PL183855B1

PL183855B1 - Białko, cząsteczka cDNA, oligonukleotyd, kompozycja farmaceutyczna i środek farmaceutyczny do hamowania krzepnięcia krwi

Info

Publication number: PL183855B1
Application number: PL95319782A
Authority: PL
Inventors: George P. Vlasuk; Patrick E.H. Stanssens; Joris H.L. Messens; Marc J. Lauwereys; Yves R. Laroche; Laurent S. Jespers; Yannick G.J. Gansemans; Matthew Moyle; Peter W. Bergum
Original assignee: Corvas International
Priority date: 1994-10-18
Filing date: 1995-10-17
Publication date: 2002-07-31
Also published as: JP3811186B2; US6090916A; DE69535317D1; US6121435A; AU711405B2; WO1996012021A3; US20050191724A1; US20060246547A1; HUT77431A; EP1772516A1; JPH10507361A; JP2006117675A; EP0788546B9; EP0788546A1; US6046318A; DK0788546T3; US6872808B1; AU4130796A; US6087487A; NZ296648A

Abstract

1. Wyizolowane bialko posiadajace aktywnosc przeciwkrzepliwa i posiadajace jedna lub wiecej domen NAP, przy czym kazda domena NAP posiada sekwencje aminokwasowa zasadniczo taka sama jak sekwencja: Cys-A1 -Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, przy czym Al, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 posiadaja sekwencje aminokwasowa wybrana sposród sekwencji okre- slonych dla A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 przedstawionych na figurze 16. 29. Wyizolowana zrekombinowana czasteczka cDNA, znamienna tym, ze koduje bialko posiadajace jedna lub wiecej domen NAP, przy czym kazda domena NAP posiada sekwencje aminokwasowa zasadniczo taka sama jak sekwencja: Cys-A1 -Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, przy czym A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 posiadaja sekwencja aminokwasowa wybrana sposród sekwencji okre- slonych dla Al, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 przedstawionych na figurze 16. 48. Oligonukleotyd, znamienny tym, ze obejmuje sekwencje nukleotydowa wybrana z YG109: TCAGACATGT- ATAATCTCAT-GTTGG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 88], i YG103: AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 89], 50. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze zawiera bialko w ilosci dajacej stezenie od 1 do 10000 nM i farmaceu- tycznie dopuszczalny nosnik, przy czym wspomnianym bialkiem jest wyizolowane bialko posiadajace aktywnosc przeciwkrzepliwa i posiadajace jedna lub wiecej domen NAP, przy czym kazda domena NAP posiada sekwencje aminokwasowa zasadniczo taka sama jak sekwencja: Cys-A1 -Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, przy czym A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 posiadaja sekwencja aminokwasowa wybrana sposród sekwencji okre- slonych dla A1 , A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 przedstawionych na figurze 16. 78. Srodek farmaceutyczny do hamowania krzepniecia krwi zawierajacy czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienny tym, ze jako czynnik aktywny zawiera wyizolowane bialko posiadajace aktywnosc przeciwkrzepliwa i posiadajace jedna lub wiecej domen NAP, przy czym kazda domena NAP posiada sekwencje aminokwasowa zasadniczo taka sama jak sekwencja: Cys-A1 -Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-tys-A8-Cys-A9-Cys-A10, przy czym A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 posiadaja sekwencja aminokwasowa wybrana sposród sekwencji okreslo- nych dla A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 przedstawionych na figurze 16, w ilosci dajacej stezenie od 1 nM do 10000 nM. PL PL PL

Description

Odnośnik do zgłoszeń pokrewnych

Zgłoszenie to jest kontynuacją w części opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach kolejnych 08/461 964, 08/465 380, 08/486 397 i 08/486 399, które złożono 4 czerwca 1995, i z których każdy jest kontynuacją w części opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/326 110, złożonego 18 października 1995; ujawnienia wszystkich tych zgłoszeń włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

Niniejszy wynalazek dotyczy specyficznych białek, jck również zrekombinowanych wersji tych białek, będących inhibitorami proteaz seiynowych, włącznie z silnymi czynnikami przeciwkrzepliwymi w osoczu ludzkim. Białka te obejmują pewne białka ekstrahowane z nicieni. W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji zawierających te białka, które są użyteczne jcko silne i specyficzne inhibitory enzymów krzepnięcia krwi in vitro i in vivo, oraz metod ich stosowania jako czynników diagnostycznych in vitro lub czynników terapeutycznych in vivo do zapobiegania krzepnięciu krwi. W dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy kodujących białka sekwencji kwasów nukleinowych, włącznie z mRNA i DNA oraz ich stosowania w wektorach do transfekcji lub transformacji komórek gospodarza oraz jako sond do izolowania pewnych zbliżonych genów innych gatunków i organizmów.

Podstawa i wprowadzenie do wynalazku

Normalna hemostaza jest wynikiem delikatnej równowagi pomiędzy procesami tworzenia skrzepu (krzepnięcia krwi) i rozpuszczania skrzepu (fibrynolizy). Złożone oddziaływania pomiędzy komórkami krwi, specyficznymi białkami osocza i powierzchnią naczyń utrzymują płynność krwi, o ile nie wystąpi uszkodzenie. Uszkodzenie bariery śródbłonkowej wyścielającej ścianę naczynia wystawia znajdująca się pod nią tkankę na działanie tych składników krwi. To z kolei wyzwala serię reakcji biochemicznych zmieniających równowagę hemostatyczną na korzyść krzepnięcia krwi, czego wynikiem może być albo pożądane tworzenie hemostatycznego czopu powstrzymującego utratę krwi, albo niepożądane tworzenie zamykającego wewnątrznaczyniowego zakrzepu prowadzącego do obniżenia lub całkowitej utraty przepływu krwi do dotkniętego organu.

Odpowiedź krzepnięcia krwi jest łącznym wynikiem szeregu kolejno wzmacnianych reakcji, w których kilka specyficznych zymogenów proteaz serynowych w osoczu aktywowanych jest przez ograniczoną proteolizę. W wyniku tego szeregu reakcji zachodzi tworzenie nierozpuszczalnej matriks, złożonej z fibryny i składników komórkowych, która jest wymagana do stabilizacji pierwotnego hemostatycznego czopu lub zakrzepu. Inicjacja i rozszerzanie się reakcji aktywacji proteolitycznej zachodzi poprzez serię kolejno wzmacnianych szlaków, które zlokalizowane są przy powierzchniach błonowych w miejscu uszkodzenia naczynia krwionośnego (Mann, K.G., Nesheim, M.E., Church, W.R., Haley, P. i Krishnaswamy,

S. (1990) Blood. 78: 1-16 oraz Lawson, J.H., Kalafctis, M., Stram, S. i Mann, K.G. (1994) J. Biol. Chem. 269: 23347-23366).

183 855

Inicjacja odpowiedzi krzepnięcia krwi na uszkodzenie naczynia następuje w wyniku tworzenia kompleksu katalitycznego, złożonego z będącego proteazą. serynową czynnika VIla i nieenzymatycznego kofaktora, czynnika tkankowego (TF) (Rappaport, S.I. i Rao, L.V.M. (1992) Arteriosclerosis and Thrombosis 12: 1112-1121). Odpowiedź wydaje się być regulowana wyłącznie przez ekspozycję subśródbłonkowego TF na śladowe poziomy czynnika VIIa i będącego jego zymogenem czynnika VII w krążeniu w następstwie ogniskowego przerwania integralności naczynia krwionośnego. Autoaktywacja prowadzi do zwiększenia ilości kompleksów czynnik VIIa/TF, które są odpowiedzialne za tworzenie będącego proteazą serynową czynnika Xa. Uważa się, że poza kompleksem czynnik VIIa/TF, niewielka ilość tworzonego czynnika Xa pobudza odpowiedź krzepnięcia poprzez proteolityczną modyfikację czynnika IX do czynnika IX_al6, który z kolei przekształcany jest w będący aktywną proteazą serynową czynnik LKa^, przez kompleks czynnik VIIa/TF (Mann, K.G., Krishnaswamy, S. i Lawson, J.H. (1992) Sem. Hematology 29: 213-226). To czynnik LKa,,^ w kompleksie z zaktywowanym czynnikiem Villa wydaje się być odpowiedzialny za wytwarzanie znaczących ilości czynnika Xa, który następnie katalizuje przedostatni etap kaskady krzepnięcia krwi: tworzenie proteazy serynowej trombiny.

Czynnik Xa katalizuje tworzenie trombiny w następstwie tworzenia, w większości przypadków na powierzchni zaktywowanych płytek krwi, które przylegają w miejscu uszkodzenia, kompleksu protrombinazy, składającego się z czynnika Xa, nieenzymatycznego kofaktora Va i substratu protrombiny (czynnika II) (Fuster, V., Badimon, L., Badimon, J.J. i Chesebro, J.H. (1992) New Engl. J. Med. 326: 310-318). W układzie naczyń tętniczych, wynikiem wzmocnionego wybuchu wytwarzania trombiny, katalizowanego przez protrombinazę, jest występowanie miejscowo wysokiego poziomu tej proteazy, co jest odpowiedzialne za tworzenie fibryny i dalszą mobilizację dodatkowych płytek krwi, jak również kowalencyjną stabilizację skrzepu poprzez aktywację zymogenu transglutaminazy będącej czynnikiem XIII. Ponadto, odpowiedź krzepnięcia jest dalej potęgowana poprzez zależną od trombiny aktywację proteolityczną na zasadzie sprzężenia zwrotnego nieenzymatycznych kofaktorów V i VIII, co prowadzi do dalszego tworzenia protrombinzy i dalszego wytwarzania trombiny (Hemker, H.C i Kessels, H. (1991) Haemostasis 21: 189-196).

Wykazano, że substancje zakłócające proces krzepnięcia krwi (czynniki przeciwkrzepliwe) są ważnymi czynnikami terapeutycznymi w leczeniu i zapobieganiu chorób zakrzepowych (Kessier, C.M. (1991) Chest 99: 97S-112S oraz Cairns, J.A., Hirsh, J., Lewis, H.D., Resnekov, L. i Theroux, P. (1992) Chest 102: 456S-481S). Obecnie zatwierdzone klinicznie czynniki przeciwkrzepliwe powodują liczne wpływy uboczne wynikające ze stosunkowo niespecyficznego charakteru ich wpływu na kaskadę krzepnięcia krwi (Levine, M.N., Hirsh, J., Landefeld, S. i Raskob, G. (1992) Chest 102: 352S-363S). Doprowadziło to do pobudzenia poszukiwań bardziej skutecznych czynników przeciwkrzepliwych, które skuteczniej mogą kontrolować aktywność kaskady krzepnięcia przez selektywne zakłócanie specyficznych reakcji tego procesu, co może mieć pozytywny wpływ na zmniejszanie komplikacji terapii przeciwkrzepliwej (Weitz, J. i Hirsh, J. (1993) J. Lab. Clin. Med. 122: 364-373). W innym aspekcie, badania te zogniskowały się na normalnych białkach ludzkich, które służą jako endogenne czynniki przeciwkrzepliwe podczas kontrolowania aktywności kaskady krzepnięcia krwi. Ponadto, badano różne organizmy krwiożeme z powodu Ich zdolności do wydajnego zapobiegania krzepnięciu spożywanej przez nie krwi, podczas i po pożywianiu się na swoich żywicielach, co sugeruje, że wyewoluowały u nich skuteczne strategie przeciwkrzepliwe, które mogą być użyteczne jako czynniki terapeutyczne.

Białko osocza, inhibitor szlaku czynnika tkankowego (TFPI) zawiera trzy kolejne domeny Kunitza i podawano, że bezpośrednio hamuje aktywność enzymatyczną czynnika Xa oraz w sposób zależny od czynnika Xa hamuje aktywność enzymatyczną kompleksu czynnik VIIa-czynnik tkankowy. Sawensen, G. i Pizzo, S.V., Proteinase Inhibitors: α-Macroglobulins, Serpins and Kunis, Hemostasis and Thrombosis, wyd. 3, str. 251-253, J.B. Lippincott Company (red. W.W. Colman i in., 1994). Podano sekwencję cDNA kodującego TFPI, masę cząsteczkową sklonowanego białka określono na 31 950 daltonów i podano, że zawiera ono 276 aminokwasów. Broze, G.J. i Girad, T.J., opis patentowy Stanów Zjednoczonych

183 855

Ameryki numer 5 106 833, kol. 1, (1992). Donoszono o różnych zrekombinowanych białkach pochodzących od TFPI. Girad, TJ. i Broze, G.J., europejski opis patentowy numer EP 439 442 (1991); Rasmussen, J.S. i Nordfand, OJ., światowy opis patentowy numer WO 91/02753 (1991); i Broze, G.J. i Girad, T. J., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 106 833, kol. 1(1992).

Donoszono, że antystazyna, białko złożone ze 119 aminokwasów i występujące w gruczole ślinowym pijawki meksykańskiej, Haementeria officinalis, hamuje aktywność enzymatyczną czynnika Xa. Tuszyński i in., J. Biol. Chem., 262: 9718 (1987); Nutt i in., J. Biol. Chem., 263: 10162 (1988). Donoszono, że zrekombinowane białko o masie cząsteczkowej 6 000 daltonów, zawierające 58 aminokwasów o wysokim stopniu homologii do aminokońcowych, od 1 do 58, aminokwasów antystazyny, hamuje aktywność czynnika Xa. Tung, J. i in., europejski opis patentowy numer 454 372 (30 października 1991); Tung, J. i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 189 019 (23 lutego 1993).

Donoszono, że kleszczowy peptyd przeciwkrzepliwy (TAP), białko składające się z 60 aminokwasów i wyizolowane z kleszcza Omithodoros moubata, hamuje aktywność enzymatyczną czynnika Xa, ale nie czynnika VHa. Waxman, L. i in., Science, 248: 593 (1990). Opisywano TAP przygotowany metodami rekombinacyjnymi. Vlausk, G.P. i in., europejski opis patentowy numer 419 099 (1991) i Vlausk, G.P. i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 239 058 (1993).

Donoszono, że psi tęgoryjec dwunastnicy, Ancylostoma caninum, który zaraża również ludzi, zawiera silną substancję przeciwkrzepliwą, która hamowała krzepnięcie krwi in vitro. Loeb, L. i Smith, A.J., Proc. Pathol. Soc. Philadelphia, 7: 173-187 (1904). Opisywano, że ekstrakty A. caninum wydłużają czas protrombinowy i częściowy czas tromboplastynowy w osoczu ludzkim, przy czym wpływ przeciwkrzepliwy przypisywano hamowaniu czynnika Xa, ale nie trombiny. Spellman, Jr., J.J. i Nossel, H.L., Am. J. Physiol., 220: 922-927 (1971). Ostatnio donoszono, że ekstrakty rozpuszczalnych białek A. canium wydłużają czas protrombinowy i częściowy czas tromboplastynowy w osoczu ludzkim in vitro. Przeciwkrzepliwy wpływ przypisywano hamowaniu ludzkiego czynnika Xa, ale nie trombiny, Cappello, M. i in., J. Infect. Diseases, 167: 1474-1477 (1993), oraz hamowaniu czynnika Xa i czynnika Vila (światowy opis patentowy numer W094/25000; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 427 937).

Podawano, że również ludzki tęgoryjec dwunastnicy, Ancylostoma ceylanicum zawiera czynnik przeciwkrzepliwy. Opisywano, że ekstrakty A. ceylanicum wydłużają czas protrombinowy i częściowy czas tromboplastynowy w osoczu psa i człowieka in vitro. Carroll, S.M. i in., Thromb. Haemostas. (Stuttgart), 51: 222-227 (1984).

Donoszono, że rozpuszczalne ekstrakty pasożyta niekrwiożemego, Ascaris suum, zawierają czynnik przeciwkrzepliwy. Podawano, że ekstrakty te wydłużają krzepnięcie pełnej krwi, jak również krzepnięcie w teście częściowego czasu tromboplastynowego z aktywacją kaolinem, ale nie w teście czasu protrombinowego. Crawford, G.P.M. i in., J. Parasitol., 68: 1044-1047 (1982). Opisywano, że wyizolowane z Ascaris suum inhibitor chymotrypsyny/elestazy 1 i jego główne izoformy, inhibitor trypsyny 1 oraz inhibitor chymotrypsyny/elastazy 4, są inhibitorami proteaz serynowych i wykazują wspólny układ pięciu mostków dwusiarczkowych. Bernard, V.D. i Peanasky, R.J., Arch. Biochem. Biophys., 303: 367-376 (1993); Huang, K. i in., Structure, 2: 679-689 (1994); i Grasberger, B.L. i in., Structure, 2: 669-678 (1994). Brak jest wskazań, że opisywane inhibitory proteaz serynowych posiadają aktywność przeciwkrzepliwą.

Donoszono, że wydzieliny tęgoryjca dwunastnicy Necator americanus wydłużają czas krzepnięcia surowicy ludzkiej, hamują amidohtyczną aktywność ludzkiego FXa przy zastosowaniu fluorogennego substratu, hamują indukowane wieloma agonistami uwalnianie ziarnistości gęstych z płytek krwi i degradują fibrynogen. Pritchard, D.I. i B. Furmidge, Thromb. Haemost. 73: 546 (1995) (światowy opis patentowy numer WO95/12615).

Podsumowanie wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanych białek posiadających aktywność hamowania proteaz serynowych i/lub aktywność przeciwkrzepliwą oraz obejmujących co najmniej jednaądomenę NAP. Białka te określamy jako ekstrahowane z nicieni białka przeciwkrzepliwe

183 855 lub NAP. Domena NAP odnosi się do sekwencji wyizolowanego białka, lub NAP, uważanej za posiadającą aktywność hamującą, jak dalej zdefiniowano w niniejszym opisie poniżej. Aktywność przeciwkrzepliwą tych białek można oceniać na podstawie aktywności wydłużania czasu krzepnięcia osocza ludzkiego w oznaczeniach czasu protrombinowego (PT) i częściowego czasu aktywowanej tromboplastyny (aPTT), jak również ich zdolności do hamowania enzymów układu krzepnięcia krwi, czynnika Xa i czynnika VIIa/TF. Uważa się, że zaobserwowaną aktywność przeciwkrzepliwą tych białek odpowiedzialna jest domena NAP. Niektóre z tych białek posiadaaą co najmniej jedną domenę NAP, która jest sekwencją, aminokwasową obejmującą mniej niż około 120 reszt aminokwasowych i zawiera 10 reszt aminokwasowych cysteiny.

W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy metody preparowania i izolowania cząsteczki cDNA kodującej białko wykazujące aktywność przeciwkrzepliwą i posiadające domenę NAP oraz przygotowania tą metodą zrekombinowanej cząsteczki cDNA. Metoda ta obejmuje etapy (a) konstruowania biblioteki cDNA z gatunku nicienia; (b) ligacji rzeczonej biblioteki w odpowiednim wektorze klonującym; (c) wprowadzania rzeczonego wektora klonującego, zawierającego rzeczoną bibliotekę do odpowiedniej komórki gospodarza; (d) zetknięcia cząsteczek cDNA rzeczonej komórki gospodarza z roztworem zawierającym sondę hybrydyzacyjną posiadającą następującą sekwencję kwasu nukleinowego: AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 94), w której R jest A lub G, Y jest T lub C, a i jest inozyną; (e) wykrywania zrekombinowanej cząsteczki cDNA, która hybrydyzuje z rzeczoną sondą; i (f) izolowania rzeczonej zrekombinowanej cząsteczki cDNA.

W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy metody przygotowywania kodowanego przez rzeczony cDNA zrekombinowanego białka, które posiada aktywność przeciwkrzepliwą i które zawiera domenę NAP, oraz przygotowywania tą. metodą zrekombinowanych białek. Metoda ta obejmuje etapy (a) konstruowania biblioteki cDNA z gatunku nicienia; (b) ligacji rzeczonej biblioteki w odpowiednim wektorze klonującym; (c) wprowadzania rzeczonego wektora klonującego, zawierającego rzeczoną bibliotekę do odpowiedniej komórki gospodarza; (d) zetknięcia cząsteczek cDNA rzeczonej komórki gospodarza z roztworem zawierającym sondę hybrydyzacyjną posiadającą następującą sekwencję kwasu nukleinowego: AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG, w której R jest A lub G, Y jest T lub C, a i jest inozyną (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 94); (e) wykrywania zrekombinowanej cząsteczki cDNA, która hybrydyzuje z rzeczoną sondą; (f) izolowania rzeczonej zrekombinowanej cząsteczki cDNA; (g) ligacji sekwencji kwasu nukleinowego rzeczonej cząsteczki cDNA, która koduje rzeczone zrekombinowane białko, w odpowiednim ekspresyjnym wektorze klonującym; (h) transformacji drugiej komórki gospodarza rzeczonym ekspresyjnym wektorem klonującym zawierającym rzeczoną sekwencję kwasu nukleinowego rzeczonej cząsteczki cDNA, która koduje rzeczone zrekombinowane białko; (i) hodowli stransformowanej drugiej komórki gospodarza oraz (j) izolowania rzeczonego zrekombinowanego białka, które ulega ekspresji w rzeczonej drugiej komórce gospodarza. Należy zwrócić uwagę, że opisując wytwarzanie zrekombinowanych białek w pewnych układach ekspresyjnych, takich jak komórki COS, zamiast (a niekiedy wymiennie) terminu transformacja powszechnie używa się terminu transfekcja.

W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy metody przygotowywania zrekombinowanego cDNA kodującego zrekombinowane białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą i posiadające domenę NAP, obejmującej etapy:

(a) izolowania biblioteki cDNA z nicienia;

(b) ligacji rzeczonej biblioteki w wektorze klonującym;

(c) wprowadzania rzeczonego wektora klonującego, zawierającego rzeczoną bibliotekę cDNA do komórki gospodarza;

(d) zetknięcia cząsteczek cDNA rzeczonych komórek gospodarza z roztworem zawierającym pierwszą i drugą sondę, gdzie rzeczona pierwsza sonda hybrydyzacyjna posiada następującą sekwencję kwasu nukleinowego: AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GAC TGT GGA ACT CAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AAT GAG GAA CCC CCT GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGC TCA CGT

183 855

GGT TGT TTA TTA CCT CCT GCT TGC GTA TGC AAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AGG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA (sekwencja o ' numerze identyfikacyjnym: 1), a rzeczona druga sonda hybrydyzacyjna posiada następującą sekwencję kwasu nukleinowego: AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GTC TGT GGA ACT AAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AGT GAG GAA GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGA TCA TTT TCT TGT CCG GGT CCC GCT GCT TGC GTA TGC GAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AAG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2);

(e) wykrywania zrekombinowanej cząsteczki cDNA, która hybrydyzuje z rzeczoną mieszaniną rzeczonych sond oraz (f) izolowania rzeczonej zrekombinowanej cząsteczki cDNA.

W jeszcze innym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy metody przygotowywania zrekombinowanego cDNA kodującego białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, i kodującego domenę NAP, obejmującej etapy: (a) izolowania biblioteki cDNA z nicienia; (b) ligacji rzeczonej biblioteki cDNA w odpowiednim fagemidowym ekspresyjnym wektorze klonującym; (c) transformacji komórek gospodarza rzeczonym wektorem zawierającym rzeczoną bibliotekę cDNA; (d) hodowli rzeczonych komórek gospodarza; (s) infekowania rzeczonych komórek gospodarza fagiem wspomagającym; (f) wydzielania faga zawierającego rzeczoną bibliotekę cDNA z rzeczonych komórek gospodarza; (g) połączenia roztworu rzeczonego faga zawierającego rzeczoną bibliotekę cDNA z roztworem biotynylowanego ludzkiego czynnika Xa; (h) zetknięcia opłaszczonej streptawidyną fazy stałej z rzeczonym roztworem zawierającym rzeczone fagi zawierające rzeczoną bibliotekę cDNA i rzeczony biotynylowany ludzki czynnika Xa; (i) izolowania fagów, które wiążą się z rzeczoną opłaszczoną streptawidyną fazą stałą oraz (j) izolowania zrekombinowanej cząsteczki cDNA z fagów, które wiążą się z rzeczoną opłaszczoną streptawidyną fazą stałą.

W jednym korzystnym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy zrekombinowanego cDNA posiadającego sekwencję kwasu nukleinowego wybrana spośród sekwencji kwasów nukleinowych przedstawionych na figurze 1, figurze 3, figurach od 7A do 7F, figurze 9, figurach od 13A do 13H oraz figurze 14.

Niniejszy wynalazek dotyczy również NAP, które hamują aktywność katalityczną FXa, NAP, które hamują aktywność katalityczną kompleksu FVIIc/tF oraz NAP, które hamują aktywność katalityczną proteazy serynowej, jak również kwasów nukleinowych kodujących takie NAP i metod ich stosowania.

Definicje

Termin aminokwas odnosi się do naturalnych L-aminokwasów; obejmuje on Daminokwasy, pod warunkiem, że białka zawierające takie D-aminokwasy zachowują aktywność biologiczną. Naturalne L-aminokwasy obejmują alaninę (Ala), argininę (Arg), asparaginę (Asn), kwas asparaginowy (Asp), cysteinę (Cys), glutaminę (Gin), kwas glutaminowy (Glu), glicynę (Gly), histydynę (His), izoleucynę (Ile), leucynę (Leu), lizynę (Lys), metioninę (Met), fenyloalaninę (Phe), prolinę (Pro), serynę (Ser), treoninę (Thr), tryptofan (Trp), tyrozynę (Tyr) i walinę (Val).

Termin reszta aminokwasowi' odnosi się do rodników posiadających strukturę: (1) -NHCH(R)C(=O)-, w której R jest grupą łańcucha bocznego L-aminokwasu przy atomie węgla alfa,

N_nZ^C(=o)— z wyjątkiem L-proliny; lub (2) I dla L-proliny.

Termin peptyd odnosi się do sekwencji aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi pomiędzy ich grupami alfa-aminowymi i karboksylowymi. Takie sekwencje, jak podano w niniejszym opisie przedstawia się w kierunku od końca aminowego po lewej stronie do końca karboksylowego po prawej.

Termin białko odnosi się do cząsteczki składającej się z jednego lub więcej peptydów. Termin cDNA odnosi się do komplementarnego DNA.

183 855

Termin kwas nukleinowy odnosi się do polimeru, w którym zasady (np. puryny lub pirymidyny) połączone są ze szkieletem cukrowofosforanowym. Kwasy nukleinowe obejmują DNAiRNA.

Termin sekwencja kwasu nukleinowego odnosi się do sekwencji nukleozydów tworzących kwas nukleinowy. Takie sekwencje jak przedstawione w niniejszym opisie podane są w kierunku od 5' do 3', od lewej do prawej strony.

Termin cząsteczka zrekombinowanego DNA odnosi się do cząsteczki DNA utworzonej przez połączenie razem kawałków DNA, które normalnie nie sąsiadują ze sobą.

Termin mRNA odnosi się do matrycowego kwasu rybo-nukleinowego.

Termin homologia odnosi się do stopnia podobieństwa sekwencji DNA lub peptydów.

Terminy czynnik Xa lub fXa lub FXa' są synonimami i powszechnie wiadomo, że oznaczają proteazę serynową enzymatycznej kaskady krzepnięcia krwi, która działa jako część kompleksu protrombinazy wytwarzającego enzym trombinę.

Zwrot aktywność hamująca czynnik Xa oznacza aktywność, która hamuje aktywność katalityczną fXa wobec jego substratu.

Zwrot specyficzna aktywność hamująca czynnik Xa oznacza aktywność hamującą, która jest specyficzna wobec czynnika Xa w porównaniu z innymi zbliżonymi enzymami, takimi jak inne proteazy serynowe.

Zwrot inhibitor czynnika Xa oznacza związek wykazujący aktywność hamującą czynnik Xa.

Terminy czynnik VH3/czynnik tkankowy lub fVIIa/TF lub FVIIa/TF są synonimami i powszechnie wiadomo, że oznaczają aktywny katalitycznie kompleks proteazy serynowej, czynnika krzepnięcia krwi VTIa (fVIIa), i białka nieenzymatycznego, czynnika tkankowego (TF), który to kompleks tworzy się na powierzchni błony fosfolipidowej o określonym składzie.

Zwrot aktywność hamująca fVIIa/TF oznacza aktywność, która hamuje aktywność katalityczną kompleksu fVniOTF w obecności fXa lub katalitycznie nieaktywnej pochodnej fXa.

Zwrot specyficzna aktywność hamująca fVIIa-'TF oznacza aktywność hamującą fVIIa/TF, która jest specyficzna wobec fVHa/TF w porównaniu z innymi zbliżonymi enzymami, takimi jak inne proteazy serynowe, włącznie z FVTIa i fXa.

Zwrot inhibitor fVIIa/TF oznacza związek posiadający aktywność hamującą fVIIa/TF w obecności fXa lub katalitycznie nieaktywnych pochodnych fXa.

Zwrot proteaza serynową oznacza, jak powszechnie wiadomo, enzym zawierający trójkę aminokwasów histydynę, kwas asparaginowy i serynę, który katalitycznie rozszczepia wiązanie amidowe, przy czym reszta seryny trójki bierze udział w kowalencyjny sposób w rozszczepieniu katalitycznym. Proteazy serynowe czyni się nieaktywnymi katalitycznie przez kowalencyjną modyfikację reszty seryny w trójce katalitycznej przez diizopropylofluorofosforan (DFP).

Zwrot aktywność hamująca proteazę serynową oznacza aktywność, która hamuje aktywność katalityczną proteazy serynowej.

Zwrot specyficzna aktywność proteazy serynowej oznacza aktywność hamującą, która jest specyficzna wobec proteazy serynowej w porównaniu z innymi proteazami serynowymi.

Zwrot inhibitor proteazy serynowej oznacza związek posiadający aktywność hamującą proteazę serynową.

Termin protrombinaza, jak powszechnie wiadomo, oznacza aktywny katalitycznie kompleks proteazy serynowej, czynnika krzepnięcia krwi Xa (fXa), z białkiem nieenzymatycznym, czynnikiem Va (fVa), który to kompleks tworzy się na powierzchni błony fosfolipidowej o określonym składzie.

Zwrot aktywność przeciwkrzepliwa oznacza aktywność, która hamuje krzepnięcie krwi, co obejmuje również krzepnięcie osocza.

Terminy specyficzny, specyficzność i ich pochodne, gdy odnoszą się do aktywności NAP wobec pewnego enzymu, oznaczają, że NAP hamuje wymieniony enzym z siłą co najmniej 10-krotnie wyższą niż hamuje inne, zbliżone enzymy. A zatem, aktywność NAP jest specyficzna wobec wymienionego enzymu.

183 855

Termin zasadniczo taki sam, gdy odnosi się do białek, sekwencji aminokwasowych, cDNA, sekwencji nukleotydowych i podobnych, dotyczy białek, cDNA lub sekwencji posiadających co najmniej 90% homologii z innym białkiem, cDNA lub sekwencją.

Termin NAP lub białko NAP oznacza wyizolowane białko, które zawiera co najmniej jedna domenę, i posiada aktywność hamującą proteazę serynową i/lub aktywność przeciwerzepliwą.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia sekwencję nukleotydową cDNA AccNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3]. Numeracja zaczyna się od pierwszego nukleotydu cDNA. Translacja rozpoczyna się od pierwszego kodonu ATG (pozycja 14); drugi kodon ATG w tej samej ramce odczytu występuje w pozycji 20.

Figura 2 przedstawia sekwencję aminokwasową dojrzałego AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4].

Figura 3 przedstawia sekwencję nukleotydową cDNA AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4]. Numeracja zaczyna się od pierwszego nukleotydu cDNA. Translacja rozpoczyna się od pierwszego kodonu ATG (pozycja 14); drugi kodon ATG w tej samej ramce odczytu występuje w pozycji 20.

Figura 4 przedstawia sekwencję aminokwasową dojrzałego AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6]. Aminokwasy, które różnią się od aminokwasów w AccNAP4 podkreślono. Poza tymi podstawieniami aminokwasowymi, AcaNAP6 w porównaniu z AcaNAP4 zawiera dwie delecje aminokwasowe (Pro-Pro).

Figura 5 przedstawia sekwencję aminokwcso^ją Pro-AccNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7],

Figura 6 przedstawia sekwencję aminokwasową Pro-AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8]. Aminokwasy, które różnią się od aminokwasów w Pro-AcaNAP6 podkreślono. Poza tymi podstawieniami aminokwasowymi, Pro-AcaNAP6 w porównaniu z ProAcaNAP4 zawiera dwie delecje aminokwasowi (Pro-Pro).

Figury od 7A do 7F przedstawiają sekwencje nukleotydowe cDNA i przewidywane sekwencje cminokwasowe niektórych białek NAP wyizolowanych z Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale i Heligmosomoides polygyrus. figura 7A przedstawia sekwencje zrekombinowcnej cząsteczki cDNA AceNAP4 wyizolowanej z Ancylostoma ceylanicum [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9]. figura 7B przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AcsNAP5 wyizolowanej z Ancylostoma ceylanicum [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10]. figura 7C przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AceNAP7 wyizolowanej z Ancylostoma ceylanicum [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11]. figura 7D przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AduNAP4 wyizolowanej z Ancylostoma duodenale [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12]. figura 7E przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AduNAP7 wyizolowanej z Ancylostoma duodenale [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13], figura 7F przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA HpoNAP4 wyizolowanej z Heligmosomoides polygyrus [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14]. We wszystkich przypadkach wskazano (podkreślono) miejsce EcoRI, odpowiadające końcowi 5' zrekombinowanej cząsteczki cDNA. Numeracja w każdej sekwencji zaczyna się od tego miejsca EcoRI. Każdy z AceNAP4 i AduNAP7 koduje białko, które posiada dwie domeny NAP; wszystkie inne klony na tej figurze kodują białka posiadające pojedynczą domenę NAP. Klon cDNA AduNAP4 nie jest klonem pełnej długości, tj. cząsteczka zrekombinowanego cDNA pozbawiona jest, w oparciu o porównanie z innymi izotermami, 2’-końcokej części regionu kodującego.

Figury od 8A do 8C przedstawiają sekwencję nukleotydową wektorów pDONG61 (figura 8A) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14], pDONG62 (figura 8B) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 16] i pDONG63 (figura 8C) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17]. Przedstawiony fragment HindllI-BamHI zlokalizowany jest pomiędzy miejscami HindIII i BamHI pUC119. Wektory umożliwiają sklonowanie cDNA, w postaci fragmentów Sfil-Notl, w trzech różnych ramkach odczytu za genem 6 faga nitkowatego. Wskazano wszystkie istotne miejsca restrykcyjne. Kodujący Lys tryplet AAA w pozycji 373-375 jest

183 855 ostatnim kodonem genu 6. Po białku kodowanym przez gen 6 występuje sekwencja łącznikowa Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 18].

Figura 9 przedstawia sekwencję nukleotydową cząsteczki zrekombinowanego cDNA AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19]. Wskazano (podkreślono) miejsce EcoRI odpowiadające końcowi 5' cDNA. Numeracja zaczyna się od tego miejsca EcoRI. Przedstawiono również przewidywaną sekwencję aminokwasową; translacyjną ramkę odczytu determinuje drugi składnik fuzji, gen 6. cDNA AcaNAPc2 pozbawiony jest odcinka 5'końcowej części regionu kodującego; na podstawie homologii z AcaNAP5 i AcaNAP6 przewiduje się, że pierwszych siedem reszt aminokwasowych należy do sygnału sekrecji.

Figury 10A i 10B przedstawiają porównanie wpływów niektórych białek NAP na pomiar czasu protrombinowego (PT) (figura 10A) i częściowego czasu aktywowanej tromboplastyny (aPTT) (figura 10B) normalnego cytrynianowego osocza ludzkiego. Pełne kółka (o) przedstawiają Pro-AcaNAP5; puste trójkąty (Δ) przedstawiają AcaNAP5 (AcaNAP³ w tabeli 2); a puste kółka (o) przedstawiają natywny AcaNAP5.

Figura 11 przedstawia przyporządkowanie sekwencji aminokwasowych kodowanych przez niektóre cDNA NAP wyizolowane z różnych nicieni. AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 20], AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 21] i AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 128] wyizolowano z Ancylostoma caninum. AceaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 22], AceNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 23] i AceNAP4 (AceNAPdi [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 24] oraz AceNAP4d2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 25]) wyizolowano z Ancylostoma ceylanicum. AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 26] i AduNAP7 (AduNAP7dl [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 27] oraz AduNAP7d2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 28]) wyizolowano z Ancylostoma diuodenale. HpoNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 29] wyizolowano z Heligmosomoides polygyrus. Sekwencje aminokwasowe przedstawione na tej figurze są takie, jak podano na figurach 1, 3, od 7A do 7F oraz 9. Sekwencje dojrzałego AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4] i AvaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6] (patrz figury 2 i 4) charakteryzują się, między innymi, dziesięcioma resztami cysteiny (ponumerowanymi od pierwszej do dziesiątej i przedstawionymi wytłuszczonymi literami). Wszystkie z sekwencji aminokwasowych na tej figurze zawierają co najmniej jedną domenę NAP. cDNA AceNAP4 składa się z dwóch sąsiadujących regionów, nazwanych AceNAP4dl [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 24] i AceNAP4d2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 25], które kodują pierwszą (dl) i drugą (d2) domenę NAP; podobnie, cDNA AduNAP7 zawiera dwa sąsiadujące regiony, AduNAP7dl [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 27] i AduNAP7d2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 28], kodujące pierwszą (dl) i drugą (d2) domenę NAP. Przy przyporządkowywaniu sekwencji aminokwasowych wszystkich domen NAP kierowano się resztami cystein; w niektórych pozycjach wprowadzono kreski (—) dla utrzymania przyporządkowania reszt cystein i wskazania nieobecności aminokwasu w tej pozycji. Po karboksylokońcowej reszcie białka kodowanego przez cDNA występuje słowo koniec.

Figury 12A i 12B przedstawiają mapę wektora ekspresyjnego/sekrecyjnego P. pastoris, pYAM7SP8 (figura 12A) i sekwencje włączone w wektor (figura 12B) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 30]. Jak przedstawiono na figurze 12A, plazmid ten zawiera następujące elementy wstawione pomiędzy indukowany metanolem promotor ΑΟΧ1 (ciemna strzałka w 5'-końcowym, nie ulegającym translacji regionie ΑΟΧ (5ΆΟΧ)) i sygnał terminacji transkrypcji ΑΟΧ1 (3'T): syntetyczny fragment DNA kodujący sygnał sekrecyjny kwaśnej fosfatazy (S), syntetyczną sekwencję pro o długości 19 aminokwasów (P) kończącą się miejscem rozszczepianym przez proteazę ΚΕΧ2, Lys-Arg, oraz miejsce wielokrotnego klonowania. Gen HIS4, który służy jako marker selekcyjny w GS 115, zmodyfikowano przez ukierunkowaną mutagenezę w celu wyeliminowania miejsca rozpoznawanego przez endonukleazę restrykcyjną Stul (HIS4*). Sekwencje pBR322, obejmujące gen Bla i miejsce początku replikacji (ori) do namnażania w E. coli, przedstawiono przez pojedynczą linię, figura 12B przedstawia następujące sąsiadujące sekwencje DNA, które włączono w pYAM7SP8: sekwencję sygnału

183 855 sekrecji kwaśnej fosfatazy (PHOl), sekwencję pro oraz sekwencję miejsca wielokrotnego klonowania (MCS). Podkreślono kodon start, ATG, sygnału sekrecji PH01.

Figury od 13A do 13H przedstawiają sekwencje nukleotydowe cDNA, i przewidywane sekwencje aminokwasowe niektórych białek NAP, wyizolowanych z Ancylostoma caninum,. Figura 13A przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AcaNAP23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 31]. Figura 13B przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AcaNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 32], Figura 13C przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AcaNAP25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 33]. Figura 13D przedstawia sekwencje zrekombinowanych cząsteczek cDNA AcaNAP31, AcaNAP42 i AcaNAP46, które wszystkie są identyczne [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 34]. Figura 13E przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AcaNAP44 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 35]. Figura 13F przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 36]. Figura 13G przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AcaNAP47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 37]. Figural3H przedstawia sekwencje zrekombinowanej cząsteczki cDNA AcaNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 38]. We wszystkich przypadkach wskazano (podkreślono) miejsce EcoRI, odpowiadające końcowi 5' zrekombinowanej cząsteczki cDNA. Numeracja w każdej sekwencji zaczyna się od tego miejsca EcoRI. Każdy z AcaNAP45 i AcaNAP47 koduje białko, które posiada dwie domeny NAP; wszystkie inne klony na tej figurze kodują białka posiadające pojedynczą domenę NAP.

Figura 14 przedstawia sekwencję nukleotydową cząsteczki zrekombinowanego cDNA NamNAP oraz przewidywaną sekwencję aminokwasową [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 39].

Figura 15 przedstawia przeciwzakrzepową aktywność AcaNAP5 i niskocząsteczkowej heparyny (LMWH; Enoxaparin™) ocenianą w modelu zakrzepicy tętniczej indukowanej FeCl₃. Dane dotyczące aktywności przedstawiono jako procentowy zakres tworzenia zamykającego zakrzepu w tętnicy szyjnej (kółka). Tworzenie zakrzepu rozpoczyna się 150 minut po podskórnym (s.c.) podaniu czynnika testowego. Krwawienie z głębokich ran określano ilościowo w oddzielnej grupie zwierząt, z którymi postępowano w identyczny sposób, ale bez dodawania FeCl₃ (kwadraty). Utratę kiwi przy głębokich chirurgicznych ranach szyi określano ilościowo łącznie w ciągu 210 minut po podskórnym podaniu związku.

Figura 16 przedstawia przyporządkowanie sekwencji aminokwasowych odpowiadających dojrzałym NAP wyizolowanym według ujawnionych w niniejszym opisie procedur, a mianowicie AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 40], AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 41], AcaNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 42], AcaNAP23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 43], AcaNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 44], AcaNAP25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 45], AcaNAP44 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 46], AcaNAP31, 42, 46 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 47], AceNAP4d1 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 48], AceNAP4d2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 49], AcaNAP45dl [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 50], AcaNAP47d1 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 51], AduNAP7d1 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 52], AcaNAP45d2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 53], AcaNAP47d2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym 54], AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym 55], AduNAP7d2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym 56], AceNAP5 [sekwencja o numerze ' identyfikacyjnym 57], AceNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym 58], AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym 59], HpoNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym 60] i NamNAP [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 61]. Każda domena NAP zawiera dziesięć reszt cysteiny, które wykorzystano do przyporządkowania sekwencji, oraz sekwencje aminokwasowe pomiędzy· resztami cystein. A1 do A10 przedstawiają sekwencje aminokwasowe pomiędzy resztami cystein.

Figura 17 przedstawia sekwencję aminokwasową dojrzałego AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 62] posiadającego dwie domeny NAP.

183 855

Figura 18 przedstawia sekwencję aminokwasową dojrzałego AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 63] posiadającego dwie domeny NAP.

Figura 19 przedstawia sekwencję aminokwasową dojrzałego AcaNAP47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 64] posiadającego dwie domeny NAP.

Figura 20 przedstawia sekwencję amino^^^^;a.sowa dojrzałego AduNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 65] posiadającego dwie domeny NAP.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek ten dostarcza rodzinę białek, łącznie określanych jako ekstrahowane z nicieni białka przeciwkrzepliwe (NAP). Białka te nazwano tak, ponieważ pierwszego wyizolowanego przedstawiciela wyekstrahowano z nicienia, tęgoryjca dwunastnicy psa, Ancyclostoma caninum. Jednakże, nazwy NAP lub domeny NAP nie należy uważać za ograniczenie białek według niniejszego wynalazku do tego lub innego źródła naturalnego.

Poszczególne białka NAP charakteryzują się posiadaniem co najmniej jednej domeny NAP i posiadaniem aktywności hamowania proteazy serynowej i/lub aktywności przeciwkrzepliwej. Taką aktywność przeciwkrzepliwą. można oceniać przez zwiększenie czasu krzepnięcia w obu opisanych w niniejszym opisie oznaczeniach PT i aPTT, przez hamowanie aktywności czynnika Xa lub czynnika/TF bądź przez wykazanie aktywności in vivo. Korzystnie, krew lub osocze użyte w takich oznaczeniach pochodzą z gatunku, o którym wiadomo, że ulega infekcjom nicieniami, takiego jak świnie, ludzie, naczelne i podobne. Domena NAP jest sekwencją aminokwasową. Uważa się, że domena NAP jest odpowiedzialna za obserwowaną aktywność hamującą i/lub przeciwkrzepliwą. Niektóre reprezentatywne domeny NAP obejmują sekwencje aminokwasowe przedstawione na figurach 11 i 16, szczególnie sekwencje pomiędzy cysternami oznaczonymi na figurach cysteiną 1 i cysteiną 10 oraz sekwencję za cysteiną 10. Podano charakterystykę szeroko definiująca tę rodzinę białek, jak również cząsteczek kwasów nukleinowych, włącznie z kodującymi takie białka sekwencjami mRNA i sekwencjami DNA. Podano również metody przygotowywania tych białek, jak również metody przygotowywania cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących takie białka. Podane specyficzne przykłady są tylko przykładowe i postępując zgodnie z wyszczególnionymi w tych przykładach i opisanymi w niniejszym opisie procedurami można otrzymać innych przedstawicieli rodziny białek NAP, jak również kodujące je kwasy nukleinowe.

Białka według niniejszego wynalazku obejmują wyizolowane NAP, które obejmują białka posiadające aktywność przeciwkrzepliwą. i zawierające co najmniej jedną domenę NAP.

W odniesieniu do aktywności przeciwkrzepliwej, oczyszczone białka według niniejszego wynalazku są aktywne jako czynniki przeciwkrzepliwe i jako takie charakteryzują się hamowaniem krzepnięcia krwi, co obejmuje krzepnięcie osocza. W jednym aspekcie, korzystne wyizolowane białka według niniejszego wynalazku obejmują te, które zwiększają czas krzepnięcia osocza ludzkiego mierzony zarówno w oznaczeniu czasu protrombinowego (PT), jak i częściowego czasu aktywowanej tromboplastyny (aPTT).

W oznaczeniu PT krzepnięcie inicjuje się przez dodanie stałej ilości kompleksu czynnik tkankowy-micele fosfolipidowe (tromboplastyny) do osocza ludzkiego. Czynniki przeciwkrzepliwe zakłócają niektóre oddziaływania na powierzchni tego kompleksu i zwiększają czas wymagany do uzyskania krzepnięcia, w porównaniu z krzepnięciem obserwowanym w nieobecności czynnika przeciwkrzepliwego. Pomiar PT jest szczególnie istotny dla oceny aktywności przeciwkrzepliwej NAP, ponieważ serie specyficznych wydarzeń biochemicznych wymaganych do spowodowania krzepnięcia w tym oznaczeniu są podobne do tych, które tęgoryjec dwunastnicy musi przezwyciężyć w naturze dla ułatwienia odżywiania się. A zatem, zdolność NAP do działania jako inhibitor w tym oznaczeniu może odpowiadać jego aktywności w naturze i pozwolić przewidzieć aktywność przeciwkrzepliwą in vivo. W obu oznaczeniach i w naturze odpowiedź krzepnięcia jest inicjowana przez tworzenie binarnego kompleksu proteazy serynowej, czynnika VlIa (fVHa), i białka, czynnika tkankowego (TF) (fVIIa/TF), w wyniku czego dochodzi do wytwarzania fXa. Zachodzące następnie łączenie się fXa w kompleks protrombinazy jest kluczowym wydarzeniem odpowiedzialnym za tworzenie trombiny i ewentualne tworzenie skrzepu.

183 855

W oznaczeniu aPTT krzepnięcie inicjuje się przez dodanie do osocza ludzkiego pewnej stałej ilości ujemnie naładowanych miceli fosfolipidow-ych (aktywatora). Substancje działające jako czynniki przeciwkrzepliwe zakłócać będą pewne oddziaływania na powierzchni kompleksu i znów zwiększać czas uzyskania pewnego stopnia krzepnięcia w porównaniu z tym obserwowanym w nieobecności czynnika przeciwkrzepliwego. Takie oznaczenia PT i aPTT opisuje przykład B. Oznaczenia te można stosować do oceny aktywności przeciwkrzepliwej wyizolowanych NAP według niniejszego wynalazku.

Korzystne wyizolowane NAP według wynalazku obejmują te, które dwukrotnie wydłużają czas krzepnięcia osocza ludzkiego w oznaczeniu PT, jeśli obecne są w stężeniu od około 1 do około 500 nanomolowego, i które dwukrotnie wydłużają również czas krzepnięcia osocza ludzkiego w oznaczeniu aPTT, jeśli obecne są w stężeniu od około 1 do około 500 nanomolowego. Szczególnie korzystne są te białka, które dwukrotnie wydłużają czas krzepnięcia osocza ludzkiego w oznaczeniu PT, jeśli obecne są w stężeniu od około 5 do około 100 nanomolowego, i które dwukrotnie wydłużają również czas krzepnięcia osocza ludzkiego w oznaczeniu aPTT, jeśli obecne są w stężeniu od około 1 do około 200 nanomolowego. Jeszcze bardziej korzystne są te białka, które dwukrotnie wydłużają czas krzepnięcia osocza ludzkiego w oznaczeniu PT, jeśli obecne są w stężeniu od około 10 do około 50 nanomolowego, i które dwukrotnie wydłużają również czas krzepnięcia osocza ludzkiego w oznaczeniu aPTT, jeśli obecne są w stężeniu od około 10 do około 100 nanomolowego.

Przeciwkrzepliwą, lub przeciwzakrzepową, aktywność NAP według niniejszego wynalazku można także oszacowywać stosując przedstawione w przykładzie F modele in vitro. Model indukowanej FeCl₃, zakrzepicy u szczurów, opisany w części A tego przykładu, jest modelem zależnej od płytek krwi zakrzepicy tętniczej, który powszechnie wykorzystuje się do oceny związków przeciwzakrzepowych. Model pozwala oceniać zdolność testowanego związku do zapobiegania tworzeniu indukowanego FeCl₃ zamykającego zakrzepu w odcinku tętnicy szyjnej szczura. Podawane dożylnie i podskórnie NAP według niniejszego wynalazku są w tym modelu skutecznymi czynnikami przeciwkrzepliwymi. Oznaczenie krwawienia z głębokich ran opisane w części B przykładu F umożliwia pomiar utraty krwi po podaniu związku przeciwkrzepliwego. Pożądany wpływ czynnika przeciwkrzepliwego polega na hamowaniu krzepnięcia krwi, lub tworzenia zakrzepu, ale nie w takim stopniu, aby zapobiegać krzepnięciu całkowicie i w ten sposób wzmacniać krwawienie. A zatem, w oznaczeniu krwawienia z głębokich ran mierzy się ilość utraconej krwi w ciągu okresu 3,5 godziny po podaniu czynnika przeciwkrzepliwego. Dane przedstawione na figurze 15 wykazują, że NAP według niniejszego wynalazku jest skutecznym związkiem przeciwzakrzepowym w dawce, która nie powoduje nadmiernego krwawienia. W przeciwieństwie, dawka niskocząsteczkowej heparyny (LMWH), która odpowiadała 0% zamykania naczynia, powodowała około trzykrotnie większe krwawienie, niż skuteczna dawka NAP.

Ogólna domena NAP [WZÓR I]

W odniesieniu do domeny NAP, wyizolowane białka (lub NAP) według niniejszego wynalazku zawierają w swoich sekwencjach aminokwasowych co najmniej jedną domenę NAP. Niektóre domeny NAP posiadają sekwencję aminokwasową. o masie cząsteczkowej około 5,0 do 10 kilodaltonów, korzystnie od około 7,0 do 10,0 kilodaltonów, i zawierają 10 reszt aminokwasu cysteiny.

Niektóre korzystne wyizolowane NAP według niniejszego wynalazku obejmują te, które obejmują co najmniej jedną domenę NAP, przy czym każda taka domena NAP charakteryzuje się ponadto obejmowaniem sekwencji aminokwasowej: Cys-A,-Cys-A₂-CYS-A3-Cys-A4Cys-A₅-Cys-A₆-Cys-A₇-Cys-A₈-Cys-A9,-Cys (WZÓR I), gdzie: (a) Al jest sekwencją aminokwasową obejmującą 7 do 8 reszt aminokwasowych;

(b) A2 jest sekwencją aminokwasową. obejmującą 2 do 5 reszt aminokwasowych; (c) A3 jest sekwencją aminokwasową obejmującą 3 reszty aminokwasowe; (d) A4 jest sekwencją aminokwasową obejmującą 6 do 17 reszt aminokwasowych; (e) A5 jest sekwencją aminokwasową obejm.ującą 3 do 4 reszt aminokwasowych; (f A6 jest sekwencją aminokwasową obejmującą 3 do 5 reszt aminokwasowych; (g) A7 jest resztą aminokwasową; (h) A8 jest sek we nęcą aminokwasową obejmującą 10 do 12 reszt aminokwasowych i (i) A9 jest sekwencją, aminokwa20

183 855 sową obejmującą 5 do 6 reszt aminokwasowych. Inne NAP, posiadające nieznacznie różniące się domeny NAP (patrz WZORY II do V) objęte są niniejszym wynalazkiem.

Szczególnie korzystne domeny NAP obejmują te, w których A₂ jest sekwencją aminokwasową obejmującą 4 do 5 reszt aminokwasowych, a A₄ jest sekwencją aminokwasową obejmującą 6 do 16 reszt aminokwasowych. Korzystniejsze są domeny NAP, w których: (a) A1 jako czwartą resztę aminokwasową posiada Glu; (b) A2 jako pierwszą resztę aminokwasową posiada Gly; (c) A8 jako trzecią resztę aminokwasową posiada Gly, a jako szóstą resztę aminokwasową Arg i (d) A9 jako pierwszą resztę aminokwasową posiada Val. Korzystniej, A3 jako resztę aminokwasową posiada Asp lub Glu, jako trzecią resztę aminokwasową Lys lub Arg, a A7 jest Val lub Gln. Również korzystniej A8 jako czwartą resztę aminokwasową posiada Leu lub Phe, a jako piątą resztę aminokwasową Lys lub Tyr. Korzystne są także domeny NAP, w których jeśli A8 posiada 11 lub 12 reszt aminokwasowych, jej przedostatnią resztą aminokwasową jest Asp lub Gly oraz te, w których jeśli A8 posiada 10 reszt aminokwasowych, dziesiątą resztę aminokwasową. jest Gly. Do ekspresji białka w pewnych układach ekspresyjnych zrekombinowane NAP może dodatkowo obejmować sekwencję aminokwasową z odpowiednim sygnałem sekrecji. Pewne reprezentatywne domeny NAP obejmują sekwencje przedstawione na figurze 11 i figurze 16, sekwencje znajdujące się pomiędzy (i obejmujące) reszty cystein oznaczone jako cysteina 1 i cysteina 10 oraz reszty znajdujące się za cysteiną 10.

Według korzystnego aspektu, dostarcza się NAP, które zawierają co najmniej jedną domenę NAP o wzorze I, w którym domena NAP obejmuje sekwencję aminokwasową:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, w której (a) Cys-A1 wybrano z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 66 i 129; (b) CysA2-Cys wybrano z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 130 do 133; (c) A3Cys-A4 wybrano z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 134 do 145; (d) CysA5 z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 146 i 147; (e) Cys-A6 wybrano z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 148 do 150; (f) Cys-A7-Cys-A8 wybrano z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 151 do 153 i (g) Cys-A9-Cys wybrano z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 154 i 155. Korzystne są również takie białka, w których Cys-A2-Cys wybrano z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 130 i 131, a A3-Cys-A4 wybrano z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 135 do 145. Korzystniejsze są te białka posiadające domeny NAP, w których sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 66 i 129 posiadająGlu w pozycji 5; sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 130 i 131 posiadają Gly w pozycji 2; sekwencje o numerach identyfikacyjnych od 151 do 153 posiadają Gly w pozycji 6 i Arg w pozycji 9, a sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 154 i 155 posiadają Val w pozycji 2. Korzystniej, sekwencje o numerach identyfikacyjnych od 151 do 153 posiadają Val lub Glu w pozycji 2, Leu lub Phe w pozycji 7 i/lub Lys bądź Tyr w pozycji 8. Jeszcze korzystniej, sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 151 posiada Asp lub Gly w pozycji 14; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 152 posiada Asp lub Gly w pozycji 13, a sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 153 posiada Gly w pozycji 13.

Niektóre NAP według niniejszego wynalazku wykazują specyficzność w kierunku hamowania określonego składnika kaskady krzepnięcia krwi, takiego jak fXa lub kompleks fVlla/TF. Specyficzność hamującej aktywności NAP wobec składnika kaskady krzepnięcia krwi można oszacować stosując protokół opisany w przykładzie D. Zgodnie z nim, mierzy się i zdolność NAP do hionowimia aktywnoścc różnych proteaz seeyyiowych biorących udział w krzepnięciu krwi. Zdolność NAP do hamowania kompleksu fVIIa/TF można również oceniać stosując protokoły opisane w przykładzie E, zgodnie z którymi bada się zdolność NAP do wiązania fXa w sposób hamujący lub nie hamujący oraz do hamowania FVIIa skompleksowanego z TF. AcaNAP5 i AcaNAP6 są przykładami białek posiadających domeny NAP, które specyficznie hamują fXa. AcaNAPc2 jest białkiem posiadającym domenę NAP, które wykazuje specyficzne hamowanie kompleksu fVIIa/TF gdy obecny jest fXa lub jego katalitycznie aktywna bądź nieaktywna pochodna.

NAP posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, obejmujące NAP posiadające aktywność hamowania czynnika Xa (WZÓR II)

183 855

A zatem, w jednym aspekcie, NAP według niniejszego wynalazku obejmują również białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, obejmujące wyizolowane białko posiadające aktywność hamowania czynnika Xa oraz posiadające jedną lub więcej domen NAP, przy czym każda domena NAP obejmuje sekwencję:

Cys-A1-Cys-AP-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A2-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 (WZÓR II), gdzie (a) A1jest sekwencją amino^^(^^^7 do 8 reszt aminokwasowych' (b) A2 jest sekwencją aminokwasową;

(c) A3 jest sekwencją aminokwasową 3 reszt aminokwasowych;

(d) A4 jest sekwencją aminokwasową;

(e) A5 jest sekwencją aminokwasow-ą. 3 do 4 reszt aminokwasowych;

(f) A6 jest sekwencją aminokwasową;

(g) A7 jest aminokwasem;

(h) A8 jest sekwencją aminokwasową 11 do 12 reszt aminokwasowych;

(i) A9 jest sekwencją aminokwasową 5 do 7 reszt aminokwasowych; i (j) A10 jest sekwencją aminokwasową;

gdzie każda z A2, A4, A6 i A10 posiada niezależnie wybraną liczbę niezależnie wybranych reszt aminokwasowych i każdą sekwencję wybiera się w taki sposób, że każda domena NAP łącznie posiada mniej niż około 120 reszt aninokwasowych.

W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego aspektu oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego aspektu.

Białka NAP w tym aspekcie wynalazku posiadają co najmniej jedną domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny NAP. Białka NAP AccNAA2 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4 i 40] i AccNAA6 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 6 i 41] posiadająjedną domenę NAP i są korzystnymi NAP według tego aspektu wynalazku.

Korzystnymi białkami NAP według jednego rozwiązania tego aspektu wynalazku są te, w których A2 jest sekwencją cmlnokkcsową 3 do 5 reszt cminokwcsowych, A4 jest sekwencją amin<^^'^^(^'^^ 6 do 19 reszt aminokwasowych, A6 jest sekwencją aminokwasową. 3 do 5 reszt aminokwasowych, a A10 jest sekwencją cmmokkasoką 5 do 25 reszt aminokwasowych.

A zatem, zgodnie z jednym korzystnym aspektem, dostarcza się wyizolowane białka posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, obejmujące wyizolowane białka posiadające aktywność inhibitorów czynnika Xa, zawierające co najmniej jedną domenę NAP o wzorze II, która obejmuje następującą sekwencję: Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-ArCys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, gdzie (a) Cys-A1 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 67 i 156; (b) Cys-A2-Cys wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 157 do 159; (c) A3-Cys-A4 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 160 do 173; (d) Cys-A5 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 174 i 175; (e) Cys-A6 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 176 do 178; (f) Cys-A7-Cys-A8 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 179 i 180; (g) Cys-A9 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 181 do 183 oraz (h) Cys-A10 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 184 do 204.

W innym korzystnym rozwiązaniu tego aspektu wynalazku, A3 ma sekwencję Glu-A3aA3b gdzie A3a i A3b, są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi. Korzystniej, a3,, wybiera się z grupy składającej się z Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu i Tyr, a A3b wybiera się z grupy składającej się z Lys, Thr i Arg. Szczególnie korzystne sekwencje A3 wybiera się z grupy składającej się z Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys i Glu-Thr-Lys.

W dodatkowym korzystnym rozwiązaniu tego aspektu wynalazku, A4 jest sekwencją aminokwasowa posiadająca anionowy ładunek wypadkowy.

Według tego aspektu wynalazku, korzystną resztą aminokwasową A7 jest Val lub Ile.

183 855

Innym korzystnym rozwiązaniem tego aspektu wynalazku jest to, w którym A8 obejmuje sekwencję aminokwasową A4_a-A8_b,-A8j,-A4I-A8_e-A8_f-A8_g [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 68], gdzie (a) A8₈jest pierwszą resztą aminokwasową A8, (b) co najmniej jedna z A8_a i A8_b wybiera się z grupy składającej się z Glu i Asp, i (c) A8_C do A8_g są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi.

Korzystnie, A8_C jest Gly, A8i wybiera się z grupy składającej się z Phe, Tyr i Leu, A8_ejest Tyr, A8_f jest Arg, a A8g wybiera się z grupy składającej się z Asp i Asn. Szczególnie korzystną sekwencję A8j-A8I-A4e-A8rA8r wybiera się z grupy składającej się z Gly-Phe-TyrArg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 72] i Gly-Leu-TyrArg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 73].

Dodatkowym korzystnym rozwiązaniem jest to, w którym A10 obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z Glu-Ile-Ile-His-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76] i Met-Glu-Ile-Ile-Thr [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77].

Białka NAP AcaNAP5 i AcaNAP6 obejmują sekwencję aminokwasową Glu-Ile-IleHis-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 74] w A10 i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania wynalazku.

W jednym rozwiązaniu tego aspektu wynalazku, korzystną cząsteczkąNAP jest ta, w której (a) A3 ma sekwencję Glu-A3_a-A3b, gdzie A3_a i A3b, są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi;

(b) A4 jest sekwencją, aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.

(c) A7 wybiera się z grupy składającej się z Val i Ile;

(d) A8 obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się Gly-PheTyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 72] i Gly-LeuTyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 73]; oraz (e) A10 obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z Glu-IleIle-His-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76 i Met-Glu-Ile-Ile-Thr [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77],

W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego rozwiązania oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego rozwiązania. Białka NAP w tym rozwiązaniu wynalazku posiadają co najmniej jedna domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedna lub dwie domeny NAP. Białka NAP AcaNAP5 i AcaNAP6 posiadają jedną domenę NAP i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania wynalazku.

W innym korzystnym rozwiązaniu, cząsteczka NAP ta, w której (a) A3 wybiera się z grupy składającej się z Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys i Glu-Thr-Lys,-, (b) A4 jest sekwencją aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.

(c) A7 jest Val lub IIs;

(d) A8 obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się A8a-A8_bGly-Phe-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 78], A8a-A8b-Gly-Phe-TyrArg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 79], A8a-A8b,-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 80], A8_a-A8b,-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 81] i A8a-A8b-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 82], gdzie co najmniej jedna z A8a i A8bjest Glu lub Asp;

(e) A9 jest sekwencją aminokwasową pięciu reszt aminokwasowych; i

183 855 (f) A10 obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z Glu-IleIle-His-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 75], Phe-IIe-Thr-Phe-Ala-Pro [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76] i Met-Glu-Ile-Ile-Thr [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77]. W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego rozwiązania oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego rozwiązania. Białka NAP w tym rozwiązaniu wynalazku posiadają co najmniej jedną domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny NAP. Korzystne są białka posiadające co najmniej jedną domenę nAp, która jest zasadniczo taka sama jak ta albo AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 40] lub AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacfjkyny41]. BiałkaNłkP NcaNAP5 [seł5wencje o numerach identydk.acyjnych: 4 i 40] i AcaNAPó [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 6 i 41] posiadaj ąjedną domenę NAP i są szczególnie korzystnymi NAP według tego rozwiązania wynalazku.

Korzystne białka posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, włącznie z tymi posiadającymi aktywność hamującą czynnik Xa, według wszystkich rozwiązań wymienionych powyżej dla tego aspektu wynalazku, można otrzymać z gatunków nicieni. Korzystny gatunek nicienia wybiera się z grupy składającej się z Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus i Heligomosomoides polygyrus. Szczególnie korzystne są białka NAP AcaNAP5 i AcaNAP6 pochodzące z Ancylostoma caninum.

Ten aspekt wynalazku rozważa także wyizolowane zrekombiaowane cząsteczki cDNA kodujące białka posiadające aktywność pezdclwkrzepliwą i/lub aktywność hamującą czynnika Xa, które to białko jest zdefiniowane według każdego z wymienionych powyżej rozwiązań dla wyizolowanych białek NAP posiadających aktywność przeciwkrzepliwą i i/lub aktywność hamującą czynnik Xa. Korzystne cDNA według tego aspektu wynalazku kodują AcaNAP5 i AcaNAp6.

Aktywność hamująca czynnik Xa NAP w tym aspekcie wynalazku można określić stosując opisane w niniejszym opisie protokoły, przykład A opisuje jedną taką metodę. Krótko, NAP inkubuje się z czynnikiem Xa w ciągu pewnego czasu, po którym dodaje się substrat czynnika Xa. Mierzy się szybkość hydrolizy substratu, i niższa szybkość w porównaniu z szybkością występująca w nieobecności NAP wskazuje na hamowanie przez NAP czynnika Xa. przykład C podaje inną metodę wykrywania aktywności hamującej NAP skierowanej wobec czynnika Xa, gdy jest on włączany w kompleks proteombiayzy, co dokładniej odzwierciedla normalne działanie fizjologiczne czynnika Xa in vitro. Jak opisano w nim, czynnik Xa włączany w kompleks peoteombiayzy inkubuje się z NAP, a następnie dodaje się substrat. Zależne od czynnika Xa wytwarzanie trombiny przez kompleks protrombinazy mierzy się poprzez pomiar szybkości tworzenia trombiny z tej mieszaniny.

NAP posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, obejmujące NAP posiadające aktywność hamowania czynnika VIIa/TF (WZÓR III)

W innym aspekcie, NAP według niniejszego wynalazku obejmują również białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwią obejmujące wyizolowane białko posiadające aktywność hamowania czynnika VIIa/TF oraz posiadające jedną lub więcej domen NAP, przy czym każda domena NAP obejmuje sekwencje:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 (WZÓR III), gdzie (a) A1 jest sekwencją aminokwasową 7 do 8 reszt ymiaokwasowych' (b) A2 jest sekwencją aminokwasową;

(c) A3 jest sekwencją ymiaokwy.sową 3 reszt ymiaokwasowych ;

(d) A4 jest sekwencją aminokwasową;

(e) A5 jest sekwencją ymlnokwysowa. 3 do 4 reszt aminokwas owych;

(f) A6 jest sekwencją aminokwasową;

(g) A7 jest aminokwasem;

(h) A8 jest sekwenccą ammokwasową 11 do 12 reszt aminokwasowych ;

(i) A9 jest sekwencją aminokwasową 5 do 7 reszt ^^kwasowych; i (j) A10 jest sekwencją aminokwasową;

183 855 gdzie każda z A2, A4, A6 i A10 posiada niezależnie wybraną liczbę niezależnie wybranych reszt aminokwasowych i każdą sekwencję wybiera się w taki sposób, że każda domena NAP łącznie posiada mniej niż około 120 reszt aminokwasowych.

W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego aspektu oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego aspektu. Białka NAP w tym aspekcie wynalazku posiadają co najmniej jedna domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny NAP. Korzystne są białka posiadające co najmniej jedną domenę NAP zasadniczo taką samą jak ta AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59]. Białko NAP AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59] posiada jedną domenę NAP i jest szczególnie korzystnym NAP według tego aspektu wynalazku.

Korzystnymi białkami NAP według tego aspektu wynalazku są te, w których A2 jest sekwencją aminokwasową 3 do 5 reszt aminokwasowych, A4 jest sekwencją aminokwasową 6 do 19 reszt aminokwasowych, A6 jest sekwencją aminokwasową 3 do 5 reszt aminokwasowych, a A10 jest sekwencją aminokwasową 5 do 25 reszt aminokwasowych.

Zgodnie z tym, w jednym korzystnym aspekcie, dostarcza się NAP posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, obejmującą aktywność hamując ą czynnik VIIa/TF i posiadające co najmniej jedną, domenę NAP o wzorze DI, która to domena NAP obejmuje sekwencję aminokwasową:

Cys-A1 -Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A 10, gdzie (a) Cys-A1 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 83 i 205; (b) CysA2-Cys wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 206 do 208; (c) A3-Cys-A4 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 209 do 222;

(d) Cys-A5 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 223 i 224; (e) Cys-A6 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 225 do 227; (f) Cys-A7Cys-A8 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 228 i 229; (g) Cys-A9 wybiera się z jedhej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 230 do 232 oraz (h) Cys-A10 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 233 do 253.

W innym korzystnym rozwiązaniu według tego aspektu wynalazku, A3 ma sekwencję Asp-A3a-A3b, gdzie A3a i A3b są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi. Korzystniej, A3 jest Asp-Lys-Lys.

W dodatkowym korzystnym rozwiązaniu, A4 jest sekwencją aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.

W innym korzystnym rozwiązaniu tego aspektu wynalazku, A5 posiada sekwencję aminokwasową A5a-A5_b-A5_e-A5_d [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 84], gdzie A5a do A5_dsą niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi.

Według tego aspektu wynalazku, korzystną resztą aminokwasową A7 jest Val lub Ile, korzystniej Val.

Innym korzystnym rozwiązaniem tego aspektu wynalazku jest to, w którym A8 obejmuje sekwencję aminokwasową A8a-A8b,-A8_c-A8d-A8e-A8^A8_g [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 68], gdzie (a) A8a jest pierwszą resztą aminokwasową. A8, (b) co najmniej jedną z A8., i A8b wybiera się z grupy składającej się z Glu i Asp, i (c) A8_C do A8g są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi.

Korzystnie, A8_C jest Gly, A8d wybiera się z grupy składającej się z Phe, Tyr i Leu, A8e jest Tyr, A8f jest Arg, a A8g wybiera się z grupy składającej się z Asp i Asn. Korzystną sekwencją A8_c-A8d-A8e-A8_rA8gjest Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 70].

W jednym rozwiązaniu, korzystną cząsteczką NAP jest ta, w której:

(a) A3 ma sekwencję Asp-A3_;i-A3b gdzie A3_:J i A3b są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi;

(b) A4 jest sekwencją aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.

(c) A5 jest sekwencją A5_;i-A5b-A5c-A5d gdzie A5_;1 do A5d są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi;

(d) A7 wybiera się z grupy składającej się z Val i Ile.

183 855

W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego rozwiązania oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego rozwiązania. Białka NAP w tym rozwiązaniu wynalazku posiadają co najmniej jedną domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny NAP. Białko NAP AcaNAPc2 posiada jedną domenę NAP i jest korzystnym NAP według tego rozwiązania wynalazku.

W innym korzystnym rozwiązaniu, cząsteczką NAP jest ta, w której (a) A3 jest Asp-Lys-Lys;

(b) A4 jest sekwencją aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.

(c) A5 posiada sekwencję A5j-A5_b-A5j-A5_d, gdzie A5a do A5_d są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi;

(d) A7 jest Val; i (e) A8 obejmuje sekwencję aminokwasową A8.₁-A8b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 79], gdzie co najmniej jedna z A8_ii i A8_b jest Glu lub Asp. W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego rozwiązania oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego rozwiązania. Białka NAP w tym rozwiązaniu wynalazku posiadają co najmniej jedną domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny NAP. Białko NAP AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59] posiada jedną domenę NAP i jest korzystnym NAP według tego rozwiązania wynalazku.

Korzystne białka posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, włącznie z tymi posiadającymi aktywność hamującą czynnik VIIa/TF, według wszystkich rozwiązań wymienionych powyżej dla tego aspektu wynalazku, można otrzymać z gatunków nicieni. Korzystny gatunek nicienia wybiera się z grupy składającej się z Ancylostoma caninum., Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus i Heligomosomoides polygyrus. Szczególnie korzystne jest białko NAP AcaNAPc2 pochodzące z Ancylostoma caninum.. Ten aspekt wynalazku rozważa także wyizolowane zrekombinowane cząsteczki cDNA kodujące białka posiadające aktywność przeciwkrzepliwą i/lub aktywność hamującą czynnik VIIa/TF, które to białka są zdefiniowane według każdego z wymienionych powyżej rozwiązań dla wyizolowanych białek NAP posiadających aktywność przeciwkrzepliwą i i/lub aktywność hamującą czynnik Vna/TF. Korzystny cDNA według tego aspektu posiada sekwencję nukleotydową [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19] i koduje AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59].

Aktywność hamującą fVIIa/TF w tym aspekcie wynalazku można określić stosując opisane w niniejszym opisie protokoły, przykład E opisuje oznaczenia fVIIa/TF. W oznaczeniach tych mierzy się zależne od fVIIa/TF rozszczepianie i uwalnianie trytowanego zaktywowanego peptydu ze znakowanego promieniotwórczo ludzkiego czynnika IX (³H-FIX) lub amidolityczną hydrolizę chromogennego substratu peptydylowego. Co interesujące, inhibitory fVIIa/TF według niniejszego wynalazku wymagają obecności fXa, aby były aktywnymi inhibitorami fWIa/TF. Jednakże, będące NAP inhibitory fVIIa/TF są równie skuteczne w obecności fXa, którego aktywne miejsce zostało nieodwracalnie zajęte przez peptydylochlorometyloketon H-Glu-Gly-Arg-CMK (EGR), i w ten sposób uczynione katalitycznie nieaktywnym. Nie chcąc się ograniczać żadnym wyjaśnieniem, wydaje się, że NAP posiadające aktywność hamującą fVIIa/TF tworzy binarny kompleks z fXa przez wiązanie się ze specyficznie rozpoznawanym miejscem na enzymie, które jest odrębne od miejsc głównego rozpoznawania P,-P₄w centrum katalitycznym enzymu. Po tym następuje tworzenie czteroskładnikowego kompleksu z kompleksem fVIIa/TF. Zgodnie z tą hipotezą EGR-fXa może w pełni podtrzymywać hamowanie fVIIa/TF przez NAP hamujące dla fVIIa/TF, pomimo kowalencyjnego zajęcia miejsc głównego rozpoznawania (PrP₄) w miejscu katalitycznym fXa przez tripeptydylochlorometyloketon (ERG-CMK).

Aktywność hamującą fVIIa/TF NAP można także określać stosując protokoły podane w przykładzie D, jak' również oznaczenia fXa opisane w przykładach A i C. W oznaczeniach tych, mierzy się zdolność NAP do hamowania aktywności katalitycznej różnych enzymów i

183 855 porównuje z ich aktywnością hamującą skierowaną ku kompleksowi fVIIa/TF. Specyficzne hamowanie fV[Ia/TF przez NAP jest pożądaną właściwością dla pewnych zastosowań.

Dalszy aspekt wynalazku obejmuje wyizolowane białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą i cDNA kodujące białko, przy czym rzeczone białko specyficznie hamuje aktywność katalityczną kompleksu fVHa/TF w obecności fXa -bądź katalitycznie nieaktywnej pochodnej fXa, ale nie hamuje specyficznie aktywności FVIIa w nieobecności TF i nie hamuje specyficznie protrombinazy. Korzystne białka według tego aspektu wynalazku posiadają opisane powyżej właściwości wyizolowanego białka posiadającego aktywność hamującą czynnik VIIa/TF i posiadającego jedną lub więcej domen NAP. Korzystnym białkiem według tego aspektu wynalazku jest AcaNAPc2.

NAP w tym aspekcie wynalazku identyfikuje się poprzez ich aktywność hamującą fVHa/TF w obecności fXa lub pochodnej fXa, niezależnie od tego, czy pochodna jest katalitycznie aktywna, czy nie. W określaniu aktywności przeciwkrzepliwej takich NAP użyteczne są protokoły opisane w przykładach B, C i F. Zgodnie z protokołem w przykładzie A można wykrywać brak aktywności NAP wobec wolnego fXa lub protrombinazy. Dane uzyskane poprzez zastosowanie protokołów podanych w przykładzie E pozwolą zidentyfikować NAP, które wymagają do hamowania kompleksu fVHa/TF katalitycznie aktywnego lub nieaktywnego fXa. _r

NAP posiadające aktywność hamowania proteazy serynowej (WZÓR IV)

W dodatkowym aspekcie, NAP według niniejszego wynalazku obejmują również wyizolowane białko posiadające aktywność hamowania proteazy serynowej oraz posiadające jedną lub więcej domen NAP, przy czym każda domena NAP obejmuje sekwencję:

Cys-A 1 -Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5 -Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A 10 (WZÓR IV), gdzie (a) A1 jest sekwein^^ii^.aminok'^:^;^cn^w_t7 do 8 reszt aminokwasowych;

(b) A2 jest sekwencją aminokwasową;

(c) A3 jest sekwencją aminokwasową 3 reszt aminokwasowych;

(d) A4 jest sekwencją aminokwasową;

(e) A5 jest sekwencją, aminokwasową 3 do 4 reszt aminokwasowych;

(f) A6 jest sekwencją aminokwasową;

(g) A7 jest aminokwasem;

(h) A8 jest sekwencją aminokwasową 10 do 12 reszt aminokwasowych;

(i) A9 jest sekwencją aminokwasową 5 do 7 reszt aminokwasowych; i (j) A10 jest sekwencją, aminokwasową;

gdzie każda z A2, A4, A6 i A10 posiada niezależnie wybraną liczbę niezależnie wybranych reszt aminokwasowych i każdą sekwencję wybiera się w taki sposób, że każda domena NAP łącznie posiada mniej niż około 120 reszt aminokwasowych. W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego aspektu oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego aspektu. Białka NAP w tym aspekcie wynalazku posiadają co najmniej jedną domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny NAP. Korzystne są domeny NAP, które posiadają sekwencje aminokwasowe zasadniczo takie same, jak domeny NAP HpoNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 60] lub - NamNAP [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 61]. Białka NAP HpoNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 60] i NamNAP [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 61] posiadają jedną domenę NAP i są korzystnym NAP według tego aspektu wynalazku.

Korzystnymi białkami NAP według tego aspektu wynalazku są te, w których A2 jest sekwencją aminokwasową 3 do 5 reszt aminokwasowych, A4 jest sekwencją aminokwasową 6 do 19 reszt aminokwasowych, A6 jest sekwencją aminokwasową 3 do 5 reszt aminokwasowych, a A10 jest sekwencją aminokwasową 1 do 25 reszt aminokwasowych.

A zatem, w jednym korzystnym aspekcie, NAP wykazujące aktywność hamowania proteazy serynowej posiadają co najmniej jedną domenę NAP o wzorze IV, która obejmuje sekwencję aminokwasową:

183 855

Cys-A 1 -Cy s-A2-Cy s-A3-Cy s-A4-Cys-A5-Cy s-A6-Cy s-A7-Cy s-A8-Cy s-A.9-Cy s-A10 , gdzie (a) Cys-A1 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 86 i 254; (b) CysA2-Cys wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 245 do 257; (c) A3-Cys-A4 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 258 do 271;

(d) Cys-A5 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 272 i 273; (s) Cys-A6 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 274 do 276; (f) Cys-A7Cys-A8 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 277 do 279; (g) Cys-A9 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 280 do 282 oraz (h) Cys-AlO wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyffkacyjnych od 283 do 307.

W innym korzystnym rozwiązaniu, A3 ma sekwencję Glu-A2a-A3b gdzie A3a i A3b są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi. Korzystniej, A3 jest Glu-Pro-Lys.

W dodatkowym korzystnym rozwiązaniu, A4 jest sekwenccą aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.

W innym korzystnym rozwiązaniu, A5 posiada sekwencję aminokwasową A5a-A5b-A2j, gdzie A5a do A5_b są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi. Korzystnie, A5a jest Thr, a a2c jest Asn. Szczególnie korzystne sekwencje A4 obejmują Thr-Leu-Asn lub ThrMet-Asn.

Według tego aspektu wynalazku, korzystną resztą aminokwasów© A7 jest Gin.

W jednym rozwiązaniu tego aspektu wynalazku, korzystną cząsteczką NAP jest ta, w której:

(a) A3 ma sekwencję GIu-A3a-A2b, gdzie A3a i A3b, są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi;

(b) A4 jest sekwencją aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.

(c) A5 posiada sekwencję A5a-A5b-A5_c, gdzie —5a do a5c są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi; i (d) A7 jest Gln. W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego rozwiązania oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego rozwiązania. Białka NAP w tym rozwiązaniu wynalazku posiadaaą co najmniej jedna domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny NAP. Białka NAP HpoNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 60] i NamNAP [^^k-wt^^tcc^ o numerze identyfikacyjnym: 61] posiadają jedną domenę NAP i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania wynalazku.

W innym korzystnym rozwiązaniu, cząsteczka NAP jest ta, w której (a) A3 jest Glu-Pro-Lys;

(b) A4 jest sekwencją aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.

(c) A5 wybiera się z Thr-Leu-Asn i Thr-Met-Asn; i (d) A7 jest Gin. W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego rozwiązania oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego rozwiązania. Białka NAP w tym rozwiązaniu wynalazku posiadają co najmniej jedna domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny NAP. Białka NAP HpoNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 60] i NamNAP [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 61] posiadają jedną domenę NAP i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania wynalazku.

Korzystne białka posiadające aktywność hamowania proteazy serynowej, według wszystkich rozwiązań wymienionych powyżej dla tego aspektu wynalazku, można otrzymać z gatunków nicieni. Korzystny gatunek nicienia wybiera się z grupy składającej się z Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus i Heligomosomoides polygyrus. Szczególnie korzystne są białka NAP HpoNAP4 i NamNAP pochodzące odpowiednio z Heligomosomoides polygyrus i Necator americanus.

Ten aspekt wynalazku rozważa także wyizolowane zrekombinowane cząsteczki cDNA kodujące białko posiadające aktywność hamowania proteazy serynowej, które to białko jest zdefiniowane według każdego z wymienionych powyżej rozwiązań dla wyizolowanego białka NAP posiadających aktywność hamowania proteazy serynowej. Korzystne cDNA według tego aspektu posiadają sekwencje nukleotydowe [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14]

183 855 (HpoNAP5) i [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 39] (NamNAP) i kodują HpoNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 60] i NanNAP [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 61]. '

Aktywność hamującą proteazę serynową można określić stosując którekolwiek z oznaczeń ujawnionych w przykładach od A do F, lub jakiekolwiek powszechnie stosowane oznaczenie enzymatyczne do pomiaru hamowania aktywności proteazy serynowej. Procedury wielu oznaczeń enzymatycznych można znaleźć w tomach Methods of Enzymology lub podobnych materiałach literaturowych. Korzystne NAP posiadają aktywność hamowania proteazy serynowej skierowaną wobec enzymów kaskady krzepnięcia krwi lub wobec trypsyny/elastazy. ,

NAP posiadające aktywność przeciwkrzepliwą (WZÓR V)

W innym aspekcie, NAP według niniejszego wynalazku obejmują również wyizolowane białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą oraz posiadające jedną lub więcej domen NAP, przy czym każda domena NAP obejmuje sekwencję:

Cys-A 1 10 (WZÓR V), gdzie (a) A1jest sekwenccąaminokwasową7 do 8 reszt aminokwasowych;

(b) A2 jest sekwencją aminokwasową;

(c) A3 jest sekwencCą aminokwasową 3 reszt aminokwasowych;

(d) A4 jest sekwencCą aminokwasową;

(e) A5 jest sekwencją aminokwasową 3 do 4 reszt aminokwasowych ;

(f) A6 jest sekwencją aminokwasową;

(g) A7 jest aminokwasem;

(h) A8 jest sekwencCą aminokwasową 11 do 12 reszt aminokwasowych ;

gdzie każda z A2, A4, A6 i A10 posiada niezależnie wybraną liczbę niezależnie wybranych reszt aminokwasowych i każdą sekwencję wybiera się w taki sposób, że każda domena NAP łącznie posiada mniej niż około 120 reszt aminokwasowych. W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego aspektu oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego aspektu. Białka NAP w tym aspekcie wynalazku posiadają co najmniej jedną domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny NAP. Korzystne NAP obejmują te posiadające co najmniej jedną domenę NAP posiadającą sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samą jak którakolwiek z [sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 40 do 58]. Białka NAP AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 40], AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 41], AcaNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 42], AcaNAP23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 43], AcaNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 44], AcaNAP25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 45], AcaNAP44 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 46], AcaNAP31 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 47], AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 55], AceNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 57] i AceNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 58] posiadają jedną domenę NAP i są szczególnie korzystnymi NAP według tego aspektu wynalazku. Białka NAP AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 62], AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 63], AcaNAP47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 64] i AduNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 65] posiadają dwie domeny NAP i są korzystnymi NAP według tego aspektu wynalazku. Korzystnymi białkami NAP według tego aspektu wynalazku są te, w których A2 jest sekwencją aminokwasową 3 do 5 reszt aminokwasowych, A4 jest sekwencją aminokwasową 6 do 19 reszt aminokwasowych, A6 jest sekwencją aminokwasową 3 do 5 reszt aminokwasowych, a A10 jest sekwencją aminokwasową 5 do 25 reszt aminokwasowych.

Korzystnymi NAP według niniejszego wynalazku zgodnie z tym aspektem obejmują wyizolowane białka posiadające aktywność przeciwkrzepliwą i posiadające co najmniej jedną domenę NAP o wzorze V, która obejmuje następującą sekwencję:

183 855

Cys-A1 -Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A 10 , gdzie (a) Cys-A1 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 87 i 308; (b) CysA2-Cys wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 309 do 311; (c) A3-Cys-A4 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 312 do 325; (d) Cys-A5 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 326 i 327; (s) Cys-A6 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 328 do 330; (f) Cys-A7Cys-A8 wybiera się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 331 do 332; (g) Cys-A9 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 333 do 335 oraz (h) CysA10 wybiera się z jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 336 do 356.

W innym korzystnym rozwiązaniu, A3 ma sekwencję Glu-A3a-A3b, gdzie A3a i A3b, są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi. Korzystniej, A3a wybiera się z grupy składającej się z Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu i Thr, a Ab wybiera się z grupy składającej się z Lys, Thr i Arg. Szczególnie korzystne sekwencje A3 wybiera się z grupy składającej się z Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-LeuLys i Glu-Thr-Lys.

Według tego aspektu wynalazku, korzystna resztą aminokwasową A7 jest Val lub Ile.

Innym korzystnym rozwiązaniem tego aspektu wynalazku jest to, w którym A8 obejmuje sekwencję aminokwasową A8a-A8b-A8j-,-A8d-A8_e-A8_f,-A8_g [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 68], gdzie (a) a8₈ jest pierwszą resztą cminokwasoką A8, (b) co najmniej jedną z A8a i A8b wybiera się z grupy składającej się z Glu lub Asp, i (c) A8_C do A8g są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi.

Korzystnie, A8c jest Gly, A8d wybiera się z grupy składającej się z Phe, Tyr i Leu, A8_ejest Tyr, A8_f jest Arg, a A8g wybiera się z Asp i Asn. Korzystną sekwencją A8c-A8d-A8_e-A8r A8g wybiera się z grupy składającej się z Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 70], GlyTyr-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 72] i Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 73].

Innym korzystnym rozwiązaniem jest to, w którym A10 obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z Glu-Ile-Ile-His-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 75], Phe-IleThr-Ahe-Alc-Pro [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76] i Met-Glu-Ile-Ile-Thr [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77], Białka NAP AccNAA2 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4 i 40] i AccNAPó [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 6 i 41] obeemują sekwencję aminokwasową Glu-Ile-Ile-His-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 74] w A10 i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania wynalazku. Białko NAP AccNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 42] obejmuje sekwencję aminokwasową Asp-Ils-Ile-Met-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 75] w A10 i jest korzystnym NAP według tego rozwiązania wynalazku. Białka NAP AccNAp23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 43], AccNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 44], AccNAA25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 45], AccNAP4P [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 46], AcaNAA41 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 47] i AceNAP4 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 48, 49 i 62] obejmują sekwencję aminokwasową Phs-IleThr-Phe-Ala-Pro [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76] i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania wynalazku. Białka NAP AcaNAP45 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 50, 53 i 63], AcaNAP47 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 51, 54 i 64], AduNAP7 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 52, 56 i 65], AduN^4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 55], AceNAA2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 57] i AceNAP7 [sekwencja ' o numerze identyfikacyjnym: 58] obejmują sekwencję aminokwasową Met-Glu-Ile-Ile-Thr [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77] i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania wynalazku.

183 855

W jednym rozwiązaniu, korzystną cząsteczką NAP jest ta, w której:

(a) A3 ma sekwencję Asp-A3a-A3_b, gdzie A3a i A3b są niezależnie wybranymi resztami aminokwasowymi;

(b) A4 jest sekwencją aminolkwiasowąposiadającą anionowy ładunek wypadkowy.

(c) A7 wybiera się z grupy składającej się z Val i Ile.

(d) A8 obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z Gly-PheTyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 72] i Gly-LeuTyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 73], i (e) A10 obejmuje sekwencje aminokwasowe wybrane z grupy składającej się z Glu-IleIle-His-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76] i Met-Glu-Ile-Ile-Thr [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77], W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego rozwiązania oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego rozwiązania. Białka NAP w tym aspekcie wynalazku posiadają co najmniej jedną domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny NAP. Białka NAP AcaNAP5 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4 i 40], AcaNAPó [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 6 i 41], AcaNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 42], AcaNAp23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 43], AcaNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 44], AcaNAP25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 45], AcaNAP44 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 46], AcaNAP31 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 47], AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 55], AceNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 57] i AceNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 58] posiadają jedną domenę NAP i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania. Białka NAP AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 62], AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 63], AcaNAP47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 64] i AduNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 65] posiadają dwie domeny NAP i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania.

W innym korzystnym rozwiązaniu, cząsteczką NAP jest ta, w której (a) A3 wybiera się z grupy składającej się z Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys i Glu-Thr-Lys;

(b) A4 jest sekwencją aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.

(c) A7 jest Val lub Ile;

(d) A8 obejmuj e sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z A8._i-A8bGly-Phe-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 78], A8a-A8b-Gly-Phe-TyrArg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 79], A8._i-A8b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 80], A8a-A8b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [sekwencja o numerze identyfikacyjnymi 1] i A8a-A8b-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 82], gdzie co najmniej jedna z A8_;i i A8b jest Glu lub Asp;

(e) A9 jest sekwencją aminokwasową pięciu reszt aminokwasowych; i (f) A10 obejmuje sekwencje aminokwasowe wybrane z grupy składającej się z Glu-IleIle-His-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 75]; Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76] i Met-Glu-Ile-Ile-Thr [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77]. W wynalazku tym rozważa się również kompozycje farmaceutyczne zawierające białka NAP według tego rozwiązania oraz metody hamowania krzepnięcia krwi obejmujące podawanie białek NAP według tego rozwiązania. Białka NAP w tym rozwiązaniu wynalazku posiadają co najmniej jedną domenę NAP. Korzystne są NAP posiadające jedną lub dwie domeny nAp. Białka NAP AcaNAP5 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4 i 40], AcaNAP6 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 6 i 41], AcaNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 42], AcaNAp23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 43], AcaNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 44], AcaNAP25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 45],

183 855

AcaNAP44 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 46], AcaNAP31 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 47], AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 55], AceNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 57] i AceNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 58] posiadaaą jedną domenę NAP i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania. Białka NAP AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 62], AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 63], AcaNAP47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 64] i AduNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 65] posiadają dwie domeny NAP i są korzystnymi NAP według tego rozwiązania.

Korzystne białka posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, według wszystkich rozwiązań wymienionych powyżej dla tego aspektu wynalazku, można otrzymać z gatunków nicieni. Korzystny gatunek nicienia wybiera się z grupy składającej się z Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceyłanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus i Heligomosomoides połygyrus. Szczególnie korzystne są białka NAP AcaNAP5 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4 i 40], AcaNAP6 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 6 i 41], AcaNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 42], AcaNAP23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 43], AcaNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 44], AcaNAP25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 45], AcaNAP44 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym:

46], AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 63], AcaNAP47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 64] i AcaNAP31 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 47] pochodzące z Ancylostoma caninum, AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 62], AceNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 57] i AceNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 58] pochodzące z Ancylostoma ceyłanicum oraz AduNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 65] i AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 55] pochodzące z Ancylostoma duodenale.

Ten aspekt wynalazku rozważa także wyizolowane zrekombinowane cząsteczki cDNA kodujące białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, które to białko zdefiniowane jest według każdego z wymienionych powyżej rozwiązań dla wyizolowanych białek NAP posiadających aktywność przeciwkrzepliwą. Korzystne cDNA według tego aspektu obejmują AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3], AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5], AcaNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 38], AcaNAP23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 31], AcaNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 32], AcaNAP25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 33], AcaNAP44 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 35], AcaNAP31 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym:

34], AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12], AceNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10], AceNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11], AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9], AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 36], AcaNAP47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 37] i AduNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13].

Aktywność przeciwkrzepliwą NAP w tym aspekcie wynalazku można określić stosując opisane w niniejszym opisie protokoły, przykłady B i F podają szczególnie użyteczne metody oznaczania aktywności przeciwkrzepliwej NAP. Opisane procedury wykrywania NAP posiadających aktywność hamującą fXa (Przykłady A, C) i aktywność hamującą fVIIa/TF (przykład E) również są użyteczne w ocenianiu aktywności przeciwkrzepliwej NAP.

Oligonukleotydy

Innym aspektem tego wynalazku jest oligonukleotyd posiadający sekwencję wybraną spośród

YG109: TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 88],

YG103: AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 89], nAp-1: AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 90], i

NAP-4.RCTW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 91].

183 855

Te sekwencje oligonukleotydowk hybrydyzują z sekwencjami kwasów nukleinowych kodujących białko NAP.

Wyizolowane NAP według niniejszego wynalazku obejmują te posiadające zróżnicowania w ujawnionej sekwencji lub sekwencjach aminokwasowych, włącznie z fragmentami, naturalnie występującymi mutacjami, wariantami yllelinzaymi, losowo tworzonymi sztucznymi mutantami, i zamierzonymi zróżnicowaniami sekwencji, z których wszystkie zachowują aktywność przkclwkezkpliwa. Tkemi4 fragment odnosi się do którejkolwiek części sekwencji, która zawiera mniej aminokwasów niż całe białko, jak na przykład częściowe sekwencje wyłączając części przy końcu aminowym, końcu karboksylowym lub pomiędzy aminowym a karboksylowym końcem całego białka.

Wyizolowane NAP według niniejszego wynalazku obejmują, również białka posiadające zekkomblnowyaą sekwencję aminokwasową lub sekwencje, które zachowują aktywność przeciwkezepliwą jednej lub wielu sekwencji ymiaokwysowych domeny NAP. A zatem, w znaczeniu tu stosowanym, zwrot białko NAP lub termin białko, jeśli odnosi się do białka zawierającego domenę NAP, oznaczają bez rozróżniania, natywne białko NAP lub białko NAP przygotowane metodami eekombinynyjnymi. Te zrekombiaowyak białka obejmują białka hybrydowe, takie jak białka fuzyjne, białka otrzymane w wyniku ekspresji wielu genów w wektorze ekspresyjnym, białka otrzymane w wyniku ekspresji wielu genów w chromosomie komórki gospodarza, i mogą obejmować polipeptyd posiadający aktywność pr·zeniwkrzkpliwą ujawnionego białka połączony wiązaniami peptydowymi z drugim polipeptydem. Zrkkombl4owaae białka obejmują także warianty jednej lub wielu sekwencji aminokwasowych domeny NAP według niniejszego wynalazku, które różnią się tylko konserwatywnymi podstawieniami ymiaokwysowymi. Konserwatywne podstawienia aminokwas/owe zdefiniowano jako zestawy w tabeli 1 w Taylor, W.R., J. Mol. Biol., 188: 233 (1986). Zrekombinowy4k białka obejmują również warianty jednej lub wielu sekwencji ymiaokwysowynh domeny NAP według niniejszego wynalazku, w których dokonuje się podstawień lub delej yminokwasowynh, które zachowują aktywność przeciwkrzepbwą wyizolowanej jednej lub wielu sekwencji domeny NAP.

Jednym korzystnym rozwiązyaikm niniejszego wynalazku jest białko wyizolowane metodami biochemicznymi z nicienia Ancylostoma caninum., jak opisano w przykładzie 1. Białko to zwiększa czas krzepnięcia osocza ludzkiego w oznaczeniach PT i aPTT, zawiera jedną domenę NAP i charakteryzuje się N-końcem posiadającym sekwencję yminokwysowa Lys-Aia-Tyr-Pro-CJlu-C.ys-Giy-Giu-As4-Giu-Tep-Leu-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 92], i masą cząsteczkową od około 8,7 kilodaltonów do około 8,8 kilodaltonów, jak określono przez spektrometrię masową.

Dalsze korzystne rozwiązania niniejszego wynalazku obejmują białka, posiadające aktywność przeciwkrzepliwą, przygotowane metodami rekombinycyjaymi z biblioteki cDNA wyizolowanej z ainieniy Ancylostoma caninum, na przykład AcyNAp5 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4 lub 40], AcaNAPó [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 6 lub 41], Pro-AcaNAPó [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7], Pro-AcyNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8], AnaNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 42], AcyNAP23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 43], AcyNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 44], AcaNAP25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 45], AcaNAP44 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 46], AcaNAP31 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 47], AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 63], AnyNAP47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 64] i AcyNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59]; wyizolowane z nicienią Ancyclostoma ceylanium, na przykład, AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 62], AceNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 57] i AceNAP? [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 58]; wyizolowanej z ainikaią Ancyclostoma duodenale, na przykład AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 55] i AduNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 65]; wyizolowanej z nicienia Heligmosmoides polygyrus, na przykład, HpoNAP5 [sdkwe4cjy o numerze identyfikacyjnym: 60]; oraz ainikaly Necator americanus, na przykład, NamNAP [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 61]. Sekwencje yminokwysowe tych białek przedstawiono na figurach 11 i 16 oraz w

183 855 innych miejscach. Każde takie korzystne rozwiązanie zwiększa czas krzepnięcia osocza ludzkiego w oznaczeniach PT i aPTT, i zawiera co najmniej jedna domenę NAP.

W odniesieniu do wyizolowanych białek, białka według niniejszego wynalazku izoluje się metodami oczyszczania białek dobrze znanymi w nauce, lub jak ujawniono poniżej. Można je wyizolować ze źródła naturalnego, z mieszaniny chemicznej po syntezie chemicznej na fazie stałej lub w roztworze, takiej jak zautomatyzowana synteza peptydu na fazie stałej, bądź z hodowli komórkowej po wytworzeniu metodami rekombinacyjnymi.

Jak opisano dalej tu poniżej, niniejszy wynalazek rozważa również kompozycje farmaceutyczne zawierające NAP i metody stosowania NAP do hamowania procesu krzepnięcia krwi i związanej z nim zakrzepicy. Sondy oligonukleotydowe użyteczne do identyfikowania kwasu nukleinowego NAP w próbce również wchodzą w zakres niniejszego wynalazku, jak opisano pełniej w niniejszym opisie poniżej.

1. NAP izolowane ze źródeł, naturalnych

Korzystne wyizolowane białka (NAP) według niniejszego wynalazku można izolować i oczyszczać ze źródeł naturalnych. Jako źródła naturalne korzystne są nicienie; odpowiednie nicienie obejmujią nicienie jelitowe, takie jak Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus i Heligmosomoides polygyrus. Szczególnie korzystny jako źródło naturalne jest nicień krwiożemy, tęgoryjec dwunastnicy, Ancylostoma caninum.

Korzystne białka według niniejszego wynalazku izoluje się i oczyszcza z ich źródeł naturalnych metodami znanymi w biochemii. Metody te obejmują przygotowywanie rozpuszczalnego ekstraktu i wzbogacanie ekstraktu z zastosowaniem metod chromatograficznych na różnych złożach nośnikowych. Korzystne metody oczyszczania mogą obejmować przygotowanie rozpuszczalnego ekstraktu nicienia w buforze 0,02 M Tris-HCl, pH 7,4, zawierającym różne inhibitory proteaz, po czym następuje kolejna chromatografia ekstraktu na kolumnach zawierających złoże konkanawalina A-Sepharose, kationowe złoże jonowymienne Poros20 HQ, złoże do sączenia molekularnego Superdex30 i złoża z odwróconymi fazami C18. Frakcje zbierane z takich kolumn chromatograficznych można selekcjonować pod względem ich zdolności do zwiększania czasu krzepnięcia osocza ludzkiego, co mierzy się poprzez oznaczenia PT lub aPTT, bądź ich zdolności do hamowania aktywności amidolitycznego czynnika Xa, co mierzy się poprzez kolorymetryczne oznaczenie amidolitycze z zastosowaniem oczyszczonego enzymu lub innymi metodami ujawnionymi tu w przykładach od A do F. przykład korzystnej metody oczyszczania wyizolowanego białka według niniejszego wynalazku może obejmować ten ujawniony w przykładzie 1.

Korzystne białka według niniejszego wynalazku, jeśli oczyszcza się je, jak opisano, ze źródła naturalnego, takiego jak Ancylostoma caninum, obejmują te, które zawierają sekwencję aminokwasową: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 92]. Szczególnie korzystne są oczyszczone białka posiadające taką sekwencję aminokwasową. końca aminowego, jak przedstawiona na figurze 2 (AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4]) lub figurze 4 (AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6]). Wykazano, że jedno z korzystnych białek według niniejszego wynalazku posiada sekwencję aminokwasową końca aminowego Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-GlyGlu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 92] i określoną przez spektrometrię masową masę cząsteczkową 8,7 do 8,8 kilodaltonów.

2. NAP przygotowane przez syntezę chemiczna

Korzystne wyizolowane nAp według niniejszego wynalazku można zsyntetyzować standardowymi metodami znanymi w dziedzinie chemii.

Wyizolowane białka według niniejszego wynalazku można przygotować stosując syntezę na fazie stałej, takąjak ta opisana przez Merrifielda, J. Amer. Chem. Soc., 84: 2149 (1964) lub inne równoważne metody znane w dziedzinie chemii, takie jak metoda opisana przez Houghtena w Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 4132 (1984).

Synteza na fazie stałej jest rozpoczynana od końca C peptydu przez sprzęgnięcie zablokowanego aminokwasu lub peptydu z odpowiednią nierozpuszczalną żywicą. Odpowiednie żywice obejmują te zawierające grupy chlorometylowe, bromometylows, hydroksymetylowe,

183 855 aminometylowe, benzohydrylowe i t-alkiloksykarbonylohydrazydowe, z którymi można bezpośrednio sprzęgać aminokwas.

W tej syntezie na fazie stałej najpierw sprzęga się z nierozpuszczalną żywicą karboksylokońcowy aminokwas, posiadający grupę alfa-aminową oraz, jeśli jest to konieczne, reaktywną grupę łańcucha bocznego, w odpowiedni sposób zablokowana. Po usunięciu grupy blokującej grupę alfa-aminową w taki sposób jak przez traktowanie kwasem trifluorooctowym w odpowiednim rozpuszczalniku, z wolną grupą alfa-aminową aminokwasu sprzęgniętego z żywicą sprzęga się następny aminokwas lub peptyd, również posiadający odpowiednio zablokowaną grupę alfa-aminową i, jeśli jest to konieczne, każdą reaktywną, grupę lub grupy łańcuchów bocznych. W ten sam sposób z rosnącym łańcuchem peptydowym sprzęga się dodatkowe odpowiednio zablokowane aminokwasy lub peptydy aż do uzyskania pożądanej sekwencji aminokwasowej. Syntezę można wykonać manualnie, stosując automatyczne syntezatory peptydów lub połączenie tych metod.

Sprzęganie odpowiednio zablokowanego aminokwasu lub peptydu z wolną grupą alfaaminową aminokwasu związanego z żywicą można przeprowadzać zgodnie z konwencjonalnymi metodami sprzęgania, takimi jak metoda z zastosowaniem azydków, metoda z zastosowaniem mieszaniny bezwodników, metoda z zastosowaniem DDC (dicykloheksylokarboimidu), metoda z zastosowaniem zaktywowanego estru (ester p-nitrofenylu lub ester Nhydroksysukcynimidu), metoda z zastosowaniem BOP (heksafluorofosforanubenzotriazol-iilo-oksy-tris(diamino)-fosfoniowego lub metoda z zastosowaniem odczynnika K Woodwarda.

W syntezie peptydów powszechne jest, że grupy blokujące grupy alfa-aminowe aminokwasów lub peptydów sprzęgniętych z rosnącym łańcuchem peptydowym połączonym z nierozpuszczalną żywicą usuwać się będzie w warunkach, które nie usuwają grup blokujących łańcuchy boczne. Po zakończeniu syntezy jest również powszechne, że peptyd usuwa się z nierozpuszczalnej żywicy i podczas lub po tym usunięciu usuwa się grupy blokujące łańcuchy boczne.

Odpowiednie grupy blokujące grupę alfa-aminową wszystkich aminokwasów' oraz grupę omega-aminową lizyny obejmują grupy benzyloksykarbonylową, izonikotynyloksy-karbonylową o-chlorobenzyloksykarbonylową, p-nitrofenyloksykarbonylową, p-metoksy-fenyloksykarbonylową, t-butoksykarbonylową, t-amyloksykabonylową adamantyloksy-kaibonylową 2-(4-bifenylo)-2-propyloksykarbonylową 9-fluorenylometoksykarbonylową metylosulfonyloetoksylokarbonylową, trifluoroaceeylową ftaliiowtą formylową 2-nitrofenylosulfenylową difenylofosfnotioilową dlmetjjofosfmottoίlową.l podobne.

Odpowiednie grupy blokujące grupę karboksylową kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego obejmują ester benzylowy, ester cykloheksylowy, ester 4-nitrobenzylowy, ester t-butylowy, ester 4-pirydylometylowy i podobne.

Odpowiednie grupy blokujące grupę guanidynową argininy obeemują grupy nitrową, ptoluenosulfonylową benzyloksykarbonylową, adamantyloksykarbonylową p-metoksybenzenosulfonylową 4-metoksy-2,6-dimetylobenzenosulfonylową, 1,i3,5-^ibr^i^i^it^l^<^:fer^;^l^(^i^i^]^:fo]^:^l^^'wą i podobne.

Odpowiednie grupy blokujące grupę tiolową. cysteiny obejmują grupy p-metoksybenzylową, trifenylometylową, acetyloaminometylową etylokarbamoilową 4-metylobenzylową, 2,4,6-trimety(obenzylową i podobne.

Odpowiednie grupy blokujące grupę hydroksylową seryny obejmują grupy benzylową, t-butylową, acetylową tetrahydropiranylową i podobne.

Zakończony peptyd można odszczepić od żywicy przez traktowanie w obniżonych temperaturach płynnym kwasem fluorowodorowym zawierającym jeden lub więcej posiadających grupy tiolowe substancji usuwających rodniki. Odszczepienie peptydu od żywicy przez takie traktowanie doprowadzi także do usunięcia z peptydu wszystkich grup blokujących łańcuchy boczne.

Odszczepiony peptyd rozpuszcza się w rozcieńczonym kwasie octowym, następnie sączy, a potem umożliwia jego właściwe sfałdowanie i wytworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych przez rozcieńczenie do stężenia peptyd około 0,5 mM do około 2 mM w 0,1 M roztworze kwasu octowego. pH tego roztworu doprowadza się do około 8,0 stosując wodoro183 855 tlenek amonowy i roztwór miesza się, przy dostępie powietrza, w ciągu około 24 do około 72 godzin.

Ufałdowany peptyd oczyszcza się przez chromatografię, korzystnie przez wysokociśnieniową chromatografię cieczową na kolumnie z odwróconymi fazami, eluując gradientem acetonitrylu w wodzie (zawierającej również 0,1% kwasu trifiuorooctowego), przy czym korzystnym gradientem jest gradient od 0 do około 85% acetonitrylu w wodzie. Po zebraniu frakcji zawierających czysty peptyd, łączy się je i liofilizuje uzyskując peptyd w postaci stałej.

3. NAP przygotowywane metodami rrkombinncyjjymi

Alternatywnie, korzystne wyizolowane NAP według niniejszego wynalazku można przygotowywać metodami rekombinacji DNA, podanymi w niniejszym opisie i dobrze znanymi w dziedzinie biologii. Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, wydanie drugie, tomy 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Metody rekombinacji DNA umożliwiają łączenie ze sobą odcinków informacji genetycznej, DNA, z różnych organizmów poza organizmami, z których DNA otrzymano i umożliwiają inkorporację tego hybrydowego DNA do komórki, co umożliwi wytwarzanie białka, które oryginalny dNa koduje.

Informację genetyczną, kodującą białko według niniejszego wynalazku można otrzymać z genomowego DNA lub mRNA organizmu metodami dobrze znanymi w nauce. Korzystne metody otrzymywania tej informacji genetycznej obejmują, izolowanie mRNA z organizmu, przekształcanie go w komplementarny do niego DNA (cDNA), wbudowywanie cDNA do odpowiedniego wektora klonującego i identyfikowanie klonu, który zawiera zrekombinowany cDNA kodujący pożądane białko poprzez hybrydyzację z odpowiednimi sondami oligonukleotydowymi skonstruowanymi na podstawie znanych sekwencji białka.

Informację genetyczną w zrekombinowanym cDNA, kodującą białko według niniejszego wynalazku, można ligować w wektorze ekspresyjnym, wektor wprowadzać do komórek gospodarza i uzyskiwać ekspresje informacji genetycznej w postaci białka przez nią kodowanego.

(A) Przygotowywanie biblioteki cDNA

Korzystnymi naturalnymi źródłami mRNA, do konstruowania biblioteki cDNA, są nicienie obejmujące nicienie jelitowe, takie jak Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma diuodenale, Necator americanus i Heligmosomoides polygyrus. Szczególnie korzystny jako naturalne źródło mRNA jest nicień tęgoryjec dwunastnicy, Ancylostoma caninum.

Korzystne metody izolowania z organizmu mRNA kodującego białko według niniejszego wynalazku, wraz z innymi mRNA, obejmują chromatografię na żelach powinowactwa poli U lub poli T. Szczególnie korzystne metody izolowania mRNA z nicieni obejmują procedurę i materiały dostarczone w zestawie do oczyszczania mRNA QuickPrep (Pharmacia).

Korzystne metody otrzymywania dwuniciowego cDNA z wyizolowanego mRNA obejmują syntetyzowanie jednoniciowego cDNA na matrycy mRNA z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy, degradowanie mRNA zhybrydyzowanego z nicią cDNA z zastosowaniem rybonukleazy (RNazy) i syntetyzowanie komplementarnej nici DNA z zastosowaniem polimerazy DNA, dla otrzymania dwuniciowego cDNA. Szczególnie korzystne metody obejmują te, w których około 3 mikrogramów mRNA wyizolowanego z nicienia przekształcane jest w dwuniciowy cDNA przy wykorzystaniu odwrotnej transkryptazy ptasiego wirusa mieloblastozy, RNazy H i polimerazy DNA IE. coli oraz polimerazy DNA T4.

cDNA kodujący białko według niniejszego wynalazku, wraz z innymi cDNA w bibliotece skonstruowanej jak powyżej, liguje się następnie w wektorach klonujących. Wektory klonujące obejmują sekwencję DNA, która przyjmuje cDNA z biblioteki cDNA. Wektory zawierające bibliotekę cDNA wprowadza się do komórek gospodarza, które mogą istnieć w stabilny sposób i zapewniają środowisko, w którym wektor klonujący ulega replikacji. Odpowiednie wektory klonujące obejmują plazmidy, bakteriofagi, wirusy i kosmidy. Korzystne wektory klonujące obejmują bakteriofagi. Wektory klonujące, które są szczególnie korzystne, obejmują wektor bakteriofagowy lambda gt11 Sfi-Not.

Konstruowanie odpowiednich wektorów klonujących zawierających bibliotekę cDNA i sekwencje kontrolujące obejmuje wykorzystywanie standardowych technik ligacji i restrykcji,

183 855 które są dobrze znane w nauce. Wyizolowane plazmidy, sekwencje DNA lub zsyntetyzowcns oligonukleotydy rozszczepia się, łączy i ponownie liguje w pożądanej postaci.

Co się tyczy technik restrykcji, specyficzne wobec miejsca rozszczepienie cDNA prowadzi się przez traktowanie odpowiednim enzymem restrykcyjnym w warunkach, które są generalnie znane w tej dziedzinie, i których szczegóły podają producenci tych komercjalnie dostępnych enzymów. Patrz, na przykład, katalog produktów New England BioLabs, Aronega i Stratcgene Cloning Systems.

Na ogół, około 1 mikrogrcma cDNA rozszczepia się przez traktowanie około jedną jednostką enzymu restrykcyjnego w objętości około 20 mikrolitrów roztworu buforowego. Zazwyczaj, stosuje się nadmiar enzymu restrykcyjnego dla zapewnienia pełnego rozszczepienia DNA. Zazwyczaj stosuje się czasy inkubacji około 1 do 2 godzin w temperaturze około 37°C, chociaż znane są wyjątki. Po każdej reakcji rozszczepiania białko można usunąć przez ekstrakcję fenolem/chloroformem, po której ewentualnie występuje chromatografia na kolumnie do sączenia molekularnego, takiej jak z Sephadex® G50. Alternatywnie, rozszczepione fragmenty cDNA rozdziela się pod względem wielkości przez elektroforezę w żelach poliakrylocmidowym lub agarozowym i izoluje stosując standardowe techniki. Ogólny opis rozdziału pod względem wielkości znajduje się w Methods of Enzymology, 65: 499-560 (1980).

Fragmenty cDNA rozszczepionego enzymem restrykcyjnym liguje się następnie w wektor kolonujący.

Co się tyczy technik ligacji, zazwyczaj przeprowadza się ligacje tępych końców w objętości około 15 do około 30 mikrolitrów buforu o pH 7,5, zawierającego około 1 mM ATP i około 0,3 do 0,6 jednostek (Weissa) ligazy DNA T4 , w temepraturze około 14°C. Międzyczasteczkowe ligacje lepkich końców zazwyczaj przeprowadza się przy około 5 do 100 nmolowych całkowitych stężeniach końców DNA. Międzyczasteczkows ligacje tępych końców (zawyczaj z zastowaniem około 10- do 30-krotnsgo nadmiaru łączników) przeprowadza się przy około 1 mikromolowym stężeniu całkowitym końców DNA.

(B) Przygotowywanie DNA kodującego NAP

Wektory klonujące zawierające bibliotekę cDNA przygotowaną jak ujawniono powyżej wprowadza się do komórek gospodarza, komórki gospodarza hoduje się, wysiewa na płytkę, a następnie testuje sondą hybrydyzacyjną w celu identyfikacji klonów, które zawierają zrekombinowany cDNA kodujący białko według niniejszego wynalazku. Jeśli stosuje się fagowy wektor klonujący, korzystne komórki gospodarza obejmują bakterie. Szczególnie korzystne komórki gospodarza obejmują szczepy E. coli, takie jak szczep Y1090.

Alternatywnie, zrekombinowcny cDNA kodujący białko według niniejszego wynalazku można otrzymać przez ekspresę takiego białka na zewnętrznej powierzchni faga nitkowatego, a następnie wyizolowanie takiego faga przez wiązanie go z białkiem docelowym, zaangażowanym w krzepnięciu krwi.

Ważną i dobrze znaną cechą kodu genetycznego jest jego degeneracja - więcej niż jeden tryplet sekwencji nukleotydowej koduje jeden aminokwas. A zatem, możliwe są liczne różne sekwencje cząsteczek zrekombinowanego cDNA, które kodują konkretną sekwencję aminokwasowąNAP według niniejszego wynalazku. Takie sekwencje nukleotydowe uważa się za funkcjonalnie równoważne, ponieważ mogą zapewnić wytwarzanie tej samej sekwencji nokwcsokęj we wszystkich organizmach. Czasami, do danej sekwencji nukleotydowej może być włączony zmetylowcny wariant puryny lub pirymidyny. Takie mstylacje nie wpływają jednak w żaden sposób na kodowaną informację.

(1) Stosowanie sond oligonukleotydowych

Sondy hybrydyzacyjne i startery są sekwencjami oligonukleotydowymi, które są komplementarne do części lub całości zrekombinowanej cząsteczki cDNA, która jest pożądana. Można je przygotowywać stosując jakąkolwiek odpowiednią metodę, na przykład metody z zastosowaniem fosfotriestrów i fosfodiestrów, opisane odpowiednio w Narang, S. A. i in., Methods in Enzymology, 68: 90 (1979) oraz Brown, E. L. i in., Methods in Enzymology, 68.: 109 (1979), lub ich zautomatyzowane rozwiązania. W jednym takim rozwiązaniu, jako materiał wyjściowy stosuje się distylofosforynocmidy i można je syntetyzować jak opisali Beaucage i in., Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862 (1981). Jednąz metod syntetyzowania oligonu183 855 kleotydów na zmodyfikowanym stałym nośniku opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 458 066. Sondy różnią się od starterów tym, że znakuje je się enzymem, takim jak peroksydaza z chrzanu, lub atomem promieniotwórczym, takim jak ³²P, dla ułatwienia detekcji. Zsyntetyzowaną sondę znakuje się promieniotwórcze przez przemieszczanie pęknięć z zastosowaniem polimerazy DNA IE. coli bądź przez znakowanie końców z zastosowaniem fofatazy alkalicznej i kinazy polinukleotydowej bakteriofaga T4.

Korzystne sondy hybrydyzacyjne obejmują sekwencje oligonukleotydowe, które są komplementarne do odcinka jednoniciowego cDNA kodującego część sekwencji aminokwasowej NAP oczyszczonego z nicienia, takiego jak tęgoryjec dwunastnicy, Ancylostoma caninum. Na przykład, można użyć część sekwencji aminokwasowej przedstawionej na figurze 2 (AcaNAP5) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4] lub figurze 4 (AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6]). Szczególnie korzystne sondy hybrydyzacyjne obejmują te, których sekwencja oligonukloetydowa jest komplementarna do odcinka jednoniciowego cDNA kodującego sekwencję aminokwasową Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 93]. Takie sondy hybrydyzacyjne obejmują zdegenerowaną sondę posiadającą sekwencję oligonukleotydową: AaR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 94], w której R jest A lub G, Y jest T lub C, a i jest inozyną. Korzystną zrekombinowaną cząsteczkę cDNA kodującą białko według niniejszego wynalazku identyfikuje się poprzez jej zdolność do hybrydyzacji z tą sondą.

Korzystne sondy hybrydyzacyjne obeemują także parę NAP-1 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym; 90] i nAP-4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 91] oraz parę YG109 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 88] i YG103 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 89], które opisano odpowiednio w przykładach 13 i 12.

Po zidentyfikowaniu klonu zawierającego pożądany cDNA, do wytworzenia dużych ilości genu kodującego białko według niniejszego wynalazku w postaci zrekombinowanej cząsteczki DNA stosuje się amplifikację.

Korzystne metody amplifikacji obejmują stosowanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Patrz, np. PCR Technology, W. H. Freeman and Company, Nowy Jork (red. Erlich, H. A., 1992). PCR jest metodą amplifikacji in vitro stosowaną do syntezy specyficznych sekwencji DNA. W PCR stosuje się dwa startery oligonukleotydowe, które hybrydyzują z przeciwnymi niciami i flankują region będący przedmiotem zainteresowania w cDNA klonu. W wyniku powtarzanych serii cykli obejmujących denaturację cDNA do pojedynczych nici, łączenie starterów z jednoniciowym cDNA oraz wydłużanie przyłączonych starterów przez polimerazę DNA uzyskuje się liczne kopie cDNA o końcach zdefiniowanych przez końce 5' starterów, których liczba w przybliżeniu podwaja się w każdym cyklu. Ibid., str. 1. Poprzez amplifikację PCR otrzymuje się domenę kodującą i każdą dodatkową informację kodowaną przez startery, taką jak miejsca restrykcyjne lub sygnały translacyjne (sekwencje sygnałowe, kodony start i/lub kodony stop) zrekombinowanej cząsteczki cDNA.

Korzystne warunki amplifikacji cDNA obejmują warunki wykorzystujące polimerazę Taq i obejmujące 30 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 95°C; 1 minuta w temperaturze 50°C; 1,5 minuty w temperaturze 72°C. Korzystne startery obejmują starter oligo(dT) -NotI, AATTCGCGGC cGc(T),1, [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 95], otrzymany z Promega Corp., łącznie z albo (i) /degenerowanym starterem posiadającym sekwencję oligonukleotydową: AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 94], gdzie R jest A lub G, Y jest T lub C, a i jest inozyną lub (ii) starter lambda gil #1218, GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 96], uzyskany z New England Biolabs.

Sekwencję kwasu nukleinowego zrekombinowanej cząsteczki cDNA przygotowanej jak ujawniono, określa się metodami opartymi o metodę z zastosowaniem dideoksynukleotydów Sangera, F. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463 (1977), jak dalej opisali Messing, i in., Nucleic Acids Res.’, 9: 309 (1981).

Korzystne zrekombinowane cząsteczki cDNA przygotowane jak ujawniono, obejmują te posiadające sekwencje kwasów nukleinowych przedstawionych na figurach 1, 3, 7, 9, 13 i 14.

183 855 (2) Stosowanie cDNA NAP jako sond

Szczególnie korzystne jako sondy hybrydyzacyjne są także sekwencje oligonukleotydows kodujące zasadniczo całą sekwencję aminokwasową NAP oczyszczonego z nicienia, tęgoryjca dwunastnicy, Ancylostoma caninum. Szczególnie korzystne sondy obejmują te pochodzące z genów AcaNAP4 i AcaNAP6 i posiadają następujące sekwencje kwasów nukleinowych (gen AcaNAP4): AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GAC TGT GGA ACT CAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AAT GAG GAA CCC CCT GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGC TCA CGT GGT TGT TTA TTA CCT CCT GCT TGC GTA TGC AAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AGG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1], lub przedstawiona na figurze 3 (gen AcaNAP6) : AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG -ATT GAA TGG CTC GAC GTC TGT GGA ACT AAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AGT GAG GAA GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGA TCA TTT TCT TGT CCG GGT CCC GCT GCT TGC GTA TGC GAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AAG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2],

Korzystne sondy hybrydyzacyjne obejmują również sekwencje kodujące zasadniczą część sekwencji aminokwasowej NAP, takie jak fragment PCR utworzony z zastosowaniem pary starterów NAP-1 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 90] i N—P-4.RC [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 91], jak opisano w przykładzie 13.

(3) Stosowanie techniki prezentacji przez fagi

W niniejszym opisie ujawniono metodę selekcjonowania cDNA kodujących białka według niniejszego wynalazku z całej biblioteki cDNA wykorzystującą technikę prezentacji przez faga nitkowatego. Aktualna technika prezentacji przez faga nitkowatego polega na wstawianiu w ramce odczytu do genu 3 lub genu 8, które odpowiednio kodują białko odpowiedzialne za adsorbcję lub główne białko kapsydu faga, będących przedmiotem zainteresowania regionów kodujących. Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie zrozumiałe, że przeprowadzeniu tego z mieszaniną bardzo wielu cDNA o nieznanych sekwencjach towarzyszą różne trudności i że najbardziej praktyczny sposób uzyskania funkcjonalnej prezentacji produktów cDNA obejmuje łączenie cDNA poprzez ich końce 4'. Rzeczywiście, biblioteki cDNA o wystarczającej wielkości mogą zawierać kilka cDNA, które pochodzą z tego samego mRNA, ale skrócone są w różnych pozycjach po stronie końca 5', tak że pewne z nich mogą ulegać ekspresji w postaci produktów fuzyjnych. Ostatnio opisano strategię zgodną z tym rozumowaniem, która wykorzystuje zdolność leucynowych zamków błyskawicznych białek Jun i Fos do tworzenia heterodimerów. Patrz Cramsri, R. i Suter, M., Gene, 137: 69-74 (1993).

Odkryliśmy nowy alternatywny i bezpośredni sposób kowalencyjnego wiązania produktów genów cDNA z powierzchnią fagów; odkrycie oparte jest na obserwacji, że białka tworzące fuzję z końcem C białka 6 otoczki fagowej mogą ulegać funkcjonalnej prezentacji. Obserwacja ta doprowadziła do opracowania układu fagsmidowego takiego jak tu opisano, który umożliwia ekspresję funkcjonalnie prezentowanych produktów cDNA, co z kolei umożliwia selekcję na zasadzie powinowactwa cząstek fagowych, które zawierają cDNA wymagany do wytwarzania prezentowanego produktu cDNA. Układ ten zapewnia podstawę do izolowania cDNA kodujących białko według niniejszego wynalazku. Po wyizolowaniu, zrekombinowane cząsteczki cDNA zawierające taki cDNA można stosować do ekspresji białek według niniejszego wynalazku w innych układach ekspresyjnych. Przygotowane w ten sposób zrekombinowane cząsteczki cDNA uważa się za pozostające w zakresie niniejszego wynalazku.

Zrekombinowane cząsteczki cDNA według niniejszego wynalazku izoluje się przez przygotowanie biblioteki cDNA ze źródła naturalnego (jak na przykład nicienia takiego jak tęgoryjec dwunastnicy), ligację biblioteki cDNA w odpowiednie wektory fagemidowe, transformację komórek gospodarza tymi zawierającymi cDNA wektorami, hodowanie komórek gospodarza, infekowanie stransformowanych komórek odpowiednim fagiem wspomagającym, wydzielanie faga z hodowli komórek gospodarza, wydzielanie faga, u którego zachodzi

183 855 ekspresja białka według niniejszego wynalazku na jego powierzchni, izolowanie tego faga oraz izolowanie z tego faga zrekombinowanej cząsteczki cDNA.

Wektory fagemidowe konstruuje się stosując opisany przez Vieira, J. i Messinga, J. Methods in Enzymology, 153: 3-11 (1987) wektor ekspresyjny pUC119. Kodujący białko powierzchniowe faga gen 6 faga nitkowatego modyfikuje się w jego końcach 5' i 3' przez dodanie odpowiednio miejsc restrykcyjnych HindIII i SfiI poprzez zastosowanie PCR z wykorzystaniem trzech starterów w odpowiadających miejscom początku replikacji i jednego odpowiadającego miejscu końca replikacji. W wyniku tego otrzymuje się trzy fragmenty DNA, które dalej modyfikuje się metodą PCR przez dodanie do ich końców 3' miejsc restrykcyjnych Notl i BamHI. Po oddzielnym strawieniu trzech fragmentów DNA endonukleazami restrykcyjnymi HindIII i BamHI, trzy fragmenty DNA liguje się w pUC119, otrzymując wektory ekspresyjne pDONG61, pDONG62 i pDONG63. Wektory te pozwalają na wstawianie do nich cDNA w postaci fragmentów Sfil-Notl.

Z naturalnych źródeł, takich jak nicienie, przygotowuje się biblioteki cDNA w sposób opisany w przykładach 2, 9 i 13. Korzystne nicienie do przygotowywania takich bibliotek obejmują, nicienie jelitowe, takie jak Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus i Heligmosomoides polygyrus.

Bibliotekę cDNA w postaci fragmentów można bezpośrednio w określonej orientacji ligować w wektory fagemidowe pDONG61, pDONG62 i pDONG63. Alternatywnie, bibliotekę cDNA, która zligowano w wektorze fagowym lambda gtll jak opisano w przykładzie 2, można odzyskać przez PCR, a następnie wyizolować przez elektroforezę i w określonej orientacji zligować w tych wektorach. W drugim podejściu korzystne warunki PCR obejmują wykorzystanie polimerazy Taq; starterów, startera lambda gtll #1218 posiadającego sekwencję GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 96] i startera oligo(dT)-NotI posiadającego sekwencję AATTCGCGGC CGC(T)₁₅ (Promega Corp.) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 95]; i 20 cykli temperaturowych 1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 3 minuty w temperaturze 72°C, a następnie 10 minut w temperaturze 65°C.

Wektorami ekspresyjnymi pDONG zawierającymi bibliotekę cDNA transformuje się komórki gospodarza. Korzystne komórki gospodarza obejmują szczepy E. coli, przy czym szczególnie korzystny jest szczep TG1. Korzystne metody transformacji komórek gospodarza E. coli obejmują elektroporację.

Stransformowane komórki gospodarza hoduje się w temperaturze 37°C w podłożu LB wzbogaconym o 1% glukozę i 100 mikrogramów/ml karbenicyliny do osiągnięcia wartości absorbancji optycznej 0,5 przy długości fali 600 nm, a następnie infekuje fagiem wspomagającym VCSM13 (Stratagene) przy wielokrotności infekcji (moi) jednej komórki wynoszącej 20 fagów.

Faga wydziela się z hodowli przez wirowanie, następnie oczyszcza przez wytrącenie glikolem polietylenowym/chlorkiem sodowym.

Fagi, u których zachodzi ekspresja NAP według niniejszego wynalazku na na ich powierzchni, izoluje się wykorzystując zdolność NAP do wiązania z białkiem biorącym udział w krzepnięciu krwi, na przykład czynnikiem Xa.

Korzystne metody izolowania takiego faga obejmują metodę obejmującą etapy:

(1) połączenia roztworu czynnika Xa wyznakowanego biotynąz roztworem takiego faga;

(2) inkubowania tej mieszaniny;

(3) zetknięcia z tą mieszaniną fazy stałej wyznakowanej streptawidyną;

(4) inkubowania fazy stałej z mieszaniną;

(5) usuwania fazy stałej z mieszaniny i zetknięcia fazy stałej z buforem w celu usunięcia niezwiązanego faga;

(6) zetknięcia fazy stałej z drugim buforem w celu usunięcia związanego faga z fazy stałej;

(7) izolowania takiego faga;

(8) transformowania komórek gospodarza takim fagiem;

(9) hodowania stransformowanych komórek gospodarza;

183 855 (10) infekowania strcnsformowanych komórek gospodarza fagiem wspomagającym VCSM13;

(11) izolowania faga z hodowli komórek gospodarza; i (12) powtarzania etapów (1) do (11) cztery razy więcej.

Szczególnie korzystna metoda izolowania takiego faga obejmuje metodę opisaną szczegółowo w przykładzie 10.

Z wyizolowanych fagów przygotowano jednoniciowy DNA i zsskwsncjonowano wstawki w kierunku 3' od genu 6 fagów nitkowatych.

Figura 9 przedstawia zrekombinowaną cząsteczkę cDNA, AccNAAc2, wyizolowaną metodą prezentacji przez faga. Na tej figurze przedstawiono również przewidywaną sekwencję aminokwasowąbiałka według niniejszego wynalazku kodowanego przez AccNAA2.

(C) Przygotowywanie zrekombinowanego NAP „ Zrekombinowcne cząsteczki cDNA według niniejszego wynalazku, po wyizolowaniu w sposób tu ujawniony, używa się do uzyskania ekspresji NAP według niniejszego wynalazku. Ogólnie rzecz ujmując, zrekombinowaną cząsteczkę cDNA według niniejszego wynalazku włącza się do wektora ekspresyjnego, ten wektor ekspresyjny wprowadza się do odpowiedniej komórki gospodarza, komórkę gospodarza hoduje się, a następnie izoluje białko ulegające ekspresji.

Wektory ekspresyjne są sekwencjami DNA, które są konieczne dla transkrypcji sklonowanych kopii genów i translacji ich mRNA w komórkach odpowiedniego gospodarza. Za pomocą tych wektorów można uzyskać ekspresję genów zarówno prokariotycznych jak i eukariotycznych w komórkach takich jak bakterie, drożdże, komórki ssaków, roślin i owadów. Ekspresje białek można również uzyskać w licznych układach wirusowych.

Właściwie skonstruowane wektory ekspresyjne zawierają miejsce początku replikacji umożliwiające autonomiczną replikację w komórkach gospodarza lub są zdolne wbudowywać się do chromosomów komórek gospodarza. Takie wektory powinny również zawierać markery, selekcyjne, ograniczoną ilość użytecznych miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne, występować w dużej ilości kopii i posiadać silne promotory. Promotory są sekwencjami DNA, które kierują wiązaniem polimerazy RNA z DNA i rozpoczęciem syntezy RNA; silne promotory powodują, że rozpoczynanie syntezy RNA zachodzi z dużą częstością. Preferowane wektory ekspresyjne według niniejszego wynalazku są połączone w sposób umożliwiający działanie z cząsteczką zrekombinowanego cDNA według niniejszego wynalazku, to znaczy wektory te są zdolne do kierowania zarówno replikacją przyłączonego odcinka cDNA jak i ekspresją białka kodowanego przez zrekombinowaną cząsteczkę cDNA. Wektory ekspresyjne mogą obejmować, ale nie są ograniczone do wektorów klonujących, zmodyfikowanych wektorów klonujących i specjalnie skonstruowanych plazmidów i wirusów.

Odpowiednie komórki gospodarza do ekspresji białek według niniejszego wynalazku obejmują bakterie, drożdże, komórki ssaków, roślin i owadów. Jak to zostanie ujawnione poniżej, dla każdego typu komórek i gatunku w ich obrębie odpowiednie są określone wektory ekspresyjne.

Do ekspresji białek według niniejszego wynalazku można wykorzystywać organizmy prokariotyczne. Odpowiednie komórki gospodarzy bakteryjnych obejmują różne szczepy E. coli, Bacillus subtiiis, i różne gatunki Pseudomonas. W tych układach stosuje się wektory plazmidowych zawierające miejsca replikacji i sekwencje kontrolne pochodzące z gatunków kompatybilnych z gospodarzem. Odpowiednimi wektorami dla E. coli są pochodne pBR322, plazmidu uzyskanego z E. coli przez Bolivara i in., Gene, 2: 95 (1977). Do powszechnych prokariotycznych sekwencji kontrolnych, które zdefiniowano w niniejszym opisie jako obejmujące promotory dla transkrypcji, inicjacji, ewentualnie operatory, oraz sekwencje zawierające miejsca wiązania dla rybosomów zalicza się układy promotorów beta-laktcmczowy i laktozowy (Chang i in., Naturę, 198: 1056 (1977)), układ promotora tryptofanowego (Goeddel i in., Nucleic Acid Res., 8: 4057 (1980)) oraz pochodzący z faga lambda promotor P_L i miejsce wiązania rybosomu genu N (Shimatcke i inni, Naturę, 292: 128 (1981)). Niemniej jednak, użyć można każdego dostępnego układu promotorowego działającego w komórkach

183 855 prokariotycznych. Do preferowanych prokariotycznych układów ekspresyjnych zalicza się E. coli i jej wektory ekspresyjne.

Do ekspresji białek według niniejszego wynalazku można wykorzystywać organizmy eukariotyczne. Są one zazwyczaj reprezentowane przez komórki drożdży i ssaków. Odpowiednie komórki gospodarzy drożdżowych obejmują Saccharomyces cerevisiae i Pichia pastoris. Odpowiednie ssacze komórki gospodarza obejmuj, komórki COS i CHO (komórki z jajnika chomika chińskiego).

Wektory ekspresyjne dla eukariontów zawierają promotory pochodzące z odpowiednich genów eukariotycznych. Odpowiednie promotory dla wektorów ekspresyjnych komórki drożdży obejmują promotory dla syntezy enzymów glikolitycznych, wliczając w to promotory genu kinazy 3-fosfoglicerynianu z Saccharomyces cerevisiae (Hitzman i in., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) oraz promotory genów metabolizmu metanolu jak gen oksydazy alkoholowej z Pichia pastoris (Stroman i in., zgłoszenia patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 808 537 i 4 855 231). Inne odpowiednie promotory to promotor genu enolazy (Holland, M. J. i in., J. Biol. Chem., 256: 1385 (1981)) lub promotor genu Leu2 otrzymany z YEpl3 (Broach, J. i in., Gene, 8: 121 (1978)).

Preferowane układy ekspresyjne drożdży obejmu ją Pichia pastoris i jej wektory ekspresyjne. Ulegające ekspresji w Pichia pastoris cDNA kodujące NAP mogą być ewentualnie zmutowane tak, że koduj, białko NAP zawierające resztę proliny przy końcu C. W niektórych przypadkach białko NAP ulega ekspresji z większą wydajnością i może być bardziej odporne na niepożądaną proteolizę. Jeden taki cDNA i jego ekspresję w Pichia pastoris, opisano w przykładzie 17.

Odpowiednie promotory dla wektorów ekspresyjnych komórki ssaczej obejmują wczesny i późny promotor SV40 (Fiers i in., Nature, 273: 113 (1978)) lub inne promotory wirusowe na przykład pochodzące z wirusa polyoma, adenowirusa II, wirusa brodawczaka bydła czy wirusów mięsaka ptasiego. Do takich wektorów ekspresyjnych mogą być również włączone wirusowe lub ssacze sekwencje wzmacniające.

Odpowiednie promotory dla wektorów ekspresyjnych komórki roślinnej obejmują promotor syntezy nopaliny opisany przez Depickera, A. i in., Mol. Appl. Gen., 1: 561 (1978).

Odpowiednie promotory dla wektorów ekspresyjnych komórki owadziej obejmują zmodyfikowane wersje układu opisanego przez Smitha i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 745 051. Wektor ekspresyjny zawiera promotor poliedryny bakulowirusa, pod kontrolą którego można umieścić cząsteczkę cDNA kodującego białko.

Komórki gospodarza transformuje się przez wprowadzenie do nich wektorów ekspresyjnych według niniejszego wynalazku.

Transformacji dokonuje się używając standardowych technik odpowiednich dla każdego typu komórki. Traktowanie wapniem, z użyciem chlorku wapnia opisane przez Cohena, S.N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972), lub metoda z użyciem RbCI opisana przez Maniatisa i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manul, str. 254, Cold Spring Harbor Press (1982) stosuje się w przypadku prokariontów lub innych komórek posiadających istotne bariery w postaci ściany komórkowej. Transformacje drożdży przeprowadza się tak jak opisano w Van Solingen, P. i in., J. Bacter., 130: 946 (1977) oraz w Hsiao, C. L. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3829 (1979). Komórki ssaków nie posiadające ściany komórkowej transformuje się stosując procedurę, wykorzystującą fosforan wapnia, Grahama i van der Eb, Virology, 52: 546 (1978). Komórki roślinne transformuje się poprzez infekcję Agrobacterium tumefaciens, jak opisano w.Shaw, C. i in., Gene, 23: 315 (1983). Do korzystnych metod transformacji E. coli i Pichia pastois zalicza się elektroporację.

Stransformowane komórki gospodarza hoduje się w warunkach, uwzględniających rodzaj podłoża, temperaturę, zawartość tlenu, ruch płynu itd., dobrze znanych w dziedzinie biologii.

Zrekombinowane białka według niniejszego wynalazku izoluje się z komórki gospodarza lub z podłoża stosdjąc standardowe metody dobrze znane w biochemii, do których zalicza się metody chromatograficzne. Korzystne metody oczyszczania obejmują kolejne, następujące po sobie chromatografie ekstraktu na kolumnach zawierających anionowe złoże jonowymienne

183 855

Poros20 HQ lub złoże kytionowymieaae Poros20 HS, żel do filtracji Supeedkx30 i złoże C18 do chromatografii z odwróconymi fazami. Frakcje zbierane z każdej takiej kolumny chromatograficznej można selekcjonować na podstawie ich zdolności do zwiększania czasu krzepaikaiy ludzkiego osocza, mierzonego w oznaczeniach PT i aPTT, lub na podstawie ich zdolności do hamowania aktywności ymifolityczaej czynnika Xa, mierzonej w oznaczeniu kolorymetrycznym, lub przez wykazanie aktywności w jakimkolwiek innym oznaczeniu ujawnionym w niniejszym opisie, przykłady korzystnych metod oczyszczania zeekombinowa4ego białka według niniejszego wynalazku ujawniono w przykładach 3, 4, 6, 8, 14, i 15.

4. Metody stosowania NAP

W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek obejmuje metody zbierania osocza ssaków w taki sposób, że krzepnięcie rzeczonego osocza jest zahamowane, obejmujące dodawanie do probówki pewnej ilości białka według niniejszego wynalazku wystarczającej do zahamowania tworzenia się skrzepu po dodaniu do probówki krwi ssaka, dodawanie kiwi ssaka do rzeczonej probówki, oddzielanie czerwonych krwinek od osocza ssaka i zbieranie osocza.

Probówki do zbierania krwi obejmują probówki testowe zaopatrzone w korek, z których usunięto powietrze, aby umożliwić wciągnięcie do ich wnętrza krwi uzyskanej poprzez nakłucie żyły. Korzystne probówki testowe obejmują probówki wykonane ze szkła borokr-zemowego o wymiarach na przykład: 10,25 x 47 mm, 10,25 x 50 mm, 10,25 x 64 mm, 10,25 x 82 mm, 13 x 75 mm, 13 x 100 mm, 16 x 75 mm, 16 x 100 mm lub 16 x 125 mm. Najlepszymi korkami są korki, które można łatwo przekłuć igłą do pobierania krwi i które, zapewniają zamknięcie uniemożliwiające w4Ikyaie powietrza do probówki.

Białka według niniejszego wynalazku dodaje się do probówek do zbierania krwi różnych postaciach, dobrze znanych w tej dziedzinie, takich jak ich płynna kompozycja, stała kompozycja lub płynna kompozycja zliofilizowy4y w probówce do postaci stałej. Ilość dodawana do takich probówek jest ilością wystarczająca do zahamowania powstawania skrzepu, gdy do probówki wprowadzi się krew ssaka. Białka według niniejszego wynalazku dodaje się do probówek do zbierania krwi w takich ilościach aby, po dodaniu 2 do 10 ml krwi ssaków, stężenie takich białek było wystarczające do zahamowania powstawaniu skrzepu. Zazwyczaj to skuteczne stężenie będzie wynosić od 1 do 10 000 nM, przy czym najlepsze jest stężenie wynosi 10 do 1000 nM. Alternatywnie, białko według niniejszego wynalazku można dodawać do takich probówek w połączeniu z innymi dodatkami hamującymi powstawanie skrzepu takimi jak: sole heparyny, sole EDTA, sole nyteyaiyau lub sole szczawianu.

Po dodaniu krwi ssaka do probówki zawierającej białko według niniejszego wynalazku, lub to samo białko w połączeniu z innymi czynnikami pezeclwkezepliwymi, oddziela się przez przez wirowanie krwinki czerwone od osocza ssaka. Wirowanie przeprowadza się stosując przyspieszenia g, temperatury i czasy dobrze znane w tej dziedzinie medycyny. Typowe warunki służące do oddzielenia czerwonych krwinek od osocza obejmują wirowanie przy przyspieszeniu od około 100 x g do około 1500 xg, w temperaturze od około 5 do około 25°C, w czasie od około 10 do 60 minut.

Osocze ssaka zbiera się zlewając do osobnego pojemnika, pobierając pipetą lub w inny sposób dobrze znany specjalistom w dziedzinie medycyny.

W innym aspekcie niniejszy wynalazek obejmuje metody zapobiegania lub hamowania zakrzepicy (tworzenia zakrzepu) lub krzepnięcia krwi w organizmie ssaka, obejmujące podawanie rzeczonemu ssakowi terapeutycznie skutecznej ilości białka lub kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku.

Białka lub kompozycje fyemaceutynzad według niniejszego wynalazku podaje się in vivo, zazwyczaj ssakom, a korzystnie ludziom. Przy stosowaniu ich in vivo, białka lub kompozycje farmaceutyczne można podawać ssakowi różnymi drogami, na przykład doustnie, pozajelitowo, dożylnie, podskórnie, domięśniowo, dookrężniczo, doodbytniczo, do nosa albo dootrzewnowe, wykorzystując różne postacie dawkowania. Korzystne jest podawanie pozajelitowe, takie jak codzienne podawanie dożylne. Alternatywnie, korzystne jest podawanie doustne w postaci przyjmowanych codziennie tabletek, kapsułek lub eliksirów.

Przy praktycznym stosowaniu metod według niniejszego wynalazku, białka lub kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku podaje się same lub w połączeniu ze

183 855 sobą bądź łącznie z innymi czynnikami terapeutycznymi lub służącymi do diagnostyki in vivo.

Dla specjalisty w dziedzinie medycyny jest oczywiste, że terapeutycznie skuteczna ilość białek lub kompozycji farmaceutycznych według niniejszego wynalazku będzie w znacznym stopniu zależna od wieku, wagi i gatunku leczonego ssaka, jak również od rodzaju podawanych białek, sposobu ich podania, oczekiwanych efektów i wskazań terapeutycznych. Ponieważ powyższe czynniki i ich wspólny wpływ na ustalenie takiej ilości są dobrze znane w medycynie, określenie poziomów terapeutycznie skutecznych dawek, ilości koniecznej dla osiągnięcia pożądanego efektu zapobiegnięcia zakrzepicy, będzie możliwe dla każdego specjalisty w tej dziedzinie.

Zazwyczaj podawanie białek lub kompozycji farmaceutycznych według niniejszego wynalazku rozpoczyna się od niskich poziomów dawek, które zwiększa się, aż do uzyskania pożądanego efektu zapobiegnięcia zakrzepicy in vivo, co zarazem określa skuteczną terapeutycznie ilość. Dla białek według niniejszego wynalazku, stosowanych oddzielnie lub jako część kompozycji farmaceutycznej, takie dawki mieszczą się w granicach około 0,01 mg/kg do 100 mg/kg wagi ciała, korzystnie w granicach od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg wagi ciała.

5. Użyteczność

Białka według niniejszego wynalazku, otrzymane i wyselekcjonowane w ujawniony tu sposób, są użyteczne jako skuteczne inhibitory krzepnięcia krwi in vitro i in vivo. Jako takie, białka te są użyteczne in vitro jako odczynniki diagnostyczne do zapobiegania krzepnięciu krwi oraz in vivo jako środki farmaceutyczne zapobiegające lub hamujące zakrzepicę lub krzepnięcie krwi u ssaków.

Białka według niniejszego wynalazku są użyteczne jako odczynniki diagnostyczne in vitro do hamowania krzepnięcia krwi pobranej do probówek. Użycie zakorkowanych probówek testowych z próżnią która służy do wciągnięcia do wewnątrz krwi otrzymanej przez nakłucie żyły, jest dobrze znane w medycynie. Kasten, B. L., Specimen Collection, Laboratory Test Handbook, Wydanie II, Lexi-Copm. Inc., Cleveland str. 16-17 (Wydawcy, Jacobs, D. S. i in., 1990). Takie probówki mogą nie zawierać dodatków przeciwkrzepliwych, służą wówczas do izolowania surowicy z krwi ssaków. I na odwrót, mogą zawierać dodatki przeciwkrzepliwe (takie jak sole heparyny, sole EDTA, sole cytrynianu czy sole szczawianu) służąc wówczas do izolowania osocza z krwi ssaków. Białka według niniejszego wynalazku są skutecznymi inhibitorami krzepnięcia krwi i jako takie mogą być dodawane do probówek do zbierania krwi, aby zapobiec krzepnięciu pobranej do nich krwi ssaka.

Białka według niniejszego wynalazku stosuje się pojedynczo, w połączeniu z innymi białkami według niniejszego wynalazku lub w połączeniu z innymi znanymi inhibitorami krzepnięcia krwi stosowanymi w probówkach do zbierania krwi, na przykład z solami heparyny, solami EDTA, solami cytrynianu lub solami szczawianu.

Ilość dodawana do takich probówek, inaczej ilość skuteczna, jest to ilość wystarczająca dla zahamowania powstawania skrzepu krwi, gdy krew zostaje wciągnięta do probówki. Białka według niniejszego wynalazku dodaje się do probówek do pobierania krwi w takich ilościach, aby po połączeniu z 2 do 10 ml krwi ssaka ich stężenie było wystarczające do zahamowania powstawania zakrzepów. Zazwyczaj ta skuteczna ilość jest to ilość konieczna do osiągnięcia końcowego stężenia we krwi od około 1 do 10 000 nM, przy czym korzystna jest ilość od 10 i 1000 nM.

Białka według niniejszego wynalazku mogą również służyć do przygotowania kompozycji diagnostycznych. W jednym z takich rozwiązań, kompozycje diagnostyczne przygotowuje się przez rozpuszczenie białek według niniejszego wynalazku w akceptowanych diagnostycznie nośnikach, do których zalicza się roztwór soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem (0,01 M fosforan sodowy + 0,15 M chlorek sodowy, pH 7,2), albo roztwór soli fizjologicznej zbuforowany Trisem (0,05 M Tris-HCl + 0,15 M chlorek sodowy, pH 8,0). W innym rozwiązaniu białka według niniejszego wynalazku mogą być zmieszane z innymi diagnostycznie akceptowanymi nośnikami w postaci stałej, przy użyciu metod dobrze znanych w tej dziedzinie, prowadzać do uzyskania kompozycji diagnostycznych w postaci stałej. Do takich nośników zalicza się sole buforów.

183 855

Dodawanie białek według niniejszego wynalazku do probówek do pobierania krwi można przeprowadzić dobrze znanymi metodami, które to metody obejmują wprowadzenie do probówki zawierającej js płynnej kompozycji diagnostycznej, kompozycji diagnostycznej w postaci stałej lub kompozycji płynnej, którą liofilizuje się w probówce do kompozycji diagnostycznej w postaci stałej.

Stosowanie probówek do pobierania krwi zawierających kompozycje diagnostyczne według niniejszego wynalazku, obejmuje połączenie skutecznej ilości takiej kompozycji diagnostycznej z krwią ssaka pobraną do probówki. Zazwyczaj, jeżeli do probówki pobierzs się próbkę o objętości 2 do 10 ml krwi ssaka i połączony z taką kompozycją diagnostyczną, skuteczna ilość będzie odpowiadać tym stężeniom białek zawartych w kompozycji diagnostycznej, które są wystarczające do zahamowania powstawania skrzepów w próbce krwi. Korzystne skuteczne stężenia wynoszą około 1 do 10 000 nM, szczególnie korzystne wynoszą od 10 do 1000 nM.

Zgodnie z innym aspektem naszego wynalazku, białka według niniejszego wynalazku są również użyteczne jako czynniki farmaceutyczne do zapobiegania lub hamowania zakrzepicy lub krzepnięcia krwi u ssaków. To zapobieganie lub hamowanie zakrzepicy czy krzepnięcia krwi obejmuje również zapobieganie lub hamowanie nienormalnej zakrzepicy.

Stany znamionujące nienormalną zaktrzspicę są dobrze znane w medycynie i obejmują układ naczyń tętniczych i żylnych u ssaków. W odniesieniu do naczyń tętnic wieńcowych, nienormalna zakrzepica (tworzenie zakrzepów) charakteryzuje się pęknięciem istniejącej płytki miażdżycowej, co stanowi główną przyczynę nagłego zawału serca i nieustabilizowanej dusznicy bolesnej, jak również charaktsryzujs się tworzeniem zamykającego zakrzepu wieńcowego będącej wynikiem albo terapii trombolitycznej albo podskórna angioplastyka światła naczyń wieńcowych (PTCA). W odniesieniu do naczyń żylnych nienormalna zakrzepica opisuje stan obserwowany u pacjentów, u których przeprowadzono poważne operacje chirurgiczne w kończynach dolnych lub w okolicy brzucha, którzy często cierpią z powodu powstania zakrzepu w naczyniach żylnych, powodującego zmniejszenie krążenia krwi w tych kończynach oraz z powodu predyspozycji do zatorów płucnych. Nienormalną zakrzepicę cechuje ponadto rozsiana koagulopatia wewnątrznaczyniowa, która zwykle występuje w obu systemach naczyniowych podczas wstrząsu septycznego, niektórych infekcji wirusowych i raka, stan, który objawia się szybkim zużyciem czynników krzepnięcia i ogólnoustrojowym krzepnięciem krwi powodującym powstawanie zagrażających życiu zakrzepów występujących w całej mikronaczyniówce i prowadzących do niewydolności wielu organów.

Białka NAP według niniejszego wynalazku są również użytecznymi immunogenami, przeciw którym można uzyskać przeciwciała. Przeciwciała, zarówno monoklonalns jak i poliklonalns, skierowane wobec NAP są użyteczne dla celów diagnostycznych i dla oznaczania poziomu stężenia NAP w różnych płynach biologicznych. Oznaczenia immunologiczne z użyciem takich przeciwciał mogą być stosowane jako testy diagnostyczne, takie jak do wykrywania infekcji organizmu gospodarza, będącego ssakiem przez pasożytniczego robaka lub do wykrywania NAP pochodzącego z pasożytniczego robaka w tkance organizmu gospodarza, będącego ssakiem. A więc, takie oznaczenia immunologiczne można również stosować do wykrywania i izolowania NAP z homogenatów tkankowych, klonowanych komórek i tym podobnych.

NAP, z odpowiednim adiuwantsm, można stosować jako szczepionkę przeciw infekcjom pasożytniczym u ssaków. Immunizację z użyciem szczepionki NAP można stosować zarówno w profilaktyce jak i terapii infekcji pasożytniczych. Objawy choroby wywołanej przez robaki pasożytnicze można leczyć przez podanie zainfekowanemu zwierzęciu przeciwciał skierowanych przeciw NAP pasożyta.

Białka NAP według niniejszego wynalazku posiadające aktywność hamującą proteazy serynows, są rówisż użyteczne w stanach, bądź oznaczeniach, w których pożądane jest hamowanie proteaz serynowych. Na przykład białka NAP hamujące aktywność proteaz ssrynowych trypsyny i elastazy są użyteczne w lsczsniu, odpowiednio, ostrego zapalenia trzustki lub ostrego stanu zapalnego, w którym pośredniczą leukocyty.

183 855

Zrekombinowane cząsteczki cDNA kodujące białka według niniejszego wynalazku są użyteczne również w aspekcie izolowania innych zrekombinowanych cząsteczek cDNA, które również kodują białka według niniejszego wynalazku. W innym aspekcie są one użyteczne do ekspresji białek według niniejszego wynalazku w komórkach gospodarza.

Sondy nukleotydowe według niniejszego wynalazku są użyteczne do identyfikacji i izolacji kwasów nukleinowych kodujących NAP z nicieni i innych organizmów. Ponadto sondy nukleotydowe mogą służyć jako odczynniki diagnostyczne do wykrywania obecności kwasów nukleinowych nicieni w próbce takiej jak płyn ustrojowy lub tkanka pochodząca od ssaka, u którego podejrzewa się zainfekowanie nicieniami. Sondy, odpowiednio wyznakowane dla umożliwienia detekcji, można stosować bezpośrednio do wykrywana obecności kwasów nukleinowych nicienia, lub w sposób pośredni, na przykład w reakcji typu PCR, dla powielenia kwasu nukleinowego nicienia, który może być obecny w badanej próbce. Warunki przeprowadzania takich metod i testów diagnostycznych są łatwo dostępne w tej dziedzinie.

Aby pomóc w zrozumieniu, niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany przez podane niżej przykłady, przykładów tych, jakkolwiek odnoszą się one do niniejszego wynalazku, nie należy interpretować jako specyficznie ograniczających ten wynalazek i takie zmiany w wynalazku jakie znane są obecnie lub zostaną wprowadzone w przyszłości, a będące w zakresie możliwości specjalisty w tej dziedzinie, uważać się będzie za wchodzące w zakres opisanego tu wynalazku i podanych dalej zastrzeżeń.

P rzykłady

Przykład 1

Izolowanie nowego białka przeciwkrzepliwego (NAP) z Ancylostoma caninum (A) Przygotowanie lizatu Ancylostoma caniumum

Zamrożone tęgoryjce dwunastnicy psa, Ancylostomac aninum, uzyskano z Antibody Systems (Bedford, TX). Do czasu przygotowania homogenatu tęgoryjce przechowywano w temperaturze -80°C.

Tęgoryjce dwunastnicy zamrożono w ciekłym azocie, rozdrobniono w moździerzu, a następnie homogenizowano na lodzie w buforze do homogenizacji stosując homogenizator Pottera z tłokiem teflonowym (B. Braun Melsungen AG, Niemcy). Bufor do homogenizacji zawierał: 0,02 M Tris-HCl pH 7,4, 0,05 M NaCl, 0,001 M MgCl₂,, 0,001 M CaCl₂, 1,0 x 10 ⁵M inhibitor proteaz E-64 (Boehringer Mannheim, Niemcy), 1,0 x 10'⁵M pepstatynę A (kwas izowalerylo-Val-Val-4-amino-3-hydroksy-6-metylo-heptanoilo-Ala-4-amino-3-hydroksy-6metyloheptanowy, ICN Biomedicals, CA), 1,0 x chymostatynę (Boehringer), 1,0 x 10'5

M leupeptynę (ICN), 5 x 10‘5 M AEBSF (fluorek 4-(2-aminoetylo)benzenosulfonowy, ICN) oraz 5% (v/v) glicerol. Na każdy gram zamrożonych robaków (około 500 sztuk) użyto około 4 ml buforu do homogenizacji. Nierozpuszczalny materiał odwirowano w dwóch następujących po sobie wirowaniach: przy 19 000 x g_m;ix w temperaturze 4°C w ciągu 30 minut, a następnie przy 110 000 x gm_;ix, w temperaturze 4°C w ciągu 40 minut. Aby uzyskać lizat Ancylostoma caniumum roztwór supematantu klarowano przepuszczając przez filtr z octanu celulozy o średnicy porów 0,45 mikrometra Corning, NY).

(B) Chromatografia na konkanawalinie A-Sepharose

Lizat Ancylostoma caniumum (100 ml) naniesiono przy szybkości przepływu wynoszącej 3 ml/na minutę (90 cm/na godzinę) na kolumnę o wymiarach 1,6 x 11 cm, wypełnioną 22 ml konkanawaliny A-Sepharose (Pharmacia, Szwecja), uprzednio zrównoważoną buforem Con A (0,02 M Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 0,002 M CaCl₂). Kolumna znajdowała się w temperaturze otoczenia, podczas gdy pojemnik z lizatem utrzymywano w temperaturze łaźni lodowej przez cały czas trwania doświadczenia. Kolumnę przemyto następnie dwiema objętościami buforu Con A. Frakcję niezwiazaiąz kolumną oraz wymytą (około 150 ml) zebrano i przechowywano w temperaturze - 80°C do czasu wykonywania dalszych etapów procedury.

(C) Chromatografia anionowymienna

Frakcję niezwiazaną i wymytą z kolumny z konkanawalmą A-Sepharose zbuforowano dodając octanu sodu w postaci stałej, do końcowego stężenia wynoszącego 12,5 mM. Zmniejszono przewodnictwo poprzez rozcieńczenie wodą miliQ i doprowadzono pH do wartości 5,3 używając HCl. Osad powstały podczas doprowadzania pH odwirowano przy 15 000 x g_ril.a w

183 855 ciągu 15 minut w temperaturze 4°C. Roztwór supematantu sklarowano, przepuszczając przez filtr z octanu celulozy o średnicy porów 0,2 mikrometra (Corning, NY).

Ten sklarowany roztwór (całkowita objętość około 600 ml) naniesiono na kolumnę Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA) o · wymiarach 1 x 2 cm zrównoważoną buforem anionowym (0,05 M octan sodu, pH 5,3, 0,1 M NaCl) przy szybkości przepływu wynoszącej 10 ml/minutę (800 cm/godzinę). Podczas tego etapu oczyszczania zarówno kolumna jak i nanoszony roztwór posiadały temperaturę otoczenia. Kolumnę przemyto następnie 10 objętościami buforu anionowego.

Materiał wykazujący aktywność hamującą, wykrytą w oznaczeniu amidolitycznym czynnika Xa wykonanym według opisanej poniżej procedury, wymyto z kolumny buforem kationowym zawierającym 0,55 M NaCl z szybkością przepływu wynoszącą 5 ml/minutę (400 cm/godzinę). Próbkę roztworu testowano poprzez oznaczenie amidolityczne czynnika Xa w następujący sposób. Mieszaniny reakcyjne (150 mikrolitrów) zawierające czynnik Xa oraz różne rozcieńczenia próbki w buforze do oznaczeń (100 mM Tris-HCl pH 7,4; 140 mM NaCl 0,1% BSA) przygotowywano w 96-studzienkowych płytkach. Ludzki czynnik X zakupiono w Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN, USA) i zaktywowano jadem żmiji Russella zgodnie z procedurą opisaną w Bock, P. E., Craig, P. A., Olson, S. T., i Singh P., Arch. Biochem. Biophys., 273: 375-388 (1989). Po 30 minutowej inkubacji w temperaturze otoczenia reakcję enzymatyczną inicjowano przez dodanie 50 mikrolitrów 1 mM roztworu substratu w wodzie (p-nitro-anilidodihydrochlorek N-alfa-benzyloksykarbonylo-D-arginylo-L-glicylo-Largininy; S-2765; Chromogenix, Molndal, Szwecja), uzyskując 0,2 nM końcowe stężenie czynnika Xa i 0,25 mM końcowe stężenie S-2765. Hydrolizę substratu monitorowano poprzez ciągły pomiar absorbancji przy długości fali 405 nm przy użyciu kinetycznego czytnika płytek z odczytem wartości Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA).

(D) Traktowanie wysoką temperaturą

Połowę (3 ml) połączonych frakcji wyeluowanych 0,55 M NaCl podczas chromatografii anionowymiennej zobojętniono przez dodanie 1 M Tris-HCl, pH 7,5 do osiągnięcia końcowego stężenia wynoszącego 50 mM, inkubowano w ciągu 5 minut w temperaturze 90° C w szklanej probówce, a następnie szybko schłodzono na lodzie. Nierozpuszczony materiał odwirowano przy 19 000 x g_m;,_x w ciągu 20 minut w temperaturze 4°C. Supernatant zawierał materiał, który hamował czynnik Xa w oznaczeniu amidolitycznym czynnika Xa. Po traktowaniu wysoką temperaturą biorąc pod uwagę rozcieńczenie, w supematancie odzyskano około 89% aktywności hamującej czynnik Xa.

(E) Sączenie molekularne z użyciem Superdex30 (alternatywa dla etapu traktowania wysoką temperaturą)

Połowę (3 ml) frakcji wymytej 0,55 M NaCl z kolumny anionowymiennej naniesiono na kolumnę Superdex30 PG (Pharmacia, Szwecja) o wymiarach 1,6 x 66 cm uprzednio zrównoważoną 0,01 M fosforanem sodowym, pH 7,4, 0,15 M NaCl w temperaturze 24°C. Chromatografię prowadzono z szybkością przepływu wynoszącą 2 ml/ minutę. Aktywność hamująca czynnik Xa (oznaczona w oznaczeniu amidolitycznym czynnika Xa) wymyto pomiędzy 56-64 mililitrem eluatu (Kav wynosi 0,207). Takiej objętość elucji należałoby oczekiwać dla białka globulamego o masie cząsteczkowej wynoszącej 14 000 daltonów.

(F) Chromatografia z odwróconymi fazami

Lizat uzyskany z tęgoryjca dwunastnicy, który podzielono na frakcje przez chromatografię na konkanawalinie A-Sepharose, chromatografię anionowymienną i chromatografię na Superdex30 (lub traktowany wysoką temperaturą) nałożono na kolumnę Cl 8 (218TP54, Vydac; Hesperia, CA), którą następnie eluowano liniowym gradientem 10%-35% acetonitrylu w 0,1% (v/v) kwasie trójfiuorooctowym z szybkością przepływu wynoszącą 1 ml/minutę i zmianą stężenia acetonitrylu o 0,625% na minutę. Aktywność hamująca czynnik Xa (oznaczona w oznaczeniu amidolitycznym czynnika Xa) uległa elucji w około 30% stężeniu acetonitrylu. HPLC wykonywano stosując Vista 5500 połączony z detektorem Polychrom 9600 ustawionym na długość fali 215 nm (Varian, CA). Sygnały detektora przesyłane były do integratora model 4290 tej samej firmy. Frakcje zawierające aktywność hamującą czynnik Xa

183 855 suszono pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie rozpuszczano w PBS (0,01 M fosforan sodowy, pH 7,4, 0,15 M NaCl).

Frakcje te łączono a następnie nakładano na kolumnę C18 (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) o wymiarach 0,46 x 25 cm i eluowano liniowym gradientem 10-35% acetonitrylu w 0,1% kwasie trójfiuorooctowym z szybkością przepływu 1 ml/minutę i wolniejszą zmianą stężenia acetonitrylu wynoszącą 0,4% na minutę. Frakcje zawierające aktywność hamującą czynnik Xa łączono, a następnie suszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

(G) Oznaczanie masy cząsteczkowej NAP z Ancylostoma caninum

Szacunkową masę NAP wyizolowanego jak opisano w tym przykładzie określano przez elektrorozpyłowej jonizacyjnej spektrometrii masowej.

Osuszony pod zmniejszonym ciśnieniem osad NAP rozpuszczono w 50% (v/v) acetonitrylu, 1% (v/v) kwasie mrówkowym. Analizę masową wykonano używając VG Bio-Q (Fisons Instruments, Manchester, Wielka Brytania).

Próbkę NAP przepompowano przez kapilcrę na której końcu przykładano wysokie napięcie wynoszące 4 kV. Pod wpływem silnego pola elektrycznego, próba ulegała rozpyleniu na kropelki zawierające cząsteczki białka Na skutek osuszającego wpływu gazu obojętnego (N₂) w temperaturze 60°C, wielkość kropli malała, aż do momentu gdy cały rozpuszczalnik wyparował i pozostało tylko białko w formie gazowej. Utworzyła się populacja cząstek białka różniących się między sobą jednym ładunkiem. Przy pomocy analizatora kwadrupolowegooznaczono różne wartości stosunku Dc/e (masc/ładunek). Instrument kalibrowano przy użyciu mioglobiny z serca konia (Sigmą Missouri).

Szacunkowa masa białka NAP wyizolowanego jak opisano w paragrafach A, B, C, D, i F tego przykładu wynosi 8734,60 daltonów. Szacunkowa masa natywnego białka NAP wyizolowanego jak opisano w paragrafach A, B, C, E i F wynosi 8445,67 daltonów.

(H) Określanie sekwencji aminokwasowej białka NAP z Ancylostoma caninum

Sekwencję aminokwasową określono stosując Arotein/Aeptids Sequencer 476-A z On

Board Microgradient PTH Analyzer i Data Analysis System model 610A (Applied Biosystems, CA). Ilościową ocenę reszt przeprowadzono poprzez analizę bezpośrednią z zastosowaniem komputera wchodzącego w skład układu (Applied Biosystems, CA); przporządkowania reszt aminokwasowych dokonano przez wzrokową analizy chromatogramów HPLC. Określono, że pierwsze dwudzieścia aminokwasów końca aminowego natywnego białka NAP jest następujących:

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly Thr Gln Lys Pro [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 97],

W analizie tej nie stwierdzono bezpośrednio obecności reszt cysternowych, gdyż nie przeprowadzono redukcji, a następnie alkilacji próbki. Reszty cysternowe przyporządkowano pozycjom, w których nie zidentyfikowano żadnego specyficznego aminokwasu.

Przykład 2

Klonowanie i sekwencjonowanie NAP z Ancylostoma caninu.

(A) Przygotowanie sondy hybrydyzacyjnee

Klony pełnej długości cDNA kodującego NAP wyizolowano poprzez przeszukiwanie biblioteki cDNA, przygotowanej z mRNA nicienia, Ancylostoma caninum;, wyznakowaną promieniotwórczo zdegenerowaną sondą oligonukleotydową, której sekwencję ustalono w oparciu o pierwszych jedenaście aminokwasów końca aminowego NAP z A. caninum:

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 93].

Oligonukleotydową sonda hybrydyzacyjna o długości 33 zasad, oznaczona jako YG99, miała następującą sekwencję:

AAR GCi TAY CC i GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 94] gdzie R oznacza A lub G; Y oznacza T lub C; i i oznacza inozynę. YG99 wyznakowano promieniotwórcze przez enzymatyczną fosforylację końca 5' (zestaw do znakowania końca 5', Amersham, Buckinghamshire, Anglia) stosując gamma-³²A-ATA (aktywność wła48

183 855 ściwa > 7000Ci/mmol; ICN, Costa Mesa, CA, USA), a następnie przepuszczono przez kolumnę NAP™10 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja).

(B) Przygotowywanie biblioteki cDNA

Bibliotekę cDNA skonstruowano wykorzystując opisane procedury (Promega Protocols and Applications Guide, Wydanie II; Promega Corp., Madison, WI, USA).

Dorosłe tęgoryjce dwunastnicy, Ancylostoma caninum, zakupiono od Antibody Systems (Bedford, TX) . Poly(A+) rna przygotowano przy użyciu esttawu do oczyzzczania mRNA QuickPrep (PhαpmazCz). Około 3 mlkpggpamż mRNA poddano procesowi odwrotnej transkrypcji stosując starter-adaptor gligg(dT)-NotI o sekwencji AATTCGCGGCCGC(T)15 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 95], (Promega Corp.) oraz odwrotną tPZRskrżptacę AMV (wirusa ptasiej mieloblzytocż), (Boehringer, Mannheim, Niemcy). Do syntezy dwuniciowegg cDNA użyto następujących enzymów: polimerzrż DNA Iz E. coli i RNazy H zakupionych w Life Technologies (Gzithepsbourg, MD, USA) oraz polimerzrż DNA T4 firmy Phzpmzziz.

Łązcncki EcoRI (pCGGAATTCCCG) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 98] zligowaao z cDNA otrzymanym po traktowaniu metylaz, EcoRI ( Riboclone EcoRI Linker Ligztion System; Promega).

cDNA strawiono enzymami Notl i EcoRI, poddawano elektroforezie na 1,5% żelu agarozowym (cały materiał o odpowiedniej długości eluowaRo z żelu zgodnie z przepisem GeneclezR, BI0W1 Inc., La Jollą, CA), z następnie jednokierunkowo ligowaRo z uzyskanymi w wyniku trawienia EcoRI i Notl ramionami wektora lambda gtl 1 Sfi-Notl (Promega). Po upakowaniu in vitro ^gapac^Go^, Stpztzgene, La Jolla, CA), ^kombinowanego faga otrzymywano przez zainfekowanie szczepu Y1090 (Promega).

Użyteczność biblioteki cDNA wykazano poprzez analizę PCR (polimeraza Taq firmy BoehpRyer; 30 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 95°C; 1 minuta w temperaturze 50°C; 3 minuty w temperaturze 72°C) pewnej ilości losowo pobranych klonów, używając startera lambda gtl 1 #1218, posiadającego sekwencję GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG (New England Biolabs, Beverly, Ma, USA) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 96]; sekwencje docelowe zlokalizowane przed wystawką cDNA) w połączeniu ze wspomnianym wyżej starterem-adapterem oligo(dT)-NotI; stwierdzono, że większość badanych klonów zawierała wstawki cDNA o różnej długości.

(C) Identyfikacja klonów

Około 1 x 106 klonów cDNA (duplikaty sączków z odwzorowaniem łysiaek przygotowano używając Hyboad™-N; Amersham) przeszukiwano w ciągu nocy w temperaturze 42°C, za pomocą wyznakowanego promieniotwórczo olCyonukleotydu YG99 stosując następujące warunki prehybpzdżcacji i hybrydyzacji: 5 x SSC (SSC: 150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trój sodowy), 5x roztwór Denhardta, 0,5% SDS, 100 mikrogramów/ml csoRCfikowznego DNA spermy rybiej (Boehringer). Filtry płukano czterokrotnie w 2x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 37°C . Po o^spozy^ i no Mony eantganowską tokoto 70 godziny- ttwiprdgono od 350 do 500 miejsc hybrydyzacji.

Dwadzieścia cztery pozytywne klony, gznzczone odpowiednio od NAP1 do NAP24, poddano drugiej procedurze hybrydyzacji przy mniejszej gęstości łysinek fagowych. We wszystkich klonach z wyjątkiem klonu NAP24 zidentyfikowano pojedyncze łysinki zawierające homogenną populację faga lambda. Klony te zaalCcowzao stosując amplifikację PCR amplification (pollmerzzz Taq firmy BoehriiRger; 30 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 95°C; 1 minuta w temperaturze 50°C; 1,5 minuty w temperaturze 72°C) z użyciem startera oligo(dT)-NotI (AATTCGCGGC CGC(T)_]5) [sekwencja o numerze CdeRtyflkzyżjaym: 95] w połączeniu z albo (i) YG99 albo (ii) starterem lambda gtl 1 #1218. W przypadku większości klonów (20 spośród 23) otrzymano fragment o długości około 400 bp, gdy stosowano zestaw starterów oligo(dT)-NotI/YG99, oraz fragment o długości około 520 bp, gdy używano pary starterów ollgo(dT)-Not[/#1258. Dziewiętnaście takich, prawdopodobnie pełnej długości klonów, charakteryzowano dalej.

Wstawki cDNA pochodzące z pięciu klonów csubkloRowzRo jako fragmenty Sfil-Notl zarówno w pGEM-5Zf(-) jak i pGEM-9Zf(-). Ponieważ miejsca restrykcyjne Sfil faga lambda

183 855 gtll i pGEM-5Zf(-) nie są wzajemnie kompatybilne, klonowanie w tym wektorze wymagało użycia krótkiego fragmentu adapterowego otrzymanego w wyniku połączenia następujących dwóch oligonukleotydów o ufosforylowanych końcach 5': pTGGCCTAGCGTCAGGAGT [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 99] i pCCTGACGCTA GGCCATGG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 100]. Po przygotowaniu jednoniciowego DNA, sekwencje tych cDNA określano stosując metodę terminacji łańcucha dideoksynukleotydami z użyciem startera #1233, posiadającego sekwencję AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA (New England Biolabs) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 101]. Stwierdzono, że wszystkie 5 klonów zawierało pełnej długości sekwencję, włącznie z pełną sekwencję sygnałową sekrecji. Stwierdzono, że klony NAP5, NAP7, NAP22 zawierały identyczny region kodujący. Klony NAP6 i NAP11 są również identyczne, ale mają region kodujący różny od regionu kodującego typu NAP5. figura 1 przedstawia sekwencję nukleotydową genu NAP5, a figura 2 przedstawia sekwencję aminokwasową kodowanego białka, AcaNAP5. Podobnie, figura 3 przedstawia sekwencję nukleotydową genu NAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5], a figura 4 przedstawia sekwencję aminokwasową kodowanego białka, AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6].

Czternaście innych prawdopodobnie pełnej długości klonów poddano analizie restrykcyjnej. Wspomniany wyżej produkt PCR o długości 400 bp, otrzymany przy użyciu pary starterów YG99/oligo(dT)-NotI, trawiono czterema różnymi enzymami zdolnymi do rozróżniania typów klonów NAP5 i NAP6: Sau.96I, Sau3AI, DdeI, i HpaII. Wyniki wykazały, że 10 spośród 14 klonów było typu NAP5 (na przykład NAP4, NAP8, NAP9, NAP 15, NAP16, NAP17, NAP 18 , NAP20 , NAP20 i NAP23, , podczas gdy pozostoee czfeiy b>yy yp>u NAP6 (na przykład NAP10, NAP12, NAP14 i NAP 19).

Nazwy badanych klonów zmieniono, aby odzwierciedlić ich pochodzenie z Ancylostoma caninum w ten sposób, że przed oznaczeniem NAP umieszczono litery Aca. Na przykład NAP5 stał się AcaNAP5, NAP6 odpowiednio AcaNAP6 i tak dalej.

Przykład 3

Wytwarzanie i oczyszczanie zrekombinowanego AcaNAP5 w P. pastoris (A) Konstruowanie wektora ekspresyjnego.

Układ ekspresyjny drożdży Pichia pastoris, obejmujący wektor wahadłowy E.coli/P.pastoris, pHILD2, opisano w wielu opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki. Zobacz, na przykład, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach: 5 330 901; 5 268 273; 5 204 261; 5 166 329; 5 135 868; 5 122 465; 5 032 516; 5 004

688; 5 002 876; 4 895 800; 4 885 242; 4 882 279; 4 879 2311 4 857 467; 4 885 23 k, 4 887

148; 4 818 700; 4 812 405; 4 808 537; 4 777 242 oraz 4 683 293.

Wektor pYAM7SP8 używany do bezpośredniej ee^k;f^i'r^^ji i sekke^ zzekombinowtuiego białka AcaNAP5 w P. pastoris był pochodną, plazmidu pHILD3 (Despreaux, C.W. i Manning, R.F., Gene 131:35-41 (1993)), posiadającym taką samą ogólną strukturę. Oprócz elementów transkrypcyjnych i rekombinacyjnych plazmidu pHILD2 koniecznych do ekspresji i integracji z chromosomem P. pastoris (patrz Stroman, D. W. i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 855 231), wektor ten zawierał chimeryczną preprosekwencję liderową wstawioną przed promotorem oksydazy alkoholowej (AOX1). Preprosekwencja liderowa składała się z sekwencji sygnałowej sekrecji kwaśnej fosfatazy (PH01) z P. pastoris połączonej z syntetyczną prosekwencją o długości 19 aminokwasów. Ta prosekwencja była jedną z dwóch prosekwencji o długości 19 aminokwasów zaprojektowanych przez Clementsa i in., Gene 106: 267-272 (1991) na podstawie sekwencji liderowej czynnika alfa Saccharomyces cerevisiae. Bezpośrednio za preprosekwencją liderową wstawiono, dla ułatwienia klonowania obcych genów, syntetyczne miejsce wielokrotnego klonowania z sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy Stul, SacII, EcoRI, Bg1II, NotI, XhoI, Spel i BamHI. NAP ulegające ekspresji pYAM7SP8 w Pichia pastoris ulegał najpierw translacji w postaci preproproduktu, a następnie procesowi modyfikacji w komórce gospodarza polegającej na usunięciu pre- i prosekwencji.

Strukturę tego wektora przedstawiono na figurze 12. Sekwencja sygnałowa (S) ma następującą sekwencję kwasu nukleinowego: ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA

183 855

ATT ATT TTA GCT TTG GCT ACT TTG CAA TCT GTC TTC GCT [sekweanjy o numerze ife4tyfikynyjaym: 102]. Peosekwe4cjy (P) ma następującą sekwencję kwasu nukleinowego: CAG CCA GGT ATC TCC ACT ACC GTT GGT TCC GCT GCC GAG GGT TCT TTG GAC AAG AGG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 103]. Miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) ma następującą sekwencję kwasu nukleinowego: CCT ATC CGC GGA ATT CAG ATC TGA ATG CGG CCG CTC GAG ACT AGT GGA TCC [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 104].

Wektor pGEM-9Zf(-) (Promega) zawierający cDNA AnyNAP5 użyto do wyizolowania, metodą amplifikacji PCR (odzyskiwania przez PCR) (stosując polimerazę Vkat z New England Biolabs, Bevdely, MA; 20 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 94°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C), regionu kodującego dojrzałe białko AnyNAP5. Używano następujących starterów oligonukleotydowych:

YG101: GCTCGCTCTA-GAAGCTTCAG-ACATGTATAA-TCTCATGTTG-G [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 105]

YG10 3: AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG

[sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 89]

Starter YG101, ukierunkowany na sekwencje końca C, zawierał nie ulegające hybrydyzacji wydłużenie zawierające miejsca restrykcyjne Xbal i HindIII (podkreślone).

Po strawieniu enzymem Xbal, wyizolowano z żelu produkt amplifikacji o oczekiwanej długości, a następnie kazymytyczaie ufosforylowano (kinaza polmukleotydowa T4 firmy New Eaglyaf Biolabs, Beverly, MA). Po termicznej inaktywacji kinazy (10 minut w temperaturze 70°C) fragment o jednym końcu tępym, a drugim trawionym Xbal, sklonowywano w określonej orientacji w wektorze pYAM7SP8 w celu uzyskania ekspresji. Wektor, do którego wprowadzono wstawkę przygotowano przez trawienie restrykcyjne Stul-Spel i oczyszczono w żelu agarozowym. Szczep E. coli WK6 [Zell, R. i Fritz, H.-J., EMBO J., 6: 1808-1815 (1987)], stransformowano mieszaniną ligacyjną i wyselekcjonowano klony oporne na ampicylinę.

W oparciu o analizę restrykcyjną klon plazmidu ze wstawką o oczekiwanej wielkości, który oznaczono pYAM7SP-NAP5, zachowano do dalszej charakteryzacji. Określenie sekwencji klonu pYAM7SP-NAP5 potwierdziło precyzyjne wstawienie regionu kodującego dojrzałe białko AnyNAP5 w połączenie peeproskkwdncja lifeeowo-sygnałową w sposób przewidziany w schemacie konstruowania tego wektora, jak również brak niepożądanych mutacji w regionie kodującym.

(B) Ekspresja rekombinowanego AcaNAP5 w P. pastoris

Szczep GTS115 (his4) Pichia pastoris opisano w Stroman, D.W. i in., zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 855 231. Wszelkie manipulacje P. pastoris wykonywano zasadniczo tak jak to opisano w Stroman, D.W. i in., zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 855 231.

Około 1 mikrograma DNA plazmidu pYAM7SP-NAP5 wprowadzono do szczepu GTS115 metodą elekteopoeynji, używając standardowych procedur. Uprzednio plazmid przeprowadzono w postać liniową przez strawienie Sali, co teoretycznie ułatwia właściwe ukierunkowanie i integrację plazmidu z chromosoma^ym locus his4.

Selekcji szczepu wykazującego wysoki poziom ekspresji AnyNAP5 dokonano zasadniczo tak jak opisano poniżej. Transformanl^ His+ odzyskiwano na płytkach MD (Yeast NiTrogen Base bez aminokwasów (DIFCO), 13,4 g/litr; biotyna, 400 mlkeogeamów/lite; Dglukoza, 20 g/litr; agar, 15g/litr). Pojedynczymi koloniami ^=60) powstałymi po elektroporacji iaokulowaao 100 mikrolitrów podłoża FM22-glicerol-PTMl w studzienkach 96stufzid4kowkj płytki umożliwiono wzrost w ciągu 24 godzin w temperaturze 30°C na wytrząsarce do płytek. Jeden litr podłoża FM22-glinkrol-PTM1 zawierał 42,87 g KH₂PO₄, 5 g (NH₄)₂SO4, 1 g CaSO4.2H₂O, 14,28 g K₂SO₄, 11,7 g MgSO₄, ° 7H₂O, 50 g glicerolu wyjałowionego w postaci roztworu o objętości 100 ml, oraz 1 ml mieszaniny pierwiastków śladowych PTM1 wyjałowionej przez sączenie. Część FM22 podłoża przygotowano w postaci 900 ml roztworu o pH doprowadzonym KOH do 4,9 i jałowo przesączonego. Jeden litr mieszaniny PTM1 zawierał 6 g CuSO4 5H₂O, 0,8 g KJ, 3 g MnSO4°H₂O, 0,2 g NaMoO4,-2H₂O, 0,02 g H₃BO3, 0,5 g CoCl2 6H₂O, 20 g ZnCl₂, 5 ml H₂SO4, 65 g FeSO4,.7H₂O, 0,2 g biotyny.

183 855

Następnie komórki osadzono i ponownie zawieszono w świeżym podłożu FM22mstanol-PTM1 (o takim samym -składzie jak powyżej, z tym wyjątkiem, żs 50 g glicerolu zastąpiono 0,5% (v/v) metanolem w celu indukcji ekspresji promotora AOXl). Po dodatkowym 24-godzinnym okresie inkubacji w temperaturze 30°C, supsmatanty minihodowli testowano pod kątem ulegającego sekrscji AcaNAP4. Wyselekcjonowano 2 klony, które wykazywały wysoki poziom syntezy i sskrscji AcaNAP5, o czym świadczyło pojawienie się w podłożu wysokiej aktywności hamującej czynnik Xa (jak mierzono oznaczeniem amidolitycznym czynnika Xa, opisanym w przykładzie 1). Po drugiej turze przeszukiwania z użyciem tej samej procedury, ale tym razem na poziomie hodowli w kolbach, wybrano jedną wyizolowaną komórkę gospodarza i oznaczono ją jako P. pastoris GTSi15/7SP-NAP5.

Wykazano, żs komórka gospodarza, GTS1 i5/7SP-NAP5, posiada fenotyp typu dzikiego (Mut⁺) wykorzystywania metanolu, co wykazało, że integracja kasetki ekspresyjnej z chromosomem GTS115 nie zmienia funkcjonowania genomowego genu AOX1.

Późniejsze wytwarzanie zrskombinowanego materiału AcaNAP2 przeprowadzono w hodowlach w kolbach, jak opisano w Stroman, D. W. i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 825 231. Zrekombinowany produkt oczyszczano z supematantu komórek Pichia pastoris jak opisano poniżej.

(C) Oczyszczanie zrekombinowanego AcaNAPó (1) Chromatografia kationowymienna

Po ekspresji, supematant hodowli GTSn5/7SP-NAP2 (100 ml) wirowano przy 16 000 obrotów na minutę (około 30 000 x g) w ciągu 20 minut, a następnie pH doprowadzano · IN HCl do pH 3. Przewodnictwo supematantu obniżano do wartości poniżej 10 mS/cm przez dodanie wody oczyszczanej w MilliQ. Rozcieńczony supematant klarowano przez przesączenie przez sączek z octanu celulozy o średnicy porów 0,22 mikrometra (Corning Inc., Corning, NY, USA).

Całość supematantu (około 500 ml) nakładano na kolumnę Poros20 HS (Perseptivs Biosystems, MA) o wymiarach 1x2 cm, zrównoważoną uprzednio buforem kationowym (0,05 M cytrynian sodowy, pH 3) z szybkością przepływu 5 ml/na minutę (400 cm na godzinę). Na tym etapie oczyszczania kolumna i próbka miały temperaturę otoczenia. Kolumnę przemywano następnie 20 objętościami buforu kationowego. Materiał posiadający w oznaczeniu amidolitycznym aktywność hamującą czynnik Xa eluowano buforem kationowym zawierającym

M NaCl z szybkością przepływu 2 ml/minutę.

(2) Chromatografia sączenia molekularnego z zastosowaniem Superdex30

Połączone frakcje sluowane 1 M NaCl z kolumny kationowymiennej zawierające materiał hamujący (3 ml) nanoszono na kolumnę Superdex20 PG (Pharmacia, Szwecja) o wymiarach 1,6 x 66 cm zrównoważoną uprzednio 0,01 M fosforanem sodowym, pH 7,4, 0,12 M NaCl w temperaturze pokojowej. Chromatografię prowadzono z szybkością przepływu ml/minutę. Aktywność hamująca czynnik Xa ulegała elucji pomiędzy 56-64 ml (Ky 0,207). Jest to ta sama objętość elucji, jak określona dla cząsteczki natywnej (przykład 1, część E).

(3) Chromatografia z odwróconymi fazami ml połączonych frakcji z chromatografii sączenia molekularnego nałożono na kolumnę C18 (2i8TP54 Vydac; Hesperią, CA) o wymiarach 0,46 x 25 cm, którą następnie sluowano liniowym gradientem 10-34% acetonitrylu w 0,1% (v/v) kwasie trifiuorooctowym z szybkością przepływu 1 ml/minutę, ze zmianą stężenia acetonitrylu o 0,4% na minutę. Aktywność hamująca czynnik Xa, oznaczana jak w przykładzie 1, elucji ulegała elucji w kilku frakcjach w około 30-35% acetonitrylu. Rozdziały HPLC prowadzono w tym samym układzie jak w przykładzie 1. Frakcje zawierające aktywność hamującą czynnik Xa otrzymane w kilku rozdziałach na tej kolumnie połączono i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

(4) Oznaczanie masy cząsteczkowej zrekombinowanego AcaNAP5

Masę cząsteczkową głównego składnika wyizolowanego jak opisano w częściach (1) i (3) tego przykładu określono stosując ten sam układ systemu slektrorozpyłowej jonizacyjnej spektrometrii masowej, jak opisany w przykładzie 1.

Oznaczona masa zrekombinowanego AcaNAP4 wynosiła 8735,69 daltonów (5) Sekwencjonowanie aminokwasów zrekombinowanego AcaNAP5

183 855

Po oczyszczaniu opisanym w częściach (1) i (3) tego przykładu, zrekombinowane białko AcaNAP5 z Pichia pastoris poddano analizie sekwencji aminokwasowej, jak opisano w przykładzie 1. Stwierdzono, że sekwencja pierwszych pięciu aminokwasów jest następująca: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 106]. Sekwencja ta była identyczna z sekwencją natywnego białka NAP (patrz przykład 1).

Przykład 4

Wytwarzanie i oczyszczanie zrekombinowanego AcaNAP6 w P. pastoris (A) Konstruowanie wektora ekspresyjnego

Wektor ekspresyjny pYAM7SP-NAP6 skonstruowano w ten sam sposób, jak opisano dla wektora YAM7SP-NAP5 w przykładzie 3.

(B) Ekspresja zrekombinowanego AcaNAP6 w P. pastoris

Wektor pYAM7SP-NAP6 zastosowano do transformacji szczepu Pichia GTS115 (his4) jak opisano w przykładzie 3.

(C) Oczyszczanie AcaNAP6

Zekombinowane białko AcaNAP6, ulegające ekspresji w szczepie Pichia GTS115 (his4) stransformowanym wektorem ekspresyjnym pYAM7SP-NAP6 oczyszczono w sposób opisany dla zrekombinowanego AcaNAP5 w przykładzie 3.

Masa zrekombinowanego AcaNAP6, oznaczona jak opisano w przykładzie 3, wynosiła 8393,84 daltonów.

Większość preparatu AcaNAP6 miała następujący koniec aminowy: Lys-Ala-Tyr-ProGlu [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 106 ].

Przykład 5

Ekspresja zrekombinowanego Pro-AcaNAP5 w komórkach COS (A) Konstruowanie wektora ekspresyjnego

Wektor pGEM-9Zf(-) (Promega Corporation, Madison, WI, USA), w którym zsubklonowano cDNA AcaNA^5, służył jako matryca do odzyskania przez PCR całego regionu kodującego AcaNAP5, łącznie z natywnym sygnałem sekrecji (z użyciem polimerazy Vent firmy New England Biolabs, Beverly, MA, USA;

cykli temperaturowych: .1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 1,5 minuty w teperaturze 72°C). Zastosowano startery oligonukleotydowe: (1) YG101, skierowany na koniec 3' genu kodującego NAP i posiadający sekwencję GCTCGCTCTA GAAGCtTcAG ACATGTATAA TCTCATGTTG G [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 105], oraz (2) YG102, skierowany na 5'-koniec genu kodującego NAP i posiadający sekwencję GACCAGTCTA GACAATGAAG ATGCTTTACG CTATCG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 107]. Startery te posiadają niehybrydyzujące przedłużenia zawierające miejsca restrykcyjne XbaI.

Po strawieniu enzymem XbaI, produkt amplifikacji o oczekiwanej długości wyizolowano z żelu agarozowego, a następnie, w celu uzyskania ekspresji, wstawiano do wektora pEFBOS w miejsce fragmentu wycinanego XbaI o długości 450 bp [Mizushima, S. i Nigata, S., Nuci. Acids Res., 18: 5322 (1990)]. Fragment wektora, do którego wprowadzano wstawkę przygotowano przez strawienie XbaI i oczyszczono w żelu agarozowym.

Szczep E. coli WK6 [Zell, R I Fritz, H-J., EMBO J., 6: 1809-1815 (1990)] stransformowano mieszaniną. Trzydzieści losowo wybranych opornych na ampicylynę transformantów poddano analizie PCR (polimeraza Taq firmy Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA; 30 cykli amplifikacji w następujących temperaturach: 1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 1 minuta w temperaturze 72°C). Zastosowano następujące startery oligonukleotydowe: (i) YG103 posiadający sekwencję AAGGCATACC CGGAGTGTGG TG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 89], hybrydyzujący z końcem aminowym regionu kodującego dojrzałą formę NAP, oraz (ii) YG60 posiadający sekwencję GTGGGAGACC TGATACTCTC AAG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 108] skierowaną na sekwencje wektora za miejscem wstawienia, tzn. znajdujące się w nie ulegającym translacji 3'-końcowym regionie kasetki ekspresyjnej pEF-BOS. Tylko z klonów zawierających wstawkę w pożądanej orientacji można otrzymać produkt PCR o oczekiwanej długości (około 250 par zasad). Dwa takie klony scharakteryzowano dalej przez określenie sekwencji i stwierdzo183 855 no, że zawieraaą pożądaną wstawkę Xbal. Jeden z tych klonów, oznaczony pEF-BOS-NAP5, użyto do trcnsfskcji komórek COS.

(B) Transfekcja komórek COS

Komórki COS-7 (ATCC CRL 1651) stransfekowcno pEF-BOS-NAP5, pEF-BOS zawierającym inną wstawkę, lub z pominięciem DNA (tzw. udawana transfekcja) używając DEAE-dekstranu. W metodzie tej używano następujących podłóż i roztworów podstawowych:

(1) podłoże COS: DMEM; 10% FBS (inkubowcna w ciągu 30 minut w temperaturze 56°C); 0,03% L-glutamina; penicylina (50 I.U./ml) i sterptomycyna (50 mikrogramów/ml) (wszystkie produkty z firmy Life Technologies).

(2) MEM-HEPES: podłoże MEM firmy Life Technologies zrekonstytuowane zgodnie ze wskazaniami producenta, zawierające 25 mM końcowe stężenie HEPES, doprowadzone do pH 7,1 przed przesączeniem (średnica porów 0,22 mikrometra).

(3) Roztwór DNA: 6 mikrogrcmów DNA na 3 ml MEM-HEPES (4) Roztwór DEAE-dekstrcnu: 30 mikrolitrów DEAE-dekstranu (Pharmacia, Uppsala, 100 mg/ml w H₂O) na 3 ml MEM-HEPES.

(5) Mieszanina do trcnsfekcji: 3 ml roztworu DEAE-dekstranu dodaje się do 3 ml roztworu DNA i mieszaninę pozostawia na 30 minut w temperaturze otoczenia.

(6) Roztwór chlorochiny: rozcieńczenie 1:100 roztworu podstawowego chlorochiny (Sigma, St. Louis, MO, USA; 10 mM w wodzie; przesączona przez membranę o średnicy porów 0,22 mikrometra) w podłożu COS.

Przejściową, transfekcję komórek COS prowadzono w następujący sposób. Komórki COS (około 3,5 x 10⁶), hodowane w kolbach Nunc TC o powierzchni podłoża 175 cm² (Life Technologies Inc.) przemywano jeden raz podłożem MEM-HEPES. Na przemyte komórki nanoszono sześć mililitrów mieszaniny do trcnsfekcji. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze otoczenia dodawano 48 ml roztworu chlorochiny i inkubowano komórki w ciągu dalszych 4 godzin w temperaturze 37°C. Komórki przemywano raz świeżym podłożem COS i ostatecznie inkubowano w objętości 50 ml tego samego podłoża w temperaturze 37°C.

(C) Hodowla stransfekowanych komórek COS

Po trzech, czterech i pięciu dniach od trcnsfekcji, próbki supematantów hodowli testowano w oznaczeniu cmidolitycznym wobec czynnika Xa zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1. Wyniki wyraźnie wykazały nagromadzanie się aktywności hamującej czynnik Xa w supematantach hodowli komórek transfekowanych wektorem pEF-BOS-NAP5.

Supematant hodowli komórek COS, zawierający Pro-AccNAA2 zbierano po pięciu dniach od trcnsfekcji i białko NAP oczyszczano jak opisano w przykładzie 6.

Przykład 6

Oczyszczanie zrekombinowanego Pro-AcaNAP5 (A) Chromatografia anionowymienna

Supematant hodowli komórek COS zawierający Pro-AcaNAA2 wirowano przy 1500 r.p.m. (około 500 x g) w ciągu 10 minut przed dodaniem octanu sodowego w postaci stałej do 50 mM stężenia końcowego. Dodano następujące inhibitory proteaz (wszystkie inhibitory proteaz pochodziły z ICN Bionedicals Inc., Costa Mesa, CA, USA): 1,0 x 10'⁵ M pepstatynę A (kwas izowalerylo-Val-V^l-^-^-^^i^^^)^^^;^i^i^(^l^i^s^'^-^-i^<^et^l<^^^<^]^itu^^ilo-Ala-4-cmino-3-hydroksy-r-mstyloheptcnowy), 1,0 x 10'⁵ M leupeptynę, 5 x 10'⁵ M AEBSF (fluorek 4-(2cminoetylo)-benzenosulfonowy). pH doprowadzano HCl do pH 5,3. Supematant sklarowano przez przesączenie przez sączek z octanu celulozy o średnicy porów 0,2 mikrometra (Corning Inc., Corning, NY, USA).

Sklarowany supematant (objętość całkowita około 300 ml) nałożono z szybkością przepływu 10 ml/minutę (80 cm/godzinę) na kolumnę Poros20 HQ (PerseptAe Biosystems, MA) o wymiarach 1 x 2 cm zrównoważoną uprzednio buforem anionowym (0,05 M octan sodowy, pH 5,3, 0,1 M NaCl). Na tym etapie oczyszczania kolumna i nanoszona próba znajdowały się w temperaturze otoczenia. Kolumnę przepłukano następnie co najmniej 10 objętościami buforu anionowego. Materiał, który posiadał aktywność hamującą czynnik Xa w oznaczeniu ami54

183 855 dolitycznym wyeluowano buforem anionowym zawierającym 0,55 M NaCl z szybkością przepływu 5 ml/minutę (400 cm/godzinę) i zebrano.

(B) Chromatografia sączenia molekularnego z zastosowaniem Superdex30.

Połączone frakcje (3 ml) wyeluowane 0,55 M NaCl z kolumny jnionowymiennej nałożono na kolumnę Superdex30 PG (Pharmacia, Szwecja) o wymiarach 1,6 x 66 cm zrównoważoną uprzednio 0,01 M fosforanem sodowym, pH 7,4, 0,15 M NaCl w temperaturze 24°C. Chromatografię prowadzono z szybkością przepływu 2 ml/na minutę. Materiał hamujący w oznaczeniu amidolitycznym czynnika Xa wyeluowano pomiędzy 56 a 64 ml rozdziału (K_at0,207). Była to dokładnie ta sama objętość elucji, jak określona dla cząsteczki natywnej.

(C) Traktowanie wysoką temperaturą

Wszystkie połączone frakcje zawierające aktywność hamującą czynnik Xa inkubowano w szklanej probówce w ciągu 5 minut w temperaturze 90°C, a następnie szybko ochłodzono na lodzie. Nierozpuszczalny materiał osadzono przez wirowanie w ciągu 20 minut przy 19 000 x g_ma w temperaturze 4°C. Supematant zawierał całą aktywność hamującą czynnik Xa.

(D) Chromatografia HPLC z odwróconymi fazami

Supernatant próbki traktowanej wysoką temperaturą, nałożono na kolumnę C18 o wymiarach 0,46 x 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA), którą następnie eluowano liniowym gradientem 10-35% acetonitrylu w 0,1% (v/v) kwasie trifluorooctowym z szybkością przepływu 1 ml na minutę i zmianą stężenia acetonitrylu wynoszącą 0,4%/minutę. Aktywność hamująca czynnik Xa eluowano około 30% acetonitrylem. Rozdziału HPLC prowadzono w tym samym układzie jak opisany w przykładzie 1. Frakcje zawierające aktywność hamującą czynnik Xa wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

(E) Określanie masy cząsteczkowej

Masę zrekombinowanego białka Pro-AcaNAP5 oczyszczonego jak opisano w częściach A-D tego przykładu określono z użyciem opisanej w przykładzie 1 metody elektrorozpyłowej jonizującej spektrometrii masowej.

Masa zrekombinowanego Pro-AcaNAP5 wynosi 9248,4 daltony.

(F) Sekwencjonowanie aminokwasów

Po oczyszczeniu zrekombinowane białko Pro-AcaNAP5 z komórek COS poddano analizie aminokwasowej dla określenia sekwencji końca aminowego, jak opisano w przykładzie 1. Pierwszych dziewięć aminokwasów od końca aminowego Pro-AcaNAP5 określono jako: Arg Thr Val Arg Lys Ala Tyr Pro Glu [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 109]. W porównaniu z natywnym białkiem AcaNAP5 (patrz przykład 1), Pro-AcaNAP5 posiada cztery dodatkowe aminokwasy na N-końcu. Sekwencję aminokwasową Pro-AcaNAP5 przedstawiono na figurze 5.

Przykład 7

Ekspresja zrekombinowanego Pro-AcaNAP6 w komórkach COS

Pro-AcaNAP6 przejściowo wytwarzano w komórkach COS zasadniczo jak opisano dla Pro-AcaNAP5 w przykładzie 5.

Region kodujący AcaNAPó, zawierający sygnał sekrecji, odzyskano przez PCK z takimi samymi dwoma starterami oligonukleotydowymi, jak dla AcaNAP5: (1) YG101 skierowanym na koniec 3' genu i posiadającym sekwencję GCTCGCTCTA GAAGCTTCAG ACATGTATAA TCTCATGTTG G [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 105], oraz (2) YG102 skierowanym na koniec 5' genu i posiadającym sekwencję GACCAGTCTA GACAATGAAG ATGCTTTACG CTATCG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 107]. Starter YG101 zawiera niedopasowany nukleotyd przy stosowaniu z AcaNAP6 jako sekwencją docelową (podkreślona zasada T; porównaj z figurą 1 i figurą 3); to niedopasowanie powoduje zastąpienie kodonu Ile ATT kodonem Ile ATA. Niedopasowanie nie wpływa znacząco na wydajność amplifikacji.

Wprowadzono następującą modyfikację w porównaniu z przykładem 5: dwadzieścia cztery godziny po transfekcji komórek COS (co opisano w przykładzie 5, część B), podłoże COS zawierające 10% FBS zastąpiono 50 ml podłoża składającego się z mieszaniny 1 : 1 DMEM i Nutrient Mixture Ham's F-12 (Life Technologies). Następnie komórki dalej inku183 855 bowano w temperaturze 37°C i wytwarzanie aktywności hamującej czynnik Xa mierzono wykrywano jak opisano w przykładzie 5.

Przykład 8

Oczyszczanie zrekombinowanego Pro-AcaNAP6 (A) Chromatografia anionowymienna

Supematant hodowli komórek COS zawierający Pro-AcaNAP6 odwirowano przy 1400 r.p.m. w ciągu 10 minut przed dodaniem octanu sodowego w postaci stałej do 20 mM stężenia końcowego. Następnie dodano inhibitory proteaz (wszystkie inhibitory proteaz z ICN Biomsdicals Inc., Costa Mesa, CA, USA): 1,0 x 10'⁵ M pepstatynę A (kwas izowalerylo-Val-Val-4amino-3-hydroksy-6-mstylo-heptanoilo-Ala-4-amino-3-hydroksy-6-mstyloheptanowy), 1,0 x 10'⁵ M lsupeptynę, 5,0 x 10⁵ M AEBSF (fluorek 4-(2-aminoetylo)-bsnzenosulfonylowy). pH doprowadzono HCl do pH 5,3. Supematant sklarowano przez przesączenie przez sączek z octanu celulozy o średnicy porów 0,2 mikrometra (Coming Inc., Coming, NY, USA).

Sklarowany Supematant (objętość całkowita około 450 ml) nałożono na kolumnę Poros20 HQ (Psrseptivs Biosystems, MA) o wymiarach 1x2 cm, zrównoważoną uprzednio buforem anionowym (0,05 M octan sodowy, pH 5,3, 0,1 M NaCl) przy szybkości przepływu 10 ml/minutę (800 cm/godzinę). Podczas tego etapu oczyszczania kolumna i próbka znajdowały się w temperaturze otoczenia. Kolumnę przepłukano następnie co najmniej 10 objętościami buforu anionowego. Materiał posiadający aktywność hamującą czynnik Xa w oznaczeniu amidolitycznym wyeluowano buforem anionowym zawierającym 0,55 M NaCI przy szybkości przepływu 2 ml/minutę (400 cm/godzinę) i zebrano.

(B) Chromatografia sączenia molekularnego z zastosowaniem Superdex30

Połączone frakcje wysluowane 0,55 M NaCl (3 ml) podczas chromatografii anionowymisnnej nałożono na kolumnę Superdsx30 PG (Pharmacia, Sweden) o wymiarach 1,6 x 66 cm zrównoważoną uprzednio 0,01 M fosforanem sodowym, pH 7,4, 0,15 M NaCl w temperaturze 24°C. Chromatografię prowadzono z szybkością przepływu 2 ml/minutę. Materiał hamujący czynnik Xa w oznaczeniu amidolitycznym wyeluowano pomiędzy 55 a 64 ml rozdziału (K^ 0,207). To była dokładnie taka sama objętość elucji, jak określona dla natywnego NAP.

(C) Chromatografia HPLC z odwróconymi fazami

Połączone frakcje z sączenia molekularnego nałożono na kolumnę C18 (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) o wymiarach 0,46 x 22 cm, a następnie eluowano liniowym gradientem 10-35% acetonitrylu w 0,1% (v/v) kwasie trifluorooctowym przy szybkości przepływu 1 ml/minutę ze zmianą o 0,4% acetonitrylu/minutę. Aktywność hamującą czynnik Xa (oznaczanąjak w przykładzie 1) wyeluowano około 30% acetonitrylem. Rozdziały HPLC prowadzono w tym samym układzie, jak opisany w przykładzie 1. Frakcje zawierające aktywność hamującą czynnik Xa wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

(D) Określanie masy cząsteczkowej

Masę zrskombinowanego Pro-AcaNAP6, wyizolowanego jak opisano w tym przykładzie w częściach od A do C, określono stosując tsn sam układ elsktrorozpyłowsj jonizacyjnej spektrometrii masowej, jak opisano w przykładzie 1.

Masa zrskombinowanego Pro-AcaNAP6 wynosiła 8906,9 daltonów.

(E) Sekwencjonowanie aminokwasów

Po oczyszczeniu, zrekombinowany Pro-AcaNAP6 z komórek COS poddano analizie sekwencji aminokwasowej, jak opisano w przykładzie 1. Pierwsze pięć aminokwasów N-końca Pro-AcaNAP6 określono jako: Arg Thr Val Arg Lys [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 110]. W porównaniu z natywnym białkiem NAP (patrz przykład 1), Pro-AcaNAP6 posiada cztery dodatkowe aminokwasy na końcu aminowym. Sekwencję amlnoek'asoką ProAcaNAP6 przedstawiono na figurze 6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8].

Przykład 9

Zastosowanie sekwencji DNA NAP do izolacji genów kodujących inne białka NAP

Sekwencje cDNA AcaNAP5 i AcaNAP6 (z przykładu 2) zastosowano do izolacji pokrewnych cząsteczek z innych gatunków pasożytów przez hybrydyzację krzyżową.

Wektory pGEM-97f(-) (Promega) zawierające cDNA AcaNAP5 i AcaNAP6 zastosowano do odzyskiwania przez PCR regionów kodujących dojrzałe białka NAP (polimsraza Taq

183 855 firmy Life Technologies; 20 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C). Zastosowano startery oligonukleotydowe:

(1) YG109 skierowany na C-końcowe sekwencje cDNA kodującego NAP i posiadający sekwencję TCAGACATGT ATAATCTCAT GTTGG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 78], i (2) YG103 posiadający sekwencję AAGGCATACC CGGAGTGTGG TG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 89]. Starter YG109 zawiera pojedynczy niedopasowany nukleotyd, jeśli stosuje się go z AcaNAP6 jako sekwencją docelową (podkreślona zasada T; porównaj z sekwencjami przedstawionymi na figurach 1 i 3). Nie wpływa to znacząco na wydajność amplifkacji. Oba produkty PCR o odpowiedniej wielkości (około 230 par zasad) wyizolowano z 1,5% żelu agarozowego. Równomolową mieszaninę wyznakowano promieniotwórczo przez wydłużanie losowych starterów (zestaw T7 QuickPrime; Pharmacia), a następnie przepuszczono przez kolumnę Bio-Spin 30 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Biblioteki cDNA Ancylostoma ceylanicum (Ace), Ancylostoma duodenale (Adu) i Heligmosomoides polygyrus (Hpo) przygotowano zasadniczo jak opisano dla Ancylostoma caninum w przykładzie 2.

Ancylostoma ceylanicum i Heligmosomoides polygyrus otrzymano od dr D. I. Pritcharda, Department of Life Science, University of Nottingham, Nottingham, UK. Ancylostoma duodenale otrzymano od dr G. A. Schada, The School of Veterinary Medicine, Department of Pathobiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA.

W każdym przypadku cDNA sklonowano w wektorze lambda gtll w postaci fragmentów EcoRI-Notl. Około 2 x 10⁵ klonów cDNA z każdej biblioteki (sączki z duplikatami łysinek przygotowano stosując Hybond™-N; Amersham) przeszukano wykorzystując wyznakowane promieniotwórczo fragmenty AcaNAP5 i AcaNAPó wykorzystując następujące warunki prehybrydyzacji i hybrydyzacji: 5 x SSC (SSC: 150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trójsodowy), 5 x roztwór Denhardta, 0,5%o SDS, 20% formamid, 100 mikrogramów/ml zsonikowanego DNA spermy rybiej (Boehringer), reakcję prowadzono przez noc w temperaturze 42°C. Sączki przemywano 4 razy w ciągu 30 minut w 2 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 37°C. Po ekspozycji (około 60 godzin) na błonie rentgenograficznej zidentyfikowano łącznie pomiędzy 100 a 200 hybrydy żujących miejsc w przypadku Ace i Adu. Mała liczba bardzo słabych miejsc była widoczna w przypadku biblioteki cDNA Hpo. Dla każdej z bibliotek osiem dodatnich łysinek poddano drugiej turze hybrydyzacji przy niższej gęstości łysinek, aby wyizolować pojedynczą łysinkę.

Zachowane klony scharakteryzowano dalej przez amplifikację PCR wstawek cDNA wykorzystując startery oligo(dT)-NotI (Promega; jest to ten sam starter, co zastosowany do przygotowania pierwszej nici cDNA; patrz przykład 2) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 95] w połączeniu ze starterem #i3I7 lambda-gtll posiadającym sekwencję GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [sekwencja o numerze identyikacyjnym: 96] (New England Biolabs; starter #1218 skierowany jest na sekwencji lambda przed miejscem wstawiania cDNA). Amplifikację PCR przeprowadzono w następujący sposób: polimeraza Taq firmy Boehringer; 30 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C. Analiza produktów PCR dla każdego gatunku przez elekroforezę żelową wyraźnie wykazała, że te cDNA mają w przybliżeniu taką samą wielkość jak cDNA AcaNAP5 (np. 400 do 500 bp). Poza cDNA o wielkościach takich jak AcaNAP5, długość niektórych cDNA Ace i Adu oceniono na około 700 bp.

Do określenia sekwencji wybrano liczne klony zawierające wstawkę o długości 500 lub 800 bp. W tym celu wstawki zsubklonowano w postaci fragmentów Sfil-Notl w fagemidach typu pGEM (Promega; szczegóły przedstawiono w przykładzie 2), co pozwala na przygotowanie iednoniciowgo DNA. W wyniku sekwencj‘onowania zidentyfikowano sześć różnych nowych białek podobnych do NAP, oznaczonych następująco: AceNAP4, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AduNAP7 i HpoNAP5. Sekwencje nukleotydowe cDNA, jak również przewidywane sekwencje aminokwasowe przedstawiono na figurze 7A (AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9]), figurze 7B (AceNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10]), figurze 7C (AceNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11]), figurze

183 855

7D (AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12]), figurze 7E (AduNAP7 [sekwencja o numerze ideRtyfckazżjRym: 13]) i figurze 7F (HpoNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14]). Każdy z cDNA AceNAP4 [sekwencja o numerze CdeRtyfkzcżjRżm: 9] oraz AduN(P7 [sekwencja o numerze identżfckazżjnżm: 13] ma długość około 700 bp i koduje białka, które zawierają dwie domeny NAP; inne wyicolowαRe cDNA kodują białka posiadające pojedynczą domenę NAP. Klon cDNA AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikzyżjnym: 12] był klonem o niepełnej długości, tj. pozbawionym 5'-kgńcowej części regionu kodującego; właściwą ramkę odczytu można jednak określić na podstawie homologii sekwencji zmiRokwzyowyzh w rodzinie zbliżonych cząsteczek NAP.

Zidentyfikowane sekwencje cDNA można użyć do wytwarzania kodowanych białek, jak ujawniono w przykładach 3, 4, 5 i 7 wykorzystując te same lub alternatywne odpowiednie układy ekspresyjne. KoadyzjonowαRe podłoża lub lizaty komórkowe, w zależności od użytego układu, można testować jako takie lub po frakcjonowaniu (wykorzystując taką metodykę, jak opisano w przykładach 3, 4, 6 i 8) dla aktywności hamowania prgtezr i aktywności przeciwkrzepliwej. Białka kodowane przez cDNA, które hybrydy;zuąz sondami otrzymanymi z fragmentów' genu AzzNAP5 (figura 1) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3] i/lub genu AcaNAP6 (figura 3) [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5] i które posiadaj, właściwości hamowania protezr serynowych i/lub ppceziwkpcepliwą uważa się za należące do zbliżonych cząsteczek k-odziay NAP.

Przykład 10

Identyfikacja NAP przez funkcjonalną prezentację białek kodowanych przez cDNA (A) Seria wektorów pDONG

Sekwencje nukleotydowe wektorów pDONG61 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 15), pDONG62 (sekwencja o numerze CdeRtżfikzcżjRżm: 16) i pDONG63 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17), pochodzące od wektora pUC119 [Vieira, J. i Messing, J., Methods ia Earymglogy, 153: 3-11 (1987)], przedstawiono odpowiednio aa figurach od 8A do 8C.

W celu skonstruowania tych trzech wektorów dodano miejsca restrykcyjne HindIII i SfiI na końcach 5' i 3' genu 6 faga nitkowatego przez amplifikację PCR jedaoalclgweyo DNA M13K07 [Vieira J. i Messiag, J., Ibid] wykorzystując starter kończący G6BACKHIND opac startery rozpoczynające G6FORsFi61, G6FORSFI62 lub G6FORSFI63. Podczas drugiej PCR trzy otrzymane fragmenty ponownie amplifikowano z G6BACKHIND i G6FORNOTBAMH jako starterem rozpoczynającym w celu dołączenia miejsc restrykcyjnych Notl i BamHI do końca 3' fragmentów. Sekwencje wymienionych powyżej starterów PcR są następujące (miejsca restrykcyjne podkreślono):

G6BACKHIND: ATCCGAAGCT TTGCTAACAT ACTGCGTAAT AAG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 111]

G6FORSFI61: TATGGGATGG CCGACTTGGC CTCCGCCTGA GCCTCCACCT TTATCCCAAT CCAAATAAGA [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 112]

G6FORSFI62: ATGGGATGGC CGACTTGGCC CTCCGCCTGA GCCTCCACCT

TTATCCCAAT CCAAATAAGA [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 113]

G6FORSFI63: TATGGGATGG CCGACTTGGC CGATCCGCCT GAGCCTCCAC

CTTTATCCCA ATCCAAATAA [sekwencja o numerze ideRtżfikzcyjażm: 114]

GAG6FORNOTBAMH: AAGAGGCT0AT CCGCCCGCGC GAGATGTGGG

ATGGCCGACTTGGCC [sekweacja o numerze ideatżfikazyjRżm: 115]

Ostatecznie, produkty PCR ozcżycccono w żelach, pojedynczo strawiono HindIII i BamHI i wstawiono pomiędzy odpowiednie miejsca wektora pUC119. Określenie sekwencji potwierdziło, że wektory pDONG61, pDONG62 i pDONG63 zawierały zamierzoną wstawkę.

Seria wektorów pDONG pozwala na klonowanie cDNA w postaci fragmentów SfilNotl. Klonowanie łączy cDNA w każdej z trzech ramek odczytu (translacji) z końcem 3’ genu 6 faga nitkowatego, który koduje jedno z fagowych białek kapsydu. Infekcja yαmcospeyyfizcnego szczepu E. coli zawierającego pochodne pDONG fagiem wspomagającym VcSM13 (Stratagene, La Jolla, CA) powoduje uwolnienie pseudowirionów, które zawierają w kapsydzie jedną specyficzną pojedynczą nić pochodnej pDONG i które mogą również wbudowy58

183 855 wać zrekombinowane fuzyjne białko 6 (p6) w swój kapsyd. cDNA, które jest takie, że kodowane białko jest funkcjonalnie prezentowane na zewnętrznej powierzchni faga jako zrekombinowane białko fuzyjne p6, można zidentyfikować stosując opisane poniżej doświadczenie.

(B) Przeniesienie biblioteki cDNA Ancylostoma caninum z wektora lambda gt11 do wektorów serii pDONG.

Preparat faga lambda połączonych klonów cDNA A. caninum (około 1 x 10⁶ kolonii, patrz przykład 2) wykorzystano do odzyskania przez PCR wstawek cDNA (polimeraza Taq firmy Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA: 20 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 3 minuty w temperaturze 72°C, a następnie 10 minut w temperaturze 65°C), ze starterem lanbda gtll posiadającym sekwencję GGTGGCGACG ACTCCTGGAG -CCG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 96] (New England Biolabs, Beverly, MA, USA: skierowany na sekwencje zlokalizowanej przed wstawką cDNA) w połączeniu ze starterem/adaptorem oligo(dT)-NotI (Promega) zastosowanym do syntezy pierwszej nici cDNA. Po strawieniu enzymami restrykcyjnymi SfiI i NotI z żelu agarozowego odzyskano produkty amplifikacji o pełnym zakresie długości.

Wszystkie fragmenty sklonowano w określonej orientacji w wektorach pDONG61, pDONG62 i pDONG63. Fragmenty wektorów, do których wprowadzano wstawki przygotowano przez trawienie wektorów oczyszczonych w gradiencie CsCl enzymami restrykcyjnymi SfiI i NotI a następnie -oczyszczono wykorzystując Wizard™ PCR Preps DNA Purification System (Promega Corp, Madison, WI, USA).

Szczep E.coli TGI [Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wydanie drugie, tomy 1 do 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] stransformowano przez elekroporację mieszaninami ligacyjnymi pDONG/cDNA. Komórki poddane transformacji przez elekroporację inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C w podłożu SOC (Sambrook, J. i in., Ibid.) i wysiano na LB-agar zawierający 0,1% glukozę oraz 100 mikrogramów/ml karbenicyliny (płytki o wymiarach 245 x 245 x 25 mm; Nunc). Otrzymano 2,2 x 106, 1,6 x 106 i 1,4 x 106 opornych na karbenicylinę transformantów zawierających odpowiednio wektory pDONG61, pDONG62 i pDONG63. Z każdej z odpowiednich bibliotek, oznaczonych 20L, 21L i 22L, pobrano losowo liczne transformanty i poddano je analizie PCR (polimeraza Taq firmy Life Technologies; 20 cykli amplifikacji z następującym programie temperaturowym: 1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 1 do 3 minut w temperaturze 72°C), wykorzystując dwa startery dopasowane do sekwencji flankujących miejsce wielokrotnego klonowania pUC119 (startery #1224 posiadający sekwencję CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 116] i #1233 posiadający sekwencję AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 101]; New England Biolabs). Wyniki wykazały, że ogromna większość klonów zawierała wstawki cDNA o różnej wielkości.

(C) Selekcja klonów cDNA kodujących białko NAP oparta o powinowactwo do czynnika Xa

Cząstki faga zawierające biblioteki 20L, 21L i 22L poddano odzyskiwaniu przez PCR w następujący sposób: każdą bibliotekę zdrapano z płytki i hodowano w temperaturze 37°C w 100 ml podłoża LB wzbogaconego o 1% glukozę i 100 mikrogramów/ml karbenicyliny do osiągnięcia absorbancji optycznej 0,5 przy długości fali 600 nm. Po dodaniu faga wspomagającego VCSM13 (Stratagene) o stężeniu odpowiadającym wielokrotności infekcji jednej komórki (moi) wynoszącej 20, hodowle pozostawiono na 30 minut w temperaturze 37°C, a następnie powoli wytrząsano w ciągu następnych 30 minut. Komórki osadzono przez wirowanie i ponownie zawieszono w 250 ml podłoża LB wzbogaconego o 100 mikrogranów/ml karbenicyliny i 50 mikrogramów/ml kanamycyny. Hodowle te pozostawiono na noc w temperaturze 30°C z energicznym wytrząsaniem. Otrzymane cząstki fagowe oczyszczono przez dwa kolejne wytrącania glikolem polietylenowym/NaCl i ponownie zawieszono z gęstością 1 x 10^ wirionów na ml w soli fizjologicznej zbuforowanej Trisem (0,05 M Tris, 0,15 M chlorek sodowy, pH 7,4) (TBS). Równe ilości cząstek fagowych z 20L, 21L i 22L zmieszano razem.

Ludzki czynnik Xa (przygotowanie patrz przykład 1) poddano biotynylacji biotyną-XXNHS zgodnie z instrukcją producenta (Pierce). Modyfikacja ta nie wpływa na aktywność amidolityczną proteazy, jak wykazano przez oznaczenie enzymatyczne z wykorzystaniem sub183 855 stratu chromogennego S-2765 (Cheomogdnix; patrz przykład 1). Perełki magnetyczne opłaszczone streptawii^^ią (Dynal; 1 mg na turę) przemyto trzy razy TBS i blokowano TBS zawierającym 2% odtłuszczone mleko (Difco) w temperaturze otoczenia. Po godzinie perełki magndtynznk dwukrotnie przemyło TBS przed użyciem.

W pierwszej turze 1 x 10’1 cząstek fagowych z połączonych bibliotek iakubowyao w ciągu 75 minut w temperaturze 4°C w 200 mikrolitrach buforu TBS zawierającego 250 nM biotynylowany czynnik Xa, 5 mM CaCh i 2% odtłuszczone mleko. Po tym czasie do roztworu fagów dodano 1 mg zablokowanych perełek magnetycznych opłaszczonych streptawidynę zawieszonych w 200 mikeoiiteach TBS zawierającego 5 mM CaCl₂ i 2% odtłuszczone mleko, i inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 4°C z delikatnym wytrząsaniem. Wykorzystując magnes (Dynal) perełki magnetyczne przemywano dziesięć razy 500 mikroliframi TBS zawierającego 0,1% Twddn-20. Związane fagi wymyto z perełek magnetycznych przez inkubację z 500 mikroliframi 0,1 M buforu glicyna-HCI (pH 2,0) w ciągu 10 minut. Supematant zobojętniono 150 mikroliframi 1M buforu Tris-HCl (pH 8,0).

W celu namnożenia fagów, szczep TG1 - E. coli [Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Mania^s,

T., Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, wydanie drugie, tomy 1 do 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] hodowano w temperaturze 37°C w 10 ml podłoża LB do osiągnięcia absorby4cji optycznej 0,5 przy długości fali 600 nm. Hodowle zainfekowano 650 mikrolitrami faga wymytego z perełek magnetycznych i krótko iakubowy4o w temperaturze 37°C bez wytrząsania. Po odwirowaniu, zainfekowane komórki zawieszono w 2 ml podłoża LB i wysiano na płytki o wymiarach 245 x 245 x 25 mm wypełnione LB-agarem zawierającym 1% glukozę i 100 mikrogramów/ml kaebe4inyilay. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C, komórki zdrapano z szalek i zawieszono w 40 ml podłoża LB wzbogaconego o 1% glukozę i 100 mikrogramów/ml kaebenicyiiay. Ilość komórek odpowiadająca gęstości optycznej 15 przy długości fali 600 nm użyto do laokulyjji 100 ml podłoża LB zawierającego 1% glukozę i 100 mikrogramów/ml kyebeaicyliay. Odzyskiwanie fagów do następnej tury przeprowadzono jak opisano powyżej.

W drugiej turze 6 x 10'1 cząstek fagowych i^cubowano podczas 90 minut z 1 mg zablokowanymi perełkami magnetycznymi opłaszczonymi streptawidyną w 200 mikeollteach TBS zawierającego 2,5 mM Ca2⁺ i 2% odtłuszczone mleko (ten etap wprowadzono do procedury dla uniknięcia selekcji klonów wiążących streptawidynę). Po usunięciu perełek postępowano zgodnie z takim samym protokołem jak w turze 1. Tury 3, 4 i 5 przeprowadzono jak turę 2 z takim wyjątkiem, że wyjściową liczbę fagów obniżono do 2 x 10 .

Po pięciu takich turach z wykorzystaniem biotynylowaakgo czynnika Xa, wyizolowane dwadzieścia cztery oddzielne klony oporne na kyeby4lnyliaę i poddano analizie ELISA. 96-studzleakowe płytki opłaszczone sfrcptawidyną (Pierce) blokowano w ciągu 1 godziny 200 mikro^rami TBS zawierającego 2% odtłuszczone mleko na studzienkę, następnie inkubowano w ciągu 1 godziny ze 100 mikrolitrami 20 nM blotyaylowyakgo czynnika Xa w TBS na studzienkę. Do studzienek dodano około 10'1 cząstek fagowych dla każdego klonu, rozcieńczonych w 100 mikrolitrach TBS zawierającego 2% odtłuszczone mleko i 0,1% Tweka20. Po 2 godzinach inkubacji studzienki przemyto cztery razy 200 mikrobami TBS zawierającego 0,1% Twkea-20. Związanego faga uwidaczniano przez kolejne inkubacje z aatysurowica królika skierowaną przeciw M13 (patrz przykład 11), z surowicą skierowaną przeciw surowicy królika skoniugowiaiąz alkaliczną fosfatazą (Sigma) oraz z p-aitrofeaylofosforynem jako substratem (Sigma). Absorbancje mierzono po 20 minutach przy długości fali 405 nm. Z 24 klonów pięć silnie wiązało czynnik Xa. Dla tych fagów nie zaobserwowano niespecyficznego wiązania podczas testowania w tym samym oznaczeniu ELISA z pominięciem biotynylowanego czynnika Xa.

Następnie z pięciu pozytywnych klonów przygotowano jed4oalnlowy DNA i wstawkę znajdującą się po stronie 3' genu 6 poddano automatycznemu sekweacjonowyniu DNA wykorzystując starter #1224 posiadający sekwencję CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 116] (New Eagiaad Biolabs). Stwierdzono, że wszystkie pięć klonów zawiera taki sam cDNA o skróconym końcu 5', posiadający długość 470 pz, połączony w ramce odczytu z genem 6 w pDONG63. Sekwencję aukikotyfową tego cDNA

183 855 oraz przewidywaną sekwencję aminokwasową przedstawiono na figurze 9 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19]. cDNA, oznaczony AcaNAPc2, koduje białko oznaczone izoformąc2 nAp, które należy do rodziny zbliżonych cząsteczek NAP.

Przykład 11

Przygotowywanie antysurowicy skierowanej przeciw fagowi Ml3

Antysurowicę skierowaną przeciw fagowi M13 przygotowano w króliku przez podskórną iniekcję około fagów M13K07 w 500 mikrolitrach PBS (0,01 M fosforan sodowy, pH 7,4 + 0,15 M chlorek sodowy) połączone z równą objętością adjuwanta. Faga M13K07 oczyszczono w gradiencie chlorku cezu, zasadniczo jak opisano w Glaser-Wuttke, G., Ksppner, J. i Raschsd,

I., Biochim. Biophys. Acta, 985: 239-247 (1989). Początkową iniekcję wykonano z kompletnym adiuwantsm Freunda w dniu 0, a następnie kolejne iniekcje wykonywano z niekompletnym adiuwantsm Freunda w dniach 7,14 i 35. Antysurowicę zabrano w 42 dniu.

Frakcję IgG surowicy wzbogacono przez przepuszczenie przez kolumnę białko A-Ssphaross, stosując warunki dobrze znane w nauce.

Przykład 12

Stosowanie sekwencji AcaNAP5 i AcaNAP6 do izolacji dodatkowych sekwencji kodujących NAP z A. caninum

Sekwencje cDNA, AcaNAP5 i AcaNAP6 (z przykładu 2) zastosowano do izolacji zbliżonych cząsteczek z tego samego gatunku pasożyta przez hybrydyzację krzyżową.

Wektory pGEM-9Zf(-) (Promega, Madison, WI) zawierające cDNA, AcaNAP5 i AcaNAP6 zastosowano do odzyskania przez PCR regionów kodujących dojrzałe białka NAP (polimeraza Taq firmy Life Technologies (Gaithersburg, MD); 20 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C). Zastosowanymi starterami oligonuklsotydowymi były: (1) YG109 skierowany na sekwencje kodujące końce C cDNA kodujących AcaNAP5 i AcaNAP6, posiadający sekwencję TCAGACATGT ATAATCTCAT GTTGG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 88), oraz (2) YG103 skierowany na sekwencje kodujące końce N dojrzałych AcaNAP5 i AcaNAPó, posiadający sekwencję AAGGCATACC cGgAGTGTGG TG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 89]. Starter YG109 zawiera pojedynczy niedopasowany nukleotyd, gdy stosuje się go z AcaNAP6 (podkreślona zasada T; porównaj z sekwenccą przedstawioną na figurze 3 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5]). To niedopasowanie nie wpływało znacząco na wydajność amplifikacji. Produkty PCR o właściwej wielkości (około 230 par zasad) dla AcaNAp5 i AcaNAPó wyizolowano z 1,5% żelu agarozowego. Równomolową mieszaninę wyznakowano promieniotwórczo przez wydłużanie losowych starterów (zestaw T7 QuickPrims; Pharmacia (Szwecja)), a następnie przepuszczono przez kolumnę Bio-Spin 30 (BioRad, Richmond, CA, USA).

Około 750 000 klonów cDNA Ancylostoma caninum (Aca) (patrz przykład 2 (B); sączki z duplikatami łysinsk przygotowano stosując Hybond™-N; Amersham (Buckinghamshire, Anglia) przeszukano wyznakowanymi promieniotwórczo fragmentami cDNA AcaNAP5 i AcaN—Pó, stosując następujące warunki prehybrydyzacji i hybrydyzacji: 5 x SSC (SSC: 150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trójsodowy), 5 x roztwór Denhardta, 0,5% SDS, 20% formamid, 100 mikrogramów/ml zsonikowansgo DNA spermy rybiej (Boehringer), reakcję prowadzono przez noc w temperaturze 42°C. Filtry przepłukano 4 razy po 30 minut w 2 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 37°C. Po ekspozycji na błonę rentgenowską zidentyfikowano łącznie około 300 hybrydyzujących miejsc.

z 300 dodatnich klonów poddano amplifikacji PCR (polimsraza Taq firmy Boshringer Mannheim, Niemcy; 30 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C) stosując wspomniany powyżej starter YG109, specyficzny wobec sekwencji cDNA AcaNAP5 i AcaNAPó kodujących końce C oraz starter #1218 skierowany na sskwsncje lambda-gtH zlokalizowane przed miejscem wstawiania cDNA (New England Biolabs, Bsverly, MA, GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 96]. 31 z 48 dodatnich klonów dało produkt PCR o wielkości podobnej do oczekiwanej dla cDNA typu AcaNAP5/6.

183 855

Pozostałe 17 dodatnich klonów użyto jako matryce do amplifikacji ze starterem #1218 i starterem specyficznym dla AcaNAPc2 (np. LJ189, skierowany na koniec C AcaNAPc2, posiadający sekwencję GTTTCGAGTT cCgGGAtAtA TAAAGTCC [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 117]; patrz przykład 10 i figura 9). Żaden z klonów nie dał produktu PCR. Wszystkie 17 dodatnich klonów poddano kolejnej turze hybrydyzacji przy mniejszej gęstości łysinek; we wszystkich przypadkach zidentyfikowano pojedyncze wyizolowane klony. 17 wyizolowanych klonów cDNA ponownie analizowano przez PCR wykorzystując pary starterów #1218/YG109 i #1218/ΤΠ89. Trzy z 17 klonów dały produkty amplifikacji ze starterem # 1218/YG109.

Pozostałe 14 klonów dalej analizowano przez amplifikacje PCR ze starterami #1218 i oligo(dT)-Not (Promega, Madison, WI; jest to ten sam starter, którego użyto do przygotowania pierwszej nici cDNA; patrz przykład 2). Wszystkie 14 klonów dało produkty PCR. Analiza przez elektroforezę żelową produktów PCR wykazała, że niektóre z cDNA były znacznie dłuższe, niż wstawka cDNA AcaNAP5.

Dziesięć klonów, włącznie z tymi posiadającymi najdłuższe wstawki cDNA, wybrano do określenia sekwencji. W tym celu wstawki cDNA zsubklonowano jako fragmenty SfiINotI w fagemidach typu pGEM (Promega, Madison, WI), jak opisano w przykładzie 2. Na podstawie sekwencjonowania zidentyfikowano osiem dodatkowych sekwencji białek NAP, oznaczonych następująco: AcaNAp23, AeaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP31, AcaNAP44, AcaNAP45, AcaNAP47 i AcaNAP48. Dwa dodatkowe klony cDNA, oznaczone AcaNAP42 i AcaNAP46, kodowały białka identyczne z kodowanym przez AcaNAP31 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 34]. Sekwencje nukleotydowe cDNA oraz przewidywane sekwencje aminokwasowe kodowanych białek przedstawiono na figurze 13A (AcaNAP23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 31]), na figurze 13B (AcaNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 32]), na figurze 13C (AcaNAP25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 33]), na figurze 13D (AeaNAP31 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 34]), na figurze 13E (AcaNAP44 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 35]), na figurze 13F (AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 36]), na figurze 13G (AcaNAP47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 37]) i na figurze 13H (AcaNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 38]). Wszystkie klony były klonami o pełnej długości i zawierają kompletny sygnał sekrecyjny. CDNA AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 36] i AcaNAp47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 37] kodują białka, które obejmują dwie domeny NAP; inne cDNA kodują białka posiadające pojedynczą domenę NAP.

Przykład 13

Stosowanie sekwencji DNA NAP do izolacji sekwencji kodujących białko NAP z Necator americanus

Sekwencje AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3], AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5], AcaNAPc2 o numerze identyfikacyjnym: 19],

AcaNAP23 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 31], AcaNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 32], AcaNAP25 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 33], AeaNAP3i [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 34], AcaNAP44 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 35], AcaNAP45 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 36], AcaNAP47 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 37], AcaNAP48 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 38], AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9], AceNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10], AceNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11], AduNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12], AduNAP7 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13] i HpoNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14] (patrz figury 1, 3, 7 i 13) wykorzystano do izolacji zbliżonych cząsteczek z pasożyta krwiożemego Necator americanus przez klonowanie PCR.

Utworzono aminokwasowe sekwencje konsensusowe homologicznych regionów białek NAP. Te sekwencje konsensusowe wykorzystano zastosowano następnie zaprojektowania następujących zdegenerowanych starterów PCR: NAP-1, 5'-AAR-CCn-TGY-GAR-MGGAAR-TGY-3' [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 90], odpowiadający sekwencji aminokwasowej NH2-Lys-Pro-Cys-Glu-(Arg/Pro/Lys)-Lys-Cys [sekwencja o numerze identyfi62

183 855 kacyjnym: 118]; NAP-4.RC, 5^,-TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA-4' [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 91], odpowiadający sekwencji aminokwasowej NH2-Cys(Val/Ile/Gln)-Cys-(Lys/Asp/Glu/Gln)-(Asp/Glu)-Gly-(Phe/Tyr)-Tyr [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 119]. Te startery zastosowano parami do wytworzenia przez PCR sond specyficznych dla NAP wykorzystując cDNA N. amerlcanus jako matrycę.

Dorosłe robaki N. americanus otrzymano od dr Davida Pritcharda, University of Nottingham. Poly(A+) RNA przygotowano stosując QuickPrsp mRNA Purification Kt (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Jeden mikrogram mRNA poddano odwrotnej transkrypcji stosując odwrotną transkryptazę AMV i losowe startery heksamerowe (Amersham, Arlington Holls, IL). Jedną pięćdziesiątą będącego produktem reakcji jednoniciowego cDNA wykorzystano jako matrycę dla ~400 pmoli każdego z NAP-1 i NAP-4.RC, stosując odczynniki do PCR GeneAmp (Perkin Elmer, Norwalk, CT) oraz aparat do cyklicznych zmian temperatury DNA Perkin-Elmer DNA. Warunki PCR były następujące: cykle 1-3, denaturacja w temperaturze 96°C w ciągu 2 minut, łączenie w temperaturze 37°C w ciągu 1 minuty i wydłużanie w temperaturze 72°C w ciągu 3 minut (czas przejścia pomiędzy temperaturą. 37°C a temperaturą 72°C wynosił 2 minuty); 4-5 cykli, denaturacja w temperaturze 94°C w ciągu 1 minuty, łączenie w temperaturze 37°C w ciągu 2 minut i wydłużanie w temperaturze 72°C w ciągu 2 minut (czas przejścia pomiędzy temperaturą. 37°C a temperaturą 72°C wynosił 2 minuty); cykle 6-45, denaturacja w temperaturze 94°C w ciągu 1 minuty, łączenie w temperaturze 37°C w ciągu 1 minuty i wydłużanie w temperaturze 72°C w ciągu 2 minut. Dla cykli 6-45 czas wydłużania zwiększano o 3 sekundy/cykl.

W wyniku amplifikacji PCR cDNA N. americanus z NAP-1 i NAP-4.RC otrzymano produkt cmplifkacji o długości około 100 bp. Produkt PCR wyznakowano [a^P^CIE (Amersham) stosując znakowanie z losowymi starterami (Stratagene, La Jolla, CA) i wyznakowany DNA oddzielono od niewbudowcnych nukleotydów stosując kolumnę Chromcspin-10 (Clonetech, Pało Alto, CA).

Bibliotekę cDNA skonstruowano stosując następującą procedurę. Dwuniciowe cDNA zsyntetyzowano z 1 mikrogarma poly(A+) RNA N. americanus wykorzystując odwrotną transkryptczę AMV i losowe startery heksamerowe (Amersham, Arlington Hilis, IL). Fragmenty cDNA większe niż około 300 bp oczyszczono w 6% żelu poliakrylamidowym i zligowcno z łącznikami EcoRI (Stratagene, San Diego, CA) stosując standardowe procedury. cDNA z łącznikami zligowcno ze strawionym EcoRI i zdefosforylowcnym wektorem lambda gtl O (Stratagene, San Diego, CA) i upakowano wykorzystując zestaw do upakowywania Gigapack Gold II (Stratagene, San Diego, CA).

Warunki prehybrydyzacji i hybrydyzacji były następujące:

x SSC (SSC : 150 0115 Nmd , 15mM (Miynim yrójaodojopw 7,0), 0,00 M f2sforan sodowy pH 6,5, 5 x roztwór Denhardta, 100 mikrogramów/ml strawionego, zdenaturowanego DNA spermy łososia, 0,23% siarczan dextrcnu. Prehybrydyzację i hybrydyzację prowadzono w temperaturze 42°C, następnie sączki płukano w ciągu 30 minut w temperaturze 45°C 2 x SSC po dwóch przemywaniach wstępnych 2 x SSC w ciągu 20 minut. Sączki eksponowano przez noc na kliszach rentgenowskich z dwoma ekranami wzmacniającymi w temperaturze -70°C.

Około 400 000 zrekombinowcnych fagów biblioteki wstawek N. americanus uzyskanych z losowymi starterami (niezcmplifikowcnych) przeszukano fragmentem PCR NAA-1/NAA-4.RC. Około jedenaście zrekombinowanych fagów hybrydyzowało z tą sondą, z których cztery wyizolowano i poddano analizie sekwencji nukleotydowej. Sskwencjnnowcnle dwuniciowego DNA uzyskano przez zsubklonowanie zawartych w tych fagach fragmentów EcoRI cDNA w pBluescript II KS+ (Stratagene, San Diego, CA). DNA zsekwencjonowano wykorzystując zestaw Sequsoass yersion 2,0 (Amersham, Arlington Hills, IL) i startery oligonukleotydowe M13 (Stratagene, San Diego, CA).

Cztery izolaty lambda zawierały DNA, który kodował pojedynczy polipeptyd NAP o długości 79 aminokwasów, którego sekwencja przypomina sekwencje NAP z Ancylostoma spp. i H. polygyrus. Polipeptyd NAP z N. americanus posiada obliczoną masę cząsteczkową wynoszącą 8859,6 daltonów. Sekwencję nukleotydową i przewidywaną sekwencję cminokwasową przedstawiono na figurze 14.

183 855

Przykład 14

Ekspresja zrekombinowanego AceNAP4 w komórkach COS (A) Ekspresja

AceNAP4 wytwarzano przejściowo w komórkach COS zasadniczo jak opisano w przykładzie 5 dla Pro-AcaNAP5 i w przykładzie 7 dla Pro-AcaNAP6.

Fagemid typu pGEM, który zawiera cDNA AceNAP4 (z przykładu 9), służył jako substrat do odzyskiwania przez PCR całego regionu kodującego AceNAP4, włącznie z sygnałem sekrecyjnym, z wykorzystaniem dwóch starterów oligonukleotydowych z dołączonym miejscem Xbal. Zastosowanymi starterami były: (1) SHPCR4, skierowany na koniec 5' genu i posiadający sekwencję GACCAGTCTA GACCACCATG GCGGTGCTTT ATTCAGTAGC AATA [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 120], oraz (2) SHPCR5, skierowany na koniec 3’ genu i posiadający sekwencję GCTCGCTCTA GATTATCGTG AGGTTTCTGG TGCAAAAGTG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 121]. Zawarte w starterach miejsca restrykcyjne Xbal podkreślono. Startery wykorzystano do ampllfikacj- sekwencji AceNAP4 zgodnie z warunkami opisanymi w przykładzie 5.

Po strawieniu enzymem XbaI, produkt amplifikacji posiadający oczekiwaną wielkość wyizolowano z żelu agarozowego i następnie podsawiono nim około fragment XbaI o długości 450 par zasad wektora pEF-BOS [Mizushima, S. I Nugata, S., Nuci. Acids Res., 18: 5322 (1990)]. Protokół opisany w przykładzie 5 wykorzystano do otrzymania klonu pEF-BOSAceNAP4, dla którego najpierw wykazano, że zawiera wstawkę XbaI w pożądanej orientacji przez PCR z zastosowaniem starterów PCR SHPCR4 i YG60, a następnie potwierdzono to przez określenie sekwencji. Klon ten wykorzystano do transfekcji komórek COS zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 5.

Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji komórek COS (patrz przykład 5, część B), podłoże COS zawierające 10%o FBS zastąpiono 50 ml podłoża składającego się z mieszaniny w stosunku 1:1 DMEM i Nutrient Mixture Ham's F-12 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Komórki inkubowano następnie w temperaturze 37°C i wytwarzanie zależnej od EGRczynnika Xa aktywności hamującej TF/czynnik VIIa oznaczano jak opisano w przykładzie E.

B. Oczyszczanie AceNAP4

1. Chromatografia anionowymienna

Supernatant hodowli komórek COS, w których zachodziła ekspresja AceNAP4 wirowano przy 1500 r.p.m. (około 500 x g) w ciągu dziesięciu minut przed dodaniem następujących inhibitorów proteaz (ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA, USA): 1,0 x 10'⁵ M pepstatyny A (kwas izowalerylo-V al-Val-4-amino-1 -hydroksy-6-metylo-heptanoilo-Ala-4-amino-3 -hydroksy6-metylol1epItaowyj, 1,0 x 10‘ M leupeptyny, 1,0 x 10'⁵M AEBSF (fluorek 4-(2-aminoetylo)benzenosulfonylowy). Przed doprowadzeniem 1N HCl pH do 5,3, do roztworu dodano octanu sodowego w postaci stałej stałego do 50 mM stężenia końcowego. Supernatant sklarowano przez przesączenie przez sączek z octanu celulozy o średnicy porów 0,2 mikrometra (Corning Inc., Corning, NY, USA).

Sklarowany supernatant (objętość całkowita około 450 ml) nałożono na kolumnę Poroj30 HQ (Perseptive Biosystems, MA) o wymiarach 1 x 2 cm zrównoważoną uprzednio buforem anionowym (0,05 M octan sodowy, pH 5,3, 0,1 M NaCl) przy szybkości przepływu 5 ml/minutę. Podczas tego etapu oczyszczania kolumna i próbka znajdowały się w temperaturze otoczenia. Kolumnę następnie przepłukano 10 objętościami 50 mM octanu sodowego, 0,37 M NaCl, pH 5,3.

Materiał, który posiadał zależną od EGR-FXa aktywność hamującą aktywność amidolityczną fVIIa/TF (patrz przykład E) wyeluowano 50 mM octanem sodowym, 1M NaCl, pH

5,3 przy szybkości przepływu 2 ml/minutę.

2. Chromatografia z odwróconymi fazami

Próbkę połączonych frakcji zebranych po chromatografii anionowymiennej nałożono na kolumnę C18 (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) o wymiarach 0,46 x 25 cm, a następnie rozwijano liniowym gradientem 10-35% acetonitrylu w 0,1% (v/v) kwasie trifluorooctowym przy szybkości przepływu 1 ml/minutę z szybkością zmiany 0,4% acetonitrylu/minutę. Zależną od EGR-FXa aktywność hamującą aktywność amidolityczną TF/FVIIa (patrz przykład E)

183 855 monitorowano i frakcje zawierające tą aktywność zebrano i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

3. Charakteryzacja zrekombinowanego AceNAP4

Związek AceNAP4 wykazywał podczas SDS-PAGE w żelu 4-20% ruchliwość zgodną z wielkością przewidzianą na podstawie sekwencji cDNA (wybarwiony błękitem Coomassiego żel z materiałem po chromatografii RP).

Przykład 15

Wytwarzanie i oczyszczanie zrekombinowanego AcaNAPc2 w P. pastoris

A. Konstruowanie Wektora Ekspresyjnego

Ekspresję genu AcaNAPc2 w P. pastoris przeprowadzono stosując protokół przedstawiony szczegółowo w przykładzie 3 dla ekspresji AcaNAP5, z następującymi modyfikacjami.

Wektora pDONG63 zawierającego cDNA AcaNAPc2, opisanego w przykładzie 10, użyto do wyizolowania przez amplifikację (odzyskiwanie przez PCR) regionu kodującego dojrzałe białko AcaNAPc2 (przy zastosowaniu polimerazy Vent firmy New England Biolabs, Beverly, MA; 20 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 94°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C). Użyto następujących starterów oligonukleotydowych:

LJ190: AAAGCAACGA-TGCAGTGTGG-TGAG

[sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 122]

LJ191: GCTCGCTCTA-GAAGCTTCAG-TTTCGAGTTC-CGGGATATAT-AAAGTCC

[sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 123]

Starter LJ595, dla którego sekwencjami docelowymi są sekwencje C-końcowe, zawierał nie ulegające łączeniu przedłużenie, które zawierało miejsca restrykcyjne Xbal i HindIII (podkreślone).

Po strawieniu enzymem XbaI, produkt amplifikacji posiadający oczekiwaną wielkość wyizolowano z żelu, a następnie ufosforylowano enzymatycznie (kinaza polinukleotydowa T4 firmy New England Biolabs, Beverly, Ma). Po termicznej inaktywacji kinazy (w temperaturze 70°C w ciągu 10 minut) fragment z tępym końcem/XbaI sklonowano w określonej orientacji w wektorze pYAM7SP8 do celów ekspresyjnych. Fragment wektora pYAM7SP8, do którego wprowadzano wstawkę przygotowano przez trawienie restrykcyjne Stul-Spel i oczyszczono w żelu agarozowym. Szczep E. coli WK6 [Zell, R. i Fritz, H.-J., EMBO J., 6: 1809-1815 (1987)] stransformowano mieszaniną ligacyjną i wyselekcjonowano klony oporne na ampicylinę.

Na podstawie analizy restrykcyjnej, klon plazmidowy zawierający wstawkę o oczekiwanej wielkości, oznaczony pYAM7SP-NAPC2, zachowano do dalszej charakterystyki. Określenie sekwencji klonu pYAM7SP-NAPC2 potwierdziło precyzyjne wstawienie regionu kodującego dojrzałe AcaNAPc2 połączonego z prepro-sekwencją sygnałowo-liderową, zgodnie z przewidywaniami schematu konstruowania, a także nieobecność niepożądanych mutacji w regionie kodującym.

B. Ekspresja zekombinowanego AcaNAPc2 w P. pastoris

Szczep Pichia GTS115 (his4) opisano w Stroman, D.W. i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 855 231. Wszystkie manipulacje na P. pastoris prowadzono zasadniczo jak opisano w Stroman, D.W. i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 855 231.

Około 1 mikrograma plazmidowego DNA pYAM7SP-NAPC2 poddano elektroporacji do szczepu GTS115 przy zastosowaniu standardowego protokołu. Plazmid uprzednio przeprowadzono w postać liniową poprzez strawienie Sali, teoretycznie mając na celu zajście integracji z locus chromosomalnym his4.

Selekcję szczepu o wysokim poziomie ekspresji AcaNAPc2 przeprowadzono jak opisano w przykładzie 3 dla izoformy NAP5 (AcaNAP5) przy zastosowaniu przeszukiwania minihodowli. Minihodowle testowano pod kątem obecności ulegającego sekrecji AcaNAPc2 przy użyciu oznaczenia fVIIa/TF-EGR-fXa (Przykład E), w wyniku czego wyselekcjonowano dwa klony. Po drugiej turze przeszukiwania, przy użyciu tej samej procedury, lecz tym razem w

183 855 wytrząsanych kolbach, wybrano jedną wyizolowaną komórkę gospodarza i oznaczono ją P. pastoris GTS115/7SP-NAPc2.

Wykazano, żę komórka gospodarza, GTS112/7SP-NAPc2, posiadała fenotyp typu dzikiego wykorzystujący metanol (Mut⁺), co wskazuje, że integracja kasetki ekspresyjnej z chromosomem GTS115 nis zmienia funkcjonalności genomowego genu AOX1.

Późniejsze wytwarzanie zrekombinowanego materiału AcaNAPc2 przeprowadzono w hodowlach w wytrząsanych kolbach, jak opisano w Stroman, D.W. i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 855 231. Zrekombinowany produkt oczyszczono z supematantu komórek Pichia pastoris jak opisano poniżej.

C. Oczyszczanie zrekombinowanego AcaNAPc2

1. Chromatografia kationowymienna

Supsrnatant hodowli (100 ml) wirowano przy 16 000 r.p.m. (około 30 000 xg)w ciągu 20 minut przed doprowadzeniem pH do 3 1N HCl. Przewodnictwo supematantu zmniejszono do mniej niż 10 mS/cm przez dodanie wody oczyszczonej w MiliQ. Rozcieńczony supsrnatant sklarowano przez przepuszczenie przez sączek z octanu celulozy o średnicy porów 0,22 mikrometra (Coming Inc., Coming, NY, USA).

Całą objętość (około 500 ml) supematantu nałożono na kolumnę Poros20HS (Perssptivs Biosystems, MA) o wymiarach 1 x 2 cm, uprzednio zrównoważoną buforem kationowym (50 mM cytrynian sodowy, pH 3) z szybkością przepływu 2 ml/minutę.

Podczas tego etapu oczyszczania kolumna i rozcieńczony supsrnatant fermentacyjny posiadały temperaturę pokojową. Następnie kolumnę przepłukiwano 50 objętościami buforu kationowego i 10 objętościami bufom kationowego zawierającego 0,1 M NaCl. Materiał posiadający aktywność hamującą w oznaczeniu protrombinazy wyeluowano buforem kationowym zawierającym 1 M NaCl z szybkością przepływu 2 ml/minutę.

2. Chromatografia sączenia molekularnego z zastosowaniem Superdex30

Połączone frakcje wyeluowans 1 M NaCl zawierające materiał hamujący EGR-fXafYTIa/TF (3 ml; patrz przykład C) z kolumny kationowymiennej nałożono na kolumnę Supsrdex30 PG (Pharmacia, Szwecja) o wymiarach 1,6 x 60 cm uprzednio zrównoważoną 0,1 M fosforanem sodowym pH 7,4, 0,15 M NaCl w temperaturze otoczenia. Chromatografię prowadzono z szybkości ą przepływu 2 ml/minutę. Aktywność hamującą protrombinazę (Przykład 3) wyeluowano pomiędzy 56 a 64 ml rozdziału i zebrano razem.

3. Chromatografia z odwróconymi fazami

Jeden ml połączonych frakcji z chromatografii sączenia molekularnego nałożono na kolumnę C18 (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) o wymiarach 0,46 x 25 cm, którą następnie rozwijano gradientem liniowym 10-30% acetonitrylu w 0,1% (v/v) kwasie trifluorooctowym z szybkością zmiany 0,5% acetonitrylu/minutę. Główny pik, który ulegał elucji przy około 20-25% acetonitrylu zebrano manualnie i stwierdzono w nim aktywność hamowania protrombinazy.

4. Określanie masy cząsteczkowej

Masę głównego składnika wyizolowanego jak opisano w części (1) do (3) tego przykładu określono stosując elektrom/pyłową jonizacyjną spektrometrię masową. Oznaczona masa zrekombinowanego AcαNAPc4 wynosiła 9640 daltonów, w pełni zgodnie z obliczoną masą cząsteczkową tej cząsteczki otrzymaną na podstawie sekwencji cDNA.

Przykład 16

Ekspresja AcaNAP42 w P. pastoris

Wektor pGEM-9zf(-) (Promega) zawierający cDNA AcaNAP42 (Przykład 12) użyto do wyizolowania regionu kodującego dojrzałe białko AcaNAP42 przez amplifikację PCR (stosując polimerazę Taq firmy Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey; 25 cykli temperaturowych: 1 minuta w temperaturze 94°C, 1 minuta w temperaturze 50°C i 1 minuta w temperaturze 72°C). Użyto następujących starterów oligonukleotydowych:

oligo3: GAG ACT TTT AAA TCA CTG TGG GAT CAG AAG³' [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 124] oligo2: 5’TTC AGG ACT AGT TCA TGG TGC GAA AGT AAT AAA³’ [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: i45]

183 855

Starter oligo3, dla którego sekwencją docelowąjest sekwencja N-końcowa, zawierał nie ulegające łączeniu przedłużenie obejmujące miejsce restrykcyjne Dral (podkreślone). Starter oligo2, dla którego sekwencją dozelowąjeyt sekwencja C-końcową, zawierał miejsce restrykcyjne Spel.

Produkt zmpliflkzzji NAP posiadający oczekiwaną wielkość około 250 bp strawiono enzymami Dral i Spel, oczyszczono przez ekstrakcję fenolem: chloroformem: alkoholem izozmżlowżm (25:24:1 v/v) i wytrącono alkoholem etylowym. Fragment wektora pYAM7SP8, do którego wprowadzano wstawkę (Przykład 3) przygotowano przez trawienie restrykcyjne Stul-Spel, occyycccono przez ekstrakcję feaolem:chloroformem:zlkgholem icoαmżlowym (25:24:1 v/v) i wytrącono alkoholem etylowym. Szczep E. coli XL1-Blue [Bullock, W.O., Femande, J.M., i Short, J.M., Biotechaiąues 5: 376-379 (1987)] straasformowano mieszanin, ligacżjaą zawierającą powyższe fragmenty DNA i wyselekcjonowano klony oporne na ampicylinę.

Na podstawie analizy restrykcyjnej, klon plazmidowy zawierający wstawkę o oczekiwanej wielkości, ocRazcoRż pYAM7SP8-NAP42, pozostawiono do dalszej charakterystyki. Określenie sekwencji klonu potwierdziło prawidłowe wstawienie dojrzałego regionu kodującego połączonego z prepro-sekwencżą sygnałowo-liderow, PHO5/zzynRlka alfa, zgodnie z przewidywaniami schemat konstruowania, a także nieobecność niepożądanych mutacji w regionie kodującym.

Około 10 mikrogramów plazmidu pYAM7SP8-NAP42 poddano elektroporacji do szczepu Pichia GTS^ (his4), opisanego w przykładzie 3. Plazmid uprzednio strawiono enzymem Notl, w celu zajścia integracji w locus zhromosomzlRżm AOX1.

TrzRyformzRtż His+ wyselekcjonowano jak opisano w przykładzie 3. Pojedyncze kolonie (n=90) z elektroporacji hodowano w studzienkach 96-studzieakowej płytki, cawierzjącżzh po 100 mikrolitrów minimalnego podłoża z glicerolem, w ciągu 24 godzin na mieszadle do płytek w temperaturze pokojowej. Jeden litr miaimaJRego podłoża z glicerolem zawierał 13,4 g Yeast Nitrogen Base bez aminokwasów (DIFCO); 400 mikrogramów biotyny; 10 ml glicerolu i 10 mM fosforanu potasowego (pH 6,0).

Komórki osadzono i ponownie zawieszono w świeżym mCnimzJRżm podłożu z metanolem (taki sam skład, jak powyżej z wyjątkiem zastąpienia 10 ml glicerolu 5 ml metanolu) dla indukcji promotora AOX1. Po dodatkowym okresie inkubacji 24 godzin z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej, 10 mikrolitrów supematantów hodowli testowano przez ocaazcenie czasu protrombiaowego (przykład B). Obecność ulegającego sekrecji AzzNAP42 wykazano przez przedłużenie czasu krzepnięcia osocza ludzkiego.

Przykład 17

Ekspresja AcaNAPc2/Prolina w P. pastoris

Dla wzmocnienia stabilności i poziomu ekspresji AcaNAPc2 skonstruowano zmutowany cDNA, który kodował dodatkową resztę probny w końcu C białka (AczNAPc2/ProJlRa lub AczNAPc2P). Wektor ekspresyjny pYAM7SP8-NAPc2/Proliaa zbudowano w ten sam sposób jak opisano w przykładzie 16. Starter oUgo 8 jest starterem N-końcowym z miejscem restrykcyjnym Dral, z starter oligo 9 jest starterem C-końcowym zawierającym miejsce XbaI i kodoa aminokwasu, TGG, dla dodania jednej reszty prolmy do końca C naturalnej postaci AcaNAPz2.

oligo 8:⁵'GCG TTT AAA GCA ACG ATG CAG TGT TGG G3'

[sekwencja o numerze ldeRtżfϊkzzżjRym: 126] oligo 9: A GCT CTA GAA GCT TCA TGG GTT TCG AGT TCC GGA ATA TAT AAA GGC3’

[sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 127]

Po strawieniu produktu amplifikayji (około 270 bp) enzymami Dral i XbaI, ozcżsczcono go i zligowaRo z fragmentem wektora pYAM7SP8 przygotowanym przez trawienie restrykcyjne Stul-Spel. Klon plazmidowy zawierający wstawkę AcaNAPc2/Proliaa potwierdzono przez cyekweazjgRowaRle DNA i ocaαycono pYAM7SP8-NAPc2/Proliaa^.

Wektor pYAM7SP8-NAPc2/Prolmz użyto do transformacji szczepu GTS5 55 (his) jak opisano w przykładzie 16. GranyformαRty wyselekcjonowano i hodowano zgodnie z przykła183 855 dem 16. Obecność ulegającego sekrecji AejNAPc2/Prolina w podłożu wzrostowym wykrywano przez przedłużanie czasu krzepnięcia osocza ludzkiego (patrz przykład B).

Przykład 18

Alternatywne metody oczyszczania AcaNAP5, AcaNAPc2 i AcaNAPc2P (A) AcaNAP5

Alternatywna metoda oczyszczania AcaNAP5 z podłoża fermentacyjnego jest następująca. Komórki usunięto z brzeczki fermentacyjnej szczepu Pichia pastoris wykazującego ekspresję AcaNAP5 i podłoże zamrożono. Procedurę oczyszczania rozpoczęto od rozmrożenia zamrożonego podłoża w ciągu nocy w temperaturze 4°C, następnie rozcieńczenia go w około czterech częściach wody z MiliQ dla obniżenia przewodnictwa do mniej niż 8 mS. pH doprowadzono do 3,5 i podłoże przesączono przy użyciu sączka z octanu celulozy o średnicy porów 0,22 pm (Corning Inc., Corning, NY).

Aktywność materiału zawierającego NAP określano przez oznaczenie protrombinowego czasu krzepnięcia na początku procedury oczyszczania i na każdym etapie procedury przy zastosowaniu protokołu podanego w przykładzie B.

Przesączoną pożywkę nałożono na kolumnę Pharmacia SP-Fast Flow z szybkością przepływu 60 ml/minutę w temperaturze otoczenia, i kolumnę przepłukano 10 objętościami 50 mM cytrynianu/fosforanu, pH 3,5. Elucję prowadzono etapami 100 mM NaCl, 250 mM NaCl, a następnie 1 000 mM NaCl, wszystkie w 50 mM cytrynianie/fosforanie, pH 3,5. Aktywność w oznaczeniu czasu protrombinowego (PT) wykryto w eluacie 250 mM NaCl. Cały eluat dializowano do uzyskania przewodnictwa poniżej 8 mS.

pH materiału doprowadzono do 4,5 kwasem octowym, a następnie nałożono go w kolumnę sulfoetyloaspartamidu w temperaturze otoczenia. Do przepłukania kolumny użyto około 10 objętości 50 mM octanu amonowego, pH 4,5/40% acetonitrylu. Kolumnę eluowano 50 mM octanem amonowym, pH 4,5/40% acetonitrylem/200 mM NaCl, a eluat poddano dializie lub diafiltracji jak uprzednio.

Eluat doprowadzono do 0,1% stężenia TFA, nałożono na kolumnę Vydac C18 z odwróconymi fazami do rozdziału białek/peptydów w temperaturze otoczenia i eluowano przy użyciu 0,1% TFA/19% acetonitrylu, następnie 0,1% TFA/25% acetonitrylu, z szybkością przepływu 7 ml/minutę. NAP wykryto i odzyskano z frakcji wyeluowanej 0,1% TFA/25% acetonitrylem.

(B) AcaNAPc2 i AcaNAPc2P

AcaNAPc2 lub AejNAPc2P można oczyścić jak opisano powyżej, z następującymi modyfikacjami protokołu. Po rozmrożeniu i rozcieńczeniu podłóż dla osiągnięcia przewodnictwa poniżej 8 mS, pH pożywek zawierających AcaNAPc2 doprowadzono do pH 5,0 stosując NaOH. Przesączone podłoża nakładano na kolumnę Pharmacia Q Fast Flow z szybkością przepływu 60 ml/minutę w temperaturze otoczenia, i kolumnę przepłukano 10 objętościami 50 mM kwasu octowego, pH 5,0. Elucję prowadzono etapami 100 mM NaCl, 250 mM NaCl, a następnie 1 000 mM NaCl, wszystkie w 50 mM kwasie octowym, pH 5,0. Aktywność PT wykryto w eluacie 250 mM NaCl. Cały eluat przedializowano do uzyskania przewodnictwa poniżej 8 mS, i kontynuowano procedurę opisaną powyżej przy użyciu sulfoetyloaspartamidu i chromatografii RP-HPLc.

Przykład A. Oznaczenie amidolityczne czynnika Xa

Zdolność NAP według niniejszego wynalazku do działania jako inhibitory aktywności katalitycznej czynnika Xa oceniono przez oznaczanie indukowanego przez NAP hamowania aktywności amidolitycznej katalizowanej przez enzym ludzki, którą wyrażano jako wartości Ki*.

Buforem użytym do wszystkich oznaczeń był HbSa (10 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM chlorek sodowy, 0,1% albumina surowicy bydlęcej). Wszystkie odczynniki pochodziły z Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), jeśli nie wskazano inaczej.

Oznaczenie prowadzono przez połączenie w odpowiednich studzienkach płytki do mikromiareczkowania Corning 50 mikrolitrów HBSA, 50 mikrolitrów badanego związku NAP rozcieńczonego (0,025-25 nM) HBSA (lub samego HBSA w pomiarach szybkości niehamowanej) i 50 mikrolitrów enzymu czynnika Xa rozcieńczonego HBSA (przygotowanego z oczyszczonego ludzkiego czynnika X otrzymanego z Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN), zgodnie z metodą opisaną przez Bock, P.E. i in., Archives of Biochem. Biophys. 273: 375 (1989). Enzym

183 855 rozcieńczano HBSA przed oznaczeniem, w którym stężenie końcowe wynosiło 0,5 nM. Po inkubacji w ciągu 30 minut w temperaturze otoczenia, do studzienek dodawano 50 mikrolitrów substratu S2765 (dichlorowodorek N-alfa-benzyloksykyebo4yio-D-jegi4i4ylo-L-gllcylo-L-jegi4iao-pnItroy4iilfu), otrzymanego z Kabi Diagnostica (lub Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH), przygotowanego w wodzie fejonIzowa4kj, a następnie rozcieńczonego HBSA przed oznaczeniem, uzyskując końcową objętość całkowitą 200 mikrolitrów i końcowe stężenie 250 mikromolowe (około 5 razy przewyższające Km). Szybkość początkową hydrolizy substratu chromogennego mierzono poprzez zmiany w abso^^cji przy długości fali 405 nm przy użyciu Thermo Maci® KIaktic ^^oplate Reader (Molecular D^ices, Pało alto, CA) w ciągu okresu 5-mlautowego, podczas którego wykorzystywane było mniej niż 5% dodanego substratu.

Stosunki hamowanych wstępnie zrównoważonych szybkości reakcji w stanie równowagi dynamicznej w obecności NAP (Vi) do nikhymowy4ej szybkości samego wolnego fXa (Vo) przedstawiono na wykresie w zależności od odpowiednich stężeń NAP. Następnie dane te fitowano bezpośrednio do równania dla inhibitorów silnie wiązanych [Morrison, J.F. i Walsh, C.T., Adv. Enzymol. 61: 201-300 (1988)], na podstawie którego obliczono równowagową stałą równowagi inhibicji dysocjacji Kj*.

Tabela 1 poniżej podaje wartości Ki* dla badanych związków AnjNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4], AcaNAPó [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6] i AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59], przygotowanych jak opisano odpowiednio w przykładach 3, 4 i 15. Dane wykazały użyteczność AcyNAP5 i AcyNAP6 jako potencjalnych inhibitorów ludzkiego FXa in vitro. Przeciwnie, AcyNAPc2 nie hamuje efektywnie aktywności ymifoiitycz4ej FXa,co oznacza, że nie wpływa na aktywność katalityczną wolnego fXa.

Tabela 1

Związek	Ki* (pM)
AnyNAP5	43 ±
AnyNAP6	996 ±5
AnyNAPn2	Na

TNI=brak inhibicji; maksymalnie obserwowano 15% hamowania do 1 μΜ.

Przykład B. Oznaczenia czasu protrombinowego (PT) i częściowego czasu aktywowanej trombopłastyny (aPTT)

Pezeniwkezepiiwy wpływ ex vivo NAP według 4Inikjszego wynalazku w osoczu ludzkim oceniano przez pomiar wydłużania częściowego czasu aktywowanej teombopljstyny (aPTT) i czasu protrombinowego (PT) w szerokim zakresie stężeń każdego inhibitora.

Świeżo zamrożone zebrane normalne cytryaIy4Owe osocze ludzkie otrzymano z George King Biomedical, Ovdeiyaf Park, KS. Odpowiednie oznaczenia aPTT i PT wykonano przy użyciu automatycznego koagulometru ^ag-A-Mate RA4 (General Diagnostics, Organon Tkchainj, Oklahoma City, OK) z zastosowaniem odpowiednio odczynników Automated aPTT Piytelia^R L (Organon Tenhainy, Durham, NC) i SimplastinR Excel (Organon Technicy Durham, NC) jako inhibitorów krzepnięcia zgodnie z instrukcjami producentów.

Oznaczenia prowadzono przez sporządzenie serii rozcieńczeń każdego badanego NAP w szybko rozmrożonym osoczu, a następnie dodanie odpowiednio 200 mikrolitrów lub 100 mikrolitrów odczynników podanych powyżej do studzienek statywu do oznaczeń aPTT i PT. Alternatywnie, NAP rozcieńczono kolejno HBSA i dodawano 10 pl każdego rozcieńczenia do 100 pl normalnego osocza ludzkiego w studzienkach statywu Coag-A-Mate, a następnie dodawano odczynnik.

Stężenia NAP przedstawiono na wykresie w zależności od czasu krzepnięcia i obliczono stężenie podwajające czas, to znaczy określone stężenie NAP, które podwajało kontrolny czas krzepnięcia PT lub aPTT. Kontrolne czasy krzepnięcia (nieobecność NAP) w PT i aPTT wynosiły odpowiednio 12,1 sekundy i 28,5 sekundy.

183 855

Tabela 2 poniżej przedstawia wpływ przeciwkrzepliwy ex vivo AcaNAP2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4], AcaNAPó [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6], AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59], AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 62] i Pro-AcaNAA5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7] wyrażony jako stężenie każdego z nich, które podwajało (stężenie podwajające) czas krzepnięcia kontroli normalnego osocza ludzkiego w oznaczeniach krzepnięcia odpowiednio PT i aPTT w stosunku do oznaczenia kontrolnego, gdzie żadne NAP nie było obecne. Dane wykazują użyteczność tych związków jako silnych czynników przeciwkrzepliwych osocza ludzkiego. Dane te wykazują także równoważność natywnego NAP i zreformowanego NAP.

Tabela 2

Związek	Stężenie podwajające (nM) w PT	Stężenie podwajające (nM) w aPTT
AcaNAP5a	43 ±8	87 ±4
AcaNAP6^a	37 ±3	62 ±0
AcaNAPc2“	15 ± 1	105 ± 11
AceNAP4“	40 ±4	115 ± 12
AcaNAP5b	26,9	76,2
AcaNAP5“	39,2	60,0
Pro-AcaNAP5^d	21,9	31,0

“Wytworzone w Pichia pastoris. bBiałko natywne.

“Wytworzone w Pichia pastoris (inna szarża rekombinacyjna niż O).

“Wytworzone w komórkach COS.

Figury 10A i 10B także przedstawiają indukowane NAP wdłużcnie PT (figura 10A) i aPTT (figura 10B) w sposób zależny od dawki.

Przykład C. Oznaczenie hamowania protrombinazy

Zdolność NAP według niniejszego wynalazku do działania jako inhibitor aktywacji protrombiny przez czynnik Xa, który wszedł w skład fizjologicznego kompleksu protrombinazy oceniano przez oznaczenie odpowiedniej stałej inhibicji Ki*.

Aktywność protrombinczy mierzono przy zastosowaniu sprzężonego oznaczenia amidolitycznego, gdzie wstępnie utworzony kompleks ludzkiego FXa, ludzkiego czynnika Va (FVa) i pęcherzyków aosaollpldowych najpierw aktywuje ludzką protrombinę do trombiny. Aktywność cmidolityczna wydzielanej trombiny mierzy się równolegle przy użyciu substratu chromogennego. Oczyszczony ludzki FVa otrzymano z Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT). Oczyszczoną ludzką protrombinę zakupiono w Celsus Laboratories, Inc. (Cincinnati, OH). Substrat chromogenny Peaachrnns t-PA (CH₃SC2-D-heksahydrntyrnzynoglicylo-L-arginino-p-nitrocnilid) firmy Pentaphcrm Ltd (Bazylea, Szwajcaria) zakupiono w Centerchem, Inc. (Tcrrytown, NY). Przed użyciem substrat rozpuszczano w wodzie dejonizowcnej. Pęcherzyki aosfolipidowe składające się z aosaatydylocholmy (67%, w/v), ansfatydyloglicerolu (16%, w/v), fosaatydyloetanoloaminy (10%, w/v) i fosfatydyloseryny (7%, w/v) utworzono w obecności detergentu, jck opisali Ruf i in. [Ruf, W., Miles, D.J., Rehemtulla, A. i Edgington, T.S., Methods in Eozymology 222: 209-224 (1993)]. Fosfolipidy zakupiono w Avanti Polar Lipids, (Alabaster, Alabama).

Kompleks protrombmczy tworzono w probówce polipropylenowej przez połączenie FVc, FXa i pęcherzyków aosaolipldowych (PLV) w HBSA zawierającym 3 mM CaCL, w ciągu 10 minut. W odpowiednich studzienkach płytki do nikroniarsczkokaola łączono 50 pl kompleksu z 50 pl NAP rozcieńczonego HBSA lub samego HBSA (dla pomiaru V_o szybkości niehcmowcnej). Po inkubacji w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej, zapoczątkowywano reakcję w trzech powtórzeniach przez dodanie roztworu substratu zawierającego protrombinę ludzką i chromogenny substrat trombiny, Pefachrome tPA. Końcowe stężenia

183 855 reagentów w objętości całkowitej 150 μΐ HBSA wynosiły: NAP (0,025-25 nM), FXa (250 fM), PLV (5 ąiM), protrombina (250 nM), Pefachrome tPA (250 μM, 5 x Km) i CaCl₂, (3 mM) .

Aktywność protrombinazy fXa mierzono jako wzrost absorbancji przy długości fali 405 nm w ciągu 10 minut (szybkość), dokładnie jak opisano w przykładzie A, w warunkach równowagi dynamicznej. Wzrost absorbancji w czasie miał charakter sigmoidalny, odzwierciedlając sprzęgnięte reakcje aktywacji protrombiny przez kompleks protrombinazy zawierający FXa i następującej po niej hydrolizy Pefachrome tPA przez utworzoną trombinę. Dane z każdej studzienki z trzech powtórzeń uśredniano i fitowano przez wielokrotną liniową, analizę regresji metodą najmniejszych kwadratów, jako funkcję absorbancji w zależności od czasu², jak opisano w [Carson, S.D. Comput. Prog. Biomed. 19: 151-157 (1985)] dla określenia początkowej szybkości (V-) aktywacji protrombiny. Stosunki hamowanych początkowych szybkości w stanie równowagi dynamicznej w obecności NAP (Vj) do niehamowanej szybkości samej protrombinazy fXa (V_o) przedstawiono na wykresie w zależności od stężeń NAP. Dane te fitowano bezpośrednio do równania dla silnie wiązanych inhibitorów, jak w przykładzie A powyżej i obliczono pozorną stalą równowagi inhibicji dysocjacji Kj*.

Tabela 3 poniżej podaje stałą dysocjacji inhibitora (K*) dla zrekombinowanego AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4], AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6] i AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59] (wszystkie wytworzone w Pichla pastoris w opisany sposób) w zależności od aktywacji protrombiny przez ludzki fXa włączony do kompleksu protrombinazy. Dane te wykazują użyteczność tych związków jako inhibitorów ludzkiego FXa włączonego w skład kompleksu protrombinazy.

Tabela 3

Związek	Ki* (pM)
AcaNAP5	144± 15
AcaNAP6	207 ± 40
AcaNAPc2	2385 ± 283

Dane przedstawione w przykładach A, B i C sugerują, że AcaNAP5 i AcaNAP6 mogą oddziaływać z FXa w podobny sposób, który obejmuje bezpośrednie ograniczanie dostępu zarówno peptydylowego, jak i makrocząsteczkowego substratu (protrombiny) do centrum katalitycznego enzymu. Przeciwnie, AcaNAPc2 wydaje się oddziaływać z FXa w sposób, który zakłóca tylko makrocząsteczkowe oddziaływania tego enzymu z substratem i/lub kofaktorem (czynnik Va), podczas gdy nie hamuje bezpośrednio przemiany katalitycznej substratu peptydylowego (patrz Tablica 1).

Przykład D. Oznaczenia enzymatyczne in vitro dla określenia specyficzności aktywności

Zdolność NAP według niniejszego wynalazku do działania jako specyficzny inhibitor aktywności katalitycznej FXa lub aktywności TF/VIIa oceniano przez określenie, czy badane NAP może hamować inne enzymy w oznaczeniu w stężeniu, które było 100 razy wyższe od stężenia następujących spokrewnionych proteaz serynowych: trombiny, czynnika Xa, czynnika XIa, czynnika XIIa, kallikreiny, aktywowanego białka C, plazminy, zrekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu (rt-PA), urokinazy, chymotrypsyny i trypsyny. Oznaczeń tych używa się także wyznaczania specyficzności NAP posiadających aktywność hamującą proteazy serynowe.

(1) Ogólny protokół, oznaczeń hamowania enzymów

Buforem użytym do wszystkich oznaczeń był HBSA (Przykład A). Wszystkie odczynniki rozpuszczono w wodzie dejonizowanej, a następnie rozcieńczono HBSA przed oznaczeniem. Test amidolityczny dla oznaczenia swoistości inhibicji proteaz serynowych prowadzono przez połączenie w odpowiednich dołkach mikropłytki Corning: 50 μΐ HBSA, 50 μl NAP o określonym stężeniu rozcieńczonego HBSA lub samego HBSA (niehamowana szybkość kontrolna, V_o) i 50 μl określonego enzymu (patrz specyficzne enzymy poniżej). Po inkubacji w ciągu 30 minut w temperaturze otoczenia, do studzienek dodawano, w trzech powtórzeniach, 50 μl substratu. Stężenia końcowe reagentów w objętości całkowitej 200 μΐ HBSA wy183 855 nosiły: NAP (75 nM), enzym (750 pM) i substrat chromogenny (jak wskazano poniżej). Szybkość początkową hydrolizy substratu chromogennego mierzono jako zmianę absorbancji przy długości fali 405 nm w ciągu - 5-minutowego okresu, podczas którego hydrolizie ulegało mniej niż 5% dodanego substratu. Szybkości w zawierających NAP próbkach badanych (Vi) wyrażono następnie dla każdego enzymu jako procent niehamowanej szybkości kontrolnej (V_o) według następującego wzoru: ViTVo x 100.

(2) Specyficzne oznaczenia enzymatyczne (a) Oznaczenie trombiny

Aktywność katalityczną trombiny oznaczono przy użyciu substratu chromogennego Pefachrome t-PA (CH^SĆh-D-heksahydrotyroozyna-glicylo-E-argmina-p-nitroanilina, otrzymanego z Pentapharm Ltd., Bazylea, Szwajcaria). Końcowe stężenie Pefachrome t-PA wynosiło 250 pM (około 5 razy więcej niż wynosi Km). Oczyszczoną ludzką alfa-trombinę otrzymano z Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN).

(b) Oznaczenie czynnika Xa

Aktywność katalityczną czynnika Xa oznaczano przy użyciu substratu chromogennego S-2765 (N-benzyloksykarbonylo-D-arginina-L-glicyna-L-arginina-p-nitrooanilina), otrzymanego z Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH). Wszystkie odczynniki przed użyciem rozpuszczano w wodzie dejonizowanej. Końcowe stężenie S-2765 wynosiło 250 pM (około 5 razy więcej niż wynosi Km). Oczyszczony ludzki czynnik X otrzymano z Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN), a czynnik Xa (FXa) aktywowano i przygotowywano z czynnika X jak opisano w [Bock, P.E., Craig, P.A., Olson, S.T. i Singh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273: 375-388 (1989)].

(c) Oznaczenie czynnika XIa

Aktywność katalityczną Czynnika FXIa oznaczano przy użyciu substratu chromogennego S-2366 (L-piroglutamylo-L-prolilo-L-arginina-p-nitroanilina, otrzymanego z Kabi Pharmacia Hepar, Framklin, OH). Końcowe stężenie S-2366 wynosiło 750 pM. Oczyszczony ludzki FXIa otrzymano z Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN).

(d) Oznaczenie czynnika XHa

Aktywność katalityczną czynnika FXIIa oznaczano przy użyciu substratu chromogennego Spectrozyme FXHa (H-D-CHT-L-glicylo-L-arginina-p-nitroanilina otrzymanego z American Diagnostica, Greenwich, CT). Końcowe stężenie Spectrozyme FXIIa wynosiło 100 pM. Oczyszczony ludzki FXIIa otrzymano z Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN).

(e) Oznaczenie kallikreiny

Aktywność katalityczną kallikreiny oznaczano przy użyciu substratu chromogennego S-2302 (H-D-prolilo-L-fenyloalanylo-L-arginina-p-nitroanilina, otrzymanego z Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH). Końcowe stężenie S-2302 wynosiło 400 pM. Oczyszczoną ludzką kallikreinę otrzymano z Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN).

(f Aktywowane białko C (aPC)

Aktywność katalityczną aktywowanego białka C oznaczano przy użyciu substratu chromogennego Spectrozyme PCa (H-D-lizylo(-Cbo)-L-prolilo-L-arginina-p-nitroanilina), otrzymanego z American Diagnostica Inc. (Greenwich, CT). Końcowe stężenie wynosiło 400 pM (około 4 razy więcej niż wynosi Km). Oczyszczone ludzkie aPC otrzymano z Hematologie Technologies, Inc. (Essex Junction, VT).

(g) Oznaczenieplazminy

Aktywność katalityczną plazminy oznaczano przy użyciu substratu chromogennego S-2366 (L-piroglutamylo-L-prolilo-L-arginina-p-nitroanilina, otrzymanego z Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH). Końcowe stężenie S-2366 wynosiło 300 pM (około 4 razy więcej niż wynosi Km). Oczyszczoną ludzką plazminę otrzymano z Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN).

(h) Zekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu (rt-PA)

Aktywność katalityczną rt-PA oznaczano przy użyciu substratu chromogennego Pefachrome t-PA (CH-iSiE-D-heksahydrotyrozyna-glicylo-L-arginina-p-nitroanilina otrzymanego z Pentapharm Ltd., Bazylea, Szwajcaria). Końcowe stężenie Pefachrome t-PA wynosiło 500 pM

183 855 (około 3 razy więcej niż wynosi Km). Ludzki rt-PA (Activass^R) otrzymano z Gsnentech, Inc. (So. San Fransisco, CA).

(i) Urokinaza

Aktywność katalityczną urokinazy oznaczano przy użyciu substratu chromogsnnego S2444 (L-piroglutamylo-L-glicylo-L-arginina-p-nitroaniłina, otrzymanego z Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH). Końcowe stężenie S-2444 wynosiło 150 pM (około 7 razy więcej niż wynosi Km). Ludzką urokinazę (/Cbbokinaze®), oczyszczoną z hodowli komórek nerki ludzkiej, otrzymano z Abbott Laboratories (North Chicago, IL).

(j) Chymotrypsyna

Aktywność katalityczną chymotrypsyny oznaczano przy użyciu substratu chromogennego S-2586 (mstoksy-sukcynylo-L-arginylo-L-prolilo-L-tyrozyna-p-nitroanilina, który otrzymano z Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH). Końcowe stężenie S-2286 wynosiło 100 pM (około 8 razy więcej niż wynosi Km). Oczyszczoną (3x krystalizowaną; CDI) chymotrypsynę z trzustek bydlęcych otrzymano z Worthington Biochemical Corp. (Freshold, NJ).

(k) Trypsyna

Aktywność katalityczną trypsyny oznaczano przy użyciu substratu chromogennego S-2222 (N-benzoilo-L-izolsucylo-L-glutamylo[-ester mstylowy]-L-arginina-p-nitroanilina, który otrzymano z Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH). Końcowe stężenie S-4422 wynosiło 300 pM (około 2 razy więcej niż wynosi Km). Oczyszczoną ludzką trypsynę trzustkową otrzymano z Scripps Laboratories (San Diego, CA).

Tabela 4 przedstawia hamowanie aktywności amidolitycznej FXa i 10 dodatkowych proteaz serynowych przez zrekombinowany AcaNAP-5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4] lub zrekombinowany AcaNAP-6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6] (oba ulegające ekspresji w Pichia pastoris, jak opisano), wyrażonąjako procent szybkości kontrolnej. NAP te wykazują wysoki stopień specyficzności hamowania FXa w porównaniu z innymi spokrewnionymi protsazami serynowymi.

Tabela 4

Enzym	% szybkości kontrolnej	% szybkości kontrolnej
	+ AcaNAP5	+ AcaNAP6
FXa	1± 1	14 ±1
Fila	104± 5	98 ±3
FXIa	34 ± 12	98 ±3
FXIIa	103 ±6	100 ±4
kallikreina	102 ±4	101 ±3
aPC	95 ±2	1
plazmina	111 ± 6	113 ± 12
r-tPA	96 ±9	96 ±7
urokinaza	101 ± 14	96 ±2
chymotrypsyna	105 ±0	100 ± 11
trypsyna	98 ±6	93 ±4

Tabela 2 przedstawia hamujący wpływ zrekombinowanego AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59] i zrekombinowanego AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 62] (oba ulegające ekspresji w Pichla pastoris, jak opisano), na aktywność amidolityczną 11 wybranych proteaz serynowych. Inhibicję wyrażono jako procent szybkości kontrolnej. Dane te wykazują, że NAP te posiadają wysoki stopień specyficzności wobec proteaz serynowych w tabeli 5.

183 855

Tabela 5

Enzym	% szybkości kontrolnej	% szybkości kontrolnej
	+ AcaNAPc2	+ AceNAP4
FXa	84 ±3	76 ±3
FIIa	99 ±3	93 ±3
FXIa	103 ±4	96 ±1
FXIIa	97 ±1	102 ±2
kallikreina	101 ±1	32 ±1
aPC	97 ±3	103 ±1
plazmina	107 ±9	100 ±1
r-tPA	96 ±2	108 ±3
urokinaza	97 ± 1	103 ±4
chymotrypsyna	99 ±0	96 ±4
trypsyna	93 ±4	98 ±4

Przykład E. Oznaczenia do pomiarów hamowania kompleksu fVIIa/TFprzez NAP (1) Oznaczenie aktywacjiflXprzezfVII/TF

Przykład ten mierzy zdolność NAP według niaIdjszkgo wynalazku do działania jako inhibitor kompleksu katalitycznego fVna/TF, który odgrywa pierwszorzędna rolę w zapoczątkowaniu odpowiedzi krzepnięcia w oznaczeniu czasu protrombinowego ex vivo (przykład B). Aktywację tiytowanego czynnika IX przez kompleks rFWłafTF/PLy oceniano przez oznaczenie odpowiedniej wewnętrznej stałej inhibicji Ki*.

Zliofilizowany, oczyszczony, zeekombl4owyay ludzki czynnik VIIa otrzymano z BiosPadAc, Inc. (Emeryvine, CA) i przed użyciem rozpuszczano w HBS (10 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM chlorek sodowy). Oczyszczony ludzki czynnik X otrzymano z Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN), a czynnik Xa (wolny FXa) aktywowano i przygotowywano z czynnika X jak opisano [Bock, P.E., Craig, P.A., Olson, S.T. i Singh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273: 375-388 (1989)]. Aktywny ludzki czynnik Xa (EGR-FXa) z zablokowanym miejscem aktywnym, który nieodwracalnie zmyktywowy4o L-glutamylo-L-glicylo-Larginylo nhioromdtylokktonem, otrzymano z Hydmatologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT). Zrekombinowany ludzki czynnik tkankowy (rTF) wytworzono w bakulowirusowym układzie ekspresyjnym i oczyszczono do homogeaności przez chromatografię powinowactwa do przeciwciała mono^o^lnego (Corvas International, Inc., San Diego, CA).

Oczyszczoną ypoprotei4ę rTF wbudowywano do pęcherzyków fosfolipidowych (rTF/PLV), składających się z fosfotydylocholiny (75%, w/v) i fosfotydyloseryny (25% w/v) w obecności detergentu, jak opisali Ruf i in. [Ruf, W., Miles, D.J., Rehemtulla A. i Edgington, T.S. Methods in Enzymology 222: 209-224 (1993)]. Fosfolipidy zakupiono w Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama). Buforem używanym we wszystkich oznaczeniach był HBSA, HBS zawierający 0,1% (w/v) albuminę surowicy bydlęcej. Wszystkie odczynniki, jeśli nie zaznaczone inaczej, otrzymano z Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

Aktywację ludzkiego ³H-czynnika IX (FIX) przez kompleks rFVIIy/eTF monitorowano przez mierzenie uwalniania znakowanego promieniotwórczo zyktywowyaego peptydu. Oczyszczony ludzki FIX otrzymano z Hyematoiogin Technologies, Inc. (Essex Junction, VT) i wyznakowano promieniotwórczo przez redukcyjne irytowanie, jak opisano (Van Lentd4 i Ashwell, 1971, JBC 246, 1889-1894). Powstały trytowany preparat FIX posiadał aktywność właściwą 194 jednostek krzepnięcia/mg, jak zmierzono w pozbawionym czynników immunologicznych osoczu z niedoborem FIX (Ortho), i zachowywał 97% aktywności. Aktywność właściwa promieniotwórczości wynosiła 2,7 x 10⁸ dpm/mg. Km aktywacji ³H-FIX przez

183 855 rFVHa/rTF/PLV wynosiła 25 nM, co było równe Km otrzymanej dla nietraktowanego (nieznakowanego) FIX.

Oznaczenie dla wyznaczania Ki* prowadzono następująco: rFVIIa i rTF/PLV łączono w probówce polipropylenowej i umożliwiano powstanie kompleksu w ciągu 10 minut w HBSA zawierającym 5 mM CaCL. Próbki kompleksu rFVTIV'rTl^/'PLV łączono w odpowiednich wirówkowych probówkach polipropylenowych z EGR-FXa lub wolnym FXa, gdy były obecne, i badanym związkiem NAP w różnych stężeniach po rozcieńczeniu HBSA, lub samym HBSA (jako kontrola V_o (niehamowcnej szybkości)). Po inkubacji w ciągu 60 minut w temperaturze otoczenia, reakcję rozpoczynano przez dodanie ³H-FIX. Końcowe stężenia reagentów w 420 pl HBSA wynosiły: rFVIIa [50 pM] , rTF [2,7 nM], PLV [6,4 mikromolowe] , EGR-FXa lub wolny FXa [300 pM], zrekombinowcne nAp [5-1 500 pM], ³H-FIX [200 nM] i CaCl2 [5 mM], Dodatkowo prowadzono kontrolną reakcję tła, która obejmowała wszystkie powyższe reagenty z wyjątkiem rFVUa.

W określonych punktach czasowych (8, 16, 24, 32 i 40 minut) dodawano 80 pl mieszaniny reakcyjnej do probówki Eppendorfa, która zawierała równą objętość 50 mM EDTA w HBS z 0,5% BSA dla zatrzymania reakcji; następnie dodawano 160 jal 6% (w/v) kwasu trichlorooctowego. Białko wytrącano i oddzielano od supematantu przez wirowanie przy 16 000 x g w ciągu 6 minut w temperaturze 4°C. Promieniotwórczość zawartą w powstałym supernatancie mierzono przez pobranie próbek w trzech powtórzeniach, które dodawano do Scintiverse BD (Fisher Scientific, Fairlawn, NJ) i mierzono ilościowo przez pomiar scyntylacji. Kontrolną szybkość aktywacji wyznaczano za pomocą analizy regresji liniowej rozpuszczalnego promieniowania uwalnianego w czasie w stanie równowagi dynamicznej, gdzie zużyciu ulegało mniej niż 5% trytowanego FIX. Kontrolę tła (<1,0% szybkości kontrolnej) odjęto od wszystkich próbek. Stosunki hamowanych szybkości w stanie równowagi dynamicznej (Vi), w obecności NAP, do niehamowanej szybkości kontrolnej samego rFVHa/TF (V_o) przedstawiono na wykresie w zależności od odpowiednich stężeń NAP. Dane te następnie fitowano bezpośrednio do równania dla silnie wiązanych inhibitorów [Morrison, J.F. i Walsh, C.T., Adv. Enzymol. 61: 201-300 (1988)], z którego obliczano pozorną stalą równowagi inhibicji dysocjacji Ki*.

Dane dla zrekombinowanych AcaNAA5, AcaNAP6, AcaNAPc2 i AceNAA4 (przygotowanych jak opisano) przedstawiono w tabeli 6 po części B poniżej.

(2) Oznaczenie amidolityczne czynnika VIIa/czynnika tkankowego

Zdolność NAP według niniejszego wynalazku do działania jako inhibitor aktywności cmidolitycznej kompleksu fVIIa/TF oceniano przez określenie odpowiedniej stałej inhibicji, Ki*, w obecności i nieobecności ludzkiego czynnika Xa (EGR-fXA) o zablokowanym miejscu aktywnym.

Aktywność cmidolityczną rFVIIa/rTF oznaczano przy użyciu substratu chromogennego S-2288 (Ή-D-izolsucyln-L-prolllo-L-crgioioa-p-oitroanilloa), otrzymanego z Kcbi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH). Substrat przed użyciem rozpuszczano w wodzie dejonizowcnej. rFVIIa i rTF/PLV łączono w probówce polipropylenowej i umożliwiano powstawanie kompleksu w ciągu 10 minut w HBSA zawierającym 3 mM CaCL. Oznaczenie dla określenia Ki* prowadzono przez łączenie w odpowiednich studzienkach płytki do nlkrnnlareczkowanla Corning: 50 pl kompleksu rFVHa/rTF/pLV, 50 pl EGR-FXa i 50 pl albo badanego składnika NAP w różnych stężeniach po rozcieńczeniu HBSA, albo samego HBSA (dla zmierzenia Vo (niehamowanej szybkości)). Po inkubacji w ciągu 30 minut w temperaturze otoczenia, rozpoczynano reakcje w trzech powtórzeniach przez dodanie 50 pl S-2288. Końcowe stężenia reagentów w objętości całkowitej 200 pl HBSA wynosiły: zrekombinowany NAP (0,025-22 oM) , rFVIIa (750 pM), rTF (3,0 nM), PLV (6,4 mikronoloks), EGR-FXa (2,5 oM) i S-2288 (3,0 mM, 3 x Km).

Aktywność amidolityczną rFVIIc/rTF/PLV mierzono jako liniowy wzrost absorbancji przy długości fali 405 nm w ciągu 10 minut (szybkość), przy użyciu Thermo Max^R Kinetic Microplate Reader (Molecular Devices, Palo Alto, CA), w stanie równowagi dynamicznej, w którym zużyte zostało mniej niż 5% substratu. Stosunki hamowanej równowagi wstępnej, szybkości w stanie równowagi dynamicznej (Vi) w obecności NAP, do niehcmowanej szybkości w obecności samego wolnego fXc (V_o) przedstawiono na wykresie w zależności od odpowiednich stężeń NAP. Dane te następnie Litowano bezpośrednio do tego samego równania

183 855 dla silnie wiązanych inhibitorów, które zastosowano w przykładzie E.I., z którego obliczano pozorną stałą równowagi inhibicji dysocjacji Kj*.

W tabeli 6 poniżej podano wartości Ki* zrekombinowanych AcaNAPc2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59], AceNAP4 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 62], AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4] i AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6] (przygotowanych jak opisano w Pichia pastoris) w oznaczeniach hamowania aktywności rFVIIa^'rTF. Dane wykazują użyteczność AcaNAPc2 i AceNAP4 jako silnych inhibitorów ludzkiego kompleksu rFVIIa/rTF/PLV w nieobecności i obecności wolnego FXa lub FXa z zablokowanym miejscem aktywnym. Aktywność AcaNAPc2P in vitro (patrz przykład 17) była zasadniczo taka sama jak AcaNAPc2.

Tabela 6

	Ki* (pM)
Oznaczenie amidolityczne	Aktywacja ³H-FIX
Związek NAP	Bez dodania FXa	Plus EGR-FXa	Bez dodania FXa	+ wolny FXa	+ EGRFXa
AcaNAPc2	NI	36 ±20	NI	35 ±5	8,4 ± 1,5
AceNAP4	59 230 ± 3 600	378 ± 37	ND	ND	ND
AcaNAP5	NI	NI	NI	NI	NI
AcaNAP6	NI	NI	NI	NI	NI

NI = brak inhibicji ND=nie oznaczono

Przykład F. Modele aktywności NAP in vivo (1) Ocena aktywności przeciwzakrzepowej NAP w modelu indukowanej FeCI₃ zależnej od płytek krwi zakrzepicy tętniczej u szczurów

Właściwości przeciwzakrzepowe (zapobiegania tworzenia zakrzepu) NAP określano przy użyciu ustalonego doświadczalnego modelu ostrej zakrzepicy naczyniowej u szczurów.

Model indukowanej FeCf zakrzepicy u szczurów jest dobrze scharakteryzowanym modelem zależnej od płytek krwi zakrzepicy tętniczej, którego używano do określenia potencjalnych związków przeciwzakrzepowych [Kurz, K.D., Main, B.W. i Sandusky, G.E., Thromb. Res., 60; 269-280 (1990)]. W modelu tym tworzy się bogaty w płytki krwi, zamykający zakrzep w odcinku tętnicy szyjnej szczura, traktowanej miejscowo świeżym roztworem FeC^ absorbowanym na kawałku bibuły filtracyjnej. Sadzi się, że FeCg, dyfunduje do traktowanego odcinka tętnicy i powoduje zniszczenie warstwy śródbłonka poddanej jego działaniu powierzchni naczynia. W wyniku tego struktury leżące pod śródbłonkiem wystawione zostają na działanie krwi, co z kolei powoduje przyleganie płytek krwi, tworzenie trombiny i agregację płytek krwi. Ostatecznym wynikiem jest powstawanie zamykającego zakrzepu. Wpływ badanego związku na występowanie tworzenia zamykającego zakrzepu po podaniu FeCl3 monitoruje się przez ultrasonograficzne badanie przepływu krwi i wykorzystuje jako główny punktu końcowego. Stosowanie tej metody do mierzenia przepływu krwi przez tętnicę szyjną jest modyfikacją oryginalnej procedury, w której zastosowano termiczną detekcję tworzenia skrzepu [Kurz, K.D., Main, B.W. i Sandusky, G.E., Thromb. Res., 60: 269-280 (1990)].

(a) Podawanie dożylne

Samce szczurów Harlan Sprague Dawley (420-450 g) aklimatyzowano w ciągu co najmniej 72 godzin przed użyciem i głodzono w ciągu 12 godzin przed zabiegiem chirurgicznym, z wolnym dostępem do wody. Zwierzęta przygotowywano, znieczulano Nembutalem, a następnie wprowadzano cewniki dla monitorowania ciśnienia krwi, podawania leków i znieczulania. Lewą tętnicę szyjną izolowano przez wykonanie cięcia przez środek szyi, a następnie technikami preparowania na tępo rozciągania oddzielano odcinek naczynia o długości 2 cm od otoczki tętnicy szyjnej. Przy przednim i tylnym końcu wyizolowanego naczynia wstawia się jedwabny szew dla łatwiejszego umieszczenia ultrasonograficznej sondy prze76

183 855 pływu (GraRyoaiz) wokół przedniego końca RaccżRiz. Sondę zabezpiecza się następnie nieruchomym ramieniem.

Po operacji zwierzęta podzielono losowo aa grupę kontrolną (sól fizjoloylzcRa) i badaną (crekombiRowany AcaNAP5). Związek badany (przygotowany w Pichia pastoris zgodnie z przykładem 3) podawano jako pojedynczą porcję dożylną w dawkach podanych w tabeli 7, po umieszczeniu sondy przepływu i 5 minut przed bodźcem czkrzepogeaRżm. W czasie zerowym (t=0), aa odcinek izolowanej tętnicy szyjnej stosowano kawałek bibuły filtracyjnej o średnicy 3 mm (Whatman #3) nasączony 10 μΐ 35% roztworu świeżego FeCl3 (sporządzonego w wodzie), w oddaleniu od sondy przepływu. Ciśnienie krwi, przepływ krwi, pracę serca i oddychanie monitorowano w ciągu 60 minut. Wystąpienie zamknięcia naczynia (zdefiniowanego jako osiągnięcie zerowego przepływu krwi) uznawano za główny punkt końcowy.

Skuteczność AzzŃAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4] jako czynnika przecCwcαkrcepowego w zapobieganiu tworzenia zakrzepu w tym modelu in vivo wykazano przez zależne od dawki zmniejszenie występowania zamykania naczynia przez zakrzep, jak przedstawiono w tabeli 7 poniżej.

Tabela 7

Grupa traktowana	Dawka (mg/kg)	n	Występowanie zamknięcia
solą fizjologiczną	-	8	8/8
AcaNAP5	0,001	8	7/8
AcaNAP5	0,003	8	5/8
AcaNAP5	0,01	8	3/8*
AcaNAP5	0,03	8	1/8*
AcaNAP5	0,1	8	0/8*
AcaNAP5	0,3	4	0/4*
AcaNAP5	1,0	2	0,2*

* - p < 0,05 wobec kontroli z solą fizjologiczną w teście Fishera

Skuteczną dawkę, która zapobiega w tym modelu (ED₅₀) 50% zamykania tętnicy przez zakrzep można wżcaaccyć z powyższych danych przez wykreślenie występowania zamykania w zależności od podanej dawki. Pozwala to na bezpośrednie porównanie skuteczności przeziwczkrcepowej AcaNAP5 z iaRymi czynnikami ppcezlwcakpcepooyml, które także oceaiaRo w tym modelu, jak opisano powyżej. Tabela 8 poniżej przedstawia wartości ED₅₀ w tym modelu dla kilku dobrze znanych czynników prceciwkpcepJlwyzh w porównaniu do AcaNAP5.

Tabela 8

Związek	ED^a
Heparyna standardowa	300 U/kg
Argatroban	3,8 mg/kg
Hirulog™	3,0 mg/kg
rTAPb	0,6 mg/kg
AcaNAP5	0,0055 mg/kg

^a-ED₅₀ zdefiniowano jako dawka, która zapobiega wystąpieniu całkowitej zamknięcia tętnicy przez zakrzep u 50% badanych zwierząt bzrekombinowany peptyd przeciwkrzepliwy kleszcza, Vlasuk i wsp. Thromb. Haemostas. 70: 212-216 (1993). (b) Podawanie podskórne

Wpływ przezlwcαkrcepowż AcaNAP5 w porównaniu z alskozcaytecckową heparyną (Enoxaparia; Loveaox, Rhoae-Pouleac Rorer) po podaniu podskórnym określono stosując

183 855 model indukowanej FeCl zakrzepicy u szczurów. Badania w z zastosowaniem tego modelu przeprowadzono w identyczny sposób jak opisany powyżej, z wyjątk-em podskórnego podawania związku, a skuteczność wyznaczono w dwóch różnych punktach czasowych: 30 i 150 minut po podaniu. W tym celu stosowano kolejno obie tętnice szyjne. Wyniki tych doświadczeń wskazują, że AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfίkacyjnnyn4] jest skutecznym czynnikiem przeciwzakrzepowym in vivo po podaniu podskórnym. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 9.

Tabela 9

Związek	ED50a po 30 min (mg/kg)	ED_i()a po 150 min (mg/kg)
niskocząsteczkowa heparyna	30,0	15,0
AcaNAP5	0,07	0,015

^a-ED₅₀ zdefiniowano jako dawkę, która zapobiega wystąpieniu całkowitej zamknięcia tętnicy przez zakrzep u 50% badanych zwierząt.

(2) Pomiary krwawienia z głębokich ran

Do pomiaru wpływu NAP na krwaw-en-e i porównanie go z wpływem niskocząsteczkowej heparyny zastosowano model krwawienia z głębokich ran.

Samce szczurów znieczulano i operowano w identyczny sposób jak w przypadku modelu z zastosowaniem FeC/ Na tętnicę szyjna nie stosowano jednak FeClp Do oceny utraty krwi w czasie wykorzystano głęboka ranę chirurgiczna w szyją która eksponuje tętnicę szyjną. Utratę krwi mierzono w ciągu okresu 3,5-godzinnego po podskórnym podaniu AcaNAP5 lub LMWH. Ranę okładano tamponami chirurgicznymi, które usuwano co 30 minut. Tampony zanurzano następnie w odczynniku Drabkina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), który lizuje krwinki czerwone i reaguje z hemoglobiną w sposób kolorymetryczny. Próbki kolorymetryczne oceniano następnie przez pomiar absorbancji przy długości fali 550 nm, co zapewnia określenie ilości krwi w tamponie.

Charakterystyki odpowiedzi w zależności na dawki obu badanych związków przedstawiono na figurze 15, razem z danymi o skuteczności obu związków. AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4] był w tym modelu znacznie silniejszy od niskocząsteczkowej heparyny w zapobieganiu tworzenia zakrzepu zamykającego tętnice. Ponadto zwierzęta traktowane NAP krwawiły w mniejszym stopniu niż te traktowane niskocząsteczkową. heparyną

Dane przedstawione w tabelach 7 i 9 i na figurze 15 wyraźnie wykazują skuteczność NAP w zapobieganiu tworzenia zakrzepu zamykającego tętnice w tym modelu doświadczalnym. Ważność tych danych dla zapobiegania zakrzepicy u ludzi jest oczywista na podstawie porównania z innymi czynnikami przeciwkrzepliwymi wymien-onym- w tabeli 8. Czynniki te oceniano w tych samych opisanych tu modelach doświadczalnych w identyczny sposób jak opisano dla NAP i wykazywały kliniczną skuteczność przeciwzakrzepową w zapobieganiu tworzenia zakrzepu, jak opisano w następujących odnośnikach literaturowych: Heparin Hirsh, J.N. Engl. J. Med. 324: 1565-1574 (1992), Caims, J.A. i wsp. Chest 102: 456S-481S (1992); Argatroban - Gold, H.K. i wsp. J. Am. Coli. Cardiol. 21: 1039-1047 (1993); i Hirulog™ - Sharma, G.V.R.K. i wsp. Am. J. Cardiol. 72: 1357-1360 (1993) i Lidon, R.M. i- wsp. Circulation 88: 1495-1501 (1993).

Przykład G. Model ostrej zakrzepicy naczyń wieńcowych u świni

Protokół zastosowany w tych badaniach jest zmodyfikowanym modelem zakrzepicy, który podano uprzednio (Lucchesi, B.R. i in., (1994) Brit. J Pharmacol. 113: 1333-1343).

Zwierzęta usypiano i wprowadzano cewniki żylne i tętnicze (odpowiednio do tętnicy szyjnej wspólnej i żyły szyjnej zewnętrznej). W 4-tej przestrzeni międzyżebrowej dokonywano torakotomii i eksponowano serce. Izolowano lewą przednią zastępującą (LAD) tętnicę wieńcową od przylegającej tkanki łącznej i wprowadzano sondę przepływową Dopplera oraz dokonywano zwężenia podwiązką numer 17. Wewnątrz naczynia implantowano również elektrodę anodową.

Dokonywano pomiarów stanu wyjściowego i podawano testowane NAP lub placebo poprzez zewnętrzną tętnicę szyjną Pięć minut po podaniu stosowano bezpośredni prąd (300 pA, DC)

183 855 w celu stymulacji elektrody dla rozpoczęcia bezpośredniego uszkodzania śródbłonka wieńcowego i rozpoczęcia tworzenia zakrzepu. Stosowanie prądu kontynuowano w ciągu okresu 3 godzin. Zwierzęta obserwowano albo do upłynięcia 1 godziny po zaprzestaniu stosowania prądu, albo śmierci zwierzęcia, w zależności od tego, co najpierw nastąpiło.

W tabeli 10 przedstawiono dane dotyczące występowania zamykania naczyń u zwierząt, którym podano AcaNAP5 lub AcaNAPc2P (patrz przykład 17) w trzech wzrastających dawkach NAP. Występowanie zamykania naczyń u zwierząt otrzymujących placebo wynosiło 8/8 (100%). Czas zamykania u zwierząt traktowanych placebo wynosił 66,6 ± 7,5 minut (średnia ± błąd standardowy). Naczyniom świń traktowanych AcaNAp, w których zamykanie nie następowało podczas 4-godzinnego okresu obserwacji, przypisano arbitralnie wybrany czas zamykania 240 minut dla ułatwienia porównań statystycznych.

Dane wykazują, że AcaNAP5 i AcaNAPc2P wykazywały podobną skuteczność w tej sytuacji; oba wydłużały czas zamykania naczyń wieńcowych w sposób zależny od dawki. Ponadto, obie cząsteczki znacząco wydłużały czas zamykania w dawce (0,03 mg/kg dożylnie), która nie powodowała znaczącego zwiększenia krwawienia. Te i inne dane sugerują, żs AcaNAP5 i AcaNAPc4P posiadają korzystne wskaźniki terapeutyczne.

Tabela 10

Porównanie głównych punktów końcowych pomiędzy AcaNAPc2P i AcaNAP5 po podaniu dożylnym w modelu ostrej zakrzepicy tętnic wieńcowych u świń.

Dawka (dożylnie)	Występowanie zamykania naczyń	Czas zamykania	Całkowita utrata krwi
(mg/kg)	AcaNAP5	AcaNAPc2P	AcaNAP5	AcaNAPc2P	AcaNAP5	AcaNAPc2P
0,01	6/6	6/6	107±13,0	105±6,2	2,8±0,8	1,6±0,3
0,03	5/6	4/6	150±23,2	159±27	5,6±1,4	4,9±1,4
0,10	4/6	2/6f	187±22,9*	215±25*	43±18*	17,6±7,9*

t p<0,05 wobec soli fizjologicznej (8/8), test Fishera;

* p<0,05 wobec soli fizjologicznej, ANOVA, test wielokrotnego porównania Dunnetta.

183 855

FIG. I

	χ	10	20	30
G AATTCCGCTA CTACTCAACA ATG	AAG ATG CTT	TAC GCT ATC GCT
		Met	Lys Met Leu	Tyr Ala Ile Ala
40	50	60	70
ATA	ATG TTT	CTC CTG GTA TCA	TTA TGC AGC	GCA AGA ACA GTG
Ile	Met Phe	Leu Leu Val Ser	Leu Cys Ser	Ala Arg Thr Val
80		90 100 tr »	110 120 • »
AGG	AAG GCA	TAC CCG GAG TGT	GGT GAG AAT	GAA TGG CTC GAC
Arg	Lys Ala	Tyr Pro Glu Cys	Gly Glu Asn	Glu Trp Leu Asp
	130 140 w »	150 160
GAC	TGT GGA	ACT CAG AAG CCA	TGC GAG GCC	AAG TGC AAT GAG
Asp	Cys Gly	Thr Gin Lys Pro	Cys Glu Ala	Lys Cys Asn Glu
	170	180	190	200
GAA	CCC CCT	GAG GAG GAA GAT	CCG ATA TGC	CGC TCA CGT GGT
Glu	Pro Pro	Glu Glu Glu Asp	Pro Ile Cys	Arg Ser Arg Gly
	210	220	230 *	240
TGT	TTA TTA	CCT CCT'GCT TGC	GTA TGC AAA	GAC GGA TTC TAC
cys	Leu Leu	Pro Pro Ala Cys	Val Cys Lys	Asp Gly Phe Tyr
250	260	270	280
AGA.	GAC ACG	GTG ATC GGC GAC	TGT GTT AGG	GAA GAA GAA TGC
Arg	Asp Thr	Val Ile Gly Asp	Cys Val Arg	Glu Glu Glu Cys
290		300 310 320 330
		tr ir		» «
GAC	CAA CAT	GAG ATT ATA CAT	GTC TGA ACGAGAAAGC AACAATAACC
Asp	Gin His	Glu Ile Ile His	Val
340	350 360 370	380
1		β tr	*	♦

AAAGGTTCCA ACTCTCGCTC TGCAAAATCG CTAGTTGGAT GTCTCTTTTG

390 400 410 420 430

CGTCCGAATA GTTTTAGTTG ATGTTAAGTA AGAACTCCTG CTGGAGAGAA

440 450

TAAAGCTTTC CAACTCC poli(A)

183 855

Lys 1

Ala

Tyr

Pro

Glu 5

Cys

Gly

Glu

Asn

Glu 10

Trp

Leu

Asp

Cys 15

Gly

Thr

Gln

Lys

Pro 20

Cys

Glu

Ala

Lys

Cys 25

Asn

Glu

Pro

Pro 30

Glu

Asp

Pro 35

Ile

Cys

Arg

Ser

Arg 40

Gly

Cys

Leu

Pro 45

Pro

Ala

Cys

Val

Cys 50

Lys

Asp

Gly

Phe

Tyr 55

Arg

Asp

Thr

Val

Ile

Gly

Asp

Cys

Val

Arg

Glu

Cys

Asp

65 70

Gln His Glu Ile Ile His Val 75

183 855

FIG.3

	1	10	20	30 *
G AATTCCGCTA CTACTCAACA ATG	AAG ATG	CTT TAC GCT ATC GCT
		Met	Lys Met	Leu Tyr Ala Ile'Ala
40	50	60	70
			n
ATA	ATG TTT CTC	CTG GTG TCA	TTA TGC	AGC ACA AGA ACA GTG
Ile	Met Phe Leu	Leu Val Ser	Leu Cys	Ser Thr Arg Thr Val
80	90	100	110 120
AGG	AAG GCA TAC	CCG GAG TGT	GGT GAG	AAT GAA TGG CTC GAC
Arg	Lys Ala Tyr	Pro Glu Cys	Gly Glu	Asn Glu Trp Leu Asp
	130	140		150 160
GTC	TGT GGA ACT	AAG AAG CCA	TGC GAG	GCC AAG TGC AGT GAG
Val	Cys Gly Thr	Lys Lys Pro	Cys Glu	Ala Lys Cys Ser Glu
	170	180 «	190 200
GAA	GAG GAG GAA	GAT CCG ATA	TGC CGA	TCA TTT TCT TGT CCG
Glu	Glu Glu Glu	Asp Pro Ile	Cys Arg	Ser Phe Ser Cys Pro
	210	220 V	230	240
GGT	CCC GCT GCT	TGC GTA TGC	GAA GAC	GGA TTC TAC AGA GAC
Gly	Pro Ala Ala	Cys Val Cys	Glu Asp	Gly Phe Tyr Arg Asp
250	260	270 «	280
ACG	GTG ATC GGC	GAC TGT GTT	AAG GAA	GAA GAA TGC GAC CAA
Thr	Val Ile Gly	Asp Cys Val	Lys Glu	Glu Glu Cys Asp Gln

290 300 310 320 330 w ♦ * * *

CAT GAG ATT ATT CAT GTC TGA ACGAGAGAGC AGTAATAACC His Glu Ile Ile His Val

340 350 350 370 380 * » » w »

AAAGGTTCCA ACTTTCGCTC TACAAAATCG CTAGTTGGAT TTCTCCTTTG

390 400 410 420 430

CGTGCGAATA GTTTTAGTTG ATATTAAGTA AAACCTCCTG TTGAAGAGAA

440

TAAAGCTTTC CAACTTC poli(A)

183 855

FIG. 4

Lys 1

Ala

Tyr

Pro

Glu 5

Cys

Gly

Glu

Asn

Glu 10

Trp

Leu

Asp

Val

Cys 15

Gly

Thr

Lvs

Lys

Pro 20

Cys

Glu

Ala

Lys

Cys 25

Ssz.

Glu

Glu 30

Glu

Asp

Pro

Ile

Cys 35

Arg

Ser

Phe

Ser

Cys 40

£12

Sly

Pro

Ala

Ala 45

Cys

Val

cys

Glu

Asp 50

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asp 55

Thr

Val

Ile

Gly

Asp 60

Cys

Val

Lvs

Glu

Glu 65

Glu

Cys

Asp

Gln

His 70

Glu

Ile

His

Val

FIG. 5

Arg

Thr

Val

Arg

Lys

Ala

'Ρ'/·*·

Pro

Glu 5

Cys

Gly

Glu

Asn

Glu i:

Trp

Leu

Asp

Cys 15

Gly

Thr

Gln

Lys

Pro 20

Cys

Glu

Ala

Lys

Cvs 25

Asn

Glu

Pro

Pro 30

Glu

Asp

Pro 35

Ile

cys

Arg

Ser

Arg 40

Gly

Cys

Leu

Pro 45

Pro

Ala

Cys

Val

Cys 50

Lys

Asp

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asp

Thr

Val

Ile

Gly

Asp

Cys

Val

Arg

Glu

65

Glu Glu Cvs Asd Gln His Glu Ile Ile His Val ' 70* 75

183 855

FIG.

Arg

Thr

Val

Arg

Lys 1

Ala

Tyr

Pro

Glu 5

Cys

Gly

Glu

Asn

Glu 10

Trp

Leu

Asp

v&l

Cys 15

Gly

Thr

Lvs

Lys

Pro 20

Cys

Glu

Ala

Lys

Cys 25

Her

Glu

Glu 30

Glu

Asp

Pro

Ile

Cys 35

Arg

Ser

Phe

Ser

Cys 40

Pro

Glv

Pro

Ala

Ala 45

Cys

Val

Cys

Siu

Asp 50

Gly

Phe

iyr

Arg

Asp 55

Thr

Val

Ile

Gly

Asp 60

.Cys

Val

Lys

Glu

Glu 65

Glu

Cys Asd Gin His Glu Ile Ile His Val 70 75

183 855

	FIG.	7a-l
1	10 20	30 40
ο	« «	* «
GAATTCACTA TTATCCAACA ATG	GCG GTG CTT TAT TCA GTA GCA
EcoRI Mec	Ala Val Leu Tyr Ser Val Ala
	50 60	70 80
	tr «
ATA	GCG TTA CTA CTG GTA TCA	CAA TGC AGT GGG AAA CCG AAC
Ile	Ala Leu Leu Leu Val Ser	Gin Cys Ser Gly Lys Pro Asn
90 100	110 120
AAT	GTG ATG ACT AAC GCT TGT	GGT CTT AAT GAA TAT TTC GCT
Asn	Val Met Thr Asn Ala Cys	Gly Leu Asn Glu Tyr Phe Ala
130	140 150 160 170
GAG	TGT GGC AAT ATG AAG GAA	TGC GAG CAC AGA TGC AAT GAG
Glu	Cys Gly Asn Met Lys Glu	Cys Glu His Arg Cys Asn Glu
	ISO 190	200 210
GAG	GAA AAT GAG GAA AGG GAC	GAG GAA AGA ATA ACG GCA TGC
Glu	Glu Asn Glu Glu Arg Asp	Glu Glu Arg Ile Thr Ala Cys
	220 230	240 250
CTC	ATC CGT GTG TGT TTC CGT	CCT GGT GCT TGC GTA TGC AAA
Leu	Ile Arg Val Cys Phe Arg	Pro Gly Ala Cys Val Cys Lys
	260 270	280 290
GAC	GGA TTC TAT AGA AAC AGA	ACA GGC AGC TGT GTG GAA GAA
Asp	Gly Phe Tyr Arg Asn Arg	Thr Gly Ser Cys Val Glu Glu
300 310	320 330
GAT	GAC TGC GAG TAC GAG AAT	ATG GAG TTC ATT ACT TTT GCA
Asp	Asp Cys Glu Tyr Glu Asn	Mec Glu Phe Ile Thr Phe Ala
340	350 360 370 380
CCA	GAA GTA CCG ATA TGT GGT	TCC AAC GAA AGG TAC TCC GAC
Pro	Glu Val Pro Ile Cys Gly	Ser Asn Glu Arg Tyr Ser Asp
	390 400	410 420
TGC	GGC AAT GAC AAA CAA TGC	GAG CGC AAA TGC AAC GAG GAC
Cys	Gly Asn Asp Lys Gin Cys	Glu Arg Lys Cys Asn Glu Asp
	430 440	450 460
GAT	TAT GAG AAG GGA GAT GAG	GCA TGC CGC TCA CAT GTT TGT
Asp	Tyr Glu Lys Gly Asp Glu	Ala Cys Arg Ser His Val Cys

183 855

470 480 <r *

GAA CGT CCT GGT GCC TGT GTA Glu Arg Pro Gly Ala Cys Val

510 520 er er

AAC AAA AAA GGT AGC TGT GTG Asn Lys Lys Gly Ser Cys Val

490 er TGC GAA Cys Glu	500
GAC Asp	GGG TTC TAC	AGA Arg
Gly Phe	Tyr
530		540
GAA AGC	GAT	GAC TGC	GAA	TAC
Glu Ser	Asp	Asp Cys	Glu	Tyr

580 er

550 er

560

O

570

590 •fr

GAT AAT ATG GAT Asp Asn Met Asp

TTC ATC ACT Phe Ile Thr

TTT GCA CCA GAA ACC Phe Ala Pro Glu Thr

TCA CGA Ser Arg

600 610 620 630 640 ·* •er •er tr tr

TAA CCAAAGATGC TACCTCTCGT ACGCAACTCC GCTGATTGAGGTTGATTC

650 660 670 680 690

Ir er ύ <r

ACTCCCTTGCATCTCAACATTTTTTTTGTGATGCTGTGCATCTGAGCTTAACCTG

700 710 er er

ATAAAGCCTATGGTG polŻ(A)

183 855

FIG. Tb

10 20 30 40 o tr tr tr tr

GAATTCCGC ATG CGG ACG CTC TAC CTC ATT TCT	ATC	TGG	TTG
EcoRI Met Arg Thr Leu Tyr Leu Ile Ser	Ile	Trp	Leu
50 60 70		80
tr & tr		tr
TTC CTC ATC TCG CAA TGT AAT GGA AAA GCA TTC	CCG	AAA	TGT
Phe Leu Ile Ser Gln Cys Asn Gly Lys Ala Phe	Pro	Lys	Cys
90 100 110	120
GAC GTC AAT GAA AGA TTC GAG GTG TGT GGC AAT	CTG		GAG
Asp Val Asn Glu Arg Phe Glu Val Cys Gly Asn	Leu	Lys	Glu
130 140 150 160
TGC GAG CTC AAG TGC GAT GAG GAC CCT AAG ATA	TGC	TCT	CGT
Cys Glu Leu Lys Cys Asp Glu Asp Pro Lys Ile	Cys	Ser	Arg
170 180 190 200			210
GCA TGT ATT CGT CCC CCT GCT TGC GTA TGC GAT	GAC	GGA	TTC
Ala Cys Ile Arg Pro Pro Ala Cys Val Cys Asp	Asp	Gly	Phe
220 230 240		250
TAC AGA GAC AAA TAT GGC TTC TGT GTT GAA GAA	GAC	GAA	TGT
Tyr Arg Asp Lys Tyr Gly Phe Cys Val Glu Glu	Asp	Glu	cys
260 270 280	290
AAC GAT ATG GAG ATT ATT ACT TTT CCA CCA GAA	ACC	AAA	TGA
Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro Glu	Thr	Lys
300 310 320 330	340
tr tr tr tr		tr

TGACCGAAGC TTCCACCTTT CTATACATAT CTTCACTGCTTGACAGGCTTCT

350 360 370 380 390 400 tr tr tr ·» « »

CGACAATTTAGAAGTTCTGCTTGACTTTGTCTATTTGAAATTGTTCACACTAATG

410 420 tr *

GGGGAAGTAAAGCATTTTCACGAC poIŻ(A)

183 855

FIG. Tc

GAATTCCGCT ACATTTTCAA CA ATG TCG ACG CTT TAT GTT ATC EcoRI Met Ser Thr Leu Tyr Val Ile

		fr						»
GCA	ATA	TGT	TTG	CTG	CTT	GTT	TCG	CAA
Ala	Ile	Cys	Leu	Leu	Leu	Val	Ser	Gln
	90			100 fr			110
GTG	AAG	AAG	TGT	GGC	AAG	AAT	GAA	AGA
Val	Lys	Lys	cys	Gly	Lys	Asn	Glu	Arg
130			140		150
fr				fr			«
AAT	GCA	AAG	GAC	TGC	GAG	ACC	AAG	TGC
Asn	Ala	Lys	Asp	cys	Glu	Thr	Lys	Cys
170		180			190
fr			fr			fr
GTG	TGC	CGT	TCG	CGT	GAG	TGT	ACT	AGT
Val	cys	Arg	Ser	Arg	Glu	Cys	Thr	Ser
		220			230
TGC	GAA	CAA	GGA	TTC	TAC	AGA	GAT	CCG
Cys	Glu	Gln	Gly	Phe	Tyr	Arg	Asp	Pro
	260		270			280
ACT	GAT	GAA	GAA	TGT	GAT	GAA	TGG	AAC
Thr	Asp	Glu	Glu	Cys	Asp	Glu	Trp	Asn
300			310			320
	>						V
ACT	ATG	CCA	AAA	CAG	TAG	TGCGAAGTTC (
Thr	Met	Pro	Lys	Gln
	350		360		370
		fr		fr

200

240

330

120

160

210

250

290

340

380 390 * fr

C TCCGTGCTCAATTATCACACACCTCCACTAGTTAAGATTGACTGACTCTCTTG

400 410 420 430 440 450 * · * « « _v

CATTGTAGTATTTTCGCTTGACTCTGTGCATTTAAGCATGAGATACTACTAGGGA

460 470 fr w

GAATAAAAATTACTAACTAC poli(A)

183 855

FIG. 7d

10 20 30 40 tr -a tr * *

GAATTCCGG AAA TGT CCT ACC GAT GAA TGG TTC GAT	TGG TGT
EcoRI Lys Cys Pro Thr Asp Glu Trp Phe Asp	Trp Cys
50 60 70	80
tr tr tr
GGA ACT TAC AAG CAT TGC GAA CTC AAG TGC GAT AGG	GAG CTA
Gly Thr Tyr Lys His Cys Glu Leu Lys Cys Asp Arg	Glu Leu
90 100 110 120 tr tr Ό ir
ACT GAG AAA GAA GAG CAG GCA TGT CTC TCA CGT GTT	TGT GAG
Thr Glu Lys Glu Glu Gin Ala Cys Leu Ser Arg Val	Cys Glu
130 140 150 160
AAG TCC GCT TGC GTA TGC AAT GAC GGA TTA TAC AGA	GAC AAG
Lys Ser Ala Cys Val Cys Asn Asp Gly Leu Tyr Arg	Asp Lys
170 180 190 200	210
tr tr tr tr	★
TTT GGC AAC TGT GTT GAA AAA GAC GAA TGC AAC GAT	ATG GAG
Phe Gly Asn Cys Val Glu Lys Asp Glu Cys Asn Asp	Mec Glu
220 230 240 250
ATT ATT ACT TTT GCA CCA GAA ACC AAA TAA TGGCCTAAGG TTCC
Ile Ile Thr Phe Ala Pro Glu Thr Lys

260 270 280 290 300 tr tr tr tr *

AAACCT TGCTACACAC CGTCAGTGCTTTACTGTTTCCTCTACGTGTTAGTAGT

310 320 330 340 350 360 tir * w

TTTGCTTGACTCTGTGTATTTAAGCATTGTCTACTAATGGGCAAAGTAAAGCATT

370 380 390 tr tr &

GTAAGGACATAATAATGAGTAAACCTTCTGATTT polr (A)

183 855

FJG. 7e-l

1	10	20	30 *	40
GAATTCCGGG CGGCAGAAAG ATG CGA	ATG CTC	TAC CTT GTT CCT
EcoRI		Met Arg	Met Leu	Tyr Leu Val Pro
50		60	70	80
			•σ	V
ATC TGG	TTG CTG	CTC ATT TCG CTA	TGC AGT	GGA AAA GCT GCG
Ile Trp	Leu Leu	Leu Ile Ser Leu	Cys Ser	Gly Lys Ala Ala
90	100 110		120
AAG AAA	TGT GGT	CTC AAT GAA AGG	CTG GAC	TGT GGC AAT CTG
Lys Lys	Cys Gly	Leu Asn Glu Arg	Leu Asp	Cys Gly Asn Leu
130	140	150	160 170
*	»	«		tr w
AAG CAA	TGC GAG	CCC AAG TGC AGC	GAC TTG	GAA AGT GAG GAG
Lys Gin	Cys Glu	Pro Lys Cys Ser	Asp Leu	Glu Ser Glu Glu
	180	190	200	210
TAT GAG	GAG GAA	GAT GAG TCG AAA	TGT CGA	TCA CGT GAA TGT
Tyr Glu	Glu Glu	Asp Glu Ser Lys	Cys Arg	Ser Arg Glu Cys
220	230 tł	240	250
TCT CGT	CGT GTT	TGT GTA TGC GAT	GAA GGA	TTC TAC AGA AAC
Ser Arg	Arg Val	Cys Val Cys Asp	Glu Gly	Phe Tyr Arg Asn
260		270 280	290
AAG AAG	GGC AAG	TGT GTT GCA AAA	GAT GTT	TGC GAG GAC GAC
Lys. Lys	Gly Lys	Cys Val Ala Lys	Asp Val	Cys Glu Asp Asp
300	310 320		330
AAT ATG	GAG ATT	ATC ACT TTT CCA	CCA GAA	GAC GAA TGT GGT
Asn Met	Glu Ile	Ile Thr Phe Pro	Pro Glu	Asp Glu Cys Gly
340	350	360	370 380
CCC GAT	GAA TGG	TTC GAC TAC TGT	GGA AAT	TAT AAG AAG TGC
Pro Asp	Glu Trp	Phe Asp Tyr Cys	Gly Asn	Tyr Lys Lys Cys
	390	400	410	420
GAA CGC	AAG TGC	AGT GAG GAG ACA	AGT GAG	AAA AAT GAG GAG
Glu Arg	Lys Cys	Ser Glu Glu Thr	Ser Glu	Lys Asn Glu Glu
43 0	440 tr	450	460
GCA TGC	CTC TCT	CGT GCT TGT ACT	GGT CGT	GCT TGC GTA TGC
Ala Cys	Leu Ser	Arg Ala Cys Thr	Gly Arg	Ala Cys Val Cys

183 855

FIG. 7e-2

470 480 490 500 tr er tr er

AAA GAC GGA TTG TAC AGA GAC GAC TTT GGC AAC TGT GTT CCA

Lys Asp Gly Leu Tyr Arg Asp Asp Phe Gly Asn Cys Val Pro

510 520 530 540 tł tr tr β

CAT GAC GAA TGC AAC GAT ATG GAG ATC ATC ACT TTT CCA CCG

His Asp Glu Cys Asn Asp Met Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro

550 560 570 580 590 er er er et tr

GAA ACC AAA CAT TGA CCAGAGGCTC CAACTCTCGC TACACAACGT CA Glu Thr Lys His

600 610 620 630 640 650 et er et er et er

GGGCTAGAATGGCCCCTCTGCGAGTTAGTAGTTTTGCTTGACTCTGCTTATTTGA

660 670 680 tr er er

GCACTTTCTATTGATGGCGAAAATAAAGCATTTAAAAC po 1 i (A)

183 855

10 20 30 40 tr tr tr tr tr

GAATTCCGCG CACCTGAGAG GTGAGCTACG CAAGTCTTCG CTGGTACA EcoRI

SO tr	60 tr	70 tr	80 tr	90 tr
ATG ATC CGA	AAG CTC GTT	CTG CTG	ACT GCT ATC	GTC ACG GTG
Met Ile Arg	Lys Leu Val	Leu Leu	Thr Ala Ile	Val Thr Val
100 110	120	130
	tr	tr	tr	tr
GTG CTA AGT	GCG AAG ACC	TGT GGA	CCA AAC GAG	GAG TAC ACT
Val Leu Ser	Ala Lys Thr	Cys Gly	Pro Asn Glu	Glu Tyr Thr
140 tr	150 tr		160	170 o
GAA TGC GGG	ACG CCA TGC	GAG CCG	AAG TGC AAT	GAA CCG ATG
Glu Cys Gly	Thr Pro Cys	Glu Pro	Lys Cys Asn	Glu Pro Met
180	190	200	210
	tr		ΰ	tr
CCA GAC ATC	TGT ACT CTG	AAC TGC	ATC GTG AAC	GTG TGT CAG
Pro Asp Ile	Cys Thr Leu	Asn Cys	Ile Val Asn	Val Cys Gln
220	230	240	250
tr	tr	tr		*
TGC AAA CCC	GGC TTC AAG	CGC GGA	CCG AAA GGA	TGC GTC GCC
Cys Lys Pro	Gly Phe Lys	Arg Gly	Pro Lys Gly	Cys Val Ala
2S0	270	280	290	300
	tr	tr	ir	tr
CCC GGA CCA	GGC TGT AAA	TAG TTCTCCACCT GCCCTTTCGT TGGAA
Pro Gly Pro	Gly Cys Lys
310	320	330	340
tr	tr	tr

CAAAT GGCTGTCTTTTTACATTCTGAATCAATAAAGCCGAACGGT pol±(A)

183 855

	F/G.	8a
1 10	20	30 40
tr tr	•a	tr tr
AAGCCTTGCT	AACATACTGC GTAATAAGGA GTCTTAATC ATG CCA GTT
Hindlll		Met Pro Val
50	60 70	i 80 90
	ir Ό	tr tT
CTT TTG GGT	ATT CCG TTA TTA	TTG CGT TTC CTC GGT TTC CTT
Leu Leu Gly	Ile Pro Leu Leu	Leu Arg Phe Leu Gly Phe Leu
100 110	120 130
	tr tr	tr tr
CTG GTA ACT	TTG TTC GGC TAT	CTG CTT ACT TTC CTT AAA AAG
Leu Val Thr	Leu Phe Gly Tyr	Leu Leu Thr Phe Leu Lys Lys
140	150	160 170
tr		tr tr
GGC TTC GGT	AAG ATA GCT ATT	GCT ATT TCA TTG TTT CTT GCT
Gly Phe Gly	Lys Ile Ala Ile	Ala Ile Ser Leu Phe Leu Ala
180	190	200 210
β	1r	tr tr
CTT ATT ATT	GGG CTT AAC TCA	ATT CTT GTG GGT TAT CTC TCT
Leu Ile Ile	Gly Leu Asn Ser	Ile Leu Val Gly Tyr Leu Ser
220	230	240 250
tr	tr	tr tr
GAT ATT AGC	GCA CAA TTA CCC	TCT GAT TTT GTT CAG GGC GTT
Asp Ile Ser	Ala Gin Leu Pro	Ser Asp Phe Val Gin Gly Val
260	270 280 290 300
tr		Ir h
CAG TTA ATT	CTC CCG TCT AAT	GCG CTT CCC TGT TTT TAT GTT
Gin Leu Ile	Leu Pro Ser Asn	Ala Leu Pro Cys Phe Tyr Val
310 320	330 340
	tr	tr #
ATT CTC TCT	GTA AAG GCT GCT	ATT TTC ATT TTT GAC GTT AAA
Ile Leu Ser	Val Lys Ala Ala	Ile Phe Ile Phe Asp Val Lys
350	360	370 380
W	1T	tr tr
CAA AAA ATC	GTT TCT TAT TTG	GAT TGG GAT AAA GGT GGA GGC
Gin Lys Ile	Val Ser Tyr Leu	Asp Trp Asp Lys Gly Gly Gly
390	400 410 420 430
tr	tr	tr β tr

TCA GGC GGA SSGE&ASICSSSC ATCCCATATCAC GCGGCCGC GGATCC

Ser Gly Gly Sfil NotI BamHI

183 855

FIG. 8b

AAGCTTTGCT AACATACTGC GTAATAAGGA GTCTTAATC ATG CCA GTT HindIII Met Pro Val

CTT TTG GGT ATT CCG TTA TTA TTG CGT TTC CTC GGT TTC CTT Leu Leu Gly Ile Pro Leu Leu Leu Arg Phe Leu Gly Phe Leu

100 tr

110 tr

120

130

CTG GTA ACT TTG TTC GGC TAT CTG CTT ACT TTC CTT AAA AAG Leu Val Thr Leu Phe Gly Tyr Leu Leu Thr Phe Leu Lys Lys

140

150

160

170

GGC TTC GGT AAG ATA GCT ATT GCT ATT TCA TTG TTT CTT GCT Gly Phe Gly Lys Ile Ala Ile Ala Ile Ser Leu Phe Leu Ala

180

190

200

210

CTT ATT ATT GGG CTT AAC TCA ATT CTT GTG GGT TAT CTC TCT Leu Ile Ile Gly Leu Asn Ser Ile Leu Val Gly Tyr Leu Ser

220

230

240

250

GAT ATT AGC GCA CAA TTA CCC TCT GAT TTT GTT CAG GGC GTT Asp Ile Ser Ala Gln Leu Pro Ser Asp Phe Val Gln Gly Val

260

270

280 tr

290

300

CAG' TTA ATT CTC CCG TCT AAT GCG CTT CCC TGT TTT TAT GTT Gln Leu Ile Leu Pro Ser Asn Ala Leu Pro Cys Phe Tyr Val

310

320

330

340

ATT CTC TCT GTA AAG GCT GCT ATT TTC ATT TTT GAC GTT AAA Ile Leu Ser Val Lys Ala Ala Ile Phe Ile Phe Asp Val Lys

350

360

370

380

CAA AAA ATC GTT TCT TAT TTG GAT TGG GAT AAA GGT GGA GGC Gln Lys Ile Val Ser Tyr Leu Asp Trp Asp Lys Gly Gly Gly

390

400

410

420

430

TCA GGC GGA G GGCCAAGTCGGCC ATCCCATATCAC GCGGCCGC GGATCC

Ser Gly Gly Sfil Notl BaroHI

183 855

FIG. 8c

10 20 30 40 tr tt et et et

AAGCTTTGCT AACATACTGC GTAATAAGGA GTCTTAATC ATG CCA GTT Hindlll Met Pro Val

60 70 80 90 tr tr tr tr *

CTT TTG GGT ATT CCG TTA TTA TTG CGT TTC CTC GGT TTC CTT

Leu Leu Gly Ile Pro Leu Leu Leu Arg Phe Leu Gly Phe Leu

100 110 120 130 tr tr tr β

CTG GTA ACT TTG TTC GGC TAT CTG CTT ACT TTC CTT AAA AAG

Leu Val Thr Leu Phe Gly Tyr Leu Leu Thr Phe Leu Lys Lys

140 150 160 170 « tr β

GGC TTC GGT AAG ATA GCT ATT GCT ATT TCA TTG TTT CTT GCT

Gly Phe Gly Lys Ile Ala Ile Ala Ile Ser Leu Phe Leu Ala

180 190 200 210 ir et et #

CTT ATT ATT GGG CTT AAC TCA ATT CTT GTG GGT TAT CTC TCT

Leu Ile Ile Gly Leu Asn Ser Ile Leu Val Gly Tyr Leu Ser

220 230 240 250 tr tr -tr

GAT ATT AGC GCA CAA TTA CCC TCT GAT TTT GTT CAG GGC GTT

Asp Ile Ser Ala Gln Leu Pro Ser Asp Phe Val Gln Gly Val

260 270 280 290 300

Ό tr tr » *

CAG TTA ATT CTC CCG TCT AAT GCG CTT CCC TGT TTT TAT GTT

Gln Leu Ile Leu Pro Ser Asn Ala Leu Pro Cys Phe Tyr Val

310 320 330 340

ATT CTC TCT GTA AAG GCT GCT ATT TTC ATT TTT GAC GTT AAA

Ile Leu Ser Val Lys Ala Ala Ile Phe Ile Phe Asp Val Lys

350 360 370 380 tr er tr tr

CAA AAA ATC GTT TCT TAT TTG GAT TGG GAT AAA GGT GGA GGC

Gln Lys Ile Val Ser Tyr Leu Asp Trp Asp Lys Gly Gly Gly

390 400 410 420 430 tr tr * tt «

TCA GGC GGA TC GGCCAAGTCGGCC ATCCCATATCAC GCGGCCGC GGATCC

Ser Gly Gly Sfil Notl BamKI

183 855

FIG. 9

1 10 tr tr GAATTCCGG CTG EcoRI Leu	GTW Val	TCC Ser	20 tr TAC Tyr	TGC Cys	AGT Ser	30 ☆ GGA Gly	AAA Lys	GCA Ala	40 tr ACG ATG Thr Met
50		60			70			80
tr		tr				tr			tr
CAG TGT GGT GAG	AAT	GAA	AAG	TAC	GAT	TCG	TGC	GGT	AGC AAG
Gln Cys Gly Glu	Asn	Glu	Lys	Tyr	Asp	Ser	Cys	Gly	Ser Lys
90	100		110			120
tr		•fr			tr			*
GAG TGC GAT AAG	AAG	TGC	AAA	TAT	GAC	GGA	GTT	GAG	GAG GAA
Glu Cys Asp Lys	Lys	Cys	Lys	Tyr	Asp	Gly	Val	Glu	Glu Glu
130 140			150			160
tr	tr
GAC GAC GAG GAA	CCT	AAT	GTG	CCA	TGC	CTA	GTA	CGT	GTG TGT
Asp Asp Glu Glu	Pro	Asn	Val	Pro	Cys	Leu	Val	Arg	Val Cys
170 180			190		200		210
tr tr							6		*
CAT CAA GAT TGC	GTA	TGC	GAA	GAA	GGA	TTC	TAT	AGA	AAC AAA
His Gln Asp Cys	Val	Cys	Glu	Glu	Gly	Phe	Tyr	Arg	Asn Lys
220		230			240			250
tr			tr			tr			tr
GAT GAC AAA TGT	GTA	TCA	GCA	GAA	GAC	TGC	GAA	CTT	GAC AAT
Asp Asp Lys Cys	Val	Ser	Ala	Glu	Asp	Cys	Glu	Leu	Asp Asn
260		270			280		290
Λ		tr				tr			tr
ATG GAC TTT ATA	TAT	ccc	GGA	ACT	CGA	AAC	TGA	ACGAAGGCTC
Met Asp Phe Ile	Tyr	Pro	Gly	Thr	Arg	Asn
300 310		320		330		340
tr '	tr		ύ			tr		tr

CATTCTTGCT GCACAAGATC GATTGTCTCTCCCCTGCATCTCAGTAGTTTTGC

350 360 370 380 390 400 tr tr tr t> tr *

TACATTGTATATGGTAGCAAAAAATTAGCTTAGGGAGAATAAAATCTTTACCTAT

410 420 430 t> * «

ATTTAATCAATGAAGTATTCTCTTTCT poli (A)

183 855

Wartość

183 855

FIG. /Η

ΝΛΡ5

Met

Lys

Met

Leu

Tyr

Ala

Ile

Ala

Ile

Met

Phe

Leu

Va 1

ΝΛΡ6

Met

Lys

Met

Leu

Tyr

Ala

Ile

Ala

Ile

Met

Phe

Leu

Va 1

NAPc2

Leu

Va 1

AceNAPS

Met

Arg

Thr

Leu

Tyr

Leu

Ile

Ser

Ile

Trp

Leu

Phe

Leu

Ile

AceNAP7

Met

Ser

Thr

Leu

Tyr

Va 1

Ile

Ala

Ile

C y 3

Leu

Va 1

AceNAP4dl

Met

Ala

Va 1

Leu

Tyr

Ser

Va 1

Ala

Ile

Ala

Leu

Va 1

AceNAP4d2

AduNAP4

AduNAP7dl

Met

Arg

Met

Leu

Tyr

Leu

Va 1

Pro

Ile

Trp

Leu

Ile

AduNAP7d2

HpoNAP5

Met

Ile

Arg

Lys

Leu

Va 1

Leu

Thr

Ala

Ile

Va 1

Thr

F/G. 1/2

ΝΛΡ5

Ser

I. e u

Cys

Ser

Ala

Arg

Thr V a 1

Arg

Lys

Ala

Tyr

Pro

Glu

ΝΛΡ6

Ser

Leu

Cys

Ser

Th r

Arg

Thr Va1

Arg

L y s

Ala

Tyr

Pro

Glu

NAPc2

S o r

Ty r

C y s

Ser

Gly

Lys

Ala

Thr

Met

Gin

AceNAPS

Ser

Gin

Cys

Asn

Gly

Lys

Ala

Phe

Pro

Lys

AceNAP7

Ser

Gin

Cys

Asn

Gly

Arg

Thr

Va 1

Lys

AceNAP4dl

Ser

G 1 n

Cys

Ser

Gly

Lys

Pro Asn

Asn

V a 1

Met

Thr

Asn

Ala

AccNAP4d2

V a 1

Pro

Ile

AduNAP4

Lys

AduNAP7dl

Ser

L e u

Cys

Ser

Gly

Lys

Ala

Lys

ArluMAP7d2

Asp

Glu

llpoNAPS

V a 1

Ma 1

Leu

Ser

Ala

Lys

Thr

183 855

FIG. H3

2

ΝΛΡ5

C y a

Gly

Glu

Asn

Glu

Trp

Leu

Asp

Cys

Gly

Thr

Gln

ΝΛΡ6

Cys

Gly

Glu

Asn

Glu

Trp

Leu

Asp

Va 1

Cys

Gly

Thr

Lys

NAPc2

Cys

Gly

Glu

Asn

Glu

Lys

Tyr

Asp

Ser

Cys

Gly

Ser

Lys

AceNAPS

Cys

Asp

Va 1

Asn

Glu

Arg

Phe

Glu

Va 1

Cys

Gly

Asn

Leu

AceNAP7

Cys

Gly

by s

Asn

Glu

Arg

Tyr

Asp

Cys

Gly

Asn

Ala

AceNAP4dl

Cys

Gly

Leu

Asn

Glu

Tyr

Phe

Ala

Glu

Cys

Gly

Asn

Met

AceNAP4d2

Cys

Gly

Ser

Asn

Glu

Arg

Tyr

Ser

Asp

Cys

Gly

Asn

Asp

AduNAP4

Cys

Pro

Thr

Asp

Glu

Trp

Phe

Asp

Trp

Cys

Gly

Thr

Tyr

AduNAP7dl

Cys

Gly

Leu

Asn

Glu

Arg

Leu

Asp

—

Cys

Gly

Asn

Leu

AduHAP7d2

Cys

Gly

Pro

Asp

Glu

Trp

Phe

Asp

Ty r

Cys

Gly

Asn

Tyr

HpoNAP5

Cys

Gly

Pro

Asn

Glu

Tyr

Thr

Glu

Cys

Gly

Thr

___

FIG. U-4

ΝΛΡ5

I. y s

P r

O

3 C y

s

G 1

U

Ala

Lys

4 C y

9

Asn

Glu

NAPG

Lys

P r

o

C y

s

G 1

u

Ala

Lys

C y

S

Ser

Glu

NAPc2

Glu

- -

-

C y

s

Λ s

P

Lys

C y

S

Lys

Tyr

Asp

Gly

Va 1

Glu

AceNAP5

Lys

G 1

u

C y

s

G 1

u

Leu

Lys

Cy

9

AceNAP?

Lys

Λ s

P

C y

s

G 1

u

Thr

Lys

Cy

a

Gly

AceNAP4dl

Lys

G 1

u

C y

s

G 1

u

His

Arg

C y

a

Asn

Glu

Asn

Glu

AceNAP4d2

Lys

G 1

n

C y

s

G 1

u

Arg

Lys

cy

a

Asn

Glu

Asp

Tyr

Glu

Lys

AduNAP4

Lys

H i

5

C y

s

G 1

u

Leu

Lys

C y

9

Asp

Arg

Glu

Leu

Thr

Glu

Lys

AduNAP7c1l

Lys

G 1

n

C y

9

G 1

u

Pro

Lys

Cy

8

Ser

Asp

Leu

Glu

Ser

Glu

AduNAP7d2

Lys

Ly

s

C y

9

G 1

u

Arg

Lys

C y

s

Ser

Glu

Thr

Ser

Glu

Lys

HpoNAP5

Pro Cys Glu Pro Lys Cys

183 855

FIG. I/-5

ΝΛΡ5

Pro

Glu

G 1

U

G 1

U

Asp

Pro

I 1

e

—

5 Cys

Arg

Ser

Arg

ΝΛΡ6

—

Glu

G 1

u

G 1

u

Asp

Pro

I 1

e

—

Cys

Arg

Ser

Phe

NAPc2

—

Glu

Asp

Λ Ξ

P

G 1

u

Glu

Pro

Λ s

n

Va 1

Pro

Cys

Leu

Va 1

Arg

AceNAP5

—

Asp

G 1

11

Λ s

P

Pro

Lys

X 1

e

—

Cys

—

Ser

Arg

AceNAP7

—

Glu

G 1

u

G 1

u

—

Lys

- -

-

Va 1

—

Cys

Arg

Ser

Arg

AceNAP4dl

Arg

—

Asp

G 1

u

G 1

u

—

Arg

11

e

Thr

Ala

Cys

Leu

Ile

Arg

AceNAP4d2

Gly

—

Asp

G 1

u

Ala

Cys

Arg

Ser

His

AduNAP4

—

Glu

G 1

u

- -

-

—

Gln

- -

-

—

Ala

Cys

Leu

Ser

Arg

AduNAP7dl

Tyr

—

Glu

G 1

u

G 1

u

Asp

Glu

Ser

Lys

—

Cys

Arg

Ser

Arg

AduNAP7d2

Asn

—

Glu

G 1

u

Ala

Cys

Leu

Ser

Arg

llpoNAP5

___

Asn

G 1

u

Pro

Met

Pro

Asp

Ile

—

Cys

—

Thr

Leu

FIG. U-6

NAP5

Gly

6 Cys

L e

U

Leu

Pro

Ala

7 Cys

Va 1

8 C y a

Lys

Asp

NAP6

Ser

Cys

P r

o

Gly

Pro

Ala

Cys

Val

C y a

Glu

Asp

NAPc2

V a 1

Cys

II i

s

Gln

Asp

—

Cys

Va 1

C y a

Glu

AceNAP5

Ala

Cys

I 1

e

Arg

Pro

Ala

Cys

Va 1

C y a

Asp

AceNAP7

Glu

Cys

T h

r

Ser

Pro

Gly

Ala

Cys

Va 1

C y a

Glu

Gln

AceNAP4dl

Va 1

Cys

Ph

e

Arg

Pro

Gly

Ala

C y a

Va 1

Cys

Ly g

Asp

AceNAP4d2

Va 1

Cys

G 1

u

Arg

Pro

Gly

Ala

Cys

Val

C y a

Glu

Asp

AduNAP4

Va 1

Cys

G 1

u

Lys

—

Ser

Ala

Cys

Va 1

C y β

Asn

Asp

AduNAP7dl

Glu

Cys

S e

Γ

Arg

—

Va 1

C y a

Va 1

C y a

Asp

Glu

AduNAP7d2

Ala

Cys

Th

r

Gly

Arg

—

Ala

C y a

Va 1

Cys

Lys

Asp

HpoNAP5

Asn

Cys

I 1

e

Va 1

Asn

—

Va 1

C y a

Gln

Cys

Lys

Pro

183 855

FJG. //-7

NAP5

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asp

Thr

V a 1

Ile

Gly

Asp

Cys

Va 1

Arg

Glu

NAP6

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asp

Thr

V a 1

I 1

e

Gly

Asp

C y a

Va 1

Lys

Glu

NAPc2

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asn

Lys

—

A S

P

Asp

Lys

C y s

Va 1

Ser

Ala

AceNAPS

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asp

Lys

Tyr

- -

-

Gly

Phe

C y a

Va 1

Glu

AceNAP7

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asp

Pro

Ala

- -

-

Gly

Asp

C y o

Va 1

Thr

Asp

AceNAP4dl

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asn

Arg

Thr

- -

-

Gly

Ser

C y a

Va 1

Glu

AceNAP4d2

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asn

Lys

- -

-

Gly

Ser

C y o

Va 1

Glu

Ser

AduNAP4

Gly

Leu

Tyr

Arg

Asp

Lys

Phe

- -

-

Gly

Asn

C y a

Val

Glu

Lys

AduNAP7dl

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asn

Lys

- -

-

Gly

Lys

C y a

Va 1

Ala

Lys

AduNAP7d2

Gly

Leu

Tyr

Arg

Asp

Phe

- -

-

Gly

Asn

C y a

Va 1

Pro

His

HpoNAP5

Gly

Phe

Lys

Arg

Gly

Pro

Lys

- -

-

Gly

—

C y a

Val

Ala

Pro

FG.

//-8

NAP5

Glu

—

1 0 Cys

Asp

Gin

His

Glu

Ile

His

NAP6

Glu

—

C y a

Asp

Gin

His

Glu

Ile

His

NAPc2

Glu

Asp

—

C y s

Glu

—

Leu

Asp

Asn

Met

Asp

Phe

Ile

Tyr

AceNAP5

Asp

Glu

—

C y s

Asn

Asp

Met

Glu

Ile

Thr

AceNAP7

Glu

—

Cys

Asp

Glu

Trp

Asn

Met

Glu

Ile

Thr

AceNAP4dl

Asp

—

C y a

Glu

—

Tyr

Glu

Asn

Met

Glu

Phe

Ile

Thr

AceNAP4d2

Asp

—

C y b

Glu

—

Tyr

Asp

Asn

Met

Asp

Phe

Ile

Thr

AduNAP4

Asp

Glu

—

C y β

Asn

Asp

Met

Glu

Ile

Thr

AduNAP7dl

Asp

Va 1

—

C y a

Glu

Asp

—

Asp

Asn

Met

Glu

Ile

Thr

AduNAP7d2

Asp

Glu

—

C y a

Asn

Asp

Met

Glu

Ile

Thr

HpoNAP5

Gly

Pro

Gly

C y a

Lys

koniec

183 855

F/G. IINAP5 V a 1 koniec

ΝΛΡ6 V a 1 koniec

NAPc2	Pro	Gly	Thr	Arg	Asn	koniec
AceNAP5	Phe	Pro	Pro	Glu	Thr	Lys koniec
AceNAP7	Met	Pro	Lys	Gin	koniec
AceNAP4dl	Phe	Ala	Pro	Glu
AceNAP4d2	Phe	Ala	Pro	Glu	Thr	Ser Arg koniec
AduNAP4	Phe	Ala	Pro	Glu	Thr	Lys koniec
AduWAP7dl	Phe	Pro	Pro	Glu
AduNAP7d2	Phe	Pro	Pro	Glu	Thr	Lys His koniec

HpoNAP5

183 855

FIG. I2a

FIG. I2b.

<----5'ΑΟΧΙ------><--------sygnał sekrecji PH01 (S)-......TTATTCGAAACGĄISTTCTCTCCAATTTTGTCCTTGGAAATTATTTTA ^><: sekwencja Pro(^?)--------GCTACTTTGCAATCTGTCTTCGCCCAGCCAGTTATCTCCACTACCGTTGGTTCC

--------------------------><-miejsce wielokrot-(MCS) nego klonowania

GCTGCCGAGGGTTCTTTGGACAAGAGGCCTATCCGCGGAATTCAGATCTGAAT Stul SacIIEcoRI Bglll

----------------------><---3 'T---->

GCGGCCGCTCGAGACTAGTGGATCCTTAGACA... Notl Xhol Spel BamHI

EagI

183 855

	(AcaNAP23)	F/G. /3a
	10	20 30 40
	tt	tt tt tt
GAATTCCGCG GAATTCCGCT TGCTACTACT CAACG ATG AAG ACG CTC
EcoRI	Met Lys Thr Leu
50	60 70 80
tt		tt * tt
TAT	ATT GTC GCT	ATA TGC TCG CTC CTC ATT TCG CTG TGT ACT
Tyr	Ile Val Ala	Ile Cys Ser Leu Leu Ile Ser Leu Cys Thr
90	100	110 120 130
tt	tt	tt tt tt
GGA	AAA CCT TCG	GAG AAA GAA TGT GGT CCC CAT GAA AGA CTC
Gly	Lys Pro Ser	Glu Lys Glu Cys Gly Pro His Glu Arg Leu
	140	150 160 170
GAC	TGT GGC AAC	AAG AAG CCA TGC GAG CGC AAG TGC AAA ATA
Asp	Cys Gly Asn	Lys Lys Pro Cys Glu Arg Lys Cys Lys Ile
	180	190 200 210
	tt	tt tt tt
GAG	ACA AGT GAG	GAG GAG GAT GAC TAC GAA GAG GGA ACC GAA
Glu	Thr Ser Glu	Glu Glu Asp Asp Tyr Glu Glu Gly Thr Glu
220	230 240 250
	tt	tt tt »
CGT	TTT CGA TGC	CTC TTA CGT GTG TGT GAT CAG CCT TAT GAA
Arg	Phe Arg Cys	Leu Leu Arg Val Cys Asp Gin Pro Tyr Glu
260	270 280 290
tt		♦ tt tt
TGC	ATA TGC GAT	GAT GGA TAC TAC AGA AAC AAG AAA GGC GAA
cys	Ile Cys Asp	Asp Gly Tyr Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Glu
300	310	320 330 340
*	tt	V tt «
TGT	GTG ACT GAT	GAT GTA TGC CAG GAA GAC TTT ATG GAG TTT
cys	Val Thr Asp	Asp Val Cys Gin Glu Asp Phe Met Glu Phe
	350	360 370 380
	tt	* tt tt
ATT	ACT TTC GCA	CCA TAA ACCCAATAAT GACCAATGAC TCCCATTCTT
Ile	Thr Phe Ala	Pro

390	400	410	420	430
tt	tt	tt	tt	tt

CGTGATCAGC GTCGGTGGTT GACAGTCTCC CCTACATCTT AGTAGTTTTG

440 450 460 470 480 « * * * » CTTGATAATG TATACATAAA CTGTACTTTC TGAGATAGAA TAAAGCTCTC

490 &

AACTAC polt (A)

183 855

FIG. Bb (AcaNAP24)

20 30 40 fr fr fr fr

GAATTCCGCG GAATTCCGCA EcoRI	ACG ATG AAG ACG CTC TAT ATT ATC
Met	Lys Thr	Leu	Tyr Ile Ile
50 60		70		80
fr -0		fr		«
GCT ATA.TGC TCG CTC CTC	ATT TCG	TTG TGT	ACT	GGA AGA CCG
Ala Ile Cys Ser Leu Leu	Ile Ser	Leu Cys	Thr	Gly Arg Pro
90 100	110		120
fr fr	fr			fr
GAA AAA AAG TGC GGT CCC	GGT GAA	AGA CTC	GCC	TGT GGC AAT
Glu Lys Lys Cys Gly Pro	Gly Glu	Arg Leu	Ala	Cys Gly Asn
130 140	150	160	170
« fr	fr		tt	fr
AAG AAG CCA TGC GAG CGC	AAG TGC	AAA ATA	GAG	ACA AGT GAG
Lys Lys Pro Cys Glu Arg	Lys Cys	Lys Ile	Glu	Thr Ser Glu
180 190	200		210
fr	fr	fr		fr
GAG GAG GAT GAC TAC CCA	GAG GGA	ACC GAA	CGT	TTT CGA TGC
Glu Glu Asp Asp Tyr Pro	Glu Gly	Thr Glu	Arg	Phe Arg Cys
220 230		240		250
fr fr		fr		fr
CTC TTA CGT GTG TGT GAT	CAG CCT	TAT GAA	TGC	ATA TGC GAT
Leu Leu Arg Val Cys Asp	Gln Pro	Tyr Glu	cys	Ile Cys Asp
260 270	280		290
fr fr		fr		fr
GAT GGA TAC TAC AGA AAC	AAG AAA	GGC GAA	TGT	GTG ACT GAT
Asp Gly Tyr Tyr Arg Asn	Lys Lys	Gly Glu	cys	Val Thr Asp
300 310	320		330
GAT GTA TGC CAG GAA GAC	TTT ATG	GAG TTT	ATT	ACT TTC GCA
Asp Val Cys Gln Glu Asp	Phe Met	Glu Phe	Ile	Thr Phe Ala
340 350 360	370		380
fr fr	fr	fr		«

CCA TAA ACCCAATAAT GACCACTGGC TCCCATTCTT CGTGACCAGC Pro

390 400 410 420 430 * fr w » *

GTCGGTGGTT GACAGTCTCC CCTGCATCTT AGTAGTTTTG CTTGATAATG

440 450 460 470 fr * fr fr

TATCCATAAA CAGTACTTTC TGAGATAGAA TAAAGCTCTC AACT poli (A)

183 855

FIG. I3c

(AcaHSJ?25)

10 20 30 40

tr * -ft *

GAATTCCGTA CTACTCAACG ATG AAG ACG CTC TAT ATT ATC GCT

EcoRI Met Lys Thr Leu Tyr Ile Ile Ala

50 60 70 80

ir ir & ir

ATA TGC TCG CTG CTC TTT TCA CTG TGT ACT GGA AGA CCG GAA

Ile Cys Ser Leu Leu Phe Ser Leu Cys Thr Gly Arg Pro Glu

90 100 110 120

tr ir tr &

AAA AAG TGC GGT CCC GGT GAA AGA CTC GAC TGT GCC AAC AAG

Lys Lys Cys Gly Pro Gly Glu Arg Leu Asp Cys Ala Asn Lys

130 140 150 160 170

X, ir ir ir «

AAG CCA TGC GAG CCC AAG TGC AAA ATA GAG ACA AGT GAG GAG

Lys Pro Cys Glu Pro Lys Cys Lys Ile Glu Thr Ser Glu Glu

180 190 200 210

ir ir ir ir

GAG GAT GAC GAC GTA GAG GAT ACC GAT GTG AGA TGC CTC GTA

Glu Asp Asp Asp Val Glu Asp Thr Asp Val Arg Cys Leu Val

220 230 240 250

O ir tr ir

CGT GTG TGT GAA CGT CCT CTT AAA TGC ATA TGC AAG GAT GGA

Arg Val Cys Glu Arg Pro Leu Lys Cys Ile Cys Lys Asp Gly

260 270 280 290

ir ir ir

TAC TAC AGA AAC AAG AAA GGC GAA TGT GTG ACT GAT GAT GTA

Tyr Tyr Arg Asn Lys Lys Gly Glu Cys Val Thr Asp Asp Val

300 310 320 330

•fr τϊ « -a

TGC CAG GAA GAC TTT ATG GAG TTT ATT ACT TTC GCA CCA TAA

Cys Gin Glu Asp Phe Met Glu Phe Ile Thr Phe Ala Pro

340 350 360 370 380

ir ir ir ir -a

ACCCAATAAT GACCACTGGC TCCCATTCTT CGTGATCAGC GTCGGTGGTT

390 400 410 420 430

O O 6 Ό c

GACAGTCTCC CCTGCATCTT AGTTGCTTTG CTTGATAATC TATACATAAA

440 450 460 470 •O ir ir ir

CAGTACTTTC TGAGATAGAA TAAAGCTCTC AACT poli (A)

183 855

FG. Ud (AcaNAP31) tr

GAATTCCGGA CTTACTAGTA CTCAGCGAAT CAAATACGAC TTACTACTAC EcoRI

70 80 90

TCAACG ATG Met	tr AAG Lys	ACG CTC TCT GCT ATC	tr CCT Pro	tr ATA ATG CTG CTC
Thr Leu	Ser Ala	Ile	Ile	Met	Leu	Leu
100		110		120		130
tr		tr			*			»
CTG GTA TCG	CAA	TGC AGT	GGA AAA	TCA	CTG	TGG	GAT	CAG	AAG
Leu Val Ser	Gln	Cys Ser	Gly Lys	Ser	Leu	Trp	Asp	Gln	Lys
140 tr		150	160 tr			170
TGT GGT GAG	AAT	GAA AGG	CTC GAC	TGT	GGC	AAT	CAG	AAG	GAC
Cys Gly Glu	Asn	Glu Arg	Leu Asp	cys	Gly	Asn	Gln	Lys	Asp
180	190 tr	200 tr			210 tr
TGT GAG CGC	AAG	TGC GAT	GAT AAA	AGA	AGT	GAA	GAA	GAA	ATT
Cys Glu Arg	Lys	Cys Asp	Asp Lys	Arg	Ser	Glu	Glu	Glu	Ile
220	230		240		250			260
tr	1»		»			β			«
ATG CAG GCA	TGT	CTC ACA	CGT CAA	TGT	CTT	CCT	CCT	GTT	TGC
Met Gln Ala	cys	Leu Thr	Arg Gln	Cys	Leu	Pro	Pro	Val	cys
270	280		290			300
			tr		*				•o
GTA TGT GAA	GAT	GGA TTC	TAC AGA	AAT	GAC	AAC	GAC	CAA	TGT
Val Cys Glu	Asp	Gly Phe	Tyr Arg	Asn	Asp	Asn	Asp	Gln	cys
310		320 Ir		330		340
GTT GAT GAA	GAA	GAA TGC	AAT ATG	GAG	TTT	ATT	ACT	TTC	GCA
Val Asp Glu	Glu	Glu Cys	Asn Met	Glu	Phe	Ile	Thr	Phe	Ala

350 360 370 380 390 β tr « w β

CCA TGA AGCAAATGAC AGCCGATGGT TTGGACTCTC GCTACAGATC

Pro

400 410 420 430 440 tT tr tr tr tr

ACAGCTTTAC TGTTTCCCTT GCATCATAGT AGTTTTGCTA GATAGTGTAT

450 460 470 480 tt tr « *

ATATTAGCAT GATTTTCTGA TAGGGAGAAT AAAGCTTTCC AATTTTC poił (A)

183 855

FIG. I3e (&caHAP44)

10 20 tt tt GAATTCCGCG GAATTCCGCA EcoRI	ACG	ATG Met	30	CTC Leu	TAT Tyr	40 ATT Ile	ATC Ile
AAG Lys	tt ACG Thr
50 60			70			80
er er			tt			tt
GCT ATA TGC TCG CTC CTC	ATT	TCG	CTG	TGT	ACT	GGA	AGA	CCG
Ala Ile Cys Ser Leu Leu	Ile	Ser	Leu	Cys	Thr	Gly	Arg	Pro
90 100		110			120
er er		tt				tt
GAA AAA AAG TGC GGT CCC	GGT	GAA	AGA	CTC	GAC	TGT	GCC	AAC
Glu Lys Lys Cys Gly Pro	Gly	Glu	Arg	Leu	Asp	Cys	Ala	Asn
130 140	150		160			170
er er		tt			tt			tt
AAG AAG CCA TGC GAG CCC	AAG	TGC	AAA	ATA	GAG	ACA	AGT	GAG
Lys Lys Pro Cys Glu Pro	Lys	Cys	Lys	Ile	Glu	Thr	Ser	Glu
180 190			200			210
tt	tt			tt				tt
GAG GAG GAT GAC GAC GTA	GAG	GAA	ACC	GAT	GTG	AGA	TGC	CTC
Glu Glu Asp Asp Asp Val	Glu	Glu	Thr	Asp	Val	Arg	Cys	Leu
220 230			240		250
GTA CGT GTG TGT GAA CGG	CCT	CTT	AAA	TGC	ATA	TGC	AAG	GAT
Val Arg Val Cys Glu Arg	Pro	Leu	Lys	cys	Ile	Cys	Lys	Asp
260 270		280			290
GGA TAC TAC AGA AAC AAG	AAA	GGC	GAA	TGT	GTG	ACT	GAT	GAT
Gly Tyr Tyr Arg Asn Lys	Lys	Gly	Glu	Cys	Val	Thr	Asp	Asp
300 310		320			330
tt tt		tt				tt
GTA TGC CAG GAA GAC TTT	ATG	GAG	TTT	ATT	ACT	TTC	GCA	CCA
Val Cys Gln Glu Asp Phe	Met	Glu	Phe	Ile	Thr	Phe	Ala	Pro

340 350 360 370 380 er er er tt »

TAA ACCCAATAAT GACCACTGGC TCCCATTCTT CGTGATCAGC

390 400 410 420 430 a et tr -a -a

GTCGGTGGTT GACAGTCTCC CCTGCATCTT AGTTGCTTTG CTTGATAATC

440 450 460 470 tr tt * tr

TATACATAAA CAGTACTTTC TGAGATAGAA TAAAGCTCTC AACTAC poli (A)

183 8S5

FG. I3f-l (AcaN&P45)

10 tt samscGGA EcoRI	AAA	ATG Met	20 tt CTG ATG Leu Met	CTC Leu	TAC Tyr	30 tt CTT Leu	GTT Val	CCT Pro	40 tt ATC Ile	TGG Trp
50			60		70			80
tt			tt		tt				tt
TTG CTA CTC	ATT	TCG	CAA TGC	AGT	GGA	AAA	TCC	GCG	AAG	AAA
Leu Leu Leu	Ile	Ser	Gin Cys	Ser	Gly	Lys	Ser	Ala	Lys	Lys
90		100		110		120
tt		tt			tt			tt
TGT GGT CTC	AAT	GAA	AAA TTG	GAC	TGT	GGC	AAT	CTG	AAG	GCA
Cys Gly Leu	Asn	Glu	Lys Leu	Asp	cys	Gly	Asn	Leu	Lys	Ala
130	140	150			160
TGC GAG AAA	AAG	TGC	AGC GAC	TTG	GAC	AAT	GAG	GAG	GAT	TAT
Cys Glu Lys	Lys	Cys	Ser Asp	Leu	Asp	Asn	Glu	Glu	Asp	Tyr
170 180		190			200		210
tt	tt		tt				tt			tt
AAG GAG GAA	GAT	GAG	TCG AAA	TGC	CGA	TCA	CGT	GAA	TGT	AGT
Lys Glu Glu	Asp	Glu	Ser Lys	Cys	Arg	Ser	Arg	Glu	Cys	Ser
220			230		240			250
CGT CGT GTT	TGT	GTA	TGC GAT	GAA	GGA	TTC	TAC	AGA	AAC	AAG
Arg Arg Val	Cys	Val	Cys Asp	Glu	Gly	Phe	Tyr	Arg	Asn	Lys
260		270 tt		280 tt			290
AAG GGC CAA	TGT	GTG	ACA AGA	GAT	GAT	TGC	GAG	TAT	GAC	AAT
Lys Gly Gin	Cys	Val	Thr Arg	Asp	Asp	Cys	Glu	Tyr	Asp	Asn
300		310		320		330
ATG GAG ATT	ATC	ACT	TTT CCA	CCA	GAA	GAT	AAA	TGT	GGT	CCC
Met Glu Ile	Ile	Thr	Phe Pro	Pro	Glu	Asp	Lys	cys	Gly	Pro
340	350	360			370
GAT GAA TGG	TTC	GAC	TGG TGT	GGA	ACT	TAC	AAG	CAG	TGT	GAG
Asp Glu Trp	Phe	Asp	Trp Cys	Gly	Thr	Tyr	Lys	Gin	cys	Glu
380 :	390		400			410		420
tt	tt		tt				tt			tt
CGC AAG TGC	AAT	AAG	GAG CTA	AGT	GAG	AAA	GAT	GAA	GAG	GCA
Arg Lys Cys	Asn	Lys	Glu Leu	Ser	Glu	Lys	Asp	Glu	Glu	Ala

183 855

FG. !3f-2

430 440 450 460

tr	tr	tr	•Cr
TGC CTC TCA CGT GCT TGT	ACT GGT CGT	GCT	TGT GTT TGC AAC
Cys Leu Ser Arg Ala Cys	Thr Gly Arg	Ala	Cys Val Cys Asn
470 480	490		500
tr tr	tr		fr
GAC GGA CTG TAC AGA GAC	GAT TTT GGC	AAT	TGT GTT GAG AAA
Asp Gly Leu Tyr Arg Asp	Asp Phe Gly	Asn	Cys Val Glu Lys
510 520	530		540
tr tr	tr		fr
GAC GAA TGT AAC GAT ATG	GAG ATT ATC	ACT	TTT CCA CCG GAA
Asp Glu Cys Asn Asp Met	Glu Ile Ile	Thr	Phe Pro Pro Glu
550 560	570	580
t? o	tr	Ό

ACC AAA CAC TGA CCAAAGGCTC TAACTCTCGC TACATAACGT Thr Lys His

590 600 610 620 630 & ·& * tr fr

CAGTGCTTGA ATTGCCCCTT TACGAGTTAG TAATTTTGAC TAACTCTGTG

640 650 660 670 680 t? tr tr fr fr

TAATTGAGCA TTGTCTACTG ATGGTGAAAA TGAAGTGTTC AATGTCT poli (A)

183 855

	FG.	/3g-/
	(AcaMAP47)
	10 20	30 40
	tr tr	tr tr
GAATTCCGCG GAATTCCGGT TGGCGGCAGA AAA ATG CTG ATG CTC
EcoRI		Met Leu Met Leu
50	60	70 80
tt	tr	tr *
TAC CTT	GTT CCT ATC TGG TTC	CTG CTC ATT TCG CAA TGC AGT
Tyr Leu	Val Pro Ile Trp Phe	Leu Leu Ile Ser Gln Cys Ser
90	100 110 120
GGA AAA	TCC GCG AAG AAA TGT	GGC CTC AAT GAA AAA TTG GAC
Gly Lys	Ser Ala Lys Lys Cys	Gly Leu Asn Glu Lys Leu Asp
130	140 150	160 170
tr	tr tr	« tr
TGT GGC	AAT CTG AAG GCA TGC	GAG AAA AAG TGC AGC GAC TTG
Cys Gly	Asn Leu Lys Ala Cys	Glu Lys Lys Cys Ser Asp Leu
	180 190	200 210
	tr tr	W «
GAC AAT	GAG GAG GAT TAT GGG	GAG GAA GAT GAG TCG AAA TGC
Asp Asn	Glu Glu Asp Tyr Gly	Glu Glu Asp Glu Ser Lys Cys
220 230	240 250
CGA TCA	CGT GAA TGT ATT GGT	CGT GTT TGC GTA TGC GAT GAA
Arg Ser	Arg Glu Cys Ile Gly	Arg Val Cys Val Cys Asp Glu
260	270	280 290
GGA TTC	TAC AGA AAC AAG AAG	GGC CAA TGT GTG ACA AGA GAC
Gly Phe	Tyr Arg Asn Lys Lys	Gly Gln Cys Val Thr Arg Asp
300	310 320 330
GAT TGC	GAG TAT GAC AAT ATG	GAG ATT ATC ACT TTT CCA CCA
Asp Cys	Glu Tyr Asp Asn Met	Glu Ile Ile Thr Phe Pro Pro
340	350 360	370 380
★	tr tr	tr tr
GAA GAT	AAA TGT GGT CCC GAT	GAA TGG TTC GAC TGG TGT GGA
Glu Asp	Lys Cys Gly Pro Asp	Glu Trp Phe Asp Trp Cys Gly
	390 400	410 420
ACT TAC	AAG CAG TGT GAG CGC	AAG TGC AGT GAG GAG CTA AGT
Thr Tyr	Lys Gln Cys Glu Arg	Lys Cys Ser Glu Glu Leu Ser

183 855

FIG. 1g-2

430 440 450 460 tr tr tr tr

GAG AAA AAT GAG GAG GCA TGC Glu Lys Asn Glu Glu Ala Cys	CTC TCA CGT GCT TGT ACT GGT
Leu Ser	Arg	Ala	Cys	Thr	Gly
470 480	490		500
tr tr	ił			tr
CGT GCT TGC GTT TGC AAC GAC	GGA TTG	TAT	AGA	GAC	GAT	TTT
Arg Ala Cys Val Cys Asn Asp	Gly Leu	Tyr	Arg	Asp	Asp	Phe
510 520 530		540
tr tr	tr		ir
GGC AAT TGT GTT GAG AAA GAC	GAA TGT	AAC	GAT	ATG	GAG	ATT
Gly Asn Cys Val Glu Lys Asp	Glu Cys	Asn	Asp	Met	Glu	Ile
550 560 570 * tr Ό		580
ATC ACT TTT CCA CCG GAA ACC	AAA CAC	TGA	CCAAAGGCTC
Ile Thr Phe Pro Pro Glu Thr	Lys His
590 600 610	620		630

tr tr tr tr tr

TAGCTCTCGC TACATAACGT CAGTGCTTGA ATTGTCCCTT TACGTGTTAG

640 650 660 670 680 tT t7 t) ti ir

TAATTTTGAC TAACTCTGTG TATTTGAGCA TTGTCTACTA ATGGTGAAAA

690 700 tr tr

TGAAGCTTTT CAATGACT poli (A)

183 855

	(AcelMAS>48)	FG.
	10 20		30 40
	fr «		fr fr
GAATTCCGTA CGACCTACTA	. CTACTCAACG ATG AAG GCG CTC TAT
EcoRI		Met Lys Ala Leu Tyr
	50 60	70 80
	tr fr		fr fr
GTT	ATC TCT ATA ACG TTG	CTC CTG	GTA TGG CAA TGC AGT GCA
Val	Ile Ser Ile Thr Leu	Leu Leu	Val Trp Gin Cys Ser Ala
90	100	110	120
0	fr	fr	fr
AGA	ACA GCG AGG AAA CCC	CCA ACG	TGT GGT GAA AAT GAA AGG
Arg	Thr Ala Arg Lys Pro	Pro Thr	Cys Gly Glu Asn Glu Arg
130	140	150	160 170
W	fr	fr	fr «
GTC	GAA TGG TGT GGC AAG	CAG TGC	GAG ATC ACA TGT GAC GAC
Val	Glu Trp Cys Gly Lys	Gin Cys	Glu Ile Thr Cys Asp Asp
	180 190	200 210
	fr	*	fr fr
CCA	GAT AAG ATA TGC CGC	TCA CTC	GCT TGT CCT GGT CCT CCT
Pro	Asp Lys Ile Cys Arg	Ser Leu	Ala Cys Pro Gly Pro Pro
	220 230		240 250

GCT Ala

TGC cys

GTA Val

TGC cys

GAC Asp

GGA TAC Gly Tyr

TAC Tyr

AGA Arg

GAC Asp

ACG Thr

AAC Asn

GTT Val

260

270

280 fr

290

GGC Gly

TTG Leu

TGT Cys

GTA Val

CAA Gin

TAT Tyr

GAC GAA Asp Glu

TGC Cys

AAC Asn

GAT Asp

ATG Met

GAT Asp

ATT Ile

300 fr

310 fr

320 fr

330 fr

340 «

ATT Ile

ATG Met

GTT Val

TCA Ser

TAG

GGTTGACTGA AGAATCGAAC AACCGGTGCA

350 360 370 380 390 fr tr tr fr *

CAACTTCTAT GCTTGACTAT CTCTCTTGCA TCATGCAAGT TTAGCTAGAT

400 410 420 430 440

AGTGTATATA TTAGCAAGAC CCCTTGGGGA GAATGAAGCT TCCCAACTAT

450 460 470 480 490 fr fr fr fr fr

ATTAAATCAA. TAACGTTTTC GCTTCATGTA CACGTGCTCA GCACATTCAT

500 510 520

ATCCACTCCT CACACTCCAT GAAAGCAGTG AAATGTT poli'(A)

183 855

FIG. I4

20 30 40 fr fr fr fr

GCC AAC TCT TCG AAC ATG ATT CGA GGC CTC GTT CTT CTT TCT CTC CTG Met Ile Arg Gly Leu Val Leu Leu Ser Leu Leu>

60 70 80 90 fr fr fr fr fr

TTT TGC GTC ACT TTT GCA GCG AAG AGA GAT TGT CCA GCA AAT GAG GAA Phe Cys Val Thr Phe Ala Ala Lys Arg Asp Cys Pro Ala Asn Glu Glu>

100 110 120 130 140 fr fr fr fr »

TGG AGG GAA TGT GGC ACT CCA TGT GAA CCA AAA TGC AAT CAA CCG ATG Trp Arg Glu Cys Gly Thr Pro Cys Glu Pro Lys Cys Asn Gln Pro Met>

150 160 170 180 190 fr fr fr fr fr

CCA GAT ATA TGT ACT ATG AAT TGT ATC GTC GAT GTG TGT CAA TGC AAG Pro Asp Ile Cys Thr Met Asn Cys Ile Val Asp Val Cys Gln Cys Lys>

200 210 220 230 240 fr fr fr fr ♦

GAG GGA TAC AAG CGT CAT GAA ACG AAG GGA TGC TTA AAG GAA GGA TCA Glu Gly Tyr Lys Arg His Glu Thr Lys Gly Cys Leu Lys Glu Gly Ser>

250 260 270 280 fr fr fr fr

GCT GAT TGT AAA TAA GTT ATC AGA ACG CTC GTT TTG TCT TAC ATT AGA Ala Asp Cys Lys

290 300 310 320 330 fr fr fr fr fr

TGG GTG AGC TGA TGT ATC TGT CAG ATA AAC TCT TTC TTC TAA AAA AAA

340 350 360 fr fr fr

AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA A

183 855

FIG. !5

0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100

Dawka (mg/kg s.q.)

Skuteczność

Krwawienie

O NAP-5 O LMWH ^ύ p<0.05 □ NAP-5 0 LMWH wobec soli

Oszacowana utrata krwi 3,5 godziny __ ed₅₀

NAP-5 0.3

LMWH 1.2

P°

ED

100

0.7

2.9

FG. /6

AcaHAP5 AcaNAPG	KAYPECGE KAYPECGE	Al	A2 W G1KKP	Λ3 cEakC CEAKC	A4
NCWLDOC NLWLOYC	NEEPPE SEEE	Et OPIĆ EL DPIC
AcaNAPAO	RTARKPPTCGE	NERVEWC	G KQ	CEITC	OOP		OKIC
AcaHAP23	KPSEKECGP	IIERI.O C	GNKKP	CERKC	KIETSEEEODYEEGTE	RFRC
AcaNAP24	RPEKKCGP	GERLA C	GNKKP	CERKC	KIETSEEEOOYPEGTE	RFRC
AcaNAP25	RPEKKCGP	GERLD C	ANKKP	CFPKC	KIETSEEEDDOVE	OT	DVRC
AcaNAP44	RPEKKCGP	GERLD C	ANKKP	CEPKC	KIETSEEEDOOVE	ET	0VRC
AcaNAP31.42	.46 KSLHOOKCGE	NERLO C	GNOKO	CERKC	ODKRSEE	El	HQAC
AceNAP4-dl	KPNNVHTNACGL	NEYFAEC	GNHKE	CEIIRC	NEE ENEERDE	tu	ITAC
AceNAP4-d2	YPICGS	NERYSOC	GNDKQ CERKC	NEO OYEKG		OEAC
AcaNAP45dl	KSAKKCGL	NEKLO C	GNLKA	CEKKC	SOL DNEEDYKE	ED	ESKC
AcaNAP47d!	KSAKKCGL	NEKLO C	GNLKA	CEKKC	SOL DNEEDYGE	to	ESKC
AdullAP7-dl	KAAKKCGL	NERID C	GNLKO	CEPKC	SDE ESEEYEE	to	ESKC
AcaHAP45d2	DKCGP	DEHFOWC	GTYKO	CERKC	NKE LSEKD		EEAC
AcaNAP47d2	OKCGP	OEHFOHC	GTYKO	CERKC	SEE LSEKN		EEAC
AduNAP4	KCPT	DEWFDWC	GTYKH	CELKC	DRE LTEKE		EOAC
AduNAP7-d2	DECGP	DEHFDYC	GNYKK	CERKC	SEE TSEKN		EEAC
AceNAP5	KAFPKCOV	NERFEYC	GNLKE	CELKC	D	ED	PKIC
AceNAP7	RTVKKCGK	IIERYODC	GNAKD	CEIKC	G	EE	EKVC
AcaNAPc2	KATHOCGE	NEKYDSC	GSKE	CDKKC	KYDGVCEEODE	EP	NVPC
HpoNAPS	KTCGP	NEEYTEC	GTP	CEPKC	HEPHPDI		C
ΝηιιιΝΛΡ	KRDCPA	NCEWREC	GIP	CEPKC	HOPHPDI		C

Λ5 A6 Ą7 AB__A9 AID

RS RGCL Lf>P AĆVCK 0 GFYRO TV 1GOCVR E E£ĆOQ II EIIHV RS ESCP GPA ACVCE D GFYRD TV IGDCVK E EECDO H El IHV

RS LACP	GPP	ACVCO	0	GYYRO TN	VGLCVQ Y OECNO	TOIIM7S
LL RVCD QPY	ECICO 0 GYYRN K	KGECVT 0 DVCOE	DFHEFITFAP
LL RVCO	QPY	ECICO	0	GYYRN K	KGECVT 0 DVCQE	DFHEFITFAP
IV RVCE	RPL	KCICK	0	GYYRN K	KGECYT D DVCQE	DFHEFITFAP
LV RVCE	RPL	KCICK	0	GYYRN K	KGECYT 0 DVCQE	DFHEFITFAP
IT ROCL	PP	VCVCE	0	GFYRN 0	NOQCVD E EECN	HEFITFAP
LI RVCF	RPG	ACVCK	0	GFYRN R	TGSCYE E ODCE	YENHEFITFAPE-
RS HVCE	RPG	ACVCE	D	GFYRN K	KGSCVE S DDCE	YONHOFITFAPETSR
RS RECSR R	VCVCD	E	GFYRN K	KGQCVT R DOCEY	ONHEIITFPPE-
RS RECIG R	VCVCO	E	GFYRN K	KGQCVT R DOCEY	DNHFIITFPPE-*
RS RECS R R	VCVCO	E	GFYRN K	KGKCVA K DVCED	ONHEIITFPPE-*
LS RACTG R	ACVCN	0	GLYRO D	FGNCVE K OECNO	HE IITFPPETKII
LS RACTG R	ACVCN	0	GLYRO D	FGNC7E K OECNO	HEIITFPPETKH
LS RVCE	K S	ACVCN	D	GLYRO K	FGNCVE K DECNO	HEIITFAPEETK
LS RACT	G R	ACVCK	D	GLYRO 0	FGNCVP H OECNO	HEI ITFPPETKII
S RACI	RPP	ACVCO	0	GFYRO K	YGFCVE E OECNO	HEEITFPPETK
RS RECT	SPG	ACVCE	0	GFYRD P	AGDCVT D EECDE	HNNHEIITHPKO
LV RVCH	0	DC7CE	E	GFYRN K	OOKCVS A EDCEL	DNHDFIYPGTRN
TLN CI	VHV	COCK	P	GFKRGPKG	CVA PGPGC K
TMN Cl	VDV	COCK	E	GYKRIIETKG CLKEGSADC K

183 855

FIG. I7

Lys 1

Pro

Asn

Val 5

Met

Thr

Asn

Ala

Cys 10

Gly

Leu

Asn

Glu

Tyr 15

Phe

Ala

Glu

Cys

Gly 20

Asn

Met

Lys

Glu

Cys 25

Glu

His

Arg

Cys

Asn 30

Glu

Asn

Glu 35

Glu

Arg

Asp

Glu

Glu 40

Arg

Ile

Thr

Ala

Cys 45

Leu

Ile

Arg Val 50

Cys

Phe

Arg

Pro 1

Gly 55

Ala

Cys

Val

Cys

Lys

Asp 60

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asn 65

Arg

Thr

Gly

Ser

Cys 70

Val

Glu

Asp

Asp 75

Cys

Glu

Tyr

Glu

Asn 80

Met

Glu

Phe

Ile

Thr 85

Phe

Ala

Pro

Glu

Val 90

Pro

Ile

Cys

Gly

Ser 95

Asn

Glu

Arg

Tyr

Ser 100

Asp

Cys

Gly

Asn

Asp 105

Lys

Gin

Cys

Glu

Arg 110

Lys

Cys

Asn

Glu

Asp 115

Asp

Tyr

Glu

Lys

Gly 120

Asp

Glu

Ala

Cys

Arg 125

Ser

His

Val

Cys

Glu 130

Arg

Pro

Gly

Ala

Cys 135

Val

Cys

Glu

Asp 140

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asn

Lys 145

Lys

Gly

Ser

Cys

Val 150

Glu

Ser

Asp

Cys 155

Glu

Tyr

Asp

Asn

Met 160

Asp

Phe

Ile

Thr

Phe 165

Ala

Pro

Glu

Thr Ser Arg 170

183 855

FIG. /-8

Lys 1	Ser Ala Lys	Lys 5	Cys Gly Leu Asn	Glu Lys 10	Leu Asp	Cys
Gly 15	Asn Leu Lys	Ala	Cys Glu Lys Lys 20	Cys Ser 25	Asp Leu	Asp
Asn	Glu Glu Asp 30	Tyr	Lys Glu Glu Asp 35	Glu Ser	Lys Cys 40	Arg
Ser	Arg Glu Cys 45	Ser	Arg Arg Val Cys 50	Val Cys	Asp Glu 55	Gly
Phe	Tyr Arg Asn 60	Lys	Lys Gly Gln Cys 65	Val Thr	Arg Asp	Asp 70
Cys	Glu Tyr Asp	Asn 75	Met Glu Ile Ile	Thr Phe 80	Pro Pro	Glu
Asp 85	Lys Cys Gly	Pro	Asp Glu Trp Phe 90	Asp Trp 95	Cys Gly	Thr
Tyr	Lys Gln Cys 100	Glu	Arg Lys Cys Asn 105	Lys Glu	Leu Ser 110	Glu
Lys	Asp Glu Glu ' 115	Ala	Cys Leu Ser Arg 120	Ala Cys	Thr Gly 125	Arg
Ala	Cys Val Cys 130	Asn	Asp Gly Leu Tyr 135	Arg Asp	Asp Phe 140	Gly
Asn	Cys Val Glu	Lys 145	Asp Glu Cyc Asn	Asp Met 150	Glu Ile	Ile

Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys His

155 160

183 855

FIG. I

Lys 1

Ser

Ala

Lys

Lys 5

Cys

Gly

Leu

Asn

Glu 10

Lys

Leu

Asp

Cys

Gly 15

Asn

Leu

Lys

Ala

Cys 20

Glu

Lys

Cys

Ser 25

Asp

Leu

Asp

Asn

Glu 30

Glu

Asp

Tyr

Gly

Glu 35

Glu

Asp

Glu

Ser

Lys 40

Cys

Arg

Ser

Arg

Glu 45

Cys

Ile

Gly Arg 50

Val

Cys

Val

Cys 1

Asp 55

Glu

Gly

Phe

Tyr

Arg

Asn 60

Lys

Gly

Gln

Cys 65

Val

Thr

Arg

Asp

Asp 70

Cys

Glu

Tyr

Asp

Asn 75

Met

Glu

Ile

Thr 80

Phe

Pro

Glu

Asp 85

Lys

Cys

Gly

Pro

Asp 90

Glu

Trp

Phe

Asp

Trp 95

Cys

Gly

Thr

Tyr

Lys 100

Gln

Cy®

Glu

Arg

Lys 105

Cys

Ser

Glu

Leu 110

Ser

Glu

Lys

Asn

Glu 115

Glu

Ala

Cys

Leu

Ser 120

Arg

Ala

Cys

Thr 125

Gly

Arg

Ala

Cys

Val

Cyn 130

Asn

Asp

Gly Leu 135

Tyr

Arg

Asp

Asp Phe 140

Gly

Asn

Cys

Val

Glu

Lys 145

Asp

Glu

Cys

Asn

Asp 150

Met

Glu

Ile

Thr Phe Pro Pro Glu Thr Lys His

155 160

183 855

FIG. 20

Lys Ala Ala Lys Lys Cy® Gly Leu Asn Glu Arg Leu Asp Cys

1

5

10

Gly

Asn

Leu

Lys

Gln

Cy®

Glu

Pro

Lys

Cys

Ser

Asp

Leu

Glu

15

20

25

Ser

Glu

Tyr

Glu

Asp

Glu

Ser

Lys

Cys

Arg

Ser

30

35

40

Arg

Glu

Cys

Ser

Arg

Val

Cy®

Val

Cys

Asp

Glu

Gly

Phe

45

50

55

Tyr

Arg

Asn

Lys

Gly

Lys

Cys

Val

Ala

Lys

Asp

Val

Cys

60

65

70

Glu

Asp

Asn

Met

Glu

Ile

Thr

Phe

Pro

Glu

Asp

75

80

Glu

Cys

Gly

Pro

Asp

Glu

Trp

Phe

Asp

Tyr

Cys

Gly

Asn

Tyr

85

90

95

Lys

Cys

Glu

Arg

Lys

Cys

Ser

Glu

Thr

Ser

Glu

Lys

100

105

110

Asn

Glu

Ala

Cys

Leu

Ser

Arg

Ala

Cys

Thr

Gly

Arg

Ala

115

120

125

Cys

Val

Cys

Lys

Asp

Gly

Leu

Tyr

Arg

Asp

Phe

Gly

Asn

130

135

140

Cys

Val

Pro

His

Asp

Glu

Cys

Asn

Asp

Met

Glu

Ile

Thr

145

150

Phe

Pro

Glu

Thr

Lys

His

155 160

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wyizolowane białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą i posiadające jedną lub więcej domen NAP, przy czym każda domena NAP posiada sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samąjak sekwencja:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, przy czym A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 posiadają sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji określonych dla Al, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 przedstawionych na figurze 16.
2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że A3 wybiera się z grupy składającej się z

Glu-Ala-Lys,

Glu-Arg-Lys,

Glu-Pro-Lys,

Glu-Lys-Lys,

Glu-Ile-Thr,

Giu-His-Arg,

Glu-Leu-Lys, i

Glu-Thr-Lys.
3. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że A7 jest Val.
4. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że A7 jest Ile.
5. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że a8 zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z

Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [Sekw.Id.Nr: 69],

Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [Sekw.Id.Nr: 70],

Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [Sekw.Id.Nr: 71],

Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [Sekw.Id.Nr: 72], i

Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [Sekw.Id.Nr: 73].
6. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że A10 zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z

Glu-Ile-Ile-His-Val [Sekw.Id.Nr: 74],

Asp-Ile-Ile-Met-Val [Sekw.Id.Nr: 75],

Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [Sekw.Id.Nr: 76], i

Met-Glu-Ile-Ile-Thr [Sekw.Id.Nr: 77],
7. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że pochodzi z gatunków nicieni.
8. Białko według zastrz. 7, znamienne tym, że rzeczone gatunki nicieni, wybiera się z grupy składającej się z Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus i Heligomosomoides polygyrus.
9. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że A3 jest Asp-Lys-Lys.
10. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że A4 jest sekwencją aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.
11. Białko według zastrz. 10, znamienne tym, że A5 posiada sekwencję A5_a- A5_b- A5_CA5_d [Sekw.Id.Nr: 85], przy czym A5ajest Leu i A5cjest Arg.
12. Białko według zastrz. 11, znamienne tym, że A7 wybiera się z grupy składającej się z Val i Ile.
13. Białko według zastrz. 12, znamienne tym, że A7 jest Val.
14. Białko według zastrz. 13, znamienne tym, że a8 zawiera sekwencję aminokwasową Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [Sekw.Id.Nr: 70].
15. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP z AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59],

183 855
16. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domeny NAP wybrane z HpoNAP5 [Sekw.Id.Nr: 60] i NamNAP [Sekw.Id.Nr: 61].
17. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP z AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 42].
18. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP wybrana z domen NAP AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr. 43], AcaNAP24 [Sekw.Id.Nr: 44], AcaNAP25 [Sekw.Id.Nr: 45], AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 46], AcaNAP31 [Sekw.Id.Nr: 47], AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 48 lub 49].
19. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP wybrana z domen NAP AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 50 lub 53], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 51 lub 54], AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 52 lub 56], AduNAP4 [Sekw.Id.Nr: 55], AceNAP5 [Sekw.Id.Nr: 57] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 58],
20. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada domenę NAP zasadniczo taką samą jak domena NAP wybrana z grupy składającej się z AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 40], AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 41], AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 42], AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr: 43], AcaNAP24 [Sekw.Id.Nr: 44], AcaNAP25 [Sekw.Id.Nr: 45], AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 46], AcaNAP31 [Sekw.Id.Nr: 47], AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 48 lub 49], AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 50 lub 53], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr·. 51 lub 54], AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 52 lub 56], AduNAP4 [Sekw.Id.Nr: 55], AceNAP5 [Sekw.Id.Nr: 57] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 58].
21. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samąjak AcaNAPc2/prolina.
22. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada aktywność hamującą czynnik Xa i tym, że wybrano je z grupy składającej się z AcaNAP5 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 40] lub AcaNAP6 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 41].
23. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada aktywność hamującą proteazą serynową oraz domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domeny NAP wybrane z grupy składającej się z HpoNAP5 [Sekw.Id.Nr: 60] i NamNAP [Sekw.Id.Nr: 61].
24. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samąjak AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59].
25. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada aktywność hamującą czynnik VIIa/TF, oraz tym, że posiada domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59].
26. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada aktywność przeciwkrzepliwą i jest wybrane z grupy składającej się z AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 40], AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 41], AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 42], AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr: 43], AcaNAP24 [Sekw.Id.Nr:

44], AcaNAP25 [Sekw.Id.Nr: 45], AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 46], AcaNAP31 [Sekw. ID.Nr: 47], AceNAP4 [Sekw. Id.Nr: 62], AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 63], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 64], AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 65], AduNAP4 [Sekw. Id. Nr: 55], AceNAP5 [Sekw. Id.Nr: 57] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 58].
27. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada dwie domeny NAP, przy czym rzeczone białko wybiera się z grupy składającej się z AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 62], AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 63], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 64], i AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 65].
28. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada sekwencje aminokwasową AcaNAPc2/prolina.
29. Wyizolowana zrekombinowana cząsteczka cDNA, znamienna tym, że koduje białko posiadające jedną lub więcej domen NAP, przy czym każda domena NAP posiada sekwencję aminokwasową zasadniczo takąsamąjak sekwencją:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cy s-A7-Cys-A8-Cy s-A9-Cys-A10, przy czym Al, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 posiadają sekwencją aminokwasową wybraną spośród sekwencji określonych dla Al, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 przedstawionych na figurze 16.

183 855
30. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że jest wybrana spośród cząsteczek cDNA zasadniczo takich samych jak cząsteczki cDNA kodujące AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 3] i AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 5].
31. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że pochodzi z gatunków nicieni.
32. Cząsteczka cDNA według zastrz. 31, znamienna tym, że rzeczone gatunki nicieni, wybiera się z grupy składającej się z Ancylostoma caninum, Ancyloskoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus i Heligomosomoldes polygyrus.
33. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że jest wybrana spośród cząsteczek cDNA kodujących domenę NAP zasadniczo taką samą jak domeny NAP wybrane z AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 40] i AcaNAPó [Sekw.Id.Nr: 41].
34. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samą jak domena NAP z AcaŃAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59].
35. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samą jak AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr:59],
36. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową zasadniczo taką samą jak sekwencja wybrana spośród cząsteczek cDNA kodujących HpoNAP5 [Sekw.Id.Nr: 14] i NamNAP [Sekw.Id.Nr: 39],
37. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową zasadniczo taką samą jak sekwencja kodująca AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 3] albo AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 5],
38. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową zasadniczo taką samąjak sekwencja kodująca AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 38].
39. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową zasadniczo taką samąjak ta wybrana z grupy składającej się z cząsteczek cDNA kodujących AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr: 31], AcaNAP24 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym:

32] , AcaNAP25 [Sekw.Id.Nr: 33], AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 35], AcaNAP31 [Sekw.Id.Nr: 34], AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 9].
40. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową zasadniczo taką samąjak ta wybrana z grupy składającej się z cząsteczek cDNA kodujących AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 36], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 37], AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 13], AduNAP4 [Sekw.Id.Nr: 12], AceNAP5 [Sekw.Id.Nr: 10] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 11].
41. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową zasadniczo taką samąjak ta wybrana z grupy składającej się z cząsteczek cDNA kodujących AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 3], AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 5], AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 38], AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr: 31], AcaNAP24 [Sekw.Id.Nr: 32], AcaNAP25 [Sekw.Id.Nr:

33] , AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 35], AcaNAP31 [Sekw.Id.Nr: 34], AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 9], AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 36], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 37], AduNAP7 [Sekw.Id.Nr. 13], AduNAP4 [Sekw.Id.Nr: 12], AceNAP5 [Sekw.Id.Nr: 10] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 11].
42. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową kodującą białko posiadające sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samą jak AcaNAPc2/prolina.
43. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że koduje białko posiadające aktywność hamującą czynnik Xa i wybrane z grupy składającej się białek posiadających domeny NAP zasadniczo takie same jak AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 40] lub AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 41].
44. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że koduje białko posiadające aktywność hamującą czynnik VIIa/TF oraz posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59].
45. Cząsteczką cDNA według zastrz. 29, znamienna, tym, że posiada sekwencję nukleotydową zasadniczo taką samąjak AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 19].

183 855
46. Cząsteczka cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, że koduje białko posiadające aktywność hamującą proteazę serynową wybrane z grupy składającej się z białek posiadających domeny NAP zasadniczo takie same jak z HpoNAP5 [Sekw.Id.Nr: 60] i NamNAP [Sekw.Id.Nr: 61].
47. Cząsteczką cDNA według zastrz. 29, znamienna tym, źe koduje białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą i tym, że wybiera się ją z grupy składającej się z cDNA kodujących AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 3], AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 5], AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 38], AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr: 31], AcaNAP24 [Sekw.Id.Nr: 32], AcaNAP25 [Sekw.Id.Nr: 33], AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 35], AcaNAP31 [Sekw.Id.Nr: 34], AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 9], AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 36], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 37], AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 13], AduNAP4 [Sekw.Id.Nr: 12], AceNAP5 [Sekw.Id.Nr: 10] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 11],
48. Oligonukleotyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową wybraną z YG109: TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 88], i YG103: AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 89],
49. Oligonukleotyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową wybraną z NAP-1: AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 90], i NAP-4.RC TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 91].
50. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera białko w ilości dającej stężenie od 1 do 10000 nM i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym wspomnianym białkiem jest wyizolowane białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą i posiadające jedną lub więcej domen NAP, przy czym każda domena NAP posiada sekwencję aminokwasową zasadniczo takąsamąjak sekwencja:

Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, przy czym Al, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 posiadają sekwencją aminokwasową wybraną spośród sekwencji określonych dla Al, A2, A3, A4, a5, A6, A7, A8, A9 i A10 przedstawionych na figurze 16.
51. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że A3 wybiera się z grupy składającej się z

Glu-Ala-Lys,

Glu-Arg-Lys,

Glu-Pro-Lys,

Glu-Lys-Lys,

Glu-Ile-Thr,

Glu-His-Arg,

Glu-Leu-Lys, i

Glu-Thr-Lys.
52. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że A7 jest Val.
53. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że A7 jest Ile.
54. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że A8 zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z

Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [Sekw.Id.Nr: 69],

Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [Sekw.Id.Nr: 70],

Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [Sekw.Id.Nr: 71],

Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [Sekw.Id.Nr: 72], i

Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [Sekw.Id.Nr: 73].
55. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że A10 zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z

Glu-Ile-Ile-His-Val [Sekw.Id.Nr: 74],

Asp-Ile-Ile-Met-Val [Sekw.Id.Nr: 75],

Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [Sekw.Id.Nr: 76], i

Met-Glu-Ile-Ile-Thr [Sekw.Id.Nr: 77].
56. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że białko pochodzi z gatunków nicieni.

183 855
57. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 56, znamienna tym, że rzeczone gatunki nicieni, wybiera się z grupy składającej się z Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus i Heligomosomoides polygyrus.
58. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, zmamiemna tym, że A3 jest AspLys-Lys. ,
59. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, zmamiemma tym, że A4 jest sekwencją aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.
60. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 59, zmamiemma tym, że A5 posiada sekwencję A5_a- A5_b- A5_C- A5_d [Sekw.Id.Nr: 85], przy czym A5_a jest Leu i A5_C jest Arg.
61. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 60, znamienna tym, że A7 wybiera się z grupy składającej się z Val i Ile.
62. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 61, znamienna tym, że A7 jest Val.
63. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 62, znamienna tym, że A8 zawiera sekwencję aminokwasową Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [Sekw.Id.Nr: 70].
64. Kompozycją farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP z AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59].
65. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domeny NAP wybrane z HpoNAP5 [Sekw.Id.Nr: 60] i NamNAP [Sekw.Id.Nr: 61].
66. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP z AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 42],
67. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP wybrana z domen NAP AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr: 43], AcaNAP24 [Sekw.Id.Nr: 44], AcaNAP25 [Sekw.Id.Nr: 45], AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 46], AcaNAP31 [Sekw.Id.Nr: 47], AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 48 lub 49],
68. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP wybrana z domen NAP AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 50 lub 53], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 51 lub 54], AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 52 lub 56], AduNAP4 [Sekw.Id.Nr: 55], AceNAP5 [Sekw.Id.Nr: 57] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 58].
69. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP zasadniczo taką samą jak domena NAP wybrana z grupy składającej się z AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 40], AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 41], AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 42], AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr: 43], AcaNAP24 [Sekw.Id.Nr: 44], AcaNAP25 [Sekw.Id.Nr:

45], AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 46], AcaNAP31 [Sekw.Id.Nr: 47], AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 48 lub 49], AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 50 lub 53], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 51 lub 54], AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 52 lub 56], AduNAP4 [Sekw.Id.Nr: 55], AceNAP5 [Sekw.Id.Nr: 57] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 58].
70. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że rzeczone białko posiada sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samąjak AcaNAPc2/prolina.
71. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające aktywność hamującą czynnik Xa wybrane z grupy składającej się z AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 40] lub AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 41].
72. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające aktywność hamującą proteazą serynową oraz domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domeny NAP wybrane z grupy składającej się z HpoNAP5 [Sekw.Id.Nr: 60] i NamNAP [Sekw.Id.Nr: 61].
73. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samąjak AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59].

183 855
74. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające aktywność hamującą czynnik VIIa/TF, oraz domenę NAP o sekwencji aminokwasowęj zasadniczo takiej samej jak domena NAP AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59].
75. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą i jest wybrane z grupy składającej się z AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 40], AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 41], AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 42], AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr: 43 ], AcNAAP24 [Sekw.dd.Nr: 44], AcNAAP25 [Sekw.dd.Nr: 45], AcNAAP44 [Sekw.Id.Nr: 6(3], AaaNAH 1 ^^ΜΝγ: 4^7], ,A^e^l^^4 ^wyJd/Nr: 22], AcaAA425 [Sekw.Id.Nr: 33], AaaAAP47 64], ANAPAP? [SwkdNNr: 65], AauNPP4 [Sekw.Id.Nr: 55], AcsNAA5 [Sekw.Id.Nr: 57] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 58].
76. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające dwie domeny NAP, przy czym rzeczone białko wybiera się z grupy składającej się z AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 62], AccNAA45 [Sekw.Id.Nr: 63], AcaNAA47 [Sekw.Id.Nr: 64], i AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 65],
77. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że zawiera białko posiadające sekwencje aminokwasową AcaNAPc2/prolina.
78. Środek farmaceutyczny do hamowania krzepnięcia krwi zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera wyizolowane białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą i posiadające jedną lub więcej domen NAP, przy czym każda domena NAP posiada sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samąjak sekwencja:

Cys-A1 -Cys-A2-Cy s-A3-Cys-A4-Cys-A 5-Cy s-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A 10, przy czym A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 posiadają sekwencją aminokwasową wybraną spośród sekwencji określonych dla Al, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 i A10 przedstawionych na figurze 16, w ilości dającej stężenie od 1 nM do 10000 nM.
79. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że A3 wybiera się z grupy składającej się z

Glu-Ala-Lys,

Glu-Arg-Lys,

Glu-Pro-Lys,

Glu-Lys-Lys,

Glu-Ile-Thr,

Glu-His-Arg,

Glu-Leu-Lys, i

Glu-Thr-Lys.
80. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, żeA7 jest Val.
81. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, żeA7 jest Ile..
82. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, Sr AB cwucc- ekkwnncję cmmokwcsoką wybraną z grupy składającej się z

Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [Sekw.Id.Nr: 69],

Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [Sekw.Id.Nr: 70],

Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [Sekw.Id.Nr: 71],

Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [Sekw.Id.Nr: 72], i

Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [Sekw.Id.Nr: 73].
83. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że A10 zawiera sekwencję aminokwasową. wybraną z grupy składającej się z

Glu-Ile-Ile-His-Val [Sekw.Id.Nr: 74],

Asp-Ile-Ile-Met-Val [Sekw.Id.Nr: 75],

Ahe-Ile-Thr-Ahe-Alc-Pro [Sekw.Id.Nr: 76], i

Met-Glu-Ile-Ile-Thr [Sekw.Id.Nr: 77].
84. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że białko pochodzi z gatunków nicieni.'

183 855
85. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że rzeczone gatunki nicieni, wybiera się z grupy składającej się z Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceyłanicum, Ancylostoma diuodenale, Necator americanus i Heligomo somoides polygyrus.
86. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że A3 jest Asp-Lys-Lys.
87. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że A4 jest sekwencję aminokwasową posiadającą anionowy ładunek wypadkowy.
88. Środek farmaceutyczny według zastrz. 87, znamienny tym, że A5 posiada sekwencję A5_a- A5_b- A5_C- A5_d [Sekw.Id.Nr: 85], przy czym A5_ajest Leu i A5_C jest Arg.
89. Środek farmaceutyczny według zastrz. 88, znamienny tym, że A7 wybiera się z grupy składającej się z Val i Ile.
90. Środek farmaceutyczny według zastrz. 89, znamienny tym, że A7 jest Val.
91. Środek farmaceutyczny według zastrz. 90, znamienny tym, że A8 zawiera sekwencję aminok,wasową Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [Sekw.Id.Nr: 70],
92. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP z AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59],
93. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znanmenny tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domeny NAP wybrane z HpoNAP5 [Sekw.Id.Nr: 60] i NamNAP [Sekw.Id.Nr: 61].
94. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP z AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 42].
95. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP wybrana z domen NAP AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr: 43], AcaNAP24 [Sekw.Id.Nr: 44], AcaNAP25 [Sekw.Id.Nr: 45], AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 46], AcaNAP31 [Sekw.Id.Nr: 47], AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 48 lub 49].
96. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP wybrana z domen NAP AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 50 lub 53], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 51 lub 54], AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 52 lub 56], AduNAP4 [Sekw.Id.Nr: 55], AceNAP5 [Sekw.Id.Nr: 57] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 58].
97. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające domenę NAP zasadniczo taką samą jak domena NAP wybrana z grupy składającej się z AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 40], AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 41], AcaNAP48 [Sekw.Id.Nr: 42], AcaNAP23 [Sekw.Id.Nr: 43], AcaNAP24 [Sekw.Id.Nr: 44], AcaNAP25 [Sekw.Id.Nr: 45], AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 46], AcaNAP31 [Sekw.Id.Nr: 47], AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 48 lub 49], AcaNAP45 [Sekw.Id.Nr: 50 lub 53], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 51 lub 54], AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 52 lub 56], AduNAP4 [Sekw.Id.Nr: 55], AceNAP5 [Sekw.Id.Nr: 57] i AceNAP7 [Sekw.Id.Nr: 58],
98. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że rzeczone białko posiada sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samąjak AcaNAPc2/prolina.
99. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające aktywność hamującą czynnik Xa wybrane z grupy składającej się z AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 40] lub AcaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 41],
100. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające aktywność hamującą proteazą serynowąoraz domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domeny NAP wybrane z grupy składającej się z HpoNAP5 [Sekw.Id.Nr: 60] i NamNAP [Sekw.Id.Nr: 61].
101. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samąjak AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59].
102. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające aktywność hamującą czynnik VIIa/TF, oraz domenę NAP o sekwencji aminokwasowej zasadniczo takiej samej jak domena NAP AcaNAPc2 [Sekw.Id.Nr: 59].

183 855
103. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające aktywność przeciwkrzepliwą i jest wybrane z grupy składającej się z AcaNAP5 [Sekw.Id.Nr: 40], AaaNAP6 [Sekw.Id.Nr: 4]], AcNAAP4 8 [Sew,v.Id.Nr: 42], AcaNAP2 3 [Sekw.Id.Nr: 43], AcNAPP44 [SeWv.Id.Nr: 44], Ac—AP25 ^Ι^.Μ.Νγ: 45], AcNAAP44 [Sekw.Id.Nr: 46], AacNM^ [Sekw.Id.Nr: 47], AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 62], AcaNAP45

63], AacN^^ [Selw/ld-Nr: 64] , AduNAP7 [Selw/Ild-Nr: 65], AduNAP4 [Sekw.Id.Nr: 44], AcsNAP5 [Sekw.Id.Nr: 47] i AcsNAP7 [Sekw.Id.Nr: 48].
104. Środek farmaceutyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające dwie domeny NAP, przy czym rzeczone białko wybiera się z grupy składającej się z AceNAP4 [Sekw.Id.Nr: 62], AcaNAP44 [Sekw.Id.Nr: 63], AcaNAP47 [Sekw.Id.Nr: 64], i AduNAP7 [Sekw.Id.Nr: 64].

104. Środek farmaceutyczny według zcstrz. 78, znamienny tym, że zawiera białko posiadające sekwencje aminokwasową. AcaNAPc4/prolina.