PL180526B1 - Sposób oznaczania obecnosci enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce i urzadzenie testowe do badania obecnosci enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce PL PL PL PL PL - Google Patents
Sposób oznaczania obecnosci enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce i urzadzenie testowe do badania obecnosci enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL180526B1 PL180526B1 PL94311140A PL31114094A PL180526B1 PL 180526 B1 PL180526 B1 PL 180526B1 PL 94311140 A PL94311140 A PL 94311140A PL 31114094 A PL31114094 A PL 31114094A PL 180526 B1 PL180526 B1 PL 180526B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hrpo
- sample
- solid support
- enzymatically active
- hydrolase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 122
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 112
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 112
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims description 31
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 10
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title description 29
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 130
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 116
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 claims abstract description 103
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 42
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 16
- 101000898643 Candida albicans Vacuolar aspartic protease Proteins 0.000 claims description 157
- 101000898783 Candida tropicalis Candidapepsin Proteins 0.000 claims description 150
- 101000898784 Cryphonectria parasitica Endothiapepsin Proteins 0.000 claims description 150
- 101000933133 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-1 Proteins 0.000 claims description 150
- 101000910082 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-2 Proteins 0.000 claims description 150
- 101000910079 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-3 Proteins 0.000 claims description 150
- 101000910086 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-4 Proteins 0.000 claims description 150
- 101000910088 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-5 Proteins 0.000 claims description 150
- 101000898773 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Saccharopepsin Proteins 0.000 claims description 150
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 87
- 239000004263 Guaiac resin Substances 0.000 claims description 66
- 229920000932 Gum guaicum Polymers 0.000 claims description 66
- 235000019278 guaiac resin Nutrition 0.000 claims description 66
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 claims description 55
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 claims description 55
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 claims description 39
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 claims description 39
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 claims description 34
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 31
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 31
- -1 deaminase Proteins 0.000 claims description 31
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 28
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 26
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 24
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 24
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 claims description 23
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 22
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 21
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 19
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 17
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 14
- 241000224527 Trichomonas vaginalis Species 0.000 claims description 13
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 13
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 claims description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 9
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 7
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 6
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims description 6
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 6
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 5
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims description 5
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 5
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 4
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 4
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 3
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 claims description 3
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 claims description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- QWDQEOKTBFFZND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(O)=C(S(O)(=O)=O)C(O)=CC2=C1 QWDQEOKTBFFZND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N abts Chemical compound S/1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N\N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 claims 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-M hydroperoxide group Chemical group [O-]O MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 51
- 239000013642 negative control Substances 0.000 abstract description 14
- 239000013641 positive control Substances 0.000 abstract description 14
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 5
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 abstract description 4
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 abstract description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 abstract 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 119
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 100
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 98
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 96
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 92
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 92
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 82
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 81
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 68
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 62
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 49
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 47
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 47
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 42
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 42
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 42
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 42
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 39
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 39
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 37
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 36
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 35
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 34
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 32
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 32
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 30
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 27
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 27
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 27
- 241000147041 Guaiacum officinale Species 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 26
- 229940091561 guaiac Drugs 0.000 description 26
- 241000228251 Aspergillus phoenicis Species 0.000 description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 23
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 18
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- 206010046901 vaginal discharge Diseases 0.000 description 15
- 201000007096 Vulvovaginal Candidiasis Diseases 0.000 description 14
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 14
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 14
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 14
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 14
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 13
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 12
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 11
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 11
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 10
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 10
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 10
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- 241000203734 Mobiluncus curtisii Species 0.000 description 9
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 9
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 9
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 8
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 8
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 8
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 7
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 7
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 7
- 229960001922 sodium perborate Drugs 0.000 description 7
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 7
- YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M sodium;oxidooxy(oxo)borane Chemical compound [Na+].[O-]OB=O YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 6
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 6
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L (2-dodecoxy-2-oxoethyl)-[6-[(2-dodecoxy-2-oxoethyl)-dimethylazaniumyl]hexyl]-dimethylazanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].CCCCCCCCCCCCOC(=O)C[N+](C)(C)CCCCCC[N+](C)(C)CC(=O)OCCCCCCCCCCCC XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 4
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 4
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 4
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 4
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 4
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 4
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- YECIFGHRMFEPJK-UHFFFAOYSA-N lidocaine hydrochloride monohydrate Chemical compound O.[Cl-].CC[NH+](CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C YECIFGHRMFEPJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 3
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 229920004934 Dacron® Polymers 0.000 description 2
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 2
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 2
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerol Natural products OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108091007187 Reductases Proteins 0.000 description 2
- 102000005262 Sulfatase Human genes 0.000 description 2
- UYFXJSBYTIMJAH-UHFFFAOYSA-J [Ti+4].[O-]O.[O-]O.[O-]O.[O-]O Chemical compound [Ti+4].[O-]O.[O-]O.[O-]O.[O-]O UYFXJSBYTIMJAH-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- HLVXFWDLRHCZEI-UHFFFAOYSA-N chromotropic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(O)=C2C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=C1 HLVXFWDLRHCZEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 2
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 2
- 239000007999 glycylglycine buffer Substances 0.000 description 2
- 150000002432 hydroperoxides Chemical class 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- HGXSRHURBLKSOD-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloropropan-2-one;hydrochloride Chemical compound Cl.ClCC(=O)CCl HGXSRHURBLKSOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2-[(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010269 ABTS assay Methods 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 101000761239 Bos taurus Kappa-casein Proteins 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 229920004142 LEXAN™ Polymers 0.000 description 1
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 1
- 239000004418 Lexan Substances 0.000 description 1
- 208000007027 Oral Candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- 239000012615 aggregate Substances 0.000 description 1
- 150000008055 alkyl aryl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical class C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 239000002812 cholic acid derivative Substances 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012505 colouration Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000002194 fatty esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000007478 fluorogenic assay Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 1
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 1
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 208000010484 vulvovaginitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011850 water-based material Substances 0.000 description 1
- 239000011240 wet gel Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
- G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
- G01N2333/40—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts from Candida
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
1. Sposób oznaczania obecnosci enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce, zna- mienny tym, ze: umieszcza sie próbke w urzadzeniu do testu, które zawiera pierwszy i drugi staly nosnik, przy czym pierwszy staly nosnik zawiera enzym reporterowy zwiazany z nim kowalencyjnie w taki sposób, ze po dzialaniu hydrolazy uwalnia sie, a na drugim nosniku, który nie konta- ktuje sie z pierwszym nosnikiem jest immobilizowany indykator, który jest substancja ulegajaca wykrywalnej zmianie po dzialaniu enzymu reporterowego, a próbke umieszcza sie w tym urzadzeniu w taki sposób, aby kontaktowala sie z pierwszym i drugim stalym nosnikiem, i wobec czego enzym reporterowy uwolniony przez aktywnosc hydrolazowa w próbce bedzie dyfundowal przez próbke do drugiego stalego nosnika i obserwuje sie, czy in- dykator ulega wykrywalnej zmianie, która swiadczy o obecnosci aktywnej hydrolazy w próbce. PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania obecności enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce i urządzenie testowe do badania obecności enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce.
Sposób według wynalazku szczególnie nadaje się do oznaczania obecności enzymatycznie aktywnej proteazy asparaginianowej i wykrywania kandydozy.
Candida albicans i inne gatunki Candida wywołują kilka powszechnych, istotnych z punktu widzenia medycznego, zakażeń. Kandydoza jamy ustnej, np. jest bardzo rozpowszechniona u pacjentów z niedoborem odporności. Ponadto kandydoza sromu i pochwy jest jedną z najczęstszych chorób w położnictwie i ginekologii. Szacuje się, że około 3/4 wszystkich dorosłych kobiet przynajmniej jeden raz było dotkniętych tą chorobą. (De Bemardis i in., J. Clin. Microbiol. 27(11): 2598-2603 (1989)). W związku z tak szerokim występowaniem choroby prowadzi się liczne badania zmierzające do zrozumienia etiologii kandydozy.
Badania wykazały, że Candida albicans i inne gatunki Candida mają etiologiczny związek z kandydoząu ludzi i uważa się, że kandydoza jest głównie spowodowana obecnością Candida albicans. Poza tym, istnieje znaczący dowód na rolę proteazy asparaginianowej lub (zamiennie) proteinazy kwasowej jako czynnika zjadliwości Candida albicans. Wiadomo, że czyste hodowle Candida albicans wydzielają proteazę asparaginianową, gdy rosną w ściśle określonych warunkach. Podobnie, wiadomo, że czyste szczepy Candida albicans wyizolowane od kobiet z objawami zapalenia pochwy i sromu uwalniają ten enzym, gdy hodowane są w ściśle określonym podłożu.
W wydzielinie pochwowej kobiet, z której wyizolowano pochwowo-sromowy Candida albicans, wykryto immunologicznie antygen, proteinazę kwaśną Candida albicans, tj. antygen, proteazę asparaginianową (De Bemardis i in., Abstract nr F-91 w: Abstract of the Annual Meeting of the American Society of Microbiology, (Anaheim, Ca 1990)). Jednak u pacjentek z objawami kandydozy pochwowo-sromowej stężenie antygenu - proteinazy kwaśnej Candida
180 526 albicans, było znacznie wyższe niż u nosicieli bez objawów. Stężenie tego antygenu w wydzielinie pochwowej u kobiet z kandydozą wynosi około 176 + 15,2 ng/ml, podczas gdy u kobiet, u których nie wyizolowano Candida albicans, tzn. bez klinicznej kandydozy, było mniejsze niż 2 ng/ml. U nosicieli Candida albicans bez objawów poziom antygenu był pośredni (94 + 18,5 mg/ml). Wyniki te wyraźnie wskazują na to, że proteinaza kwaśna (tj. proteaza asparaginianowa) bierze udział w patogenezie kandydozy pochwowo-sromowej. Wiadomo jednak, że proteaza asparaginianowa Candida albicans jest nietrwała w temperaturze ciała. Ponadto, wykrycie antygenu proteinazy asparaginianowej immunologicznie nie wskazywało, czy enzym ten występuje w enzymatycznie aktywnej formie.
Proteinaza kwaśna Candida albicans jest pozakomórkową proteazą asparaginianową. Proteazy asparaginianowe są jedną z głównych klas proteaz. Zawierają jedną lub więcej kluczowych reszt kwasu asparaginowego, które są niezbędne dla aktywności. Proteaza asparaginianowa Candida albicans ma szeroką specyficzność wobec substratu białkowego, który obejmuje np. albuminę, hemoglobinę, kazeinę, immunoglobulinę A i wiele innych białek. Enzym ten działa optymalnie w warunkach kwasowych (tj. przy pH 2,5-5,5) i szybko deaktywuje się przy wysokim pH (tzn. przy pH 7,5). Proteaza asparaginianowa Candida albicans jest silnie hamowana przez pepstatynę, ale nie jest hamowana przez reagenty tiolowe, chelatory lub inhibitory proteazy serynowej.
Wiele firm farmaceutycznych i wiodących ośrodków naukowych bada inhibitory proteazy asparaginianowej pod kątem ich potencjalnego zastosowania leczniczego. Badania są jednak utrudnione ponieważ brak jest odpowiedniego testu enzymatycznego na proteazy asparaginianowe. Podczas gdy dostępne są proste testy kolorymetryczne na niektóre proteazy i peptydazy serynowe, tiolowe, metaloproteazy i peptydazy, kwaśne i alkaliczne, brak jest takich testów na proteazy asparaginianowe. Specyficzność substratowa tej szczególnej klasy enzymów wymaga obecności kilku hydrofobowych aminokwasów. Właściwość ta znacznie utrudnia poszukiwania prostych syntetycznych substratów chromo genowych ponieważ hydrofobowe aminokwasy, które służą jako substrat dla proteaz asparaginianowych, są bardzo trudno rozpuszczalne w wodzie. Wobec tego brak jest w handlu chromogenowych subtratów dla proteazy asparaginianowej, trudno jest je zsyntetyzować i scharakteryzować i są one bardzo słabo rozpuszczalne w wodzie. Ograniczenia te powodują że aktywność enzymatyczna określona z użyciem tych substratów chromogenowych jest wyjątkowo niska, wobec czego testy kolorymetryczne na proteazę asparaginianową zupełnie nie mają sensu. Podobnie, opisane substraty fluorogenne dla proteaz asparaginianowych mają ograniczoną użyteczność. Po pierwsze, jak uprzednio wspomniano, specyficzność wobec substratu tej szczególnej klasy enzymów wymaga obecności kilku hydrofobowych aminokwasów, które czynią je nierozpuszczalnymi. Po wtóre, przy osiąganych niskich stężeniach tych substratów hydroliza ich zachodzi bardzo wolno i dlatego testy fluorogenne są czasochłonne. Ponadto, wiele materiałów biologicznych zawiera substancje fluorescencyjne, które mogą zakłócać testy fluorogenne na proteazy asparaginianowe.
Wobec braku odpowiednich testów kolorymetrycznych lub fluorogennych na wykrywanie proteaz asparaginianowych, na ogół stosuje się do określania obecności tej szczególnej klasy enzymów testy spektrofotometryczne przeprowadzane w ultrafiolecie (UV). W typowych testach spektrofotometrycznych UV proteazę asparaginianową dodaje się do roztworu białka (takiego jak np. hemoglobina lub albumina) i inkubuje się mieszaninę w 30-37°C przez 0,5 do 4 godzin. Po inkubacji do oziębionej mieszaniny inkubacyjnej dodaje się stężonego kwasu trichlorooctowego (TCA), aby wytrącić białko, które nie zostało strawione, pozostawiając w roztworze peptydy absorbujące światło ultrafioletowe. W końcu zbiera się wytrącone niestrawione białko przez wirowanie w ciągu około 1 godziny w niskiej temperaturze, odsysa się supematant i określa się jego gęstość optyczną przy 280 nm, która jest odbiciem stopnia hydrolizy białka. Aczkolwiek próbę tę można stosować do wykrywania proteaz asparaginianowych, jest to jednak test czaso- i pracochłonny.
180 526
Nie ma zatem wygodnego, prostego testu „on-site” na wykrywanie obecności enzymatycznie aktywnych proteaz asparaginianowych. Wynalazek niniejszy dotyczy szczególnie sposobu wykrywania obecności enzymatycznie aktywnych proteaz asparaginianowych, w którym nie występują powyższe problemy i wady. Sposób według wynalazku nadaje się także do określania obecności innych znanych enzymów hydrolitycznych, tj. hydrolaz, takich jak, ale nie wyłącznie, proteazy lub (zamiennie) proteinazy, peptydazy, lipazy, nukleazy, homo-oligosacharydazy, hetero-oligosacharydazy, homopolisacharydazy, heteropolisacharydazy, fosfatazy, sulfatazy, neuraminidazy i esterazy.
Sposób według wynalazku polega na tym, że umieszcza się próbkę w urządzeniu do testu, które zawiera pierwszy i drugi stały nośnik, przy czym pierwszy stały nośnik zawiera enzym reporterowy związany z nim kowalencyjnie w taki sposób, że po działaniu hydrolazy uwalnia się, a na drugim nośniku, który nie kontaktuje się z pierwszym nośnikiem, jest immobilizowany indykator, który jest substancją ulegającą wykrywalnej zmianie po działaniu enzymu reporterowego, a próbkę umieszcza się w tym urządzeniu w taki sposób, aby kontaktowała się z pierwszym i drugim stałym nośnikiem, i wobec czego enzym reporterowy uwolniony przez aktywność hydrolazową w próbce będzie dyfundował przez próbkę do drugiego stałego nośnika i obserwuje się, czy indykator ulega wykrywalnej zmianie, która świadczy o obecności aktywnej hydrolazy w próbce. I odwrotnie, brak wykrywalnej zmiany w indykatorze wskazuje, że w próbce nie ma enzymatycznie aktywnej hydrolazy. Sposób oceny obecności enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce według wynalazku jest szybki, dokładny, ekonomicznie efektywny i prosty w stosowaniu.
Stwierdzono, że w płynie pochwowym kobiet z kandydozą pochwowo-sromową występuje proteaza asparaginianowa Candida albicans. Stwierdzono dalej, że obecność enzymatycznie aktywnej proteazy asparaginianowej w próbce może służyć jako marker do wykrywania i diagnozowania kandydozy. Oceniając zatem obecność enzymatycznie aktywnej proteazy asparaginianowej w próbce, można wykryć kandydozę.
W metodzie tej próbkę, np. wydzielinę pochwową, kontaktuje się ze stałym nośnikiem. Na stałym nośniku immobilizowany jest enzym reporterowy (tzn. enzym wytwarzający sygnał). Enzym reporterowy jest immobilizowany na stałym nośniku w taki sposób, że jest uwalniany z nośnika po działaniu enzymatycznie aktywnej proteazy asparaginianowej, jeżeli rzeczywiście znajduje się w próbce. Próbkę po skontaktowaniu ze stałym nośnikiem, łączy się z indykatorem. Indykator stanowi dowolna substancja chemiczna, która po działaniu enzymu reporterowego ulega widocznym lub wykrywalnym zmianom (takim jak np. zmiana koloru). Jeżeli po kontakcie z próbką zachodzi widoczna zmiana w indykatorze to znaczy, że w próbce obecna jest enzymatycznie aktywna proteaza i wobec tego można twierdzić, że występuje kandydoza.
Do czasu opracowania niniejszego wynalazku nie było szybkich i prostych środków do wykrywania obecności enzymatycznie aktywnych proteaz asparaginianowych lub, co ważniejsze, kandydozy. Do wykrycia obecności aktywności proteazy asparaginianowej stosowano testy spektrofotometryczne, fluorogenne i immunologiczne, ale są to testy czasochłonne, pracochłonne i nieodpowiednie do stosowania przez niewyszkolony personel kliniczny „on-site”. Podobnie, Candida albicans można wykrywać przez hodowanie badanego materiału w określonej pożywce lub metodą mikroskopii ze świeżej próbki („wet mount microscopy”). Procedura prowadzenia hodowli jest bardzo czasochłonna (tj. zajmuje około 48 godzin) i obie procedury wymagają kosztownego sprzętu i szkolenia. W przeciwieństwie do prób stosowanych uprzednio, sposób według wynalazku oceny obecności enzymatycznie aktywnej proteazy asparaginianowej w próbce i z kolei kandydozy, jest szybki, dokładny, efektywny ekonomicznie i prosty w stosowaniu.
Stosowany tu termin „enzym reporterowy” lub (zamiennie) „enzym markerowy” odnosi się do enzymu wytwarzającego sygnał, tj. enzymu, którego aktywność wywołuje wykrywalną zmianę. Takie enzymy reporterowe obejmują korzystnie następujące enzymy: peroksydazy, fosfatazy, oksydoreduktazy, dehydrogenazy, transferazy, izomerazy, kinazy, reduktazy,
180 526 deaminazy, katalazy, ureazy i glukuronidazy. Przy wyborze enzymu reporterowego do stosowania w sposobie według wynalazku bardzo ważne jest, aby enzym ten nie ulegał deaktywacji przez jakikolwiek czynnik obecny w próbce, w tym aby nie ulegał deaktywującej hydrolizie przez aktywność hydrolazową w próbce. Wybór odpowiedniego enzymu reporterowego lub markerowego jest oczywisty dla fachowca. Korzystnymi enzymami reporterowymi są peroksydazy, takie jak np. peroksydaza chrzanowa.
Enzym reporterowy jest immobilizowany na stałym nośniku, tj. na nierozpuszczalnym polimerycznym materiale, nieorganicznej lub organicznej matrycy, żelu, agregacie, precypitacie lub żywicy, w taki sposób, że po działaniu hydrolazy, której obecność się wykrywa, enzym uwalnia się. Korzystne stałe nośniki zgodnie z wynalazkiem, obejmują, ale nie są do nich ograniczone: celulozę, agarozę, dekstran, poliakrylan, poliakryloamid lub ich pochodne, chitynę, sefarozę, perełki oksiranoakrylowe i polimeryczny dialdehyd, skrobię, kolagen, keratynę, elastynę, sproszkowaną skórę bydlęcą, peptydoglikan ze ścianek komórek bakteryjnych lub jego fragmenty, nylon, politereftalan etylenu, poliwęglan i szkło porowate. Immobilizowanie enzymu reporterowego na stałym nośniku przeprowadza się stosując konwencjonalne metody i procedury znane i zrozumiałe dla fachowców.
Enzym reporterowy może być związany bezpośrednio ze stałym nośnikiem. W tym przypadku nierozpuszczalny nośnik służy bezpośrednio jako substrat dla hydrolazy. Na przykład, gdy badaną hydrolazą jest chitynaza, enzym reporterowy lub markerowy (taki jak np. peroksydaza chrzanowa) może być związany bezpośrednio z nierozpuszczalną chityną. W obecności chitynazy peroksydaza chrzanowa będzie uwalniana ze stałego nośnika.
Podobnie, jeśli wykrywaną hydrolazą jest celulaza, enzym reporterowy, np. peroksydaza chrzanowa, może być związany bezpośrednio z celulozą i w obecności hydrolazy-celulazy, peroksydaza będzie uwalniana ze stałego nośnika.
W końcu, jeżeli wykrywaną hydrolaząjest lizozym enzym reporterowy, np. peroksydaza chrzanowa, może być związany bezpośrednio z peptydoglikanem ze ścianek komórek bakteryjnych i w obecności hydrolazy-lizozymu, peroksydaza będzie uwalniana ze stałego nośnika.
Alternatywnie, enzym reporterowy może być immobilizowany na stałym nośniku poprzez cząsteczkę wiążącą, którą stanowi ulegający hydrolizie substrat dla wykrywanej hydrolazy. Takie cząsteczki wiążące obejmują, ale nie są do nich ograniczone: białka, węglowodany, lipidy, peptydy, estry i kwasy nukleinowe. Korzystnym białkiem jest azokazeina, kazeina, kappa-kazeina, immunoglobulina, hemoglobina, mioglobina, albumina, elastyna, keratyna lub kolagen. Wybór określonej cząsteczki wiążącej, którą stosuje się w celu połączenia enzymu reporterowego ze stałym nośnikiem, będzie zależał od wykrywanej hydrolazy i w danym przypadku będzie oczywisty dla fachowca.
Stosowany tu termin „indykator” dotyczy dowolnej substancji chemicznej, która ulega wykrywalnej zmianie, w wyniku reakcji lub w wyniku kulminacji reakcji, które przebiegają, gdy w próbce lub badanym materiale obecna jest enzymatycznie aktywna hydrolaza. Uzyskana wykrywalna zmiana wskazuje, że w próbce lub badanym materiale obecna jest enzymatycznie aktywna hydrolaza.
Korzystne są indykatory wizualne, a zwłaszcza indykatory chromogenowe, tzn. takie, w których widoczną zmianą jest zmiana barwy, w tym zabarwienie się materiału, który normalnie jest bezbarwny, pod wpływem działania enzymu reporterowego lub markerowego, który jest uwalniany ze stałego nośnika przez enzymatycznie aktywną hydrolazę, której obecność wykrywa się. Alternatywnie, enzym reporterowy po uwolnieniu ze stałego nośnika przez działanie hydrolazy może być zdolny do katalizowania powstawania sygnału fluoroscencyjnego, fosforescencyjnego, bioluminiscencyjnego, chemiluminiscencyjnego lub elektrochemicznego. Ponadto, enzym reporterowy może być zdolny do dawania innych widocznych lub wykrywalnych sygnałów, takich jak np. powstawanie skrzepów, aglutynacja, wytrącenie osadu lub
180 526 klarowanie. W tych przypadkach indykatorem jest substancja chemiczna lub substrat, który jest wymagany aby enzym reporterowy lub markerowy doprowadził do żądanej wykrywalnej zmiany.
Wiele różnych indykatorów chromogenowych (tj. chromogenów) i innych substancji o podobnym działaniu można stosować jako indykatory wizualne z peroksydazą chrzanową jako enzymem reporterowym. Korzystne indykatory chromogenowe zgodnie z wynalazkiem obejmują wodoronadtlenek i chromogen, włącznie z jednym z następujących ale nie ograniczonych do takich związków: żywica gwąjakowa, kwas 2,2'-azyno-bis(3-etylo-benztiazolino-6-sulfonowy), tetrametylobenzydyna, fenol, 4-aminoantypiryna i kwas 4,5-dihydroksynaftaleno-2,7-disulfonowy. Szczególnie korzystny indykator chromogenowy obejmuje wodoronadtlenek i żywicę gwajakową, chromogen, który jest bezbarwny w stanie zredukowanym i ma głęboko niebieski kolor w stanie utlenionym. Żywicę gwajkową można ewentualnie oczyścić przed użyciem, np. przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem. Najodpowiedniejszy indykator chromogenowy dla danego enzymu reporterowego zależy od reakcji, którą lub które ten enzym może katalizować lub inicjować, a wybór w danym przypadku będzie oczywisty dla fachowców.
Jeżeli jako wizualny indykator stosuje się indykator chromogenowy, może to być ciekły lub stały układ chromogenowy. Jeżeli do wykrywania peroksydaz stosuje się ciekły układ chromogenowy, wówczas powinien on zawierać rozpuszczalnik, wodoronadtlenek i chromogen, który może być utleniony przez wodoronadtlenek w obecności peroksydazy, takiej jak np. peroksydaza chrzanowa. Alternatywnie, jeżeli stosuje się stały układ chromogenowy powinien on zawierać wodoronadtlenek, chromogen, który może być utleniony przez wodoronadtlenki w obecności peroksydazy i stały nośnik, nasycony chromogenem lub, na którym chromogen jest immobilizowany i wysuszony. W tym układzie chromogenem może być nasycona bibuła lub nośnik, tak jak to się robi z arkuszami HemoccultR lub alternatywnie chromogen może być osadzony na arkuszu z tworzywa sztucznego lub innym, w postaci cienkiej warstwy. W tym drugim przypadku można wytworzyć warstwę chromogenu z roztworu zawierającego materiał polimeryczny (taki jak np. hydroksypropyloceluloza, etyloceluloza itd.). Jeżeli sam chromogen jest rozpuszczalny w wodzie, może być zamknięty w matrycy z materiału, który jest nierozpuszczalny w wodzie. Alternatywnie, jeżeli sam chromogen jest nierozpuszczalny w wodzie może być naniesiony w postaci roztworu w rozpuszczalniku organicznym ewentualnie w kombinacji z polimerem rozpuszczalnym lub nierozpuszczalnym w wodzie.
W stałym układzie chromogenowym do wykrywania peroksydaz wodorotlenek może być w postaci stałej (jak np. wodoronadtlenek tytanu) albo może być wytworzony in situ. Nadtlenek wodoru np. może być wytworzony in situ z glukozy, tlenu z otoczenia i oksydazy glukozowej. Alternatywnie, nadtlenek wodoru może być wytworzony in situ przez wykorzystanie wysuszonej warstwy utworzonej po osadzeniu zawiesiny nadboranu sodu w alkoholu. Przy niskim pH nadboran sodu uwalnia spontanicznie nadtlenek wodoru. W obecności nadtlenku wodoru i peroksydazy po uwolnieniu jej przez hydrolazę ze stałego nośnika, chromogen zostanie utleniony, w związku z czym wystąpi widoczna zmiana barwy. Ta zmiana barwy świadczy, że w próbce lub badanym materiale jest obecna enzymatycznie aktywna hydrolaza.
Sposób według wynalazku może być stosowany do równoczesnego oznaczania obecności dwóch lub więcej aktywnych hydrolaz w próbce lub badanym materiale. Należy wówczas stosować mieszaninę dwóch lub więcej enzymów reporterowych immobilizowanych na stałym nośniku (nośnikach) przez wiązania z substratem, które są podatne na specyficzne hydrolazy oraz dwa lub więcej indykatory i układy reagentów do wytwarzania wykrywalnej odpowiedzi dla każdego enzymu reporterowego. Na przykład, sposób według wynalazku można byłoby stosować do wykrywania równocześnie mieszaniny proteaz, lipaz i polisacharydaz, otrzymując w ten sposób hydrolityczny profil danego patogenu lub procesu chorobowego.
Dla fachowców jest oczywiste, że warunki reakcji (takie jak wybór cząsteczki wiążącej lub mostka, stałe nośniki, pH, pojemność buforu, rodzaj buforu, sole itd.) w sposobie według wynalazku można modyfikować i regulować w celu zwiększenia specyficzności hydrolazy
180 526 i zróżnicowania pomiędzy różnymi hydrolazami obecnymi w próbce. Na przykład wiadomo, że pewne hydrolazy działają przy niskim pH, a są hamowane przy wysokim pH. Inne hydrolazy natomiast działają przy wysokim pH, a hamowane są przy niskim pH. Regulując pH podczas testu można selektywnie wykryć obecność konkretnej hydrolazy. Dla fachowców jest to również oczywiste, że można także stosować specyficzne inhibitory enzymu w celu zwiększenia aktywności hydrolazy i specyficzności oraz w celu zróżnicowania różnych hydrolaz.
W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku wykrywalną hydrolaząjest enzymatycznie aktywna proteaza asparaginianowa, a metoda ta obejmuje: umieszczenie próbki w urządzeniu, które zawiera pierwszy i drugi stały nośnik, przy czym pierwszy stały nośnik jest poliakrylanem i zawiera peroksydazę chrzanową immobilizowaną na nim przez cząsteczkę mioglobiny, która jest substratem dla proteazy asparaginianowej, drugi stały nośnik, który nie kontaktuje się z pierwszym stałym nośnikiem, jest pochodną celulozy i zawiera immobilizowany na nim wodoronadtlenek i żywicę gwajakową, chromogen, który zmienia barwę po działaniu peroksydazy chrzanowej w obecności wodoronadtlenku, a próbka umieszczona jest tak w urządzeniu, że kontaktuje się z pierwszym i drugim stałym nośnikiem, wobec czego peroksydaza chrzanowa uwolniona przez enzymatycznie aktywną proteazę asparaginianową występującą w próbce, może dyfundować przez próbkę do drugiego stałego nośnika; oraz obserwowanie czy żywica gwajakowa zmienia barwę, co wskazuje na obecność enzymatycznie aktywnej proteazy asparaginianowej w próbce.
Jak wspomniano uprzednio, dla fachowców jest oczywiste, że można stosować określone warunki reakcji (takie jak wybór cząsteczki wiążącej lub mostka, stałe nośniki, pH, pojemność buforu, rodzaj buforu, sole itd.) i specyficzne inhibitory w celu zwiększenia specyficzności proteazy asparaginianowej. Na przykład, w próbie na proteazę asparaginianową przy pH około 2,5 do około 5,0, można selektywnie wykryć tę proteazę wśród wielu proteaz: holowej, serynowej, metaloproteaz i proteaz alkalicznych. Ponadto, dodając inhibitory metaloproteaz, proteazy tiolowej, serynowej i proteaz kwaśnych lub alkalicznych, można selektywnie wykryć proteazy asparaginianowe.
Wykrywając obecność enzymatycznie aktywnej proteazy asparaginianowej w próbce sposobem według wynalazku można wykryć kandydozę.
Jedną z hydrolaz jest też proteaza tiolowa, która może służyć jako marker do wykrywania Trichomonas vaginalis.
Jak w teście na proteazę asparaginianową można stosować pewne warunki reakcji i specyficzne inhibitory w celu zwiększenia aktywności i specyficzności proteazy tiolowej. Na przykład do układu można dodawać inhibitorów (takich jak pepstatyna do hamowania proteaz asparaginianowych, inhibitor trypsynowy z soi do hamowania trypsyny, EDTA lub inne środki chelatujące do hamowania metaloproteaz, lub dowolne z wielu znanych występujących naturalnie inhibitorów nietiolowych proteaz białkowych) i wówczas będą działały i wobec tego będą wykryte tylko proteazy tiolowe.
Ponadto, gdy test przeprowadza się przy pH około 7,4 wiele proteaz holowych jest wówczas aktywnych, ale proteazy asparaginianowe będą ulegały deaktywacji.
Wynalazek dotyczy także stanowiącego całość (ang. „self-contained”) urządzenia testowego do badania na obecność enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce, które obejmuje:
(a) naczynko określone przynajmniej w części przez pierwszą i drugą ściankę położone naprzeciw siebie z wykładziną na wewnętrznych powierzchniach i szczeliną między nimi, przy czym jedna lub obie ścianki wykonane są z materiału przepuszczającego światło, a w górnej ściance znajduje się otwór do wprowadzania próbki i ewentualnie otwory wentylacyjne;
(b) stały nośnik na wewnętrznej powierzchni pierwszej lub drugiej ścianki z immobilizowanym na nim enzymem reporterowym, który się uwalnia po działaniu hydrolazy;
(c) wykładzinę na wewnętrznej powierzchni pierwszej lub drugiej ścianki z zawartym w niej indykatorem, który ulega wykrywalnej zmianie po działaniu enzymu reporterowego.
Urządzenie według wynalazku obejmuje enzym reporterowy immobilizowany na stałym nośniku, indykator i jeden lub więcej innych reagentów w suchej postaci w warstwowej
180 526 płytce z wewnętrzną komorą, która jest pusta aż do umieszczenia w niej próbki. Dla wygody części płytki i rozmieszczenie w niej funkcjonalnych substancji chemicznych będą opisywane w odniesieniu do pozycji poziomej, ponieważ jest to najbardziej prawdopodobna pozycja płytki podczas stosowania urządzenia. W takim położeniu płytki, zwłaszcza w przypadku korzystnych płytek według wynalazku, które są cienkie i płaskie, próbkę umieszcza się w komorze przez otwór w gómej ściance naczynka. Najwyższa warstwa płytki w tej pozycji, przez którą wprowadza się próbkę, będzie określana jako wierzchnia warstwa, a dolna powierzchnia tej warstwy będzie tworzyć górną powierzchnię komory. Podobnie najniższa warstwa płytki będzie określana jako spodnia warstwa płytki, a górna jej powierzchnia będzie tworzyć dolną powierzchnię komory. Cienkie krawędzie wzdłuż obwodu tych warstw wierzchniej i spodniej będą określane jako krawędzie boczne płytki, a cienkie boczne ograniczenia komory wzdłuż krawędzi jej gómej i dolnej powierzchni będą określane jako ścianki boczne komory. Regiony danej powierzchni, które przylegają do siebie w tej samej poziomej płaszczyźnie będą określane jako przylegające poziomo, natomiast warstwa nałożona bezpośrednio na inne warstwy i tworząca równoległą poziomą płaszczyznę będzie określana jako przylegająca pionowo.
Wierzch, spód lub obie warstwy płytki są wytworzone z przepuszczającego światło, korzystnie przezroczystego materiału. Enzym reporterowy immobilizowany na stałym nośniku, indykator i inne składniki i reagenty potrzebne do testu umieszcza się w jednej lub więcej warstwach w obrębie komory albo w postaci powłok na gómej powierzchni komory albo jako powłoki na dolnej powierzchni komory albo na obydwu. Indykator jest dowolną substancją chemiczną która ulega wykrywalnej zmianie, zwykle zmianie kolom, po działaniu enzymu reporterowego, wówczas gdy zostaje on uwolniony ze stałego nośnika przez enzymatycznie aktywną hydrolazę, której obecność się wykrywa. Warstwa zawierająca indykator może być na gómej i dolnej powierzchni komory. Jeden lub więcej reagentów potrzebnych do testu może być w tej samej warstwie, co indykator, lub w innych warstwach, na tej samej lub na przeciwnej powierzchni. W pewnych korzystnych wykonaniach wynalazku indykator znajduje się w warstwie znajdującej się bezpośrednio pod ścianką przepuszczającą światło, a enzym reporterowy immobilizowany na stałym nośniku jest zawarty w warstwie nałożonej na przeciwległą ściankę.
Reagenty znajdujące się w warstwach mogą być tak dobrane, że do przeprowadzenia testu potrzebny jest tylko dodatek próbki plus minimalnej liczby dodatkowych odczynników takich jak np. wywoływacz. Jednak w szczególnie korzystnych wykonaniach warstwy zawierają wszystkie reagenty poza próbką tak że przeprowadzenie testu wymaga jedynie dodania próbki.
Wszystkie warstwy są stałe przed kontaktowaniem z próbką a warstwa zawierająca indykator korzystnie stanowi kompozycję, która jest nierozpuszczalna w ciekłej próbce, dla której jest przeznaczony test i w ten sposób indykator pozostaje w warstwie przez cały czas trwania testu. Zatem dla próbek w środowisku wodnym lub w środowisku rozpuszczalnym w wodzie korzystna warstwa indykatora stanowi albo indykator nierozpuszczalny w wodzie albo indykator w matrycy, która jest nierozpuszczalna w wodzie. Gdy indykator jest w cienkiej zatężonej warstwie bezpośrednio pod ścianką przepuszczającą światło, jego zmiana, którą można wykryć przez ściankę przepuszczającą światło, następuje w krótkim czasie, co daje zarówno wysoką czułość, jak i szybki wynik.
Wynalazek niniejszy może być dostosowany do wykorzystania w testach na bardzo różne hydrolazy w próbkach z bardzo różnych źródeł. Test może obejmować albo pojedynczą reakcję albo sekwencję reakcji, których kulminacyjny punkt stanowi wykrywalna zmiana indykatora, a liczba i typ reagentów i reakcji będą zmieniać się odpowiednio w różnych testach w zależności od tego, jaką hydrolazę się wykrywa. W niektórych przypadkach otrzymuje się najlepsze wyniki, gdy wstępnie naniesione reagujące substancje chemiczne są rozdzielone pomiędzy górną i dolną powierzchnię komory, wobec czego są rozdzielone szczeliną aż do wypełnienia tej szczeliny przez badaną próbkę. W innych przypadkach substancje reagujące można umieścić we wspólnej warstwie lub w dwóch lub więcej różnych ale pionowo przylegających warstwach na górnej i dolnej powierzchni komory bez straty w rzetelności testu.
180 526
We wszystkich jednak przypadkach warstwy są tak ułożone, że reakcje, w których punktem szczytowym jest wykrywalna zmiana indykatora, przebiegają tylko wówczas, gdy komora jest wypełniona badaną próbką oraz, że kiedy nastąpi już zmiana indykatora, jest ona korzystnie ograniczona do warstwy bezpośrednio przylegającej do ścianki przepuszczającej światło.
W korzystnych wykonaniach wynalazku urządzenie do testu obejmuje wbudowaną próbkę kontrolną dodatnią, wbudowaną próbkę kontrolną ujemną lub obie, które są aktywowane dodatkiem jednego materiału. Aktywację tych próbek kontrolnych przeprowadza się równocześnie z prowadzeniem testu, a wykrywalne wskazanie (takie jak np. zmiany koloru lub brak takich zmian) dla obu próbek, kontrolnej i badanej, uzyskuje się po jednokrotnym wprowadzeniu materiału do urządzenia i wykrywa się je przez przepuszczającą światło ściankę. Próbka kontrolna zajmuje w urządzeniu pozycję, która jest poziomo przylegająca do badanego obszaru, z odpowiednimi wskazaniami na górnej lub dolnej powierzchni urządzenia, korzystnie na górnej, aby zidentyfikować próby kontrolne i odróżnić je od badanej. Same próby kontrolne zwykle składają się z dalszych warstw zawierających reagenty lub inne odpowiednie substancje, które albo będą wywoływać wykrywalną zmianę w indykatorze, albo będą zapobiegać występowaniu zmiany i będą tak działać tylko wówczas, gdy obecna jest badana próbka i niezależnie od obecności bądź nieobecności hydrolazy w badanej próbce. Wybór tych prób kontrolnych i mechanizmy chemiczne, według jakich działają, jak również decyzja czy warstwy te należy umieścić na tej samej powierzchni komory co indykator czy na przeciwnej, zależy od testu.
Inne korzystne wykonania wynalazku zawierają dodatkowe cechy, które wzmagają sprawność testu. Dla próbek opartych na wodzie włączenie środka powierzchniowo czynnego do warstw bezpośrednio przylegających do szczeliny, która ma być wypełniona próbką, będzie poprawiało zwilżenie warstwy próbką i szybkie i równomierne wypełnienie komory. Środek powierzchniowo czynny może być jedynym funkcjonalnym składnikiem w warstwie lub może występować w warstwie w kombinacji z odczynnikami do testu. Korzystnie oba boki szczeliny są wyłożone warstwami, w których jest środek powierzchniowo czynny. Urządzenie obejmuje otwór do wprowadzenia próbki, co pozwala na umieszczenie próbki bezpośrednio w komorze, a w korzystnych wykonaniach wynalazku w komorze znajduje się jeden lub więcej otworów odpowietrzających umieszczonych niezależnie od otworu do wprowadzania próbki w celu ułatwienia wypełnienia komory.
Inne cechy, cele i zalety wynalazku i jego korzystne wykonanie będą w sposób oczywisty wynikać z następującego opisu.
Naczynko korzystnie jest płaskie i cienkie i ma wymiary, które pozwalają łatwo je trzymać w ręku. Komora korzystnie jest płaska i płytka, przy czym jej szerokość i długość są znacznie większe niż głębokość, a głębokość jest zasadniczo stała. Komora korzystnie jest na tyle płytka, aby nastąpiło spontaniczne zwilżenie jej ścianek przez badany materiał i osiągnięty był maksymalny kontakt między badanym materiałem i powłokami suchych reagentów na górnej i dolnej powierzchni. Jest to szczególnie ważne, gdy powłoki reagentów znajdują się na obu powierzchniach komory, górnej i dolnej. W takich przypadkach, mała stała odległość między tymi powierzchniami będzie także minimalizować odległość, przez którą reagenty na powierzchni przeciwnej w stosunku do tej, na którąjest naniesiony wizualny indykator, będą musiały dyfundować, aby dotrzeć do indykatora.
Jednak głębokość komory nie jest cechą krytyczną wynalazku i może się zmieniać. W większości przypadków, przy głębokości komory w zakresie od około 0,0076 - 0,127 cm, korzystnie od około 0,0127 - 0,0381 cm, uzyskuje się najlepsze wyniki. Przy danej głębokości wymiary poprzeczne komory (tzn. odległość między bocznymi ściankami) będą określać wielkość próbki, którą może pomieścić urządzenie, a poza tym ważne są tylko o tyle, że określają wielkość i kształt widocznego obszaru na zewnętrznej powierzchni urządzenia. Poprzeczne wymiary powinny być zatem takie, aby testowany obszar był na tyle duży, aby był widoczny, ale jednak na tyle mały, aby komora, która będzie całkowicie wypełniona badanym materiałem, miała rozsądną wielkość. Wielkość próbki zmienia się w zależności od typu badanego
180 526 materiału, jego źródła i sposobu pobierania próbki. W typowych strukturach boczna powierzchnia komory jest w zakresie od około 0,1 cm2 do około 10 cm2 lub korzystnie od około 0,3 cm2 do około 3 cm2. Wewnętrzna objętość komory w typowych strukturach będzie zmieniać się podobnie, a dla większości typów próbek najbardziej odpowiednie i dogodne objętości są w zakresie od około 3 pl do około 300 pl.
Urządzenie testowe według wynalazku może być stosowane do badania na obecność dowolnego znanego enzymu hydrolitycznego obejmującego, ale nie wyłącznie: proteazy lub (zamiennie) proteinazy, peptydazy, lipazy, nukleazy, homo- lub hetero-oligosacharydazy, homo- lub hetero-polisacharydazy, fosfatazy, sulfatazy, neuraminidazy i esterazy. W korzystnym wykonaniu urządzenie testowe według wynalazku może być stosowane do wykrywania obecności proteaz, które obejmują ale nie wyłącznie, następujące enzymy: proteazy asparaginianowe, serynowe, tiolowe, metaloproteazy, proteazy kwaśne i alkaliczne. W innym korzystnym wykonaniu urządzenie testowe według wynalazku można stosować do wykrywania obecności homo- lub hetero-oligosacharydaz lub homo- lub hetero-polisacharydaz, włącznie ale nie wyłącznie, z chitynazą amylazą celulazą i lizozymem.
Enzym reporterowy lub markerowy stosowany w urządzeniu testowym może być dowolnym enzymem wytwarzającym sygnał, tj. enzymem, którego aktywność wywołuje wykrywalną zmianę, który nie ulega deaktywacji przez żaden czynnik w próbce, w tym także nie ulega deaktywującej hydrolizie przez aktywność hydrolazową obecną w próbce. Takie enzymy reporterowe obejmują ale nie wyłącznie: peroksydazy, fosfatazy, oksydoreduktazy, dehydrogenazy, transferazy, izomerazy, kinazy, reduktazy, deaminazy, katalazy, ureazy i glukuronidazy. Wyrób odpowiedniego enzymu reporterowego lub markerowego jest oczywisty dla fachowca. Korzystnymi enzymami reporterowymi są peroksydazy, takie jak np. peroksydaza chrzanowa.
Enzym reporterowy jest immobilizowany na pierwszym stałym nośniku, tj. na nierozpuszczalnej matrycy, żelu lub żywicy, w taki sposób, że uwalnia się z tego nośnika po działaniu hydrolazy, której obecność się wykrywa. Korzystne stałe nośniki zgodnie z wynalazkiem, obejmują ale nie są do nich ograniczone: celulozę, agarozę, dekstran, poliakrylan, poliakryloamid lub ich pochodne, chitynę, sefarozę, perełki oksiranoakrylowe i polimeryczny dialdehyd, skrobię, kolagen, keratynę, elastynę, sproszkowaną skórę bydlęcą peptydoglikan ze ścianek komórek.bakteryjnych lub jego fragmenty, nylon (poliamid) politereftalany etylenu, poliwęglany i szkło porowate. Immobilizowanie enzymu reporterowego na pierwszym stałym nośniku przeprowadza się stosując konwencjonalne metody i procedury znane i zrozumiałe dla fachowców.
Enzym reporterowy może być związany bezpośrednio z pierwszym stałym nośnikiem lub alternatywnie może być immobilizowany na pierwszym stałym nośniku poprzez cząsteczkę wiążącą która zawiera ulegające hydrolizie wiązanie i stanowi substrat dla wykrywanej enzymatycznie aktywnej hydrolazy. Takie cząsteczki wiążące obejmują ale nie są do nich ograniczone: białka, węglowodany, lipidy, peptydy, estry i kwasy nukleinowe. Wybór określonej cząsteczki wiążącej, którą stosuje się w celu połączenia enzymu reporterowego ze stałym nośnikiem będzie zależał od wykrywalnej hydrolazy i w danym przypadku będzie oczywisty dla fachowca.
W urządzeniu testowym według wynalazku indykator jest immobilizowany na drugim stałym nośniku, który nie jest w kontakcie z pierwszym stałym nośnikiem. Korzystne stałe nośniki zgodnie z wynalazkiem, obejmują ale nie są do nich ograniczone: celulozę, agarozę, dekstran, poliakrylan, poliakryloamid lub ich pochodne, chitynę, sefarozę, perełki oksiranoakrylowe i polimeryczny dialdehyd, skrobię, kolagen, keratynę, elastynę, sproszkowaną skórę bydlęcą peptydoglikan ze ścianek komórek bakteryjnych lub jego fragmenty, nylon (poliamid), politereftalany etylenu, poliwęglany i szkło porowate. Immobilizowanie indykatora na drugim stałym nośniku przeprowadza się stosując konwencjonalne metody i procedury znane specjalistom.
Indykator może być dowolną substancją chemiczną która ulega wykrywalnej zmianie, w wyniku reakcji lub w wyniku kulminacji reakcji, które przebiegają gdy w próbce lub badanym
180 526 materiale obecna jest enzymatycznie aktywna hydrolaza. Uzyskana wykrywalna zmiana wskazuje, że w próbce lub badanym materiale obecna jest enzymatycznie aktywna hydrolaza.
Korzystne są indykatory wizualne, a zwłaszcza indykatory chromogenne, tzn. takie, w których widoczną zmianą jest zmiana barwy, w tym zabarwienie się materiału, który normalnie jest bezbarwny, pod wpływem działania enzymu reporterowego lub markerowego, który jest uwalniany ze stałego nośnika przez enzymatycznie aktywną hydrolazę, której obecność wykrywa się. Alternatywnie, enzym reporterowy po uwolnieniu ze stałego nośnika przez działania hydrolazy może być zdolny do katalizowania powstawania sygnału fluoroscencyjnego, fosforescencyjnego, bioluminiscencyjnego, chemiluminiscencyjnego lub elektrochemicznego. Ponadto, enzym reporterowy może być zdolny do dawania innych widocznych lub wykrywalnych sygnałów, takich jak np. powstawanie skrzepów, aglutynacja, wytrącenie osadu lub klarowanie. W tych przypadkach indykatorem jest substancja chemiczna lub substrat, który jest wymagany aby enzym reporterowy lub markerowy doprowadził do żądanej wykrywalnej zmiany.
Wiele różnych indykatorów chromogenowych (tj. chromogenów) i innych substancji o podobnym działaniu można stosować jako indykatory wizualne. Gdy jako enzymy reporterowe lub markerowe stosuje się peroksydazy, korzystne indykatory chromogenowe obejmują wodoronadtlenek i chromogen, włącznie z jednym z następujących ale nie ograniczonych do takich związków: żywica gwajakowa, kwas 2,2'-azyno-bis (3-etylo-benztiazolino-6-sulfonowy), tetrametylobenzydyna, fenol, 4-aminoantypiryna i kwas 4,5-dihydroksynaftaleno-2,7-disulfonowy. Szczególnie korzystny indykator chromogenowy obejmuje wodoronadtlenek i żywicę gwajakową, chromogen, który jest bezbarwny w stanie zredukowanym i ma głęboko niebieski kolor w stanie utlenionym. Żywicę gwajakową można ewentualnie oczyścić przed użyciem, np. przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem. Najodpowiedniejszy indykator chromogenowy dla danego enzymu reporterowego zależy od reakcji, którą lub które ten eznym może katalizować lub inicjować, a wybór w danym przypadku będzie oczywisty dla fachowców.
Jeżeli jako wizualny indykator stosuje się indykator chromogenowy, wówczas stosuje się stały układ chromogenowy. Taki stały układ chromogenowy zawiera wodoronadtlenek, chromogen, który może być utleniony przez wodoronadtlenki w obecności peroksydazy i stały nośnik, nasycony chromogenem lub, na którym chromogen jest immobilizowany i wysuszony. W tym układzie chromogenem może być nasycona bibuła lub nośnik, tak jak to się robi z arkuszami Hemoccult® lub alternatywnie chromogen może być osadzony na arkusz z tworzywa sztucznego lub innym, w postaci cienkiej warstwy. W tym drugim przypadku można wytworzyć warstwę chromogenu z roztworu zawierającego materiał polimeryczny (taki jak np. hydroksypropyloceluloza, etyloceluloza itd.). Jeżeli sam chromogen jest rozpuszczalny w wodzie, może być zamknięty w matrycy z materiału, który jest nierozpuszczalny w wodzie. Alternatywnie, jeżeli sam chromogen jest nierozpuszczalny w wodzie może być naniesiony w postaci roztworu w rozpuszczalniku organicznym ewentualnie w kombinacji z polimerem rozpuszczalnym lub nierozpuszczalnym w wodzie.
W tym konkretnym układzie chromogenowym wodorotlenek może być w postaci stałej (jak np. wodoronadtlenek tytanu) albo może być wytworzony in situ w urządzeniu. Nadtlenek wodoru np. może być wytworzony in situ przez nałożenie warstwy wysuszonej glukozy i oksydazy glukozy na wewnętrzne powierzchnie urządzenia testowego. Alternatywnie, nadtlenek wodoru można wytworzyć in situ przez wytworzenie warstwy zawiesiny nadboranu sodu w alkoholu na wewnętrznych powierzchniach urządzenia testowego. Przy niskim pH nadboran sodu uwalnia spontanicznie nadtlenek wodoru. W obecności nadtlenku wodoru i peroksydazy (np. peroksydazy chrzanowej) po uwolnieniu jej przez hydrolazę ze stałego nośnika, chromogen zostanie utleniony, w związku z czym wystąpi widoczna zmiana barwy. Ta zmiana barwy świadczy, że w próbce lub badanym materiale jest obecna enzymatycznie aktywna hydrolaza.
Dla fachowców jest oczywiste, że warunki reakcji (takie jak np. wybór stałego nośnika i cząsteczki wiążącej, pH, pojemność buforowa, typ buforu, sole itd.) w zastrzeganym
180 526 urządzeniu testowym można modyfikować i regulować w celu zwiększenia aktywności i specyficzności hydrolazy i zróżnicowania między różnymi hydrolazami, które mogą być w próbce. Dla fachowców jest to oczywiste, że do zastrzeganych urządzeń testowych można dodawać specyficznych inhibitorów enzymów w celu zwiększenia aktywności i specyficzności hydrolazy i zróżnicowania między różnymi hydrolazami w próbce.
Urządzenie testowe zawiera otwór do wprowadzania próbki, przez który badany materiał umieszcza się w komorze. Otwór korzystnie jest w tej samej ściance, przez którą obserwuje się zmiany w wizualnym indykatorze, tj. w ściance przepuszczającej światło. Otwór ma kształt dostosowany do urządzenia stosowanego do przenoszenia próbki ze źródła, może zatem być zmieniony i dostosowany do urządzeń przenoszących różnego typu, których można używać. Przykładem urządzeń przenoszących są strzykawki, pipety, waciki na pałeczce lub drucie i wzierniki. Inne są łatwo dobierane przez specjalistów. Otwór kolisty zwykle jest odpowiedni dla takich środków przenoszących jak waciki; otwór może też mieć krawędź prostą o którą można drapać urządzenie przenoszące, aby ułatwić uwolnienie badanego materiału.
Korzystne wykonania urządzenia testowego mają dodatkowe cechy, które ułatwiają migrację płynu potrzebną do wypełnienia komory i umieszczenie wszystkich odczynników w kontakcie z badanym materiałem. Jedną z takich cech jest jeden lub więcej otworów w komorze, przez które wydostaje się powietrze. Otwory odpowietrzające są w odpowiedniej odległości od otworu do wprowadzania próbki, przy której uzyskuje się maksymalną powierzchnię zwilżalną przez badany materiał. W urządzeniu, w którym dodatnie i ujemne obszary kontrolne aktywowane badanym materiałem znajdują się w komorze w pozycjach poziomo przylegających do badanego obszaru, otwory odpowietrzające są tak rozmieszczone, aby zapewnić dotarcie materiału badanego do obu obszarów kontrolnych i wypełnienie ich unikając fałszywych lub niejednoznacznych odczytów. Jak to omówiono poniżej, korzystne jest umieszczenie w urządzeniu obszaru testowego pomiędzy obszarami kontrolnymi, tak że dodatnie i ujemne obszary kontrolne nie mają wspólnej granicy, a każdy ma wspólną granicę z obszarem testowanym. W takim układzie otwór do wprowadzania próbki najdogodniej jest umieszczony w ściance bezpośrednio nad obszarem testowanym i jeden otwór odpowietrzający nad każdym z dwóch obszarów kontrolnych przy lub w pobliżu zewnętrznych krańców tych obszarów, co powoduje, że badany materiał najpierw wypełnia obszar testowany, a następnie oba obszary kontrolne.
Inną cechą ułatwiającą migrację płynu w korzystnych wykonaniach wynalazku jest umieszczenie środka powierzchniowo czynnego na wewnętrznej powierzchni komory. Środek ten może być naniesiony na górną lub dolną powierzchnię komory, korzystnie na obie, i może być stosowany jako sucha substancja w matrycy stanowiącej najbardziej wewnętrzną warstwę lub powłokę na powierzchni. W niektórych przypadkach warstwa będzie także zawierać jeden lub więcej odczynników biorących udział w reakcjach w teście. W innych przypadkach, środek powierzchniowo czynny będzie jedynym funkcjonalnym składnikiem warstwy.
Środki powierzchniowo czynne są użyteczne dla materiałów opartych na wodzie, które stanowią większość materiałów biologicznych. Odpowiednie są takie środki powierzchniowo czynne, którym można nadać stałą postać, a mogą być też stosowane różne substancje, które mają działanie powierzchniowo czynne. Są to na ogół detergenty, środki zwilżające lub emulgatory, które mogą mieć różną strukturę chemiczną i różny charakter elektronowy i obejmują substancje anionowe, kationowe, obojnacze i niejonowe. Przykładem są alkilo-alkoksysiarczany, alkiloarylosulfoniany, estry gliceryny i kwasów tłuszczowych, pochodne oparte na lanolinie, polioksyetylenowane alkilofenole, polioksyetylenowane aminy, polioksyetylenowane kwasy tłuszczowe i estry, polioksyetylenowane alkohole tłuszczowe i etery, kwasy poli (etylenoglikolo) tłuszczowe i estry, polioksyetylenowane estry tłuszczowe i oleje, kondensaty polioksypropylen/polioksyetylen i polimery blokowe, estry sorbitanu i kwasów tłuszczowych, pochodne sulfonowe bursztynianów, alkiloglukozydy i pochodne kwasu cholowego. Produkty wchodzące w zakres niektórych z wymienionych klas mają następujące nazwy handlowe: Lubrol, Brij, Tween, Tergitol, Igepal, Triton, Teepol i wiele innych.
180 526
Wytwarzanie stałych warstw, zarówno z indykatorem, jak i z odczynnikami, można przeprowadzać przez nakładanie materiału warstwy w postaci ciekłej, po czym suszenie lub zestalanie w inny sposób. Ciekłą formą substancji może być np. roztwór, zawiesina lub nieutwardzony ciekły stan substancji, a etapem zestalania może być odparowanie rozpuszczalnika lub utwardzenie substancji. Substancja może być połączona z dodatkowymi materiałami w różnym celu, jak np.:
1) aby ułatwić nakładanie cieczy na powierzchnię przez modyfikowanie lepkości cieczy,
2) aby pomóc w powstawaniu ciągłej, gładkiej lub stałej warstwy, która pozostaje jednorodna i nie rozpada się ani nie ulega granulacji podczas lub po nałożeniu na nią dodatkowej warstwy,
3) aby zmodyfikować rozpuszczalność warstwy w rozpuszczalnikach stosowanych do nakładania na nią innych warstw lub nadać warstwie rozpuszczalność w rozpuszczalnikach, które nie rozpuszczają warstw położonych pod nią lub we wszystkich powyższych celach równocześnie.
Do jednego lub wszystkich tych celów służą rozpuszczalne materiały polimeryczne jako korzystne dodatki, np. celuloza i różne jej pochodne z odpowiednio wybranymi podstawnikami, tak aby uzyskać żądane charakterystyki rozpuszczalności. W urządzeniach testowych przeznaczonych dla próbek wodnych lub opartych na wodzie, warstwa z indykatorem korzystnie zawiera indykator utrzymywany w matrycy, którą stanowi stały materiał nierozpuszczalny w wodzie. Zapobiega to migracji indykatora z warstwy i ucieczkę z powierzchni przepuszczającej światło. Alternatywnie, gdy sam indykator jest nierozpuszczalny w wodzie, sam będzie tworzył spójną warstwę, która utrzymuje się nienaruszona.
W tych wykonaniach według wynalazku, w których urządzenie obejmuje dodatni kontrolny indykator, ujemny kontrolny indykator lub oba indykatory, dla każdego obszaru kontrolnego będzie też obecny jeden lub więcej dodatkowych odczynników. Te dodatkowe odczynniki albo będą włączone do jednej z warstw występujących w poziomo określonej części tej warstwy lub będą naniesione jako oddzielne pionowo przylegające warstwy nad poziomo określoną częścią istniejącej warstwy. Zatem, dzięki ich pozycji w komorze, te dodatkowe odczynniki określają obszary kontrolne, które są poziomo oddzielone od siebie i od obszaru testowanego.
Wybór odpowiedniego odczynnika dla dodatniej lub ujemnej kontroli będzie zależał od hydrolazy, na którą test jest skierowany, od typu wizualnego indykatora stosowanego do wykrywania obecności hydrolazy oraz od tego, czy reagent ma służyć jako kontrola dodatnia lub ujemna.
Przy wykorzystaniu znanej wiedzy z dziedziny chemii, wybór odpowiedniego odczynnika w większości przypadków będzie oczywisty dla specjalistów. Odczynnik do kontroli dodatniej np. może być próbką samej hydrolazy, analogu hydrolazy lub inną dowolną substancją z podobnym sposobem działanią który inicuje lub indukuje reakcję lub sekwencję reakcji, których punktem kulminacyjnym jest wykrywalna zmiana w indykatorze. Warstwa zawierająca ten odczynnik będzie albo na górnej albo dolnej powierzchni komory, pod warunkiem, że odczynnik nie zainicjuje ani nie wywoła wykrywalnej zmiany, dopóki badany materiał jest obecny, ale zrobi to niezależnie od obecności bądź nieobecności enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce. Odczynnik do kontroli ujemnej może być substancją hamującą taką jak środek denaturujący, hamujący lub inny czynnik deaktywujący, który zapobiega lub blokuje reakcję lub sekwencję reakcji i zapobiega w ten sposób wykrywalnej zmianie niezależnie od tego, czy w próbce lub badanym materiale jest czy nie jest obecna enzymatycznie aktywna hydrolaza.
Obie kontrolne próby są aktywowane, gdy badany materiał wprowadza się do urządzenia testowego. W niektórych przypadkach najbardziej skutecznie uzyskuje się to przez umieszczenie odczynników kontrolnych w warstwach na tej samej powierzchni, na której jest warstwa (warstwy) zawierająca inny odczynnik (odczynniki). W innych przypadkach uzyskuje się najlepsze wyniki, gdy odczynniki kontrolne są umieszczone w warstwach na przeciwnej
180 526 powierzchni komory, tej która zawiera inny reagent (reagenty) i w taki sposób odczynnik kontrolny i pozostały odczynnik (odczynniki) są rozdzielone szczeliną powietrza. W korzystnych wykonaniach obszary kontrolne w urządzeniu będą zawierały wszystkie składniki i odczynniki stosowane w obszarze testowanym z dodatkiem odczynników kontrolnych, albo włączonych do sekcji poziomych jednej lub więcej tych samych warstw stosowanych w obszarze testowym lub nałożonych jako oddzielne warstwy na takie poziomo określone sekcje. Aby uzyskać stałą ostrą granicę dla obszarów kontrolnych i zabezpieczyć odczynniki kontrolne przed aktywacją lub deaktywacją obszaru testowego, często korzystnie wytwarza się przerwy w warstwach przy granicach rozdzielających obszary kontrolne od testowych, co minimalizuje lub eliminuje możliwość poprzecznej dyfuzji odczynników kontrolnych poza ich odpowiednie obszary kontrolne. Takie przerwy w warstwach mogą być na górnej powierzchni lub na dolnej powierzchni lub na obu.
Jak wskazano powyżej, obszary kontrolne korzystnie aktywuje się tym samym materiałem badanym, którego używa się do testu. Dogodnie przeprowadza się to zestawiając obszary kontrolne jako przedłużenie obszaru testowego, przy czym wszystkie są w tej samej komorze w urządzeniu testowym, a przepływ płynu między różnymi obszarami nie napotyka trudności. W korzystnych wykonaniach, gdy urządzenie zawiera oba, dodatni i ujemny, obszary kontrolne, są one oddzielone od siebie obszarem testowym, umieszczonym między tymi dwoma. Wypełnienie wszystkich obszarów przy jednokrotnym nanoszeniu można uzyskać przez odpowiednie rozmieszczenie otworu do wprowadzania próbki i otworów odpowietrzających, jak opisano powyżej. Ponieważ wykrywalne zmiany lub ich brak wykrywa się przez ściankę przepuszczającą światło, identyfikację obszarów jako obszary kontrolne dodatnie i ujemne dogodnie przeprowadza się przez umieszczenie odpowiednich wskaźników na zewnętrznej powierzchni urządzenia.
Ścianki przepuszczające światło mogą być wykonane z dowolnego materiału, który jest obojętny i wystarczająco sztywny, aby utrzymać warstwę z indykatorem, ale jeszcze wystarczająco przepuszczalny dla światła, aby można było zauważyć zmianę indykatora od razu po jej wystąpieniu. Można stosować materiały półprzezroczyste lub przezroczyste, korzystnie nieabsorpcyjne, korzystnie materiały przezroczyste. Przykładem przezroczystych polimerycznych materiałów odpowiednich do tego zastosowania są politereftalany etylu (jak np. MylarR) i poliwęglany (jak np. LexanR). Przeciwna ścianka (tzn. spodnia) urządzenia podobnie może być wykonana z materiału półprzezroczystego lub przezroczystego, aczkolwiek może być także z materiału nieprzezroczystego, ponieważ widoczność wyników testów oraz kontroli dodatniej i ujemnej musi być tylko z jednej strony urządzenia. Gdy spodnia ścianka jest przezroczystą wykrywanie zmiany w obszarze testowym, w obszarach kontrolnych lub w obu przez górną ściankę, może być wzmocnione przez nałożenie druku lub powłoki na powierzchnię spodniej ścianki z barwnego lub odbijającego materiału, aby zwiększyć kontrast koloru.
Urządzenie testowe może być wytworzone różnymi sposobami. Arkusze polimerycznego materiału mogą być sklejone razem z odpowiednim wycinkiem określającym kształt komory i otworami na wprowadzenie próbki i odpowietrzającymi. Głębokość komory oraz jej kształt i wymiary poprzeczne będą zatem określone przez grubość centralnego arkusza, natomiast rozmieszczenie otworów będzie kontrolowane przez arkusz górny. Powłoki z indykatorem i odczynnikiem można nanosić na górny arkusz, spodni arkusz lub na oba, w zależności od potrzeb, przed zestawieniem arkuszy do laminowania. Arkusze można następnie połączyć razem konwencjonalnymi środkami, jak np. przez zgrzanie na gorąco lub za pomocą kleju.
Szczególnie korzystna metoda wytwarzania urządzenia obejmuje stosowanie jednego arkusza z przezroczystego lub innego przepuszczającego światło polimerycznego materiału, którego część jest wgnieciona lub w inny sposób obrabiana, mechanicznie lub chemicznie, tak aby uzyskać zagłębienie lub wyżłobienie o stałej głębokości w wewnętrznej powierzchni komory. To zagłębienie jest umieszczone na jednej połowie arkusza, podczas gdy na drugiej znajduje się otwór do wprowadzania próbki i otwory odpowietrzające. Powłoki z indykatorem i odczynnikiem nakładane są w odpowiednich miejscach na arkusz, a połowę z otworami
180 526 składa się na drugą połowę i tworzy się zamknięta komora i uzyskuje się prawidłowe ułożenie obszarów górnej i dolnej powierzchni komory. Powierzchnie czołowe arkusza są związane razem jak w laminacie według poprzedniego akapitu.
Korzystnym sposobem wiązania razem dwóch połówek jest zastosowanie kleju łączącego na gorąco, przylepcowego, opartego na wodzie lub rozpuszczalniku. Klej może być ograniczony do obszaru na obwodzie komory, aby uniknąć kontaktu z odczynnikami testowymi lub może pokryć całą powierzchnię arkusza i być naniesiony przed naniesieniem powłok z indykatorem i odczynnikiem. W tym drugim przypadku odpowiednie są kleje, które są przezroczyste, obojętne, zwilżalne przez warstwę, którą nakłada się na klej lub w inny sposób kompatybilne z tą warstwą. Istnieje wiele typów klejów odpowiednich do takiego zastosowania, a najodpowiedniejszy wybór zmienia się w różnych układach i zależy od warstw, które mają być nakładane na klej.
Wynalazek nie jest ograniczony do danej konkretnej konstrukcji urządzenia, a załączone rysunki, które nie są wykonane w skali, ilustrująjak takie urządzenie można skonstruować.
Figura 1 przedstawia perspektywiczny widok ilustracyjnego urządzenia do testu według wynalazku.
Figura 2 jest to widok boczny w częściowym przekroju części urządzenia przedstawionego na fig. 1.
Figura 1 przedstawia strukturę nośnikową urządzenia w widoku perspektywicznym, przed naniesieniem indykatora i odczynników i zamknięciem komory. Struktura podtrzymująca składa się z jednego arkusza 11 ze stosunkowo sztywnego, przezroczystego obojętnego chemicznie tworzywa sztucznego, z naciętą linią 12 określającą miejsce rozdzielenia arkusza na dwie połowy 13, 14, każdą o takiej samej długości i szerokości. Dolna połowa 13 zawiera wgłębienie o złożonym kształcie, koła 15 w centrum z dwoma prostokątnymi przedłużeniami 16, 17 rozciągającymi się w przeciwnych kierunkach. Górna połowa 14 zawiera 3 otwory: centralny 18, który służy jako otwór do wprowadzania próbki i dwa otwory 19, 20, które służą jako otwory odpowietrzające. Dwa otwory odpowietrzające 19, 20 są okrągłe, natomiast otwór do wprowadzania próbki 18 jest okrągły, ale z jedną prostą krawędzią, co ułatwia zeskrobywanie badanego materiału z wacika, który służy jako urządzenie przenoszące. Otwory są tak rozmieszczone, że gdy arkusz plastikowy złoży się wzdłuż 12 i wierzchnią połowę 14 umieści się w kontakcie ze spodnią połową 13, otwór do wprowadzania próbki 18, znajdzie się nad środkiem okrągłej części 15 wycięcie, a otwory odpowietrzające 19, 20 znajdą się nad dwoma prostokątnymi przedłużeniami 16, 17 przy najbardziej zewnętrznych ich krawędziach. Dwa prostokątne przedłużenia 16, 17 oznaczają w urządzeniu dodatni i ujemny obszar kontrolny.
Możliwe są liczne zmiany w urządzeniu według fig. 1. Dwa otwory 13, 14 mogą mieć różną długość lub szerokość lub różne oba wymiary z różnych powodów. Jedyną cechą krytycznąjest to, aby wgłębienie w dolnej połowie i otwory w górnej połowie były tak rozmieszczone w stosunku do linii działowej, że będą znajdować się we właściwym położeniu, gdy obie połowy złoży się wzdłuż linii dzielącej. Według innego przykładu, prostokątne przedłużenie 16, 17 w dolnej połowie struktury mogą dochodzić do obszaru kolistego (lub półkolistego) aby pasowały do otworów odpowietrzających w górnej połowie. Same otwory odpowietrzające mogą mieć dowolny kształt. Faktycznie, otwory odpowietrzające, które mają kształt inny niż otwór do wprowadzania próbki 18 mają tę zaletę, że zapobiegają pomyłce użytkownika przy wprowadzaniu próbki.
Figura 2 przedstawia poprzeczny przekrój urządzenia według fig. 1 i pokazuje komorę 31 w przekroju po naniesieniu powłok i dwie połówki położone jedna na drugiej i szczelnie razem złączone. Wewnętrzne powierzchnie każdej z dwóch połówek 13, 14 wykonanych z przezroczystego polimeru, są pokryte klejem 32, 33, odpowiednio. Bezpośrednio pod górną warstwą kleju 33 znajduje się warstwa zawierająca wizualny indykator 34, a poniżej tej warstwy warstwa z odczynnikiem 35. Należy zauważyć, że obie warstwy 34 i 35 mogą
180 526 rozciągać się na całej długości i szerokości komory, otaczając otwór do wprowadzania próbki 18 i rozciągając się na całą powierzchnię komory.
Obszar testowy i kontrolny w komorze są określone przez położenie powłok na dolnej ściance komory 13. Odczynnik do próby kontrolnej ujemnej jest zawarty w jednej powłoce 36, która znajduje się na dolnej powierzchni jednego z dwóch prostokątnych przedłużeń 16 w komorze (patrz fig. 1), a odczynnik do próby kontrolnej dodatniej jest zawarty w drugiej powłoce 37, podobnie usytuowanej w drugim prostokątnym przedłużeniu 17. Alternatywnie, odczynniki do prób kontrolnych mogą być umieszczone na górnej powierzchni komory a nie na dolnej. Jest to korzystne dla pewnych prób. Część dolnej powierzchni pod centralną kolistą częścią 15 komory (patrz fig. 1) pokrywa się warstwą 38, która albo może zawierać dodatkowy odczynnik stosowany w reakcji testowej albo może nie zawierać żadnego odczynnika. Zatem, jak w widoku z góry zamkniętego urządzenia kolisty obszar testowy 41 jest ograniczony przez prostokątny obszar kontroli ujemnej 42 i prostokątny obszar kontroli dodatniej 43. Trzy segmenty 36, 37, 38 można rozdzielić szczelinami lub przerwami 44, 45, aby zahamować lub zminimalizować wzajemną dyfuzję zawartości tych segmentów lub kontakt między nimi. Podobne przerwy można także umieścić w warstwie z wizualnym indykatorem lub w warstwie z odczynnikiem lub w obu warstwach 34, 35 bezpośrednio nad przerwami 44, 45 w niższej warstwie. Przerwy w warstwie z wizualnym indykatorem i w warstwie z odczynnikiem będą dalej zapobiegać dyfuzji komponentów kontrolnych lub innych odczynników z obszarów kontrolnych do obszarów testowych. Wszystkie pierwsze od wnętrza komory warstwy 35, 36, 37, 38 mogą zawierać oprócz odczynników także środek zwilżający lub detergent, które ułatwiają szybkie i całkowite rozprowadzenie badanego materiału na górnej i dolnej powierzchni i wypełnienie komory. W niektórych przypadkach taki sam efekt uzyskuje się z warstwą białka.
W niektórych wykonaniach wynalazku jakość odczynników może ulec pogorszeniu po dłuższym wystawieniu na działanie powietrza lub zawartej w powietrzu wilgoci. W urządzeniu przedstawionym na fig. 2 zapobiega się temu za pomocą cienkiego arkusza materiału 46, który jest nieprzepuszczalny dla wilgoci i powietrza. Arkusz pokrywa otwór do wprowadzania próbki i oba otwory odpowietrzające, zamykając wnętrze komory i oddzielając je od środowiska zewnętrznego aż do czasu stosowania urządzenia, po czym arkusz się łatwo odrywa. W przypadku materiałów, które są szczególnie wrażliwe na wodę lub powietrze, może być potrzebne umieszczenie takiego nieprzepuszczalnego dla wilgoci i powietrza arkusza na dnie urządzenia, przy czym arkusz może być umocowany trwale lub tak aby go można było zerwać. Zabezpieczenie przed wilgocią i powietrzem można też uzyskać przez umieszczenie urządzenia w torebce całkowicie otaczającej urządzenie.
Jak wskazano powyżej, każdy wymiar urządzenia przedstawionego na fig. 1 i 2, może zmieniać się. Zmieniać się mogą też kształty i układ. Typowy jest przykład, w którym arkusz nośnikowy z materiału Mylar ma grubość 0,0127 cm, a warstwę klejącą stanowi polietylen wysokociśnieniowy (o grubości 0,0051 cm), szerokość szczeliny 47 wynosi 0,019 cm, obszar testowy jest kołem o średnicy 0,79 cm (powierzchnia: 0,494 cm2), a każdy z obszarów kontrolnych, dodatni i ujemny, ma wymiary 0,32 cm x 0,16 cm (powierzchnia: 0,0504 cm2). Otwory odpowietrzające w tym przykładzie są koliste i każdy z tych otworów oraz otwór do wprowadzania próbki ma średnicę 0,32 cm. Objętość komory wynosi 12 μΐ.
Urządzenie testowe według wynalazku jest przeznaczone do badania próbek na obecność hydrolazy, pobranych z wielu różnych źródeł, w tym ze źródeł biologicznych i innych. Przykładem są płyny ustrojowe, takie jak krew, surowica, osocze, mocz, wydaliny z cewki moczowej, łzy, wydzielina pochwowa, wysięk szyjkowy, płyn kręgowy i ślina oraz płyny nieustrojowe, takie jak żywność, woda w stawach lub basenach i ścieki ciekłe.
180 526
PRZYKŁADY
I. WYTWARZANIE
A. Wytwarzanie stałego nośnika aktywowanego bromkiem cyjanu
1. Materiały
a. Stałe nierozpuszczalne nośniki (Sepharose 4B, chityna, i SigmacellR [z firmy Sigma Chemical Co.])
b. Destylowana woda i lód wytworzony z destylowanej wody
c. 4,0 M NaOH
d. Stały CNBr
e. Bufor sprzęgający (0,1 M NaHCO3 zawierający 0,5 M NaCl)
f. Mieszadło magnetyczne z silnikiem elektrycznym i prętem mieszającym, przyrząd do pomiaru pH, wyciąg laboratoryjny 2. Procedura
Do 5 gramów wilgotnego, przemytego stałego nośnika dodano 10 mililitrów (10 ml) zimnej destylowanej wody i mieszaninę oziębiono do 10°C-15°C. pH zawiesiny doprowadzono do 10,8 dodatkiem 4,0 M NaOH i dodano 100 mg stałego, pokruszonego CNBr na gram wilgotnego stałego nośnika. Utrzymywano pH 10,8, dodając w razie potrzeby 4,0 M NaOH, a w temperaturze zawiesiny pozwolono wzrosnąć do 18°Ć-20°C podczas procesu aktywowania. Aktywowanie uważano za ukończone, gdy nie było potrzeby dalszego dodawania 4,0 M NaOH, aby utrzymać pH 10,8. W tym momencie dodano pokruszonego lodu aby ochłodzić mieszaninę reakcyjną i przesączono zawiesinę przez ochłodzony wcześniej lejek ze szkła spiekanego. Przesącz zebrano w kolbie próżniowej zawierającej stały siarczan żelazawy, który inaktywował resztkowy CNBr i cyjanek pozostały w mieszaninie reakcyjnej. Stały nośnik przemyto pod próżnią 1 litrem zimnej destylowanej wody i 1 litrem buforu sprzęgającego i przechowywano w postaci wilgotnej pasty w 4°C.
B. Wytwarzanie koniugatów [Kappa-kazeina-HRPO] (metoda hydrazydowa)
1. Materiały
a. Kappa-kazeina i hydrazyd peroksydazy chrzanowej (HRPO) [z firmy Sigma Chemical Co]
b. Woda destylowana
c. Bufory:
i. 50 mM kwas 2-[morfolino]etanosulfonowy (MES), bufor, pH 6,0 ii. 100 mM octan sodu, bufor, pH 4,0, zawierający 0,5 M NaCl iii. 100 mM boran sodu, pH 9,0 zawierający 0,5 M NaCl, d. Stały nadjodan sodu e. 100 mM formaldehydu
2. Procedura
a. Aktywowanie kappa-kazeiny nadjodanem
Dwadzieścia mg kappa-kazeiny rozpuszczono w 2 ml buforu MES i do roztworu dodano 8,6 mg stałego nadjodanu sodu. Mieszaninę inkubowano w wirniku przez 30 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę reakcyjną dializowano do około 300 ml 50 mM MES, pH 6,0 przez około 45 minut w temperaturze pokojowej, po czym płyn do dializy wymieniono i dializę kontynuowano przez dalsze 45 minut.
b. Wiązanie kowalencyjne HRPO z kappa-kazeiną
Do aktywowanej dializowanej kappa-kazeiny dodano pięć mg hydrazydu HRPO (około 175 jednostek/mg białka) i mieszaninę inkubowano mieszając przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny dodano dwieście mikrolitrów 100 mM formaldehydu i dalej inkubowano w temperaturze pokojowej przez następne 30 minut. Dodano dwa ml 1 M zimnego buforu octanowego, pH 4,0, i pozostawiono do wytrącenia się koniugatu na 30 minut w 4°C. Osad usunięto przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 2 ml 100 mM buforu boranowego, pH 9,0, i przechowywano w 4°C przed użyciem.
180 526
C. Przyłączenie koniugatów [kappa-kazeina-HRPO] (metoda hydrazydowa) do nośników aktywowanych bromkiem cyjanu
1. Materiały
a. Koniugaty [kappa-kazeina-HRPO] (Preparat B)
b. Woda destylowana
c. Bufory:
i. Bufor sprzęgający (0,1 M NaHCO3, zawierający 0,5 M NaCl) ii. 1,0 M bufor Tris, pH 8,0 iii. 100 mM octan sodu, bufor, pH 4,0, zawierający 0,5 M NaCl iv. 100 mM boran sodu, bufor, pH 9,0, zawierający 0,5 M NaCl d. Sepharose 4B i SigmacellR 20 aktywowane bromkiem cyjanu (Preparat A) e. Sepharose 6 MB aktywowana bromkiem cyjanu (z firmy Sigma Chemical Co.)
2. Procedura
a. Sepharose 4B i SigmacellR 20 aktywowane bromkiem cyjanu
Do jednego grama wilgotnej Sepharose 4B lub SigmacellR 20 aktywowanej bromkiem cyjanu dodano dwa mililitry koniugatu [kappa-kazeina-HRPO] wytworzonego z hydrazydu HRPO jak opisano w punkcie B i rozcieńczonego 3 ml buforu sprzęgającego. Zawiesinę dokładnie mieszano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Stały nośnik przemyto buforem sprzęgającym i wodą i dodano 3 ml 1,0 M buforu Tris o pH 8. Zawiesinę inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, aby inaktywować pozostające na stałym nośniku miejsca aktywne. Aby usunąć nie związane materiały z nośnika przemywano go w trzech cyklach, każdorazowo najpierw buforem octanowym o pH 4,0, a następnie buforem sprzęgającym. W końcu przemyto destylowaną wodą a wilgotną zawiesinę przechowywano w 4°C przed użyciem.
b. Handlowa aktywowana Sepharose 6 MB (z firmy Sigma Chemical Co.) Wilgotny żel (1 gram wilgotnej masy) przemyto przed użyciem 200 ml 1 mM HC1, jak opisano powyżej.
c. Aktywowana chityna
Prowadzono procedurę opisaną w punkcie A powyżej, ale zamiast 1 grama stosowano 500 mg wilgotnej aktywowanej chityny.
D. Wytwarzanie aldehydu peroksydazy chrzanowej (HRPO)
1. Materiały
a. HRPO, Typ II, 200 jednostek/mg (z firmy Sigma Chemical Co.)
b. 20 mM bufor, kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES), pH 5,0
c. Stały nadjodan sodu
d. Kuleczki żelu poliakryloamidowego BiogelR P-30 z firmy Bio-Rad
2. Procedura
Do 30 mg HRPO dodano w 3 ml buforu MES dodano 25,7 mg stałego nadjodanu sodu (40 milimoli). Roztwór inkubowano przez 30 minut w ciemności, w temperaturze pokojowej i podczas ciągłego wirowania. Roztwór przepuszczono przez kolumnę P-30 w buforze MES, aby usunąć nadmiar nadjodanu sodu, po czym zebrano zabarwioną HRPO o całkowitej objętości 3 ml. Aldehyd HRPO natychmiast związał się z żądanym białkiem (hemoglobiną mioglobiną lub kazeiną).
E. Przyłączenie hemoglobiny i mioglobiny do stałych nośników aktywowanych bromkiem cyjanu 1. Materiały
a. Stałe, nierozpuszczalne nośniki
i. Sepharose 6MB aktywowana bromkiem cyjanu (z fumy Sigma Chemical Co.) ii. SigmacellR 20 (jak opisany w punkcie A)
b. Woda destylowana
180 526 c: Bufory:
i. Bufor sprzęgający (0,1 M NaHCO3 zawierający 0,5 M NaCl) ii. 1,0 M bufor Tris, pH 8,0 iii. 100 mM octan sodu, bufor, pH 4,0 zawierający 0,5 M NaCl iv. 100 mM boran sodu, bufor, pH 8,0 zawierający 0,5 M NaCl v. 0,1-procentowy (obj./obj.) roztwór aldehydu glutarowego w wodzie 2. Procedury
Do 1 grama wilgotnego stałego nośnika dodano sto miligramów hemoglobiny lub mioglobiny rozpuszczonej w 5 ml buforu sprzęgającego. Zawiesinę mieszano intensywnie w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Stały nośnik przemyto buforem sprzęgającym i wodą, dodano 3 ml 1,0 M buforu Tris, pH 8, i zawiesinę inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej aby inaktywować pozostające na stałym nośniku miejsca aktywne. Aby usunąć nie związane materiały z nośnika przemywano go w trzech cyklach każdorazowo, najpierw buforem octanowym o pH 4,0, potem buforem boranowym, przy czym obydwa zawierały chlorek sodu. Nośniki derywatyzowane mioglobiną przemyto na końcu wodą destylowaną, a wilgotną zawiesinę przechowywano w 4°C przez użyciem. Dla nośników derywatyzowanych hemoglobiną, do wilgotnej zawiesiny wytworzonej w powyższej procedurze dodano 5 ml 0,1% roztworu aldehydu glutarowego i zawiesinę inkubowano przez noc w 4°C. Aby usunąć nie związane materiały z nośnika przemywano go w trzech cyklach, najpierw buforem octanowym o pH 4,0, a potem buforem boranowym o pH 8,0. Na końcu przemyto wodą destylowaną a wilgotną zawiesinę przechowywano w 4°C przed użyciem.
F. Przyłączenie aldehydu peroksydazy chrzanowej (HRPO) do nośników derywatyzowanych hemoglobiną lub mioglobiną
1. Materiały
a. Aldehyd HRPO wytworzony jak opisano w punkcie D
b. Stałe nośniki derywatyzowane hemoglobiną lub mioglobiną wytworzone jak opisano w punkcie E
c. 100 mM cyjanoborowodorek sodu
d. 1,0 M NaCl
e. woda destylowana
2. Procedura
Do 1 grama stałych nośników derywatyzowanych hemoglobiną lub mioglobiną opisanych w punkcie E dodano trzy ml aldehydu HRPO (30 mg) odzyskanego z kolumny P-30 w punkcie D. Zawiesinę inkubowano przez 16 godzin w 4°C, a następnie przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Aby usunąć nie związane materiały z nośnika, prowadzono trzy cykle przemywania, przemywając w każdym destylowaną wodą i 1,0 M NaCl. Stały nośnik następnie inkubowano przez noc 5 ml 100 mM cyjanoborowodorku w 4°C. W końcu przemyto destylowaną wodą i wilgotną zawiesinę przechowywano w 4°C przed użyciem.
G. Wytwarzanie SigmacellR 20 aktywowanego aldehydem
1. Materiały
a. SigmacellR 20 (z firmy Sigma Chemical Co.)
b. Woda destylowana
c. Stały nadjodan sodu
d. 20 mM wodorowęglan sodu, pH 9,5
2. Procedura
Do jednego grama SigmacellR 20 zawieszonego w 10 ml destylowanej wody dodano stałego nadjodanu sodu (428 mg). Mieszaninę mieszano nieprzerwanie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Osad usunięto przez odwirowanie, przemyto pięć razy 10 ml destylowanej wody i jeden raz 10 ml 20 mM wodorowęglanu sodu o pH 9,5. Żywicę stosowano natychmiast po wytworzeniu.
180 526
H. Kowalencyjne przyłączenie hemoglobiny i mioglobiny do SigmacellR 20 aktywowanego aldehydem 1. Materiały
a. SigmacellR 20 aktywowany aldehydem (Preparat G)
b. Woda destylowana
c. 100 mM cyjanoborowodorku sodu
d. Ludzka hemoglobina i mioglobina z serca konia (obydwie z firmy Sigma Chemical Co.)
e. Bufory
i. 20 mM wodorowęglan sodu, pH 9,5 ii. 50 mM etanoloamina, pH 9,5 iii. 100 mM bufor Tris, pH 8,0 zawierający 0,5 M NaCl iv. 100 mM octan sodu, bufor, pH 4,0, zawierający 0,5 M NaCl
v. 20 mM bufor MES, pH 5,0.
2. Procedura
Do 1 ml SigmacellR 20 aktywnego aldehydem (Preparat G) dodano pięćdziesiąt mg mioglobiny lub hemoglobiny rozpuszczonej w 9 ml wodorowęglanu sodu o pH 9,5. Zawiesinę wirowano przez noc w temperaturze pokojowej, a osad usunięto przez odwirowanie. Osad przemyto 10 ml wody. Dodano dziewięć ml 50 mM etanoloaminy, pH 9,5, i mieszaninę w dalszym ciągu wirowano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto kolejno 10 ml buforu octanowego, buforu Tris i buforu MES. Dodano dwadzieścia ml wodnego roztworu 100 mM cyjanoborowodorku sodu i mieszaninę inkubowano przez 1 godzinę z ciągłym wirowaniem w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w 4°C. Po całonocnym inkubowaniu derywatyzowany nośnik przemyto pięć razy 10 ml porcjami wody destylowanej i dwa razy 10 ml porcjami buforu MES.
I. Kowalencyjne przyłączenie aldehydu HRPO do hemoglobiny lub mioglobiny immobilizowanej na aktywowanym aldehydem SigmacellR 20 1. Materiały
a. SigmacellR 20 derywatyzowany hemoglobiną lub mioglobiną (Preparat H) b. Woda destylowana
c. 100 mM cyjanoborowodorek sodu
d. Bufory
i. 100 mM bufor Tris, pH 8,0, zawierający 0,5 M NaCl ii. 100 mM octan sodu, bufor, pH 4,0, zawierający 0,5 M NaCl iii. 20 mM bufor MES, pH 5,0
2. Procedura
Do 1 grama hemoglobiny lub mioglobiny derywatyzowanej SigmacellR 20 (Preparat H) dodano dwadzieścia miligramów pozbawionego soli aldehydu HRPO (preparat D) rozpuszczonego w 2 ml buforu MES o pH 5,0. Zawiesinę wirowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym inkubowano przez noc w 4°C. Nośnik oddzielono przez odwirowanie i przemyto dwa razy 10 ml porcjami destylowanej wody. Dodano dwadzieścia ml 100 mM cyjanoborowodorku sodu i zawiesinę inkubowano przez 60 godzin w 4°C. Osad przemyto kolejno dwukrotnie: destylowaną wodą, buforem octanowym, buforem Tris i buforem MES.
J. Kowalencyjne przyłączenie hemoglobiny do dostępnych w handlu perełek akrylowych (EupergitR)
1. Materiały
a. Perełki oksiranoakrylowe (EupergitR, z firmy Sigma Chemical Co.) b. Ludzka hemoglobina (typ IV z firmy Sigma Chemical Co.) c. Bufory i roztwory
i. 1,0 M fosforan potasu, bufor, pH 7,5, zawierający 0,1% azydku sodu (wag./obj.) ii. 1,0 M NaCl
180 526 iii. 5% (obj./obj.) merkaptoetanol, pH doprowadzone do 8,0 dodatkiem 0,5 M NaOH iv. 100 mM fosforan potasu, bufor, pH 7,4 v. 500 mM fosforan potasu, bufor, pH 7,4 vi. 3,5 M tiocyjanian sodu vii. Solanka buforowana fosforanem (PBS) (0,01 M fosforan sodu, pH 7,2 zawierający 0,15 M NaCl)
d. Woda destylowana
2. Procedura
Do 1 grama EupergitR C dodano hemoglobinę (125 mg) rozpuszczoną w 5 ml 1,0 M buforu fosforanowego o pH 7,5, zawierającego azydek sodu. Mieszaninę pozostawiono do inkubowania bez mieszania na 72 godziny w temperaturze pokojowej. Nośnik przemyto trzy razy 1,0 M NaCl i pięć razy destylowaną wodą. Nośnik zmieszano z 2,5 ml merkaptoetanolu, o pH doprowadzonym najpierw do wartości 8,0, i zawiesinę pozostawiono do odstania przez noc w temperaturze pokojowej. Perełki 10 razy przemyto destylowaną wodą umieszczono na małym lejku z filtrem ze spiekanego szkła i przemywano kolejno 50 ml: 0,5 M fosforanu potasu o pH 7,5; 0; 1 M fosforanu potasu o pH 7,5; 3,5 M tiocyjanianu sodu, a w końcu dużymi objętościami solanki buforowanej fosforanem (PBS) (0,1 M fosforan sodu, pH 7,2, zawierający 0,15 M NaCl). Derywatyzowane perełki traktowano 0,1% (obj./obj.) aldehydem glutarowym mieszając przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i przez noc w 4°C, po czym przemyto wodą destylowaną.
K. Kowalencyjne przyłączenie aldehydu HRPO (Preparat D) do EupergitR C derywatyzowanego hemoglobiną (Preparat J) 1. Materiały
a. Aldehyd HRPO (Preparat D)
b. EupergitR C derywatyzowana hemoglobiną (Preparat J)
c. 100 mM cyjanoborowodorek sodu
d. 1,0 M NaCl
e. Woda destylowana
2. Procedura
Do 1 grama EupergitR C derywatyzowanego hemoglobiną (Preparat J) dodano trzydzieści miligramów aldehydu HRPO (Preparat D) w trzech ml buforu MES. Zawiesinę inkubowano przez 16 godzin w 4°C, po czym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Aby usunąć nie związane materiały z nośnika prowadzono przemywanie w trzech cyklach, w każdym z nich przemywając wodą destylowaną i 1,0 M NaCl. Następnie stały nośnik inkubowano przez 60 godzin w 4°C 5 ml 100 mM cyjanoborowodorku. Na koniec przemyto wodą destylowaną a wilgotną zawiesinę przechowywano w 4°C przed użyciem.
L. Kowalencyjne przyłączenie kazeiny-HRPO do polimerycznego dialdehydu
1. Materiały
a. 25 mg koniugatu Kappa-kazeina-HRPO wytworzonego metodą hydrazydową (Preparat B) i rozpuszczonego w 2 ml 100 mM buforu boranowego, pH 9,0
b. Polimeryczny dialdehyd (z firmy Sigma Chemical Co.)
c. Bufory:
i. 100 mM etanoloamina, pH 9,5 ii. 100 mM boran sodu, bufor, pH 9,0, zawierający 0,5 M NaCl iii. 100 mM octan sodu, bufor, pH 4,0, zawierający 0,5 M NaCl iv. 50 mM bufor MES, pH 6,0
d. 100 mM formaldehyd
e. 100 mM cyjanoborowodorek sodu
180 526
2. Procedura
Wytworzono dwa ml koniugatu kappa-kazeina-HRPO, jak opisano w punkcie B, z jedną modyfikacją: pominięto obróbkę formaldehydem. Roztwór ten mieszano z trzema ml buforu MES, po czym dodano do 1 grama polimerycznego dialdehydu. Zawiesinę wirowano przez 6 godzin w temperaturze pokojowej i inkubowano przez noc w 4°C. Do zawiesiny dodano dwieście mikrolitrów 100 mM formaldehydu i mieszaninę inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Żywicę usunięto przez odwirowanie, przemyto wodą i ponownie zawieszono w 3 ml 100 mM etanoloaminy o pH 8,5. Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej, żywicę przemyto kolejno buforem octanowym, buforem boranowym i wodą. Stały nośnik następnie inkubowano z 5 ml 100 mM cyjanoborowodorku przez noc w 4°C. Na koniec przemyto destylowaną wodą, a wilgotną zawiesinę przechowywano w 4°C przed użyciem.
M. Przyłączenie całej kazeiny lub kappa-kazeiny znakowanej HRPO (metoda aldehydowa) do perełek akrylowych EupergitR 1. Materiały
a. Perełki oksiranoakrylowe (EupergitR C, z firmy Sigma Chemical Co.) b. Kazeina lub kappa-kazeina wołowa (z firmy Sigma Chemical Co.) c. Bufory i roztwory
i. 100 mM wodorowęglan sodu, pH 8,5, zawierający 0,5 M NaCl ii. 100 mM octanu sodu, bufor, pH 4,0, zawierający 0,5 M NaCl iii. 100 mM bufor Tris, pH 8,0, zawierający 0,5 M NaCl iv. 20 mM bufor MES, pH 5,0
v. 5% (obj./obj.) roztwór merkaptoetanolu w wodzie vi. 200 mM borowodorek sodu w wodzie
d. Woda destylowana
2. Procedury
a. Kowalencyjne przyłączenie kazeiny lub kappa-kazeiny do perełek EupergitR C
Do 1 ml perełek EupergitR C zawieszonych w wodzie dodano 2 ml roztworu zawierającego całą kazeinę lub kappa-kazeinę (10 mg/ml) w 100 mM buforze, wodorowęglanie sodu, pH 8,5, zawierającym 0,5 M NaCl. Mieszaninę inkubowano wirując przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto kolejno 9 ml porcjami buforu octanowego i Tris, a następnie dwa razy 9 ml porcjami buforu MES. Dodano dziesięć ml 5% roztworu merkaptoetanolu i mieszaninę inkubowano mieszając przez noc w temperaturze pokojowej. Derywatyzowany kazeiną nośnik oddzielono przez odwirowanie i przemyto czterokrotnie 9 ml buforu MES.
b. Znakowanie kazeiny immobilizowanej na EupergitR C za pomocą HRPO
Do EupergitR C derywatyzowanego kazeiną z punktu A powyżej dodano trzy ml HRPO aktywowanego aldehydem (Preparat D) i mieszaninę inkubowano wirując przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przez 60 godzin w 4°C. Osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto dwukrotnie 10 ml porcjami wody. Do osadu dodano wodnego roztworu borowodorku sodu (5 ml) i zawiesinę inkubowano przez 6 godzin w temperaturze pokojowej. Osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto kolejno 9 ml porcjami buforów : octanowego, Tris, octanowego, Tris i MES.
N. Kowalencyjne przyłączenie mioglobiny-HRPO do polimerycznego dialdehydu 1. Materiały
a. 30 mg mioglobiny z serca konia rozpuszczonej w 2 ml 20 mM buforu wodorowęglanu sodu, pH 9,5
b. Polimeryczny dialdehyd (dialdehyd celulozy, z firmy Sigma Chemical Co.)
180 526
c. Bufory:
i. 50 mM etanoloamina, pH 9,5 ii. 100 mM boran sodu, pH 9,0, zawierający 0,5 M NaCl iii. 100 mM buforu octanu sodu, pH 4,0, zawierający 0,5 M NaCl iv. 50 mM bufor MES, pH 6,0
v. 100 mM bufor Tris, pH 8,0, zawierający 0,5 M NaCl
d. 100 mM formaldehyd
e. 100 mM roztwór cyjanoborowodorku sodu w wodzie
2. Procedura
a. Kowalencyjne wiązanie mioglobiny to polimerycznego dialdehydu
Dwa ml roztworu mioglobiny zmieszano z 1 ml zawiesiny polimerycznego dialdehydu i zawiesinę wirowano przez noc w temperaturze pokojowej. Żywicę oddzielono przez odwirowanie i przemyto dwukrotnie 10 ml porcjami wody. Dodano dziewięć ml roztworu etanoloaminy i zawiesinę inkubowano wirując przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Żywicę oddzielono przez odwirowanie i przemyto kolejno 10 ml porcjami buforów : octanowego, Tris i MES. Dodano dwadzieścia ml cyjanoborowodorku sodu. Zawiesinę inkubowano przez noc w 4°C. Polimeryczny dialdehyd derywatyzowany mioglobiną przemyto pięć razy 10 ml porcjami wody i dwa razy buforem MES.
b. Znakowanie perełek derywatyzowanych mioglobiną aldehydem HRPO (Preparat D)
Do żywicy dodano dwa ml pozbawionego soli aldehydu HRPO (Preparat D) i zawiesinę inkubowano, wirując w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i przez noc w 4°C. Żywicę oddzielono przez odwirowanie przemyto dwukrotnie 10 ml porcjami wody, zawieszono w 20 ml cyjanoborowodorku sodu i inkubowano przez 60 godzin w 4°C. Żywicę oddzielono przez odwirowanie i przemyto dwukrotnie 10 ml porcjami wody, a następnie dwa razy kolejno czterema 10 ml porcjami buforów octan/NaCl i Tris/NaCl. W końcu, żywicę przemyto 10 ml buforu MES i przechowywano w 4°C przed użyciem.
O. Wytwarzanie chityny znakowanej HRPO i jej zastosowanie do próby z chitynazą.
1. Materiały
a. Chityna aktywowana bromkiem cyjanu (Preparat A)
b. HRPO (Typ II z firmy Sigma Chemical Co., 78 jednostek/mg)
c. Chitynaza (EC 3.2.1.14, wyizolowana z Streptomyces grisius, z firmy Sigma Chemical Co.)
d. Bufory:
i. 500 mM bufor Tris/MES, pH 5,4 ii. Bufor sprzęgający, 100 mM wodorowęglan sodu, zawierający 0,5 M NaCl iii. 100 mM octan sodu, pH 4,0, zawierający 0,5 M NaCl iv.l00 mM buforu boranu sodu, pH 8,0, zawierający 0,5 M NaCl v. 1,0 M bufor Tris, pH 8,0
e. Mieszanina do próby ABTS: 40 mikrolitrów 25 mg/ml ABTS (sól diamonowa kwasu 2,2'-azyno-di[3-etylobenztiazolinosulfonowego), 10 mikrolitrów 1% (obj./obj.) nadtlenku wodoru; 950 mikrolitrów wody
2. Procedura
a. Wytwarzanie chityny dery waty zowanej HRPO
Pięćset mg chityny aktywowanej bromkiem cyjanu (Preparat A) zawieszono w 5 ml buforu sprzęgającego, dodano 5 mg HRPO i zawiesinę intensywnie mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Stały materiał przemyto wodą destylowaną i buforem sprzęgającym. Do nośnika dodano trzy ml buforu Tris, pH 8,0, i zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie przemyto kolejno 3 razy buforami octanowym i boranowym, i w końcu wodą.
180 526
b. Próba z chitynazą
Pięćdziesiąt mg chityny znakowanej HRPO zawieszono w 200 mikrolitrach buforów MES/Tris. Dodano pięćdziesiąt mikrolitrów roztworu chitynazy (50 jednostek/ml) i mieszaninę inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Mieszaninę reakcyjną odwirowano do osadzenia się chityny, 10 mikrolitrów supernatantu zmieszano z 100 mikrolitrami mieszaniny ABTS. Uwolnienie HRPO związanej z chityną katalizowane chitynazą wykrywano przez powstanie zielonej barwy w roztworze.
P. Wytwarzanie koniugatu aktywowanego bromkiem cyjanu Sepharose-kazeina lub kappa-kazeiny-aldehyd HRPO 1. Materiały
a.Sepharose aktywowana bromkiem cyjanu (Preparat A)
b. Kazeina lub Kappa-kazeina, 10 mg/ml w buforze sprzęgającym (0,1 M wodorowęglan sodu zawierający 0,5 M NaCl)
c. Bufory i roztwory:
i. 50 mM etanoloamina, pH 9,5 ii. 100 mM boran sodu, pH 9,0, zawierający 0,5M NaCl iii. 100 mM octan sodu, pH 4,0, zawierający 0,5 M NaCl iv. 20 mM bufor MES, pH 5,0
v. 100 mM bufor Tris, pH 8,5, zawierający 0,5 M NaCl vi. 100 mM roztwór borowodorku sodu w wodzie
d. aldehyd HRPO (Preparat D)
2. Procedura
Do jednego ml Sepharose aktywowanej bromkiem cyjanu dodano dwa ml roztworu kazeiny lub kappa-kazeiny i zawiesinę inkubowano przez 2 godziny, wirując w temperaturze pokojowej. Dodano siedem ml roztworu etanoloaminy i mieszaninę inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Żywicę oddzielono przez odwirowanie i przemyto kolejno 9 ml porcjami buforów octanowego i Tris, zawierających chlorek sodu, a następnie dwa razy 9 ml buforu MES.
Dodano 3 ml pozbawionego soli aldehydu HRPO (Preparat D) i mieszaninę wirowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w 4°C. Żywicę oddzielono przez odwirowanie i przemyto dwukrotnie 10 ml wody. Żywicę zawieszono w 10 ml borowodorku sodu i mieszaninę inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Wreszcie, żywicę oddzielono przez odwirowanie i przemyto kolejno 9 ml każdego z następujących buforów zawierających 0,5 M NaCl: octanowym; Tris, octanowym i Tris. Na koniec żywicę przemyto 9 ml buforu MES i przechowywano w buforze MES w 4°C przed użyciem.
Q. Kowalencyjne przyłączenie mioglobiny i albuminy z surowicy wołowej do subtelnie sproszkowanych perełek akrylowych EupergitR C i następnie znakowanie kowalencyjne peroksydazą chrzanową (metoda aldehydowa)
Etap 1: Kowalencyjne przyłączenie mioglobiny i albuminy z surowicy wołowej do perełek akrylowych EupergitR C
1. Materiały
a. Perełki oksiranoakrylowe (EupergitRC, perełki 150 mikronów, z firmy Sigma ChemicalCo.)
b. Mioglobina z serca konia (typ IV) lub albumina z surowicy wołowej (z firmy Sigma Chemical Co.)
c. Bufory i roztwory
i. 1,0 mM fosforan potasu, bufor, pH 7,5, zawierający 0,1% azydku sodu (wag./obj.) ii. 1,0 M NaCl
180 526 iii. 5% (obj./obj.) merkaptoetanol, pH doprowadzone do wartości 8,0 dodatkiem 0,5 N NaOH iv. 100 mM fosforan potasu, bufor, pH 7,5 v. 500 mM fosforan potasu, bufor, pH 7,5 vi. 3,5 M tiocyjanian sodu vii. Solanka buforowana fosforanem (PBS) (0,01 M fosforanu sodu, pH 7,2, zawierającego 0,15 M NaCl)
d. Woda destylowana
2. Procedura
Rozdrobniono ręcznie tłuczkiem w moździerzu na subtelny proszek jeden gram perełek oksiranoakrylowych. Do 1 grama subtelnie rozdrobnionego Eupergit-uR C dodano mioglobinę lub albuminę z surowicy wołowej (125 mg) rozpuszczono w 5 ml 1,0 M buforu fosforanowego o pH 7,5, który zawierał azydek sodu. Mieszaninę inkubowano bez mieszania przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Stosując wirówkę, nośnik przemyto trzykrotnie 1,0 M NaCl i pięć razy 20 ml destylowanej wody. Nośnik zmieszano z 2,5 ml merkaptoetanolu, którego uprzednio doprowadzono do wartości 8,0, i zawiesinę pozostawiono w temperaturze pokojowej do odstania. Stosując wirówkę perełki przemyto 10 razy wodą destylowaną a następnie kolejno 50 ml każdego z następujących buforów: 0,5 M fosforanu potasu, pH 7,5; 0,1 M fosforanu potasu, pH 7,5; 3,5 M tiocyjanianu sodu; i w końcu solanką buforowaną fosforanem (PBS) (0,01 M fosforan sodu, pH 7,2, zawierający 0,15 M CaCl).
Etap 2: Kowalencyjne znakowanie peroksydazą chrzanową (metoda aldehydowa)
Aldehyd peroksydazy chrzanowej (Preparat D) stosowano do znakowania perełek akrylowych derywazytowanych mioglobiną lub albuminą z etapu powyżej, stosując procedurę F.
R. Sprzęganie SigmacellR-20 mioglobiny z HRPO za pomocą aldehydu glutarowego 1. Materiały
a. Mioglobiną kowalencyjnie przyłączona do SigmacellR aktywowanego bromkiem cyjanu (Preparat E)
b. 0,5 M bufor MES, pH 5,0
c. 1% (obj./obj.) roztwór aldehydu glutarowego w wodzie
d. HRPO-hydrazyd (z firmy Sigma Chemical Co., 200 jednostek/mg)
e. 100 mM formaldehyd
f. 100 mM cyjanoborowodorek sodu
g. 0,5 M NaCl
2. Procedury
Do 1 grama koniugatu mioglobina-SigmacellR-20 dodano jeden ml roztworu aldehydu glutarowego i zawiesinę wirowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut i przemyto wodą Do przemytej żywicy dodano pięć mg hydrazydu HRPO w 2 ml 100 mM buforu MES i zawiesinę wirowano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Dodano dwieście mikrolitrów 100 mM roztworu formaldehydu i mieszaninę inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Żywicę przemyto wodą zawieszono w 5 ml 100 mM cyjanoborowodorku sodu i inkubowano przez noc w 4°C. Żywicę przemyto następnie wodą destylowaną i 0,5 M NaCl i przechowywano w postaci wilgotnej pasty przed użyciem.
S. Wytwarzanie roztworu żywicy gwąjakowej i arkuszy gwajakowych
1. Żywica gwajakowa, roztwór hydroksypropylocelulozy (tj. atrament gwajakowy)
150 gramów sproszkowanej żywicy gwąjakowej rozpuszczono, podczas mieszania, w 600 ml ciepłego etanolu. Do otrzymanego roztworu dodano 1330 ml destylowanej wody i wytworzoną mieszaninę pozostawiono, aby oziębiła się do temperatury pokojowej. Po dwóch godzinach supematant zdekantowano utrzymując resztkową zawiesinę.
180 526
250 ml 10% (wag. /wag) roztworu hydroksypropylocelulozy w etanolu mieszano z dodatkowymi 250 ml etanolu i wytworzony roztwór dodano do zawiesiny żywicy gwajakowej. Mieszaninę mieszano aż do całkowitego rozpuszczenia pozostałości żywicy gwajakowej.
2. Arkusze z żywicą gwajakową
Jeden ml powyższego roztworu żywicy gwajakowej przeniesiono pipetą na arkusz 25,4 cm x 25,4 cm Mylar/laminat polietylenowy, nakładająna stronę z polietylenem (0,018 cm Mylar/3 ml polietylenu). Roztwór żywicy gwajakowej rozprowadzono po całej powierzchni arkusza za pomocą standardowego pręcika z drutu i pozostawiono do wysuszenia w temperaturze pokojowej.
T. Wytwarzanie zawiesiny nadboranu sodu (tj. barwnika nadboranu sodu) gramów subtelnie rozdrobnionego stałego nadboranu sodu zmieszano z wystarczającą objętością 10% (wag./wag.) roztworu hydropropylocelulozy w bezwodnym alkoholu i uzyskano jeden litr zawiesiny.
II. EKSPERYMENTY EKSPERYMENT I
Eksperyment ten dotyczy uwolnienia HRPO z [Sepharose-Kazeina-HRPO] i [Sepharose-Kappa-Kazeina-HRPO] za pomocą proteazy asparaginianowej uzyskanej z hodowli Candida albicans.
A. MATERIAŁY: (Sepharose aktywowana bromkiem cyjanu) (Metoda sprzęgania z użyciem aldehydu HRPO)
1. Speharose 4B aktywowana bromkiem cyjanu (Preparat A), najpierw derywatyzowana z kowalencyjnie związaną kazeiną lub Kappa-kazeiną (Preparat P) i następnie znakowana aldehydem HRPO (Preparat D)
2. Hodowla Candida albicans (ATCC 28366) wytwarzająca proteazę asparaginianową namnożona i wzrastająca w ciekłej hodowli, jak opisano w Journal od General Microbiology (1983), 129:431-438.
3. Arkusze pokryte żywicą gwajakową (Preparat S)
4. Bufory i roztwory
a. 20 mM nadtlenek wodoru
b. 500 mM bufor MES, pH 6,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [Sepharose-Kazeina-HRPO] (lub równoważnej Kappa-Kazeiny) zawieszono albo w 300 mikrolitrach hodowli Candida albicans zawierającej wydzieloną aktywną proteazę asparaginianową lub w 300 mikrolitrach tej samej hodowli Candida albicans, którą utrzymywano w stanie wrzenia przez 20 minut, aby deaktywować proteazę asparaginianową. Mieszaninę mieszano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a zawiesinę odwirowano, uzyskując osad stałego koniugatu i komórki Candida albicans.
Osiemdziesiąt mikrolitrów klarownego supematantu zmieszano z 10 mikrolitrami roztworu nadtlenku wodoru i 10 mikrolitrami buforu MES. Na pokryty warstwą żywicy gwajakowej arkusz nałożono dwadzieścia mikrolitrów każdego roztworu i arkusz badano pod kątem wytworzenia barwy niebieskiej
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 1,5 - | Barwa niebieska o intensywności pośredniej pomiędzy 1,0 i 2,0 |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
180 526
C. WYNIKI
W obszarze arkusza z warstwą żywicy gwajakowej, do którego dodano supematantu Sepharose-białko-HRPO potraktowanego Candida albicans wytworzyła się barwa ciemnoniebieska. W obszarze, do którego dodano supematantu Sepharose-białko-HRPO potraktowanego wrzącą hodowlą nie zaobserwowano żadnego zabarwienia.
| ŹRÓDŁO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Hodowla Candida albicans | 1,5 |
| Wrząca hodowla | 0 |
D. INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa wydzielana do pożywki hodowlanej przez komórki Candida albicans zhydrolizowała kazeinę lub Kappa-kazeinę związaną z Sepharose, uwalniając rozpuszczalną aktywną HRPO. Podczas wirowania oddzielono osad HRPO związanej z Sepharosą pozostawiając w roztworze tylko HRPO solubilizowaną proteazą asparaginianową. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru, dodając niebieską barwę. Tak więc, powstawanie niebieskiej barwy na arkuszach pokrytych żywicą gwajakową dostarcza dogodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej.
Utrzymywanie hodowli w stanie wrzenia deaktywowało proteazę asparaginianową wydzielaną do pożywki hodowlanej przez Candida albicans. Tak więc, kazeina lub Kappa-kazeina związana z Sepharose nie została zhydrolizowana i rozpuszczalna, aktywna HRPO nie uwalniała się z nośnika. Przez wirowanie oddzielono osad HRPO związanej z Sepharosą ale w roztworze nie było HRPO solubilizowanej proteazą asparaginianową. Utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru nie było katalizowane, a wytworzona barwa niebieska była słabo wykrywalna. Uwolnienie HRPO z nośnika było wynikiem niespecyficznego uwolnienia HRPO przez sole i inne składniki obecne w pożywce hodowlanej.
EKSPERYMENT II
Eksperyment dotyczy uwolnienia HRPO z koniugatów [Perełki akrylowe EupergitR C-Kazeina-HRPO] i z koniugatów [Perełki akrylowe EupergitR C-Kappa-Kazeina-HRPO] przez proteazę asparaginianową uwolnioną przez hodowlę Candida albicans'.
A. MATERIAŁY: (Aktywowane perełki akrylowe EupergitR C) (metoda sprzęgania z użyciem aldehydu HRPO)
1. Perełki oksiranoakrylowe (EupergitR C) traktowano kazeiną lub Kappa-kazeiną (Preparat M) i następnie znakowano aldehydem HRPO (Preparat D)
2. Hodowla Candida albicans (ATCC 28366) wytwarzająca proteazę asparaginianową rozmnażająca się i wzrastająca w ciekłej hodowli, jak opisano w Journal of General Microbiology, (1983) 129: 431-438.
3. Arkusze pokryte żywicą gwajakową (Preparat S)
4. Bufory i roztwory
a. 20 mM nadtlenku wodoru
b. 500 mM buforu MES, pH 6,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [EupergitR C-Kazeina-HRPO] (lub równoważnika Kappa-kazeiny) zawieszono w 300 mikrolitrach hodowli Candida albicans zawierającej wydzielaną aktywną proteazę asparaginianową lub w 300 mikrolitrach tej samej hodowli Candida albicans, którą przez 20 minut utrzymywano w stanie wrzenia, aby deaktywować proteazę asparaginianową. Mieszaninę wirowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a zawiesinę odwirowano, uzyskując zsedymentowany stały koniugat i komórki Candida albicans.
Osiemdziesiąt mikrolitrów klarownego supematantu zmieszano w 10 mikrolitrami roztworu nadtlenku wodoru i 10 mikrolitrami buforu MES. Na powierzchnię arkusza z żywicą
180 526 gwajakową wprowadzono dwadzieścia mikrolitrów każdego roztworu, i badano arkusz pod kątem wytworzenia się niebieskiej barwy.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 1,5 | Barwa niebieska o intensywności pośredniej pomiędzy 1,0 i 2,0 |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C WYNIKI
W obszarze arkusza z warstwą żywicy gwajakowej, do którego dodano supematantu [EupergitR C-białko-HRPO] potraktowanego Candida albicans wytworzyła się barwa ciemnoniebieska. W obszarze, do którego dodano supematantu [EupergitR C-białko-HRPO] potraktowanego wrzącą hodowlą nie zaobserwowano żadnego zabarwienia.
| ŻRODLO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Hodowla Candida albicans | 1,5 |
| Wrząca hodowla | 0 |
D. INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa wydzielana w pożywce hodowlanej przez komórki Candida albicans zhydrolizowała kazeinę lub Kappa-kazeinę związaną z EupergitR C, uwalniając rozpuszczalną aktywną HRPO. Podczas wirowania oddzielono osad HRPO związanej z EupergitR C, pozostawiając w roztworze tylko HRPO solubilizowaną proteazą asparaginianową Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru, dodając niebieską barwę. Tak więc, powstawanie niebieskiej barwy na arkuszach pokrytych żywicą gwajakową dostarcza dogodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej.
Utrzymywanie hodowli w stanie wrzenia deaktywowało proteazę asparaginianową wydzielaną do pożywki hodowlanej przez Candida albicans. Tak więc, kazeina lub Kappa-kazeina związana z EupergitR C nie została zhydrolizowana i rozpuszczalna, aktywna HRPO nie uwalniała się z nośnika. Przez wirowanie oddzielono osad HRPO związanej z EupergitR C, ale w roztworze nie było HRPO solubilizowanej proteazą asparaginianową. Utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru nie było katalizowane, a wytworzona barwa niebieska była słabo wykrywalna. Uwolnienie HRPO z nośnika było wynikiem niespecyficznego uwolnienia HRPO przez sole i inne składniki obecne w pożywce hodowlanej.
EKSPERYMENT III
Eksperyment dotyczy uwolnienia HRPO z [Sepharose-Hemoglobina-HRPO] lub [Sepharose-Mioglobina-HRPO] przez pepsynę i proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi.
A. MATERIAŁY: (Sepharose aktywowana bromkiem cyjanu) (Metoda sprzęgania z użyciem aldehydu HRPO)
1. Sepharose 4B aktywowana bromkiem cyjanu (Preparat A) najpierw derywatyzowana kowalencyjnie związaną hemoglobiną lub mioglobiną (Preparat E), a następnie znakowana aldehydem HRPO (Preparaty D i F). Koniugaty traktowano przez noc 100 mM cyjanoborowodorkiem sodu w temperaturze pokojowej i przemyto 0,5 M NaCl przed stosowaniem.
180 526
2. Roztwory do badań: a. Dostępna w handlu proteaza asparaginianowa (Typ XIII) z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 jednostek/mg); b. pepsyna (1 mg/ml, 2900 jednostek/ml); oraz c. albumina z surowicy wołowej (BSA) (2 mg/ml w wodzie) (wszystkie z firmy Sigma Chemical Co.)
3. Bibuła impregnowana żywicą gwajakową w postaci dostępnych w handlu arkuszy HemoccultR (z firmy Smith Kline Diagnostics)
4. Bufory i roztwory
a. 0,02% (obj./obj.) nadtlenek wodoru w 200 mM buforze fosforanowym, pH 7,0
b. 100 mM bufor octanowy, pH 4,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [Sepharose-Hemoglobina-HRPO] (lub równoważna mioglobina) zawieszono w 75 mikrolitrach buforu octanowego o pH 4,0 i dodano 25 mikrolitrów roztworu do badań. Zawiesinę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut i odwirowano, aby usunąć stałą fazę koniugatu. Na arkusze z żywicą gwajakową wprowadzono pięć mikrolitrów supematantu, a następnie pięć mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C. WYNIKI
W obszarze arkusza impregnowanego żywicą gwajakową, do którego dodano próbki supematantu zawierającego proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi lub pepsynę zaobserwowano ciemnoniebieską barwę. W obszarze arkusza, do którego dodano porcje supematantu zawierającego jedynie BSA (2 mg/ml) lub bufor, zaobserwowano tylko bardzo delikatne zabarwienie.
| ŹRÓDŁO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Proteaza asparaginianowa | 2,0 |
| Pepsyna | 2,0 |
| BSA | +/- |
| Bufor | +/- |
D. INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa z Aspergillus saitoi i pepsyna, proteaza asparaginianowa z żołądka świńskiego, hydrolizowała hemoglobinę lub mioglobinę związaną z Sepharose, uwalniając rozpuszczalną, aktywną HRPO. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z Sepharose, w roztworze pozostała jedynie HRPO solubilizowaną enzymem. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru, wytwarzając niebieską barwę. Tym samym, wytworzenie niebieskiej barwy na arkuszach pokrytych żywicą gwajakową dostarcza dogodnego sposobu wykrywania aktywnej proteazy asparaginianowej z Aspergillus lub pepsyny świńskiej.
Zarówno BSA, jak i bufor nie wykazują aktywności proteazy asparaginianowej. Tak więc, związana z Sepharose hemoglobina lub mioglobina nie była zhydrolizowana i rozpusz
180 526 czalna, aktywna HRPO nie uwalniała się z nośnika. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z Sepharose w roztworze nie było HRPO zsolubilizowanej z proteazą asparaginianową. Utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru nie było katalizowane i wytworzyła się nieznacznie wykrywalna barwa niebieska.
EKSPERYMENT IV
Eksperyment dotyczy uwolnienia HRPO z [Sepharose-Kazeina-HRPO] lub [Sepharose-Kappa-Kazeina-HRPO] przez pepsynę i proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi:
A. MATERIAŁY: (Sepharose aktywowana bromkiem cyjanu) (Metoda sprzęgania z użyciem hydrazydu HRPO)
1. Sepharose 4B aktywawana bromkiem cyjanu (Preparat A) pozostawiona do przereagowania z Kappa-kazeiną-HRPO lub Kazeiną-HRPO (metoda hydrazydowa) (Preparaty B i C).
2. Roztwory do badań: a.Handlowo dostępna proteaza asparaginianowa z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 jednostek/mg); b. pepsyna (1 mg/ml, 2900 jednostek/mg); oraz c. albumina z surowicy wołowej (BSA) (2 mg/ml roztwór w wodzie) (wszystkie z firmy Sigma Chemical Co.).
3. Bibuła impregnowana żywicą gwajakową w postaci dostępnych w handlu arkuszy HemoccultR.
4. Bufory i roztwory
a. 0,02% (obj./obj.) nadtlenek wodoru w 200 mM buforze fosforanowym, pH 7,0
b. 100 mM bufor octanowy, pH 4,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa)koniugatu [Sepharose-Kazeina-HRPO] (lub równoważnika Kappa-Kazeiny) zawieszono w 75 mikrolitrach buforu octanowego, pH 4,0 i dodano 25 mikrolitrów roztworu do badań. Zawiesinę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut i odwirowano, aby usunąć stałą fazę koniugatu. Do arkusza gwajakowego dodano pięć mikrolitrów supematantu, a następnie pięć mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C. WYNIKI
Na arkuszu impregnowanym żywicą gwajakową w obszarze, do którego dodano próbki supematantu zawierającego proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi lub pepsynę zaobserwowano ciemnoniebieską barwę. Na obszarze, do którego dodano próbki zawierające tylko BSA (2,0 mg/ml) lub bufor zaobserwowano tylko delikatne niebieskie zabarwienie.
| ZRODLO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Proteaza asparaginianowa | 2,0 |
| Pepsyna | 2,0 |
| BSA | +/- |
| Bufor | +/- |
180 526
D. INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa i pepsyna świńska hydrolizowała kazeinę lub Kappa-kazeinę związaną z Sepharose, uwalniając rozpuszczalną, aktywną HRPO. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z Sepharose, w roztworze pozostała tylko HRPO solubilizowana enzymem. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru, wytwarzając niebieską barwę. Tak więc, powstawanie niebieskiej barwy na arkuszach z warstwą żywicy gwajakowej dostarcza dogodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej lub pepsyny.
Zarówno BSA, jak i bufor nie wykazywały aktywności proteazy asparaginianowej. Tak więc, związana z Sepharose kazeina lub Kappa-kazeina nie była zhydrolizowana i rozpuszczalna, aktywna HRPO nie uwalniała się z nośnika. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z Sepharose w roztworze nie było HRPO solubilizowanej proteazą asparaginianową. Utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru nie było katalizowane i wytworzyła się nieznacznie wykrywalna barwa niebieska.
EKSPERYMENT V
Eksperyment ten dotyczy uwalniania HRPO z [Chityna-Kappa-Kazeina-HRPO] przez pepsynę proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi.
A. MATERIAŁY: (Chityna aktywna bromkiem cyjanu) (metoda sprzęgania z użyciem hydrazydu HRPO)
1. Chityna aktywowana bromkiem cyjanu (Preparat A) poddana reakcji z Kappa-Kazeina-HRPO (metoda hydrazydowa) (Preparaty B i C)
2. Roztwory do badań:
a. Handlowo dostępna proteaza asparaginianowa z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 jednostek/mg);
b. pepsyna (1 mg/ml, 2900 jednostek/mg) oraz;
c. albumina z surowicy wołowej (BSA) (2 mg/ml roztwór w wodzie) (wszystkie z firmy Sigma Chemical Co).
3. Bibuła impregnowana żywicą gwajakową w postaci dostępnych w handlu arkuszy HemoccultR (z firmy Smith Kline Diagnostic)
4. Bufory i roztwory
a. 0,02% (obj./obj.) nadtlenek wodoru w 200 mM buforze fosforanowym, pH 7,0
b. 100 mM bufor octanowy, pH 4,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [Chityna-Kappa-Kazeina-HRPO] zawieszono w 75 ml buforu octanowego, pH 4,0, i dodano 25 mikrolitrów roztworu do badań. Zawiesinę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut i odwirowano, aby usunąć stałą fazę koniugatu. Do arkusza z żywicą gwajakową dodano pięć μΐ supematantu, a następnie pięć mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
180 526
C. WYNIKI
Na arkuszu impregnowanym żywicą gwajakową w obszarze, do którego dodano próbki supematantu zawierającego proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi lub pepsynę zaobserwowano ciemnoniebieską barwę. Na obszarze, do którego dodano próbki supematantu zawierającego tylko BSA (2,0 mg/ml) lub bufor zaobserwowano tylko delikatne niebieskie zabarwienie.
| ŹRODLO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Proteaza asparaginianowa | 2,0 |
| Pepsyna | 2,0 |
| BSA | +/- |
| Bufor | +/- |
D. INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa i pepsyna świńska hydrolizowała kazeinę lub Kappa-kazeinę związaną z SigmacellR 20, uwalniając rozpuszczalną, aktywną HRPO. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z SigmacellR20, w roztworze pozostał tylko enzym solubilizowany HRPO. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodom, wytwarzając niebieską barwę. Tak więc, powstawanie niebieskiej barwy na arkuszach z warstwą żywicy gwajakowej dostarcza dogodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej lub pepsyny.
Zarówno BSA, jak i bufor nie wykazywały aktywności proteazy asparaginianowej. Tak więc, związana z SigmacellR 20 hemoglobina lub mioglobina nie były zhydrolizowane i rozpuszczalna, aktywna HRPO nie uwalniała się z nośnika. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z SigmacellR20 w roztworze nie było HRPO solubilizowanej proteazą asparaginianową. Utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru nie było katalizowane i wytworzyła się nieznacznie wykrywalna barwa niebieska.
EKSPERYMENT VI
Eksperyment dotyczy uwolnienia HRPO z [SigmacellR 20-Hemoglobina-HRPO] lub [SigmacellR 20-Mioglobina-HRPO] przez pepsynę i proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi
A. MATERIAŁY: (SigmacellR20 aktywowany bromkiem cyjanu) (Metoda sprzęgania z użyciem HRPO)
1. SigmacellR 20 aktywowany bromkiem cyjanu (Preparat A) najpierw derywatyzowany kowalencyjnie związaną hemoglobiną lub mioglobiną (Preparat E), a następnie znakowany aldehydem HRPO (Preparaty D-F). Koniugat traktowano przez noc 100 mM cyjanoborowodorkiem sodu w temperaturze pokojowej i przed użyciem przemyto 0,5 M NaCl.
2. Roztwory do badań: a. Handlowo dostępna proteaza asparaginianowa z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 jednostek/mg); b. pepsyna (1 mg/ml, 2900 jednostek/mg); oraz c. albumina z surowicy wołowej (BSA) (2 mg/ml roztwór w wodzie) (wszystkie z firmy Sigma Chemical Co.)
3. Bibuła impregnowana żywicą gwajakową w postaci dostępnych w handlu arkuszy HemoccultR
4. Bufory i roztwory
a. 0,02% (obj./obj.) nadtlenek wodoru w 200 mM buforze fosforanowym, pH 7,0
b. 100 mM bufor octanowy, pH 4,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [SimgacellR 20-Hemoglobina-HRPO] (lub równoważnie mioglobiny) zawieszono w 75 ml buforu octanowego o pH 4,0 i dodano 25 mikrolitrów roztworu do badań. Zawiesinę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut i odwi
180 526 rowano, aby usunąć stałą fazę koniugatu. Do arkusza z żywicą gwajakową dodano pięć mikrolitrów supematantu, a następnie pięć mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C. WYNIKI
Na arkuszu impregnowanym żywicą gwajakową w obszarze, do którego dodano próbki supematantu zawierającego proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi lub pepsynę zaobserwowano ciemnoniebieską barwę. Na obszarze, do którego dodano próbki supematantu zawierającego tylko BSA(2,0 mg/ml) lub bufor zaobserwowano tylko delikatne niebieskie zabarwienie.
| ZRODLO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Proteaza asparaginianowa | 2,0 |
| Pepsyna | 2,0 |
| BSA | +/- |
| Bufor | +/- |
D. INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa i pepsyna świńska hydrolizowała hemoglobinę lub mioglobinę związaną z SigmacellR 20, uwalniając rozpuszczalną, aktywną HRPO. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z SigmacellR 20, w roztworze pozostał tylko enzym solubilizowany z HRPO. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodom, wytwarzając niebieską barwę. Tak więc, powstawanie niebieskiej barwy na arkuszach z warstwą żywicy gwajakowej dostarcza dogodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej lub pepsyny.
Zarówno BSA, jak i bufor nie wykazywały aktywności proteazy asparaginianowej. Tak więc, związana z SigmacellR20 hemoglobina lub mioglobina nie były zhydrolizowane i rozpuszczalna, aktywna HRPO nie uwalniała się z nośnika. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z SigmacellR20 w roztworze nie było HRPO zsolublilizowanej z proteazą asparaginianową. Utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodom nie było katalizowane i wytworzyła się nieznacznie wykrywalna barwa niebieska.
EKSPERYMENT VII
Eksperyment dotyczy uwolnienia HRPO z [SigmacellR 20-Kappa-Kazein-HRPO] przez pepsynę i proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi.
A. MATERIAŁY: (SigmacellR 20 aktywowany bromkiem cyjanu) (Metoda sprzęgania z użyciem hydrazydu HRPO)
1. SigmacellR 20 aktywowany bromkiem cyjanu (Preparat A) poddany reakcji z Kappa-Kazeina-HRPO (metoda hydrazydowa) (Preparaty B i C)
180 526
2. Roztwory do badań: a. Handlowo dostępna proteaza asparaginianowa z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 jednostek/mg); b. pepsyna (1 mg/ml, 2900 jednostek/mg); oraz c. albumina z surowicy wołowej (BSA) (2 mg/ml roztwór w wodzie) (wszystkie z firmy Sigma Chemical Co.)
3. Bibuła impregnowana żywicą gwajakową w postaci dostępnych w handlu arkuszy HemoccultR
4. Bufory i roztwory
a. 0,02% (obj./obj.) nadtlenek wodoru w 200 mM buforze fosforanowym, pH 7,0
b. 100 mM bufor octanowy, pH 4,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [Sigmacellr 20-Kappa-Kazeina-HRPO] zawieszono w 75 ml buforu octanowego, pH 4,0 i dodano 25 mikrolitrów roztworu do badań. Zawiesinę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut i odwirowano, aby usunąć stałą fazę koniugatu. Do arkusza z żywicą gwajakową dodano pięć mikrolitrów supematantu, a następnie pięć mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C. WYNIKI
Na arkuszu impregnowanym żywicą gwajakową w obszarze, do którego dodano próbki supematantu zawierającego proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi lub pepsynę zaobserwowano ciemnoniebieską barwę. Na obszarze, do którego dodano próbki supematantu zawierającego tylko BSA (2,0 mg/ml) lub bufor zaobserwowano tylko delikatne niebieskie zabarwienie.
| ŹRÓDŁO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Proteaza asparaginianowa | 2,0 |
| Pepsyna | 2,0 |
| BSA | +/- |
| Bufor | +/- |
D. INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa i pepsyna świńska hydrolizowała Kappa-Kazeinę związaną z SigmacellR 20, uwalniając rozpuszczalną, aktywną HRPO. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z SigmacellR 20, w roztworze pozostał tylko enzym solubilizowany HRPO. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru, wytwarzając niebieską barwę. Tak więc, powstawanie niebieskiej barwy na arkuszach z warstwą żywicy gwajakowej dostarcza dogodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej lub pepsyny.
Zarówno BSA, jak i bufor nie wykazywały aktywności proteazy asparaginianowej. Tak więc, związana z SigmacellR20 Kappa-Kazeina nie była zhydrolizowana i rozpuszczalna, aktywna HRPO nie zwalniała się z nośnika. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z SigmacellR20 w roztworze nie było HRPO solublilizowanej proteazą asparaginianową. Utlenianie
180 526 żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru nie było katalizowane i wytworzyła się nieznacznie wykrywalna barwa niebieska.
EKSPERYMENT VIII
Eksperyment jest przykładem uwalniania HRPO z [SigmacellR 20-Kappa-Kazeina-HRPO] (metoda hydrazydowa) lub [SigmacellR 20-Mioglobina/Hemoglobina-HRPO] (metoda aldehydowa) przez proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi lub pepsynę.
A. MATERIAŁY: (SigmacellR 20 aktywowany bromkiem cyjanu) (Preparat A) derywatyzowany Kappa-Kazeiną i HRPO (metoda hydrazydowa) (Preparat B). Alternatywnie, SigmacellR 20 aktywowany bromkiem cyjanu derywatyzowany hemoglobiną lub mioglobiną (Preparat E), i następnie sprzężony z aldehydem HRPO (Preparat D)
2. Roztwory do badań: a. Handlowo dostępna proteaza asparaginianowa z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 jednostek/mg); b. pepsyna (1 mg/ml, 2900 jednostek/mg); oraz c. albumina z surowicy wołowej (BSA) (2 mg/ml roztwór w wodzie) (wszystkie z firmy Sigma Chemical Co.)
3. Bibuła impregnowana żywicą gwajakową w postaci dostępnych w handlu arkuszy HemoccultR
4. Bufory i roztwory
a. 0,02% (obj./obj.) nadtlenek wodoru w 200 mM buforze fosforanowym, pH 7,0
b. 100 mM bufor octanowy, pH 4,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [SimgacellR 20-Kappa-Kazeina-HRPO] zawieszono w 75 ml buforu octanowego, pH 4,0 i dodano 25 mikrolitrów roztworu do badań. Zawiesinę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut i odwirowano, aby usunąć stałą fazę koniugatu. Do arkusza z żywicą gwajakową dodano pięć mikrolitrów supernatantu, a następnie pięć mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C. WYNIKI
Na arkuszu impregnowanym żywicą gwajakową w obszarze, do którego dodano próbki supernatantu zawierającego proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi lub pepsynę zaobserwowano ciemnoniebieską barwę. Na obszarze, do którego dodano próbki supernatantu zawierającego tylko BSA (2,0 mg/ml) lub bufor zaobserwowano tylko delikatne niebieskie zabarwienie.
| ŹRODLO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Proteaza asparaginianowa | 2,0 |
| Pepsyna | 2,0 |
| BSA | +/- |
| Bufor | +/- |
180 526
D. INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa i pepsyna świńska hydrolizowała Kappa-Kazeinę związaną z SigmacellR 20, uwalniając rozpuszczalną aktywną HRPO. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z SigmacellR20, w roztworze pozostał tylko enzym solubilizowany HRPO. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru, wytwarzając niebieskąbarwę. Tak więc, powstawanie niebieskiej barwy na arkuszach z warstwą żywicy gwajakowej dostarcza dogodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej lub pepsyny.
Zarówno BSA, jak i bufor nie wykazywały aktywności proteazy asparaginianowej. Tak więc, związana z SigmacellR 20 Kappa-kazeina nie była zhydrolizowana i rozpuszczalna, aktywna HRPO nie zwalniała się z nośnika. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z SigmacellR 20 w roztworze nie było HRPO zsolublilizowanej z proteazą asparaginianową. Utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru nie było katalizowane i wytworzyła się nieznacznie wykrywalna barwa niebieska.
EKSPERYMENT IX
Eksperyment jest przykładem uwalniania HRPO z [SigmacellR 20-Hemoglobina-HRPO] lub [SigmacellR 20-Mioglobina-HRPO] przez proteazę asparaginianową uwolnioną przez hodowlę Candida albicans.
A. MATERIAŁY: (SigmacellR 20 aktywowany aldehydem) (Metoda sprzęgania z użyciem aldehydu HRPO)
1. SigmacellR 20 aktywowany aldehydem (Preparat G) najpierw derywatyzowano kowalencyjnie związaną hemoglobiną lub mioglobiną (Preparat H), a następnie znakowany aldehydem HRPO (Preparaty D i F).
2. Proteaza asparaginianowa wytworzona przez hodowlę Candida albicans (ATCC 28366) namnożoną i wzrastającą w ciekłej hodowli, jak opisano w Journal of General Microbiology, (1983) 129:431-438
3. Arkusze z warstwą żywicy gwajakowej (Preparat S)
4. Bufory i roztwory
a. 20 mM nadtlenek wodoru
b. 500 mM bufor MES, pH 6,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [SimgacellR 20-Białko-HRPO] zawieszono w 300 mikrolitrach hodowli Candida albicans zawierającej wydzielonąproteazę asparaginianową lub w 300 mikrolitrach tej samej hodowli Candida albicans, którą dla deaktywowania proteazy asparaginianowej przez 20 minut utrzymywano w stanie wrzenia. Mieszaninę wirowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, i zawiesinę odwirowano, aby wytrącić stały koniugat i komórki Candida albicans.
Osiemdziesiąt mikrolitrów klarownego supematantu mieszano z 10 mikrolitrami roztworu nadtlenku wodoru i 10 mikrolitrami buforu MES. Na powierzchnię arkusza z warstwą żywicy gwajakowej wprowadzono dwadzieścia mikrolitrów każdego roztworu i badano arkusz pod kątem wytworzenia niebieskiego zabarwienia.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 1,5 | Barwa niebieska o intensywności pośredniej pomiędzy 1,0 i 2,0 |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
180 526
C. WYNIKI
Na arkuszu z warstwą żywicy gwajakowej w obszarze, do którego dodano Sepharosebiałko-HRPO potrakowane Candida albicans zaobserwowano ciemnoniebieską barwę. Na obszarze Sepharose-białko-HRPO potraktowanym wrzącą hodowlą nie zauważono żadnego zabarwienia.
| ZRODLO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Hodowla Candida albicans | 1,5 |
| Wrząca hodowla | 0 |
D. INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa wydzielana w pożywce hodowlanej przez komórki Candida albicans zhydrolizowała białko związane z SigmacellR 20, uwalniając rozpuszczalną aktywną HRPO. Podczas wirowania oddzielono osad HRPO związanej z Sepharosą pozostawiając w roztworze tylko HRPO solubilizowaną proteazą asparaginianową. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru, dając niebieską barwę. Tak więc, powstanie niebieskiej barwy na arkuszach pokrytych żywicą gwajakową dostarcza dogodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej.
Utrzymywanie hodowli w stanie wrzenia deaktywowało proteazę asparaginianową wydzielaną do pożywki hodowlanej przez Candida albicans. Tak więc, białko związane z SigmacellR20 nie zostało zhydrolizowane i rozpuszczalna, aktywna HRPO nie uwalniała się z nośnika. Przez wirowanie oddzielono osad HRPO związanej z SigmacellR20, ale w roztworze nie było HRPO solubilizowanej proteazą asparaginianową. Utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru nie było katalizowane, a wytworzona barwa niebieska była słabo wykrywalna. Uwolnienie HRPO z nośnika było wynikiem niespecyficznego uwolnienia HRPO przez sole i inne składniki obecne w pożywce hodowlanej.
EKSPERYMENT X
Eksperyment jest przykładem uwolnienia HRPO z [Polimerycznego dialdehydu-Kappa-Kazeina-HRPO] przez pepsynę i proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi.
A. MATERIAŁY: (Polimeryczny dialdehyd) (Metoda sprzęgająca z użyciem hydrazydu HRPO)
1. Dostępny w handlu polimeryczny dialdehyd z firmy Sigma Chemical Co., poddany reakcji z Kappa-Kazeina-HRPO (metoda hydrazydowa) (Preparaty B i L)
2. Roztwory do badań: a. Dostępna w handlu proteaza asparaginianowa z Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 jednostek/mg); b. pepsyna (1 mg/ml, 2900 jednostek/mg); oraz c. albumina z surowicy wołowej (BSA) (2 mg/ml roztwór w wodzie) (wszystkie z firmy Sigma Chemical Co.)
3. Bibuła impregnowana żywicą gwajakową w postaci dostępnych w handlu arkuszy HemocultR
4. Bufory i roztwory
a. 0,02% (obj./obj.) nadtlenek wodoru w 200 mM buforze fosforanowym, pH 7,0
b. 100 mM buforu octanowy, pH 4,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [Polimeryczny dialdehyd-Kappa-Kazeina-HRPO] zawieszono w 75 ml buforu octanowego, pH 4,0, i dodano 25 mikrolitrów roztworu do badań. Zawiesinę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut i odwirowano, aby usunąć stałą fazę koniugatu. Do arkusza z żywicą gwajakową dodano pięć mikrolitrów supematantu, a następnie pięć mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru.
180 526
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 1,5 | Barwa niebieska o intensywności pośredniej pomiędzy 1,0 i 2,0 |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C WYNIKI
Na arkuszu impregnowanym żywicą gwajakową w obszarze, do którego dodano próbki supematantu zawierającego proteazę asparaginianową z Aspergillus saitoi lub pepsynę zaobserwowano ciemnoniebieską barwę. Na obszarze, do którego dodano próbki supematantu zawierającego tylko BSA (2,0 mg/ml) lub bufor zaobserwowano tylko delikatne niebieskie zabarwienie.
| ZRODŁO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Proteaza asparaginianowa | 2,0 |
| Pepsyna | 2,0 |
| BSA | +/- |
| Bufor | +/- |
D INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa i pepsyna świńska hydrolizowała Kappa-Kazeinę związaną z polimerycznym dialdehydem, uwalniając rozpuszczalną, aktywną HRPO. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z polimerycznym dialdehydem, w roztworze pozostał tylko enzym solubilizowany HRPO. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru, wytwarzając niebieską barwę. Tak więc, powstawanie niebieskiej barwy na arkuszach z warstwą żywicy gwajakowej dostarcza wygodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej lub pepsyny.
Zarówno BSA, jak i bufor nie wykazywały aktywności proteazy asparaginianowej. Tak więc, związana z polimerycznym dialdehydem Kappa-kazeina nie była zhydrolizowana i rozpuszczalna, aktywna HRPO nie uwalniała się z nośnika. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z polimerycznym dialdehydem w roztworze nie było HRPO solubilizowanej proteazą asparaginianową. Utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru nie było katalizowane i wytworzyła się nieznacznie wykrywalna barwa niebieska.
EKSPERYMENT XI
Eksperyment dotyczy uwalniania HRPO z [Polimeryczny dialdehyd-Mioglobina-HRPO] przez proteazę asparaginianową z Candida albicans.
A.MATERIAŁY: (Polimeryczny dialdehyd) (Metoda sprzęgania z użyciem aldehydu HRPO)
1. Dostępny handlowo polimeryczny dialdehyd z firmy Sigma Chemical Co. poddany reakcji z mioglobiną (Preparat N) i następnie z aldehydem HRPO (Preparaty N).
2. Hodowla Candida albicans (ATCC 28366) wytwarzająca proteazę asparaginianową, namnożona i wzrastająca w ciekłej hodowli, jak opisano w Journal of General Microbiology, (1983), 129: 431-438
3. Arkusze z warstwą żywicy gwajakowej (Preparat S)
180 526
4. Bufory i roztwory
a. 20mM nadtlenek wodoru
b. 500 mM bufor MES, pH 6,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [Polimeryczny dialdehyd-Mioglobina-HRPO] zawieszono w 300 mikrolitrach hodowli Candida albicans zawierającej wydzieloną proteazę asparaginianową, lub w 300 mikrolitrach tej samej hodowli Candida albicans, którą dla deaktywowania proteazy asparaginianowej przez 20 minut utrzymywano wstanie wrzenia. Mieszaninę wirowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej, i zawiesinę odwirowano, aby wytrącić stały koniugat i komórki Candida albicans.
Osiemdziesiąt mikrolitrów klarownego supematantu mieszano z 10 mikrolitrami roztworu nadtlenku wodoru i 10 mikrolitrami buforu MES. Na powierzchnię arkusza z warstwą żywicy gwajakowej wprowadzono dwadzieścia mikrolitrów każdego roztworu i badano arkusz pod kątem wytworzenia niebieskiego zabarwienia.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 1,5 | Barwa niebieska o intensywności pośredniej pomiędzy 1,0 i 2,0 |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C. WYNIKI
Na arkuszu z warstwą żywicy gwajakowej w obszarze, do którego dodano polimeryczny dialdehyd-mioglobina-HRPO potraktowany Candida albicans zaobserwowano ciemnoniebieską barwę. Na obszarze polimeryczny dialdehyd-mioglobina-HRPO potraktowanym wrzącą hodowlą nie zauważono żadnego zabarwienia.
| ZRODLO ENZYMU | SKALA BARWY |
| Hodowla Candida albicans | 1,5 |
| Wrząca hodowla | 0 |
D.INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa wydzielana w pożywce hodowlanej przez komórki Candida albicans zhydrolizowała polimeryczny dialdehyd-mioglobinę, uwalniając rozpuszczalną, aktywną HRPO. Podczas wirowania oddzielono osad HRPO związanej z polimerycznym dialdehydem, pozostawiając w roztworze tylko HRPO solubilizowaną proteazą asparaginianową. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie żywicy gwajakowej nadtlenkiem wodoru, dając niebieską barwę. Tak więc, powstanie niebieskiej barwy na arkuszach pokrytych żywicą gwajakową dostarcza dogodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej.
Utrzymywanie hodowli w stanie wrzenia deaktywowało proteazę asparaginianową wydzielaną do pożywki hodowlanej przez Candida albicans. Tak więc, mioglobiną związana z polimerycznym dialdehydem nie została zhydrolizowana i rozpuszczalna, aktywna HRPO nie uwalniała się z nośnika. Przez wirowanie oddzielono osad HRPO związanej z polimerycznym aldehydem, ale w roztworze nie było HRPO solubilizowanej proteazą asparaginianową.
180 526
Utlenianie żywicy gwąjakowej nadtlenkiem wodoru nie było katalizowane, a wytworzona barwa niebieska była słabo wykrywalna. Uwolnienie HRPO z nośnika było wynikiem niespecyficznego uwolnienia HRPO przez sole i inne składniki obecne w pożywce hodowlanej.
EKSPERYMENT XII
Eksperyment dotyczy uwalniania HRPO z [Sepharose 6 MB-Kappa-Kazeina-HRPO] przez próbki wydzieliny pochwowej:
1. Normalna wydzielina pochwowa
2. Normalna wydzielina pochwowa, do której dodano hodowlę Candida albicans
3. Wydzielina pochwowa pobrana od kobiet, u których klinicznie stwierdzono kandydozę sromowo-pochwową
A. MATERIAŁY: (Handlowa Sepharose 6 MB aktywowana bromkiem cyjanu) (Metoda sprzęgania z użyciem hydrazydu HRPO)
1. Koniugat Sepharose 6 MB-Kappa-Kazeina-HRPO (Preparat C)
2. Próbki wydzieliny pochwowej uzyskane na standardowych wacikach do wymazów Dacron. Przed użyciem próbki zamrożono. Następnie próbki odmrożono i wirowano w specjalnie przystosowanych probówkach, aby umożliwić ekstrakcję nie rozcieńczonych wydzielin z wymazu. Badano cały materiał z każdego wymazu. W razie potrzeby dodawano do próbki destylowanej wody aż do osiągnięcia końcowej objętości 75 mikrolitrów. Do próbek wydzieliny pochwowej pobranych od kobiet, u których nie stwierdzono kandydozy sromowo-pochwowej dodawano 25 mikrolitrów hodowli Candida albicans (patrz np. Eksperyment I)
3. Bibuła filtracyjna impregnowana żywicą gwajakową (handlowe arkusze do testów HemoccultR)
4. Bufory i roztwory
a. 6 mM nadtlenek wodoru
b. 250 mM bufor glicyloglicynowy, pH 3,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu [Sepharose-Kappa-Kazeina-HRPO] zawieszono w 75 mikrolitrach traktowanej lub nie traktowanej wydzieliny pochwowej. Zawiesiny inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie odwirowano, aż do osadzenia stałego koniugatu i innych debris.
Do bibuły impregnowanej żywicą gwajakową dodano pięć mikrolitrów klarownych supematantów, a następnie 5 mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru i badano arkusze pod kątem wytworzenia niebieskiego zabarwienia.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| Ł0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C. WYNIKI
Na bibule impregnowanej żywicą gwajakową w obszarze, w którym dodano supematantu wydzieliny pochwowej pobranej od kobiet zakażonych kandydozą sromowo-pochwową zaobserwowano powstanie ciemnoniebieskiej barwy. Na obszarach bibuły impregnowanej żywicą gwajakową w których dodano supematantu wydzieliny pochwowej pobranej od kontrolnej grupy kobiet, nie zaobserwowano żadnego zabarwienia. Również intensywne niebieskie zabarwienie zaobserwowano na obszarach bibuły impregnowanej żywicą gwajakową
180 526 w których dodano supematantu wydzieliny pochwowej pobranej od zdrowych kobiet, ale uzupełnionej pożywką ze wzrastającą hodowlą Candida albicans.
| PRÓBKA NR | DIAGNOZA | SKALA BARWY |
| 7757 | Kandydoza | 2,0 |
| 7701 | Kandydoza | 2,0 |
| 7749 | Kandydoza | 2,0 |
| 7760 | Kandydoza | 2,0 |
| 7753 | Kandydoza | 2,0 |
| 7795 | Kandydoza | 2,0 |
| 7779 | Kandydoza | 2,0 |
| 7799 | Kandydoza | 2,0 |
| 7768 | Normalna | 1,0 |
| 7770 | Normalna | 0,0 |
| 7744 | Normalna | 0,0 |
| 7745 | Normalna | 0,0 |
| 7750 | Normalna | 0,0 |
| 7761 | Normalna | 0,0 |
| 0001 | Normalna | 0,0 |
| 0001 | Normalna+hodowla Candida | 2,0 |
| 7747 | Normalna+hodowla Candida | 2,0 |
| 7748 | Normalna+hodowla Candida | 1,0 |
| 7750 | Normalna+hodowla Candida | 2,0 |
| 7756 | Normalna+hodowla Candida | 2,0 |
D. INTERPRETACJA
Wydzielina pochwowa pobrana od kobiet z klinicznie stwierdzoną kandydozą sromowo-pochwową zawierała proteazę asparaginianową, która, przy pH 3,0 i przez 15 minut w temperaturze pokojowej, zhydrolizowała Kappa-kazeinę związaną z Sepharose 6 MB, uwalniając rozpuszczalną aktywną HRPO. Po odwirowaniu HRPO związanej z Sepharose 6 MB, w roztworze pozostała tylko uwolniona solubilizowana HRPO. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie arkuszy HemoccultR, wytwarzając niebieskie zabarwienie. Tak więc, powstanie niebieskiego zabarwienia na arkuszach HemoccultR dostarcza szybkiego i wygodnego sposobu wykrywania proteazy asparaginianowej wytwarzanej przez Candida w wydzielinie pochwowej, i tym samym kandydozy sromowo-pochwowej.
Wydzielina pochwowa pobrana od kobiet bez kandydozy sromowo-pochwowej nie zawierała proteazy asparaginianowej i przy pH 3,0 w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej nie hydrolizowała kappa-kazeiny związanej z Sepharose 6 MB, nie uwalniając rozpuszczalnej, aktywnej HRPO. Po odwirowaniu HRPO związanej z Sepharose 6 MB w roztworze nie było uwolnionej solubilizowanej HRPO. Wskutek braku katalizatora HRPO nie zaszło utlenianie arkuszy HemoccultR i nie wytworzyło się niebieskie zabarwienie. Tak więc, brak powstania niebieskiego zabarwienia na arkuszach HemoccultR jest szybkim i wygodnym sposobem wykrywania braku proteazy asparaginianowej wytwarzanej przez Candida w wydzielinie pochwowej i tym samym stwierdzenia, że~kobiety nie mają kandydozy sromowo-pochwowej.
180 526
Wreszcie, gdy pożywkę z hodowlą Candida albicans dodaje się do wydzieliny pochwowej pobranej od zdrowych kobiet bez kandydozy sromowo-pochwowej, przy pH 3 w ciągu 15 minut i w temperaturze pokojowej zachodzi hydroliza Kappa-kazeiny związanej z Sepharose 6 MB i rozpuszczalna aktywna HRPO zostaje uwolniona. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z Sepharose 6 MB, w roztworze pozostaje uwolniona solubilizowana HRPO. Rozpuszczalna HRPO katalizuje utlenianie arkuszy HemoccultR nadtlenkiem wodoru, wytwarzając niebieskie zabarwienie. Tak więc, powstanie niebieskiego zabarwienia na arkuszach HemoccultR wykazuje, że proteaza asparaginianowa uwolniona z pożywki hodowlanej przez komórki Candida albicans może być szybko i łatwo wykryta, nawet jeśli komórki dodaje się do wydzieliny pochwowej pobranej od zdrowych kobiet.
EKSPERYMENT XIII
Eksperyment ten dotyczy uwolnienia HRPO z [EupergitR C-Mioglobina-HRPO] i [SigmacellR 20-Mioglobina-HRPO] przez próbki wydzieliny pochwowej.
1. Normalna wydzielina pochwowa
2. Wydzielina pochwowa pobrana od kobiet z klinicznie stwierdzoną kandydozą sromowo-pochwową
A. MATERIAŁY: (SigmacellR 20-Mioglobina-HRPO-aktywowany bromkiem cyjanu Preparaty A i I) i EupergitR C-Mioglobina-HRPO - Preparat Q) (Metoda sprzęgania z użyciem aldehydu HRPO)
1. Subtelnie zmielone perełki oksiranoakrylowe sprzężone z Mioglobiną-aldehydem HRPO (Preparat Q)
2. SigmacellR 20 (aktywowany bromkiem cyjanu, Preparat A) sprzężony z Mioglobiną-aldehydem HRPO) (Preparat I)
3. Próbki wydzieliny pochwowej pobrane na standardowych wacikach do wymazów Dacron. Próbki zamrożono przed użyciem. Następnie próbki odmrożono i wirowano w specjalnie przystosowanych probówkach, aby umożliwić ekstrakcję nie rozcieńczonych wydzielin z wacika. Badano cały materiał z każdego wacika.
4. Bibuła filtracyjna impregnowana żywicą gwajakową (dostępne w handlu arkusze do testów HemoccultR)
5. Bufory i roztwory
a. 6 mM nadtlenek wodoru
b. 250 mM bufor glicyloglicynowy, pH 3,0
c. 1,0 M bufor octanowy, pH 4,0
B. PROCEDURY mg (wilgotna masa) koniugatu mioglobina-HRPO związanego z EupergitR C zawieszono w nierozcieńczonej wydzielinie pochwowej i 10 mikrolitrach 1 M buforu octanowego. Zawiesiny inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut, po czym odwirowano aż do wytrącenia stałego koniugatu i innych debris.
Do bibuły impregnowanej żywicą gwajakową dodano pięć mikrolitrów klarownych supematantów, a następnie 5 mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru i badano arkusze pod kątem wytworzenia niebieskiego zabarwienia.
mg (wilgotna masa) koniugatu mioglobina-HRPO związanego z SigmacellR 20 zawieszono w nierozcieńczonej wydzielinie pochwowej i 10 mikrolitrach 250 mM buforu octanowego. Zawiesiny inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut, po czym odwirowano aż do wytrącenia stałego koniugatu i innych debris.
Do bibuły impregnowanej żywicą gwajakową dodano pięć mikrolitrów klarownego supematantu, a następnie 5 mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru i badano arkusze pod kątem wytworzenia niebieskiego zabarwienia.
180 526
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C. WYNIKI
Na bibule impregnowanej żywicą gwajakową w obszarze, w którym dodano supematantu wydzieliny pochwowej pobranej od kobiet zakażonych kandydozą sromowo-pochwową zaobserwowano powstanie ciemnoniebieskiej barwy. Na obszarach bibuły impregnowanej żywicą gwajakową, w których dodano wydzielinę pochwową od kontrolnej grupy kobiet nie zaobserwowanego żadnego zabarwienia.
| NR PRÓBKI | DIAGNOZA | PODŁOŻE | BARWA |
| 7823 | Kandydoza | SigmacellR | 2,0 |
| 7824 | Kandydoza | SigmacellR | 2,0 |
| 7844 | Kandydoza | SigmacellR | 2,0 |
| 7848 | Kandydoza | SigmacellR | 2,0 |
| 7820 | Kontrolna | SigmacellR | 0,0 |
| 7821 | Kontrolna | SigmacellR | 0,0 |
| 7826 | Kontrolna | SigmacellR | 0,0 |
| 7831 | Kontrolna | SigmacellR | 0,0 |
| 7891 | Kandydoza | EupergitR C | 2,0 |
| 7921 | Kandydoza | EupergitR C | 2,0 |
| 7914 | Kontrolna | EupergitR C | +/- |
| 7915 | Kontrolna | EupergitR C | 0,0 |
D. INTERPRETACJA
Aktywna proteaza asparaginianowa wydzielana do wydzieliny pochwowej kobiet z klinicznie stwierdzoną kandydozą przez komórki Candida albicans hydrolizowała zarówno białko związane z SigmacellR 20, jak i białko związane z EupergitR, uwalniając rozpuszczalną aktywną HRPO. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z polimerem, w roztworze pozostała jedynie HRPO solubilizowana proteazą asparaginianową. Rozpuszczalna HRPO katalizowała utlenianie arkuszy z żywicą gwajakową wytwarzając niebieskie zabarwienie. Tak więc, powstanie niebieskiego zabarwienia na arkuszach impregnowanych żywicą gwajakową dostarcza szybkiego i skutecznego sposobu wykrywania aktywnej proteazy asparaginianowej w wydzielinie pochwowej, i tym samym, kandydozy sromowo-pochwowej.
W wydzielinie pochwowej pobranej od kontrolnej grupy kobiet, tzn. od kobiet bez klinicznie stwierdzonej kandydozy, nie stwierdzono aktywnej proteazy asparaginianowej. Tak więc, próbki wydzieliny pochwowej od kontrolnej grupy kobiet nie powodowały hydrolizowania białka związanego z polimerem i uwalniania rozpuszczalnej, aktywnej HRPO z nośnika. Po odwirowaniu osadu HRPO związanej z polimerem w roztworze nie było HRPO solubilizowanej proteazą asparaginianową. Wskutek braku HRPO, supematant z kontrolnych próbek
180 526 nie powodował katalizowania utleniania nadtlenkiem wodoru i wytwarzania niebieskiego zabarwienia. Tak więc, brak niebieskiego zabarwienia na bibule impregnowanej żywicą gwajakową stanowi dogodny sposób identyfikowania kobiet, które nie są zakażone sromowo-pochwowymi Candida albicans.
EKSPERYMENT XIV
Eksperyment dotyczy różnicowania aktywności hydrolitycznej proteaz niektórych bakterii na nośniku [SigmacellR-Mioglobina-HRPO]
A. MATERIAŁY:
1. [SigmacellR-Mioglobina-HRPO] (Preparaty E i F)
2. Hodowla Candida albicans (ATCC 28366) wytwarzająca proteazę asparaginianową
3. Hodowla Trichomonas vaginalis (ATCC 3001)
4. Zawiesina komórek Mobiluncus curtisii (ATCC 35241) w roztworze soli fizjologicznej
5. Bufory i roztwory
a. 0,02% roztwór nadtlenku wodoru
b. Fosforan potasu, bufor, pH 7,5, 300 mM
c. Octan sodu, bufor, pH 4,0, 100 mM
6. Bibuła impregnowana żywicą gwajakową (arkusze HemoccultR)
B. PROCEDURA
Dwadzieścia miligramów podłoża [SigmacellR-Mioglobina-HRPO] zawieszono w 75 mikrolitrach odpowiedniego buforu (patrz poniższa tabela), a następnie dodano 25 mikrolitrów hodowli komórek/zawiesinę. Mieszaninę inkubowano w czasie pomiędzy 10-30 minut, po czym próbki odwirowano, aby usunąć stałą fazę koniugatu i debris komórkowe. Do arkuszy z żywicą gwajakową dodano 5 mikrolitrów supematantów reakcyjnych i 5 mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru. Warunki reakcji i osiągnięte barwy przedstawiono w następującej tabeli.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C WYNIKI
Gdy do arkuszy z żywicą gwajakową dodano supematantów reakcyjnych inkubowanych buforem przy pH 4,0 lub pH 7,5 przez 30 minut, a następnie dodano nadtlenku wodoru, nie zaobserwowano żadnego zabarwienia. Podobne wyniki (tj. brak zabarwienia) odnotowano z wrzącymi hodowlami Candida albicans (pH 4,0 i 7,5), Trichomonas vaginalis (pH 4,0 i 7,5) lub Mobilluncus curtisii (pH 4,0 i 7,5). Po 10 minutach inkubacji przy pH 4,0 hodowla Candida albicans wytworzyła intensywne niebieskie zabarwienie, którego nie było przy pH 7,5 nawet po 30 minutach inkubacji. Trichomonas vaginalis spowodowała intensywne niebieskie zabarwienie po 30 minutach inkubacji i przy pH 7,5, ale po 30 minutach inkubacji przy pH 4,0 obserwowano jedynie słabo widoczną barwę. Hodowla Mobiluncus curtisii nie wytworzyła zabarwienia po 30 minutach inkubacji, zarówno przy pH 4,0 jak i 7,5.
180 526
| ŹRÓDŁO ENZYMU (HODOWLE KOMÓREK) | PH INKUBACJI | CZAS INKUBACJI | SKALA BARWY |
| Candida Albicans | 4,0 | 10 min. | 2,0 |
| Candida albicans | 7,5 | 30 min. | 0,0 |
| Wrząca Candida albicans | 4,0 | 30 min. | 0,0 |
| Wrząca Candida albicans | 7,5 | 30 min. | 0,0 |
| Mobiluncus curtisii | 4,0 | 30 min. | 0,0 |
| Mobiluncus curtisii | 7,5 | 30 min. | 0,0 |
| Wrząca Mobiluncus curtisii | 4,0 | 30 min. | 0,0 |
| Wrząca Mobiluncus curtisii | 7,5 | 30 min. | 0,0 |
| Trichomonas vaginalis | 4,0 | 30 min. | 0,25 |
| Trichomonas vaginalis | 7,5 | 30 min. | 2,0 |
| Wrząca T. vaginalis | 4,0 | 30 min. | 0,0 |
| Wrząca T. vaginalis | 7,5 | 30 min. | 0,0 |
| Bufor | 4,0 | 30 min. | 0,0 |
| Bufor | 7,5 | 30 min. | 0,0 |
D. INTERPRETACJA
Przy 300 mM buforze fosforanowym przy pH 7,5 lub 100 mM buforze octanowym przy pH 4,0 nawet trwająca 30 minut inkubacja nie uwalnia HRPO ze stałego nośnika. Podobnie, wrzące zawiesiny Candida albicans, Trichomonas vaginalis lub Mobiluncus curtisii nie uwalniają HRPO z temperaturze pokojowej przy pH 7,5 lub 4,0 nawet przy ponad 30-minutowej inkubacji. Jednakże hodowla Candida albicans uwalnia HRPO ze stałego nośnika przy pH 4,0 w ciągu 10 minut, ale nie jest zdolna do uwolnienia HRPO przy pH 7,5, nawet jeżeli inkubacja trwa więcej niż 30 minut. Jest to zgodne z ustalonym profilem pH proteazy asparaginianowej Candida albicans, która jest aktywna przy niskim pH, ale słabo aktywna lub nieaktywna przy wysokim pH. W przeciwieństwie do tego, hodowla T. vaginalis łatwo uwalnia HRPO ze stałego nośnika przy pH 7,5 i ponadto 30 minutowej inkubacji, ale przy pH 4,0 uwalnia tylko nieznacznie wykrywalne ilości HRPO. Zjawisko to jest również zgodne ze znanym profilem pH proteaz holowych T. vaginalis (tzn. aktywnych przy wysokim pH, ale dużo mniej aktywnych lub nieaktywnych przy niskim pH). W końcu, Mobiluncus curtisii, które są znane z wydalania proteaz, nie są zdolne do uwalniania HRPO zarówno przy pH 4,0, jak i 7,5, nawet jeżeli inkubacja trwa ponad 30 minut.
Tak więc, przez prowadzenie badań w warunkach różnych wartości pH możliwe jest rozróżnienie trzech bakterii: tylko Candida albicans spowodują zabarwienie po 10 minutach w temperaturze pokojowej i przy pH 4,0; tylko Trichomonas vaginalis spowodują zabarwienie przy pH 7,5 po 30 minutach i tylko Mobiluncus curtisii spowodują zabarwienie po 30 minutach i przy pH zarówno 7,5 jak i 4,0.
EKSPERYMENT XV
Eksperyment ten dotyczy aktywności różnych proteaz i ich inhibitorów na podłożu [EupergitR C-Mioglobina-HRPO]
A. MATERIAŁY
1. Sproszkowany [EupergitR C-Mioglobina-HRPO] (Preparat Q)
2. Dostępna w handlu proteaza asparaginianowa z firmy Sigma Chemical Co. (Typ XIII, z Aspergillus saitoi, 0,6 jednostek/mg aktywności) 40 mg/ml
3. Trypsyna (proteaza serynowa) z trzustki wołowej (2900 jednostek/mg aktywności, z firmy U.S. Biochemicals, 2 mg/ml
180 526
4. Papaina (proteaza tiolowa) z kauczuku papaya (12 jednostek/mg aktywności) z firmy Sigma Chemical Co., 2 mg/ml
5. Hodowla Candida albicans (ATCC 28366) wytwarzająca proteazę asparaginianową
6. Chlorowodorek ketonu chlorometylowego tosylolizyny (TLCK), 50 mM roztwór w etanolu z firmy Sigma Chemical Co.
7. Pepstatyna A ze źródła bakteryjnego, z firmy Sigma Chemical Co., 2 mg/ml w etanolu
8. Bufory i roztwory
a. Bufor, fosforan potasu, pH 7,0, 200 mM
b. Bufor, fosforan potasu, pH 7,4, 100 mM
c. Bufor, octan sodu, pH 4,0, 100 mM
d. 0,02% roztwór nadtlenku wodoru
e. Absolutny etanol
9. Bibuła impregnowana żywicą gwajakową (arkusze HemoccultR)
B. PROCEDURY
Próbę tę prowadzono w dwu częściach. W pierwszej oznaczano aktywność różnych proteaz na podłożu [EupergitR C-Mioglobina-HRPO], Enzymy i próbki kontrolne (enzymy gotowane przez 15 minut) inkubowano w 20 mg podłoża i buforami (patrz ilości w poniższej tabeli) przez 15 minut przed badaniem.
W drugiej części, enzymy inkubowano wstępnie przez 15 minut z odpowiednimi inhibitorami i buforami. Następnie dodano je do podłoża i inkubowano w temperaturze pokojowej przez następne 15 minut.
W obydwu etapach mieszaninę reakcyjną odwirowano aby usunąć stałą fazę koniugatu. Supematant (5 pg) dodano do arkuszy HemoccultR, po czym dodano 5 pl nadtlenku wodoru.
| SKALA BARWY | INTERPRETACJA |
| 0 | Nie powstaje widoczne zabarwienie niebieskie |
| +/- | Możliwe zabarwienie niebieskie |
| 0,25 | Delikatne zabarwienie niebieskie wykrywalne wizualnie |
| 0,5 | Wyraźna barwa niebieska |
| 1,0 | Barwa ciemnoniebieska |
| 2,0 | Najciemniejsza barwa niebieska możliwa do uzyskania w teście |
C. WYNIKI
1. Część I: Supematanty reakcyjne z kolb zawierających sam bufor zarówno przy pH 4,0, jak i 7,5, wytworzyły tylko nieznacznie zauważalny kolor, gdy dodano je do arkuszy z żywicą gwajakową po dodaniu nadtlenku wodoru jako substancji rozwijające. Te same wyniki zaobserwowano z supematantami reakcyjnymi zawierającymi wrzącą trypsynę przy pH 7,4, wrzącą hodowlę Candida przy pH 4,0 i wrzącą papainę przy pH 7,4. Przy nie wrzącej trypsynie i pH 7,4, nie wrzącej hodowli Candida i pH 4,0 i nie wrzącej papainie i pH 7,0 osiągnięto mocną niebieską barwę.
2. Część II: TLCK, inhibitor proteazy zdolny do inhibowania zarówno proteaz typu serynowego, jak i tiolowego, hamuje tworzenie się zabarwienia zarówno przez trypsynę (proteaza serynowa), jak papainę (proteaza tiolowa). Pepstatyna, znany inhibitor proteaz asparaginianowych hamuje wytwarzanie barwy przez proteazę asparaginianową Candida albicans.
180 526
TABELA
CZĘŚĆ 1
| ŹRÓDŁO ENZYMU (OBJ = 25 pL | BUFOR (OBJ - 75 pL) | SKALA BARWY |
| Trypsyna | pH 7,4 | 2,0 |
| Trypsyna (wrząca) | pH 7,4 | 0,25 |
| Hodowla Candida | pH 4,0 | 1,5 |
| Wrząca Candida | pH 4,0 | 0,25 |
| Papaina | pH 7,0 | 1,0 |
| Papaina (wrząca) | pH 7,4 | 0,25 |
| tylko bufory | 0,25 |
TABELA
CZĘŚĆ 2
| ENZYM | ROZTWÓR INHIBITORA | ETANOL(KONTROLA) | BUFOR, PH, OBJ | SKALA BARWY |
| Trypsyna | TLCK (10 μΐ) | 7,4, 65 μΐ | Ι,ο | |
| Trypsyna | - | - | 7,4, 65 μΐ | 2,0 |
| Papaina | TLCK (25 μΐ) | 25 μΐ | 7,0, 50 μΐ | 0,5 |
| Papaina | - | 7,0, 50 μΐ | 1,0 | |
| Proteaza asparaginianowa | Pepstatyna (25 μΐ) | 4,0, 50 μΐ | 0,5 | |
| Proteaza asparaginianowa | - | 25 μΐ | 4,0, 50 μΐ | 1,5 |
D. INTERPRETACJA
Trypsyna, proteaza serynowa hydrolizowała stałą fazę podłoża przy pH 7,4, uwalniając rozpuszczalną HRPO, która katalizowała powstawanie barwy niebieskiej na arkuszach z żywicą gwajakową. Tak samo było w przypadku proteazy asparaginianowej Candida albicans przy pH 4,0 i proteazy tiolowej - papainy - przy pH 7,0. Wrzenie zapobiegło uwolnieniu HRPO przez każdy z enzymów. Tak więc, każdy z trzech różnych typów enzymów był zdolny do hydrolitycznego uwolnienia rozpuszczalnej HRPO z nośnika w odpowiednich warunkach reakcji. Ani bufory, ani gorące deaktywowane enzymy nie uwolniły rozpuszczalnej HRPO, wskazując, że uwolnienie HRPO było jedynie wynikiem niespecyficznego uwolnienia spowodowanego przez sole, itd. w podłożu hodowlanym lub mieszaninie inkubacyjnej.
TLCK, inhibitor proteazy zdolny do inhibowania zarówno proteaz typu serynowego jak i tiolowego zahamował wytworzenie zabarwienia zarówno przez trypsynę (proteaza serynowa), jak i przez papainę (proteaza tiolowa). Pepstatyna, znany inhibitor proteaz asparaginianowych, hamuje wytwarzanie zabarwienia przez proteazę asparaginianową Candida albicans. Tak więc, prowadzenie inkubacji w obecności znanych specyficznych inhibitorów enzymów lub inhibitorów specyficznych typów enzymów, umożliwia wykrycie konkretnej hydroliazy.
180 526
Fig. 2
ISO 52.6
Nakład 10^·
Claims (17)
1. Sposób oznaczania obecności enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce, znamienny tym, że:
umieszcza się próbkę w urządzeniu do testu, które zawiera pierwszy i drugi stały nośnik, przy czym pierwszy stały nośnik zawiera enzym reporterowy związany z nim kowalencyjnie w taki sposób, że po działaniu hydrolazy uwalnia się, a na drugim nośniku, który nie kontaktuje się z pierwszym nośnikiem jest immobilizowany indykator, który jest substancją ulegającą wykrywalnej zmianie po działaniu enzymu reporterowego, a próbkę umieszcza się w tym urządzeniu w taki sposób, aby kontaktowała się z pierwszym i drugim stałym nośnikiem, i wobec czego enzym reporterowy uwolniony przez aktywność hydrolazową w próbce będzie dyfundował przez próbkę do drugiego stałego nośnika i obserwuje się, czy indykator ulega wykrywalnej zmianie, która świadczy o obecności aktywnej hydrolazy w próbce.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrolazajest proteazą wybraną z grupy obejmującej proteazy asparaginianowe, proteazy serynowe, proteazy tiolowe, metaloproteazy, proteazy kwaśne i proteazy alkaliczne.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę bada się na obecność enzymatycznie aktywnej proteazy asparaginianowej, która służy jako marker do wykrywania kandydozy.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę bada się na obecność enzymatycznie aktywnej proteazy tiolowej, która służy jako marker do wykrywania Trichomonas vaginalis.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 3 albo 4, znamienny tym, że enzym reporterowy stanowi peroksydaza, fosfataza, oksydoreduktaza, dehydrogenaza, transferaza, izomeraza, kinaza, reduktaza, deaminaza, katalaza, ureaza lub glukuronidaza.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako enzym reporterowy stosuje się peroksydazę chrzanową.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 3 albo 4, znamienny tym, że stały nośnik stanowi nierozpuszczalna matryca, żel lub żywica.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stały nośnik stanowi celuloza, agaroza, dekstran, poliakrylan, poliakryloamid lub ich pochodne, chityna, kuleczki oksiranoakrylowe, polimeryczny dialdehyd, skrobia, kolagen, keratyna, elastyna, sproszkowana skóra bydlęca, peptydoglikan ze ścianek komórek bakteryjnych lub jego fragmenty, nylon, politereftalan etylenu, poliwęglan lub szkło o kontrolowanej wielkości porów.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 3 albo 4, znamienny tym, że enzym reporterowy jest immobilizowany na stałym nośniku przy użyciu cząsteczki łącznika, która jest ulegającym hydrolizie substratem dla enzymatycznie aktywnej hydrolazy lub proteazy.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że cząsteczką łącznika jest białko lub peptyd.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że białkiem jest azokazeina, kazeina, kappa-kazeina, immunoglobulina, hemoglobina, mioglobina, albumina, elastyna, keratyna lub kolagen.
12. Sposób według zastrz. 1 albo 3 albo 4, znamienny tym, że wykrywalną zmianą jest zmiana koloru po działaniu enzymu reporterowego, który uwalnia się ze stałego nośnika przez działanie enzymatycznie aktywnej hydrolazy.
180 526
13. Sposób według zastrz. 1 albo 3 albo 4, znamienny tym, że enzym reporterowy po uwolnieniu ze stałego nośnika przez działanie enzymatycznie aktywnej hydrolazy jest zdolny do katalizowania powstawania sygnału fluorescencyjnego, fosforoscencyjnego, bioluminescencyjnego, chemiluminescencyjnego lub elektrochemicznego.
14. Sposób według zastrz. 1 albo 3 albo 4, znamienny tym, że enzym reporterowy jest zdolny do wytworzenia skrzepu, do aglutynacji, wytrącenia osadu lub strefy przejaśnienia.
15. Sposób według zastrz. 1 albo 3 albo 4, znamienny tym, że enzymem reporterowym jest peroksydaza, a indykatorem jest wizualny chromogeniczny indykator.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że chromogeniczny indykator jest wybrany z grupy obejmującej wodoronadtlenek i żywicę gwajakową, kwas 2,2'-azynobis(3-etyIo-benzotiazolino-6-sulfonowy), tetrametylobenzydynę, fenol, 4-aminoantypirynę i kwas 4,5-dihydroksynaftaleno-2,7-disulfonowy.
17. Urządzenie testowe do badania próbki na obecność enzymatycznie aktywnej hydrolazy, zwłaszcza enzymatycznie aktywnej proteazy asparaginianowej i proteazy tiolowej, znamienne tym, że obejmuje:
(a) naczynko (31) określone przynajmniej w części przez pierwszą (13) i drugą (14) ściankę położone naprzeciw siebie z wykładziną na wewnętrznych powierzchniach (35, 36, 37, 38) i szczeliną (47) między nimi, przy czym jedna lub obie ścianki wykonane są z materiału przepuszczającego światło, a w górnej ściance znajduje się otwór (18) do wprowadzania próbki i ewentualnie otwory wentylacyjne (19) i (20);
(b) stały nośnik na wewnętrznej powierzchni pierwszej lub drugiej ścianki z immobilizowanym na nim enzymie reporterowym, który się uwalnia po działaniu hydrolazy;
(c) wykładzinę na wewnętrznej powierzchni pierwszej lub drugiej ścianki z zawartym w niej indykatorem (34), który ulega wykrywalnej zmianie po działaniu enzymu reporterawego. * * *
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/048,539 US5418226A (en) | 1992-04-22 | 1993-04-14 | Monoquaternary 2,16-bispiperidinylandrostane derivatives |
| PCT/US1994/004098 WO1994024306A1 (en) | 1993-04-14 | 1994-04-13 | Reporter enzyme release technology: methods of assaying for the presence of aspartic proteases and other hydrolytic enzyme activities |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL311140A1 PL311140A1 (en) | 1996-02-05 |
| PL180526B1 true PL180526B1 (pl) | 2001-02-28 |
Family
ID=21955126
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94311140A PL180526B1 (pl) | 1993-04-14 | 1994-04-13 | Sposób oznaczania obecnosci enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce i urzadzenie testowe do badania obecnosci enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce PL PL PL PL PL |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3705441B2 (pl) |
| AU (1) | AU6633894A (pl) |
| BR (1) | BR9405963A (pl) |
| CA (1) | CA2160262C (pl) |
| CZ (1) | CZ289902B6 (pl) |
| HU (1) | HUT73393A (pl) |
| PL (1) | PL180526B1 (pl) |
| WO (1) | WO1994024306A1 (pl) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5571684A (en) * | 1994-11-07 | 1996-11-05 | Litmus Concepts, Inc. | Assay for proline iminopeptidase and other hydrolytic activities |
| MX9703163A (es) * | 1994-11-07 | 1997-07-31 | Litmus Concepts Inc | Ensayo para la iminopeptidasa de prolina y otras actividades hidroliticas. |
| GB0111987D0 (en) * | 2001-05-16 | 2001-07-04 | Univ Sheffield | Method |
| US9017963B2 (en) | 2002-01-31 | 2015-04-28 | Woundchek Laboratories (Us), Inc. | Method for detecting microorganisms |
| JP2009501715A (ja) * | 2005-07-13 | 2009-01-22 | イーシーアイ バイオテック インコーポレイティッド | 女性の状態を評価するための基質、センサー、および方法 |
| US7878644B2 (en) | 2005-11-16 | 2011-02-01 | Gerber Scientific International, Inc. | Light cure of cationic ink on acidic substrates |
| WO2007141030A2 (en) * | 2006-06-09 | 2007-12-13 | Bio Pur Ag | A method for the detection of enzymatic reactions |
| AT509355B1 (de) * | 2010-02-10 | 2012-04-15 | Univ Graz Tech | Testanordnung |
| CN116970479B (zh) * | 2023-09-25 | 2023-12-19 | 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司 | 一种胃蛋白酶测定试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4859581A (en) * | 1986-03-10 | 1989-08-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Endoglycosidase assay |
| US4789629A (en) * | 1986-11-24 | 1988-12-06 | Smithkline Beckman Corporation | Method and device for collecting and testing for fecal occult blood |
| DE4217474A1 (de) * | 1992-05-27 | 1993-12-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und Mittel zur Bestimmung eines Analyts |
-
1994
- 1994-04-13 JP JP52344194A patent/JP3705441B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-13 AU AU66338/94A patent/AU6633894A/en not_active Abandoned
- 1994-04-13 PL PL94311140A patent/PL180526B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-04-13 BR BR9405963A patent/BR9405963A/pt active Search and Examination
- 1994-04-13 CA CA002160262A patent/CA2160262C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-13 HU HU9502965A patent/HUT73393A/hu unknown
- 1994-04-13 CZ CZ19952664A patent/CZ289902B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-04-13 WO PCT/US1994/004098 patent/WO1994024306A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2160262C (en) | 2002-03-26 |
| HUT73393A (en) | 1996-07-29 |
| BR9405963A (pt) | 1996-01-30 |
| WO1994024306A1 (en) | 1994-10-27 |
| HU9502965D0 (en) | 1995-12-28 |
| CA2160262A1 (en) | 1994-10-27 |
| CZ266495A3 (en) | 1996-05-15 |
| JPH08509124A (ja) | 1996-10-01 |
| PL311140A1 (en) | 1996-02-05 |
| CZ289902B6 (cs) | 2002-04-17 |
| JP3705441B2 (ja) | 2005-10-12 |
| AU6633894A (en) | 1994-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0694077B1 (en) | Reporter enzyme release technology: methods of assaying for the presence of aspartic proteases and other hydrolytic enzyme activities | |
| US5571684A (en) | Assay for proline iminopeptidase and other hydrolytic activities | |
| US7964340B2 (en) | One-step enzymatic and amine detection technique | |
| US7504235B2 (en) | Enzyme detection technique | |
| EP2005180B1 (en) | Enzymatic detection techniques | |
| PL180526B1 (pl) | Sposób oznaczania obecnosci enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce i urzadzenie testowe do badania obecnosci enzymatycznie aktywnej hydrolazy w próbce PL PL PL PL PL | |
| EP2407549B1 (en) | Detection of trichomonas and candida | |
| JP2009532058A5 (pl) | ||
| CA1271419A (en) | Signal enhancement in immunoassay by modulation of chemical catalysis | |
| US5846754A (en) | Enzyme determination with protease inactivation | |
| JPS6187755A (ja) | 重合体単一層分析用素子 | |
| AU721069B2 (en) | Reporter enzyme release technology: methods of assaying for the presence of aspartic proteases and other hydrolytic enzyme activities | |
| EP0791071B1 (en) | Assay for proline iminopeptidase and other hydrolytic activities | |
| JP2000035427A (ja) | 乾式分析要素の製造方法及び乾式分析要素 | |
| EP1920253A2 (en) | Detection of proteases secreted from pathogenic microorganisms | |
| Ogawa | Immunoassay of Circulating Enzymes: Current Status |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20070413 |