PL186765B1

PL186765B1 - DNA, polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA, wektor, organizm gospodarza, zastosowanie transformowanego organizmu gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu

Info

Publication number: PL186765B1
Application number: PL96324225A
Authority: PL
Inventors: Linden Gledhill; Philip A. Greaves; John P. Griffin
Original assignee: Smithkline Beecham Plc
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2004-02-27
Also published as: SI0835316T1; AU6417396A; GB9513403D0; EP0835316A1; CN1145699C; PL324225A1; US6245524B1; PL188190B1; ATE239081T1; JPH11508450A; ES2198493T3; KR19990028533A; PT835316E; JP3819429B2; DE69627856D1; EP0835316B1; MX9800212A; CN1194002A; HK1010213A1; WO1997002349A1

Abstract

1. DNA obejmujacy sekwencje DNA przedstawiona na fig. 3 oznaczona jako SEQ ID nr 2, kodujaca polipeptyd posiada- jacy aktywnosc ligazy fenyloacetylokoen- zymu A (PAA-CoA) lub sekwencje DNA, która hybrydyzuje w scislych warunkach hybrydyzacji z sekwencja DNA oznaczona jako SEQ ID nr 2 i która koduje polipeptyd posiadajacy aktywnosc ligazy PAA-CoA. FIG. 1 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wektor do ekspresji enzymu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA w odpowiednim organizmie gospodarza zawierający sekwencję DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawiona na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, Iub sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA SEQ ID nr 2.

Następnym przedmiotem wynalazku jest organizm gospodarza transformowany sekwencją DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawiona na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, Iub sekwencją DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA (a), która koduje polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie transformowanego organizmu gospodarza do wytwarzania penicyliny Iub do wzrostu miana organizmów produkujących penicylinę, przy czym organizm ten transformowany jest sekwencją DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, Iub sekwencją DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z tą sekwencją DNA i która koduje polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania enzymu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA obejmujący transformację komórki gospodarza z gatunku Penicillium, hodowlę stransformowanej komórki gospodarza, obróbkę tej hodowli i odzyskiwanie produktu końcowego, polegający na tym, że hoduje się komórkę gospodarza transformowaną

186 765 wektorem zawierającym sekwencję DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, lub przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA SEQ ID nr 2, w celu uzyskania ekspresji enzymu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA, w odpowienim organizmie gospodarza, następnie prowadzi się ekstrakcję i oczyszczanie, gdzie aktywne frakcje chromatograficzne są wykrywane przy użyciu oznaczenia zależnego od PAA (kwasu fenylooctowego) i koenzymu A, dając w przybliżeniu 1000-krotny wzrost czystości.

Enzym można stosować w biotransformacjach in vitro. Np. do syntezy estru CoA albo do syntezy penicyliny mieszając z acylo-CoA : acylotransferazą ó-APA. Biotransformacje in vitro można prowadzić stosując całe komórki, ekstrakty bez komórek, komórki o zwiększonej przepuszczalności albo enzymy wydzielone z mikroorganizmów, albo którekolwiek z nich w postaci unieruchomionej.

Przy prowadzeniu biotransformacji przy użyciu całych komórek mikroorganizm może mieć postać rosnącej hodowli, odpoczywającej hodowli, przemytej grzybni, unieruchomionych komórek lub protoplastów.

Przy stosowaniu ekstraktów bez komórek przydatnie wytwarza się je przez ścinanie i/lub rozkład chemiczny lub enzymatyczny albo innymi sposobami rozrywania, korzystnie metodą nadźwiękowienia, i ewentualnie następnie usuwając resztki komórek, przy pozostawieniu aktywności enzymów w roztworze.

Enzym korzystnie wytwarza się zgodnie z poniższymi przykładami stosując dostępne w handlu szczepy P. chrysogenum, w tym typ naturalny NRRL 1951. Inne przydatne szczepy P. chrysogenum obejmują szczepy wytwarzające wysokie ilości penicyliny, np. szczep BW1901 (EMBO J. 9 (3), 741-747 (1990) D. J. Smith i in.).

Enzym można wytwarzać hodując mikroorganizm w typowy sposób, szczególnie w warunkach aerobowych w przydatnej pożywce ciekłej lub półstałej. Warunki hodowli mogą być następujące: temperatura w zakresie 5-50°C, korzystnie 25-30°C, a pH w zakresie 3-9, korzystnie 6-8, najkorzystniej 7,2.

Enzym można wydzielić i stosować w postaci oczyszczonej, postaci częściowo oczyszczonej, w stanie zanieczyszczonym tak jak otrzymano, jako przesącz z preparatu rozerwanych komórek. Najdogodniej enzym zostaje np. co najmniej częściowo oczyszczony w celu usunięcia innych enzymów, które mogłyby również katalizować niszczenie materiałów początkowych lub enzymu.

Najdogodniej enzym unieruchamia się na nierozpuszczalnym podłożu tak, jak w procedurach dyskutowanych przez Powella (1990) w Microbial Enzymes and Biotechnology, red. Fogarty & Kelly, str. 369-394. Daje to również korzyść w postaci zwiększonej wydajności i przerobu.

Przy prowadzeniu biotransformacji przy użyciu całych komórek przydatną pożywkę do hodowli stanowi pożywka: KH2PC4 2 g, K2HPO4 1,5 g, KCl 0,2 g, MgCh-ńHjO 0,2 g, Na2SO4-10H2O 0,22 g, glukoza 1,0 g w 1 litrze wody dejonizowanej o pH 6,5 lub wodnym układzie z dopasowaniem pH. .

Przy prowadzeniu biotransformacji przy użyciu ekstraktów bez komórek, pożywkę do hodowli stanowi odpowiedni bufor. Oprócz substratów enzymu, mieszanina reakcyjna może zawierać jeden lub więcej innych czynników, np. jonów metali lub stabilizatorów, np. tioli.

Biotransformację można przeprowadzić w środowisku wodnym, utrzymując przydatnie mieszaninę reakcyjną w zakresie pH 4-10, przydatniej od 6 do 10, korzystnie około 9,0. Korzystnie pH reguluje się buforami lub korzystnie metodą dodawania roztworu mianowanego kwaśnego lub zasadowego. Temperatura reakcji powinna ogólnie leżeć w zakresie 5-50°C, korzystnie 22-45°C, najkorzystniej 30-37°C. Alternatywnie, reakcję można prowadzić w rozpuszczalnikach organicznych albo w obecności rozpuszczalników organicznych np. acetonu, ketonu metylowo-izobutylowego (MlBK).

Czas reakcji zależy od takich czynników jak stężenie reagentów i czynników, temperatura i pH. Po zakończeniu reakcji produkt można wydzielić typowymi sposobami. Początkowe oczyszczanie dogodnie obejmuje etap chromatografii.

186 765

W dalszym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest DNA kodujące ligazę PAA-CoA niniejszego wynalazku. Gen kodujący tę proteinę znajduje się wewnątrz fragmentu DNA pokazanego na fig. 2. W szczególności DNA stanowi zasadniczo sekwencja DNA na fig. 3 / ID SEQ 2.

Należy rozumieć, że DNA według niniejszego wynalazku nie jest w swoim stanie naturalnym, lecz w postaci wydzielonej lub zasadniczo czystej. Należy rozumieć, że wynalazek obejmuje DNA, które może nie mieć dokładnej konfiguracji zilustrowanych miejsc restrykcji, jeśli to DNA wyprowadzono normalnymi technikami obejmującymi delecję, podstawienie, addycję lub inwersję nukleotydów z DNA zgodnie z dowolnym aspektem wyżej opisanego wynalazku.

Korzystnie DNA niniejszego wynalazku pochodzi z P. chrysogenum. Jednak przedmiotem wynalazku są również sekwencje DNA pochodzące z innych przydatnych organizmów, zwłaszcza organizmów wytwarzających innych niż P. chrysogenum, które to sekwencje nie mają konfiguracji pokazanych miejsc restrykcji, lecz hybrydyzują, korzystnie w ścisłych warunkach hybrydyzacji, z DNA pokazanym na fig. 2 Iub jego podfragmentem, i które kodują ligazę PAA-CoA lub enzym o aktywności ligazy PAA-CoA (ścisłe warunki hybrydyzacji podano np. w przykładzie 18).

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również wektor obejmujący takie DNA, korzystnie wektor ekspresji do ekspresji ligazy PAA-CoA w przydatnym organizmie gospodarza. Specyficznym przykładem takiego wektora ekspresji jest pBK-CMV (zakupiony od Stratagene) i stosowany w tym wynalazku do ekspresji w E. coli. W tym wynalazku wstawka cDNA ligazy PAA-CoA (= pPEN09, fig. 2) jest korzystnym wektorem do ekspresji w E. coli.

DNA według wynalazku i zawierające je wektory mogą znaleźć zastosowanie w wielu dziedzinach działalności przemysłowej. Odnosi się to również do mikroorganizmów gospodarzy zmienionych tymi wektorami i wyrażanymi przez nie enzymami. Np. DNA można wykorzystać jako sondę hybrydyzacji do identyfikowania i wydzielania związanych lub pokrywających się genów obecnych w całkowitym DNA komórkowym P. chrysogenum (NRRL 1951) i innych mikroorganizmów wytwarzających enzymy o podobnej strukturze i specyficzności.

Wektory rekombinowane zawierające to DNA po przeniesieniu do przydatnych gospodarzy mogą mieć znaczenie przy wytwarzaniu genetycznie zmienionych mikroorganizmów, które syntetyzują zwiększone ilości penicyliny.

Korzystnie jest zwiększyć ilość aktywności PAA-CoA w odpowiednim organizmie. Wektory rekombinowane można by również stosować przy wytwarzaniu nowych lub hybrydowych antybiotyków na drodze transferu genów (patrz np. D.A.Hopwood i in., Naturę, 1985, 341, 642-644). Enzymy kodowane przez DNA niniejszego wynalazku można stosować np. w układach bez komórek, zwłaszcza przy unieruchomieniu na przydatnych podłożach stałych, w celu wytwarzania znanych antybiotyków z naturalnych prekursorów albo nowych antybiotyków z „nienaturalnych” prekursorów otrzymanych np. metodą syntezy chemicznej.

DNA według wynalazku lub jego fragment (niekoniecznie zawierający nietknięty gen) można łączyć, albo technikami rekombinacji DNA albo metodą naturalnych procesów rekombinacji, z fragmentem genu zaangażowanym w biosyntezie w celu wytworzenia genu hybrydowego zdolnego do kierowania syntezą hybrydowego enzymu. Takie enzymy można stosować do wytwarzania nowych antybiotyków sposobami analogicznymi do opisanych tu uprzednio.

DNA według wynalazku można również modyfikować znanymi technikami mutagenezy ukierunkowanej na miejsca enzymu (w sposób analogiczny do opisanego np. przez G. Wintera i in., Naturę, 1982, 299, 756-758; albo przez Zollera i Smitha, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6487-6500) z wytworzeniem DNA, w którym dokonano specyficznych mutacji i/lub delecji. Zmutowane DNA można zastosować do otrzymania zwiększonej wydajności (lub miana) penicyliny z przydatnego mikroorganizmu gospodarza.

Zmutowane DNA można również stosować do otrzymania nowych lub hybrydowych antybiotyków metodą przenoszenia genów, lub stosować do wytwarzania zmutowanych enzymów (mutein), które można stosować do wytwarzania nowych antybiotyków metodami analogicznymi do opisanych tu uprzednio. Zmutowane DNA można również stosować do

186 765 zmieniania innych właściwości fermentacyjnych u przydatnych organizmów, np. tolerancję na PAA, zmienione substraty. .

Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami:

Przykład 1- Fermentacja P. chrysogenum

Zarodnikami Penicillium chrysogenum (SmithKline Beecham BW 1901) zaszczepiono 15 ml pożywki PVS (35 g/l wyciągu z kukurydzy, 15 g/l glukozy, 5 g/l CaCO3, 8 ml/l oleju rzepakowego, pH doprowadzone do 5,9 przy użyciu NaOH) w kolbie Erlenmeyera 100 ml. Kulturę hodowano przez 48 h w temperaturze 26°C wytrząsając ruchem orbitalnym (230 obr./min) przed pobraniem 1 ml całej brzeczki i przeniesieniem do 10 ml pożywki C5 (35 g/l wyciągu z kukurydzy, 85 g/l laktozy, 10 g/l CaCO3, 10 g/l NaH2PO4, 8 g/l (NH^SOą, 4 g/l MgSO4-7H2O, 4 g/l Na2SO4, 6 ml/l oleju rzepakowego, pH doprowadzone do 6,0 przy użyciu NaOH) w kolbie Erlenmeyera 100 ml. Następnie kulturę hodowano przez 55 h w temperaturze 26°C wytrząsając ruchem orbitalnym (230 obr./min) przed zebraniem grzybni.

Przykład 2 - Wytwarzanie ekstraktów protein z P. chrysogenum do oznaczenia, oczyszczenia i blottingu metodą Western ligazy PAA-CoA.

Grzybnie z kolby Erlenmeyera 55 h C% hodowane jak opisano w przykładzie 1 zebrano metodą sączenia przez sączki z mikrowłókien szklanych (Whatman GF/A). Matę grzybni przemyto 300 ml roztworu 0,9% (wag./obj.) chlorku sodowego (4°C), a następnie zdrapano z sączka i umieszczono w 10 ml buforu do oznaczania ligazy (30 mM Tris-HCl pH 9,0, 1 mM ditiotreitolu, 100 pg/ml Prefabloc™ w 50% glicerolu). Następnie grzybnię nadźwiękowiono na łaźni lodowej (rozrywanie 3 x 15 s przy użyciu generatora ultradźwięków Ultrasonics model W-385, nastawienie mocy 5, tempo cyklu 5 s, 50% cyklu roboczego), a następnie resztki grzybni sprasowano w pastylkę metodą odwirowania (18000 x g, 4°C, 30 min). Supernatant zamrożono w -70°C do przechowywania albo stosowano natychmiast do oznaczania ligazy PAA-CoA, oczyszczania lub blottingu metodą Western (przykład 7).

Przykład 3 - Oznaczanie ligazy PAA-CoA in vitro.

W celu wykazania obecności aktywności ligazy PAA-CoA w ekstraktach lub frakcjach z chromatografii kolumnowej mieszano 20 pl z roztworem 0,1 M kwasu fenylooctowego w 50 mM Tris-HCl pH 7,5 (20 pl), 0,1 M soli sodowej ATP (10 pl), 0,2 M chlorku magnezowego 10 pl, 0,02 M soli sodowej koenzymu A (10 pl) i 0,015 M ditiotreitolu (10 pl) w plastikowych probówkach Eppendorfa. Probówki mieszano ruchem wirowym (5 s), a następnie umieszczano w łaźni wodnej o temperaturze 30°C na 15 minut. Następnie do mieszaniny dodawano metanol (100 pl) i probówki odwirowywano (14K, 1 min) w celu wytrącenia protein. Frakcje supematantu analizowano na obecność PAA-CoA metodą HPLC (przykład 4). W każdej serii oznaczeń razem z wzorcem PAA-CoA jako próbę kontrolną dodatnią oznaczano ekstrakt protein wytworzony z fermentacji w kolbie P. chrysogenum (przykład 1) .

Przykład 4 - Analiza HPLC supernatantów z oznaczenia.

Próbki supernatantów z oznaczeń ligazy PAA-CoA (przykład 3) analizowano na obecność PAA-CoA używając układu HPLC Waters LCM1. Próbki (100 pl) wstrzykiwano na kolumnę sprężającą Radial Pak C18 w temperaturze pokojowej przy szybkości przepływu

2,5 ml/min, używając fazy ruchomej 0,2 M fosforanu sodowego pH 5,4 (Bufor A) izokratycznie od 0-4 min. Następnie stosowano liniowy gradient do 100% Bufora B zawierającego 0,16 M fosforan sodowy o pH 5,4 w 40% acetonitrylu (4-10 min). Przez dalsze 2 min utrzymywano 100% Bufora B, a następnie układ ponownie doprowadzano do równowagi przygotowując do następnego wstrzyknięcia przy użyciu liniowego gradientu z powrotem do 100% A (12-13 min). Piki wykrywano przy 260 nm, zaś PAA-CoA miał czas retencji 12 min. Za próbki dodatnie uznawano te, które miały piki współeluujące się ze wzorcem PAA-CoA i wykazywały takie same jak wzorzec widma absorpcyjne UV określone na spektrometrze z zespołem fotodiod.

Przykład 5 - Oczyszczanie ligazy PAA-CoA.

Wymagana była staranność, ponieważ stwierdzono skrajnie labilną aktywność enzymu. Nieskuteczne były próby strącania enzymu siarczanem amonowym, ponieważ w otrzymanym materiale nie można było stwierdzić żadnej aktywności. To samo przez się odróżnia niniejszy enzym od opisanego w WO 96/10085 (Gist-Brocades).

186 765

O ile nie stwierdzono inaczej, to następującą procedurę prowadzono w temperaturze 4°C stosując bufor C zawierający 30 mM Tris-HCl, 4 mM DTT, 4 mM EDTA, 5 mM MgCh i 20% glicerolu (obj.) przy pH 9,0. Rozdziały uzyskiwano stosując układ Pharmacia HiLoad™. Ekstrakt bez komórek (500 ml), wytworzony jak w przykładzie 1, rozmrażano powoli w temperaturze 4°C. Następnie ekstrakt nastawiano na pH 9,0 stosując 5 M NaOH przy mieszaniu na łaźni lodowej. Do tego mieszanego ekstraktu dodano 275 g żywicy jonowymiennej Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), którą uprzednio przemyto 3 l wody, a następnie 1 l buforu C. Tę mieszaninę mieszano przez 1,5 h na łaźni lodowej. Następnie zawiesinę przesączono przez dalsze 50 g przemytej żywicy Q-Sepharose na spiekanym sączku szklanym pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie żywicę przemyto kolejnymi 100 ml bufora C, a następnie zostawiono aż odciekła do sucha, otrzymując 600 ml klarownego ekstraktu zawierającego ligazę PAA-CoA. Następnie dodano siarczan amonowy (92,4 g, tj. ilość mniejsza niż do strącania) i roztwór mieszano na łaźni lodowej przez 1 h, po czym przesączono (sączek 0,45 pm, Millipore, typ HA).

Następnie ekstrakt ligazy PAA-CoA (700 ml) podano z szybkością 1 ml/min na kolumnę Phenylsepharose 6 Fast Flow o niskim podstawieniu (Pharmacia, 12 cm x 2,6 cm średnicy) uprzednio potraktowaną 1 1 bufora D (jak bufor C ze 140 g/l siarczanu amonowego). Następnie napełnioną kolumnę przemyto 230 ml bufora D z szybkością 0,8 ml/min, a potem eluowano liniowym gradientem od 100% bufora D do 100% bufora C przez 238 ml z szybkością 0,8 ml/min. Zbierano frakcje po 5,5 ml i testowano na obecność aktywności ligazy PAACoA, jak podano w przykładzie 3. Frakcje aktywne, od 41 do 49, zlano razem otrzymując 50 ml, które podano z szybkością 0,5 ml/min na 5 ml kolumnę HiTrap™ Blue do chromatografii powinowactwa (Pharmacia), uprzednio przemytą 50 ml bufora C. Napełnioną kolumnę przemyto 15 ml bufora C, a następnie eluowano stosując liniowy gradient od 100% bufora C do 100% bufora E w ciągu 25 ml z szybkością 0,5 ml/min. Bufor E był taki jak bufor C, z dodatkiem kwasu fenylooctowego do otrzymania końcowego stężenia 0,5 M, który ponownie nastawiono na pH 9,0 przy pomocy stałego NaOH. Eluowanie z kolumny powinowactwa przy pomocy naturalnego substratu zastosowano dla zwiększenia selektywności oczyszczania i dla umożliwienia pomiaru aktywności enzymu w powstałych frakcjach. Eluowanie NaCl okazało się nieskuteczne, ponieważ ta sól hamowała aktywność enzymu. W przeciwieństwie do tego enzym opisany w WO 96/10085 okazał się stabilny przy eluowaniu w KCl.

Frakcje aktywne 21, 22 i 23 zlano razem otrzymując 6 ml, które następnie rozdzielano przy szybkości przepływu 0,25 ml/min na wysokosprawnej kolumnie z wykluczaniem wielkości Sephacryl S-200 (Pharmacia, 64 cm x 2,6 cm średnicy), którą uprzednio równoważono w buforze F (jak bufor C, z nastawieniem na pH 7,5 przy użyciu 5 M HCl). Frakcje aktywne, 54 do 65, zlano razem otrzymując 11 ml, które zatężono do 60 ul metodą ultrasączenia wirówkowego (Centricon, odcinanie przy ciężarze cząsteczkowym 10000, Amicon Inc.). Analiza frakcji z kolumny wykluczania wielkości metodą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym-SDS (przykład 6) wykazała proteinę o ciężarze 63 000, której intensywność korelowała z aktywnością ligazy PAA-CoA. Do zakończenia oczyszczania i do umożliwienia sekwencjonowania aminokwasów N-terminalnych ligazy PAA-CoA zastosowano Blotting metodą Western (przykład 6).

Przykład 6 - Blotting metodą Western proteiny ligazy PAA-CoA.

W celu uzyskania materiału do sekwencjonowania aminokwasów N-terminalnych oczyszczoną proteinę (60 μΐ, przykład 5) zmieszano z równą objętością bufora próbki SDSPAGE zawierającego 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (10 ml), dodecylosiarczan sodowy (2 g, ultraczysty), 2-merkaptoetanol (1 ml), glicerol (10 ml), destylowaną wodę demineralizowaną (7 ml) i błękit bromochlorofenolowy 0,1% (2 ml). Tę mieszaninę gotowano przez 10 min i zostawiono do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Próbki (5, 15 i 20 ul) załadowano na wylany żel poliakryloamidowy 10% (żel spiętrzający 4%) w kuwecie do elektroforezy BioRad Mini Protean II, przygotowany przy zastosowaniu procedury producenta. Elektroforezę prowadzono w buforze elektrodowym zawierającym 0,025 M Tris, 0,192 M glicyny i 0,1% wag./obj. dodecylosiarczanu sodowego (ultra-czystego) przy 200 V przez 45 min, po czym żel poliakryloamidowy umieszczono w buforze do elektroblottingu (10 mM kwasu

186 765

3-[cykloheksyloamino]-1-propanosulfonowego, pH 11 w 10% metanolu) na 5 min. Proteiny w żelu poliakryloamidowym przeniesiono na membranę unieruchamiającą Applied Biosystems ProBlott™ przy użyciu kuwety do przenoszenia elektroforetycznego Bio-Rad Mini Trans-Blot zgodnie z procedurą Applied Biosystems. Na zakończenie blottingu membranę zabarwiono błękitem Coomassie R-250 stosując sposób barwienia w procedurze Applied Biosystems. Z membrany wycięto pasmo protein przy 63 kDa i ten materiał zastosowano do ustalania sekwencji aminokwasów N-terminalnych (przykład 7).

Przykład 7 - Ustalanie sekwencji aminokwasów N-terminalnych.

Sekwencję aminokwasów N-terminalnych uzyskano z proteiny po blottingu (przykład 6) stosując Applied Biosystems (ABI) 477A Pulsed Liquid Sequencer. Sekwencję uzyskano stosując normalną chemię Edmana z rozpoznawaniem uwolnionych aminokwasów znaczonych PTH przy pomocy chromatografii wąskokanałowej ABI 120A. Analiza oczyszczonej proteiny ligazy PAA-CoA dała następujące przypisanie sekwencji: V-F-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P

Przykład 8 - Synteza peptydu N-terminalnego ligazy PAA-CoA.

Sekwencję aminokwasów N-terminalnych określoną z proteiny 63 000 PAA-CoA (przykład 7) zastosowano do syntezy peptydu. Został on zsyntetyzowany przez Peptide and Protein Research Consultants (Washington Singer Laboratories, University of Exeter, Perry Road, Exeter, Devon EX4 4QG, UK) jako 50 mg wolnych peptydów. 12 mg skoniugowano z BSA (albuminą z osocza wołowego) aktywowaną maleimidem przy zastosowaniu SMCC (4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu sukcynoimidylu), a 2,5 mg skoniugowano z OVA (owalbuminą) aktywowaną maleimidem przy zastosowaniu MBS (estrem N-hydroksysukcynoimidowym m-maleimidobemzoilu).

Przykład 9 - Wytworzenie przeciwciał poliklonalnych wobec peptydu pochodzącego z N-konca proteiny 63 kDa ligazy PAA-CoA.

Peptyd sprzężony z BSA (przykład 8) wykorzystano do otrzymania przeciwciał poliklonalnych królika specyficznych wobec proteiny ligazy PAA-CoA. Koniugat peptyd-BSA (375 pg/1) wysterylizowano metodą sączenia (sączek 0,2 pm) i 1 ml sterylnego roztworu starannie zmieszano z 2 ml niewrzodziejącego kompletnego adjuwantu Freundsa (Brian Morris International, Guilford, Wielka Brytania). Całkowitą ilość 0,8 ml tej mieszaniny (100 pg koniugatu peptydu-BSA) podano podskórnie nowozelandzkim białym królikom (w przybliżeniu dziesięciotygodniowym) w czterech różnych miejscach iniekcji. Dalsze immunizacje podano w 28 i 58 dniu po początkowej immunizacji jak opisano wyżej, z tym wyjątkiem, że zastosowano nie-wrzodziejący niekompletny adjuwant Freundsa. Próbki krwi do testów pobrano z brzeżnej żyły ucha w 42 i 72 dniu po początkowej immunizacji dla oceny miana przeciwciał i specyficzności przy użyciu oznaczenia ELISA (oznaczenia immunosorbentu związanego z enzymem) (przykład 10).

Przykład 10 - Oznaczenie immunosorbentu związanego z enzymem (ELISA) do określenia miana przeciwciał i specyficzności wobec ligazy 63 kDa PAA-CoA. Oznaczenie miana przeciwciał

Płytkę do mikromianowania o 96 zagłębieniach płaskodennych (Nunc MaxiSorp™) pokryto koniugatem peptydu-OVA ligazy PAA-CoA (200 pl na zagłębienie, 0-10 pg/ml) w roztworze fizjologicznym buforowanym fosforanami pH 7,2 (8 g/l chlorku sodowego, 0,2 g/l chlorku potasowego, 1,44 g/l diwodoroortofosforanu sodowego, 0,24 g/l diwodoroortofosforanu potasowego, pH 7,2). Pokrytą płytkę do mikromianowania inkubowano w 4°C przez w przybliżeniu 18 h, po czym płytkę przemyto cztery razy buforem do przemywania (10 mM Tris, 0,15 M chlorku sodowego, 0,02% azydku sodowego, 0,05% Tween 20, pH 7,2) przy użyciu urządzenia do przemywania płytek Dynatech MRW. Ten sposób przemywania stosowano w pozostałej części procedury, o ile nie podano inaczej. Do płytki dodano bufor blokujący (1,56 g/l diwodoroortofosforanu sodowego, 0,5% gamma-globuliny wołowej z Sigma, pH 7,4, 200 pl na zagłębienie) i inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze Dynatech Varishaker przez 1 h. Wszystkie kolejne inkubacje w 37°C wykonywano tym sposobem. Płytkę przemyto cztery razy, a następnie do płytki dodano przeciwciało poliklonalne królika (100 pl na zagłębienie, rozcieńczenie 0-1:500000), rozcieńczone w buforze do oznaczenia (50 mM Tris, 150 mM chlorku sodowego, 1 mM chlorku magnezowego, 0,5% BSA,

186 765

0,25% gamma-globuliny wołowej, 0,02% azydku sodowego, pH 7,4), i inkubowano w temperaturze 37°C. Po przemyciu płytki, do płytki dodawano biotynylowane przeciwciało antykrólicze IgG z Amersham (100 μΐ na zagłębienie, rozcieńczenie 1:5000 w buforze do oznaczenia), i inkubowano w temperaturze 37°C. Płytkę przemyto i dodano do płytki koniugat streptawidyny z fosfatazą alkaliczną z Amersham (100 μΐ na zagłębienie, rozcieńczenie 1:2000 w buforze do oznaczenia), i inkubowano w temperaturze 37°C. Po przemyciu płytki dodano do płytki (100 μΐ na zagłębienie) fosforan p-nitrofenylu (Sigma, 1 mg/ml) rozpuszczony w buforze zawierającym 0,1 M glicyny, (7,51 g/l glicyny, 203 mg/l chlorku magnezowego, 136 mg/l chlorku cynkowego, pH 10,4), i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 min. Następnie dodano do płytki wodorotlenek sodowy (2 M, 50 μΐ na zagłębienie) i zmierzono absorbancję każdego zagłębienia przy 405 nm stosując czytnik płytek Anthos Labtec. Otrzymano miana przeciwciał pomiędzy 1:500000 i 1:1000000.

Oznaczanie specyficzności przeciwciała

Dla wykazania, że przeciwciała monoklonalne królika mogą reagować z nieskoniugowanym peptydem ligazy PAA-CoA wykonano oznaczenie ELISA jak opisano wyżej, ze zmianą na etapie inkubacji, który wykorzystywał przeciwciała poliklonalne królika. Przeciwciała rozcieńczono 1:100000-1:400000 w buforze do oznaczenia i 50 μl rozcieńczonego przeciwciała dodano do zagłębień zawierających 50 μΐ nieskoniugowanego peptydu (0-20 μg/ml) przygotowanego w buforze do oznaczenia zawierającym 2-merkaptoetanol (0,01% obj.). Przy stężeniu nieskoniugowanego peptydu w przybliżeniu 2 μg/ml osiągnięto 50% inhibicji reaktywności przeciwciała z koniugatem peptydu-OVA.

Przykład 11- Oznaczenie specyficzności przeciwciała na błotach uzyskanych metodą Western na ligazę PAA-CoA w ekstraktach z Penicillium chrysogenum, E. coli i na oczyszczonych próbkach proteiny.

Ekstrakty wytworzone z hodowli w kolbach Penicillium chrysogenum (BW 1901 i BW 1900A - szczep pochodzący z projektu przypadkowej mutacji), z E. coli JM109 i z próbek oczyszczonej proteiny ligazy PAA-CoA blottingowano metodą Western jak opisano w przykładzie 6, z tym że nie barwiono membrany błękitem Coomassie. Membrany po blottingu umieszczono w buforze blokującym (1,56 g/l diwodoroortofosforanu sodowego, 8,8 g/l chlorku sodowego, 0,2 g/l ficoll 400, 0,2 g/l poliwinylopirolidonu, 0,5% gamma-globuliny wołowej, pH 7,4) i inkubowano przez około 18 h w 4°C. Następnie membranę przemyto cztery razy buforem do przemywania (10 mM Tris, 0,15 M chlorku sodowego, 0,05% Tween 20, pH 7,2) przed inkubacją (temperatura pokojowa, 60 min) z przeciwciałami poliklonalnymi królika wytworzonymi jak podano w przykładzie 9 i uprzednio rozcieńczonymi 1:100 w buforze do oznaczania (50 mM Tris, 150 mM chlorku sodowego, 1 mM chlorku magnezowego, 0,5% BSA, 0,25% gamma-globuliny wołowej pH 7,4). Po czterech dalszych przemywaniach w buforze do przemywania membranę inkubowano z koniugatem oślej przeciwkróliczej IgG z peroksydazą chrzanu (Bio-Rad, 1:2000 w buforze do oznaczania, 60 min, temperatura pokojowa), a następnie czterokrotnie przemyto buforem do przemywania. Następnie membranę inkubowano z substratem peroksydazy (Bio-Rad Horseradish Peroxidase Conjugate Substrate Kit) przez 10 min w temperaturze pokojowej przed zatrzymaniem reakcji metodą przemycia błotu przy pięciu zmianach destylowanej wody zdemineralizowanej. Za wyniki pozytywne uznano te próbki proteiny ligazy PAA-CoA, które miały pasmo przy około 63 000, które współmigrowało z pasmem oczyszczonej ligazy PAA-CoA. W ekstrakcie protein E. coli JM 109 nie wykryto pozytywnego pasma przy 63 000.

Przykład 12 - Konstrukcja banku cDNA Penicillium chrysogenum.

Bank cDNA Penicillium chrysogenum (szczep SmithKline Beecham BW 1901) skonstruowano według podręcznika do ZAP Express™ cDNA Synthesis Kit z Stratagene. RNA wydzielono ze szczepu BW 1901 jak następuje. Szczep BW 1901 hodowano jak podano w przykładzie 1 przez 40 h przed zebraniem grzybni metodą sączenia przez dwa sączki z mikrowłókna szklanego Whatman GF/A 9,0 cm. Grzybnię przemyto 100 ml DEPC (dietylopirokarbanianu) potraktowanego wodą destylowaną. Następnie grzybnię roztarto w ciekłym azocie stosując moździerz i tłuczek potraktowane DEPC. Zamrożoną sproszkowaną grzybnię przeniesiono do probówki do wirówki 50 ml, zawierającej 10 ml roztworu G (4 M tiocyjanianu

186 765 guanidyniowego, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM EDTA). Proszek zawieszono w roztworze G i zostawiono na łaźni lodowej na 15 min. Resztki grzybni tabletkowano przy 17500 x g w temperaturze 4°C przez 20 min. Supernatant zebrano w innej probówce do wirówki 50 ml i RNA ekstrahowano jak opisali Chomczynski i Sacchi (1987) Analytical Biochemistry 162, 156-159. Z całkowitej ilości RNA wydzielono poliA+ RNA stosując zestaw wirującej kolumny z celulozą CP Laboratories Mini-Oligo (DT) zgodnie z instrukcją producenta. PoliA+ RNA analizowano metodą elektroforezy żelowej jak opisali Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (wydanie drugie). Pobrano próbki poliA+ RNA(5 pg) i wykorzystano do syntezy cDNA o podwójnym łańcuchu flankowanego przez miejsce restrykcji EcoRI na końcu 5' i miejsce restrykcji Xhol na końcu 3' cDNA, zgodnie z protokołem syntezy cDNA ZAP Express™ Stratagene. Tak zsyntetyzowane cDNA frakcjonowano zależnie od wielkości przepuszczając przez kolumny wirujące Sephacryl S-400 Stratagene dostarczone z zestawem do syntezy cDNA zgodnie z instrukcją producenta. Frakcjonowane cDNA ligowano do ramion Xhol i EcoRl /-ZAP Express zgodnie z podręcznikiem Stratagene. Następnie ligowane XDNA pakietowano stosując zestaw Gigapack II Gold Packaging Stratagene według procedury z podręcznika. Powstałe bakteriofagi cDNA wzmocniono przez posiewanie na pożywce stałej, inkubując przez 8 godzin. Otrzymano ponad 250000 niezależnych klonów i bakteriofagi eluowano w 20 ml pożywki SM (0,1 M NaCl, 0,01 M MgSO4, 0,05 M Tris-HCl pH 7,5, 0,01% żelatyny) na szalkę Nunc, podzielono i przechowywano jak opisali Sambrook i in. (1989).

Przykład 13 -Badania immunoprzesiewowe banku cDNA.

Bank λ ZAP Express cDNA z przykładu 12 badano przesiewowe na klony, które wyrażały proteinę ligazy PAA-CoA 65 kDa, stosując przeciwciała wytworzone jak podano w przykładzie 9. Bank cDNA przesiewano jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże. Bankiem λZAP Express w odpowiednim rozcieńczeniu zakażono E. coli szczep XL1 Blue MRF'. Zakażone bakterie hodowano przez 4 h na agarozie Luria zawierającej 10 mM MgSO4, 0,2% maltozy i 5 mM IPTG (w celu wzbudzenia ekspresji wstawki cDNA) w temperaturze 37°C przed nałożeniem nitrocelulozy (Hybond-C, Amersham) i inkubowaniem przez noc w temperaturze 37°C. Następnie sączki poddano badaniom immunoprzesiewowym stosując pierwotne przeciwciała królika (przykład 9) w rozcieńczeniach 1/1000, podczas gdy wtórne przeciwciało, kozie przeciwciało przeciwkrólicze skoniugowane z fosfatazą alkaliczną (produkt Sigma A-8025) zastosowano w rozcieńczeniach 1/2000. Lokalizację klonów pozytywnych przeprowadzono stosując tabletki BCIP/NBT (fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilu/nitrobłękit tetrazoliowy) zakupione od Sigma (produkt B-5655) zgodnie z instrukcją producenta. Zidentyfikowano i wybrano dwadzieścia cztery klony pozytywne, zawieszono ponownie w buforze SM (5,8 g/l NaCl, 2 g/l MgS04-7H20, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,01% żelatyny) i powtórnie badano przesiewowe przy niższej gęstości plamek aż do zidentyfikowania sygnału pozytywnego dla jednej plamki.

Przykład 14 - Subklonowanie klonów pozytywnych.

Pozytywne klony λZAP Express cDNA zidentyfikowane w badaniach immunoprzesiewowych (przykład 13) zostały wycięte jako plazmidowe pochodne pBKCMV przy zastosowania bakteriofaga pomocniczego ExAssist i procedury wycinania dostarczonej przez Stratagene. Następnie klony plazmidowe były hodowane (selekcja kanamycyną) i „minipreparowane” jak podali Sambrook i in. (1989) tamże. Następnie otrzymane plazmidy analizowano podwójnymi wyciągami Xbal/Sstl w celu scharakteryzowania wielkości wstawki cDNA klonów. Wstawki cDNA miały wielkość w zakresie od 700 bp (par zasad) do 2,8 kbp, przy największej grupie (12 klonów) posiadających wstawkę o wielkości 2,0 kbp. Plazmidy były również trawione przez Sau3 A (odcinający 4 pary zasad) dla potwierdzenia grup klonów na podstawie podobnych wzorów restrykcji. W ten sposób klony podzielono na 6 grup na podstawie wspólnych wzorów trawienia restrykcyjnego. Następnie reprezentatywne klony z każdej grupy testowano na produkcje proteiny 63 000 ligazy PAA-CoA metodą analizy Western i na aktywność enzymu.

186 765

Przykład 15 - Wykazanie pozytywnych klonów cDNA przy użyciu blottingu metodą Western.

Ekstrakty protein z reprezentatywnych wyciętych klonów pozytywnych w teście immunoprzesiewowym wytworzono biorąc hodowlę klonów E. coli hodowanych przez noc w bulionie Luria i kanamycynie (50 pg/ml), IPTG (5 mM) w temperaturze 25°C i dodając równą objętość buforu próbki SDS-PAGE, gotując i poddając elektroforezie jak w przykładzie 6. Następnie proteiny poddano blottingowi metodą Western dla oznaczenia obecności proteiny ligazy PAA-CoA 63 000 (przykład 11). Immunobarwienie membrany wykonano jak w przykładzie 11, z tym że zastosowano koniugat przeciwkróliczej IgG z fosfatazą alkaliczną (rozcieńczenie 1:2000 w buforze do oznaczania), a substratem fosfatazy był BCIP/NBT w postaci tabletek (Sigma) stosowany zgodnie z instrukcją producenta. Jedną grupę klonów (wielkość wstawki cDNA 2,0 kb) zidentyfikowano jako mającą proteinę 63 kDa (współmigrującą z próbą kontrolną BW 1901).

Przykład 16 - Oznaczenie klonów E. coli na aktywność ligazy.

Bulion zawierający komórki E. coli (wyhodowane jak w przykładzie 15) wirowano w chłodzonej wirówce Denley przy 4000 x g w temperaturze 4°C przez 7 min w celu pastylkowania komórek. Supernatant odrzucono, a komórki zawieszono ponownie w buforze do oznaczania ligazy (przykład 2) w połowie pierwotnej objętości bulionu. Następnie komórki oziębiono na łaźni lodowej przed nadźwiękowieniem w celu rozerwania komórek. Warunki nadźwiękowienia: Apollo Electronisc Sonicator, nastawienie mocy 5, 50% cyklu roboczego, po 30 s rozrywania przez 7 min na łaźni lodowej. Ekstrakty albo stosowano natychmiast albo przechowywano do użycia w temperaturze -80°C. Aktywność ligazy PAA-CoA wykazano stosując procedurę oznaczania opisaną w przykładzie 3, z tym wyjątkiem że stosowano 40 μΐ ekstraktu, a mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 60 min w temperaturze 30°C. Obecność PAA-CoA w supernatantach oznaczenia wykazano stosując HPLC jak opisano w przykładzie 4 przy uzupełnieniu o detektor zespołu fotodiod Waters 996 do analizy spektralnej. Aktywność ligazy PAA-CoA wykryto w klonie 6,6 (reprezentatywnym dla grupy ze wstawką cDNA o wielkości 2,0 kb) i potwierdzono wytworzenie PAA-CoA przez analizę zespołem diod wobec wzorca PAA-CoA.

Przykład 17 - Sekwencja 5' DNA klonów ligazy PAA-CoA.

Klon 6,6 (= pPEN09) „maksi-preparowano” i DNA oczyszczono gradientami CsCl jak opisali Sambrook i in. (1989). Przygotowano mapę restrykcji pPEN09 wykonując pojedyncze i podwójne trawienie enzymami (fig. 2). Następnie ten klon sekwencjonowano używając startera (5'-ACAGGAAACAGCTATGACCTTG-3') zakupionego od Cruachem i stosując zestaw Pharmacia T7 według instrukcji producenta. Sekwencja końca 5' wstawki cDNA, pokazana poniżej, pozwoliła sprawdzić, że przetłumaczona sekwencja aminokwasów na Nkoncu cDNA odpowiadała sekwencji peptydów otrzymanej poprzednio (przykład 6), z wyjątkiem początkowej metioniny (brakującej z sekwencji peptydów).

TCTAAACCCCGAGATCACCTCAGTtTCCTGCACTTTGGAGACCTGCCC -26

CTATATTACC CCGAGGATTTGGGAAA ATG GTT TTT TTA CCT 15

M V F L P 5

CCA AAG GAG TCC GGT CAA TTG GAC CCA ATT CCC 48

PKESGQLDPIP 16

GAC AAT ATT CCA ATC AGC GAG TTT ATG CTC AAT 81

DNIPISEFMLN 2(7

Pozostałość pPEN09 sekwencjonowano stosując normalne reakcje terminacji dinukleotydów zawierających 7-deaza dGTP. Jako znacznik stosowano [³⁵S]dATP. Reakcje sekwencji analizowano na klinowych żelach poliakryloamidowych 6% zawierających 8 M mocznik [Sanger i in. (1977) PNAS 74, 5463-5467; Chen i Seeburg (1985) DNA 4, 165-170], Zagnieżdżone delecje tworzono zarówno z końców T7 i T3 stosując nukleazę ExoIII i SI [Henikoff (1984) Gene 24, 351-359] . Klony delecji selekcjonowano wielkością do sekwencjonowania DNA metodą elektroforezy na żelach agarozowych. Wybrane klony sekwencjonowano jak pPEN09. W miarę potrzeb syntetyzowano wewnętrzne startery sekwencjonowania.

186 765

Kompletną sekwencję wstawki cDNA pokazano na fig. 3. Przetłumaczoną sekwencję protein pokazano na fig. 1.

Porównanie wydedukowanej sekwencji aminokwasów proteiny ligazy PAA-CoA z bazą danych sekwencji protein Narodowej Biomedycznej Fundacji Badawczej (NBRF-PIR) i bankiem danych sekwencji protein SWISS-PROT oprogramowaniem DNASTAR najlepsze dopasowanie dało dla ligazy 4-kumaryniano-CoA ziemniaka. Stosując program DNASTAR megalign (metoda skupisk) ułożono obok siebie proteinę ligazy PAA-CoA i ligazę 4-kumaryniano-CoA ziemniaka. Analiza odstępów sekwencji ujawniła 25% podobieństwa aminokwasów pomiędzy dwiema proteinami. Podobne porównanie z syntazami acetylo-CoA grzybów (Penicillium, Aspergillus, Neurospora i drożdży) wykazało tylko 15% podobieństwa.

Ostatnie trzy aminokwasy proteiny ligazy PAA-CoA to seryna-lizyna-izoleucyna. Ta sekwencja aminokwasów odpowiada zgodności do C-terminalnego sygnału kierującego mikrociało (CMTS) i te same aminokwasy są uważane za zasadniczo istotne dla kierowania proteiny katalazy Hansenula polymorpha do mikrociał (Didion i Roggenkamp (1992) FEBS Lett. 303 (2-3), 113-116). Tripeptyd C-terminalny SKI może również kierować proteiny do mikrociał Neurospora crassa (de Zoysa i Connerton (1994) Curr. Genet. 26, 430-437). Ostatni etap biosyntezy penicyliny wykonywany przez proteinę ACTF (stosujący PAA-CoA - produkt ligazy PAA-CoA) zlokalizowano w mikrociałach w P. chrysogenum (Muller i in. (1991) EMBO J. 10 (2), 489-495). Proteina ACTF również ma CMTS, który potrzebny jest do kierowania do mikrociała (EP 0488 180 A2). To, że proteina ligazy PAA-CoA ma CMTS, jest spójne z jej rolą w biosyntezie penicyliny.

Przykład 18 - Hybrydyzacja genomowego DNA z sondą cDNA ligazy PAA-CoA.

Genomowe DNA z szeregu szczepów, w tym z Penicillium chrysogenum typu naturalnego NRRL1951, BW1900A, BW1901, wydzielono jak następuje. Szczepy hodowano jak w przykładzie 1 i zebrano po 40 h metodą sączenia przez sączki z mikrowłókien szklanych Whatman GF/A. Grzybnię przepłukano w 0,9 M NaCl przed zamrożeniem w ciekłym azocie. Grzybnię roztarto na drobny proszek w ciekłym azocie i proszek ponownie zawieszono w roztworze G (przykład 12), pozostawiając na łaźni lodowej na 15 min. Resztki grzybni pastylkowano przy 17500 x g w temperaturze 4°C przez 20 min. Supernatant zebrano w innej probówce do wirówki 50 ml i DNA ekstrahowano fenolem / chloroformem pH 8,0, ekstrahowano chloroformem i strącano etanolem jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Kwas nukleinowy ponownie zawieszono w 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA i usunięto RNA działaniem RNAzy jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Genomowe DNA trawiono BamHI, a produkty trawienia elektroforezowano, blottingowano na membranę Hybond N (Amersham) jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Membranę hybrydyzowano wstawką cDNA z pPEN09 jak następuje: Membranę pre-hybrydyzowano w 6 x SSC, 1% SDS, 6% PEG 6000, 100 pg/ml zdenaturowanego, fragmentowanego DNA nasienia śledzia w 60°C przez 6 h. Potem do roztworu hybrydyzującego dodano znaczony, zdenaturowany fragment cDNA (stosując zestaw Megaprime Amersham i ³²P-dCTP według instrukcji producenta) i hybrydyzację kontynuowano przez noc w 60°C. Następnie membrany przemywano w 65°C w 2 x SSC, 01% SDS przez 30 min (dwukrotnie). Membrany audiografowano jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Wyniki wykazały wspólny pojedynczy fragment 8 kb BamHI ze wszystkich szczepów Penicillium (w tym naturalnego typu NRRL 1951), który hybrydyzowal z sondą cDNA.

Przykład 19 - Konstrukcja banku XEMBL3.

Hodowlę w kolbie P. chrysogenum szczepu SmithKline Beecham BW1900A przygotowano szczepiąc jedną ezą zarodników 50 ml pożywki ACM (20 g/1 wyciągu słodowego, 1 g/1 bakto-peptonu, 20 g/1 glukozy) i inkubując z wytrząsaniem w temperaturze 25°C. Po 40 godzinach wzrostu, grzybnię zebrano metodą sączenia przez sączki z mikrowłókien szklanych Whatman GF/A i przepłukano w 0,9 M NaCl. Następnie grzybnię ponownie zawieszono w 0,9 M NaCl zawierającym 10 mg/ml Novozymu (Novo Biolabs, Novo Industri. Dania) i inkubowano w temperaturze 25°C przez 2 h. Protoplasty oczyszczono z resztek grzybni przepuszczając przez sączek bawełniany przed odwirowaniem przy 4000 x g przez 10 min w celu pastylkowania protoplastów. Protoplasty dwukrotnie przepłukano w 0,9 M NaCl przed

186 765 dodaniem tiocyjanianu guanidyniowego, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM EDTA dla rozpuszczenia protoplastów. Resztki usunięto metodą odwirowania, zaś supernatant zawierający DNA chromosomowe dodano do równej objętości 8 M LiCl, łagodnie zmieszano i przechowywano w -20°C przez 30 min. Następnie proteiny i nieco RNA pastylkowano metodą odwirowania (10000 x g, 4°C, 10 min), a supernatant zawierający DNA chromosomowe został strącony etanolem. DNA chromosomowe częściowo strawiono Sau3A i fragmentowane DNA chromosomowe frakcjonowano pod względem wielkości na gradiencie gęstości sacharozy, jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże. Frakcje zawierające fragmenty Sau3A większe niż 10 kb zlano razem i zastosowano do konstrukcji banku kEMBL3. Fragmenty genomowe Sau3A ligowano do ramion kEMBL3 BamHl otrzymanych z Promega. Następnie ligowane kDNA pakietowano stosując zestaw Packagene Promega. Następnie pakietowane kDNA wzmocniono zakażając komórki E. coli szczep LE392 i plamki odbito na podłożu bakteryjnym i inkubowano przez 8 h w temperaturze 37°C, jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże. Otrzymano w przybliżeniu 18000 niezależnych klonów. Bakteriofagi eluowano do buforu SM i przechowywano właściwie (jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże).

Przykład 20- Klonowanie genomowego DNA ligazy PAA-CoA.

Z klonu 6.6 cDNA fragment Sstl-Xbal zawierający wstawkę cDNA (fig. 2) wykorzystano do sondowania banku kEMBL3 (wytworzonego w przykładzie 19) metodą hybrydyzacji plamek, jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże (warunki takie same jak w przykładzie 18). W pierwotnym badaniu przesiewowym zidentyfikowano szereg pierwotnych wyników pozytywnych, które wybrano i zastosowano do wtórnego badania przesiewowego przy niższych rozcieńczeniach. Powtórzono hybrydyzację plamek i poszczególne plamki zidentyfikowano jako hybrydyzujące z sondą cDNA ligazy PAA-CoA. Te klony kEMBL wybrano i wzmocniono. Klony kEMBL trawiono jednym z enzymów BamHI, EcoRI albo Sali oraz wszystkimi kombinacjami ich par, wraz z pojedynczymi produktami trawienia genomowego DNA ze szczepu BW 1900A. Produkty trawienia poddano elektroforezie, blottingowi i charakteryzacji metodą hybrydyzacji Southerna, i zidentyfikowano fragmenty restrykcyjne zawierające cały gen ligazy PAA-CoA. Fragment 6,5 kb EcoRl pobrano z niektórych klonów kEMBL (takie same fragmenty obserwowane w produktach trawienia DNA chromosomowego) i podstawiony pod pIJ2925 (G. R. Janssen i M. J. Bibb (1993) Gene 124 (1) 133-134) . Mapę restrykcyjną genomowego DNA przedstawiono na fig. 4.

Przykład 21- Transformacja P. chrysogenum szczep BW 1901 ligazą PAA-CoA. Subklon 6,5 kb EcoRI w pI2925 (przykład 20, = paMX131) razem z liniowym fragmentem amdS z p3SR2 (Hynes i in. (1983) Mol. Celi. Biol. 3, 1430-1439) zastosowano do współtransformowania protoplastów P. chrysogenum szczep BW 1901 (sposób, jak opisali Tilbum i in. (1984) Gene 26, 205-221). Transformanty wybrano pod względem zdolności do wykorzystywania acetamidu. Następnie transformanty badano przesiewowe na miano PenV. Szereg transformantów miał wyższe poziomy PenV w porównaniu z próbą kontrolną BW 1901 (do 111% przy powtórnych testach), sugerując możliwe scalenie obu plazmidów. Taki wynik może poprzeć rolę tego klonu w biosyntezie penicyliny.

186 765

WYDRUK SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: SmithKline Beecham plc (B) ULICA: New Horizons Court (C) MIASTO: Brentford (D) STAN: Middlesex (E) PAŃSTWO: Wielka Brytania

(F)	KOD POCZTOWY:	TW8	9EP
(G)	TELEFON: 0181	975	3314
(H)	TELEFAX: 0181	975	3688
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU:	Nowy	produkt

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 2 (iv) POSTAĆ CZYTELNA DLA KOMPUTERA:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOC/MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Wydanie #1.0, Wersja 1.30 (EPO) (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 578 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) KROTNOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (iii) HIPOTETYCZNA: tak (iv) ANTYSENSOWNA: nie

186 765 (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Penicillium chrysogenum (B) SZCZEP: BW1901 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 1:

Met

Val

Phe

Leu

Pro

Lys

Glu

Ser

Gly

Gln

Leu

Asp

Pro

Ile

Pro

1

5

10

15

Asp

Asn

Ile

Pro

Ile

Ser

Glu

Phe

Met

Leu

Asn

Glu

Arg

Tyr

Gly

Arg

20

25

30

Val

Arg

His

Ala

Ser

Arg

Asp

Pro

Tyr

Thr

Cys

Gly

Ile

Thr

Gly

35

40

45

Lys

Ser

Tyr

Ser

Lys

Glu

Val

Ala

Asn

Arg

Val

Asp

Ser

Leu

Ala

50

55

60

Arg

Ser

Leu

Ser

Lys

Glu

Phe

Gly

Trp

Ala

Pro

Asn

Glu

Gly

Ser

Glu

65

70

75

80

Trp

Asp

Lys

Thr

Leu

Ala

Val

Phe

Ala

Leu

Asn

Thr

Ile

Asp

Ser

Leu

85

90

95

Pro

Leu

Phe

Trp

Ala

Val

His

Arg

Leu

Gly

Val

Leu

Thr

Pro

Ala

100

105

110

Asn

Ala

Ser

Tyr

Ser

Ala

Glu

Leu

Thr

His

Gln

Leu

Asp

Ser

115

120

125

Lys

Ala

Lys

Ala

Leu

Val

Thr

Cys

Val

Pro

Leu

Ser

Ile

Ser

Leu

130

135

140

Glu

Ala

Lys

Ala

Gly

Leu

Pro

Lys

Asn

Arg

Ile

Tyr

Leu

145

150

155

160

Asp

Val

Pro

Glu

Gln

Leu

Gly

Val

Lys

Pro

Ala

Gly

Tyr

165

170

175

Lys

Ser

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Gln

Ala

Gly

Lys

Ser

Leu

Pro

Val

180

135

190

186 765

Asp Glu Leu Arg

Trp Ser

Ala Gly Glu Gly Ala Arg Arg Thr Ala

Phe

195

200

205

Val

Cys

Tyr

Ser

Gly

Thr

Ser

Gly

Leu

Pro

Lys

Gly

Val

Met

Ile

210

215

220

Ser

His

Arg

Asn

Val

Ile

Ala

Asn

Thr

Leu

Gln

Ile

Lys

Ala

Phe

Glu

225

230

235

240

Gln

Asn

Tyr

Arg

Asp

Gly

Thr

Lys

Pro

Ala

Ser

Thr

Glu

Val

245

250

255

Ala

Leu

Gly

Leu

Pro

Gln

Ser

His

Ile

Tyr

Ala

Leu

Val

Ile

260

265

270

Gly

His

Ala

Gly

Ala

Tyr

Arg

Gly

Asp

Gln

Thr

Ile

Val

Leu

Pro

Lys

275

280

285

Phe

Glu

Leu

Lys

Ser

Tyr

Leu

Asn

Ala

Ile

Gln

Gin

Tyr

Lys

Ile

Ser

290

295

300

Ala

Leu

Phe

Leu

Val

Pro

Ile

His

Met

Leu

Gly

Thr

Gln

305

310

315

320

Asp

Val

Cys

Ser

Lys

Tyr

Asp

Leu

Ser

Val

Thr

Ser

Leu

Phe

Thr

325

330

335

Gly

Ala

Pro

Leu

Gly

Met

Glu

Thr

Ala

Asp

Phe

Leu

Lys

Leu

340

345

350

Tyr

Pro

Asn

Ile

Leu

Ile

Arg

Gln

Gly

Tyr

Gly

Leu

Thr

Glu

Thr

Cys

355

360

365

Thr

Val

Ser

Thr

His

Pro

His

Asp

Ile

Trp

Leu

Gly

Ser

370

375

380

Gly

Ala

Leu

Pro

Gly

Val

Glu

Ala

Arg

Ile

Val

Thr

Pro

Glu

Asn

385

390

395

400

Lys

Glu

Ile

Thr

Tyr

Asp

Ser

Pro

Gly

Glu

Leu

Val

Arg

Ser

405

410

415

186 765

Pro

Ser Val

Val 420

Leu Gly

Tyr

Leu

Asn 425

Asn Glu

Lys Ala

Thr 430

Ala

Glu

Thr

Phe

Val

Asp

Gly

Trp

Met

Arg

Thr

Gly

Asp

Glu

Ala

Val

Ile

Arg

435

440

445

Arg

Ser

Pro

Lys

Gly

lie

Glu

His

Val

Phe

Ile

Val

Asp

Arg

Ile

Lys

450

455

460

Glu

Leu

lie

Lys

Val

Lys

Gly

Leu

Gln

Val

Ala

Pro

Ala

Glu

Leu

Glu

465

470

475

480

Ala

His

lie

Leu

Ala

His

Pro

Asp

Val

Ser

Asp

Cys

Ala

Val

Ile

Ala

485

490

495

Ile

Pro

Asp

Arg

Ala

Gly

Glu

Val

Pro

Lys

Ala

Ile

Val

Lys

500

505

510

Ser

Ala

Ser

Ala

Gly

Ser

Asp

Glu

Ser

Val

Ser

Gln

Ala

Leu

Val

Lys

515

520

525

Tyr

Val

Glu

Asp

His

Lys

Ala

Arg

His

Lys

Trp

Leu

Lys

Gly

Ile

530

535

540

Arg

Phe

Val

Asp

Ala

lie

Pro

Lys

Ser

Pro

Ser

Gly

Lys

Ile

Leu

Arg

545

550

555

560

Arg

Leu

lie

Arg

Asp

Gln

Glu

Lys

Glu

Ala

Arg

Lys

Ala

Gly

Ser

564

570

575

Lys Ile (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ:	1976 par zasad
(B)	TYP: kwas	nukleinowy
(C)	KROTNOŚĆ:	podwójna
(D)	TOPOLOGIA	: nieznana

186 765 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Penicillium chrysogenum (B) SZCZEP: BW1901 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 2:

GAATTCGGCA	CGAGTCTAAA	CCCCGAGATC	ACCTCAGTTT	CCTGCACTTT	GGAGACCTGC	60
CCCTATATTA	CCCCGAGGAT	TTGGGAAAAT	GGTTTTTTTA	CCTCCAAAGG	AGTCCGGTCA	120
ATTGGACCCA	ATTCCCGACA	ATATTCCAAT	CAGCGAGTTT	ATGCTCAATG	AGAGATATGG	180
ACGAGTGCGA	CACGCCAGCT	CCCGGGACCC	ATACACCTGT	GGTATTACCG	GGAAGTCATA	240
CTCGTCGAAA	GAGGTAGCCA	ATCGCGTCGA	CTCGCTGGCT	CGTAGTCTAT	CAAAGGAATT	300
TGGTTGGGCG	CCGAATGAAG	GGTCAGAATG	GGATAAGACA	TTGGCCGTGT	TTGCCCTCAA	360
CACTATCGAT	TCCTTACCCC	TATTCTGGGC	CGTTCACAGA	CTGGGCGGTG	TTCTCACTCC	420
CGCCAACGCA	TCATACTCCG	CCGCCGAGCT	GACGCATCAG	CTGCTTGATT	CCAAGGCCAA	480
GGCCCTTGTG	ACTTGTGTTC	CTCTCCTCTC	CATCTCACTG	GAAGCTGCAG	CCAAAGCTGG	540
TCTCCCGAAG	AACAGAATCT	ACTTACTCGA	TGTACCTGAG	CAGCTTCTTG	GCGGAGTCAA	600
GCCTCCAGCA	GGATACAAGT	CCGTTTCCGA	ACTGACCCAG	GCTGGGAAGT	CTCTCCCGCC	660
AGTGGATGAA	TTGCGATGGA	GCGCGGGTGA	AGGTGCCCGG	CGAACAGCAT	TTGTGTGCTA	720
TCTAAGTGGA	ACGTCTGGAT	TGCCGAAAGG	AGTCATGATC	TCACACCGCA	ACGTGATCGC	780
CAATACCCTT	CAGATCAAGG	CGTTTGAGCA	GAACTACCGG	GATGGTGGGG	GCACAAAGCC	840
TGCGAGTACT	GAGGTTGCTC	TTGGTCTCCT	TCCGCAGAGC	CATATCTATG	CTCTTGTGGT	900
CATTGGCCAT	GCTGGGGCAT	ACCGAGGCGA	CCAAACAATG	GTTCTCCCCA	AATTCGAATT	960
GAAATCCTAC	CTGAACGCCA	TCCAACAGTA	CAAGATCAGT	GCGCTGTTCC	TGGTACCTCC	1020
GATCATCATT	CACATGCTGG	GCACTCAAGA	CGTGTGCTCC	AAGTATGACC	TGAGTTCCGT	1080
GACGTCTCTG	TTCACGGGAG	CGGCACCCCT	GGGTCTGGAG	ACAGCTGCCG	ATTTCCTCAA	1140
ACTCTACCCG	AACATTTTGA	TCCGCCAAGG	ATACGGTCTG	ACAGAGACAT	GCACGGTCGT	1200

AAGCTCGACC CACCCGCACG ATATCTGGCT AGGTTCATCC GGCGCTTTGC TCCCTGGAGT 1260

186 765

CGAGGCACGA	ATTGTGACGC	CTGAAAACAA	GGAAATCACA ACGTACGACT	CACCGGGACA	1320
ATTGGTCCTC	CGAAGCCCAA	GCGTCGTCCT	GGGCTATTTG	AACAACGAAA	AAGCCACCGC	1380
AGAGACATTT	GTGGACGGAT	GGATGCGTAC	GGGAGACGAG	GCTGTCATCC	GTAGAAGCCC	1440
GAAGGGCATC	GAGCACGTGT	TTATTGTCGA	TCGGATCAAG	GAGTTCATCA	AGGTCAAGGG	1500
TCTGCAAGTC	GCGCCTGCCG	AACTCGAAGC	CCATCTCCTC	GCCCACCCCG	ATGTCTCGGA	1560
CTGTGCTGTC	ATCGCTATTC	CGGATGATCG	TGCAGGAGAA	GTACCCAAGG	CCATTGTTCT	1620
GAAGTCCGCC	AGCGCAGGAT	CGGACGAATC	TGTCTCCCAG	GCTCTCGTGA	AGTATGTTGA	1680
GGACCACAAG	GCTCGTCACA	AGTCCTTCAA	GGGAGGTATC	AGATTTGTGG	ATGCCATTCC	1740
CAAGAGCCCG	AGTGGTAAGA	TTCTTCGTCG	GTTGATCCGT	GA.CCAA.GACA	AGGAGGCACG	1800
GAGAAAGGCT	GGTAGCAAGA	TCTAAAAATG	TCGGGGGTAG	CTTTHAYYAH	AACTTGGTCT	1860
GGGAAACTTG	GAAACCGATA	ACCATTGTTG	GCTTGAACTA	GAAGTATATA	TGT.AAA.TACG	1920
TGATAAACAA	GGCATCTCAT	CTGCTGTTAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	CTCCOG	1976

186 765

MYFI^PKESGęiJDPIPDNIPISEFMLNERYGRYRHASSPJDPYTCGITGKSYSSKEYANR

VDSLARSLSKEFGWAPNEGSEWDKTLAVEALNTIDSLPLFWAVHRLGGVLIRANASY

SAAELTHQLLDSKAKALVTCVPLLSISLEAAAKAGLPKNRIYLLDVPEQLLGGVKPPA

GYKSVSELTQAGKSLPPVDELRWSAGEGARRTAFVCYSSGTSGLPKGVMISHRNVLA

NTLQIKAFEQNYRDGGGTKPASTEVALGLLPQSHrYALVYIGHAGAYRGDQTIVLPKF

ELKSYLNAIQQYKISALFLVPPmHMLGTQDVCSKYDLSSVTSLFTGAAPLGMETAAD

FLKLYPNILIRQGYGLTETCTWSSTHPHDIWLGSSGALLPGVEARJVTPENKEITTYD

SPGELVVRSPSVVLGYLNNEKATAETEVDGWMRTGDEAVIRRSPKGIEHYHVDRIKE

LKVKGLQVAPAELEAHILAHPDVSDCAVIAIPDDRAGEVPKArWKSASAGSDESVS

QALVKYVEDHKAIGiKWLKGGIRFVDAIPKSPSGKILRRLIRDQEKEARRKAGSKI fig. 1

186 765 o

cr

Sstl

Pstl

Sali

BamHi

EcoRI

- Smal

- Sali

- Ciał

- Pstl

- KpnI

- EcoRY o

H-*

W fi)

O

N

H·

X m

cjq’ bo pBKCMY

- Bglll

M Xhol Xbal Ciał Smal KpnI

Mapa restrykcyjna klonu cDNA PAA - CoAligazy

186 765

GAATTCGGCACGAGTCTAAACCCCGAGATCACCTCAGTTTCCTGCACTTTGGAGA

CCTGCCCCTATATTACCCCGAGGATTTGGGAAAATGGTTT7TTTACCTCCAAA.GGA

G7CCGGTCAATTGGACCCAĄ.TTCCCGACAATATTCCAATCAGCGAGTTTATGCTCA

ATGAGAGATATGGACGAGTGCGACACGCCAGCTCCCGGGACCCATACACCTGTGG

TATTACCGGGAAGTCATACTCGTCGAAAGAGGTAGCCAATCGCGTCGACTCGCTG

GCTCGTAGTCTATCAAAGGAATTTGGTTGGGCGCCGAATGAAGGGTCAGAATGGG

ATAAGACATTGGCCGTGTTTGCCCTCAACACTATCGATTCCTTACCCCTATTCTGG

GCCGTTCACAGACTGGGCGGTGTTCTCACTCCCGCCAACGCATCATACTCCGCCG

CCGAGCTGACGCATCAGCTGCrTGATTCCAAGGCCAAGGCCCTTGTGACTTGTGT

TCCTCTCCTCTCCATCTCACTGGAAGCTGCAGCCAAAGCrGGTCTCCCGAAGAACA

GAATCTACTTACTCGATGTACCTGAGCAGCTTCTTGGCGGAGTCAAGCCTCCAGC

AGGATACAAGTCCGTTTCCGAA.CTGACCCAGGCTGGGAAGTCTCTCCCGCCAGTG

GATGAATTGCGATGGAGCGCGGGTGAAGGTGCCCGGCGAACAGCATTTGTGTGCr

ACTCAAGTGGAACGTCTGGATTGCCGAAAGGAGTCATGATCTCACACCGCAACGT

GATCGCCAATACCCTTCAGATCAAGGGGTrTGAGCAGAACTACCGGGATQGTGGG

GGCACAAAGCCTGCGAGTACTGAGGTTGCTCTTGGTCTCCrrCCGCAGAGCCATA

TCTATGCTCTTGTGGTCATTGGCCATGCTGGGGCATACCGAGGCGACCAAAĆAAT

CGTTCTCCCCAAATTCGAATTGAAATCCTACCTGAACGCCATCCAACAGTACAAG

ATCAGTGCGCTGTTCCTGGTACCTCCGATCATCATTCACATGCTGGGCACTCAAGA

CGTGTGCTCCAAGTATGACCTGAGTTCCGTGACGTCTCTGTTCACGGGAGCGGCA

CCCCTGGGTATGGAGACAGCTGCCGATTTCCTCAAACTCTACCCGAACATTTTGAT

CCGCCAAGGATACGGTCTGACAGAGACATGCACGGTCGTAAGGTCGACCCACCCG

CACGATATCTGGCTAGGTTCATCCGGCGCrTTGCTCCCTGGAGTCGAGGCACGAA

TTGTGACGCCTGAAAACAAGGAAATCACAACGTACGACTCACCGGGCGAATTGGT

GGTCCGAAGCCCAAGCGTCGTCCTGGGCTATTTGAACAACGAAAAAGCCACCGCA

GAGACATTTGTGGACGGATGGATGCGTACGGGAGACGAGGG7GTCA7CCGTAGA

AGCCCGAAGGGCATCGAGCACGTGTTTATTGTCGATCGGATCAAGGAGTTGATCA

AGG7CAAGGG7C7GCAAG7CGCGCC7GCCGAACTCGAAGCCCA7ATCC7CGCCCA

CCCCGA7G7C7CGGAC7G7GC7G7CA7CGC7A7TCCGGA7GA7CG7GCAGGAGAA

GTACCCAAGGCCA7TGT7G7GAAGTCCGCCAGCGCAGGATCGGACGAATCTG7CT

CCCAGGCTCTCGTGAAGTATGTTGAGGACCACAAGGCTCGTCACAAGTGGTTGAA

GGGAGG7A7CAGA77TG7GGA7GCCA77CCCAAGAGCCCGAG7GG7AAGA7TC77

CGTCGGTTGATCCGTGACCAAGAGAAGGAGGCACGGAGAAAGGCTGGTAGCAAG atctaaaaatgtcgggggtagctttgattagaacttggtctgggaaa.cttggaaa ccgataaccattgttggcttgaactag.aagtatatatgtaąatacgtgataaaca aggcatctcatctc-ctgttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcgag

FIG. 3

186 765 cr

Ό >—I

ΙΟ

Ό to £

(D

7?

ft

O n

oq'

BglH

EcoRI

- BglII

- Sali

- Xbal

O) *0

Ol η

(0 cn rt*

X*

Q

L_J.

□

0i

Φ •3

O

Z

Φ tQ

O

O >

g (Ί

O >

H*

HtQ

CU

N ·<

EcoRI

BamHI

Xbal

Ή o

H·

Pr¹ rOl

Ω

N

H· χSali

HindlU

BglII

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. DNA obejmujący sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, kodującą polipeptyd posiadający aktywność ligazy fenyloacetylokoenzymu A (PAACoA) lub sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA oznaczoną jako SEQ ID nr 2 i która koduje polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA.
2. Polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA, kodowany przez sekwencję DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, lub przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA oznaczoną jako SEQ ID nr 2 i która koduje polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA.
3. Polipeptyd według zastrz. 2, znamienny tym, że ma pozorny ciężar cząsteczkowy oznaczony metodą SDS-PAGE równy około 63 000.
4. Polipeptyd, według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów N-terminalnych:

V-F-L-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P.
5. Polipeptyd według zastrz 2, albo 3, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów pokazaną na fig. 1 i oznaczoną jako sekwencja sEQ ID nr 1.
6. Wektor do ekspresji enzymu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA w odpowiednim organizmie gospodarza, znamienny tym, że zawiera sekwencję DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, lub przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA oznaczoną jako SEQ ID nr 2.
7. Organizm gospodarza transformowany sekwencją DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, Iub sekwencją DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA oznaczoną jako SEQ ID nr 2, która koduje polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA.
8. Zastosowanie transformowanego organizmu gospodarza do wytwarzania penicyliny lub do wzrostu miana organizmów produkujących penicylinę, przy czym organizm ten transformowany jest sekwencją DNA obejmującą (a) sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, lub (b) sekwencją DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA (a) która koduje polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA.
9. Sposób wytwarzania polipeptydu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA obejmujący transformacje komórki gospodarza, hodowlę stransformowanej komórki gospodarza, obróbkę tej hodowli i odzyskiwanie produktu końcowego, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza, transformowaną wektorem zawierającym sekwencję DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, Iub przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA oznaczoną jako SEQ ID nr 2, następnie przeprowadza się ekstrakcję i oczyszczanie, gdzie aktywne frakcje chromatograficzne są wykrywane przy użyciu oznaczenia zależnego od PAA (kwasu fenylooctowego) i koenzymu A.

* * *

186 765

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest DNA, polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA, wektor, organizm gospodarza, zastosowanie transformowanego organizmu gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu. Enzym posiadający aktywność ligazy fenyloacetylokoenzymu A (PAA-CoA) jest użyteczny w syntezie penicylin z produktów pośrednich uczestniczących w biosyntezie penicyliny.

Droga przemian biochemicznych do penicyliny G jest ujawniona w literaturze (Queener (1990) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34 (6), 943-948; Martin (1992) J. Industrial Microbiol. 9, 73-90; Luengo (1995) J. Antibiotics 48 (11), 1195-1212). Droga przemian była przedmiotem znacznych badań mających na uwadze wzrost wydajności (miana) w procesach fermentacji.

U Penicillium chrysogenum (pędzlaka złociejącego) fenylooctan (PAA) i fenoksyoctan (POA) zostają aktywowane do odpowiednich tioestrów CoA enzymem ligazą (np. ligazą PAA-CoA). Te tioestry następnie zostają wykorzystane do biosyntezy penicyliny G w przypadku PAA oraz penicyliny V w przypadku POA. Dlatego ligazę PAA-CoA uważa się za niezbędną w biosyntezie tych ważnych handlowo antybiotyków leczniczych.

Enzym mający aktywność ligazy PAA-CoA (J. Biol. Chem. 267 (12), 7084-7090 (1990)) wydzielono z Pseudomonas putida metodą oczyszczania obejmującą strącanie siarczanem amonowym i wymywanie chlorkiem potasowym z kolumny DEAE-Sephacel. Enzym ma masę cząsteczkową 48 000 +/-1000, optimum pH 8,2, i jest zaangażowany w katabolizm PAA.

Próby oznaczenia enzymu z P. chrysogenum mającego aktywność ligazy PAA-CoA metodą hydroksaminianową (oznaczanie kolorymetryczne wykrywające hydroksaminian fenyloacetylu lub hydroksaminian fenoksyacetylu przy 540 nm) opisali Kogekar i Deshpande (1983) Ind. J. Biochem. Biophys. 20, 208-212 oraz Brunner i Rohr (1975) Methods Enzymol. 43, 476481; jednak inni badacze (Martinez-Blanco i in. (1992) J. Biol. Chem. 267 (8), 5474-5481) są zdania, że proteina nie została oczyszczona albo aktywność nie została szczegółowo scharakteryzowana. Ponadto ci ostatni autorzy nie zdołali znaleźć tego enzymu podaną procedurą.

WO 96/10085 (Gist Brocades, opublikowano 4 kwietnia 1996) podaje przegląd tych i innych prób wydzielenia ligazy PAA CoA, która działa na drodze przemian penicyliny. W WO 96/10085 opisano syntazę enzymu acylo-CoA jako otrzymaną ze szczepu Penicillium chrysogenum B10 przechowywanego w PanLabs (USA). Wśród właściwości przypisywanych enzymowi są następujące: ciężar cząsteczkowy około 50 000 (określono metodą sączenia w żelu), optymalne pH 8 do 8,5 (niska aktywność przy pH 7 Iub poniżej), optymalna temperatura 40°C, pH ponad 7,25. Co ważne, enzym można oczyszczać metodą strącania siarczanem amonowym. Ma on dość szeroką specyficzność, tj. jest w stanie katalizować tworzenie fenoksyacetylo-koenzymu A, fenyloacetylo-koenzymu A, adypoilo-koenzymu A i heksanoilo-koenzymu A z Mg2+, ATP, CoASH, i odpowiednio kwasu fenoksyoctowego, fenylooctowego, kwasu adypinowego Iub kwasu heksanowego, ale nie wykazuje żadnej aktywności wobec kwasu octowego. Wykazano także, że enzym jest stabilizowany środkami redukującymi. Wysokie stężenie siarczanu amonowego Iub glicerolu również stabilizuje enzym. Nie podano wskazań co do czystości dla aktywności enzymatycznej enzymu otrzymanego ujawnionymi sposobami, nie podano sekwencji ani też sekwencji N-terminalnej enzymu, jak również nie scharakteryzowano odpowiadającego mu DNA, ani nie podano jego sekwencji.

Mimo tych wszystkich wysiłków niewiele wiadomo o autentycznym enzymie ligazy PAA-CoA, który działa in vivo u gatunku Penicillium. Przypuszczano, że odpowiedzialny enzym może być zaangażowany w metabolizm pierwotny (Smith i in. (1990) Biotechnology 8, 39-41) . Martinez-Blanco i in. (1992) wybrali jeden enzym jako możliwego kandydata, syntazę acetylo-CoA, i oczyścili go z P. chrysogenum na podstawie aktywności syntazy acetylo-CoA. Byli oni w stanie wykazać, że poza tworzeniem pochodnej CoA octanu syntaza acetylo-CoA mogła aktywować kilka kwasów tłuszczowych (C2-C8) i in vitro niektóre cząsteczki aromatyczne (w tym PAA).

Gen syntazy acetylo-CoA poddano sekwencjonowaniu (Międzynarodowy Opis Patentowy WO 92/07079, Gouka i in. (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 514-519, MartinezBlanco i in. (1993) Gene 130, 265-270) i wykazano, że jest homologiczny z innymi syntazami acetylo-CoA pochodzącymi z grzybów. Jednakże mutacje w tym genie wybrane kwasem

186 765 fluorooctowym nie wydają się zmieniać poziomu wytwarzania penicyliny (Międzynarodowy Opis Patentowy WO 92/07079) sugerując, że w rzeczywistości za aktywację PAA odpowiedzialny jest inny enzym.

W niniejszym wynalazku opracowano bezpośrednie oznaczenie aktywności ligazy PAA-CoA w połączeniu z właściwą procedurą oczyszczania, co pozwoliło na oczyszczenie, a następnie klonowanie tego, co uważane jest za autentyczną ligazę PAA-CoA. Enzym wydzielony według niniejszego wynalazku ma N-terminalną sekwencję aminokwasów, różną od syntazy acetylo-CoA wymienionej wyżej i posiada szereg różnych właściwości (np. ciężar cząsteczkowy) wskazując, że wydzielono enzym inny niż wszystkie enzymy, którym dotąd przypisywano tę rolę. Właściwości charakterystyczne dla enzymu wydzielonego w niniejszym wynalazku obejmują bezwzględną zależność od CoASH jako substratu, podczas gdy enzym wydzielony przez Kogekara i Deshpande (1983), testowano w warunkach, w których pomijano CoASH. Ta i inne różnice między wydzielonymi proteinami (np. optymalne pH i inne właściwości charakterystyczne podane w przykładach poniżej) wykazują że enzym według niniejszego wynalazku jest różny od każdego z opisanych poprzednio. Uważa się, że niniejsze rozwiązanie stanowi pierwsze wydzielenie czystej postaci enzymu ligazy PAA CoA z gatunków Penicillium. W szczególności obecność C-terminalnego peptydu SKI jest zgodna z rzeczywistą rolą tego enzymu w biosyntezie penicyliny. Enzym według wynalazku różni się od enzymu opisanego w powyżej wspomnianej publikacji WO 96/10085 tym, że ma różny ciężar cząsteczkowy, i że enzym według niniejszego wynalazku jest wrażliwy na strącanie siarczanem amonowym i solami chlorkowymi w odróżnieniu od enzymu opisanego w WO 96/10085.

Zgodnie z tym, przedmiotem niniejszego wynalazku jest DNA obejmujący sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, kodującą peptyd posiadający aktywność ligazy fenyloacetylokoenzymu A (PAA-CoA) Iub sekwencje DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA oznaczoną jako SEQ ID nr 2 i która koduje polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA.

Korzystnie, przedmiotem wynalazku jest polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA, kodowany przez sekwencję DNA obejmującą (a) sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, Iub przez (b) sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA (a) i która koduje polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, polipeptyd ma pozorny ciężar cząsteczkowy, oznaczony metodą SDS-PAGE jest równy około 63 000.

Polipeptyd, korzytnie obejmuje sekwencję aminokwasów N-terminalnych: V-F-L-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P, a jeszcze bardziej korzystnie obejmuje sekwencję aminokwasów pokazaną na fig. 1, oznaczoną jako sekwencja SEQ ID SEQ nr 1.