PL183698B1 - Pochodna insuliny, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie pochodnej insuliny - Google Patents
Pochodna insuliny, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie pochodnej insulinyInfo
- Publication number
- PL183698B1 PL183698B1 PL96322299A PL32229996A PL183698B1 PL 183698 B1 PL183698 B1 PL 183698B1 PL 96322299 A PL96322299 A PL 96322299A PL 32229996 A PL32229996 A PL 32229996A PL 183698 B1 PL183698 B1 PL 183698B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- insulin
- xaa
- chain
- amino acid
- cys
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 309
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims abstract description 88
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 59
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 36
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 32
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 20
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 20
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 118
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 118
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 108
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 49
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 45
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 25
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- WCNVGGZRTNHOOS-ULQDDVLXSA-N Pro-Lys-Tyr Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O WCNVGGZRTNHOOS-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims description 8
- IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 108010084572 phenylalanyl-valine Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 7
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims 5
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims 4
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 claims 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 3
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 claims 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 claims 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims 2
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 claims 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 claims 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims 1
- 102000005237 Isophane Insulin Human genes 0.000 claims 1
- 108010081368 Isophane Insulin Proteins 0.000 claims 1
- 108010092217 Long-Acting Insulin Proteins 0.000 claims 1
- 102000016261 Long-Acting Insulin Human genes 0.000 claims 1
- 229940100066 Long-acting insulin Drugs 0.000 claims 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 claims 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims 1
- JAWGVVJVYSANRY-UHFFFAOYSA-N cobalt(3+) Chemical class [Co+3] JAWGVVJVYSANRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 claims 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 claims 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 claims 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 claims 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 claims 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 46
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 46
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 28
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 26
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 23
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 23
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 16
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 14
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 13
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 12
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 12
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 11
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N mating hormone Chemical compound C([C@@H](C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCS(C)=O)C(=O)NC(CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CN=CN1 SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 8
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 7
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- VEVRNHHLCPGNDU-MUGJNUQGSA-O desmosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC[N+]1=CC(CC[C@H](N)C(O)=O)=C(CCC[C@H](N)C(O)=O)C(CC[C@H](N)C(O)=O)=C1 VEVRNHHLCPGNDU-MUGJNUQGSA-O 0.000 description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 6
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 6
- -1 Boc groups Chemical group 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 description 5
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- IYLXCLAZLAWMIR-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione;tetradecanoic acid Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O.CCCCCCCCCCCCCC(O)=O IYLXCLAZLAWMIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000590035 Achromobacter lyticus Species 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 4
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 125000001419 myristoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 101100400201 Drosophila melanogaster LysB gene Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 101150018711 AASS gene Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 1
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 1
- 240000007311 Commiphora myrrha Species 0.000 description 1
- 235000006965 Commiphora myrrha Nutrition 0.000 description 1
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N Gln-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N Glu-Gln-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N Gly-Ile-Val Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N His-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 101500025353 Homo sapiens Insulin A chain Proteins 0.000 description 1
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 1
- 101000610640 Homo sapiens U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Proteins 0.000 description 1
- DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N Ile-Cys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 235000007265 Myrrhis odorata Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001110823 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-A Proteins 0.000 description 1
- 101000712176 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-B Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MPUMPERGHHJGRP-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MPUMPERGHHJGRP-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N Tyr-Leu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 102100040374 U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- TZLFWVPLPHJLSE-UHFFFAOYSA-N cyclopentane phenanthrene Chemical group C1CCCC1.C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 TZLFWVPLPHJLSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 108700011811 des(B27-B30)- insulin Proteins 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Cardiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
1 Pochodna insuliny, posiadajaca nastepujaca sekwencje Lancuch A S S i Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser- X 2 1 4 5 6 1 8 9 10 11 12 S | Lancuch B S | Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Lancuch A (ciag dalszy) 2 0 Leu-Tyr-GIn-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (SEQ TD Nr 1) 13 14 15 16 17 18 19 | 2 1 |-S Lancuch B(ciag dalszy) S I Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Lancuch B(ciag dalszy) Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID Nr 2) 25 26 27 28 29 30 w której Xaa w pozycji A21 jest kazdym mozliwym do kodowania aminokwasem, z wyjatkiem Lys, Arg, t Cys, Xaawpozycji B1 ,B2,B3,B26,B27,B28 i B29 sa, niezaleznie od si e bie, kazdym mozliwym do kodowania aminokwasem z wyjatkiem Cys, lub usunietym, Xaa w pozycji B30 jest kazdym mozliwym do kodowania aminokwasem z wyjatkiem Cys, dipeptydem nie obejmujacym Cys lub Arg, tnpeptydem nie obejmujacym Cys lub Arg, tetrapeptydem nie obejmujacym Cys lub Arg, albo usunietym, i albo grupa aminowa aminokwasu N-terminalnego lancucha B po- siada zwiazane z ma ugrupowanie lipofilowe W, które posiada 12-40 atomów wegla i ewentualnie zawiera grupe, która moze byc naladowana ujemnie, albo grupa karboksylowa aminokwasu C-terminalnego lancucha B posiada zwiazane z nia ugrupowanie lipofilowe Z, które posiada 12-40 atomów wegla i ewen- tualnie zawiera grupe, która moze byc naladowana ujemnie, pod warunkiem, ze jesli usuwa sie jeden lub wiecej aminokwasów w pozycji Bl, B21B3, wtedy numer aminokwasu N-terminalnego okresla sie przez liczenie w dól od CysB7, której zawsze przypisuje sie numer 7,...................... PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest pochodna insuliny, posiadającej następujące sekwencje: Łańcuch A S_S
I 7 |
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-ThrrSerrlle-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 | 8 9 10 11 12
S
I
Łańcuch B S
Xaa-Xaa-Xaa-GGn-His-Leu-Cys-GGy-Ser-His-Leu-Val1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Łańcuch A (ciąg dalszy)
Leu-Tyr-Gl--Lr--Gl--A---Tsr-yss-X-- (SEQ ID Nr:1)
14 15 16 17 18 19 | 21 —S
Łańcuch B(ciąg dalssy) S
I
Gl--Al--Lr--Tyr-Leu-Val-yys-Gl—-Gl--Arg-Gl—-Γ^13 14 15 16 178 18 18 28 221 22 2 23 24
183 698
Łańcuch B(ciąg dalszy)
Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID Nr:2)
26 27 28 29 30 w której
Xaa w pozycji A21 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Lys, Arg, i Cys;
Xaa w pozycji B1, B2, B3, B26, B27, B28 i B29 są, niezależnie od siebie, każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, lub usuniętym,
Xaa w pozycji B30 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, dipeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tripeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tetrapeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, albo usuniętym; i albo grupa aminowa aminokwasu N-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe W, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, albo grupa karboksylowa aminokwasu C-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe Z, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, pod warunkiem, że jeśli usuwa się jeden lub więcej aminokwasów w pozycji B1, B2 i B3, wtedy numer aminokwasu N-terminalnego określa się przez liczenie w dół od CysB7, której zawsze przypisuje się numer 7, i że (a) gdy B1-B2-B3 jest Phe-Yal-Asn i A21 jest Asn oraz B26-B27-B28-B29-B30 jest Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr lub Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, wtedy wspomniane W lub Z zawsze zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie;
oraz (b) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z j aką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B i ani Bl, B2 ani B3 nie usuwa się, wtedy B1-B2 jest różny od Phe-Yal lub B26-B27-B28 jest różne od Tyr-Thr-Pro albo zarówno B1-B2 jak i B26-B27-B28 są różne od wspomnianych sekwencji;
oraz (c) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B, ijedenzB! B2 lub B3 usuwa się, wtedy aminokwas N-terminalny łańcucha B jest różny od Val lub sekwencja B26-B27-B28 jest różna od Tyr-Thr-Pro albo zarówno aminokwas N-terminalny łańcucha B jak i sekwencja B26-B27-B28 są różne od odpowiednio Val i Tyr-Thr-Pro.
W korzystnej postaci realizacji, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej insuliny, posiadaj ącej następuj ącą sekwencj ę:
| łańcuch | A S | S | |
| Gly-Ile- | 1 7 -Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile- | -Cys- | Ser |
| 1 2 | 3 4 5 6 | 8 9 10 | 11 | 12 |
S
Łańcuch B S
I
Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-
| 1 2 | 3 4 | 5 6 7 | 8 9 | 10 11 12 |
| Łańcuch | A (ciąg | dalszy) | 20 |
Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa 13 14 15 16 11 18 19 | 21 —S (SEQ ID Nr:1)
183 698
Łańcuch B(ciąg dalszy) S
I
Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Łańcuch B(ciąg dalszy)
Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa 25 26 27 28 29 30 (SEQ ID Nr:2) w której
X— w pozycji A21 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Lys, Arg, i Cys;
X— w pozycji B1, B2, B3, B26, B27, B28, B29 i B30 są, niezależnie od siebie, każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, lub usuniętym; i albo grupa aminowa aminokwasu N-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe W, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, albo grupa karboksylowa aminokwasu C-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe Z, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, pod warunkiem, żejeśli usuwa się jeden lub więcej aminokwasów w pozycji B1, B2 i b3, wtedy numer aminokwasu N-terminalnego określa się przez liczenie w dół od CysB7, której zawsze przypisuje się numer 7, i że (a) gdy B1-B2-B3 jest Phe-Val-Asn i A21 jest Asn oraz B26-B27-B28-B29-B30 jest Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr lub Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, wtedy wspomniane W lub Z zawsze zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie;
oraz (b) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B i ani B1, B2 aniB3 nie usuwa się, wtedy B1-B2 jest różny od Phe-Val 'lub B26-B27-B28 jest różny od Tyr-Thr-Pro albo zarówno B1-B2 jak i B26-B27-B28 są różne od wspomnianych sekwencji;
oraz (c) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B, ijedenzB1, B2 lub B3 usuwa się, wtedy aminokwas N-terminalny łańcucha B jest różny od Val lub sekwencja B26-B27-B28 jest różna od Tyr-Thr-Pro albo zarówno aminokwas N-terminalny łańcucha B jak i sekwencja B26-B27-B28 są różne od odpowiednio Val i Tyr-Thr-Pro.
Gdy ugrupowanie lipofilowe W wiąże się z grupą α-aminową. aminokwasu N-terminalnego łańcucha B, wtedy wiązanie między grupą α-aminową i W jest korzystnie wiązaniem amidowym, w którym N-terminalna grupa aminowa łańcucha B stanowi cząstkę aminy, a grupa zawarta w W stanowi cząstkę karboksylu.
Gdy ugrupowanie lipofilowe Z wiąże się z grupą, karboksylową aminokwasu C-terminalnego łańcucha B, wtedy wiązanie między grupą karboksylową i Z jest korzystnie wiązaniem amidowym, w którym C-terminalna grupa karboksylową stanowi cząstkę karboksylu, a grupa aminowa zawarta w Z stanowi cząstkę aminy.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny jaką opisano powyżej, w której ugrupowanie lipofilowe W wiąże się z grupą α-aminową aminokwasu N-terminalnego łańcucha B.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny jaką opisano powyżej, w której ugrupowanie lipofilowe Z wiąże się z grupą karboksylową aminokwasu C-terminalnego łańcucha B.
183 698
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji A21 wybiera się z grupy, obejmującej Ala, Asn, Gln, Glu, Gly i Ser.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji B1jest Phe.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji B1 usuwa się.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji B2 jest wybrany z grupy, obejmującej Ala i Val.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji B3 wybiera się z grupy, obejmującej Asn, Gln, Glu i Thr.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji B26 jest Tyr.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji B27 jest Thr.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji B28 jest Pro.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji B29 jest. Lys lub Thr.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji B28 jest Lys i aminokwas w pozycji B29 jest Pro.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas w pozycji B30 jest Thr lub ε-acylowaną Lys.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której Xaa w pozycji 30 w SEQ ID Nr: 2 oznacza dipeptyd Thr-Lys.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której Xaa w pozycji 30 Nr: 2 oznacza dipeptyd Gly-Lys.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której Xaa w pozycji 30 w SEq ID Nr: 2 oznacza tripeptyd Glu-Ser-Lys.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której Xaa w pozycji 30 w SEQ ID Nr: 2 oznacza tripeptyd Thr-Gly-Lys.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której Xaa w pozycji 30 w SEQ ID Nr: 2 oznacza tetrapeptyd Thr-Gly-Gly-Lys.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której Xaa w pozycji 30 w SEQ ID Nr: 2 oznacza tetrapeptyd Tto-Glu-Gly-Lys.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której Xaa w pozycji 30 w SEq ID Nr: 2 oznacza tetrapeptyd Gly-Asp-Thr-Lys.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwas C-terminalny łańcucha B jest ε-acylowaną Lys i aminokwas następny po aminokwasie C-terminalnym jest Gly.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której insuliną pierwotną jest insulina des(B30).
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której insuliną pierwotnąjest ludzka insulina des(B30).
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której insuliną pierwotną jest insulina des(B28-B30).
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której insuliną pierwotną jest insulina des(B27-B30).
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której insuliną pierwotną jest insulina des(B26-B30).
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, w której aminokwasem w pozycji B28 jest Pro i aminokwasem w pozycji B29 jest Thr.
183 698
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, która posiada ugrupowanie W, jakie wymieniono powyżej, związane z N-terminalnągrupą a-aminową jej łańcucha B, przy czym W jest ugrupowaniem o ogólnym wzorze CH3(CH2)nCH (COOH)NH-CO(CH2)2CO-, w którym n oznacza liczbę całkowitą od 9 do 15.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, która posiada ugrupowanie W, jakie wymieniono powyżej, związane z N-terminahną grupą a-aminowąjej łańcucha B, przy czym W jest ugrupowaniem o ogólnym wzorze CH3(CH2)rCO -NHCH (COOH)(CH2)2CO- w którym r oznacza liczbę całkowitą od 9 do 15.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, która posiada ugrupowanie W, jakie wymieniono powyżej, związane z N-terminalną grupą, α-aminową jej łańcucha B, przy czym W jest ugrupowaniem o ogólnym wzorze CH3(CH2)S CO-NHCH((CH2)2COOH)CO-, w którym s oznacza liczbę całkowitą od 9 do 15.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, która posiada ugrupowanie Z, jakie wymieniono powyżej, związane z C-tenminalnym aminokwasem jej łańcucha B, przy czym Z jest ugrupowaniem o ogólnym wzorze -NHCH(COOH) (CH2)4NH-CO(CH2)mCH3, w którym m oznacza liczbę całkowitąod 8 do 18, tojest Z jest N-acylowaną resztą lizyny.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, która posiada ugrupowanie Z, jakie wymieniono powyżej, związane z C-terminalnym aminokwasem jej łańcucha B, przy czym Z jest ugrupowaniem o ogólnym wzorze -NHCH (COOH) (CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3, w którym p oznacza liczbę całkowitą od 10 do 16.
W innej korzystnej postaci realizacji, niniejszy wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, która posiada ugrupowanie Z, jakie wymieniono powyżej, związane z C-terminalnym aminokwasem jej łańcucha B, przy czym Z jest ugrupowaniem o ogólnym wzorze -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3, w którym q oznacza liczbę całkowitąod 10 do 16.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, która posiada ugrupowanie Z, jakie wymieniono powyżej, która zawiera częściowo lub całkowicie uwodorniony szkielet cyklopentanofenantrenowy.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do pochodnej insuliny, która posiada ugrupowanie Z, jakie wymieniono powyżej, będące acylowanym aminokwasem, w szczególności acylowaną lizyną.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do ludzkiej insuliny Thr^9 ugrupowaniem Z, jakie wymieniono powyżej, związanym z C-terminalnym aminokwasemjej łańcucha B.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do ludzkiej insuliny dci^(Bi2{8-lBij^C0, z ugrupowaniem Z, jakie wymieniono powyżej, związanym z C-terminalnym aminokwasem jej łańcucha B.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do -ludzkiej insuliny des(B27-B30), z ugrupowaniem Z, jakie wymieniono powyżej, związanym z C-terminalnym aminokwasem jej łańcucha B.
W innej korzystnej postaci realizacji, wynalazek odnosi się do ludzkiej insuliny des(B26-B30), z ugrupowaniem Z, jakie wymieniono powyżej, związanym z C-terminalnym aminokwasem jej łańcucha B.
Następnie wynalazek dotyczy zastosowania pochodnej insuliny według wynalazku, do sporządzenia leku do leczenia cukrzycy.
Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej do leczenia cukrzycy, charakteryzującej się tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość pochodnej insuliny posiadającej następującą sekwencję:
183 698
| Łańcuch | A | S | S |
| Gly-Ile- | -V-1-G1u-G1-- | I 7 -yys-yys-ThhrSer-Ilr | I -Cys-Ser |
| 1 2 | 3 4 5 | 6 | 8 9 10 | 11 12 |
S
Łańcuch B S
I
Xaa-Xaa-Xa--GGnnHis-Leu-Cys-GGy-Ser-His-Leu-Val-
| 1 2 | 3 4 5 6 7 | 8 9 | 10 11 12 |
| Łańcuch | A (ciąg dalszy) | 20 |
Leu-Tyr-Gl--Lru-Glu-A---Tsr-ys--X-- (SEQ ID Nr:l)
14 15 16 Π 18 19 I 21 _S
I
Łańcuch B(ciąg dalszy S
I
Glu-Al--Lru-Tyr-Leu-ValGyys-Gls-Glu-Arg-Gls-Pre13 14 15 16 17 18 18 20 21 22 223 24
Łańcuch B(ciąg dalszy)
Phe-Xaa-X---X---X---X-- (SEQ ID Nr:2)
26 27 28 29 30 w której
Xaa w pozycji A21 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem, z wyjątkiem Lys, Arg, i Cys,
Xaa w pozycji B1, B2, B3, B26, B27, B28 i B29 są, nieyalrż-ir od siebie, każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, lub usuniętym,
Xaa w pozycji B30 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, dipeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tripeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tetrapeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, albo usuniętym, i albo grupa aminowa aminokwasu N-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe W, które posiada 12-40 atomów węgla i rwe-tualnie zawiera grupę, która może być —ładow— ujemnie, albo grupa karboksylowa aminokwasu C-terminalnego łańcucha B posiada związane z mąugrupowanie lipofilowe Z, które posiada 12-40 atomów węgla i ewrntu-l-ir zawiera grupę, która może być —ładow— ujemnie, pod warunkiem, że jeśli usuwa się jeden lub więcej aminokwasów w pozycji B1, B2 i B3, wtedy numer aminokwasu N-trImi—l-rgo określa się przez liczenie w dół od CysB7, której zawsze przypisuje się numer 7, i, że (a) gdy B1 -B2-B3jest Pre-V-l-As- i A21 oz--cz-As- i B26-B27-B28-B29-B30jest Tyr-Trr-Pro-Lys-Thr lub Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, wtedy wspomni— W lub Z zawsze zawiera grupę, która może być nał-dow— ujemnie, oraz (b) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest: obecna w aminokwasie y-trrminalnym łańcucha B i ani B1, B2 ani B3 nie usuwa się, wtedy B1-B2 jest róż183 698 ny od Phe-Val lub B26-B27-B28 jest różne od Tyr-Thr-Pro albo zarówno B1-B2 jak i B26-B27-B28 są różne od wspomnianych sekwencji, oraz (c) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B, i jeden z B1, B2 lub B3 usuwa się, wtedy aminokwas N-terminalny łańcucha B jest różny od Val lub sekwencja B26-B27-B28 jest różna od Tyr-ThrPro albo zarówno aminokwas N-terminalny łańcucha B jak i sekwencja B26-B27-B28 są różne od odpowiednio Val i Tyr-Thr-Pro, razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej do leczenia cukrzycy, charakteryzującej się tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość pochodnej insuliny posiadająca następującą sekwencję:
| Łańcuch | A S | S |
| Gly-Ile- | 1 7 -Val-Glu-GlnGCys-Cys-ThhrGeer1le- | 1 -Cys-Ser |
| 1 2 | 3 4 5 6 | 8 1 10 | 11 12 |
S
Łańcuch B S
I
Xaa-Xaa-Xaa-GlnnHiS-Leu-CCS-Gly-Ser-His-Leu-Val-
| 1 2 | 3 4 | 5 6 7 | 8 9 | 10 11 12 |
| Łańcuch | A (ciąg | dalszy) | 20 |
Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (SEQ ID Nr:l)
14 15 16 117 18 19 | 21 _S
I
Łańcuch B(ciąg dalszy) S
I
Glu-AlaHLe--Tyr-Leu-Val-Cys-GlyGGl--Arg-GlyGPheH 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Łańcuch B(ciąg dalszy)
Phe-XaaGXaaGXaa-Xaa-Xaa (SEQ ID Nr:2)
26 27 28 29 30 w której
Xaa w pozycji A21 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem, z wyjątkiem Lys, Arg, i Cys,
Xaa w pozycji B1, B2, B3, B26, B27, B28 i B29 są, niezależnie od siebie, każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, lub usuniętym,
Xaa w pozycji B30 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, dipeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tripeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tetrapcptydem nie obejmującym Cys lub Arg, albo usuniętym, i albo grupa aminowa aminokwasu N-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe W, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, albo grupa karboksylowa aminokwasu C-terminalnego łańcucha B posiada związane z niąugrupowa16
183 698 nie lipofilowe Z, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, pod warunkiem, że jeśli usuwa się jeden lub więcej aminokwasów w pozycji B1, B2 i B3, wtedy numer aminokwasu N-terminalnego określa się przez liczenie w dół od CysB7, której zawsze przypisuje się numer 7, i że (ż) gdyB 1-B2-B- j2-t Phe-Val-esn i -Asi ozna1za Asn |7 1326-^1322-1^:^224-^228^^32 jest Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr lub Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, wtedy wspomniane W lub Z zawsze zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, oraz (b) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B i ani B1, B2 ani B3 nie usuwa się, wtedy B1-B2 jest różny od Phe-Val lub B26-B27-Ba8 jest różne od Tyr-Tllr-Pno albo z-równo B1-B2 j-k i B26-B27-B28 są różne od wspomnianych sekwencji, oraz (c) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-termmalnym łańcucha B, ijedenzB1, B2 lub B3 usuwa się, wtedy aminokwas N-terminalny łańcucha B jest różny od Val lub sekwencja B26-Ba7-B28 jest różna od Tyr-ThrPro albo zarówno aminokwas N-terminalny łańcucha B jak i sekwencja B26-B27-Ba8 są różne od odpowiednio Val i Tyn-Thn-Pro, w mieszaninie z insuliną lub analogiem insuliny, posiadającym szybki początek działania w proporcjach odpowiednio od 1:5 do 5:1, razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Kompozycja farmaceutyczna, według wynalazku jest rozpuszczalna przy fizjologicznych wartościach pH.
Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku, najwydajniej rozpuszcza się przy' wartościach pH w przedziale od około 6,5 do około 8,5.
Kompozycja według wynalazku jest kompozycją farmaceutyczną o przedłużonym działaniu.
Kompozycja farmaceutyczna, może występować w roztworze zawierającym od około 120 nmoli/ml do około 1200 nmoli/ml, korzystnie około 600 nmoli/ml pochodnej insuliny według wynalazku.
Kompozycją według wynalazku można leczyć pacjentów z cukrzycą, które to leczenie obejmuje podawanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości pochodnej insuliny według wynalazku, w mieszaninie z insuliną lub analogiem insuliny, który posiada szybki początek działania, razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Przykładami zalecanych pochodnych insuliny według niniejszego wynalazku są następujące pochodne:
Ludzka insulina (N^^-tetradekanoilo) Thr^9, LysB30,
Ludzka insulina (N^Metradekanoilo) Lys2a8 des(B29, B30),
Ludzka insulina (N^Utetradekanoilo) Lss2a7 des(B28-B30) oraz ludzka insulina (N^^-tetradekanoilo) Lys2a6 des(B27-B30).
Ludzka insulina (N^^-tetradekanoilo) GluB30, Ser031, Lys23a.
Ludzka insulina (N^-acetylo, NB^-tetradekanoilo) GluB30, Ser^1, Lys032.
Niniejszy wynalazek został zilustrowany na załączonym rysunku, w którym fig. 1 ukazuje konstrukcję plazmidów pKV 153, pKV159, pJB173, pJB174 i pJB175; fig.2a, którąkontynuuje się na fig.2b, ukazuje sekwencję pMT742, pozycja 907 i 1500, oraz oligonukleotydy #94, #593, #2371 i #3075 użyte do PCR1A, PCR1B i PCR1C zgodnie z przykładem 1. Sekwencję aminokwasu 138, odpowiadającą alfa preproliderowi MF (aminokwasy nr 1-85), i prekursorowi insuliny, o sekwencji aminokwasowej B(1-29)AlaAlaLysA(1-al), w której A(1-21) jest łańcuchem A ludzkiej insuliny i B(1-29) jest łańcuchem B ludzkiej insuliny, w której nie ma Thr(B30), ukazuje się podsekwencją kodującą (aminokwasy nr 86-138).
TERMINOLOGIA'
Trzy litery oraz jedna litera, kodujące reszty aminokwasowe, użyte tutajsą literami ustalonymi w J.Biol.Chem. 243, str.3558 (1968).
W sekwencjach DNA, A jest adeniną, C jest cytozyną, G jest guaninąi T jest tyminą.
Użyto następujących akronimów:
183 698
DMSO dla sulfotlenku dimetylu,
DMF dla dimetyloformamidu,
Boc dla tert-butoksykarbonylu,
NMP dla 1-mrtylo-2-plrolldonu
TFA dla kwasu trifiuorooctowego,
X-OSu dla estru N-hydroksysukcynoimidowego,
X dla grrupy acylowej,
RP-HPLC dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwrotną fazą.
SPORZĄDZENIE LIPOFILOWYCH POCHODNYCH INSULINY
Pochodne insuliny według niniejszego wynalazku można sporządzić między innymi jak opisano poniżej:
1. Pochodne insuliny, cechujące się resztą aminokwasową w pozycji B30, którą można kodować za pomocą kodu genetycznego, np. trconina (insulina ludzką) lub alanina (insulina świńska).
1.1 Insuliny modyfikowane przez dołączenie ugrupowania lipofiłowego Wdo N-terminalnej grupy aminowej, poczynając od insuliny ludzkiej.
Ludzką insulinę traktuje się odczynnikiem Boc (np. diwęglanem di-ter-butylowym), aby utworzyć ludzką insulinę (Al,B29)-diBoc, to jest insulinę ludzką, w której koniec N-terminalny łańcucha A i grupę e-aminowaLys1329 zabezpieczono grupąBoc. Po ewentualnym oczyszczeniu, np. przez HPLC, wprowadza się grupę acylową do grupy α-aminowej PheB*, pozostawiając produkt do przereagowania z estrem N-hydroksysukcynoimidowym o wzorze W-OSu, w którym W jest grupąacylowąjak określono powyżej, wprowadzanaprzy N-terminalnej grupie a-aminowej łańcucha B. W etapie końcowym, stosuje się TFA, aby usunąć grupy Boc oraz izoluje się produkt, ludzką insulinę N^-W.
2. Pochodne insuliny bez reszty aminokwasu w pozycji B30, to jest insuliny des(B30).
2.1 Wyjście od ludzkiej insuliny lub świńskiej insuliny.
Po potraktowaniu karboksypeptydazą A w buforze amonowym, obie insuliny ludzka i świńska, dają insulinę des(B30). Po ewentualnym oczyszczeniu insulinę des(B30) traktuje się odczynnikiem Boc (np. diwęglanem di-tert-butylowym), aby utworzyć insulinę (A1,B29)-diBoc des(B30). Po ewentualnym oczyszczeniu np. przez HPLC, wprowadza się grupę acylową do grupy α-aminowej aminokwasu w pozycji B1, pozostawiając produkt do przereagowania z estrem N-hydroksysukcynoimidowym o wzorze W-OSu, w którym W jest wprowadzaną grupą acylową. W etapie końcowym, stosuje się TFA, aby usunąć grupy Boc oraz izoluje się produkt, ludzką insulinę Na|n- w des (b30).
2.2 Wyjście od prekursora ludzkiej insuliny o pojedynczym łańcuchu.
Jako materiału wyjściowego, można użyć prekursora ludzkiej insuliny o pojedynczym łańcuchu, przedłużonej w pozycji B1 przedłużeniem (Ext), przyłączonym do B1 poprzez resztę argininy, i posiadającej mostek od lizyny C-terminalnej w pozycji B26, B27, B28 lub B30 do Al. Korzystnie mostkirmJest peptyd o wzorze Yn-Arg, gdzie Y jest możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem cysteiny, lizyny i argininy, oraz n oznacza zero lub liczbę całkowitą, wynoszącą 1-35. Gdy n>1, Y’może oznaczać różne aminokwasy. Zalecanymi przykładami mostka od Lys w pozycji B26, B27, B28 lub B30 do A1 są: AlaAlaArg, SerArg, SerAspAspAlaArg i Arg (europejskie zgłoszenie patentowe nr 163 529). Traktowanie takiego prekursora o ogólnym wzorze Ext-Arg-B(1-Q)-Yn-Arg-A(1-21), w którym Q jest 26,27,28 lub 30, endopeptydazą lizylową np. proteazą Achromobacter lyticus, daje w wyniku insulinę Ext-Arg-1B(1-Q) Yn-Arg-A(1-21). Acylacja tego związku pośredniego estrem N-hydroksysukcynoimidowym o ogólnym wzorze X-OSu, w którym X oznacza grupę acylową, wprowadza grupę acyIowąX do grupy ε-aminowej LysBQ, oraz do N-terminalnej grupy aminowej łańcucha A i łańcucha B, aby dać insulinę (NeBQ-X) X-Ext-Arg-B(1-Q) X-Yn-Arg-A(1-21). Ten związek pośredni, po potraktowaniu trypsyną w mieszaninie wody i odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego np. DMF, DMSO lub niższego alkoholu, daje żądanąpochodną, Z-insulinę ludzką, w której Z oznacza LyseBQ -X..
183 698
Kompozycje farmaceutyczne zawierające pochodnąpeptydu według niniejszego wynalazku można podawać pozajelitowe pacjentom potrzebującym takiego leczenia. Podawanie pozajelitowe można wykonać przez iniekcję podskórną, domięśniową, lub dożylną za pomocą strzykawki, ewentualnie strzykawki typu pen. Alternatywnie, podawanie pozajelitowe można wykonać za pomocą pompy infuzyjnej. Dalszą ewentualnością jest kompozycja, która może być proszkiem lub cieczą do podawania pochodnej peptydu w postaci sprayu do nosa. Jako jeszcze dalsza ewentualność, możliwe jest podawanie pochodnych peptydu przez skórę.
Kompozycje farmaceutyczne, zawierające związek według niniejszego wynalazku można sporządzić poprzez zwykłe techniki np. jakie opisano w Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1985.
Tak więc, możliwe do wstrzyknięcia kompozycje pochodnych peptydowych według wynalazku można wytworzyć przy użyciu technik zwyczajnych w przemyśle farmaceutycznym, które obejmująodpowiednie rozpuszczanie i mieszanie składników, w celu dostarczenia żądanego produktu końcowego.
Tak więc, zgodnie z jedną procedurą, pochodną peptydową rozpuszcza się w ilości wody, która jest nieco mniejsza niż ostateczna objętość sporządzanej kompozycji. Dodaje się wymagany środek izotoniczny, konserwant i bufor, a wartość pH roztworu reguluje się - jeśli trzeba - przy użyciu kwasu np. kwasu chlorowodorowego, lub zasady np. wodnego roztworu wodorotlenku sodu, według potrzeby. Ostatecznie, objętość roztworu reguluje się wodą, aby otrzymać żądane stężenie składników'.
Przykładami środków izotonicznych są chlorek sodu, mannitol i glicerol.
Przykładami konserwantów są fenol, m-krezol, p-hydroksybenzoesan metylu oraz alkohol benzylowy.
Przykładami odpowiednich buforów są octan sodu oraz fosforan sodu.
Zalecanymi kompozycjami farmaceutycznymi szczególnych insulin według niniejszego wynalazku sąroztwory kompleksów hek-amerycznsch. Typowo kompleksy heksameryczne stabilizuje się dwoma lub więcej jonów cynkowych i trzema lub więcej cząsteczek związku fenolowego, jak fenol lub m-krezol albo ich mieszaniny, na heksamer.
W szczególnej postaci realizacji, dostarcza się kompozycji, która zawiera dwie różne insuliny, jedną, posiadającą przedłużony profil działania i jedną, posi-d-jącą szybki początek działania, w postaci rozpuszczalnych kompleksów heksamerycznych. Typowo kompleksy heksameryczne stabilizuje się dwoma lub więcej jonów cynkowych i trzema lub więcej cząsteczek związku fenolowego, jak fenol lub m-krezol albo ich miesz-nins, na heksamer. Kompleksami są mieszaniny heksamerów poszczególnych insulin i zmieszanych heksamerów, w których stosunek między dwoma różnymi insulinami wynosi od 1:5 do 5:1.
Kompozycję do podawania donosowego pewnych hormonów peptydowych można np. sporządzićjak opisano w europejskim opisie patentowym nr 272 097 (dlaNovo Nordisk A/S).
Kompozycje insulinowe według tego wynalazku można stosować w leczeniu cukrzycy. Optymalny poziom dawkowania dla każdego pacjenta zależeć będzie od rozmaitości czynników włączając- skuteczność stosowanej specyficznej pochodnej ludzkiej insuliny, wiek, ciężar ciała, aktywność fizyczna oraz dieta pacjenta, od możliwego połączenia z innymi lekami oraz od ciężkości przypadku cukrzycy. Zaleca się, aby dawka pochodnej ludzkiej insuliny według tego wynalazku była określana przez fachowców, dla każdego indywidualnego pacjenta, w sposób podobny jak dla znanych kompozycji insulinowych.
Tam gdzie jest to celowe, pochodnych ludzkiej insuliny według tego wynalazku można używać w mieszaninie z innymi rodzajami insuliny np. insuliną ludzką lub insuliną świńską albo analogami insuliny, z szybszym początkiem działania. Przykłady takich analogów insulin opisano np. w europejskich zgłoszeniach patentowych o numerach publikacji EP 214 826 (Novo Nordisk A/S), EP 375 437 (Novo Nordisk A/S) i EP 383 472 (Eli Lilly & Co.).
Niniejszy wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami.
183 698
Przykłady
PLAZMIDY I MATERIAŁ DNA
Wszystkie plazmidy ekspresji są typu cPOT. Plazmidy takie opisano w zgłoszeniu patentowym EP nr 171 142 i charakteryzują się one posiadaniem genu izomerazy triozofosforanowej (POT) Schizosaccharomyc.es pombe, w celu selekcji i stabilizacji plazmidu. Plazmid, zawierający gen POT, jest osiągalny ze złożonego do depozytu szczepuE.coli (ATCC 39685). Plazmidy zawierają ponadto promotor i terminator izomerazy triozofosforanowej S.cerevisiae (PPt i TTpiJ . Są one identyczne z pMT742 (M.Egel-Mitani i in., Gene 73 (1988( 113-120) (patrz fig. 1), z wyjątkiem regionu określonego przez miejsca restrykcji EcoRI-XbaI, obejmującego region kodujący dla MF alfapreprolidera/produktu. Fragment EcoRI-XbaI pMT742 sam koduje sekwencję alfa preprolidera czynnika dopasowania (Mating Factor) (MF) Saccharomyces cerevisiae, po czym prekursor insuliny MI3, który posiada mostek Ala-Ala-Lys, łączący B29 i Al (to jest BU^j-Ala-Ala-Lys-Af 1-21) (patrz fig. 2).
Syntetyczne fragmenty’ DNA zsyntetyzowano na automatycznym synte^zerze DNA (Applied Biosystems model 380A), przy użyciu chemii fosforoamidynów i dostępnych w handlu odczynników (S.L.Beaucage i M'.H.Caruthers,TetrahedronŁetters 22 (1981) 1859-1869).
Wszystkie inne metody i materiały stosowały powszechny stan wiedzy z tej dziedziny (patrz np. J.Sambrook, E.F.Frrtsch, i T.Maniatis, Molecular Cloning: A Łabo-ator- Manuał, Cold Spring Harbour Laboratory, Press, Nowy Jork, 1989).
CZĘŚĆ ANALITYCZNA
Masy cząsteczkowe sporządzonych prekursorów insuliny otrzymano drogą spektroskopii masowej (MS), albo za pomocą spektrometrii masowej z desorpcją plazmy (PDMS), przy użyciu urządzenia Bio-Ion 20 (Bio-IonNordic AB, Uppsala, Szwecja) lub spektrometrii masowej z chmurą elektronową (elect-osp-a-) (ESMS), przy użyciu API III BiomolecularMass Analyzer (Perkin Elmer Sciex Instruments, Thomhill, Kanada).
Lipofilność pochodnej insuliny w stosunku do ludzkiej insuliny, k’re„ zmierzono na kolumnie HPLC LiChrosorb RP18 (5 pm, 250x4 mm) przez elucję izokratyczną, w temperaturze 40°C, stosując jako eluenty mieszaniny A) 0,1M buforu fosforanu sodu, pH 7,3, zawierającego 10% acetonitrylu, oraz B) 50% acetonitrylu w wodzie. Elucję monitorowano poprzez następującą potem absorpcję UV eluatu przy 214 nm. Czas pusty, ta znaleziono wstrzykując 0,1 mM azotan sodu. Czas retencji dla ludzkiej insuliny, wyregulowano do co najmniej 2^, przez zróżnicowanie proporcji między roztworami A i B. k’re| określono jako (pochodnej- toMudzkej - te).
Badano prędkość zanikania jako miarę przedłużenia związków według wynalazku, oraz określono T50<% T50% jest czasem, w którym 50% znakowanego A14 TyE^I), zniknie z miejsca injekcji, mierzonym za pomocą zewnętrznego licznika γ (U.Ribel i in., The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in Man. w: M.Serrano-Rios i P.J.Lefebre (wyd):
Diabetes 1985; Proceedings of the 12th Congress ofthe International Diabetes Federation, Madryt, Hiszpania, 1985, (Excerpta Medica, Amsterdam, (1986) 891-96).
Przykład 1
Synteza prekursora insuliny Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-BCD^-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-AC 1-21), ze szczepu drożdży yKV 153, przy użyciu alfa preprolidera MF S.cerevisiae.
Zsyntet^zowano następujące ollgonukleot-d-:
#593 5 CCAAGTACA AAGCTTCAACCAAGTGGCAACCGCACA AGTG TT
GGTTAAyGAATyTTGTAGCCTTTGGTTCAGCTTCAGyTTyAGyTT CTTCT yTTTTATCCyAA^GAAACACC-3 ’ #94 5’-TAAATCTATAACTACAATGGGTyTCATA-y’ #3075 5 ©TGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTT
TCTTCTACACTCCTAAGTCTGTCGGTGCTAGATGTATTG-3’ ’-TTAATCTTAGTTTCTAGATTTTyTTGG-T’ #2371
183 698
Przeprowadzono następujące dwie łańcuchowe reakcje polimerazy, przy użyciu zestawu odczynników Gene Amp PCR (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT, USA), zgodnie z instrukcjami producenta (patrz fig.2).
PCR1A:
0,2 pl matrycy plazmidu pMT742 4,0 pl oligonukleotydu #593 (100 pmoli)
4,0 pl oligonukleotydu #94 (100 pmoli)
10.0 pl 10x buforu PCR
10.0 pl 2,5 mM dNTP 0,5 pl enzymu polimerazy Taq
71.3 pl wody .
PCR1B:
0,2 pl matrycy plazmidu pMT742
4.0 pl oligonukleotydu #3075 (100 pmoli)
4.0 pl oligonukleotydu #2371 (100 pmoli)
10.0 pl 10x buforu PCR
10.0 pl 2,5 mM dNTP
0,5 pl enzymu polimerazy Taq
71.3 pl wody
W obu przypadkach przeprowadzono dwa cykle w temperaturze 94°C przez 1 minutę, w temperaturze 45°C przez 1 minutę i w temperaturze 72°C przez 1 minutę, i następnie 11 cykli: w temperaturze 94°C przez 1 minutę, w temperaturze 55°C’przezl minutę, w temperaturze 72°C przez 1 minutę.
Załadowano 20 pl każdej mieszaniny PCR na 2% żelagarozowy i poddano elektroforezie, przy użyciu standardowych technik (Sambrook i in., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory press, 1989). Otrzymane fragmenty DNA (452 bp z PCR1A i 170 bp z PCR1B) odcięto od żelu agarozowego i izolowano za pomocą zestawu Gene Clean (Bio101 Inc., POBOX2284, La Jolla, CA, USA), zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone fragmenty DNA rozpuszczono w 100 pl wody.
Przeprowadzono następujące PCR:
PCR1C:
1.0 p l fragmentu DNA z PCR1A 1.0 pl fragmentu DNA z PCR1B10,0 pl 10x buforu PCR 10.0 p l 2,5 mM dNTP
0,5 pl enzymu polimerazy Taq
69,5 pl wody
Przeprowadzono dwa cykle w temperaturze 94°C przez 1 minutę, w temperaturze 45 °C przez 1 minutę i w temperaturze 72°C przez 1 minutę.
Następnie dodano 4 pl oligonukleotydu #94 (100 pmoli) i 4,0 pl oligonukleotydu #2371 (100 pmoli) i przeprowadzono 15 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę, w temperaturze 55°C przez 1 minutę, w temperaturze 72°C przez 1 minutę.
Mieszaninę PCR załadowano na 1% żel agarozowy i otrzymany fragment o 594 bp oczyszczono, przy użyciu zestawu Gene Clean jak opisano. Oczyszczony fragment PCR DNA rozpuszczono w 20 pl wody oraz buforu endonukleazy restrykcyjnej i pocięto za pomocą endonuklcazy restrykcyjnej EcoRl i Xbal (New England Biolabs, Inc. MA, USA). Otrzymany fragment restrykcyjny EcoK/Xbal o 550 bp uruchomiono na żelu agarozowymi oczyszczono za pomocą zestawu Gene Clean.
W dwóch oddzielnych procesach trawienia restrykcyjnego, plazmid pMT742 pocięto za pomocą i) endonukleaz restrykcyjnych Apal i Xbal oraz ii) endonukleaz restrykcyjnych Apal i EcoRl. W wyniku tych trawień wyizolowano fragment restrykcyjny Apal/Xbal o 8,6 kb oraz fragment restrykcyjny ApaMEcoRl o 2,1 kb.
183 698
Tiz- fragmenty (to jest fragment restrykcyjnyEcoRI/Xbal o 550 bp, z PCR1C i fragment restrykcyjny ApallXbal o 8,6 kb oraz fragment restrykcyjny ApaUXbal o 8,6 kb oraz fragment restrykcyjny Apal/EcoRI o 2,1 kb, z pMT742) poddano razem ligacji, przy użyciu ligazy DNA T4 w standardowych warunkach (Sambrook i in., Molecular cloning, Cold Spring Harbour Laborator- press, 1989) (patrz fig.1). Mirsz--i-ę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek E.coli (Ap1), po czym poddano selekcji pod względem oporności na ampicylinę. Plazmidy izolowano z otryyma-scr kolonii E.coli,, za pomocą standardowych technik miniprep-Iacyjnycr DNA (Sambrook i in., Molecular cloning, Cold Spring Harbour Laboratory press, 1989) i sprawdzono stosując odpowiednie e-do-u]kleazs restrykcyjne (to jest EcoRI, ApaI i XbaI). Wykazano przez —lizę sekwrncjonowa-ia DNA (stosując zestaw Seque—se z US. Biocremical Corp. zgodnie 2 zalece-iami producenta), że wsselekcjo-owj-s plazmid, oznaczony pKV153, zawiera prawidłową sekwencję, kodującą alfa preprolider MF/prekursor i-suII-s Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-29) -Ser -Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21).
pKV153 transformowano do szczepu MT663 S.cerevisiae i poddano selekcji pod względem wzrostu na glukozie, jak opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym o numerze publikacji 214 826.
Otrzymany szczep drożdży oznaczono yKV153 i zweryfikowano pod względem produkcji prekursora I—uIi-- Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Al--Glu-Pro-Lys-Al--Trr-Arg-B(1-29) -err-Asp-Asp-Al--Arg-A( 1-21) w pożywce hodowlanej, drogąHPLC i spektroskopii masowej.
Przykład 2
Synteza ludzkiej msulmy LysB30()(Ni'-tetradekanoilo) ThrB29.
2a. Synteza prekursora i-suII-s Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lss-Ala-Trr-Arg-B(1-28)-Trr-Lys-Ser-Asp-Asp-AIa-Arg-A(1-21) ze szczepu dK^^^żckży sKV153 przy użyciu alfa preprolidera S.cerevisiae,
Zsyntetyzowano następujące olinukleotydy:
#3881 5 '-TTCGTTCAłAGCTTTGTACTTGGiTTTGCGGTGAAAGAAGGTTTCT
TCTACAyTCCTAyyAAGTCTGAyGATGyTAGAGGTATTGTyG-3 ’ #2371 5 ’-TTAATCTTCGTTTCTAGAGCCTGCGGG33 ’
Przeprowadzono następującą łańcuchową reakcję poiime^^(PCR), przy użyciu zestawu odcysn-ików Gene Amp PCR jak opisano powyżej.
PCR2:
0,2 μΐ matrycy plazmidu pKV153 (z przykładu 1)
4.0 μ l oligonukleotydu #3881 (100pmoli)
4.0 μl oligonukleotydu #2371 (100 pmoli)
10,0 μΐ 10x buforu PCR
10.0 μ! 2,5 mM dNTP
0,5 μl enzymu polimer-zs Taq
71,3 μ! wody
Przeprowadzono dwa cykle w temperaturze 94°C przez 1 minutę, w temperaturze 45 °C przez 1 minutę i w temperaturze 72°C przez 1 minutę, a następnie 11 cykli w temperaturze 94° przez 1 minutę, w temperaturze 55°C przez 1 minutę, w temperaturze 72°C przez 1minutę.
Mirsz-ninę PCR załadowano na 2% żel -g-ϊΌzow- i otrzymany fragment o 174 bp oczyszczono, przy użyciu zestawu Gene Clean, jak opisano. Ocy-syczo-y fragment PCR DNA rozpuszczono w 20 gl wody i buforu end()nukle-z- restrykcyjnej i pocięto endo-ukleaz-mi restr-kc-jn-mi HindIII i XbaI Powstały fragment restrykcyjny Hlndlll/Xbal o 153 bp uruchomiono na żelu -g-IΌzow-m oraz izolowano i oczyszczono, z użyciem zestawu Gene Cle—.
W dwóch oddzielnych, rndonukle-y-mi restr-kc-jn-mi pMT742 pocięto r-do-uklr-yami Iestrykc-jn-mi Apal i Xbal, podczas gdy pKV153 (z przykładu 1) cięto endo-uklraz-ml rrstrykcyjn-mi Apal i EcoRI. Z tych trawień wyodrębniono fragment restrykcyjny Apal/XbaI o 8,6 kb, pochodzący od pMT742 i fragment restr-kc-jn- ApaI/EcoRI o 2,1 kb, pochodzący od pKV153.
183 698
Trzy fragmenty (to jest fragment restrykcyjny EcoRl/Xbal o 550 bp, pochodzący z PCR2 i fragment restrykcyjny Apal/Xbal o 8,6 kb, pochodzący od pMT748 oraz fragment restrykcyjny Apal/EcoR o 2,1 kb, pochodzący od pKV 153) poddano razem ligacji, przy użyciu ligazy DNA T4, jak opisano powyżej (patrz fig. 1). Mieszaninę do ligacji transformowano do kompetentnych komórek E.coli (Apr-), po czym poddano selekcji pod względem oporności na ampicylinę. Plazmidy izolowano od otrzymanych kolonii E.coli i sprawdzono pod względem odpowiednich endonukleaz restrykcyjnych (to jest Hindlll, Apali Xbal), jak opisano.
Wykazano, przez analizę sekwencjonowania DNA, że wybrany plazmid oznaczony pKV159 zawiera prawidłową sekwencję kodującą alfa preprolidera MF/prekursora insuliny Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21).
pKV159 transformowano do szczepu MT663 S.cerevisiae i poddano selekcji pod względem wzrostu na glukozie, jak opisano.
Otrzymany szczep drożdży oznaczono yKV159 i zweryfikowano pod względem wytwarzania prekursora insuliny Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (l-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) w pożywce hodowlanej, drogąHPLC i spektroskopii masowej'.
2b. Izolacje prekursora insuliny Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-^Thr-Arg-B( 1 -28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-?\la-Arg-A( 1-21).
Szczep yKV159 poddano fermentacji przez 72 godziny i zebrano pięć litrów bulionu. Komórki drożdży usunięto przez odwirowanie, wartość pH wyregulowano do 3,0, stosując kwas siarkowy i zatężono prekursor insuliny na kolumnie Pharmacia Streamline® 50 wypełnionej 300 ml wymiennika jonów Streamline® SP. Po przemyciu 25 mM buforu cytrynianowego, wartość pH 3,6, prekursor wymyto z użyciem 0,5 NH3 i odebrano frakcję od 300 do 600 ml. Wartość pH wyregulowano do 2,5 i oczyszczono prekursor przez RP-HPLC, z użyciem 15 μ, sferycznej krzemionki C18 o wielkości porów 10 nm, oraz 0,2 M Na2SO4,0,04 M H3PO4 jako buforu, i z użyciem gradientu od 23 do 33% acetonitrylu. Prekursor wymyto przy około 27-28% acetonitrylu. Pulę, zawierającą centralny, główny pik prekursora, odsolono przez filtrację żelową na Sephadex® G-50 F w 0,5 M kwasu octowego, prekursor izolowano przez liofilizację. Wydajność: 486 mg.
2c. Synteza insuliny Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21).
486 mg prekursora o pojedynczym łańcuchu jak opisano powyżej, rozpuszczono w 30 ml 0,05 M buforu glutaminianowego przy pH 9,0, i dodano 3 ml żeluunieczynnionej proteazy A.litycus (patrz PCT/DK94/00347, strona 45). Po delikatnym mieszaniu w ciągu 5 godzin w temperaturze 30°C, żel usunięto przez filtrację i podwójny łańcuch wydłużonej insuliny krystalizowano przez dodanie 10 ml etanolu, 845 mg diwodzianu cytrynianu trisodowego i 78 chlorku cynku. Po ustawieniu wartości pH do 6,1 i przechowaniu w temperaturze 4°C przez noc, kryształy zebrano przez odwirowanie, przemyto dwukrotnie izopropanolem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność: 450 mg.
2d. Synteza insuliny , ΝσΒ--’, N®830- tris(tetradekanoiio)Ala-Thr-Arg-B( 1-28) -Thr-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21).
450 mg wydłużonej insuliny o podwójnym łańcuchu, otrzymanej jak opisano powyżej, rozpuszczono w mieszaninie 3,15 ml DMSO i 0,69 ml 2 M diizopr^^^;yloetyloaminy w NMP. Roztwór ochłodzono do 15°C i dodano 0,3 M estru N-hydroksysukcynoimidowego kwasu tetradekanowego w DMSO/NMP (1:1 stosunek objętościowy). Po dwóch godzinach w temperaturze 15°C, reakcję zatrzymano, dodając 112 ml 0,01 M buforu glicynowego w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) i wartość pH ustawiono do 10,0. Triacylowanego związku pośredniego nie izolowano.
2e. Synteza ludzkiej insuliny Lys^0 (Metradekanoilo) ThrB29.
Do roztworu z poprzedniego etapu, dodano 5 ml żelu unieczynnionej trypsyny (patrz PCT/DK94/00347, strona 46). Po delikatnym mieszaniu w temperaturze 15°C przez 16 godzin, żel usunięto przez filtrację, wartość pH wyregulowano do 9,0 i roztwór załadowano na kolumnę
183 698
2,5x25 cm QAE-Sephadex® A-25. Przeprowadzono elucję izokratyczną przy prędkości 17,3 ml/godzinę, stosując 0,12 M bufor NH4C· l w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) o pH 9,0 ustawionym za pomocąNH3. Związek tytułowy wyłoniono z kolumny po 650 ml, a pulę od 650 do 754 ml zebrano. Ostatecznie, bufor zmieniono do 0,01 M NH4HCO3 przy użyciu filtracji żelowej na Sephadex® G-50 Fine, i produkt izolowano w stanie suchym przez liofilizację. Wydajność; 91 mg.
Masa cząsteczkowa związku tytułowego, znaleziona przez MS: 6020 ± 6, teoretyczna:
6018.
Masa cząsteczkowa łańcucha B, znaleziona przez MS: 3642 ± 5, teoretyczna: 3640.
M-s- cząsteczkowa fragmentu C-terminalnego trawionego przez proteazę V8, znaleziona przez MS: 1326 ±2, teoretyczna: 1326.
Względna lipofilność, k’rel = 113.
Okres połowicznego zaniku, T50%, po podskórnej injekcji u świń: 20,3 ±5,2 godziny (n=6).
Przykład 3
Synteza ludzkiej insuliny LssB2S(Nc-tet^^^«^l·^ik^^oilo) des(B29-B30).
3a. Synteza prekursora insuliny Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lss-Ser-Asp-Asp-Al--Arg-A(1-21) ze szczepu drożdży yJB173, przy użyciu alfa preprolidera MF S.cerevisiae.
Zsyntetyzowano następujące oligonukleotydy:
#627 5 ’ - CACTTGGTTGAAGGTTTGTACTTGGUTTGCGGTGAAAGAGGTTT
CTTCTACACTAAGTCTGACGATGCTAG-3 ’ #2371 5 ’-TTAATCTTCGTTTCIAGAGC^C^TGC^(C^(^-^3’
DNA, kodujący Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr--Arg-B(1-27)- LysSer-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) skonstruowano w ten sam sposób jak opisano w przykładzie 2, przez podstawienie oligonukleotydu #3881 oligonukleotydu #627.
Otrzymany plazmid oznaczono pJB173 i szczep drożdży wykazujący ekspresję Glu-Glu-Ala-Glu-Al--Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lss-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) oznaczono yJB173.
3b. Izolacja prekursora insuliny Glu-Glu-Al--Glu-Al--Glu-Ala-Glu-Pro-Lss-Ala^-^Ghr-Arg-BO^Yj-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A^©!).
Szczep yJB173 poddano fermentacji przez 72 godziny i zebrano 4,8 litrów bulionu. Komórki drożdży usunięto przez odwirowanie, a wartość pH ustawiono na 3,0, przy użyciu kwasu siarkowego. Konduktywność· wyniosła 0,78 kS/m. Prekursor insuliny zatężono, przy użyciu kolumny Ph-rm-ci- Streamline^® 50 wypełnionej 300 ml wymiennika jonów Streamline® SP. Po przemyciu 25 mM buforu cytrynianowego, wartość pH 3,6, prekursor wymyto z użyciem 0,5 NH3 i zebrano frakcję od 300 do 600 ml. Wolny amoniak odparowano po zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej, a pH otrzymanych 280 ml roztworu wyregulowano do 9,0 za pomocą kwasu chlorowodorowego.
3c. Synteza insuliny Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lss, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) .
Do 280 ml roztworu, zawierającego 118 mg' prekursora o pojedynczym łańcuchu, otrzymanego jak opisano powyżej, dodano 3 ml żelu unieczynnionej proteazy A.litycus (patrz PCT/DK94/00347, strona 45). Po delikatnym mieszaniu przez 24 godziny w temperaturze 30°C. Żel usunięto przez filtrację. Wartość pH wyregulowano do 3,5 i roztwór przesączono przez filtr Milipore®, o średnicy porów 0,45 pm.
Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu oczyszczono w 2 przebiegach, przez RP-HPLC, stosując kolumnę 2x20 cm wypełnioną 15 pm sfery cznąkrzcmionkąyΊ8 o wielkości porówlOnm oraz 0,2 MNa2SO4, 0,04MH3PO4, pH 3,5, jako buforu, i stosując gradient od 23 do 33% acetonitrylu przy prędkości 4 ml/minutę i temperaturze kolumny 40°C. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu wymyto przy około 30-31% acetonitrylu. Acetonitryl usunięto z połączonych puli 70 ml przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, i usunięto sole przez filtrację żelową, stosując kolumnę 5x47 cm Sephadex G-25 w 0,5 M kwasu octowego. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu izolowano przez liofilizację. Wydajność: 110 mg.
183 698
3d. Synteza insulinyN-A^N-B^N^-trisrietradekanoilo) Ala-Thr-Arg-B( 1-27)-Lys Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21). ... .
110 mg wydłużonej insuliny o podwójnym łańcuchu otrzymanej jak opisano powyżej, rozpuszczono w mieszaninie 0,84 ml DMSO i 0,275 ml 2M diizopropyloetyloaminy w NMP. Roztwór ochłodzono do temperatury 15°C i dodano 0,185 ml 0,3 M estru N-hydroksysukcynoimidowego kwasu tetradekanowego w DMSO/NMP (1:1 stosunek objętościowy). Po dwóch godzinach w temperaturze 15°C, reakcję zatrzymano, dodając 32,5 ml 0,01M buforu glicynowego w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) i wartość pH ustawiono do 10,0. Triacylowanego związku pośredniego nie izolowano.
3e. Synteza ludzkiej insuliny LysB28 (Nc-tetr^<^t^^^i^<^]ilo) des(B29-B30).
Do roztworu otrzymanego w poprzednim etapie, dodano 1,5 ml żelu unieczynnionej trypsyny (patrz PCT/.DK94/O0347, strona 46). Po delikatnym mieszaniu w temperaturze 15°C przez 18 godzin, żel usunięto przez filtrację, wartość pH wyregulowano do 9,0 i roztwór załadowano na kolumnę 1,5x21 cm QAE-Sephadex® A-25. Przeprowadzono elucję izokratyczną przy prędkości 10 ml/godzinę, stosując 0,12 M bufor N.H.,Cl w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) o pH 9,0 ustawionym za pomocąNH3. Związek tytułowy odebrano z kolumny po 250-390 ml, ze szczytem przy 330 ml. Ostatecznie, bufor zmieniono do 0,01 MNH4HCO3 przy użyciu filtracji żelowej na Sephadex® G-50 Fine, i produkt izolowano w stanie suchym przez liofilizację. Wydajność: 47 mg.
Masa cząsteczkowa związku tytułowego, znaleziona przez MS:5820 ± 2, teoretyczna:
5819.
Masa cząsteczkowa łańcucha B, znaleziona przez MS: 3444 ± 4, teoretyczna: 3442.
Masa cząsteczkowa fragmentu C-terminalnego trawionego przez proteazę V8, znaleziona przez MS: 1128 ± 2, teoretyczna: 1128.
Względna lipofilność, k’rel = 121.
Okres połowicznego zaniku, T50o/o, po podskórnej injekcjj uświń: 19,6±3,6 godziny (n=4).
Pr z y k ł a d 4
Synteza ludzkiej insuliny LysB2? (Ne,-tetr^(^t^l^^i^<oilo) des(B28-B30).
4a. Synteza prekursora insuliny Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys-Sen-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) ze szczepu drożdży yJB 174, przy użyciu alfa preprolidera MF S.cerevisiae.
Zsyntetyzowano następujące oligonukleotydy:
#628 5 ’-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGG
TTTCTTCTACAAGTCTGACGATGCTAG-3 ’ #2371 5 ’-TTAATCTTCGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3 ’
DNA, kodujący Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-26)-LysSer-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) skonstruowano w ten sam sposób jak opisano w przykładzie 2, przez podstawienie oligonukleotydu #3881 oligonukleotydu #628.
Otrzymany plazmid oznaczono pJB174 i szczep drożdży wykazujący ekspresję Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) oznaczono yJB174.
4b. Izolacja prekursora insuliny Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( 1 -26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21).
Szczep yJB174 poddano fermentacji przez 72 godziny i zebrano 3,5 litrów bulionu. Komórki drożdży usunięto przez odwirowanie, a wartość pH doprowadzono do 3,0, przy użyciu kwasu siarkowego i roztwór rozcieńczono wodą do 8 litrów, w celu zmniejszenia stężenia soli. Otrzymana konduktywność wyniosła 0,79 kS/m. Prekursor insuliny zatężono przy użyciu kolumny Pharmacia Streamline® 50 wypełnionej 300 ml wymiennika jonów Streamline® SP. Po przemyciu 25 mM buforu cytrynianowego, wartość pH 3,6, prekursor wymyto z użyciem 0,5 NH3 i zebrano frakcję od 300 do 600 ml. Wolny amoniak odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej, a pH otrzymanych 280 ml roztworu wyregulowano do 9,0 za pomocą kwasu chlorowodorowego.
183 698
4c. Synteza insuliny Ala-Thr-Arg-B(l-26)-Lss, Ser-A.sp-Asp-Ala-Arg-A(1-al).
Do 280 ml roztworu, prekursora o pojedynczym łańcuchu, otrzymanego jak opisano powyżej, dodano 3 ml żelu unieczynnionej proteazy A.lyticus (patrz PCT/DK94/O0347, strona 45). Po delikatnym mieszaniu przez 13 godzin w temperaturze 30°C, żel usunięto przez filtrację. Wartość pH wyregulowano do 3,5 i roztwór przesączono przez filtr Milipore®, o średnicy porów 0,45 pm. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu oczyszczono w 4 przebiegach, przez RP-HPLC, stosując kolumnę 2x20 cm wypełnioną 15 pm sferyczną krzemionką Cl 8 o wielkości porów 10 nm oraz 0,2 M Na2SO4,0,04 M H3PO4, pH 2,5, jako buforu, i stosując gradient od 24 do 33% acetonitrylu. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu wymyto przy około 30-31 % acetonitrylu. Acetonitryl usunięto z połączonych puli przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, i usunięto sole przez filtrację żelową, stosując kolumnę 5x47 cm Sephadex G-25 w 0,5 M kwasu octowego. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu izolowano przez liofilizację. Wydajność: 69 mg.
4d. Synteza insuliny N“A'5, N“8'3, Nε2a7-tris(tetradekanoilo) Ala-Thr-Arg-B( 1-26)Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21).
mg wydłużonej insuliny o podwójnym łańcuchu otrzymanej jak opisano w 4e, rozpuszczono w mieszaninie 0,44 ml DMSO i 0,15 ml 2M diizoprop^loetyloaminy w NMP. Roztwór ochłodzono do temperatury 15°C i dodano 0,096 ml 0,3 M estru N-hydroksysukcynoimidowego kwasu tetradekanowego w DMSO/NMP (1:1 stosunek objętościowy). Po 2 godzinach w temperaturze 15°C, re-kcję zatrzymano, dodając 17 ml 0,01 M buforu glicynowego w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) i wartość pH ustawiono do 10,0. Triacylowanego związku pośredniego nie izolowano.
4e. Synteza ludzkiej insuliny Lys82? (NMetradekanoilo) des(B28-B30).
Do roztworu otrzymanego w poprzednim etapie, dodano 1 ml żelu unieczynnionej trypsyny (patrz PCT/DK94/00347, strona 46). Po delikatnym mieszaniu w temperaturze 15°C przez 26 godzin, żel usunięto przez filtrację, wartość pH wyregulowano do 9,0 i roztwór załadowano na kolumnę 1,5x25,5 cm QAE-Sephadex® A-25. Przeprowadzono elucję izokratycznąprzy prędkości 17,3 ml/godzinę, stosując 0,12 M bufor NH4O w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) o pH 9,0 ustawionym za pomocąNH.3. Związek tytułowy wyłoniono z kolumny po 360 ml, a pulę od 272 do 455 ml zebrano. Ostatecznie, bufor zmieniono do 0,01 M NH4HCO3 przy użyciu filtracji żelowej na Sephadex® G-50 Fine, i produkt izolowano w stanie suchym przez liofilizację. Wydajność: 38 mg. Masa cząsteczkowa związku tytułowego, znaleziona przez MS: 5720 ± 6, teoretyczna: 5718.
Masa cząsteczkowa łańcucha B, znaleziona przez MS: 3342 ± 4, teoretyczna: 3340.
Masa cząsteczkowa fragmentu C-terminalnego trawionego przez proteazę V8, znaleziona przez MS: 1027 ±2, teoretyczna: 1027.
Względna lipofilność, k’re = 151.
Okres połowicznego zaniku, T50% po podskórnej injekcji u świń: 15,2 ± 2,2 godziny (n=5).
Przykład 5
Synteza ludzkiej insuliny Lss826 (NT-tetradekanoilo) des(B27-B30).
5a. Synteza prekursora insuliny Glu-Ghl-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-aro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1 -25)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) ze szczepu drożdży yJB175, przy użyciu alfa preprolidera MF S.cerevisiae. Zsyntetyzowano następujące oligonukleotydy:
#629 5 ’-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGG
TTT CTTCAAAGTCTGACGATGCTAG-3’ #2371 5--TTAATCTTCGTTTCTAGAGCCTGCGCGM ’
DNA, kodujący Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lss-Ala-Thr-Ag-B(1 -25--Lys -Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) skonstruowano w ten sam sposób jak opisano w przykładzie 2, przez podstawienie oligonukleotydu #3881 oligonukleotydu #629.
Otrzymany plazmid oznaczono pJB175 i szczep drożdży wykazujący ekspresję Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-25)-Lss-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg'^/'!^) oznaczono yKV175.
183 698
5b. Izolacja prekursora insuliny Gjlu-Gj]u-Ala-Gjlu-A.la-Glu-Ala-Gilu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( 1 -25)-Lys-Ser-Asp-Asp-Aki-Arg-A(1 -21).
Szczep yJB 175 poddano fermentacji przez 72 godziny i zebrano 3,7 litra bulionu. Komórki drożdży usunięto przez odwirowanie, a wartość pH ustawiono na 3,0, przy użyciu kwasu siarkowego i roztwór rozcieńczono wodą do 8,5 litra, w celu zmniejszenia stężenia soli. Otrzymana konduktywność wyniosła 0,77 kS/m. Prekursor insuliny zatężono przy użyciu kolumny Pharmacia Streamline® 50 wypełnionej 300 ml wymiennika jonów Streamline® SP. Po przemyciu 25 mM buforu cytrynianowego, wartość pH 3,6, prekursor wymyto z użyciem 0,5 NH3 i zebrano frakcję od 300 do 600 ml. Wolny amoniak odparowano po zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej, a pH otrzymanych 270 ml roztworu wyregulowano do 9,0 za pomocą kwasu chlorowodorowego.
5c. Synteza insuliny Ala)Thr-Arg-B(1-25)-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg--4(1-21).
Do 270 ml roztworu, prekursora o pojedynczym łańcuchu, otrzymanego jak opisano powyżej, dodano 3 ml żelu unieczynnionej proteazy A.lyticus (patrz PCT/DK94/00347, strona 45). Po delikatnym mieszaniu przez 23 godziny w temperaturze 30°C, żel usunięto przez filtrację. Wartość pH wyregulowano do 2,5 i roztwór przesączono przez filtr Milipore®, o średnicy porów 0,45 pm. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu oczyszczono w 4 przebiegach, przez RP-HPLC, stosując kolumnę 2x20 cm wypełnioną 15 pm sferyczną krzemionką Cl 8 o wielkości porów 10 nm oraz 0,2 M Na2SO4,0,04 M H3PO4, pH 3,5, jako buforu, i stosując gradient od 24 do 33% acetonitrylu. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu wymyto przy około 29)31%acetonitrslu. Acetonitryl usunięto z połączonych puli przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, i sole usunięto przez filtrację żelową, stosując kolumnę 5x47 cmSephadex G-25 w 0,5 M kwasu octowego. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu izolowano przez liofilizację. Wydajność: 81 mg.
5d. Synteza insuliny nOA'5, N0®^, Ni’B26-tris(tetradekanoilo) Ala-Thr-Arg-B( 1-25)
-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21).
mg wydłużonej insuliny o podwójnym łańcuchu rozpuszczono w mieszaninie 0,56 ml DMSO i 0,19 ml 2M dlizopropylortsloamins w NMP. Roztwór ochłodzono do temperatury 15°C i dodano 0,124 ml 0,3 M estru N-hydroksysukcynoimidowego kwasu tetradekanowego w DMSO/NMP (1:1 stosunek objętościowy). Po 2 godzinach w temperaturze 15°C, reakcję zatrzymano, dodając 21,8 ml 0,01 M buforu glicynowego w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) i wartość pH ustawiono do 10,0. Έrii^c^c^lί^'wan<rgo związku pośredniego nie izolowano.
5e. Synteza ludzkiej insuliny LysB26 (N£tetr^^<^^.k^mo^lo) drs(B27)B30).
Do roztworu otrzymanego w poprzednim etapie, dodano 1 ml żelu unieczynnionej try^syny (patrz PCT/DK94/00347, strona 46). Po delikatnym mieszaniu w temperaturze 15°C przez 23 godziny, żel usunięto przez filtrację, wartość pH wyregulowano do 9,0 i roztwór załadowano na kolumnę 1,5x25,5 cm QAE-Sephadex® A-25. Przeprowadzono elucjęizokratycznąprzy prędkości 19,3 ml/godzinę, stosując 0,12 M bufor N^Cl w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) o pH 9,0 ustawionym za pomocą amoniaku. Związek tytułowy wyłoniono z kolumny po 320 ml, a frakcję od 320 do 535 ml zebrano. Ostatecznie, bufor zmieniono do 0,01 MNH4HCO3 przy użyciu filtracji żelowej na Srphadrx®G)50 Fine, i produkt izolowano w stanie suchym przez liofilizację. Wydajność: 25 mg.
Masa cząsteczkowa związku tytułowego, znaleziona przez MS: 5555 ± 6, teoretyczna:
5555.
Masa cząsteczkowa łańcucha B, znaleziona przez MS: 3179 ± 4, teoretyczna: 3178.
Masa cząsteczkowa fragmentu C-terminalnego trawionego przez proteazę V8, znaleziona przez MS: 864 ± 1, teoretyczna: 863,5.
Względna lipofilność, k’rei = 151.
Okres połowicznego zaniku, T50o/o, po podskórnej injekcji u świń: 14,4 ± 1,5 godziny (n=5).
183 698
Przykład 6
Synteza ludzkiej insuliny (N\1-karboksytniIecylo)-2-anndosukcynylo) - Phe“B' des(B30).
Ludzką insulinę Al,B29-diBoc-des(B30) (200 mg, 0,033 mmola) rozpuszczono w DMF (15 ml) i dodano trietyloaminę (20 gl). Dodano ester N-hydroksysukcynoimidowy kwasu N(l-karboksymetoksytridecylo)-2-amieosukcynowcgo (16 mg, 0,033 minola) i po 4 godzinach w temperaturze pokojowej mieszaninę odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Grupy Boc usunięto przez potraktowanie kwasem trifiuorooctowym (5 ml), przez 30 minut, w temperaturze pokojowej. Kwas trifiuorooctowy usunięto przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Resztę rozpuszczono w 0,1 N NaOH (20 ml), przy temperaturze 0°C. Zmydlenia estru metylowego dokonano po 1godzinie, w temperaturze 0°C. Wartość pH mieszaniny reakcyjnej wyregulowano do 5,0 przez dodanie kwasu octowego i etanolu (5 ml). Wytworzony precypitat izolowano przez odwirowanie.
Związek tytułowy oczyszczono z precypitatu drogą chromatografii jonowymiennej, przy użyciu kolumny 2,5x27 cm QAE-S^e^p^^£^c^e^^® A25.
Precypitat rozpuszczono w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) (25 ml), przez ustawienie wartości pH do 9,8, z użyciem amoniaku, i roztwór dostarczono do kolumny. Przeprowadzono elucj ę w buforach NH3/NH4C l, przy pH 9,0, przy użyciu gradientu liniowego od 0,12Co (018MNH4Cl w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) i całości 1000 ml eluenta. Absorbancję UV eluatu monitorowano przy 280 nm i frakcje o 10 ml zebrano.
Związek tytułowy wyłoniono z kolumny we frakcjach 62 do 72. Związek tytułowy wytrącono przez rozcieńczenie puli 2 objętościami wody i ustawieniu wartości pHdo 5,0. Po odwirowaniu, precypitat przemyto wodą i po drogim wirowaniu produkt wysuszono pod zmniej szonym ciśnieniem. Wydajność: 10 mg.
Masa cząsteczkowa, znaleziona drogą PDMS: 6032, teoretyczna: 6032.
Względna lipofilność, k’rel = 140.
Okres połowicznego zaniku, T50%, po podskórnej injekcji u świń: 8,65 ± 1,65 godziny (n=5).
Przykład 7
Ludzka insulina PheαB1-tetradekanoiio-glutamyto-glicylowa Ccs(B30).
Ludzką insulinę A1, B29-diBoc-des(B30) (200 mg, 0,033 mmola) rozpuszczono w DMF (15 ml) i dodano trietyloaminę (100 gl). Dodano ester mirystoilo-Glu (γ-OtBu) -Gly N-hydroksysukcynoimieowy (95 mg, 0,17 mmola) i po 4 godzinach w temperaturze pokoj owej mieszaninę odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Grupy Boc i tBu usunięto przez potraktowanie kwasem trifiuorooctowym (5 ml), przez 30minut, w temperaturze pokojowej. Kwas trifiuorooctowy usunięto przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem.
Związek tytułowy oczyszczono z precypitatu drogą, RP-HPLC, przy użyciu kolumny z krzemionkąC18 i elucję gradientem liniowym od 16 do 64% acetonitrylu w 50 mM buforu Tris/fosforan, zawierającego 75 mM (NH4)2SO4 przy pH 7.
Związek tytułowy wyłoniono z kolumny przy około 50% acetonitrylu. Acetonitryl odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano etanol do 20% (stosunek objętościowy). Ustawienie wartości pH do 5,0 spowodowało wytrącenie produktu. Po odwirowaniu precypitat rozpuszczono w 10 mM NH4HCO3, odsolono przez filtrację żelową, przy użyciu Sephadex G-25 i liofilizowano. Wydajność: 97 mg. Masa cząsteczkowa, znaleziona drogą, PDMS: 6105, teoretyczna: 6104.
Przykład 8
Synteza ludzkiej insuliny GlyB28, ThrB29, LysB30 (N^tetr^<^^i^^^oilo).
8a. Synteza prekursora insuliny Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-A-g-B(1-27)-Gdy'-Th--Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-A-g-A(1-21) ze szczepu drożdży yKV 195, przy użyciu alfa preprolidera MF S.cerevisiae.
Zsyntetyzowano następujące oligonukleotydy:
183 698 #4790 5 ’-TTCGT7CGGGCTTTGTGCTTGCTTTCyGCTGGGGCAGCTTT
CTTyTAyGCTGGTAACAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTCTyG-3 ’ #2371 5’-TTTGTyTTCCTTTCTAGGGCCTGCGGG-3 ’
DNA, kodujący Clu-Clu-Ala-Glu-Gla-Glu-Ala-Clu-Pro-Lys-Ala-Th---Grg-B( 1 -27)Gl--Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Λla-Grg-A(1-71) skonstruowano w ten sam sposób, jak opisano w przykładzie 2, przez podstawienie oligonukleotydu #3881 oligonukleotydu #4790.
Otrzymany plazmid oznaczono pKV195 i szczep drożdży w-kazuJąc- ekspresję Glu-Glu-Ala-Glu-Gla-Clu-Ala-Clu-P-o-Lys-Ala-Thr-Arg-B(ł-27)-Gl--Thr-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) oznaczono yKV195.
8b. Izolacja prekursora insuliny Glu-Clu-Ala-Glu-Ala-Clu-Gla-Glu-P-o-Ł-s-Tla-Thr-Arg-B( 1 -77)-Cl--Th--Ł-s-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21).
Szczep yKV 195 poddano fermentacji przez 72 godziny i zebrano 4,4 litra bulionu. Komórki drożdży usunięto przez odwirowanie, a wartość pH doprowadzono do 3,0, przy użyciu kwasu siarkowego i dodano 3,6 litra wody, w celu rozcieńczenia soli do ot-z-manla konduktywności 0,77 kS/m. Prekursor insuliny zatężono przy użyciu kolumny Pharmacia Streamline® 50 wypełnionej 300 ml wymiennika jonów Streamline® SP. Po przemyciu 3 litrami 25 mM buforu c-trsnianowego, wartość pH 3,6, prekursor wymyto z użyciem 0,5 amoniaku i zebrano frakcję od 300 do 600 ml. Wolny amoniak odparowano po zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze pokojowej, a pH otrzymanych 280 ml roztworu wyregulowano do 9,0 za pomocą kwasu chlorowodorowego.
8c. Synteza insuliny Ala-Thr-Arg-B( 1 -77)-Gl--Thr-Ł-s, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-^ 1-21).
Do 280 ml roztworu, zawierającego 300 mg prekursora o pojedynczym łańcuchu, otrzymanego jak opisano powyżej, dodano 3 ml żelu unieczynnionej proteazy G.l-ticus (patrz PCT/DK94/00347, strona 45). Po delikatnym mieszaniu przez 17 godzin w temperaturze 30°C, żel usunięto przez filtrację. Wartość pH wyregulowano do 3,5 i roztwór przesączono przez filtr Milipore®, o średnicy porów 0,45 pm. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu oczyszczono w 3 przebiegach, przez RP-HPLC, stosując kolumnę 2x20 cm wypełnioną 10 pm sferyczną krzeemonką.C18o wielkości porów 12nm oraz 0,2 MNa2SO4, 0,04, M^PO^pH 3,5, jako buforu, i stosując gradient od 23 do 33% acetonitrylu, przy prędkości 4 ml/minutę i temperaturze kolumny 40°C. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu wymyto przy około 30-31% acetonitrylu. Ace^tonitryl usunięto z połączonych puli o 70 ml przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, i sole usunięto przez filtrację żelową stosując kolumnę 5x47 cm SephadexC75 łańcuchu izoiowano przez liofilizację. Wydajność: 176 mg.
8d. Synteza insuliny NaA-5, NaaB-3, NeB30-tris(tetradekanoilo) Gla-Th--Arg-B(ł-27) -Gl--Thr-L-s, Ser-Asp-Gsp-Gla-Gr'g-G( 1-21).
176 mg wydłużonej insuliny o podwójnym łańcuchu rozpuszczono w mieszaninie 1,4 ml DMSO i 0,275 ml 2M dlizop-op-loet-loamin- w NMP. Roztwór ochłodzono do temperatury 15°C i dodano 0,963 ml 0,3 M estru r-h-droksysukcyn.oimidowegokwasutetradekanowegow DMSO/'NMP(1:1 stosunek objętościowy). Po 20 godzinach w temperaturze 15°C, reakcję zatrzymano, dodając 50 ml 0,01 M buforu glicynowego w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) i wartość pH ustawiono do 10,0. Triacylowanego związku pośredniego nie izolowano.
8e. Synteza ludzkiej insuliny Cl-B)8, ThrB)9, Lys®30 (Νε-tetradekanoilo).
Do roztworu otiazymanego w poprzednim etapie, dodano 2,5 ml żelu unieczynnionej trypsyny (patrz PCT/DK94/00347, strona 46). Po delikatnym mieszaniu w temperaturze 15°C przez 5 godzin, żel usunięto przez filtrację, wartość pH wyregulowano do 9,0 i roztwór nałożono na kolumnę 1,5x26,5 cm QAE.-Sephadex® A-25. Przeprowadzono elucję izokratycznąprz- prędkości
9,3 ml/godzinę, stosując 0,12 M bufor NH4C1 w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) o pH 9,0 ustawionym za pomocą amoniaku. Związek tytułowy wyłoniono z kolumny po 325-455 ml, z pikiem przy 380 ml. Ostatecznie, bufor zmieniono do 0,01 M NH4HCO3 przy użyciu filtracji żelowej na Sephadex® G-50 Fine, i produkt izolowano w stanie suchym przez liofilizację. Wydajność: 50 mg.
183 698
Masa cząsteczkowa związku tytułowego, z-leziona przez MS: 5979 ± 6, teoretyczna:
5977.
Masa cząsteczkowa łańcucha B, znaleziona przez MS: 3600 ± 4, teoretyczna: 3600.
Masa cząsteczkowa fragmentu C-termi—lnego trawionego przez proteazę V8, z-leziona przez MS: 1286 ±2, teoretyczna: 1286.
Względna lipofilność, k’rel = 103.
Okres połowicznego zaniku, T50<% po podskórnej injekcji u świń: 17 ± 2 godziny (n=4).
Przykład 9
Sy-try- ludzkiej insuli-- GlyB28. LysB29 (NMetradekanoilo).
9a. es-teya prekursora i-suli-y Glu-Glu-Al--Glu-Al--Glu-Ala-Glu-Pro-Lss-Al--TrI-Arg-B (1 -27)-Gly-L-s-eer-Asp-Asp-Al--Arg-A( 1-21) ze szczepu drożdży yKV 196, przy użyciu alfa preprolidera MF S.cererisiae.
Z syntetyzowano następujące oligonukleotydy:
#47 5 ’-TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGT
TT CTTCTAyCGGTAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATΓGTyG-3 ’ #2371 5 ’-TTAATCTTCGTTTCTAGAGCCTGCGGG33 ’
DNA, kodujący Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Al--Glu-Pro-Lys-Al--Thr-Arg-B( 1-27) -Gly-Lys-eer-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) skonstruowano w ten sam sposób jak opisano w przykładzie 2, przez podstawienie oligonukleotydu #3881 oligo-ukleot-du #4791.
Otrzymany plazmid oznaczono pJB196 i szczep drożdży wykazujący ekspresję Glu-GluAl--CJlu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Al--Trr-Arg-B(1-27)-Gl\--L-s-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg- A( 1-21) omaczozo yK V196.
9b. Izolacja prekursora ϊ-suIIo- Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Al--Trr-Arg-B(1-27)-Gly-Trr-Lys-eer-Asp-Asp-Ala-Arg-A0l-21).
Szczep sKV196 poddano fermentacji przez 72 godziny i zebrano 3,6 litra bulionu. Komórki drożdży usunięto przez odwirowj-ir. a wartość pH ustawiono na 3,0, przy użyciu kwasu siarkowego i dodano 3,4 litra wody, w celu rozcieńczenia soli do otrzym-oiako-duktywności 0,77 kS/m.
Prekursor insuliny zatężono do 300 ml za pomocąprocedur^' opisanej w przykładzie 8b.
9c. Sy-tey- insuliny Al--Thr-Arg-B(1-27)-Gl--Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21).
Do 300 ml roztworu o pH 9,0, zawierającego 390 mg prekursora o pojedyo.czym łańcuchu, otryymaorgo jak opisano powyżej, dodano 5 ml żelu uoieczynoiooej proteay- A.lyticus (patrz PyT/DK94/00347, strona 45). Po delikatnym miesz—iu przez 40 godzin w temperaturze 30°C, żel usunięto przez filtrację. Wartość pH wyregulowano do 3,5 i roztwór przesączono przez filtr Mil.ip>ol^ti®. o średnicy porów 0,45 pm. Wydłużoną insulinę o podwójnym łańcuchu oczyszczono w 3 przebiegach, przez RP-HPLC, stosując kolumnę 2x20 cm w-peł-iona 10 jlm. sferyczną krzemionkąC 18 o wielkości porów 12 nm oraz 0,2 M N-2SO4, 0,04 M H3PO4, pH 3,5, jako buforu, i stosując gradient od 23 do 33% -ceto-itrylu, przy prędkości 4 ml/minutę i temperaturze kolumny 40°C. Wydłużoną, insulinę o podwójnym łańcuchu wymyto przy około 29% -cetonitrylu. Acrtooitryl usunięto z połacyo-ycr puli o objętości 60 ml przez odparowanie pod zm-lejsyoosm ciśnieniem, i sole usunięto przez filtrację żelową, stosując kolumnę 5x47 cm eephadex G-25 w 0,5 M kwasu octowego. Wydłużoną, insulinę o podwójnym łańcuchu izolowano przez liofilizację. Wydajność: 154 mg.
9d. es-teza insuliny N”A5, N”3 3, NEB29-tris0trtradekanoilo) Ala-Thr-Arg-B(1-27) -Gly-Lys err-Asp-Asp-Al--Arg-A(1-21).
154 mg wydłużonej insuliny o podwójnym łańcuchu rozpuszczono w miesz—inie 1,05 ml DMSOi 0,329 ml 2M diiyopropyloetyloamin- w NMP. Roztwór ochłodzono do temperatury 15°C i dodano 0,22 ml 0,3 M estru N-r-droksysukc-ooimidowego kwasu tetradekanowego w DMSO/NMP (1:1 stosunek objętościowy). Po 2 godzinach w temperaturze 15^, reakcję y-trzym--o. dodając 40 ml 0,01 M buforu glicynowego w miesyaoioie et—ol/woda (60:40, stosunek objętościowy) i wartość pH ustawiono do 10,0. Triacyiowanego związku pośredniego nie izolowano.
183 698
9e. Synteza ludzkiej insuliny GlyB28, Lys1’29 (NMetradekanoilo).
Do roztworu otrzymanego w poprzednim etapie, dodano 1,5 ml żelu unieczynnionej trypsyny (patrz PCT/DK94/00347, strona 46). Po delikatnym mieszaniu w temperaturze 15°C przez 21 godzin, żel usunięto przez filtrację, wartość pH wyregulowano do 9,0 i produkt w 43 ml roztworu nałożono na kolumnę 1,5x26,0 cm QAE-Sephadex® A-25. Przeprowadzono elucję izokratyczną przy prędkości 9,5 ml/godzinę, stosując 0,12 M bufor NH^Cl w mieszaninie etanol/woda (60:40, stosunek objętościowy) o pH 9,0 ustawionym za pomocą amoniaku. Związek tytułowy wyłoniono z kolumny po 190-247 ml, z pikiem przy 237 ml. Ostatecznie, bufor zmieniono do 0,01 MNH4HCO3 przy użyciu filtracji żelowej naSephadex®G-50 Fine, i produkt izolowano w stanie suchym przez liofilizację. Wydajność: 67 mg.
Masa cząsteczkowa związku tytułowego, znaleziona przez MS: 5877 ± 2, teoretyczna:
5876.
Masa cząsteczkowa łańcucha B, znaleziona przez MS: 3499 ± 3, teoretyczna: 3499. Masa cząsteczkowa fragmentu C-terminalnego trawionego przez proteazę V8, znaleziona przez MS: 1184 ± 2, teoretyczna: 1185.
Względna lipofilność, k’rel = 118,5.
Okres połowicznego zaniku, T50o%, po podskórnej iniekcji u świń: 25 ± 9 godziny (n=4) .
183 698
WYKAZ SEKWENCJI
1) INFORMACJE OGÓLNE:
1) ZGŁASZAJĄCY:
A) NAZWA: Novo Nordisk A/S
B) ULICA: Novo Alle
c) MIASTO: DK-2880 Bagsvaerd E) KRAJ: Dania
G) TELEFON: +45 44448888
H) TELEFAX: +45 44490555
I) TELEX: 37173 ii) TYTUŁ WYNALAZKU: INSULINA ACYLOWANA iii) LICZBA SEKWENCJI: 2 iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:
A) ADRES: Novo Nordisk A/S Korporacja Patentowa
B) ULICA: Novo Alle
C) MIASTO: DK-2880 Bagsvaerd E) KRAJ: Dania
v) POSTAĆ ODCZYTYWALNA PRZEZ KOMPUTER:
A) TYP STEROWANIA: Stacja dyskietek
B) KOMPUTER: Zgodny z IBM PC
C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS
D) OPROGRAMOWANIE: Patenfin RAet^aass; #1,0, Wersja #1,25 vi) AKTUALNE DANE ZGŁOSZENIOWE:
A) NUMER ZGŁOSZENIA:
B) DATA WYPEŁNIENIA:
C) KLASYFIKACJA:
vii) POPRZEDNIE DANE ZGŁOSZENIOWE:
A) NUMER ZGŁOSZENIA: DK 0276/95
B) DATA WYPEŁNIENIA: 17-MAR-1995 viii) INFORMACJE O PEŁNOMOCNIKU/POŚREDNIKU A) NAZWISKO: Dan Jorgensen i in..
C) NUMER ŚWIADECTWA/POZWOLENIA: 4341-WO, DJ ix) INFORMACJE TELEKOACJNITACYJNE:
A) TELEFON: +45 44448888
B) TELEFAX: +45 44490555
2) INFORMACJE O SEQ ID nr 1
1) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów b) TYP: aminokwas
D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: białko xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin 15 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 20
2) INFORMACJE O SEQ ID nr 2:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 30 aminokwasów b) TYP: aminokwas
D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
183 698 xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 2:
Xaa Xaa Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
10 15
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30
183 698 »94 1
5' -TAAATCTATAACTACAAAAAACACATA-3' EcoRI 5' -CTTAAATCTATAACTACAAAAAACACATACAGGAATTCCATTCAAGAATAGTTCAAACAA
907 ---+---------+---------+---------+---------+---------+------ 966
3' -GAATTTAGATATTGATGTTTTTTGTGTATGTCCTTAAGGTAAGTTCTTATCAAGTTTGTT
GAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAATATAAACGATTAAAAGAATGAGATTTCCT 967 ----1-----------1— --------i-----------v----------1-----------i-------1026
CTTCTAATGTTTGATAGTTAAAGTATGTGTTATATTTGCTAATTTTCTTACTCTAAAGGA
MetArgPhePro 4
TCTATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCTGCTTCCTCCGCTTTAGCTGCTCCAGTCAACACT
1027 ----1-----------i-----------1-----------(----·-------t----------4-------1086
AGATAAAAATGACGACAAAATAAGCGACGAAGGAGGCGAAATCGACGAGGTCAGTTGTGA
SerIlePheThrAlaValLeuPheAlaAlaSerSerAlaLeuAlaAlaProValAsnThr 24
ACCACTGAAGATGAAACGGCTCAAATTCCAGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCTGATTTA
1087 ----i-----------i-----------1-----------1----·-------:-----------i-------114 6
TGGTGACTTCTACTTTGCCGAGTTTAAGGTCGACTTCGACAGTAGCCAATGAGACTAAAT
ThrThrGluAspGluThrAlaGlnIleProAlaGluAlaValIleGlyTyrSerAspLeu 44
GAAGGTGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACTCCACCAATAACGGTTTATTG
1147----1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------t-------1206
CTTCCACTAAAGCTACAACGACAAAACGGTAAAAGGTTGAGGTGGTTATTGCCAAATAAC
GluGlyAspPheAspValAlaValLeuProPheSerAsnSerThrAsnAsnGlyLeuLeu 64
TTTATCAATACTACTATTGCCTCCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGTGTTTCTTTGGATAAA
1207 ----i----------i-----------1----------4-----------i----------4-------1266
AAATAGTTATGATGATAACGGAGGTAACGACGATTTCTTCTTCCACAAAGAAACCTATTT
PheIleAsnThrThrIleAlaSerIleAlaAlaLysGluGluGlyValSerLeuAspLys 84 3'-CCACAAAGAAACCTATTT
1267
Hmdlll
5’-TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGC AGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGC
---(------------1-----------1------------1-----------1-----------|----—-TCTAAGCAATTGGTTGTGAACACGCCAAGGGTGAACCAACTTCGAAACATGAACCAAACG ArgPheValAsnGlnExsLeuCysGlySerHisŁeuValGluAlaLeuTyrLeuValCys TCT GCAATTGGTTGTGAACACGCCAAGGGTGAACCAACTTCGAAACATGAACC-5'
A #593 I
ATGTAGCCTTTGGT
T
1326
104
TGACGATGCT C A #3075 1 T G
GGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCTAAG AGGTATTG-3’
GGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTCGAACAATGCTGT
----1-----------1--------.---{------—---.η-----------1-----------1------CCACTTTCTCCAAAGAAGATGTGAGGATTCCGACGATTCCCATAACAGCTTGTTACGACA
GlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLysAlaAlaLysGlyIleValGluGlnCysCys
CTTCGACTTCGACTTCGAC
1327
1386
124
ACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAATTGGAAAACTACTGCAACTAGA.CGCAGCCCGCAGGC
1387 ----i-----------1------—----i------------1-----------1-------———------1446
TGGAGGTAGACGAGGAACATGGTTAACCTTTTGATGACGTTGATCTGCGTCGGGCGTCCG
ThrSerlleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsn*** 3'-GGGCGTCCG 138
Fig - 2<a.
Xbal
TCTAGAAACTAAGATTAATATAATTATATAAAAATATTATCTTCTTTTCTTTAT-3'
1447 ----i-----------1-----------1------------1-----------1-----------1500
AGATCTTTGATTCTAATTATATTAATATATTTTTATAATAGAAGAAAAGAAATA-S' AGATCTTTGATTCTAATT-5' »2371 I
Fig. 2t>
183 698
EcoRI (940) PREKURSOR Hindlll (1308) Xbal (1448)
Apal (10088)
2μ ORIGIN
PCR 1
EcoRI/Xbal
HindIII/XbaI
Fig. X
EcoRI (940) ' PREKURSOR Hindlll (1347) bal (1493)
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.
Claims (27)
- Zastrzeżenia patentowe1. Pochodna insuliny, posiadająca następującą sekwencję:Łańcuch A S _ SI 7 |Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 | 8 9 10 11 12SIŁańcuch B SIXaa-Xaa-Xaa-GGn--is-Leu-Ccs-GGyySer-His-Leu-Val-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Łańcuch A (ciąg dalszy) 20 Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (SEQ ID Nr:l)23 24 15 16 17 18 19 1 21 _SŁańcuch B(ciąg dalszy) SIGlu-Ala-Leu-Tyr-Leu^al-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Łańcuch B(ciąg dalszy)Phe—Xa-—Xaa-X--—X-- —X-- (SEQ ID Nr:2)25 26 27 28 29 30 w którejXaa w pozycj i A21 j est każdym możliwym do kodowania aminokwasem, z wyjątkiem Lys, Arg, i Cys,Xa- w pozycji B1, B2, B3, B26, B27, B28 i B29 są, niezależnie od siebie, każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, lub usuniętym,Xaa w pozycji B30 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, dipeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tripeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tetrapeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, albo usuniętym, i albo grupa aminowa aminokwasu N-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe W, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, albo grupa karboksylowa aminokwasu C-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe Z, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie z-wiera grupę, która może być naładowana ujemnie, pod warunkiem, że jeśli usuwa się jeden lub więcej aminokwasów183 698 w pozycji B1, B2 i B3, wtedy numer aminokwasu N-terminalnego określa się przez liczenie w dół od CysB7, której zawsze przypisuje się numer 7, i że (a) gdy B1-B2-B3 jest Phe-Val-Asn i A21 oznacza Asn |i B26-B27-B28-B29-B30 jest Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr lub Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, wtedy wspomniane W lub Z zawsze zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, oraz (b) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B i ani B1, B2 ani B3 nie usuwa się, wtedy B1-B2 jest różny od Phe-Val lub B26-B27-B28 jest różne od Tyr-Thr-Pro albo zarówno B1-B2 jak i B26-B27-B28 są różne od wspomnianych sekwencji, oraz (c) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Zjaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B, i jeden z B1, B2 lub B3 usuwa się, wtedy aminokwas N-terminalny łańcucha B jest różny od Val lub sekwencja B26-B27-B28 jest różna od Tyr-ThrPro albo zarówno aminokwas N-terminalny łańcucha B jak i sekwencja B26-B27-B28 są różne· od odpowiednio Val i Tyr-Thr-Pro. - 2. Pochodna insuliny według zastrz. 1, znamienna tym, że ugrupowanie lipofilowe W wiąże się z grupą aminową N-terminalnego aminokwasu w łańcuchu B.
- 3. Pochodna insuliny według zastrz. 1, znamienna tym, że ugrupowanie lipofilowe Z wiąże się z grupą karboksylową C-terminalnego aminokwasu w łańcuchu B.
- 4. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji A21 oznacza aminokwas wybrany z grupy, obejmującej Ala, Asn, Gln, Glu, Gly i Ser.
- 5. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji B1 oznacza Phe lub jest usunięta.
- 6. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji B2 oznacza Ala lub Val.
- 7. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji B3 oznacza aminokwas wybrany z grupy, obejmującej Asn, Gln, Glu i Thr.
- 8. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji B26 oznacza Tyr.
- 9. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa’ w pozycji B27 oznacza Thr.
- 10. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji B28 oznacza Pro.
- 11. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji B29 oznacza Lys lub Thr.
- 12. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji B30 oznacza Thr lub ε -acylowaną Lys.
- 13. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji B30 jest usunięty.
- 14. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji B28 oznacza Lys, i Xaa w pozycji B29 oznacza Pro.
- 15. Pochodna insuliny według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że Xaa w pozycji B28 oznacza Pro, i Xaa w pozycji B29 oznacza Thr.
- 16. Pochodna insuliny według zastrz. 2 znamienna tym, że W związana jest z grupą aminową aminokwasu N-terminalnego poprzez wiązanie amidowe.
- 17. Pochodna insuliny według zastrz. 16 znamienna tym, że W oznacza CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CO-, i n oznacza liczbę całkowitą od 9 do 15.
- 18. Pochodna insuliny według zastrz. 3 znamienna tym, że Z związana jest z grupą karboksylową aminokwasu C-terminalnego poprzez wiązanie amidowe.
- 19. Pochodna insuliny według zastrz. 18 znamienna tym, że Z oznacza -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3, i m oznacza liczbę całkowitą od 8 do 18.
- 20. Pochodna insuliny według zastrz. 19 znamienna tym, że pierwotną insuliną, z którą wiąże się Z, jest z ludzką insuliną Thi329.183 698
- 21. Pochodna insuliny według zastrz. 19 znamienna tym, że insuliną pierwotną, z którą wiąże się Z, jest ludzka insulina des(B28-B30).
- 22. Pochodna insuliny według zastrz. 19 znamienna tym, że insuliną pierwotną, z którą wiąże się Z, jest ludzka insulina des(B27-B30).
- 23. Pochodna insuliny według zastrz. 19 znamienna tym, że insuliną pierwotną, z którą wiąże się Z, jest ludzka insulina des(B26-B30).
- 24. Pochodna insuliny według zastrz. 1 znamienna tym, że C-terminalny aminokwas łańcucha B jest e-acylowaną Lys i aminokwasem następnym po aminokwasie C-terminalnym, jest Gly.
- 25. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia cukrzycy u pacjenta potrzebującego takiego leczenia, znamienna tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość pochodnej insuliny posiadającej następującą sekwencję:Łańcuch AS S |— IGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thh-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 | 8 9 10 11 12SIŁańcuch B SIXaa-Xaa-Xaa-GGn-His-Leu-Ccs-GGyySer-His-Leu-Val123456789 10 11 12Łańcuch A (ciąg dalszy)Leu-Tyr-Gln-Lru-Glu-Asn-Tsr-Css-Xaa (SEQ ID Nr:l)13 14 15 16 11 18 19 I 21 _SIŁańcuch B(ciąg dalszy) SIGlu-Ala-Le--Tyr-Leu-Val-Cys-Gls-Gl--Arg-Gls-Phe13 14 15 16 17 88 19 220 21 22 23 24Łańcuch B(ciąg dalszy)Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID Nr-2)25 26 27 28 29 30 ' w którejXaa w pozycji A21 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem, z wyjątkiem Lys, Arg, i Cys,Xaa w pozycji B1, B2, B3, B26, B27, B28 i B29 są, niezależnie od siebie, każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, lub usuniętym,Xaa w pozycji B30 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, dipeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tripeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tetrapeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, albo usuniętym, i albo grupa aminowa aminokwasu N-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe W, które posiada183 69812-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, albo grupa karboksylowa aminokwasu C-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe Z, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, pod warunkiem, że jeśli usuwa się jeden lub więcej aminokwasów w pozycji B1, B2 i B3, wtedy numer aminokwasu N-terminalnego określa się przez liczenie w dół od CysB7, której zawsze przypisuje się numer 7, iże (a)gdyB1-B2-B3jestPhe-Val-A.sniA21 oznaczaAsn iB26-B27-B28-B29-B30jest Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr lub Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, wtedy wspomniane W lub Z zawsze zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, oraz (b) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jak określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B i ani B1, B2, ani B3 nie usuwa się, wtedy B1-B2 jest różny od Phe-Val lub B26-B27-B28 jest różne od Tyr-Thr-Pro albo zarówno B1-B2 jak i B26-B27-B28 są różne od wspomnianych sekwencji, oraz (c.) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jak określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B, i jeden z B1, B2 lub B3 usuwa się, wtedy aminokwas N-terminalny łańcucha B jest różny od Val lub sekwencja B26-B27-B28 jest różna od Tyr-ThrPro albo zarówno aminokwas N-terminalny łańcucha B jak i sekwencja B26-B27-B28 są różne od odpowiednio Val i Tyr-Thr-Pro, razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
- 26. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia cukrzycy u pacjenta potrzebującego takiego leczenia, znamienna tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość pochodnej insuliny posiadająca następującą sekwencję:Łańcuch A S___SI 7 |Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 | 8 9 10 11 12SIŁańcuch B SIXaa-Xaa-XaaaGGnnHiss-Leu-Cys-GGy-Ser-His-Leu-Val123456789 10 11 12Łańcuch A (ciąg dalszy)Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-T---y-s-Xaa 13 14 15 16 17 18 19 | 21 (^^ζ2 ID Nrrl1Łańcuch B(ciąg dalszy) SGlu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-yys-Gl--Glu-Arg-Gl--Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 222 23 24Łańcuch B(ciąg dalszy)Phe-aaa-aaa-aaa-aaa-aaa 25 26 27 28 29 30 (SEQ ID Nrrl)183 698 w którejXaa w pozycji A21 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem, z wyjątkiem Lys, Arg, i Cys,Xaa w pozycji B1, B2, B3, B26, B27, B28 i B29 są, niezależnie od siebie, każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, lub usuniętym,Xaa w pozycji B30 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, dipeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tripeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tetrapeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, albo usuniętym, i albo grupa aminowa aminokwasu N-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe W, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, albo grupa karboksylowa aminokwasu C-terminalnego łańcucha B posiada związane z niąugrupowanie lipofilowe Z, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, pod warunkiem, że jeśli usuwa się jeden lub więcej aminokwasów w pozycji B1, B2 i B3, wtedy numer aminokwasu N-terminalnego określa się przez liczenie w dół od CysB7, której zawsze przypisuje się numer 7, iże (a)gdyB1-B2-B3jestPhe-Val-AsniA21 oznaczaAsn iB26-B27-B28-B29-B30jest Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr lub Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, wtedy wspomniane W lub Z zawsze zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, oraz (b) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jak określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B i ani B1, B2 ani B3 nie usuwa się, wtedy B 1-B2j est różny od Phe-Val lub B26-B27-B28jest różne od Tyr-Thr-Pro albo zarówno B1-B2 jak i B26-B27-B28 są różne od wspomnianych sekwencji, oraz (c) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B, i jeden z B1, B2 lubB3 usuwa się, wtedy aminokwas N-terminalny łańcucha B jest różny od Val lub sekwencja B26-B27-B28 jest różna od Tyr-ThrPro albo zarówno aminokwas N-terminalny łańcucha B jak i sekwencja B26-B27-B28 są różne od odpowiednio Val i Tyr-Thr-Pro, w mieszaninie z insuliną lub analogiem insuliny, posiadającym szybki początek działania w proporcjach odpowiednio od 1: 5 do 5 :1, razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
- 27. Zastosowanie pochodnej insuliny posiadającej następującą sekwencję:Łańcuch A S_ SI 7 IGly-Ile-yal-Glu-Gln-Cys-Cys-Thh-Ssr-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 | 8 9 10 11 12SIŁańcuch B SIXaa-Xaa-Xaa--Gnn-is-LeuuCyS-GGy~Ser-His-Leu-Val-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Łańcuch A (ciąg dalszy) 20 Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (SEQ ID Nr:1)13 14 15 16 1-7 18 19 | 21 _S183 698Łańcuch B(ciąg dalszy) SIGlu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Łańcuch B(ciąg dalszy)Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID Nr:2)25 26 27 28 29 30 w którejXaa w pozycji A21jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem, z wyjątkiem Lys, Arg, i Cys,Xaa w pozycji B1, B2, B3, B26, B27, B28 i B29 są, niezależnie od siebie, każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, lub usuniętym,Xaa w pozycji B30 jest każdym możliwym do kodowania aminokwasem z wyjątkiem Cys, dipeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, tripeptydem. nie obejmującym Cys lub Arg,tetrapeptydem nie obejmującym Cys lub Arg, albo usuniętym, i albo grupa aminowa aminokwasu N-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe W, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, albo grupa karboksylowa aminokwasu C-terminalnego łańcucha B posiada związane z nią ugrupowanie lipofilowe Z, które posiada 12-40 atomów węgla i ewentualnie zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, pod warunkiem, że jeśli usuwa się jeden lub więcej aminokwasów w pozycji B1, B2 i B3, wtedy numer aminokwasu N-terminalnego określa się przez liczenie w dół od CysB7, której zawsze przypisuje się numer 7, i że (a) gdy B1-B2-B3 jest Phe-Val-Asn i A21 oznacza Asn |i B26-B27-B28-B29-B30 jest Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr lub Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, wtedy wspomniane W lub Z zawsze zawiera grupę, która może być naładowana ujemnie, oraz (b) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B i ani B1, B2 ani B3 nie usuwa się, wtedy B1-B2 jest różny od Phe-Val lub B26-B27-B28jest różne od Tyr-Thr-Pro albo zarówno B1-B2 jak i B26-B27-B28 są różne od wspomnianych sekwencji, oraz (c) gdy B29 i B30 usuwa się, a grupa Z jaką określono powyżej jest obecna w aminokwasie C-terminalnym łańcucha B, i jeden z B1, B2 lub B3 usuwa się, wtedy aminokwas N-terminalny łańcucha B jest różny od Val lub sekwencja B26-B27-B28 jest różna od Tyr-ThrPro albo zarówno aminokwas N-terminalny łańcucha B jak i sekwencja B26-B27-B28 są różne od odpowiednio Val i Tyr-Thr-Pro, do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy··'.Niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej insuliny, kompozycji farmaceutycznej i zastosowania pochodnej insuliny. Wynalazek dotyczy zwłaszcza pochodnych ludzkiej insuliny, które są rozpuszczalne w wodzie i posiadająprzedłużony profil działania a także kompozycji farmaceutycznych zawierających te pochodne, oraz zastosowania takich pochodnych insuliny w leczeniu cukrzycy.Wielu pacjentów z cukrzycą leczy się wielokrotnymi w ciągu dnia iniekcjami insuliny, w reżimie obejmującymjedną lub dwie iniekcje dziennie insuliny o przedłużonym działaniu, aby pokryć podstawowe zapotrzebowanie, uzupełnione pojedynczymi dużymi iniekcjami szybko działającej insuliny, pokrywającej wymagania związane z posiłkami.Kompozycje insuliny o przedłużonym działaniu są dobrze znane. Tak więc, główny typ kompozycji insuliny o przedłużonym działaniu obejmuje możliwą do wstrzyknięć wodną zawiesinę insuliny krystalicznej lub insuliny bezpostaciowej. W tych kompozycjach, związka8183 698 mi insuliny typowo wykorzystywanymi są insulina protaminowa, insulina cynkowa lub insulina protaminowo-cynkowa.W związku z tym, że z użyciem zawiesin insuliny związane sąpewne wady, w celu zabezpieczenia dokładnego dawkowania, cząsteczki insuliny muszą być zawieszone homogenicznie poprzez delikatne wstrząsanie przed wyciągnięciem określonej objętości zawiesiny z fiolki lub wycofaniem z naboju. Także, przy przechowywaniu zawiesiny insuliny, temperatura musi być utrzymywana w węższych granicach, niż przy roztworach insuliny, w celu uniknięcia zbrylenia lub koagulacji.Chociaż wcześniej uważano, że protaminy są nie immunogenne, obecnie okazało się, że protaminy mogą być immunogenne u ludzi i że ich użycie do celów medycznych może prowadzić do wytwarzania, przeciwciał (Samuel i in., Studies on the immun^ogenicity ofprotamines in humans and experimental animals by means of a micro-complement fixation test, Clin.Exp.Immunol. 33, str. 252-260 (1978)).Stwierdzono także, że kompleks protamina-insulina jest sam immunogenny (Kurtz i in., Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins. Diabetologica 25, str. 322-324 (1983)) i dlatego, u niektórych pacjentów, należy koniecznie unikać stosowania kompozycji insuliny o przedłużonym działaniu, zawierających protaminy.Innym typem kompozycji insuliny o przedłużonym działaniu są roztwory posiadające wartość pH poniżej pH fizjologicznego, z których insulina będzie się wytrącać, z powodu podniesienia wartości pH po wstrzyknięciu roztworu. Wadą jest to, że stałe cząstki insuliny działają jak miejscowy czynnik drażniący, powodujący zapalenie tkanki w miejscu wstrzyknięcia.Zgłoszenie patentowe WO 91/12817 (Novo Nordisk A/S) ujawnia rozpuszczalne kompozycje insuliny o przedłużonym działaniu, zawierające kompleksy kobaltu(III). Przedłużone działanie tych kompleksów jest tylko przejściowe, a biodostępność zredukowana.Ludzka insulina posiada trzy główne grupy aminowe: N-terminalną grupę łańcucha A i łańcucha B oraz grupę e-aminowąLssB29. We wcześniejszym stanie wiedzy znane jest kilka pochodnych insuliny, podstawionych w jednej lub więcej tych grup. W ten sposób, opis patentowy US nr 3 528 960 (Eli Lilly) dotyczy insulin N-karboksyarollowsch, w których jedna dwie lub trzy główne grupy aminowe cząsteczki insuliny posiadają grupę karboksyaroiiową. Nie opisuje się specyficznie podstawionych insulin NeB29.Zgodnie z opisem patentowym GB nr 1 492 997 (Nat.Res.Dev.Corp), odkryto, że insulina z podstawieniem karbamylowym przy N^9 posiada polepszony profil efektu hipoglikemicznego.Japońskie wyjaśniające zgłoszenie patentowe nr 1-254 699 (Kodama Co.,Ltd.) ujawnia insulinę w której kwas tłuszczowy wiąże się z grupą aminową PheB1 lub z grupą ε aminową LysB29 albo z obiema. Celem wytwarzania pochodnychjest zatem otrzymanie fanm-kologicznie dopuszczalnego, stabilnego preparatu insuliny.Insuliny, które w pozycji B30 posiadają aminokwas, zawierający co najmniej pięć atomów węgla, które nie mogą być koniecznie kodowane przez triplet nukleotydów, opisano w wyjaśniającym zgłoszeniu patentowym JP nr 57-067 548 (Shionogi). Analogi insuliny zastrzeżono jako użyteczne w leczeniu cukrzycy, w szczególności u pacjentów opornych na insulinę, z powodu wytworzenia przeciwciał na insulinę bydlęcą lub świńską.Opis patentowy US 5 359 030 (Ekwuribe, Protem Deliveiy, Inc.) opisuje stabilizowane przez sprzężenie kompozycje polipeptydowe do podawania doustnego lub pozajelitowego, obejmującepolipeptydkowalentnie sprzężony z polimerem, włączając liniową cząstkę polialkilenowąi cząstkę lipofilową, przy czym wspomniane cząstki sąułożone w stosunku do siebie tak, że polipeptyd wzmaga in .vivo oporność na degradację enzymatyczną.Zgłoszenie patentowe EP 511 600 A2 dotyczy między innymi pochodnych białkowych o wzorze [bia!^^o][Z]n , w którym [białko] oznacza białko, posiadające n reszt aminowych, każda z nich może pochodzić od grupy aminowej przez usunięcie jednego z atomów wodoru zamiast grup aminowych, [Z] jest resztą oznaczoną wzorem-CO-W-COOH, w którym W jest dwuwartościową grupą długiego łańcucha wodorowęglowego, mogącego zawierać także pew183 698 ne heteroatomy, i n oznacza przeciętną liczby wiązań amidowych między [Z] i [białkiem]. Stwierdzono, że pochodne białkowe według wynalazku posiadająniezwykle przedłużony okres półtrwaniaw surowicy, w porównaniu z białkami, od których one pochodzą oraz, żeniewykazują działaniajako antygeny. Okazało się także, że insulinajestjednym z białek, z którego można wytwarzać pochodne według wynalazku, ale ani nie opisano w EP 511 600 specyficznych pochodnych insuliny, ani nie wskazuje się w nim żadnego zalecanego [Z] lub zalecanej pozycji (jednej lub kilku) wjakiej [Z] powinno zostać wprowadzone, w celu otrzymania użytecznych pochodnych insuliny.W niniejszym opisie, gdziekolwiek używa się terminu insulina, obejmuje on zarówno naturalnie występujące insuliny, jak i analogi insuliny oraz ich pochodne. Przez “pochodną insuliny” rozumie się tutaj polipeptyd, posiadający strukturę cząsteczkową podobną do ludzkiej insuliny, włączając mostki disiarczkowe między CysA7 i CysB7 oraz między Cys^0 i CysB”, oraz wewnętrzny mostek disiarczkowy między CysA6 i CysA'1, imające aktywność insuliny.Jednakże, wciąż istnieje potrzeba możliwych do wstrzyknięć kompozycji insulinowych o przedłużonym działaniu, będących roztworami i zawierających insulinę, która pozostaje w roztworze po iniekcji i posiada minimalne właściwości zapalne i immunogenne.Jednym z celów jaki osiągnięto było dostarczenie pochodnych ludzkiej - insuliny posiadających przedłużony profil działania, rozpuszczalnych przy fizjologicznych wartościach pH; a także stworzenie kompozycji farmaceutycznej, zawierającej pochodne ludzkiej insuliny według wynalazku.Nieoczekiwanie okazało się, że pewne pochodne insuliny, w których albo grupa aminowa aminokwasu N-terminalnego łańcucha B posiada dołączony podstawnik lipofilowy, zawierający 12-40 atomów węgla, albo w których grupa kwasu karbok sy Io wego aminokwasu C-terminalnego łańcucha B posiada dołączony podstawnik lipofilowy, zawierający 12-40 atomów węgla, mają przedłużony profil działania i są rozpuszczalne przy fizjologicznych wartościach pH.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK27695 | 1995-03-17 | ||
| PCT/DK1996/000107 WO1996029344A1 (en) | 1995-03-17 | 1996-03-18 | Insulin derivatives |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL322299A1 PL322299A1 (en) | 1998-01-19 |
| PL183698B1 true PL183698B1 (pl) | 2002-06-28 |
Family
ID=8091725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96322299A PL183698B1 (pl) | 1995-03-17 | 1996-03-18 | Pochodna insuliny, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie pochodnej insuliny |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0871665B1 (pl) |
| JP (1) | JP3872105B2 (pl) |
| KR (1) | KR19980703039A (pl) |
| CN (1) | CN1196061A (pl) |
| AT (1) | ATE245659T1 (pl) |
| AU (1) | AU720966B2 (pl) |
| BR (1) | BR9607647A (pl) |
| CA (1) | CA2215694A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ289343B6 (pl) |
| DE (1) | DE69629210T2 (pl) |
| HU (1) | HUP9800523A3 (pl) |
| NO (1) | NO974270L (pl) |
| PL (1) | PL183698B1 (pl) |
| WO (1) | WO1996029344A1 (pl) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693609A (en) * | 1994-11-17 | 1997-12-02 | Eli Lilly And Company | Acylated insulin analogs |
| US6451970B1 (en) | 1996-02-21 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Peptide derivatives |
| US7235627B2 (en) | 1996-08-30 | 2007-06-26 | Novo Nordisk A/S | Derivatives of GLP-1 analogs |
| US6458924B2 (en) | 1996-08-30 | 2002-10-01 | Novo Nordisk A/S | Derivatives of GLP-1 analogs |
| US6268343B1 (en) | 1996-08-30 | 2001-07-31 | Novo Nordisk A/S | Derivatives of GLP-1 analogs |
| EP1039920A4 (en) | 1997-10-24 | 2003-05-28 | Lilly Co Eli | INSULIN ANALOGS ACYLATED BY FATTY ACID |
| US6531448B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-03-11 | Eli Lilly And Company | Insoluble compositions for controlling blood glucose |
| DE69934967T2 (de) * | 1998-12-08 | 2007-12-06 | Biovation Ltd. | Verfahren zur verminderung der immunogenität von proteinen |
| TWI242000B (en) * | 1998-12-10 | 2005-10-21 | Univ Southern California | Reversible aqueous pH sensitive lipidizing reagents, compositions and methods of use |
| ES2360182T3 (es) | 2002-05-07 | 2011-06-01 | Novo Nordisk A/S | Formulaciones solubles que comprenden insulina monomérica e insulina acilada. |
| CN1247616C (zh) * | 2002-07-19 | 2006-03-29 | 上海中科生龙达生物技术（集团）有限公司 | 新的单体胰岛素，药物组合物及其制法 |
| JP4463814B2 (ja) | 2003-08-05 | 2010-05-19 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 新規のインスリン誘導体 |
| WO2005047508A1 (en) * | 2003-11-14 | 2005-05-26 | Novo Nordisk A/S | Processes for making acylated insulin |
| RU2385879C2 (ru) | 2004-01-21 | 2010-04-10 | Ново Нордиск Хелс Кеа Аг | Способ конъюгации пептидов, опосредованной трансглутаминазой |
| MXPA06010345A (es) | 2004-03-17 | 2007-06-19 | 7Tm Pharma As | Agonistas de receptor selectivo de y4 para intervenciones terapeuticas. |
| WO2005089789A2 (en) | 2004-03-17 | 2005-09-29 | 7Tm Pharma A/S | Y2 selective receptor agonists for therapeutic interventions |
| EP1846447B1 (en) | 2005-02-02 | 2013-08-21 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
| ES2438145T3 (es) | 2005-02-02 | 2014-01-16 | Novo Nordisk A/S | Nuevos derivados de insulina |
| US20090074882A1 (en) | 2005-12-28 | 2009-03-19 | Novo Nordisk A/S | Insulin compositions and method of making a composition |
| WO2007096431A1 (en) * | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
| AU2007247109B2 (en) * | 2006-05-09 | 2012-03-15 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivative |
| ES2542146T3 (es) | 2006-07-31 | 2015-07-31 | Novo Nordisk A/S | Insulinas extendidas PEGiladas. |
| RU2524150C2 (ru) | 2006-09-22 | 2014-07-27 | Ново Нордиск А/С | Аналоги инсулина, устойчивые к протеазам |
| WO2008132224A2 (en) | 2007-04-30 | 2008-11-06 | Novo Nordisk A/S | Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein |
| WO2008152106A1 (en) | 2007-06-13 | 2008-12-18 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical formulation comprising an insulin derivative |
| JP5715418B2 (ja) * | 2007-11-08 | 2015-05-07 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | インスリン誘導体 |
| EP2058330A1 (en) * | 2007-11-08 | 2009-05-13 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivative |
| ES2618073T3 (es) | 2008-03-14 | 2017-06-20 | Novo Nordisk A/S | Análogos de insulina estabilizados frente a proteasas |
| MX2010009850A (es) | 2008-03-18 | 2010-09-30 | Novo Nordisk As | Analogos de insulina acilados y etabilizados contra proteasas. |
| ES2607003T3 (es) | 2008-10-30 | 2017-03-28 | Novo Nordisk A/S | Tratamiento de diabetes mellitus utilizando inyecciones de insulina con una frecuencia de inyección inferior a la diaria |
| HRP20191793T1 (hr) | 2010-10-27 | 2019-12-27 | Novo Nordisk A/S | Liječenje dijabetesa melitusa injekcijama inzulina koje se primijenjuje u različitim intervalima injiciranja |
| EP2836508B1 (en) | 2012-04-11 | 2016-06-29 | Novo Nordisk A/S | Insulin formulations |
| JP2016519127A (ja) | 2013-04-30 | 2016-06-30 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 新規投与レジメン |
| KR20160065126A (ko) | 2013-10-07 | 2016-06-08 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 인슐린 유사체의 신규한 유도체 |
| AR099569A1 (es) | 2014-02-28 | 2016-08-03 | Novo Nordisk As | Derivados de insulina y los usos médicos de estos |
| AU2017378102B2 (en) | 2016-12-16 | 2022-10-13 | Novo Nordisk A/S | Insulin containing pharmaceutical compositions |
| MX2020001525A (es) | 2017-08-24 | 2020-03-20 | Novo Nordisk As | Composiciones de peptido similar al glucagon tipo 1 (glp-1) y sus usos. |
| US10335464B1 (en) | 2018-06-26 | 2019-07-02 | Novo Nordisk A/S | Device for titrating basal insulin |
| CA3122636A1 (en) | 2018-12-11 | 2020-06-18 | Sanofi | Insulin analogs having reduced insulin receptor binding affinity |
| JP7518149B2 (ja) | 2019-07-12 | 2024-07-17 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 高濃度インスリン製剤 |
| IL294520A (en) | 2020-02-18 | 2022-09-01 | Novo Nordisk As | Pharmaceutical formulations |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| DK155690D0 (da) * | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Novo Nordisk As | Nye peptider |
| CZ287945B6 (cs) * | 1993-09-17 | 2001-03-14 | Novo Nordisk A/S | Inzulinový derivát a farmaceutický prostředek s jeho obsahem pro léčení diabetu |
-
1996
- 1996-03-18 CZ CZ19972899A patent/CZ289343B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-03-18 AU AU49396/96A patent/AU720966B2/en not_active Ceased
- 1996-03-18 BR BR9607647A patent/BR9607647A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-03-18 JP JP52799596A patent/JP3872105B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-18 DE DE69629210T patent/DE69629210T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-18 CA CA002215694A patent/CA2215694A1/en not_active Abandoned
- 1996-03-18 HU HU9800523A patent/HUP9800523A3/hu unknown
- 1996-03-18 WO PCT/DK1996/000107 patent/WO1996029344A1/en not_active Ceased
- 1996-03-18 PL PL96322299A patent/PL183698B1/pl unknown
- 1996-03-18 EP EP96905764A patent/EP0871665B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-18 CN CN96193362A patent/CN1196061A/zh active Pending
- 1996-03-18 AT AT96905764T patent/ATE245659T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-03-18 KR KR1019970706447A patent/KR19980703039A/ko not_active Ceased
-
1997
- 1997-09-16 NO NO974270A patent/NO974270L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69629210T2 (de) | 2004-04-22 |
| MX9707056A (es) | 1997-11-29 |
| ATE245659T1 (de) | 2003-08-15 |
| WO1996029344A1 (en) | 1996-09-26 |
| PL322299A1 (en) | 1998-01-19 |
| NO974270L (no) | 1997-11-14 |
| JP3872105B2 (ja) | 2007-01-24 |
| CA2215694A1 (en) | 1996-09-26 |
| DE69629210D1 (de) | 2003-08-28 |
| AU720966B2 (en) | 2000-06-22 |
| HUP9800523A2 (hu) | 1998-06-29 |
| CZ289343B6 (cs) | 2002-01-16 |
| EP0871665A1 (en) | 1998-10-21 |
| NO974270D0 (no) | 1997-09-16 |
| CZ289997A3 (cs) | 1998-01-14 |
| BR9607647A (pt) | 1999-04-06 |
| HUP9800523A3 (en) | 1998-09-28 |
| CN1196061A (zh) | 1998-10-14 |
| JPH11502110A (ja) | 1999-02-23 |
| EP0871665B1 (en) | 2003-07-23 |
| KR19980703039A (ko) | 1998-09-05 |
| AU4939696A (en) | 1996-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0871665B1 (en) | Insulin derivatives | |
| US7229964B2 (en) | Insulin derivatives | |
| US6869930B1 (en) | Acylated insulin | |
| EP0894095B1 (en) | Insulin derivatives and their use | |
| JP4060583B2 (ja) | アシル化インスリン | |
| EP2256129B1 (en) | Insulin derivatives | |
| AU725201B2 (en) | Insulin derivatives with increased zinc binding | |
| US20030104981A1 (en) | Human insulin analogues | |
| CN101970476A (zh) | 具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物 | |
| MXPA97007056A (en) | Insulated derivatives | |
| AU5196000A (en) | Acylated insulin |