PL195815B1 - Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, środki go zawierające i zastosowania bakteriofagów - Google Patents
Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, środki go zawierające i zastosowania bakteriofagówInfo
- Publication number
- PL195815B1 PL195815B1 PL355355A PL35535502A PL195815B1 PL 195815 B1 PL195815 B1 PL 195815B1 PL 355355 A PL355355 A PL 355355A PL 35535502 A PL35535502 A PL 35535502A PL 195815 B1 PL195815 B1 PL 195815B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteriophage
- cell
- eukaryotic cell
- cells
- eukaryotic
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 88
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 102100037373 DNA-(apurinic or apyrimidinic site) endonuclease Human genes 0.000 claims description 15
- 101710088570 Flagellar hook-associated protein 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 claims 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 claims 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 7
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10151—Methods of production or purification of viral material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1. Bakteriofag HAP1 zdeponowany w PCM jako F/00028. 2. Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga o powinowactwie do komórek eukariotycznych, znamienny tym, ze zawiera etapy, w których: (a) kontaktuje sie komórke eukariotyczna z bakteriofa- gami, (b) usuwa sie niezwiazane lub slabo zwiazane bakteriofagi, (c) bakteriofaga zwiazanego z ko- mórka eukariotyczna namnaza sie w komórce bakteryjnej uzyskujac w ten sposób szczep bakteriofa- ga o zwiekszonym powinowactwie do komórek eukariotycznych. 16. Srodek do diagnozowania i/lub leczenia, i/lub zapobiegania, i/lub powstrzymywania rozwoju choroby zwiazanej z wystepowaniem komórki eukariotycznej, znamienny tym, ze jako czynnik ak- tywny zawiera bakteriofaga wiazacego sie z ta komórka eukariotyczna. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania bakteriofagów o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, nowe zastosowania bakteriofagów, mutant bakteriofaga i środek farmaceutyczny.
Choroby nowotworowe stanowią poważne wyzwanie dla współczesnej medycyny. Mimo wielu lat badań zmierzających do uzyskania uniwersalnej terapii antynowotworowej medycyna nie dysponuje tego rodzaju narzędziami. Istnieje zatem potrzeba dostarczenia środków i sposobów leczenia, zapobiegania i powstrzymywania rozwoju chorób nowotworowych.
Znane są liczne zastosowania bakteriofagów polegające na wykorzystaniu ich jako czynnika antybakteryjnego. Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu otrzymywania bakteriofagów wykazujące powinowactwo do komórek eukariotycznych. Bakteriofagi posiadające podwyższone powinowactwo do komórek eukariotycznych mogłyby znaleźć szereg zastosowań zarówno w terapii jak i diagnostyce. W szczególnym przypadku pożądane jest otrzymanie bakteriofagów posiadających podwyższone powinowactwo do komórek nowotworowych.
W szczególności celem tego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogą być wykorzystane do diagnozowania, leczenia, zapobiegania i powstrzymywania rozwoju chorób związanych z występowaniem, określonych komórek eukariotycznych, zwłaszcza nowotworowych.
Określone powyżej zamierzenia zostały nieoczekiwanie zrealizowane w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, charakteryzujący się tym, że zawiera etapy, w których: (a) kontaktuje się komórkę eukariotyczną z bakteriofagami, (b) usuwa się niezwiązane lub słabo związane bakteriofagi, (c) bakteriofaga związanego z komórką eukariotyczną namnaża się w komórce bakteryjnej uzyskując w ten sposób szczep bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych. Korzystnie, szczep bakteriofaga uzyskanego w (c) wykorzystuje się w kolejnym powtórzeniu etapów (a), (b) i (c), przy czym korzystnie liczba kolejnych powtórzeń jest większa niż 1, korzystnie nie mniejsza niż 7. Korzystnie etap (a) obejmuje dodatkowo poddawanie bakteriofaga działaniu czynników mutagennych przed skontaktowaniem go z komórką eukariotyczną. W sposobie według wynalazku, korzystnie komórką eukariotyczną jest komórka nowotworowa. Korzystnie w etapie (a) inkubuje się komórki eukariotyczne z roztworem zawierającym bakteriofagi w stosunku ilościowym od 1do 105 pfu bakteriofaga na komórkę eukariotyczną, przy czym korzystniej w etapie (a) inkubuje się komórki eukariotyczne z roztworem zawierającym bakteriofagi w stosunku ilościowym 1000 pfu bakteriofaga na komórkę eukariotyczną, w temperaturze 37°C przez 2 h. Korzystnie w etapie (b) sposobu według wynalazku prowadzi się przynajmniej jedno płukanie komórek, przy czym korzystniej w etapie (b) prowadzi się 1-10-krotne płukanie wodą lub nisko stężonym roztworem soli. Korzystnie w etapie (c) sposobu według wynalazku prowadzi się hodowlę bakteriofaga metodą płytek dwuwarstwowych. Korzystnie w etapie (c) sposobu według wynalazku otrzymaną w wyniku namnażania zawiesinę zawierającą bakteriofagi przesącza się przez sączki antybakteryjne.
Przedmiotem wynalazku jest także bakteriofag HAP1 zdeponowany w PCM jako F/00028.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie bakteriofaga do wiązania się z komórką eukariotyczną, korzystnie komórką nowotworową.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie bakteriofaga wiążącego się z komórką eukariotyczną do wytwarzania preparatu do diagnozowania i/lub leczenia i/lub zapobiegania B i/lub powstrzymywania rozwoju choroby związanej z występowaniem tej komórki eukariotycznej, korzystnie komórką eukariotyczną którą jest komórka nowotworowa.
Przedmiotem wynalazku jest także środek do diagnozowania i/lub leczenia i/lub zapobiegania i/lub powstrzymywania rozwoju choroby związanej z występowaniem komórki eukariotycznej, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera bakteriofaga wiążącego się z tą komórką eukariotyczną, korzystnie komórką nowotworową.
W wyniku przeprowadzonych badań nieoczekiwanie stwierdzono, że zaprezentowany sposób pozwala uzyskać bakteriofagi wykazujące zwiększone powinowactwo do komórek eukariotycznych. Uzyskane w ten sposób bakteriofagi stanowią dogodne narzędzie dla współczesnej medycyny, które może być szeroko wykorzystane zarówno w terapii jak i w diagnostyce. Zastosowania terapeutyczne mogą obejmować terapię celowaną, polegającą np. na wykorzystaniu bakteriofagów jako czynnika dostarczającego lek (np. obce białko wbudowane w strukturę, lub obce, lecznicze DNA wbudowane w genom faga). Inne zastosowanie terapeutyczne otrzymanych bakteriofagów może polegać na pośrednim
PL 195 815 B1 stymulowaniu i ukierunkowywaniu odpowiedzi immunologicznej organizmu gospodarza na tkankę, do której powinowactwo wykazują bakteriofagi. Fagi o zwiększonym powinowactwie do tkanki nowotworowej mogą być wykorzystane do leczenia, zapobiegania i powstrzymywania rozwoju chorób nowotworowych, oraz zapobieganiu powstawania przerzutów. Zaprezentowane figury stanowią uzupełnienie treści niniejszego opisu.
Figura 1 przedstawia liczbę kolonii nowotworowych w płucach myszy w 22 dni po dożylnym podaniu komórek mysiego czerniaka B16 w ilości komórek 3x105/mysz, myszom z grupy T4 podawano lizat bakteriofaga T4, HAP1 myszom z grupy HAP1 podawano lizat bakteriofaga HAP1, myszom z grupy SON podawano sonifikat bakteryjny, natomiast myszy z grupy K (kontrola) otrzymywały sól fizjologiczną (szczegółowy opis patrz przykład 2).
Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku została ona zilustrowana poniższymi przykładami. Błędne byłoby jednak ograniczanie zakresu wynalazku jedynie do tych przykładowych realizacji.
P r z y k ł a d 1. Uzyskanie mutanta bakteriofagowego o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych.
Jako docelowe komórki eukariotyczne zastosowano komórki przeszczepialnego mysiego czerniaka B16. Linię tą otrzymano z Narodowego Instytutu Rakowego, Bethesda, USA i obecnie jest ona utrzymywana w Banku Linii Komórkowych w Zakładzie Immunologii Nowotworów IITD. Badany bakteriofag T4 został zakupiony w American Type Culture Collection USA. Zastosowano lizaty bakteriofagowe uzyskane w wyniku hodowli bakteriofaga T4 na bakteriach Escherichia coli Bz Kolekcji Mikroorganizmów IITD; lizaty przesączono przez sączki antybakteryjne 0,22 μm Millipore. Miana lizatów bakteriofagowych użytych w doświadczeniach wynosiły 108-109 pfu/ml.
Przeprowadzono mutagenezę bakteriofaga T4 z zastosowaniem EMS (ethyl methane sulphonate, Sigma) [Lawley P.D., Martin C.N. (1975): Molecular Mechanisms in Alkylation Mutagenesis. Biochem.J. 145, 85-91].
Wykonano serię pasaży bakteriofaga na komórkach B16 in vitro. W każdym pojedynczym pasażu inkubowano komórki B16 z lizatem bakteriofagowym w stosunku ilościowym 1000 pfu bakteriofaga T4 na 1komórkę B16, w temperaturze 37°C przez 2 h. Następnie komórki B16 były 5-7-krotnie płukane 0,9% NaCl: komórki zwirowywano, zlewano supernatant, zawieszano w 0,9% NaCl. Końcowa zawiesina komórek była wykorzystana do hodowli bakteriofaga metodą płytek dwuwarstwowych [Adams M.H. (1959): Bacteriophages. Inter. Science Publ., New York], na bakteriach Escherichia coli B z Kolekcji Mikroorganizmów IITD. Otrzymaną zawiesinę przesączono przez sączki antybakteryjne 0,22 μm Millipore i używano do następnego pasażu. Łącznie wykonano 7 pasaży.
Po serii pasaży porównano zdolność do wiązania się z komórkami B16 bakteriofaga T4 oraz populacji fagów otrzymanej drogą selekcji w pasażach (PPF). Przygotowano lizat bakteriofaga T4 oraz lizat po hodowli PPF na bakteriachEscherichia coli Bz Kolekcji Mikroorganizmów IITD, tak, abymiana w obu lizatach były takie same. Lizaty przesączono przez sączki antybakteryjne 0,22 μm Millipore. Inkubowano komórki B16 z powyższymi lizatami w stosunku ilościowym 1000 pfu na 1 komórkę B16 bakteriofaga, w temperaturze 37°C przez 2 h. Następnie komórki B16 były 7-krotnie płukane 0,9% NaCl: komórki zwirowywano, zlewano supernatant, zawieszano w 0,9%NaCl. W końcowej zawiesinie komórek ustalano liczbę komórek B16 w 1 ml zawiesiny oraz miano bakteriofaga. W ostatnim zlanym supernatancie ustalano miano bakteriofaga w celu potwierdzenia dokładnego usunięcia niezwiązanych bakteriofagów. Następnie ustalano stosunek ilościowy bakteriofagów znajdujących się w uzyskanej zawiesinie końcowej komórek B16 do liczby komórek w tej zawiesinie. Potwierdzono, że stosunek ten w przypadku komórek B16 inkubowanych z lizatem uzyskanym drogą hodowli PPF jest większy od stosunku w przypadku komórek B16 inkubowanych z bakteriofagiem T4 (Tab.1.).
Następnie z bakteriofagów należących do PPF wyprowadzono hodowle bakteriofagowe z pojedynczych łysinek. Hodowle prowadzono na bakteriach Escherichia coli B z Kolekcji Mikroorganizmów IITD, tak, aby miana w lizatach były takie same. Lizaty przesączono przez sączki antybakteryjne 0,22 μm Millipore. Dla każdej tak uzyskanej czystej linii fagowej porównano zdolność do wiązania się z komórkami B16 w stosunku do bakteriofaga T4 (wykonano jw.).Wybrano linię bakteriofaga, który wykazywał największą różnicę w stosunku do bakteriofaga T4; bakteriofag ten otrzymał nazwę HAP1 (Tab. 2.). Bakteriofag HAP1 został zdeponowany dnia 05 sierpnia 2002 r. zgodnie z wymogami traktatu budapeszteńskiego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) zanumerem dostępu PCM F/000028.
PL 195 815 B1
T ab el a 1
Porównanie zdolności do wiązania się z komórkami B16 bakteriofaga T4 oraz populacji bakteriofagów otrzymanej drogą selekcji w pasażach (PPF).
| inkubacja z lizatemT4 | inkubacja z lizatem po hodowli PPF | |
| liczba komórek w zawiesinie końcowej (kom/ml) | 2,6 x 106 | 2,3 x 106 |
| miano bakteriofaga w zawiesinie końcowej (pfu/ml) | 1,3 x 104 | 9,5 x 104 |
| stosunek ilościowy bakteriofagów do komórek (%) | 0,5% | 4,1% |
T ab el a 2
Porównanie zdolności do wiązania się z komórkami B16 bakteriofaga T4 oraz bakteriofaga HAP1
| inkubacja z lizatemT4 | inkubacja z lizatem HAP1 | |
| liczba komórek w zawiesinie końcowej (kom/ml) | 1,9x 106 | 1,6 x 106 |
| miano bakteriofaga w zawiesinie końcowej (pfu/ml) | 1 x 104 | 6,5 x 104 |
| stosunek ilościowy bakteriofagów do komórek (%) | 0,5% | 4,1% |
Podsumowanie: Stwierdzono, że bakteriofagi mogą wykazywać powinowactwo do komórek eukariotycznych. Nieoczekiwanie dowiedziono, że zaprezentowany sposób pozwala na uzyskanie bakteriofagów o podwyższonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, przykładowo komórek nowotworowych.
Przykład 2. Aktywność antynowotworowa bakteriofagów wiążących się z komórkami nowotworowymi. Testy in-vivo.
W badaniach zastosowano komórki przeszczepialnego mysiego czerniaka B16. Linię tą otrzymano z Narodowego Instytutu Rakowego, Bethesda, USA i obecnie jest ona utrzymywana w Banku Linii Komórkowych w Zakładzie Immunologii Nowotworów IITD.
Do badań wykorzystano 6-12 tyg. samice myszy szczepu wsobnego: C57Bl/6 pochodzące z Centrum Onkologii w Warszawie. Wszystkie zwierzęta utrzymywane były w konwencjonalnych warunkach laboratoryjnych. Na przeprowadzenie doświadczeń na zwierzętach uzyskano zgodę I Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń z Wykorzystaniem Zwierząt Laboratoryjnych we Wrocławiu.
Do przeszczepiania drogą dożylną (i.v.) stosowano zawiesinę komórek pochodzących z hodowli in vitro. Jednorodną zawiesinę komórek (3x105/mysz) w 0,9% NaCl wstrzykiwano do żyły ogonowej bocznej w objętości 0,2 ml. W wyniku tego rodzaju przeszczepu (komórki nowotworowe wprowadzane są bezpośrednio do krwiobiegu) uzyskujemy przerzuty „eksperymentalne” (sztuczne) [DR: Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis 1997; 15: 272-306]. Po iniekcji dożylnej część komórek nowotworowych przeżywa w krążeniu i po zatrzymaniu się i opuszczeniu światła naczynia zasiedla narząd, w którym może utworzyć ognisko nowotworowe. W przypadku czerniaka B16 narządem tym są płuca.
W badaniach zastosowano bakteriofaga T4 zakupionego w American Type Culture Collection USA oraz jego mutanta HAP1, charakteryzującego się zwiększonym powinowactwem do komórek czerniaka B16, wyselekcjonowanego drogą seryjnych pasaży in vitro bakteriofaga T4 na komórkach czerniaka B16 (patrz przykład 1). Zastosowano lizaty bakteriofagowe uzyskane w wyniku hodowli bakteriofagów na bakteriach Escherichia coli B z Kolekcji Mikroorganizmów IITD. Lizaty przed podaniem zwierzętom przesączono przez sączki antybakteryjne 0,22 μm Millipore. Miana lizatów bakteriofagowych wynosiły 1-2x109 pfu/ml. W pierwszej kontrolnej grupie zwierzętom podawano 0,9% NaCl, w drugiej grupie kontrolnej myszy otrzymały hodowlę bakteryjną Escherichia coli Bz Kolekcji Mikroorganizmów IITD, po rozbiciu bakterii metodą sonifikacji oraz przesączeniu przez sączki antybakteryjne 0,22 μm
Millipore. Metodą chromatografii gazowej spektroskopii masowej (GCMS) porównywano zawartość lipopolisacharydu w lizatach oraz sonifikowanej hodowli bakteryjnej i przygotowano preparaty o takiej samej zawartości LPS. Wszystkie preparaty były podawane dootrzewnowo (i.p.) w objętości 0,2ml na
PL 195 815 B1 mysz. Myszom z grupy T4 podawano lizat bakteriofaga T4, myszom z grupy HAP1 podawano lizat bakteriofaga HAP1, myszom z grupy SON podawano sonifikat bakteryjny, natomiast myszy z grupy K (KONTROLA) otrzymywały roztwór soli fizjologicznej. Pierwsza dawka była podawana 1 godzinę przed podaniem komórek nowotworowych, a dalsze dawki 1 raz dziennie, począwszy od następnej doby po podaniu komórek, do końca doświadczenia, tj. przez 21-22 dni. Zwierzęta były obserwowane przez okres 3 tyg. Myszy uśmiercano przez przemieszczenie kręgów szyjnych i przeprowadzano dokładne oględziny poszczególnych narządów. W ocenie wzrostu nowotworu brano pod uwagę liczbę kolonii nowotworowych w płucach. Do badań histopatologicznych narządy umieszczano w 4% zbuforowanym roztworze formaliny. Do opracowań wyników używano pakietu programowego STATISTICA. Do oszacowania stopnia istotności stosowano test t-Studenta. Wyniki zgromadzono w tabeli 3 i przedstawiono na figurze 1.
Tabela 3
Liczba kolonii nowotworowych w płucach myszy po dożylnym podaniu komórek mysiego czerniaka B16 w liczbie 3x105/mysz (dzień 22)
| GRUPA | LICZBA MYSZY | LICZBA KOLONII W PŁUCACH | % ZAHAMOWANIA | ||
| Średnia ± SD | Min | Max | |||
| T4 | 6 | 20,5 ± 9,3* | 10,0 | 32,0 | 59 |
| HAP1 | 6 | 7,2 ± 8,6*@ | 0,0 | 19,0 | 86 |
| SON. | 5 | 50,0 ± 15,8 | 26,0 | 66,0 | 0 |
| KONTROLA | 6 | 50,3± 11,1 | 34,0 | 66,0 | — |
* p<0,05 - w porównaniu do kontroli - test t-Studenta dla danych niezależnych (T4: p=0,0005, HAP1: p=0,00002) @ p<0,05 - w porównaniu do T4 - test t -Studenta dla danych niezależnych (p=0,03)
Podsumowanie:
Nieoczekiwanie okazało się, że preparaty bakteriofagowe, zwłaszcza preparat zawierający fagi HAP1 o podwyższonym powinowactwie do komórek B16 pozwalają na zahamowanie powstawania i rozwoju guzów w płucach zwierząt zaszczepianych dożylnie komórkami nowotworowymi. Świadczy too wysokim potencjale terapeutycznym preparatów fagowych posiadających powinowactwo do komórek eukariotycznych wywołujących chorobę. Wykazano także, że zwiększenie tego powinowactwa potęguje aktywność leczniczą.
Claims (17)
1. Bakteriofag HAP1 zdeponowany w PCM jako F/00028.
2. Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga o powinowactwie do komórek eukariotycznych, znamienny tym, że zawiera etapy, w których: (a) kontaktuje się komórkę eukariotyczną z bakteriofagami, (b) usuwa się niezwiązane lub słabo związane bakteriofagi, (c) bakteriofaga związanego z komórką eukariotyczną namnaża się w komórce bakteryjnej uzyskując w ten sposób szczep bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że szczep bakteriofaga uzyskanego w (c) wykorzystuje się w kolejnym powtórzeniu etapów (a), (b) i (c).
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że liczba kolejnych powtórzeń jest większa niż 1, korzystnie nie mniejsza niż 7.
5. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że etap (a) obejmuje dodatkowo poddawanie bakteriofaga działaniu czynników mutagennych przed skontaktowaniem go z komórką eukariotyczną.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że komórką eukariotyczną jest komórka nowotworowa.
7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (a) inkubuje się komórki eukariotycz5 ne z roztworem zawierającym bakteriofagi w stosunku ilościowym od 1 do 105 pfu bakteriofaga na komórkę eukariotyczną.
PL 195 815 B1
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w etapie (a) inkubuje się komórki eukariotyczne z roztworem zawierającym bakteriofagi w stosunku ilościowym 1000 pfu bakteriofaga na komórkę eukariotyczną, w temperaturze 37°C przez 2 h.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w etapie (b) prowadzi się przynajmniej jedno płukanie komórek.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że w etapie (b) prowadzi się 1-10-krotne płukanie wodą lub nisko stężonym roztworem soli.
11. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (c) prowadzi się hodowlę bakteriofaga metodą płytek dwuwarstwowych.
12. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (c) otrzymaną w wyniku namnażania zawiesinę zawierającą bakteriofagi przesącza się przez sączki antybakteryjne.
13. Zastosowanie bakteriofaga do wiązania się z komórką eukariotyczną, korzystnie komórką nowotworową.
14. Zastosowanie bakteriofaga wiążącego się z komórką eukariotyczną do wytwarzania preparatu do diagnozowania i/lub leczenia, i/lub zapobiegania, i/lub powstrzymywania rozwoju choroby związanej z występowaniem tej komórki eukariotycznej.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że komórką eukariotyczną jest komórka nowotworowa.
16. Środek do diagnozowania i/lub leczenia, i/lub zapobiegania, i/lub powstrzymywania rozwoju choroby związanej z występowaniem komórki eukariotycznej, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera bakteriofaga wiążącego się z tą komórką eukariotyczną.
17. Środek według zastrz. 16, znamienny tym, że komórką eukariotyczną jest komórka nowotworowa.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL355355A PL195815B1 (pl) | 2002-08-05 | 2002-08-05 | Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, środki go zawierające i zastosowania bakteriofagów |
| AU2003272158A AU2003272158A1 (en) | 2002-08-05 | 2003-08-05 | A method of obtaining a bacteriophage strain of increased affinity to eukaryotic cells, preparations containing it, and applications of bacteriophages |
| PCT/PL2003/000075 WO2004013317A1 (en) | 2002-08-05 | 2003-08-05 | A method of obtaining a bacteriophage strain of increased affinity to eukaryotic cells, preparations containing it, and applications of bacteriophages |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL355355A PL195815B1 (pl) | 2002-08-05 | 2002-08-05 | Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, środki go zawierające i zastosowania bakteriofagów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL355355A1 PL355355A1 (pl) | 2004-02-09 |
| PL195815B1 true PL195815B1 (pl) | 2007-10-31 |
Family
ID=31492971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL355355A PL195815B1 (pl) | 2002-08-05 | 2002-08-05 | Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, środki go zawierające i zastosowania bakteriofagów |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU2003272158A1 (pl) |
| PL (1) | PL195815B1 (pl) |
| WO (1) | WO2004013317A1 (pl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1618886A1 (en) * | 2004-07-20 | 2006-01-25 | Fonds zur Förderung der Forschung auf dem Gebiet der molekularen Virologie und Gentherapie | Bacteriophage and prophage proteins in cancer gene therapy |
| WO2006066224A2 (en) * | 2004-12-14 | 2006-06-22 | Yale University | Virulence targeted antibiotics |
| PL212286B1 (pl) | 2010-06-20 | 2012-09-28 | Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Pan | Sposób otrzymywania bakteriofagów |
| PL232951B1 (pl) | 2013-06-03 | 2019-08-30 | Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Im Ludwika Hirszfelda Polskiej Akademii Nauk | Zastosowanie bakteriofaga T4 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5736388A (en) * | 1994-12-30 | 1998-04-07 | Chada; Sunil | Bacteriophage-mediated gene transfer systems capable of transfecting eukaryotic cells |
-
2002
- 2002-08-05 PL PL355355A patent/PL195815B1/pl not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-08-05 WO PCT/PL2003/000075 patent/WO2004013317A1/en not_active Ceased
- 2003-08-05 AU AU2003272158A patent/AU2003272158A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2003272158A1 (en) | 2004-02-23 |
| PL355355A1 (pl) | 2004-02-09 |
| WO2004013317A1 (en) | 2004-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114761012B (zh) | 组合疗法 | |
| Ortiz | Extracellular vesicles in cancer progression | |
| KR101765575B1 (ko) | 알데히드 억제제 및 비구아나이드 계열 화합물을 포함하는 암 줄기세포의 성장 억제용 약학적 조성물 | |
| JP2001247459A (ja) | 癌の組み合わせ療法 | |
| JP2023533485A (ja) | 重症型の肺高血圧症の治療方法 | |
| CZ20023228A3 (cs) | Farmaceutické prostředky k vyvolání účinku poąkozujícího cévy | |
| CN112566628A (zh) | 预防和治疗癌症的药物组合物，包括棉酚、苯乙双胍和抗癌剂 | |
| CN105147683B (zh) | 用于肾脏细胞癌的治疗的3,3＇,4，4＇-四羟基-2,2＇-联吡啶-n,n＇-二氧化物 | |
| CN103930113B (zh) | 用于预防和治疗非小细胞肺癌的包含吡嗪并三嗪衍生物的组合物 | |
| PL195815B1 (pl) | Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, środki go zawierające i zastosowania bakteriofagów | |
| CN108670969A (zh) | 一种治疗骨髓造血功能障碍的药物 | |
| Fowler et al. | Targeting the canonical nuclear factor-κB pathway with a high-potency IKK2 inhibitor improves outcomes in a mouse model of idiopathic pneumonia syndrome | |
| EP3572080B1 (en) | Composition for inhibiting cancer metastasis and treating cancer | |
| RU2269359C2 (ru) | Способ профилактики развития онкологических заболеваний или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутации генов соматических клеток (варианты) | |
| Hellmann et al. | Radiotherapeutic enhancement by razoxane | |
| CN114949000B (zh) | 麝香提取物及其增强car-t细胞疗效的应用 | |
| AU2004296129A1 (en) | CHP-gemcitabin combined agent and use thereof as anti-tumoural active substances | |
| JP2002540172A (ja) | 腫瘍治療の増強のためのスフィンゴミエリン含有調製物 | |
| South-East European Oncology Group (SEEOG) et al. | Phase II study of 4′-epi-doxorubicin in patients with untreated, extensive small cell lung cancer | |
| JP2021107447A (ja) | 移植片拒絶反応の処置方法 | |
| CN114522184A (zh) | 工程细菌的细胞裂解液及其在肿瘤治疗中的应用 | |
| JP2842888B2 (ja) | リボヌクレアーゼインヒビターを有効成分とする癌細胞転移抑制剤 | |
| EP1220687B1 (en) | Administration of gamma globulins to treat lymphoma | |
| JP7598660B2 (ja) | フラジェリン由来のｔｌｒ５アゴニストを有効成分として含む抗がん剤組成物 | |
| CN114222753B (zh) | 一种预防和/或治疗神经母细胞瘤的多肽药物及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20130805 |