komórkowa stanowi fundamentalny mechanizm leżący u podstaw wielu zjawisk biologicznych. Przykładowo, adhezja komórkowa jest odpowiedzialna za adhezję komórek krwiotwórczych do komórek śródbłonka i migrację tych komórek na zewnątrz naczyń krwionośnych oraz do miejsc urazu. Jako taka, adhezja odgrywa rolę w wielu stanach patologicznych, jak np. stan zapalny i reakcje odpornościowe u ssaków.

Badanie podstaw molekularnych adhezji komórkowej wykazało, że różne cząsteczki powierzchniowe, określane jako cząsteczki albo receptory adhezji komórkowej, pośredniczą w oddziaływaniach pomiędzy komórkami albo komórkami i macierzą. Przykładowo, białka nadrodziny zwanej „integrynami stanowią kluczowe mediatory w oddziaływaniach adhezyjnych pomiędzy komórkami krwiotwórczymi i ich lokalnym środowiskiem (M.E. Hemler, „VLA Proteins in the Integrin Family: Structures, Functions and their Role on Leucocytes, Ann. Rev. Immunol. 8:365 (1990)). Integryny są niekowalencyjnymi kompleksami heterodimerycznymi obejmującymi dwie podjednostki zwane α- i β. Istnieje co najmniej 17 różnych podjednostek α (α 1-α 10, α-L, α-M, α-D, a-X, α-IIB, a-V i α-E), oraz co najmniej 9 różnych podjednostek β (β1-β9), które do tej pory zidentyfikowano. W oparciu o składniki typu podjednostek α i β każdą z cząsteczek integryn zaliczono do konkretnej klasy.

Integryna α4β1, znana również jako bardzo późny antygen-4 (VLA-4) albo CD49d/CD29, jest powierzchniowym receptorem leukocytów, który uczestniczy w różnych oddziaływaniach międzykomórkowych i komórek z macierzą (M.E. Hemler, Ann. Rev. Immunol. 8:365 (1990)). Służy ona jako receptor dla białek komórek śródbłonka indukowanych cytokinami, cząsteczki adhezyjnej komórek naczyń-1, (VCAM-1), jak również dla białek macierzy zewnątrzkomórkowej, fibronektyny (FN) (Ruegg i in., J. Cell Biol., 177:179 (1991); Wayner i in., J. Cell Biol., 105: 1873 (1987); Kramer i in., J. Biol. Chem., 264:4684 (1989); Gehlsen i in., Science 24:1228 (1988). Wykazano, że przeciwciała monoklonalne przeciwko VLA-4 (mAbs) hamują oddziaływanie adhezyjne zależne od VLA-4, zarówno in vitro, jak i in vivo (Fereguson i in., Proc. Nalt. Acad. Sci. 88, 8072 (1991). Ferguson i in., J. Immunol. 150:1172 (1993). Wyniki doświadczeń in vivo sugerują, że zahamowanie zależnej adhezji komórkowej od VLA-4 może zapobiegać, zahamować albo zmieniać niektóre zapalne i autoagresyjne stany patologiczne (R.L. Lobb i in., „The Pathophysiologic Role of α4 Integrins in vivo, J. Clin. Invest., 94:1722-28, (1994)).

W celu identyfikowania minimalnej czynnej sekwencji aminokwasowej koniecznej do związania VLA-4, Komoriya i in., syntetyzowali różne nakładające się polipeptydy oparte na sekwencji aminokwasowej regionu CS-1 (domena wiążąca VLA-4) konkretnego rodzaju fibronektyny („The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion Site (CS1) within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine, J. Biol. Chem., 266 (23), 15075-79 (1991)). Zidentyfikowali oni 8-aminokwasowy peptyd, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-SetThr, jak również dwa mniejsze nakładające się pentapeptydy, Glu-Ile-Leu-Asp-Val i Leu-Asp-Val-ProSer, które wykazują aktywność hamującą wobec adhezji komórkowej zależnej od FN. Wyniki te sugerują, że tripeptyd Leu-Asp-Val, stanowi sekwencję minimalną dla aktywności adhezyjnej. Później wykazano, że Leu-Asp-Val wiąże wyłącznie limfocyty, które wyrażają aktywowaną postać VLA-4, podważając skuteczność takiego peptydu in vivo. (E.A. Wayner i in., „Activation-Dependent Recognition by Hematopoietic Cells of LDV Sequence in the V Region of Fibronectin J. Cell Biol., 116(2):489-497 (1992)). Jednakże wykazano, że pewne większe peptydy zawierające sekwencje LDV są aktywne in vivo (T.A. Ferguson i in., „Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell Mediated Immune Responses in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8072-76 (1991)) i Wahl i in. „Synthetic Fibronectine Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leucocyte Adhesion and Recruitment, J. Clin. Invest. 94, 655-62 (1994)). Opisano cykliczny pentapeptyd, który hamuje adhezje VLA-4 i VLA-5 do

PL 198 189 B1

FN (D.M. Nowlin i in., „A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits α4β1 i α5β1 Integrin-mediated Cell Adhesion J. Biol. Chem., 268 (27): 20352-59 (1993)) i publikacja zgłoszenia PCT/US91/04862). Ten pentapeptyd oparty jest na znanym tripeptydzie Arg-Gly-Asp z FN, który, jak wiadomo, jest wspólnym motywem rozpoznawania dla kilku białek macierzy zewnątrzkomórkowej.

Opisano przykłady innych inhibitorów VLA-4, przykładowo, w równolegle rozpatrywanych zgłoszeniach USA nr 08/376,372 i WO 98/04913, włączonych tu jako odnośnik. W cytowanym opisie USA ujawnione są liniowe związki peptydylowe zawierające β-aminokwasy, które wykazują aktywność hamującą adhezję. W dokumentach WO 94/15958 i WO 92/00995, powołanych tu jako odnośniki, opisane są cykliczne peptydy i związki peptydomimetyczne o aktywności modulującej adhezję komórek. Dokumenty WO 93/08823 i WO 92/08464 (włączone tu jako odnośniki) opisują związki modulujące adhezję komórek, zawierające grupę guanidynylową, mocznikową i tiomocznikową. Opis patentowy USA nr 5,260,277 opisuje związki guanidynylowe modulujące adhezję komórek i także jest tu włączony jako odnośnik.

Mimo tych postępów, pozostaje potrzeba drobnocząsteczkowych, swoistych inhibitorów adhezji komórkowej zależnej od VLA-4, o ulepszonych właściwościach farmakokinetycznych i farmakodynamicznych, takich jak dostępność po podaniu doustnym oraz o istotnie przedłużonym działaniu. Związki takie są przydatne pod względem dostępności biologicznej i czasu działania. Związki takie zapewniają działanie w leczeniu, zmianie, zapobieganiu i zahamowaniu różnych stanów patologicznych zachodzących za pośrednictwem adhezji komórkowej i wiązania VLA-4.

Związek według wynalazku jest inhibitorem integryny VLA-4, blokując w ten sposób wiązanie VLA-4 z różnymi ligandami, takimi jak VCAM-1 i fragmentami fibronektyny. Związek ten jest przydatny do zahamowania procesów adhezji komórkowej obejmujących aktywację, migrację, proliferację i różnicowanie komórek. Związek ten jest przydatny do zahamowania, zapobiegania i supresji adhezji i patologii związanych z tą adhezją, przebiegających za pośrednictwem VLA-4, takich jak stan zapalny i reakcja odpornościowa, w tym, przykładowo stwardnienie rozsiane, astma, katar alergiczny, alergiczne zapalenie spojówek, choroba zapalna płuc, reumatoidalne zapalenie stawów, przeszczepianie narządów, restenoza, autologiczny przeszczep szpiku, zapalne następstwa chorób wirusowych, zapalenie wsierdzia, zapalna choroba jelita grubego, w tym choroba Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego, pewne rodzaje toksycznego i immunologicznego zapalenia nerek, kontaktowe zapalenie skóry, łuszczyca, przerzuty nowotworów, szpiczak mnogi i reumatoidalne zapalenie stawów. Związek według wynalazku można zastosować sam oraz w kombinacji z innymi środkami terapeutycznymi albo profilaktycznymi, hamującymi, zmieniającymi, zapobiegającymi lub tłumiącymi adhezję komórkową. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca inhibitory adhezji za pośrednictwem VLA-4 i zastosowanie związku i kompozycji według wynalazku do zahamowania adhezji komórkowej.

Figura 1 opisuje reakcję dróg oddechowych owcy na leczenie oMePUPA-V. Owce, wrażliwe na Ascaris suum, poddano ekspozycji na aerozol alergenu Ascaris suum 2 godziny po podaniu aerozolu oMEPUPA-V w określonej dawce lub określonej ilości nośnika. Parametry płuc mierzono w oznaczonym czasie i przedstawiono jako swoistą zmianę oporności dróg oddechowych w porównaniu z badaniem podstawowym (panel lewy). Oporność dróg oddechowych wobec wdychanego karbacholu określana była przed rozpoczęciem badania i w 24 godziny po ekspozycji na alergen (prawy panel). Reakcję dróg oddechowych określano jako PC400 (ilość karbacholu, która jest konieczna do zwiększenia oporności o 400%) przez porównanie z wartościami przed ekspozycją i po ekspozycji.

Figura 2. Owce, wrażliwe na Ascaris suum, poddano ekspozycji na aerozol zawierający oMePUPA-V, w podanych dawkach, albo aerozol Ascaris suum. Zmiany oporności dróg oddechowych mierzono po ekspozycji na aerozol i szczytową oporność płuc (cm H₂O/sek.) po ekspozycji porównano w odniesieniu do wartości podstawowych. *=p<0,05 w porównaniu z kontrolą PBS, w jednostronnej analizie wariancji, a następnie w teście Dunnett' a wielokrotnego porównania z grupą kontrolną. Analiza wskazuje na istotny statystycznie wzrost szczytowego oporu płuc w porównaniu z grupą kontrolną PBS.

Figura 3. Owce, wrażliwe na Ascaris suum, poddano ekspozycji na aerozol alergenu Ascaris suum w 24 godziny po 4-dniowym podaniu aerozolu zawierającego oMEPUPA-V (0,03 mg) albo równoważnej ilości nośnika (etanol:roztwór fizjologiczny soli 1:2, górny panel; Tris:roztwór fizjologiczny soli, 1:499, dolny panel). Parametry płuc mierzono w określonych odstępach czasu i określano jako zmianę oporności właściwej płuc w odniesieniu do wartości podstawowej na początku badania (panel lewy). Oporność dróg oddechowych wobec wdychanego karbacholu określano przed rozpoczęciem

PL 198 189 B1 badania i 24 godziny po ekspozycji na alergen (prawy panel). Reakcję dróg oddechowych przedstawiono jako PC4₀₀ (ilość karbacholu, konieczną do zwiększenia oporności o 400%), przez porównanie z wartościami przed i po ekspozycji.

Figura 4. Myszy Balb/c, uczulone uprzednio DNFB, poddano ekspozycji na DNFB przez zastosowanie tego związku na grzbietową powierzchnię lewego ucha, i nośnika na grzbietową powierzchnie prawego ucha. 24 godziny później, mierzono grubość ucha przy użyciu mikrometru. oMEPUPA-V podawano w określonych dawkach 4 godziny po ekspozycji na DNFB. Kontrolom pozytywnym (+CTRL) podawano dojelitowo maksymalną dawkę skuteczną. Wartości stanowią średnią ± błąd standardowy średniej z 8 zwierząt. Górny panel pokazuje bezwzględny obrzęk ucha. Dolny panel pokazuje procentowe zahamowanie obrzęku ucha w porównaniu z nośnikiem (VEH).

Figura 5. Analiza współzawodnictwa pomiędzy oMePUPA-V i znanym inhibitorem w różnych warun^kac^h aktywacji famM Jurkal: (I,⁵ x W^{6 k}om^órek^/m^l) w ^TBS z todattiem ² m^M Mn²+, 1 m^MCa²⁺ + 1 mM Mg2+ 1 mM Ca2+ + 10 mM Mg2+ 10 mM Mg2+ albo 10 mM Mg2+ z dodatkiem 10 pg/ml TS2/16 traktowano 5 nM 3H-znanego inhibitora samego albo 5 nM 3H-znanego inhibitora z dodatkiem 10 nM B101591 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki wirowano, zawieszano w 100 μΙ TBS z dodatkiem Mn2+ i analizowano przez zliczanie impulsów. Zliczenia powiązane z tymi warunkami pomiarów określały ilość integryny nie związanej ze związkiem badanym, a więc związanej ze znanym inhibitorem znakowanym ³H.

(R)-N-{[4-{[(2-metylofenyloamino)-karbonylo]amino}fenylo]acetylo}-L-prolilo-3-metylo]-3-alanina, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że stanowi związek o podanym niżej wzorze I

Kompozycja farmaceutyczna, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że zawiera związek o wzorze I i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Zastosowanie związku o wzorze I, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że związek ten stosuje się do wytwarzania leku do zapobiegania, hamowania lub zmniejszania adhezji komórek u ssaków.

Korzystnie, lek stosuje się w zapobieganiu, hamowaniu lub łagodzeniu zapalenia.

Zastosowanie związku o wzorze I, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że związek ten stosuje się do wytwarzania leku do leczenia astmy, alergicznego nieżytu nosa, stwardnienia rozsianego, miażdżycy naczyń, choroby zapalnej jelita grubego lub szpiczaka mnogiego u ssaka.

Zastosowanie związku o wzorze I, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że związek ten stosuje się do wytwarzania leku do leczenia stwardnienia rozsianego u ssaka.

Zastosowanie związku o wzorze I, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że związek ten stosuje się do wytwarzania leku do leczenia chorób zapalnych jelita grubego u ssaka.

Zastosowanie związku o wzorze I, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że związek ten stosuje się do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia objawów astmy u ssaka.

Związek według wynalazku jest zdolny do hamowania adhezji komórek, która przebiega z udziałem VLA-4, przez hamowanie wiązania ligandów z tym receptorem.

Związkiem tym jest (R)-N-{[4-{[(2-metylofenyloamino)-karbonylo]amino}fenylo]acetylo}-L-prolilo-3-metylo]-3-alanina, określona w opisie jako „oMePUPA-V, którą przedstawia wzór I.

Zdolność związku o wzorze I do antagonizowania działania VLA-4 czyni go użytecznym do zapobiegania, leczenia lub odwracania objawów, zaburzeń lub chorób wywoływanych przez wiązanie VLA-4 z jego ligandami. Zatem ci antagoniści będą hamować proces adhezji komórek obejmujący aktywację, migrację, proliferację i różnicowanie komórek. Przez podawanie leku, wytworzonego z zastosowaniem związku według wynalazku bądź przez podawanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku można leczyć, zapobiegać, łagodzić lub hamować choroby lub zaburzenia, które przebiegają za pośrednictwem szlaku VLA-4. Takie choroby i zaburzenia obejmują np. astmę, stwardnienie rozsiane, alergiczny nieżyt nosa, alergiczne zapalenie spojówek, zapalne choroby płuc, reumaPL 198 189 B1 toidalne zapalenie stawów, szpiczak mnogi, septyczne zapalenie stawów, cukrzycę typu I, odrzucenie przeszczepów, zapalne choroby jelita grubego i inne.

Związek według wynalazku można syntetyzować dowolną konwencjonalną techniką, z których kilka zilustrowano w przykładach. Korzystnie, związki te syntetyzuje się chemicznie z łatwo dostępnych materiałów wyjściowych, takich jak α-amino-kwasy i ich funkcyjne równoważniki. Korzystne są także modularne i zbieżne („modulator and conwergent) metody syntezy tych związków. W metodach zbieżnych, np. duże fragmenty produktu końcowego są przenoszone razem w ostatnich stadiach syntezy, a nie przez stopniowe dodawanie małych kawałków do rosnącego łańcucha cząsteczki.

Związki według wynalazku można również modyfikować przez dołączanie odpowiednich grup funkcyjnych w celu zwiększenia selektywnych właściwości biologicznych. Takie modyfikacje są znane w stanie techniki i obejmują właściwości zwiększające przenikanie biologiczne do danego układu biologicznego (np. krwi, układu chłonnego, ośrodkowego układu nerwowego), zwiększające dostępność biologiczną, zwiększające rozpuszczalność w celu umożliwienia podawania przez wstrzykiwanie, zmieniające metabolizm i zmieniające tempo wydzielania. Przykłady tych modyfikacji obejmują, ale nie wyłącznie, estryfikację glikolami polietylenowymi, derywatyzację podstawnikami piwolanami albo kwasami tłuszczowymi, przekształcanie w karbaminiany, hydroksylowanie pierścieni aromatycznych oraz podstawienie heteroatomem w pierścieniach aromatycznych.

W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „pacjent dotyczy ssaków, w tym ludzi. Określenie „komórka w znaczeniu tu zastosowanym oznacza dowolną komórkę, korzystnie komórkę ssaka, w tym komórkę ludzką.

Po syntetyzowaniu, aktywności i swoistości wobec VLA-4 związków według wynalazku można określić w badaniu in vitro i in vivo.

Przykładowo, aktywność hamującą adhezję komórkową związków można zmierzyć przez określenie stężenia inhibitora koniecznego do zablokowania wiązania komórek wyrażających VLA-4 z płytkami pokrytymi fibronektyną albo CS1. W tym rodzaju testów, płytki do mikromiareczkowania powleka się fibronektyną (zawierającą sekwencję CS1) albo SC-1. Jeżeli stosuje się CS-1, trzeba sprzęgać ją z białkiem nośnikowym takim jak albumina surowicy bydlęcej, aby umożliwić wiązanie ze studzienkami. Po powleczeniu studzienki dodaje się różne stężenia związku badanego razem z odpowiednio znakowanymi komórkami wyrażającymi VLA-4. Alternatywnie, badany związek można dodawać do powleczonych studzienek przed dodaniem komórek. Komórki pozostawia się do inkubacji w studzienkach przez przynajmniej 30 minut. Po inkubacji, studzienki opróżnia się i płucze. Zahamowanie wiązania mierzy się przez określenie fluorescencji albo radioaktywności związanej z płytką dla każdego z różnych stężeń badanego związku, jak również dla kontroli nie zawierających badanego związku.

Komórki wyrażające VLA-4, które można wykorzystać w testach, obejmują komórki Ramos, Jurkat, komórki czerniaka A375, jak również ludzkie limfocyty krwi obwodowej (PBL). Komórki zastosowane w tym teście można znakować w dowolny sposób, przykładowo fluorescencyjnie albo radioaktywnie.

W celu określenia aktywności hamującej związków według wynalazku można również zastosować bezpośredni test wiązania. W tym teście, białko fuzyjne VCAM-IgG, zawierające pierwsze dwie domeny immunoglobuliny VCAM (D1D2) przyłączone do regionów zawiasowych cząsteczki IgG1 (VCAM 2D-IgG) łączy się z enzymem znacznikowym, takim jak fosfataza alkaliczna (AP) Syntezę fuzji VCAM-IgG opisano w publikacji PCT WO 90/13300, której ujawnienie włączono tu jako odnośnik. Koniugację tej fuzji ze znacznikiem enzymatycznym uzyskuje się sposobami sieciowania znanymi w stanie techniki.

Koniugat enzymu z VCAM-IgG umieszcza się w studzienkach filtracyjnej płytki wielostudzienkowej, takiej jak w zestawie Millipore Multiscreen Assay System (Millipore Corp. Bedford, MA). Różne stężenia badanego związku hamującego dodaje się do studzienek po dodaniu komórek wyrażających VLA-4. Komórki, związki i koniugat enzymu z VCAM-IgG miesza się i pozostawia do inkubacji w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji, studzienki osusza się pod próżnią, pozostawiając komórki i związany VCAM. Oznaczenie ilościowe VCAM przeprowadza się przez dodanie odpowiedniego substratu kolorymetrycznego dla enzymu sprzęgniętego z VCAM-IgG oraz określenie ilości powstałego produktu. Zmniejszenie ilości produktu wskazuje na zwiększoną aktywność hamującą wiązanie. Protokół niektórych testów przedstawiono poniżej:

PL 198 189 B1

W celu określenia swoistości hamującej wobec VLA-4 związków według wynalazku, przeprowadzono testy dla innych grup integryn: tj. β2 i β3, jak również innych β1, jak VLA-5, VLA-6 i α4β7. Testy te mogą być podobne do opisanych wyżej testów zahamowania adhezji i testów bezpośredniego wiązania, z zastąpieniem odpowiednich komórek wyrażających integryny i odpowiednich ligandów. Przykładowo, wielojądrzaste komórki (PMN) wyrażające integryny β2 na powierzchni i wiążące ICAM. Integryny β3 związane z agregacją płytek i zahamowaniem można oznaczyć w standardowym teście agregacji płytek. VLA-5 wiąże się swoiście z sekwencjami Arg-Gly-Asp, podczas gdy VLA-6 wiąże się swoiście z lamininą. Stwierdzono ostatnio, że α4β7 jest homologiem VLA-4, który wiąże również fibronektynę i VCAM. Swoistość, w odniesieniu do α4β7 określa się w teście wiązania, który wykorzystuje opisany wyżej koniugat VCAM-IgG-enzymu znacznikowego oraz linię komórkową, która wyraża α4β7, ale nie VLA-4, taką jak komórki RPMI-8866 albo JY.

Po zidentyfikowaniu inhibitorów swoistych wobec VLA-4, można je dalej charakteryzować w testach in vivo. Jednym z takich testów bada się zahamowanie nadwrażliwości typu kontaktowego u zwierząt, jak np. opisany przez P.L. Chisholm i in., Monoclonal antibodies to the Integrin α-4 Subunit Inhibit the Murine Contact Hypersensitivity Response Eur. J. Immunol., 23, 682-688 (1993)) oraz „Current Protocols in Immunology, J.E. Coligan i in., wyd. John Wiley and Sons, Nowy York, 1, 4.2.1-4.2.5 (1991). W tym teście, skórę zwierzęcia uczula się przez ekspozycję na środek drażniący, np. dinitrofluorobenzen, a następnie lekkie fizyczne podrażnienie, jak lekkie zarysowanie skóry ostrym narzędziem. Po okresie zdrowienia, zwierzęta ponownie uczula się tym samym sposobem. Kilka dni po uczuleniu, jedno z uszu zwierzęcia poddaje się ekspozycji na chemiczny czynnik drażniący, podczas gdy drugie ucho traktuje się niedrażniącym roztworem kontrolnym. Krótko po tym, zwierzętom podaje się różne dawki inhibitora VLA-4 przez wstrzyknięcie podskórne. Zahamowanie in vivo stanu zapalnego związanego z adhezją komórkową ocenia się przez pomiar obrzęku ucha zwierzęcia w porównaniu z nietraktowanym uchem. Obrzęk mierzy się mikrometrem albo innym przydatnym do tego celu urządzeniem. W ten sposób można zidentyfikować związki hamujące według wynalazku, które są najbardziej przydatne do zahamowania stanu zapalnego.

Innym testem in vivo, który można zastosować do badania inhibitorów według wynalazku, jest test astmy u owiec. Test ten przeprowadza się zasadniczo jak opisano w W.M. Abraham i in., (a4-Integrins Mediate Antigen-induced Late Bronchial Response and Prolonged Airway Hyperresponsiveness in Sheep, J. Clin. Invest., 93, 776-87 (1994)), którego ujawnienie włączone jest tu w całości. Test ten mierzy zahamowanie reakcji dróg oddechowych typu późnego wywołanej antygenem Ascaris i nadwrażliwości dróg oddechowych u alergicznych owiec. Związki według wynalazku można także badać w teście agregacji płytek.

Wykazano, że inhibitory VLA-4 według wynalazku nieoczekiwanie wykazują korzystną aktywność i swoistość. Zasadniczo, związki te są wybiórcze wobec VLA-4 (>1000-krotnie w stosunku do β4β7 i β5β1), negatywne w rutynowych testach PanLabs i testach non-GLP Ames, przydatne w standardowych pomocniczych testach farmakologicznych i skuteczne w testach na modelu owiec po jednodniowym podawaniu przewidywanej dawki ludzkiej 1 mg/dzień albo mniej.

Zastrzegane związki wykazują nieoczekiwanie lepsze właściwości w porównaniu z inhibitorami strukturalnie powiązanymi z VLA-4. Przykładowo, w teście owiec wrażliwych na Ascaris, leczonych raz dziennie przez cztery dni lekiem rozpylanym w dawce 0,1 mg/kg, a następnie poddanych ekspozycji na antygen 24 godziny po ostatniej dawce, uprzednio leczonych związkami zasadniczo atenuującymi reakcję wczesną albo blokującymi późną fazę skurczu oskrzeli i rozwój nieswoistej nadwrażliwości. Zakładając biorównoważność u ludzi, całkowita dawka 7 mg powinna wystarczyć dla człowieka o ciężarze 70 kg. Ponadto, lek podawano owcy przez rurkę tchawiczą, ze współczynnikiem dostępności, który oceniono na 2-krotnie wyższy niż zwykle uzyskiwany u ludzi przy użyciu urządzeń do podawania doustnego. Ponadto, prawdopodobnie konieczne będzie dodanie zaróbki do końcowej stałej formulacji w celu optymalizacji wypełnienia urządzenia i podawania leku. Czynniki te wskazują, że prawdopodobna wymagana dawka dla człowieka może wynosić 14 mg albo więcej, co przekracza technologiczny limit 1-5 mg, który można dostarczyć w inhalatorze dostarczającym suchy proszek (DPI). Aczkolwiek konieczną dawkę można dostarczyć przez wielokrotne zastosowania DPI, stanowi to wadę na rynku leków astmatycznych, gdzie typowa dawka steroidów wdychanych wynosi 0,2-1,0 mg.

oMePUPA-V atenuuje wczesną reakcję, blokuje późną fazę skurczu oskrzeli i normalizuje nadwrażliwość w minimalnej dawce 0,003 mg/kg po podaniu w nebulizatorze 2 godziny przed ekspozycją na antygen. Ponadto, dzienna dawka 0,001 mg/kg przez 4 dni z ekspozycją na antygen w 24 godziny po ostatniej dawce daje optymalną reakcję. Tak więc, oMePUPA-V jest 30- do 100-krotnie silniejsza

PL 198 189 B1 niż uprzednie związki, z zakresem dawek wynoszącym około najlepiej sprzedawanego wziewnego leku steroidowego na rynku. oMePUPA-V jak również przedostatnie pośrednie związki syntetyczne występują w postaci wysoce krystalicznej (patrz, Fig. 1, Tabela 1).

Oprócz tego, oMePUPA-V wykazuje korzystny profil metaboliczny w porównaniu ze znanymi związkami hamującymi VLA-4. Przykładowo, po podaniu w aerozolu, zastrzegane związki ulegają gwałtownej konwersji do mniej aktywnego metabolitu, który był głównym produktem [odzyskiwanym z płynu popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BALF), jak również głównym produktem obserwowanym w krążeniu, gdzie wykazywał dłuższy okres półtrwania w porównaniu ze związkiem wyjściowym. O ile gwałtowna konwersja do mniej aktywnego związku jest przydatną strategią w celu osiągnięcia mniejszej ekspozycji ogólnej, związki, które są metabolizowane do produktów ubocznych z mniejszą albo żadną aktywnością wykazują mniejszą złożoność opracowywania i są korzystne z punktu widzenia zabezpieczenia badań.

Potencjalne produkty proteolityczne oMePUPA-V są nieaktywne wobec VLA-4 w testach wiązania, a więc proteoliza daje pomijalne nieaktywne produkty. Mimo to, badania metabolizmu in vitro jak również badania PK in vivo na szczurach, psach i owcach wykazały, że oMePUPA-V jest proteolitycznie stabilna.

T a b e l a 1

Własności oMePUPA-V w porównaniu z inhibitorami znanymi ze stanu techniki

Własności	Znany związek	oMePUPA-V
IC50 dla wiązania VLA-4 VCAM-lg	i,5 nM	2,7 nM
IC50 dla wiązania a4p7-VCAM-lg	2,7 ąM	>100 ąM
IC50 dla adhezji a5pi-FN	>100 ąM	>100 ąM
Minimalna skuteczna dawka w modelu owczym - dawka pojedyncza - dawka powtórzona	0,1 mg/kg 0,03-0,1 mg/kg	0,003 mg/kg 0,001 mg/kg
Krystaliczność	NIE	TAK
85 Skriningowych testów farmakologicznych in vitro	1 słabe uderzenie	czysty
Aktywność ACE	substrat ACE	czysty
Glukuronidacja	niskie poziomy	planowana
Test Amesa (mutagenność)	czysty	czysty
Dodatkowe badania farmakologiczne (skutki uboczne)	czysty
Ekspozycja układowa, dawka i0 mg aerozolu (owca)	40 ng/ml x godzin	zakończony
Profil metaboliczny	aktywny metabolit
Dostępność przy podawaniu doustnym	<1%	<1%
Trwałość w masie (40°C, 75% wilgotności względnej)	„nietrwały	trwały >4 tygodnie
Trwałość w kompozycji	0,2% rozkładu/dzień	trwały >4 tygodnie

Związki według wynalazku można wprowadzać do kompozycji farmaceutycznych, które mogą być podawane doustnie, pozajelitowo, przez inhalację, miejscowo, doodbytniczo, donosowo, dopoliczkowo, dopochwowo lub z wszczepianych zbiorniczków. Stosowany tu termin „pozajelitowe obejmuje podawanie podskórne, dożylne, domięśniowe, dostawowe, domaziówkowe, domostkowe, dooponowe, dowątrobowe, iniekcje do zmian chorobowych i wewnątrzczaszkową lub technikę infuzji.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku obejmują związki według wynalazku lub ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne, razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Stosowany tu termin „nośnik obejmuje dopuszczalne środki pomocnicze i podłoża. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, które można stosować w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku,

PL 198 189 B1 obejmują, ale nie wyłącznie, wymieniacze jonowe, tlenek glinu, stearynian glinu, lecytynę, białka surowicy, takie jak albumina ludzkiej surowicy, substancje buforujące takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbinowy, sorbinian potasu, mieszaniny częściowych glicerydów nasyconych roślinnych kwasów tłuszczowych, wodę, sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy, wodorofosforan potasu, chlorek sodu, sole cynku, koloidalną krzemionkę, trikrzemian magnezu, poliwinylopirolidon, substancje oparte na celulozie, glikol polietylenowy, sól sodową karboksymetylocelulozy, poliakrylany, woski, polimery blokowe polioksyetylen-polioksypropylen, glikol polietylenowy i lanolinę.

Zgodnie z wynalazkiem kompozycje farmaceutyczne mogą być w postaci jałowych preparatów do iniekcji, np. jałowych wodnych lub olejowych zawiesin do iniekcji. Taką zawiesinę można wytwarzać znanymi technikami stosując odpowiednie środki dyspergujące lub zwilżające lub zawieszające. Jałowe preparaty do iniekcji mogą też być w postaci jałowych roztworów lub zawiesin do iniekcji w nietoksycznym dopuszczalnym pozajelitowo rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, np. w postaci roztworu w 1,3-butanodiolu. Wśród dopuszczalnych podłoży i rozpuszczalników, które można stosować, można wymienić wodę, roztwór Ringer'a i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Ponadto jako rozpuszczalniki lub środowisko zawieszające konwencjonalnie stosuje się jałowe, ciekłe oleje. W tym celu można stosować każdy niedrażniący ciekły olej, w tym syntetyczne mono- lub diglicerydy. Do wytwarzania preparatów do iniekcji odpowiednie są kwasy tłuszczowe, takie jak kwas olejowy i jego glicerydowe pochodne, jak również naturalne farmaceutycznie dopuszczalne oleje, takie jak olej z oliwek lub olej rycynowy, zwłaszcza w ich polietoksylowanej formie. Te olejowe roztwory lub zawiesiny mogą także zawierać długołańcuchowy alkoholowy rozcieńczalnik lub dyspergator.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane doustnie w postaci dopuszczalnych do podawania doustnego form użytkowych obejmujących, ale nie wyłącznie, kapsułki, tabletki, wodne zawiesiny lub roztwory. W przypadku tabletek do stosowania doustnego, zwykle stosowane nośniki obejmują laktozę i skrobię kukurydzianą. Typowo dodaje się też środki poślizgowe, takie jak stearynian magnezu. Rozcieńczalniki, nadające się do wytwarzania kapsułek do podawania doustnego, obejmują laktozę i suchą skrobię kukurydzianą. Wodne zawiesiny do podawania doustnego wytwarza się przez połączenie substancji czynnej ze środkami emulgującymi i zawieszającymi. W razie potrzeby można także dodać środków słodzących, zapachowo-smakowych lub barwiących.

Alternatywnie kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać doodbytniczo w postaci czopków. Można je wytwarzać przez mieszanie substancji czynnej z odpowiednią niedrażniącą substancją pomocniczą, która jest stała w temperaturze pokojowej ale ciekła w temperaturze odbytnicy, zatem topi się w odbytnicy i uwalnia lek. Takie substancje obejmują masło kakaowe, wosk pszczeli i glikole polietylenowe.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą również być podawane miejscowo, zwłaszcza, gdy cel leczenia obejmuje powierzchnie lub narządy łatwo dostępne dla nanoszenia miejscowego, w tym np. choroby oczu, skóry lub dolny odcinek przewodu pokarmowego. Odpowiednie środki do stosowania miejscowego na każdej z tych powierzchni lub na każdym z organów można łatwo wytworzyć.

Miejscowe stosowanie na dolny odcinek przewodu pokarmowego można zrealizować stosując doodbytniczy czopek (jak powyżej) lub odpowiedni środek do wlewu. Można także stosować miejscowo plastry przezskórne.

Kompozycje farmaceutyczne do stosowania miejscowego mogą być sporządzone w odpowiedniej maści zawierającej składnik czynny zawieszony lub rozpuszczony w jednym lub więcej nośnikach. Nośniki do miejscowego podawania związków według wynalazku obejmują, ale nie wyłącznie, olej mineralny, parafinę płynną, białą wazelinę, glikol propylenowy, polioksyetylen, polioksypropylen, wosk emulgujący i wodę. Alternatywnie, kompozycje farmaceutyczne mogą być sporządzone w odpowiednim lotionie lub kremie zawierającym składniki aktywne zawieszone lub rozpuszczone w jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośnikach. Odpowiednie nośniki obejmują, ale nie wyłącznie olej mineralny, monostearynian sorbitu, polysorbate 60, woski oparte na estrach cetylowych, alkohol cetearylowy, 2-oktylododekanol, alkohol benzylowy i wodę.

Kompozycje farmaceutyczne do stosowania w okulistyce mogą być sporządzane w postaci mikronizowanych zawiesin w izotonicznej, jałowej soli fizjologicznej o ustalonym pH lub korzystnie w postaci roztworów w izotonicznej, jałowej soli fizjologicznej o ustalonym pH ze środkiem konserwującym, takim jak chlorek benzyloalkoniowy lub bez takiego środka. Alternatywnie, kompozycje do stosowania w okulistyce można sporządzać w maści takiej jak wazelina żółta.

PL 198 189 B1

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być także podawane w postaci donosowego aerozolu lub przez inhalację z użyciem rozpylacza, inhalatora do suchego proszku lub inhalatora z dozownikiem. Takie kompozycje wytwarza się dobrze znanymi sposobami i można je wytwarzać jako roztwory w soli fizjologicznej, stosując alkohol benzylowy lub inne odpowiednie środki konserwujące, promotory absorpcji poprawiające biodostępność, fluorowęglowodory i/lub inne, typowe środki solubilizujące lub dyspergujące. Ponadto, kompozycje według wynalazku mogą zawierać dowolne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, takie jak np. laktoza, gdy mają postać suchego proszku.

Ilość substancji czynnej, którą można połączyć z nośnikiem, aby wytworzyć dawkę jednostkową, zmienia się w zależności od leczonego osobnika, a zwłaszcza sposobu podawania. Należy rozumieć jednak, że konkretne dawkowanie i reżim leczenia dla danego pacjenta będzie zależeć od różnych czynników, w tym od aktywności konkretnego stosowanego związku, wieku, ciężaru ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu podawania, szybkości wydalania, kombinacji leków i oceny prowadzącego lekarza oraz stopnia zaawansowania konkretnej choroby. Ilość substancji czynnej może także zależeć od środka leczniczego lub profilaktycznego, który ewentualnie może być razem podawany.

Dawka i częstość dawkowania związków według wynalazku, które skutecznie zapobiegają, tłumią lub hamują adhezję komórek, zależy od różnych czynników, takich jak charakter inhibitora, wielkości pacjenta, celu leczenia, charakteru patologii, konkretnej stosowanej kompozycji farmaceutycznej i oceny prowadzącego lekarza. Użyteczne są poziomy dawkowania w zakresie od 0,001 do 100 mg/kg wagi ciała/dzień, korzystnie w zakresie od 0,01 do 50 mg/kg i bardziej korzystnie około 10 mg/kg wagi ciała/dzień.

Gdy kompozycję podaje się dożylnie, odpowiedni zakres dawkowania wynosi od 0,001 mg do 25 mg/kg, bardziej korzystnie od 0,01 mg do 1 mg/kg.

Zgodnie z innym wykonaniem kompozycje zawierające związek według wynalazku mogą również zawierać dodatkowy środek wybrany z grupy obejmującej kortykosteroidy, środki rozszerzające oskrzela, środki przeciwastmatyczne (stabilizatory komórek tucznych), środki przeciwzapalne, środki przeciwreumatyczne, środki immunosupresyjne, antymetabolity, immunomodulatory, środki przeciwłuszczycowe i przeciwcukrzycowe. Konkretne związki, w obrębie każdej z wymienionych klas związków, można dobrać spośród grup wymienionych w odpowiednich rozdziałach publikacji „Conprehensive Medicinal Chemistry, Pergamon Press, Oxford, Anglia, str. 970-986 (1990), której ujawnienie wprowadza się tutaj jako stan techniki. W zakres tej grupy wchodzą również związki takie jak teofilina, sula-salazyna i aminosalicylany (środki przeciwzapalne); cyklosporyna, FK-506 i rapamycyna (środki immunosupresyjne); cyklofosfamid i metotreksat (antymetabolity); steroidy (do podawania drogą inhalacji, doustnie i miejscowo) oraz interferony (immunomodulatory). Ponadto, związki według wynalazku można podawać w połączeniu z innymi inhibitorami adhezji komórek. Gdy w kombinacji z inhibitorem VLA-4 podaje się jeden lub więcej dodatkowych środków, składniki czynne można wówczas połączyć w razem w jednej kompozycji, lub alternatywnie, można je podawać w kombinacji. Zasadniczo, w kombinacji z inhibitorami VLA-4 według wynalazku jeden lub więcej dodatkowych środków można podawać jednocześnie lub kolejno. Specjalista w tej dziedzinie techniki łatwo określi najbardziej odpowiednie podawanie, w zależności od konkretnych dostarczanych pacjentowi środków, żądanych rezultatów, pacjenta i stanu, który ma być leczony.

Dzięki rozwiązaniom według wynalazku można zapobiegać, hamować lub łagodzić zapalenia związane z adhezją komórek oraz reakcji odpornościowych i autoimmunizacyjnych u pacjenta, które związane są z adhezją komórek. Adhezja komórek za pośrednictwem VLA-4 odgrywa ważną rolę w różnych zapaleniach oraz chorobach układu odpornościowego i autoimmunizacyjnych. A zatem, zahamowanie adhezji komórek związkami według wynalazku wykorzystać można w leczeniu lub zapobieganiu zapaleniom, chorobom układu odpornościowego i chorobom autoimmunizacyjnym. Korzystnie, sposobami według wynalazku leczy się choroby wybrane z grupy obejmującej astmę, zapalenie stawów, łuszczycę, odrzucenie przeszczepu, stwardnienie rozsiane, cukrzycę i chorobę zapalną jelita grubego.

Można stosować związki według wynalazku w monoterapii lub w kombinacji ze środkiem przeciwzapalnym lub immunosupresyjnym. Takie terapie skojarzeniowe obejmują podawanie środków w postaci pojedynczej dawki jednostkowej lub w postaci dawek wielokrotnych podawanych w tym samym lub w różnym czasie.

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie oMePUPA-V oMePUPA-V, (R)-N-[[4-[[(2-metylofenyloamino)karbonylo]-amino]fenylo]acetylo]-L-prolilo-3-metylo)-e-alaninę, wytworzono na drodze zbieżnej syntezy z dostępnej na rynku sukcynimidylo-Boc(L)proliny (Boc-Pro-OSu; Bachem) i hemisiarczanu (R)-3-aminomaślanu benzylu (Celgene Corp.).

PL 198 189 B1

W wyniku sprzęgania substancji wyjściowych w CH2CI2 w obecności Et₈N, a następnie hydrolizy grupy Boc 4N HCl w dioksanie otrzymano sól HCl, którą rekrystalizowano z CH2Cl2/Et2O. Chlorowodorek ten sprzęgano z 2-[4-[2-(metylofenyloaminokarbonylo)]aminofenylooctanem sukcynimidylu (MPUPA-Osu), wytworzonym z odpowiedniego kwasu, MPUPA-OH (Ricerca, Inc.) i otrzymano krystaliczny ester benzylowy OMePUPA-V, który uwodorniano katalitycznie (10% Pd/C) w układzie THF/H2O (9:1), z wytworzeniem OMePUPA-V. Po rekrystalizacji z 20% wodnego roztworu acetonu otrzymano produkt końcowy w postaci białej substancji stałej.

Nazwa chemiczna: (R)-W-[[4-[[(2-metylofenyloamino)karbonylo]-amino]fenylo]acetylo]-L-prolilo-3-metylo)-p-alanina,

Wzór empiryczny: C25H30N4O5 Ciężar cząsteczkowy: 466,53 Wygląd: czysty biały proszek Temperatura topnienia: 153,6-154,4°C Schemat 1

Wytwarzanie MPUPA-OSu (2) z MPUPA-OH (1)

Schemat 2

Synteza oMePUPA-V (8) z Boc-(L)-Pro-OSu (3) hemisiarczanu (R)-3-aminomaślanu benzylu

Synteza oMePUPA-V

Do wytworzenia oMePUPA-V stosowano syntezę zilustrowaną na Schematach 1 i 2. Substancje wyjściowe zakupiono na rynku lub otrzymano od producentów: (1) został wytworzony w dużej ilości przez firmę Ricerca, Inc., Painesville, OH; (3) uzyskano z firmy Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA, zaś (4) otrzymano z firmy Celgene Corp., Warren, NJ.

Wytwarzanie oMEPUPA-V:

O^gólne metod^y anali^{zy (1}H NMR^{, 13}C NMR^, MS^, IR i HPLC) ¹H NMR prowadzono stosując aparat Bruker AC 300 lub Varian 500 albo Varian 600, a do próbek stosowano w DMSO-d6 w odniesieniu do DMSO-d6 (d 2,49 ppm) lub w CDCh w odniesieniu do resztkowego CHCh (d 7,24 ppm).

PL 198 189 B1 ¹³C NMR prowadzono stosując aparat Varian 500 lub Varian 600, a do próbek stosowano DMSO-d6 w odniesieniu do DMSO-d6 (d 40,5 ppm) lub w CDCl₃ w odniesieniu do resztkowego CDCl₃(d 77,0 ppm).

Widma mas rejestrowano na spektrometrze masowym VG Platform LC-MS-DS Mass Spectrometer System w układzie z Hewlett Packard Model 1500 AutoSampler, a dane przetwarzano przy użyciu Fisons VG MassLynx Mass Spectrometer Workstation. HRMS prowadzono przy M-Scan (PA), stosując bombardowanie szybkimi atomami na spektrometrze mas z wysokim polem VG Analytical ZAB 2SE w odniesieniu do SOP# MS-002, MS-006, MS-012 i MS-023. Do wytworzenia jonów potrzebnych do widma mas stosowano pistolet jonów cezowych, a widma zapisywano stosując układ danych PDP-11-250J.

Widma IR rejestrowano stosując urządzenie Perkin Elmer 1600 Series FTIR.

Analityczną chromatografię HPLC prowadzono w następujący sposób:

1. Chromatogramy z zastosowaniem Programu 1 (zrównoważone przy 20% B, wtryśnięta próbka, 20% B (1 min) 20-70% B (24 min), 70-100% B (17 min)) otrzymano stosując automatyczny układ do próbek Perkin Elmer Series 2000 HPLC z detektorem UV Perkin Elmer 785A (ustawionym na 214 nm) i detektorem UV Applied Biosystems 783A (ustawionym na 254 nm) z integratorem PE Nelson 1020. Rejestrowano jedynie wartości procentowe powierzchni.

2. Chromatogramy z zastosowaniem Programu 8 (zrównoważone przy 15% B, wtryśnięta próbka, 15% B (1 min) 15-40% B (15 min), 40% B (10 min)) otrzymano stosując urządzenie Applied Biosystems 400 Solvent Delivery System z detektorem UV przy długości fali 783A, stosując automatyczne urządzenie do próbek Waters 717. Dane przetwarzano stosując integrator Hewlett Packard 3396 Series II. Integrator ustawiono według następujących parametrów: Wygaszanie = 8, Próg = 5, Obszar krytyczny = 1000, Szerokość piku = 0,04, prędkość karty = 0,2. Wszystkie HPLC prowadzono na kolumnie Vydac C-18 (wielkość porów 5 m, 4,5 mm x 25 cm, cat. # 218TP54).

Rozpuszczalnik A (woda + 0,1% TFA)

Rozpuszczalnik B (acetonitryl + 0,1% TFA)

Szybkość przepływu = 1 ml/min

Stosowano następujące układy gradientów:

Program 1: zrównoważenie przy 20% B, wtryśnięta próbka, 20% B (2 min), 20%-70% B (25 min), 100% B (5 min).

Dane fizyczne dla kwasu [4-[[(2-metylofenylo)amino]karbonylo]amino]-fenylo]octowego (1, MPUPA-OH; materiał wytworzony przez Ricerca Inc.):

Temp. topn. = 210-215°C (rozkład);

IR (KBr) 3295 (szerokie pasmo), 3034 (szerokie pasmo), 1707, 1637, 1603, 1551, 1516, 1457, 14^ 1302^, 1241 1189^, 1118 cm^-1.

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d 12,28 (szer. s, 1H), 9,0 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,88 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,19 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,16 (m, 2H), 6,94 (dd, J =7,8, 8,4 Hz, 1H), 3,51 (s, 2H), 2,25 (s, 3H);

⁵C NMR (150 NMz, DMSO-d6) d 173,0 (C), 152,7 (C), 138,5 (C), 137,5 (C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 128,3 (CH), 127,5 (CH), 126,2 (CH), 122,7 (CH), 121,0 (CH), 118,1 (CH), 40,1 (CH₂), 17,9 (CH₃);

MS (El) m/z 285 (M+1)+ 193, 152, 134, 132, 109, 108, 106, 93, 91,57;

Analiza obliczono dla C^H^N^: C, 67,59; H, 5,67; N, 9,85;

Znaleziono: C, 67,60; H, 5,70; N, 10,01.

Wytwarzanie [4-[[[(2-metylofenylo)amino]karbonylo]amino]-fenylo]octanu sukcymidylu (2, MPUPA-OSu)

Do ogrzewanej do wrzenia pod chłodnicą zwrotną zawiesiny kwasu o-metylofenyloureilenofenylooctowego (1, MPUPA-OH; 150 g, 0,501 mola; 0,501 mola; z firmy Ricerca, Inc.) w acetonitryl (600 ml) dodano w ciągu 10 minut podczas energicznego mieszania dodano chlorku tionylu (41 ml, 0,558 mola). Wydzieliły się duże ilości HCl. Mieszaninę reakcyjną oziębiono do temperatury pokojowej, mieszając w sposób ciągły przez 1,5 godziny. Mieszanina reakcyjna zmieniła się w różową zawiesinę, do której w jednej porcji dodano stałego N-hydroksysukcynimidu (HOSu; 75,5 g, 0,636 mola). Do mieszaniny tej w ciągu 30 minut wkroplono trietyloaminy (174 ml), utrzymując temperaturę poniżej 60°C za pomocą łaźni wodnej. Mieszaninę reakcyjną mieszano jeszcze przez 2 godziny, po czym dodano destylowanej wody (500 ml). Substancję stałą odsączono i przemyto 2 l destylowanej wody, acetonitrylem (2 x 200 ml), wysuszono w powietrzu nad P₂O₅ pod próżnią około 13 Pa (~0,1 mm Hg),

PL 198 189 B1 uzyskując surowy produkt (175 g, 97% wydajności) w postaci beżowego proszku. Surowy produkt rekrystalizowano z acetonitrylu (3,5 l) z odbarwieniem węglem drzewnym (10 g) i otrzymano 129 g MPUPA-OSu (2; 68% wydajności) w postaci białego proszku (czystość >99%).

Temp. topn. 211,2-211,8°C;

IR (KBr): 3905^-3203 (szerokie, pasmo), 18^ 1783^, 165ty 1368^, 130ty 124ty 11^ 1021 cm^-1; ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): d 9,04 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,82 (d, 1H), 7,44 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,24 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,15 (m, 2H), 6,93 (dd, J = 7,4, 7,3 Hz, 1H), 4,02 (s, 2H), 2,80 (s, 4H), 2,23 (s, 3H);

MS (El, ES+ m/z 382 [(M+1)⁺), 239, 108, 106.

Dane fizyczne dla sukcynimidylo-Boc-(L)-proliny (Boc-Pro-OSu, 3; materiał otrzymany z firmy Bachem Bioscience):

Temp. topn. 132-136°C;

IR (KBr) 3456, 2940, 1731, 1619, 1561, 1541, 1497, 1454, 1395, 1337, 1259, 1202, 1118, 1060 cm'¹;

¹H NMR (300 MHz, CDCl₈) d 4,51 (dd, J = 3,8, 8,7 Hz, 1H), 3,56 (m, 1H), 3,44 (m, 1H), 2,80 (s, 4), 2,32 (m, 1H), 2,27 (m, 1H), 1,94 (m, 2H), 1,43 (s, 9H);

MS ⁽El) m/^z 335 (M+^A 279^, 213, 138, 1^ 86^;

HPLC 97,1%.

Dane fizyczne dla hemisiarczanu (P)-3-aminomaślanu benzylu (4; materiał otrzymany z firmy Celgene Corp.):

Temp. topn. 249,4-249,8°C;

IR (KBr) 3515, 3383, 2989, 2945, 2880, 1821, 1788, 1744, 1701, 1476, 1454, 1421, 1394, 1368^, 1260^, 1241 1202^, 1159, 1077 cm^-1; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₈) d 7,85 (szer. s, 2H), 7,26 (s, 5H), 5,06 (ABq, J = 12,3 Hz, 2H), 4,35 (m, 2H), 3,73 (m, 1H), 2,92 (dd, J = 6,4, 17,1 Hz, 1H), 2,66 (dd, J = 6,4, 17,0 Hz, 1H), 1,35 (d, J = 6,5 Hz, 3H);

MS ⁽El) m/^z 195 (M+3)+, 194 (M+2)+, 106^, 92^, 91;

HPLC 99,0%.

Wytwarzanie estru benzylowego W-(tert-butoksykarbonylo)-L-prolilo-3-metylo-(P)-e-alaniny (5)

Do zawiesiny hemisiarczanu R-3-aminomaślanu benzylu (4, 66,7 g, 213 mmoli) podczas dokładnego mieszania 2 CH₂Cl₂ (200 ml) dodano Boc-(L)-Pro-OSu (3; 53,9 g, 222 mmola) i ELN (95 ml, 681 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozdzielono pomiędzy EtOAc (1,5 l) i H₂O (250 ml) i warstwę organiczną przemyto 10% kwasem cytrynowym (3 x 250 ml), H₂O (250 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (250 ml), H₂O (250 ml) i solanką (3 x 250 ml), wysuszono nad Na₂SO4 i zatężono najpierw na wyparce obrotowej [40°C; około 10 666 Pa (~80 mm Hg)], a następnie pod wysoką próżnią [temperatura pokojowa, 16 godzin, 27 Pa (0,2 mm Hg)]. Otrzymano związek przejściowy 5 w postaci lepkiego oleju (88,1 g), który zawierał resztkowy EtOAc i CH₂Cl₂ (potwierdzone NMR), a czystość jego wynosiła >98% (HPLC). Materiał ten stosowano bez dalszego oczyszczania w następnej reakcji.

¹H-NMR (300 MHz, CDCl₈) d 7,30 (m, 5H), 6,44 (szer.s, 1H), 5,10 (dd, J = 12,3, 14,1 Hz, 2H), 4,32 (m, 1H), 4,13 (m, 1H), 3,34 (szer. s, 2H), 2,48 (d, J= 5,1 Hz, 2H), 2,1 (m, 2H), 1,75 (szer. s, 2H), 1,40 (s, 9H), 1,17 (d, J = 6,60 Hz, 3H);

MS ⁽El) m/^z 413 (M+Na)+, 3^ 291, 191, 194, 165^, 91.

Wytwarzanie chlorowodorku estru benzylowego L-prolilo-3-metylo-(P)-3-alaniny (6)

Do produktu przejściowego 5 z poprzedniej reakcji stopniowo dodawano roztwór 4N HCl w dioksanie (240 ml). Zaobserwowano energiczne wydzielanie się gazu (uwaga: reakcja jest egzotermiczna). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej (2 godziny), a następnie zatężono najpierw na wyparce obrotowej (45°C; ~80 mm Hg), a następnie pod wysoką próżnią [(temperatura pokojowa, 14 godzin, 27 Pa (0,2 mm Hg)]. Otrzymano wysoce lepki materiał, który krystalizowano z układu CH₂Cl₂/Et₂O (600 ml/700 ml) i uzyskano 64,0 g (92% wydajności łącznie dla dwóch etapów) chlorowodorku 6 w postaci białej substancji stałej (czystość według HPLC = 99,6%).

Temp. topn. 119,8-120,5°C;

IR (KBr): 3217, 3072, 2094, 2756, 1736, 1681, 1560, 1446, 1387, 1352, 1295, 1244, 1178, 1096 cm^-1.

PL 198 189 B1 ¹H-NMR (300 MHz, CDCI3) d 10,21 (szer. s, 1H), 8,71 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,77 (szer. s, 1H), 7,24 (m, 5H), 5,00 (s, 2H), 4,52 (szer. s, 1H), 4,22 (pozorny t, J = 6,5 Hz, 1H), 3,33 (szer. s, 2H), 2,67 (dd, J= 5,5, 15,5 Hz, 1H), 2,44 (m, 2H), 1,89 (m, 3H), 1,15 (d, J = 6,5 Hz, 3H);

⁵C NMR (125 MHz, CDCh) d 171,03 (C=O), 167,67 (C=O), 135,58 (C), 128,43 (CH), 128,13 (CH), 128,06 (CH), 66,34 (CH2), 59,71 (CH), 46,55 (CH₂), 43,34 (CH), 40,42 (CH₂), 30,50 (CH₂), 24,23 (CH2), 19,92 (CH3);

MS ⁽El) m/^z 291 [M^ilT 199, 194, 160, 139, 92^, 91;

Analiza obliczono dla C16H23N2O3CI: C, 58,80; H, 7,094; N, 8,57; znaleziono: C, 58,95; H, 6,99; N, 8,46.

Wytwarzanie estru benzylowego N-[[4-[[(2-metylofenyloamino)-karbonylo]amino]fenylo]acetylo]-L-prolilo-3-metylo)-(R)-alaniny (7)

Do roztworu chlorowodorku 6 (61,777 g, 189 mmoli) w DMF (125 ml) dodano MPUPA-OSu (2; 69,39 g, 181,9 mmola), a następnie EL3N (90 ml; pH ~10). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez

3,5 godziny, a następnie rozcieńczono EtOAc (11) i ekstrahowano H₂O ((3 x 250 ml). W tym momencie zaczął wytrącać się produkt. Do warstwy organicznej dodano 10% roztworu kwasu cytrynowego (250 ml) (uwaga: reakcja jest egzotermiczna!) i po wytrząsaniu wytworzył się obfity osad. Substancję stałą przesączono przez lejek z filtrem ze spiekanego szkła (2 l, M). Substancję stałą przemyto kwasem cytrynowym (10%, 2 x 250 ml), H₂O (250 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 250 ml), H₂O (250 ml) i solanką (3 x 250 ml), po czym wysuszono na lejku z odsysaniem pod ciśnieniem około 10 666 Pa (~80 mm Hg) przez noc (~14 godzin) i otrzymano białawą substancję stałą, którą rekrystalizowano z układu (THF/Et₂O) (1 1/1,4 l), uzyskując 83,3 g związku 7 (czystość 99,6% według HPLC) w postaci białej substancji stałej.

Przesącz przemyto jeszcze kwasem cytrynowym (10%, 3 x 250 ml), H₂O (250 ml), nasyconym wodorowęglanu (2 x 250 ml), H₂O (250 ml) i solanką (3 x 250 ml). Podczas każdego przemywania wodą wytracała się dodatkowa ilość związku, jednakże przemywanie kontynuowano, uważając, aby nie stracić osadu. Po przesączeniu otrzymano 4,02 g produktu w postaci białej substancji stałej. Na końcu przesącz rozcieńczono Et₂O (1 l), przesączono i substancję stałą przemyto Et₂O (3 x 100 ml), uzyskując następny rzut 1,67 g białej substancji stałej.

Łączna wydajność tej reakcji wynosiła 88%.

Temp. topn. 153-153,5°C.

iR (KBr) 3342, 3307, 3119, 2966, 1737, 1702, 1643, 1590, 1543, 1514, 1455, 1414, 1308, 1238^, 1179 cm'¹;

¹IH-^NMR (⁵⁰⁰ MHz, ^DMSO-^d6) : mfoszantoa rofomerów ³:² (^{piki dl}a ^gfownej konformacji ^{d 9,00}(szer. s, 1H), 7,91 (szer. s, 1H), 7,84 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,68 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,40-7,28 (m, 7H),

7.13 (3H), 7,06 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 6,92 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 5,06 (ABq, J = 12,2 Hz, Dn = 8,9 Hz, 2H), 4,18 (dd, J = 3,4, 8,8 Hz, 1H), 4,10 (kwintet, J = 6,8 Hz, 1H), 3,57 (m, 2H), 3,50-3,22 (m, 3H), 2,62-2,37 (m, 2H), 2,23 (s, 3H), 2,18-1,68 (m, 3H), 1,05 (d, J = 6,8 Hz, 3H) i (piki dla drugorzędnej konformacji): d 9,00 (szer. 1H), 7,91 (szer. s, 1H), 7,84 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,15 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,40-7,28 (m, 7H), 7,13 (3H), 7,06 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,92 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 5,01 (ABq, J = 12,2 Hz, Dn = 19,0 Hz), 4,32 (dd, J = 2,4, 8,8 Hz, 1H), 4,22 (kwintet, J = 6,8 Hz, 1H), 3,57 (m, 2H), 3,50-3,22 (m, 3H), 2,62-2,37 (m, 2H), 2,23 (s, 3H), 2,18-1,68 (m, 3H), 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H);

¹³C ^NMR (¹²⁵ MHz, ^DMSO-^d6) : mfoszantoa rofomerów (^{piki dl}a ^gtównej konformacji ^{d 170,80}(C=O), 170,52 (C=O), 169,18 (C=O), 152,51 (C=O), 138,10 (C), 137,38 (C), 136,04 (C), 130,05 (CH), 129,63 (CH), 129,47 (CH), 128,58 (C), 128,28 (CH), 127,89 (CH), 127,85 (C), 126,02 (CH), 122,50 (CH), 117,90 (CH), 117,81 (CH), 65,44 (CH₂), 59,61 (CH), 47,04 (CH₂), 41,75 (CH), 40,41 (CH₂), 40,00 (CH₂), 29,29 (CH₂), 24,13 (CH₂), 19,88 (CH3), 17,78 (CH3) i (piki dla drugorzędnej konformacji): d 170,94 (C=O), 170,52 (C=O), 169,31 (C=O), 152,61 (C=O), 138,10 (C), 137,38 (C), 136,04 (C), 130,05 (CH), 129,63 (CH), 129,47 (CH), 128,65 (C), 128,28 (CH), 127,89 (CH), 127,85 (C), 126,02 (CH), 120,940 (CH), 117,90 (CH), 117,81 (CH), 65,44 (CH₂), 59,61 (CH), 46,51 (CH₂), 42,01 (CH),

40.13 (CH₂), 39,84 (CH₂), 31,75 (CH₂), 22,11 (CH₂), 20,05 (CH3), 17,78 (CH3);

MS ⁽El^{): m}/^z 579 ^[M+N^a^ 557^, 454^, 426^, 357^, 336^, 293^, 267^, 201^;

Analiza obliczono dla C3₂H36N4O₅: C, 69,05, H, 6,52, N, 10,07, znaleziono: C, 68,87; H, 6,52; N, 9,93.

Wytwarzanie N-[[4-[[(2-metylofenyloamino)karbonylo]amino]-fenylo]acetylo]-L-prolilo-3-metylo)-(R)-p-alaniny (8; oMePUPA-V)

PL 198 189 B1

Roztwór OMePUPA-V-OBn (7; 80,18 g) w mieszaninie THF/H2O (9:1; 800 ml) uwodorniono pod ciśnieniem 379 212 Pa w obecności Pd/C (10%, 2,44 g). Po 25 godzinach mieszaninę reakcyjną przesączono przez Solka Floc® (144 g, Fiber Sales & Development Corp.) na lejku z filtrem ze spiekanego szkła. Następnie przesącz ponownie przesączono przez inną wkładkę Solka Floc® (115 g), zatężono do ~250 ml i podczas energicznego mieszania stopniowo przelewano do toluenu (3 l). Zawiesinę mieszano przez 0,5 godziny, przesączono (2 l lejek z filtrem ze spiekanego szkła) i otrzymany biały proszek wysuszono, najpierw na lejku z odsysaniem ~10665 Pa (~80 mm Hg, 0,5 godziny), a następnie w piecu próżniowym (14 godzin; 45°C; ciśnienie doprowadzono do wartości podciśnienia 84660 Pa strumieniem N2). Białe grudki rozkruszono (moździerz i tłuczek) na subtelny proszek i otrzymano 58,3 g (wydajność 87%) oMePUPA-V w postaci białej substancji stałej. Produkt rekrystalizowano z układu aceton/H2O (320 ml/75 ml). Kryształy zebrano i wysuszono najpierw na lejku z filtrem ze spiekanego szkła z odsysaniem (1 godzina, 10665 Pa, 80 mm Hg), a następnie w piecu próżniowym [25 godzin; 45°C; ciśnienie doprowadzono do wartości podciśnienia 84 660 Pa (635 mm Hg) strumieniem N2]. Otrzymano 47,0 g (84% odzysku z rekrystalizacji) oMePUPA-V w postaci białej substancji stałej (czystość 99,1% według HPLC);

Temp. topn. 153,6-154, 4°C;

IR (KBr) 3354^, 3307^, 17^ 1643^, 1590^, 1543^, 15^ 1449^, 14^ 1308^, 1237 cm^-1.

¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) mieszanina rotamerów 3:2 (piki dla głównej konformacji): δ 12,21 (szer. s, 1H), 8,99 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,87 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,68 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,17 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 7,15 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,12 (dd, J = 7,9, 8,2 Hz, 1H), 6,95 (dd, J = 7,3, 7,3 Hz, 1H), 4,22 (dd, J = 3,3, 8,8 Hz, 1H), 4,06 (m, J = 6,6 Hz, 1H), 3,47 (dd, 1H), 3,44 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 3,37 (dd, 1H), 3,29 (d, J = 15,4 Hz, 1H), 2,46 (dd, 1H), 2,27 (m, 1H), 2,25 (s, 3H),

I, 99 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,76 (m, 1H), 1,07 (d, J = 6,6 Hz, 3H) i (piki dla drugorzędnej konformacji): δ 12,21 (szer. s, 1H), 8,99 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,87 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,12 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,16 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 7,15 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,12 (dd, J = 7,9, 8,2 Hz, 1H), 6,94 (dd, J = 7,3, 7,3 Hz, 1H), 4,34 (dd, J = 1,8, 8,4 Hz, 1H), 3,60 (m, J = 6,6 Hz, 1H), 3,60 (m, 2H), 3,59 (m, 1H), 3,48 (m, 1H), 2,47 (dd, J= 6,6, 15,4 Hz, 1H), 2,40 (dd, J = 6,6, 15,4 Hz, 1H), 2,25 (s, 3H), 2,15 (m, 1H), 1,83 (m, 1H), 1,91 (m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,12 (d, J = 6, 6 Hz, 3H);

'⁵C NMR (150 MHz, DMSO-d6, (piki dla głównej konformacji): δ 172,4 (C=O), 170,9 (C=O), 169,3 (C=O), 152,6 (C=O), 138,2 (C), 137,5 (C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 129,6 (CH), 128,7 (C), 127,4 (C), 126,1 (CH), 122,6 (CH), 120,9 (CH), 118,0 (CH), 117,9 (CH), 59,7 (CH), 46,6 (CH2), 41,7 (CH2), 40,6 (CH2), 40,2 (CH2), 29,4 (CH2), 22,2 (CH2), 19,9 (CH3), 17,9 (CH3) i (piki dla drugorzędnej konformacji): δ

172.5 (C=O), 171,0 (C=O), 160,5 (C=O), 152,7 (C=O), 138,19 (Q, 137,5 (C), 130,2 (CH), 129,8 (CH),

129.6 (CH), 128,8 (C), 127,4 (C), 126.1 (CH), 122,6 (CH), 120,9 (CH), 118,0 (CH), 117,9 (CH), 59,9 (CH), 47,1 (CH2), 42,0 (CH2), 39,8 (CH2), 40,3 (CH2), 31,8 (CH2), 24,2 (CH2), 20,2 (CH3), 17,9 (CH3);

MS ⁽El) m/^z 468 ^[M+H^]+ 336^, 267^, 137^;

Analiza obliczono dla C25H3₀N4O₅; C, 64,36; H, 6,48; N, 10,21; znaleziono: C, 64,07; H, 6,40; N,

II, 85.

P r z y k ł a d 2. Aktywność wobec alergicznego zapalenia płuc w modelu na owcach

Zastosowano alergiczne owce ważące 27-50 kg. Wykazano uprzednio, że wszystkie owce wykazują wczesną i późną aktywność oskrzelową wobec wziewnego alergenu Ascaris suum. Owce były przytomne i unieruchomione na standardowym urządzeniu z unieruchomioną głową. Po znieczuleniu miejscowym przewodów nosowych, przy użyciu 2% lidokainy, wprowadzono cewnik z balonem, przez nozdrza do dolnego odcinka przełyku. Protokół doświadczenia został zatwierdzony przez komisję etyczną Mount Sinai Medical Center Animal Research Committee. Ciśnienie oskrzelowe określano za pomocą balonu w przełyku (wypełnionego 1 l powietrza), który umieszczono 5-10 cm od połączenia przełyku z żołądkiem.

Cewniki do badania ciśnienia tchawiczego i oskrzelowego połączono z przetwornikiem różnicowym (MP45, Validyne, Northridge, CA) w celu zmierzenia ciśnienia opłucnowego, które określono jako różnicę pomiędzy ciśnieniem tchawiczym i opłucnowym. Przepływ powietrza mierzono przez połączenie końca rurki intubacyjnej z pneumotachygrafem (Fleisch, Dyna Sciences, Inc., Blue Bell, PA). Sygnały ciśnienia śródpłucnego i przepływu rejestrowano na rejestratorze 80-386 DOS Personal Computer w celu zliczania in-line średniego oporu dróg oddechowych (Rl) przez podzielenie ciśnienia płucnego przez zmianę przepływu powietrza w szczytowym przepływie (otrzymane przez zliczanie cyfrowe). Średnią z 5 oddechów zastosowano do otrzymania RL w cmH₈O/l/sekundę. Bezpośrednio po pomiarze RL, mierzono gazy w pletyzmografie o stałej objętości, w celu otrzymania oporności właściwej płuc (SRL=RLxVIg) w LxcmH₈O/l/sek.

PL 198 189 B1

Wszystkie aerozole wytwarzano stosując jednorazowe nebulizatory (Raindrop® Puritan Bennett, Lenaxa, KS), które zapewniają aerozol, które mediana średnicy aerodynamicznej wynosi 3,2 ąm według kaskadowego impaktora Andersena. Nebulizer połączono z dozymetrem obejmującym zawór elektromagnetyczny i źródło sprężonego powietrza (137 895 Pa). Wylot nebulizatora był skierowany na plastikową rurkę T, której jeden koniec połączono z wziewną częścią respiratora tłokowego (Harvard Apparatus, S. Natick, MA). Zawór elektromagnetyczny był uruchamiany na jedną sekundę na początku wdechowego cyklu respiratora. Aerozol dostarczono w objętości szczytowej 500 ml, przy prędkości 20 oddechów/min. W celu otrzymania reakcji oskrzeli na skumulowane stężenie karbacholu, mierzono SRL bezpośrednio po wdechu buforu i po podaniu kolejnych 10 wdechów rosnących stężeń karbacholu (0,25-4% wag./obj. w roztworze soli). Test prowokacji przerwano gdy SRL wzrósł powyżej 400% od wartości po podaniu solanki lub po podaniu najwyższego stężenia karbacholu. Odpowiedź oskrzelową oceniano przez określenie skumulowanego stężenia karbacholu (w jednostkach oddechowych), które zwiększyło SRL do 400% w stosunku do wartości po dodaniu solanki (PC400) przez interpolację z krzywej odpowiedzi na dawkę. Jedną jednostkę oddechową (BU) określono jako jeden wdech 1% wag./obj. roztworu karbacholu.

Dawki oMePUPA-V rozpuszczono w układach etanol:roztwór soli 1:2, etanol:200 mM fosforan sodu 1:5 albo bufor Tris. Gdy stosowano Tris, wymagane rozcieńczenie uzyskano stosując roztwór soli. Dawki wytworzono w objętości 3-5 ml.

We wszystkich badaniach, reaktywność podstawową dróg oddechowych (tj. PC400) określano 3-4 dni przed początkiem badania. W badaniach nad pojedynczą dawką, SRL mierzono i leczono zwierzęta związkiem albo nośnikiem. SRL mierzono ponownie 2 godziny po leczeniu (przed ekspozycją), a następnie eksponowano na alergen. W badaniach wielokrotnego dawkowania, począwszy od 4 dnia przed ekspozycją na alergen, zwierzęta leczono raz dziennie przez 4 dni i eksponowano na alergen 24 godziny po ostatniej dawce. SRL mierzono przed i po ostatniej dawce związku lub nośnika. We wszystkich badaniach, SRL badano bezpośrednio po ekspozycji na alergen, co godzinę od 1-6 godzin po ekspozycji, i co pół godziny od 6,5-8 godzin po ekspozycji na alergen. Oznaczenie reaktywności płuc (PC4₀₀) przeprowadzano w 24 godziny po ekspozycji na alergen.

Wartości wyrażano jako średnią ± błąd standardowy. Zmianę SRL obliczano dla każdej owcy jako różnicę wobec poziomu podstawowego SRL przed ekspozycją. Zmiany SRL po ekspozycji określano jako wczesną reakcję dróg oddechowych (EAR), rozwijającą się w ciągu 0-4 godzin. Następnie występowała reakcja późna (LAR), która rozwijała się w ciągu około 4-8 godzin po ekspozycji. Pole powierzchni pod krzywymi EAR i LAR przetworzono dla każdego zwierzęcia stosując zasadę trapezoidu. Istotne zmniejszenie pola powierzchni pod krzywą EAR i LAR w porównaniu z placebo uznano jako efekt terapeutyczny zmian w SRL wywołanych alergenem. Reakcję dróg oddechowych wobec karbacholu (PC400) przed i po 24 godzinach po ekspozycji na alergen, wyrażono jako stosunek PC400 (po/przed ekspozycją) dla każdej z owiec. Znaczący wzrost w stosunku PC400 w porównaniu z kontrolą placebo uznano za efekt terapeutyczny. Porównanie z kontrolą placebo przeprowadzono stosując analizę wariancji Dunetta („1-tailed) dla wielokrotnych porównań z kontrolą. Porównania, które spowodowały p<0,05 uznano za istotne statystycznie.

Figura 1 pokazuje reakcję owiec wrażliwych na Ascaris suum poddanych ekspozycji na inhibitującą dawkę oMePUPA-V podanego w aerozolu. Panel lewy pokazuje zmianę w swoistej oporności płuc SRL, cm H₂O/sek. Panel prawy pokazuje reaktywność dróg oddechowych wobec wziewanego karbacholu (stosunek PC400 przed i po ekspozycji) w 24 godziny po ekspozycji. oMePUPA-V w dawkach 0,01 i 0,03 mg nie hamowała reakcji wczesnej albo późnej dróg oddechowych lub nie zmieniała nadreaktywności wobec karbacholu 24 godziny po ekspozycji na alergen. Dawki 0,1, 1 i 3 mg hamowały wczesną reakcję dróg oddechowych i maksymalnie hamowały późną reakcję dróg oddechowych. Dawki te hamowały również nadreaktywność wobec karbacholu w 24 godziny po ekspozycji. Analizę statystyczną tych danych przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2

Leczenie	Dawka (mg)	Nośnik	n	EAR (ASLRx godz.)	LAR (ASLR x godz.)	PC400 (Po/Przed)
Dawka 2 godziny przed ekspozycją na alergen
PBS			12	5,85 ± 0,62	4,85 ± 0,69	0,49 ± 0,03

PL 198 189 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7
oMePUPAV-	0,01	EtOH:NS	2	6,87 ± 0,05	5,11 ± 1,46	0,44 ± 0,04
0,03	EtOH:NS	2	10,62 ± 3,91	3,98 ± 0,23	0,43 ± 0,00
0,10	EtOH:NS	4	2,54 ± 0,74*	0,67 ± 0,17*	1,18 ± 0,11*
1,00	EtOH:PBS	2	2,14 ± 0,70	0,27 ± 0,34*	1,05 ± 0,11*
3,00	EtOH:PBS	2	2,47 ± 0,62	0,68 ± 0,07*	1,07 ± 0,08*

Owce naturalnie wrażliwe na Ascaris suum poddano ekspozycji na aerozol alergenu Ascaris suum w 2 godziny po podaniu aerozolu oMePUPA-V w oznaczonej dawce albo w 24 godziny po ostatniej dawce powtarzanego codziennie podawania przez 4 dni w dawce subprogowej, oMePUPA-V albo równoważnej ilości PBS. Reakcję płuc, określaną jako zmianę oporności właściwej płuc w porównaniu z opornością wyjściową mierzono przez 8 godzin po ekspozycji na alergen. Wczesną reakcję dróg oddechowych (0-4 godziny EAR) i późną reakcję dróg oddechowych (4-8 godzin, LAR) wyrażano jako średnie pole powierzchni pod krzywą Δ właściwa oporność płuc ± SEM. Oporność dróg oddechowych wobec wdychanego karbacholu określano przed badaniem i 24 godziny po ekspozycji na alergen. Reaktywność dróg oddechowych określano jako PC400 (ilość karbacholu koniecznego do zwiększenia oporności płuc o 400%), przez porównanie wartości przed i po ekspozycji.

* = p<0,05 w porównaniu z kontrolą PBS w „one-way analizie wariancji, a następnie w teście Dunnett'a wielokrotnego porównywania z grupą kontrolną. Wskazuje statystycznie istotny spadek EAR lub LAR lub istotny wzrost stosunku PC400 w porównaniu z grupą kontrolną PBS.

Drażnienie pojedynczą dawką

Żadna z dawek oMePUPA-V zastosowana w powyższym badaniu nie wykazywała efektu drażniącego, co odzwierciedlał brak zmiany oporności dróg oddechowych w porównaniu z poziomem podstawowym, po ekspozycji na alergen Ascaris suum. Pokazano to w tabeli 2.

Badanie powtarzaną dawką

Figura 3 pokazuje, że dawka 0,03 mg oMePUPA-V, którą zbadano jako nieskuteczną, gdy stosowano wstępne ostre leczenie pojedynczą dawką była dawką ochronną, gdy podawano ją codziennie przez 4 dni, a ekspozycja na antygen nastąpiła 24 godziny po ostatniej dawce. Górny i dolny lewy panel pokazują te działanie przy użyciu dwóch różnych formulacji. Nadreaktywność wobec karbacholu widać po dalszych 24 godzinach jest maksymalnie hamowana, jak to widać na górnych i dolnych prawnych panelach na fig. 3. Działanie ochronne oMePUPA-V jest istotne wobec EAR i LAR oraz wobec nadreaktywności wobec karbacholu, zaś analiza ilościowa pokazana jest w tabeli 3.

Wyniki tego badania wskazują, że wstępne leczenie pojedynczą dawką inhibitora VLA-4 o małej cząsteczce, oMePUPA-v, w postaci aerozolu, mogą chronić przed wczesną i późną odpowiedzią dróg oddechowych indukowanych aleergenem w modelu owcy alergicznej. Nie zauważono żadnego drażniącego działania na drogi oddechowe oMePUPA-V w żadnej dawce, podawanego jako jednorazowe wstępne leczenie.

Wyniki pokazują również, że skuteczna dawka oMePUPA-V może być zmniejszona przez wielokrotne stosowanie. Podsumowując, dane dostarczają mocnych dowodów świadczących o tym, że szlak adhezji VLA-4 odgrywa kluczową rolę we wskaźnikach patofizjologicznych (LAR i AHR) przedłużonych objawów zapalnych, zapoczątkowanych w drogach oddechowych u alergicznych owiec po ekspozycji na alergen.

T a b e l a 3

Leczenie	Dawka (mg)	Nośnik	n	EAR (ASLR x godz.)	LAR (ASLR x godz.)	PC400 (Po/Przed)
Dawka 1 raz dziennie przez 4 dni, ekspozycja 24 godziny po ostatniej dawce
PBS			8	4,33 ± 0,81	4,96 ± 0,40	0,38 ± 0,03
oMePUPAV-	0,03	EtOH:NS	4	1,53 ± 0,34*	0,59 ± 0,16*	1,06 ± 0,04*
0,03	Tris-NS	4	1,40 ± 0,35*	0,02 ± 0,06*	1,43 ± 0,04*

PL 198 189 B1

Owce naturalnie wrażliwe na Ascaris suum poddano ekspozycji na aerozol alergenu Ascaris suum w 24 godziny po ostatniej dawce powtarzanego codziennie podawania przez 4 dni w dawce subprogowej, oMePUPA-V albo równoważnej ilości PBS. Reakcję płuc, określaną jako zmianę oporności właściwej płuc w porównaniu z opornością wyjściową mierzono przez 8 godzin po ekspozycji na alergen. Wczesną reakcję dróg oddechowych (0-4 godziny EAR) i późną reakcję dróg oddechowych (4-8 godzin, LAR) wyrażano jako średnie pole powierzchni pod krzywą Δ właściwa oporność płuc ± SEM. Oporność dróg oddechowych wobec wdychanego karbacholu określano przed badaniem i 24 godziny po ekspozycji na alergen. Reaktywność dróg oddechowych określano jako PC400 (ilość karbacholu koniecznego do zwiększenia oporności płuc o 400%), przez porównanie wartości przed i po ekspozycji.

* = p<0,05 w porównaniu z kontrolą PBS w „one-way analizie wariancji, a następnie w teście Dunnett' a wielokrotnego porównywania z grupą kontrolną. Wskazuje statystycznie istotny spadek EAR lub LAR lub istotny wzrost stosunku PC400 w porównaniu z grupą kontrolną PBS.

P r z y k ł a d 3: Aktywność w modelu reakcji nadwrażliwości typu późnego wobec erytrocytów owcy

Do doświadczenia zastosowano samice myszy Balb/c w wieku 8-10 tygodni, zwierzęta żywiono i pojono ad libitum. Erytrocyty owcy (RBC) w roztworze Alsevera otrzymano z Charles River Farm. Services (Southbridge, MA). sRBC wirowano przy 1000 x g przez 10 minut w 4°C i usuwano widoczne kożuszki leukocytarne. Następnie komórki płukano w roztworze soli. Osad zawieszano w soli i liczono w hemocytometrze. Komórki zawieszano w roztworze fizjologicznym soli buforowanym fosforanem (PBS) w gęstości 2x10⁸ sRBC na ml. W dniu 0 myszy uczulano przez wstrzyknięcie podskórne 2x10⁷ sRBC w 100 gl PBS. W dniu 5 sRBC przygotowywano jak powyżej, ale rozcieńczono w PBS do końcowego stężenia 4x10⁹ sRBC/ml. 25 ml tego preparatu wstrzykiwano s.c. w prawą poduszeczkę tylnej łapy.

Preparat dojelitowy oMePUPA-V (partia 2770-029) formułowano w nośniku 60% PEG 4000 w 0,02M Tris w stężeniu wyjściowym 5 mg/ml. Odpowiednie rozcieńczenie wytworzono w PEG/TRIS i podawano dojelitowo w objętości 100 gl. Przeciwciało przeciwko VLA-4 (PS/2) rozcieńczono w soli fizjologicznej w stężeniu 4,2 mg/kg, i podawano dootrzewnowe w 100 gl. Wszystkie dawki podawano bezpośrednio po ekspozycji sRBC.

Obrzęk kontrolnej nieeksponowanej (lewej) i eksponowanej (prawej) poduszeczki łapy mierzono mikrometrem Mitutoyo (Model 304-196, Dyer, Lancaster, PA) w 20 godzin po ekspozycji. Dane przedstawione jako zmianę obrzęku łapy określano przez odjęcie grubości łapy lewej od grubości łapy prawej. Zmiana grubości łapy porównywana była testem t Studenta.

Przeciwciało PS/2 przeciwko VLA-4 w dawce 4,3 mg/kg dootrzewnowo hamowało obrzęk łapy o około 30%, podczas gdy oMePUPA-V podawany dojelitowo w dawce 20 mg/kg nie dawał efektu w tym modelu (dane nie pokazane). Badano skuteczność oMePUPA-V w dawce 20 mg/kg drogą jelitową w modelu mysim DTH indukowanym sRBC i nie zaobserwowano skuteczności.

P r z y k ł a d 4: Aktywność w modelu reakcji kontaktowej nadreaktywności typu późnego

20-gramowe samice BALB/c wolne od wirusów (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) trzymano po 4 sztuki w ośrodku Biogen, i pozostawiano wobec pożywienia i wody ad libitum. Myszy znieczulano mieszaniną ketamiy:ksylazyny (90:10 mg/kg, ip) Około 3 cm² skóry brzucha odsłaniano przez golenie sierści i oczyszczano 70 etanolem. 25 gl 0,5% DNFB w mieszaninie 4:1 acetonu:oliwy nakładano równomiernie na odsłoniętą skórę. Skórę zarysowywano pipetą powodując lekki stan zapalny. 24 godziny później, myszy ponownie uczulano 25 gl 0,5% DNFB w nośniku w tym samym miejscu. Drugie uczulanie przeprowadzano na unieruchomionej i znieczulonej myszy. W dniu 5 (około 120 godzin po pierwszym uczuleniu) stosowano dawkę 0,2% DNFB w mieszaninie 4:1 acetonu i oliwy) w celu wywołania reakcji odpornościowej. Myszy znieczulano mieszaniną ketamiy:ksylazyny (90:10 mg/kg, ip). Prawe ucho eksponowano na nośnik (4:1 acetonu:oliwy). Przez następne 24 godziny badano obrzęk ucha jak pokazano na Fig. 4, przez zastosowanie mikrometru o dokładności ^25,4 x ¹⁰'⁴ mm.

Związki (w odpowiednim nośniku; 100 gl) (sulfotlenek dimetylu) w izotonicznym buforze fosforanowym soli fizjologicznej) podawano doustnie, w zgłębniku żołądkowym, 4 godziny po ekspozycji w dniu 5. Grupy po 8 myszy zastosowano do każdej z grup. oMePUPA-V (partia 2044-076) rozpuszczona została w 0,5% buforze fosforanowym. pH 8,8 i 3% DMSO). Reakcję obrzęku ucha badano jako różnicę między kontrolą i grupą eksponowaną na DNFB w 24 godziny po ekspozycji. Zahamowanie obrzęku ucha określano przez porównanie grupy leczonej z nieleczoną. Istotność statystyczną pomię18

PL 198 189 B1 dzy grupami badano stosując test Dunnetta, dla wielokrotnych porównań z grupą kontrolną (Systat, SPSS Inc.) stosując p<0,05. Wartości wyrażano jako średnią ± standardowy błąd.

Figura 4 pokazuje porównanie reakcji obrzęku ucha mierzonego 24 godziny po ekspozycji na DNFB, u myszy otrzymującej nośnik (DMSOI, PBS), grupy kontroli pozytywnej (0,03 μθ/kg) albo 0,03 albo 0,3 oMePUPA-V w dawce dojelitowej 4 godziny po ekspozycji na DNFB (Górny Panel). Leczenie wywołane lekiem pokazano na dolnym panelu. Dawki oMePUPA-V istotnie hamują reakcję obrzękową w stopniu porównywalnym ze związkiem kontrolnym.

P r z y k ł a d 5. BIOCHEMIA

5.1. Powinowactwo oMePUPA-V do receptora zmierzone z użyciem koniugatu VCAMalkaliezna fosfataza Ig w próbie bezpośredniego wiązania VCAM-Ig (DBA)

Skonstruowano i oczyszczono VCAM-Ig zgodnie z publikacją A. Jakubowski i in., Cell Adhesion and Communication, 3: 131-142, 1995. Koniugację cielęcej jelitowej fosfatazy alkalicznej, potrzebną do odszczepienia chromogenicznego substratu, przeprowadzono zgodnie z publikacją R.R. Lobb i in., Cell Adhesion and Communication 3:385-397, 1995). Wiązanie do VLA-4 oceniono na ludzkiej linii limfocytów T, Jurkat (α4β1). VCAM-Ig-AP i oMePUPA-V konkurowały o wiązanie z α4β1 na powierzchni tych komórek w obecności 1 mM Mn⁺².

W teście na bezpośrednie wiązanie VCAM-Ig oMePUPA-V współzawodniczy z VCAM-Ig-AP o wiązanie z komórkami Jurkat w obecności 1 mM MnCl₂, w zależności od stężenia, z IC50 dla 8 ± 1 nM (n=9). Wyniki są przedstawione w tabeli 4.

5.2. Powinowactwo oMePUPA-V do receptora zmierzone z użyciem koniugatu VCAM-alkaliczna fosfataza Ig w próbie z oczyszczonym VLA-4 białko/białko

VLA-4 wydzielono z ekstraktu detergentowego subklonu komórek K562 transfekowanych α4, charakteryzującego się wysoką ekspresją, metodą chromatografii powinowactwa do przeciwciał i immobilizowano w studzienkach na płytkach do mikromianowania aby przeprowadzić próbę kompetytywnego wiązania białko/białko. VCAM-Ig-AP związało się z płytką pokrytą oczyszczonym VLA-4 w nieobecności bądź w obecności oMePUPA-V (partia nr 2) i 1 mM MnCl₂. Płytki odczytano przy 405 nm, a dane poddano analizie stosując program SoftMax v. 2.32.

Wiązanie koniugatu VCAM-Ig z oczyszczonym VLA-4 było całkowicie zablokowane przez swoiste neutralizujące monoklonalne przeciwciało przeciw α4 (HP1/2). W tabeli 4 są przedstawione dwie wartości IC50 uzyskane dla oMePUPA-V w próbie VLA-4 białko/białko oraz wartości IC50 otrzymane w próbie na kompetytywne wiązanie VCAM-Ig-AP przeprowadzonej na komórkach Jurkat oraz w próbie na adhezję komórek CS1.

5.3. Powinowactwo oMePUPA-V do receptora ocenione w próbie na adhezję komórek CS1

a. Adhezja komórek Jurkat do koniugatu CS1/BSA

Zsyntetyzowano peptyd NH2-cysteina-tyrozyna-CS-1 i sprzężono go z BSA-SMCC (SMCC jest heterobifunkcyjnym środkiem sieciującym, który reaguje z wolnymi grupami aminowymi na BSA i jedyną cysteiną w syntetycznym peptydzie) w stosunku CS1/BSA 10:1. Studzienki pokryto 100 μl koniugatu rozcieńczonego do końcowego stężenia 1 μg/ml i utrzymywano przez noc. Następnie dnia studzienki zablokowano BSA w PBS na 1 godzinę, po czym przemyto trzy razy.

Ludzką linię limfocytów T, Jurkat, znakowano estrem acetoksymetylowym (2',7',bis-(2-karboksyetylo)-5 i 6-)karboksyfluoresceiny (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon; katalog nr B-1150), który jest internalizowany i deestryfikowany i złapany w ten sposób przez żywe komórki. Do pokrytych płytek dodano komórki Jurkat (1 x 10⁵ komórek/studzienkę) w buforze zawierającym 1 mM Mn+2, w obecności trzykrotnych seryjnych rozcieńczeń inhibitora. Każde stężenie badano w dwóch próbach. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej płytki odwrócono i przemyto trzy razy albo do momentu aż żadne komórki nieprzylegały do kontrolnych studzienek pokrytych samym BSA. Komórki przylegające zliczono we fluorescencyjnym czytniku płytkowym Cytofluor przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 530 nm.

Komórki, które przylegały do CS1/BSA w nieobecności związku, służyły jako kontrola - 0% zahamowania, zaś komórki przylegające do samego BSA służyły jako kontrola - 100% zahamowania. Wartości IC50 obliczono stosując program Deltagraph, wersja 5.

Adhezja znakowanych komórek Jurkat w obecności Mn=2 była całkowicie zablokowana przez EDTA i neutralizujące monoklonalne przeciwciało przeciw-a4p1, HP1/2, co wskazuje, że wiązanie było swoiste. W tabeli 4 przedstawione są aktywności oMePUPA-V w próbie adhezji CS1/BSA oraz wyniki z próby wiązania.

PL 198 189 B1 oMePUPA-V jest silnym antagonistą VLA-4 w buforach zawierających Mn⁺². Jest on 80 razy silniejszy, gdy badany jest w obecności Mn=2 na wyizolowanym VLA-4 niż na komórkach Jurkat w próbie wiązania. oMePUPA-V jest funkcjonalnym antagonistą, jak wykazała jego zdolność do zależnego od dawki i całkowitego blokowania adhezji Jurkat do CS1. Te absolutne wartości w próbie adhezji są większe niż te, które zaobserwowano w próbach wiązania. Może to być spowodowane multiwalentnym charakterem adhezji. We wszystkich próbach hamowanie wiązania przez EDTA i HP1/2 wykazało swoiste wiązanie z VLA-4.

T a b e l a 4

Powinowactwo oMePUPA-V do receptora w obecności 1 mM MnCL jak zmierzono w próbie na kompetytywne wiązanie VCAM-Ig, w próbie adhezji komórek CS1 i w próbie oczyszczone VLA-4 białko/białko

	IC50 ± SD [nM]
Próba	oMePUPA-V
Komórki Jurkat	8 ± 1 (n=9)
Wiązanie VCAM-Ig
Komórki Jurkat	22 ± 2 (n=4)
Adhezja CS1
Oczyszczony VLA-4	0,1 (n=2)
Wiązanie VCAM-Ig	(0,1, 0,1)

6.4. Swoistość hamowania przez OMePUPA-V

a. Swoistość oMePUPA-V oceniona z użyciem komórek JY w próbie bezpośredniego wiązania VCAM-Ig i w próbie adhezji CS1

Wiązanie α4β7 oceniono na komórkę JY w obecności Mn+2. W próbie wiązania VCAM-Ig i oMePUPA-V współzawodniczyły o wiązanie do α4β7 na komórkach JY (patrz część 4,1.1 w protokole prób). W próbie adhezji komórek badano oMePUPA-V na zdolność do blokowania komórek JY (α4β7) wiążących się z koniugatem CS1/BSA.

oMePUPA-V nie blokuje wiązania α 4β7 do VCAM-Ig lub CS1/BSA. Monoklonalne przeciwciało przeciw β7, Fib27 (Pharmingen) zahamowało całkowicie te interakcje wskazując, że wiązanie α4β7 było swoiste. Zatem oMePUPA-V jest swoistym inhibitorem dla VLA-4. Wyniki są przedstawione w tabeli 5.

b. Swoistość oM^FPUF^/^--V oceniona na podssawie adhezjj komórek K562 do studzienek pokrytych Fn-120

Nietraktowane 96-studzienkowe płytki polistyrenowe z płaskim dnem pokryto na noc 5 pg/ml Fn-120 w 4°C. Płytki przemyto dwa razy solanką buforowaną fosforanem (PBS) i zablokowano 1%-albuminą surowicy bydlęcej (BSA) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki przemyto dwukrotnie buforem TBS zawierającym 1 mM MnCL (bufor do próby). Komórki K562 znakowano 2 μΜ barwnika fluorescencyjnego CECF-AM (patrz część 4.1.3) i związano z płytką na 30 minut w temperaturze pokojowej. Płytki odwrócono i przemyto trzy razy i przylegające komórki zliczono we fluorescencyjnym czytniku płytkowym Cytofluor przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 530 nm.

Adhezja K562 do Fn-120 była całkowicie zablokowana przez neutralizujące przeciwciało przeciw α5, IIA1 (Pharmingen), co wskazuje na swoiste wiązanie przez VLA-5. Nie stwierdzono zahamowania wiązania komórek K562 z fragmentem Fn120K przez O-MePUPA-V w dawkach tak wysokich, jak 100 pM. Patrz tabela 5 poniżej.

c. Próba na agregację przeprowadzona w celu oceny swoistości oMePUPA-V

Metody

Aktywność wobec gpllbllla oceniono za pomocą standardowej agregometrii płytek, w której stosowano bogate w płytki osocze. Do zainicjowania agregacji stosowano ADP w obecności osocza, w którym główne dwuwartościowe kationy stanowiły Ca⁺2 i Mg+2. GRGDSP w stężeniu 10 pg/ml stosowano jako kontrolę dodatnią.

Wyniki oMePUPA-V badano w trzech dawkach = 1, 10 i 100 pM. Przy żadnej dawce nie zaobserwowano hamowania agregacji płytek indukowanej przez ADP. Wyniki są przedstawione w tabeli 5.

PL 198 189 B1 oMePUPA-V jest znaczenie bardziej (>10 000 razy) swoisty wobec VLA-4. Nie zaobserwowano dającej się zmierzyć aktywności (>100 μΜ) wobec pokrewnych integryn, α4 β7 i VLA-5 lub wobec integryny β3, gpllbllla.

T a b e l a 5

Aktywność hamująca oMePUPA-V zmierzona w próbie na kompetytywne wiązanie α4β7 VCAM-Ig w próbie na adhezję α4β7 i VLA5 oraz w badaniach na agregację płytek.

Linia komórkowa	Ligand	Dwuwartościowy kation	oMePUPA-V IC50 ± SD [nM]
JY	VCAM-lg	Mn⁺²	3% zahamowania
(α4β7)	DBA		przy 100 gM (n=3)
JY	Adhezja	Mn⁺²	brak zahamowania
(α4β7)	CS1/BSA	przy 100 gM (n=4)
K562	Adhezja	Mn⁺²	brak zahamowania
(VLA-5)	Fn-120	przy 100 gM (n=3)
Płytki	Agregacja	Ca^+2/Mg^+z	brak zahamowania
(llbllla)	fibrynogenu	przy 100 gM (n=1)

P r z y k ł a d 6. Ocena oMePUPA-V na indukcję LIBS

6.1. Pomiar na komórkach Jurkat z użyciem przeciwciała LIBS, 9EG7

a. Indukcję LIBS przez antagonistów α4β1 oceniono in vitro przez analizę FACS. Komórki Jurkat (2 x 10⁵/studzienkę) inkubowano wstępnie w 37°C przez 20 minut z solanką buforowaną TRIS zawierającą 2 mM samego MgCl₂ (Mg⁺²-TBS) lub z seryjnymi rozcieńczeniami badanych związków. Próbki przeniesiono do łaźni lodowej i dodano przeciwciała LIBS, 9EG7, w końcowym stężeniu 10 μg/ml. Komórki przemyto dwa razy Mg+2-TBS i ponownie zawieszono w rozcieńczeniu 1:200 FITC skoniugowanego z kozią przeciw-szczurzą IgG w Mg+2-TBS i inkubowano przez 30 minut w 4°C. Komórki przemyto dwa razy i ponownie zawieszono w Mg+2-TBS. Średnie natężenie fluorescencji (MFI) oznaczono przez analizę FACS (Becton Dickinson FACScan). Wyniki wyrażono jako MFI. Dane analizowano stosując program Microsoft Excel wersja 5.0 i Deltagraph wersja 4.0.

Figura 5 wykazuje, że oMePUPA-V indukuje ekspozycję epitopu LIBS, co porównano z 2 mM buforu Mg+2 (Panel B). Indukcja była zależna od stężenia i ilościowo podobna do indukcji obserwowanej z 1 mM Mn+2 (Panel A). Pominięcie przeciwciała LIBS i wykrycie przeciwciała lub pominięcie wykrywania samego przeciwciała eliminowało znakowanie (Panel B). ED50 odpowiedzi wynosiła ~20 nM.

Wniosek

Dane te wskazują, że oMePUPA-V indukuje taką samą zmianę konformacyjną w VLA-4, jaką zaobserwowano z natywnymi ligandami. Wartości LIBS na ogół są w zakresie określonym przez próbę na wiązanie i próbę adhezji, które mają wartości 8 nM i 22 nM, odpowiednio, dla oMePUPA-V.

6.2. Badanie przesiewowe receptorów z wielu gatunków

a. Powinowactwo oMePUPA-V do receptora zmierzone w próbie na bezpośrednie wiązanie VCAM-Ig z użyciem koniugatu VCAM-alkaliczna fosfataza Ig i limfocytów krwi obwodowej lub komórek śledziony z różnych gatunków

PBL wyizolowano stosując metody opisane dla PBL owcy (W.M. Abraham i in., J. Clin. Invest. 93:776-787, 1994). W celu porównania wiązania oMePUPA-V do tych różnych typów komórek stosowano próbę na wiązanie kompetytywne VCAM-Ig-AP.

Wartości IC50 uzyskane dla oMePUPA-V na limfocytach krwi obwodowej lub komórkach śledziony z różnych gatunków w obecności Mn⁺2 przedstawione są w tabeli 6. W obecności Mn+2 oMePUPA-V hamuje, z podobną wartością IC50, wiązanie VCAM-Ig do limfocytów otrzymanych od ludzi, szczurów, psów, owiec i myszy. Nie ma żadnego obwodu na swoistość gatunkową. Zgadza się to z wysokim stopniem zakonserwowania sekwencji obserwowanym wśród gatunków dla VLA-4 i jego naturalnych ligandów, CS-1 i VCAM.

PL 198 189 B1

T a b e l a 6

Powinowactwo oMePUPA-V do receptora zmierzone w próbie kompetytywnego wiązania VCAM-Ig z użyciem koniugatu VCAM-alkaliczna fosfataza Ig i limfocytów krwi obwodowej lub komórek śledziony z różnych gatunków

Gatunki	Źródło	Dwuwartościowy kation	IC59 [nM]
Człowiek	PBL	Mn⁺²	6 ± 1 (n=3)
Owca	PBL	Mn⁺²	3 ± 1 (n=3)
Pies	PBL	Mn⁺²	13 ± 2 (n=3)
Mysz	splenocyty	Mn⁺²	4 ± 2 (n=4)
Szczur	splenocyty	Mn⁺²	5 ± 1 (n=3)

P r z y k ł a d 7: Kinetyka wiązania oMePUPA-V z receptorem

7.1. Próba na współzawodnictwo z użyciem ³H-znanego inhibitora jako sondy

Komórki Jurkat utrzymywano w pożywce RPMI-1640 z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej w 37°C w inkubatorze do hodowli tkankowej. Do badań na wiązanie komórki zebrano przez wirowanie, przemyto dwa razy TBS (50 mM Tris HCl, 150 nM NaCl, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej, 2 nM glukozy ¹⁰ m^{M H}EPE^S, ^{pH 7,4}X zawtoszono w ^TBS w Hośd okoto ² x W^{6 k}om^órek/m^{l i} zHczono stosuj^ąc hemocytometr Neubauer. Komórki dalej rozcieńczano do 1,5 x 106/ml we wskazanych buforach i traktowano jak określono dla każdego doświadczenia. Następnie komórki zebrano przez wirowanie, zawieszono ponownie w 100 μΙ buforu do próby i przeniesiono do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 2,9 ml ScintiVerse II (Fisher Scientific). Radioaktywność związaną z komórkami zliczono w liczniku scyntylacyjnym. Impulsy związane w tych warunkach dawały pomiar integryny, która nie jest zajęta przez badany związek, zatem jest wolna i może związać się z ³H-znanym inhibitorem. Wszystkie badania prowadzono w silikonowanych 1,5 ml probówkach Eppendorfa z próbkami o standardowej objętości 1 ml. Nieswoiste wiązanie ³H-znanego inhibitora do komórek (tło) określono przez pomiar inhibitora związanego w nieobecności jonu metalu. Swoiste związane impulsy obliczono przez odjęcie nieswoistych impulsów od całkowitej liczby związanych impulsów.

Przeprowadzono serię badań współzawodnictwa, aby potwierdzić, że oMePUPA-V i znany inhibitor współzawodniczą o to samo miejsce na VLA-4. W pierwszym badaniu ³H-znany inhibitor zmieszno z równomolową ilością oMePUPA-V, z 10-krotnym nadmiarem i 100-krotnym nadmiarem, inkubowano z komórkami Jurkat i oceniono zdolność zimnego inhibitora do współzawodnictwa o wiązanie z inhibitorem. Po potraktowaniu oMePUPA-V uzyskano zahamowanie wiązania ³H-znanego inhibitora zależnego od dawki. Stężenie oMePUPA-V, które było potrzebne do współzawodnictwa w wiązaniu i z ³H-znanym inhibitorem było 10 razy większe niż to, które było potrzebne, gdy stosowano zimny inhibitor, zgodne z jego niższym powinowactwem wobec VLA-4 aktywowanym Mn+2

W drugim badaniu komórki Jurkat aktywowane Mn⁺² traktowano ³H-znanym inhibitorem w tym celu, aby najpierw związać VLA-4 z radioaktywną sondą, a następnie dodano zimny oMePUPA-V. Następne działania nadmiarem zimnego oMePUPA-V lub znanym inhibitorem nie różniły się zdolnością do zastąpienia radioaktywnej sondy.

W trzecim badaniu komórki Jurkat aktywowane Mn+2 traktowano nasycającymi ilościami oMePUPA-V i zmierzono szybkość dysocjacji oMePUPA-V. W przeciwieństwie do przedłużonego okresu półtrwania znanego inhibitora dla VLA-4 aktywowanego Mn+2, oMePUPA-V szybko uwalnia się z oMePUPA-V-VLA-4 t1/2 poniżej 10 minut. Duża różnica w t₄/2 dla oMePUPA-V i znanego inhibitora sugeruje, że niższe powinowactwo oMePUPA-V wobec VLA-4 jest wynikiem jego szybszego uwolnienia.

Dane odnośnie dysocjacji potwierdzają, że wiązanie oMePUPA-V do VLA-4 jest w dużym stopniu zależne od stanu aktywacji VLA-4 i że wykazuje taką samą selektywność dla aktywacji ze znanym inhibitorem.

Jak z VLA-4 aktywowanym Mg+2, t₄/2 dla dysocjacji oMePUPA-V z VLA-4 aktywowanego Mg+2 był krótszy niż wartość w punkcie czasowym dającym się ocenić w teście współzawodnictwa. Z drugiej strony w obecności Mg+2 i aktywującego przeciwciała, TS2/16, t_d/2 był przedłużony (20 min). Nie oceniano dokładnie wszystkich możliwych stanów aktywacji, jednak zastosowano proste badanie przesiewowe, które szybko wykazało różnice. W tej próbie oMePUPA-V (10 mM) o określonym stężeniu zmieszano z 5 nM ³H-znanego inhibitora i w tych warunkach przeprowadzono wiązanie w różnych stanach aktywacji. Gdyby oMePUPA-B miał nienormalnie wysokie lub niskie powinowactwo wobec

PL 198 189 B1

VLA-4, można byłoby to wykryć przez różnicę w ilości ³H-znanego inhibitora. Różnice w udziale procentowym związanego ³H-inhibitora w różnych warunkach aktywacji są w przybliżeniu takie, jak przewidywano w oparciu o znane własności inhibitora.

Badania wiązania potwierdzają, że oMePUPA-V współzawodniczy ze znanym inhibitorem o wiązanie do VLA-4 w stężeniach zgodnych z jego powinowactwem i wykazują, że dwa związki współzawodniczą o to samo miejsce na integrynie. Podobieństwo w wiązaniu oMePUPA-V i znanego inhibitora w różnych stanach aktywacji VLA-4 sugeruje, że mechanizm wiązania jest podobny.

7.2. Próba z oMePUPA-V w próbach przesiewowych Panlabs i Cerep oMePUPA-V badano w próbach przesiewowych Panlabs Profiling Screen, Discobery Screen i Immunoscreen radioliganda, enzymu i prób funkcjonalnych i w panelu z receptorem błonowym Cerep. Nie zaobserwowano żadnej znaczącej aktywności dla oMePUPA-V w stężeniu 10 μΜ w żadnej z prób, w tym w próbie z receptorem NKl, wobec którego znane inhibitory wykazywały pewną aktywność.

Z badania Cerep wynika, że oMePUPA-V nie wykazuje hamowania wobec aktywności ludzkiej ^proteaz^y ACE. Źr^ódłem ^proteaz^y ACE ^były tadztoe tomórld ^śr^ódbłon^ka (^HUVEC). ^3H-^HGG^, do^dan^y do HUVEC, przeprowadzono w kwas ³H-hipurowy i glicyloglicynę przez ACE. Captopril, silny inhibitor ACE, blokował konwersję z IC50 990 pM, podczas gdy oMePUPA-V w stężeniu 10 μM nie blokował.

Własności farmaceutyczne oMePUPA-V jest krystalicznym proszkiem o zabarwieniu białym do białawego. Jest rozpuszczalny w DMSO i ma rozpuszczalność w wodzie 0,120 mg/ml. Termiczne zachowanie się oMePUPAV badane metodą DSC TGA i mikroskopii w stanie na gorąco wskazuje, że substancja topi się w około 160°C. Analiza DSC i TGA w około 136°C sugeruje, że oMePUPA-V jest pozbawiony lotnych zanieczyszczeń, co być może zgadza się z odwodnieniem monohydratu.

Kompozycja

Kompozycja do rozpylania

Poniżej wymieniono zalecenia dotyczące wytworzenia kompozycji do rozpylania dla 100 ml 5 mg/ml oMePUPA-V:

Przygotować 200 ml podstawowego roztworu buforowego, jak następuje:

1. Odważyć 0,286 g trometaminy, USP do odpowiedniego pojemnika

2. Odważyć 1,676 g chlorku sodu, USP do tego samego pojemnika

3. Dodać 200 ml wody do iniekcji, USP.

Zmieszać aż do jednorodności.

1. Odważyć 0,500 g oMePUPA-V do odpowiedniego pojemnika

2. Dodać 100 ml buforu wytworzonego w etapie 1

3. Zmieszać aż do jednorodności

4. Przesączyć w sposób sterylny do odpowiedniego pojemnika

5. Zamknąć odpowiednią zatyczką.

Typowe własności kompozycji: pH: 7,4, Osmolowość: 290 mOsm

P r z y k ł a d 9: Oznaczenie trwałości metodą HPLC

Kolumna: Zorbax® SB-C18, cząstki 3 ..m, 4,6 x 150 mm

Kolumna dodatkowa: Zorbax® SB-C17, cząstki 5 μίΓ, 4,6 x 12,5 mm

Szybkość przepływu: 1 ml/min

Temperatury kolumny: 40°C

Temperatura w automatycznym urządzeniu do próbek: 4°C

Faza ruchoma: A: 0,1% (wag./obj.) kwas trifluorooctowy (TFA) w wodzie

B: 0,1% (wag./obj.) TFA w 90% (obj./obj.) acetonitryl, 10% (obj./obj.) woda

Gradient:
	Czas (min)	%B
	0-3	15
	3-1 8	15 do 100
	18-21	100
	21 -28	15
Wtrysk:	10 μl 0,2 mg/ml roztworów w układzie

Tris/NaCl/woda (masa przejściowa) lub w 0,1% TFA/45% acetonitryl (produkt końcowy) Detekcja: UV przy 254 nm (początkowy) i 215 nm

PL 198 189 B1

Kontrola: oMePUPA-V, ogrzewana wewrzącej wodzie przez 20 minut.

Zakończono metodę wstępną badania jakości.

Trwałość substancji leku

Nie obserwowano rozkładu masy przejściowej przechowywanej przez dwa tygodnie w następujących warunkach przechowywania: w 40°C w zamkniętej fiolce; w 50°C w zamkniętej fiolce; w 25°C przy wilgotności względnej 60%; i w 40°C przy wilgotności względnej 75%. Po czterech tygodniach jeden lub dwa piki rozkładu stały się wykrywalne w 40°C i 50°C, ale poziom każdego piku zanieczyszczeń był nadal mniejszy niż 0,02%.

Trwałość roztworu

a) Komppozyje do joozplania, 5 mg/ml w TTs/NnCI, przzehowywana w jemppeaturzz pc^k^c^oj>^w^j przez dwa miesiące wykazały wczesne piki elucji rozkładu przy całkowitym poziomie 1% (przy 254 nm) i 2-3% (przy 215 nm).

b) Og/zzwaniekcmgpozcji dd roozplaniawa wrząceć wa0dieprzze22 mionu zmgiejszzcczs/okć z 99,9% do 98,7% przy 254 nm i ze 100% do 93,6% przy 215 nm.

c) RRo^wr 0,2πιρ/πΡ w ukCaadieTris/NaCI/waOdprzz oOojetnam pH j je/t rwatyw temgpcaturzz 2-8°C co najmniej przez tydzień.

Claims

1. (R)-N-{[4-{[(2-metylofenyloamino)-karbonylo]amino}fenylo]acetylo}-L-prolilo-3-metylo]-e-alanina, stanowiąca związek o wzorze

2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera związek określony w zastrz. 1 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

3. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do zapobiegania, hamowania lub zmniejszania adhezji komórek u ssaków.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że lek stosuje się w zapobieganiu, hamowaniu lub łagodzeniu zapalenia.

5. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia astmy, alergicznego nieżytu nosa, stwardnienia rozsianego, miażdżycy naczyń, choroby zapalnej jelita grubego lub szpiczaka mnogiego u ssaka.

6. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia stwardnienia rozsianego u ssaka.

7. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia chorób zapalnych jelita grubego u ssaka.

8. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia objawów astmy u ssaka.