PL176408B1 - Kompozycja naturalnego alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej i sposób wytwarzania kompozycji naturalnego alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej - Google Patents

Abstract

1. Kompozycja naturalnego alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej, znamienna tym, ze zawiera alfa interferon w postaci mieszaniny gatunków a2 i a8 oraz ich alleli co najmniej 50% i co najmniej jeden gatunek wybrany z grupy obej- mujacej a4, a7, a10, a16, a17 i a21 oraz ich allele w dowolnym farmaceutycznie akceptowalnym nosniku, przy czym kompozycja wykazuje poziom toksycznosci u ludzkich pacjentów znaczaco zredukowany w od- niesieniu do kompozycji zawierajacych pojedyncze gatunki interferonu lub inne mieszaniny gatunków interferonu. FIG 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja naturalnego alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej oraz sposób wytwarzania kompozycji naturalnego alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej.

Kompozycja alfa interferonu charakteryzuje się wysoką aktywnością właściwą, czystością powyżej 95% i zmniejszeniem działań ubocznych występujących przy stosowaniu jej z ludzi w stosunku do znanych kompozycji alfa interferonu, a sposób wytwarzania kompozycji alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej umożliwia prowadzenie procesu w dużej skali.

Niniejsze zgłoszenie jest częściową kontynuacją zgłoszenia patentowego dokonanego w Stanach Zjednoczonych nr seryjny 835.030, zgłoszonego 10 lutego 1992.

Ludzki alfa interferon stanowi rodzinę więcej niż piętnastu białek o działaniu przeciwwirusowym, przeciwwzrostowym i immunoregulacyjnym [Pestka i wsp. Ann. Rev. Biochem., 56:727 (1987)]. Skuteczność terapeutyczna ludzkich alfa interferonów została stwierdzona wobec ludzkich nowotworów i chorób wirusowych. Na przykład, interferony rekombinacyjne (IFN a-2A, IFN a-2b, IFN a-2c), interferon pochodzący z linii komórkowej (IFN α-ni) i interferon pochodzący od leukocytów (IFN a-n3) obecnie stosowane są do leczenia Condyloma acuminata, zapalenia wątroby [Weck i wsp., Am. J. Med., 85 (suplement 2A): 159 (1988); Korenman i wsp., Annal. In tern. Med., 114:629 (1991); FriedmanKien i wsp., JAMA, 259:533 (1988)], do cofania niektórych przypadków o charakterze nowotworowym [Baron i wsp., JAMA, 266:1375 (1991)], do leczenia mięsaków Kaposi'ego związanych z AIDS [Physicians Desk Reference, 47 wydanie, Medical Economics Data, Montvale, NJ, str. 2194 i 2006 (1993)] i obecnie brane są pod uwagę do leczenia zespołu nabytego braku odporności u ludzi (AIDS), bądź same, bądź w połączeniu z innymi środkami przeciwwirusowymi [Hirsch, Am. J. Med., 85 (suplement 2A): 182 (1988)].

Interferony rekombinacyjne mogą być wytwarzane technikami inżynierii genetycznej, na przykład w Escherichia coli na dużą skalę [Goeddel i wsp., Naturę, 287:411 (1980); Streuli i wsp., Science, 209:1343 (1980). Jednakże, interferony otrzymane za pomocą inżynierii genetycznej składają się tylko z jednego pojedynczego gatunku, który w ogóle niejest modyfikowany posttranslacyjnie lub nie jest identyczny z interferonami naturalnymi, co może ograniczyć biologiczną aktywność kompozycji. Na przykład, IFN-a2 jest jedynym gatunkiem w produkcie Intron® A (IFNa -2b) [Schering Plough] i Roferon® A (INF a-2a) [Hoffman-La Roche].

Interferony pochodzące ze źródeł naturalnych, takie jak interferony z ludzkiego limfoblastoidu, linia komórkowa Namalwa [Mizrahi, Meth. Enzymol., 78-54 (1981); Phillips i wsp., Meth. Enzymol., 119:35 (1986)] i pochodzące z ludzkich leukocytów z krwi obwodowej [Mogensen i wsp., Pharmacol. Ther. Część C, 1:369 (1977); Cantell i wsp. Methods Enzymol., 78:29 (1981); Horowitz, Methods Enzymol., 119:39 (1986)], składają się z wielu gatunków, każdy o różnej strukturalnej i biologicznej aktywności.

Wielu naukowców uważa, że takie naturalne interferony potencjalnie zapewniają lepszą skuteczność leczenia niż interferon rekombinacyjny. Na przykład, naturalny alfa interferon może być stosowany w czterokrotnie niższych dawkach przy traktowaniu Condyloma niż produkty rekombinacyjne [patrz np. Physicians Desk Reference, wymienione powyżej, na str. 1879 i 2194]. Najbardziej znaczącą korzyścią ze stosowania naturalnego interferonu leukocytowego jako środka leczniczego jest jego niska zdolność wzbudzania odpowiedzi u pacjentów poddanych leczeniu interferonem. Dowiedziono, że pacjenci

176 408 traktowani interferonami rekombinacyjnymi zidentyfikowaymi powyżej i interferonem limfoblastoidowym Wellferon® IFN α-n1 [Burroughs Wellcome] wykształcili przeciwciała neutralizujące interferon [Lok i wsp., Hepatology, 12:1266 (1990); Jakobs i wsp., J. Biol. Resp. Mod., 7:447 (1988); Weck i wsp., J. Interferon Res., 1 (suplement):S37 (1989)]. Jednakże, pacjenci traktowani interferonem pochodzącym z leukocytu (IFN a-n3 lub preparat Cantella częściowo oczyszczonego interferonu) nie wytworzyli w surowicy wykrywalnego przeciwciała w stosunku do interferonu [Von Wussow i wsp., Lancet, 2:635 (1987); Liao i wsp., J. Infect. Dis., 165:757-760 (1992)]. Obecność neutralizujących przeciwciał przeciwinterferonowych może potencjalnie blokować działanie terapeutyczne interferonu, a zatem może być znaczącym czynnikiem podczas leczenia klinicznego. Jednakże wielu takich pacjentów odpornych na alfa interferon rekombinowany wykazało odpowiedź na leczenia naturalnym interferonem alfa.

Znane metody produkcji alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej są zarówno niewydajne jak i bardzo kosztowne [Mogensen i wsp., (1977); Cantell i wsp., (1981); i Horowitz, (1986), wszystkie wymienione powyżej]. Opublikowana metoda Cantella wytwarzania naturalnego alfa interferonu z leukocytów daje przy wytwarzaniu stosunkowo niskie miano interferonu (60.000 CPE jedn./ml) ze stosunkowo wysokiego stężenia komórek (1x10⁷ komórek/ml).

Znane metody oczyszczania naturalnego alfa interferonu mają również swoje ograniczenia. Na przykład, Cantell i wsp., Meth. Enzymol., 78:499 (1981) opisuje tylko częściowe oczyszczanie ludzkiego interferonu leukocytowego na dużą skalę metodą kolejnych wytrąceń. Otrzymywany interferon ma czystość w przybliżeniu 1% i zawiera wiele gatunków interferonu. Berg i wsp., Meth. Enzymol., 78:487 (1981) opisali zastosowanie chromatografii powinowactwa Sepharose 4B - sprzężone przeciwciało monoklonalne do oczyszczania ludzkiego interferonu leukocytowego. W końcu Horowitz (1986) cytowany powyżej, opisuje wytwarzanie i oczyszczanie na dużą skalę ludzkiego interferonu leukocytowego z leukocytów krwi obwodowej. Stosował on bądź metodę wytrąceniową Cantella lub chromatografię powinowactwa przeciwciał NK2.

Z opisu USA nr 4 696 899 jest znany sposób przygotowywania zarówno a jak i y interferonów ludzkich (INFs) przy zastosowaniu dostępnego na rynku środka odżywczego do indukowania interferonów. W sposobie tym nie przewiduje się jednak stosowania specjalnie dobranych substancji i preparatów zwiększających aktywność interferonu i zmniejszających jego działania uboczne.

Z opisu USA nr 4 503 035 jest znany sposób oczyszczania ludzkiego interferonu. Indukowanie interferonu przeprowadza się przy użyciu wirusa choroby New Castle i dostępnych na rysunku preparatów (MEM z Gibco), zawierających surowicę płodu cielęcego (FCS) i kazeinę mleka. Z opisu tego, z podanych w nim sekwencji aminokwasowych wynika, że sposób dotyczy tylko gatunków alfa 2 interferonu.

Rosnąca liczba preparatów alfa jest obecnie stosowana przez pacjentów w próbach klinicznych dla różnych wskazań. Jednakże wszystkie charakteryzują się pewną liczbą działań ubocznych. Obejmują one objawy podobne do grypowych, gorączkę, niską liczbę komórek krwi, zaburzenia przewodu pokarmowego takie jak wymioty i biegunka, zaburzenia układu moczowego, zaburzenia układu oddechowego, reakcje uczuleniowe takie jak skurcz oskrzeli lub anafilacja lub wysypka skórna, wypadanie włosów, oraz infekcja, które są opisane jako charakterystyczne dla alfa interferonów występujących obecnie na rynku.

Mimo, ze niektóre działania uboczne są niewielkie, mogą mieć poważne negatywne działanie na pacjentów, którzy muszą pobierać znaczne dawki kompozycji przez dłuższe okresy czasu. Na przykład, przy niektórych terapiach np. w leczeniu mięsaka Kaposi'ego związanego z AIDS i objawowego AIDS, dawki przy których interferony są skuteczne dają działania uboczne, które są gorsze niż samo działanie choroby na pewnych jej etapach. W próbach klinicznych dla tych wskazań, pojawienie się działań ubocznych powoduje, że pacjenci zaprzestają stosowania interferonu, mimo możliwości osiągnięcia pozytywnego efektu w przypadku jego długotrwałego stosowania. [H. Lane i wsp., Annals of Internal Medicine, 112:805 (1990)].

176 408

Istnieje więc potrzeba ulepszenia kompozycji alfa interferonowych tak, aby charakteryzowały się niską toksycznością i wysoką czystością i mogły dawać minimalne działania uboczne u pacjentów poddanych terapii interferonowej.

Zgodnie z wynalazkiem kompozycja naturalnego alfa interferonu wytworzona jest z ludzkich leukocytów krwi obwodowej i zawiera alfa interferon w postaci mieszaniny gatunków «2 i «8 oraz ich alleli, w ilości co najmniej 50% mieszaniny i co najmniej jeden gatunek interferonu wybrany z grupy obejmującej α4, α Ί, α10, α 16, α 17 i α 21 oraz ich allele w dowolnym farmaceutycznie akceptowalnym nośniku. Wymieniona kompozycja wykazuje poziom toksyczności u ludzkich pacjentów istotnie zredukowany w odniesieniu do kompozycji, które zawierają pojedyncze gatunki interferonu lub inne mieszaniny gatunków interferonu.

Korzystnie kompozycja według zastrz. 1, posiada zawartość węglowodanu między 1 a 6 molami cukru na mol białka interferonu, czystość co najmniej 95% białek ludzkiego alfa interferonu, względną masę cząsteczkową pomiędzy 16 O00 a 27 000 daltonów, co najmniej jedną N-terminalną sekwencję przedstawioną w tabeli 10 oraz co najmniej jedną C-terminalną sekwencję przedstawioną w tabeli 14.

Kompozycja według wynalazku ma hydrofobowość mierzoną elucją w 0,1% kwasie trójfluorooctowym z kolumny (C4), przy stosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej - HPLC z odwróconą fazą, w liniowym gradiencie między 40 - 60% stężenia acetonitrylu jako rozpuszczalnika, dając profil OD280 przedstawiony na fig. 4 oraz jak przedstawiono w tabeli 4, we względnej proporcji w siedmiu pikach na HPLC, jako procent średniego obszaru, przy czym wymieniona kompozycja ma zawartość węglowodanu między 1 a 6 molami cukru na mol białka interferonu, aktywność właściwą pomiędzy około 1-10 x 10⁸ IU/mg według pomiaru in vitro w próbie przeciwwirusowej z zastosowaniem komórek ludzkich i bydlęcych, N-terminalną sekwencję przedstawioną w tabeli 10 oraz C-terminalną sekwencję przedstawioną w tabeli 14.

Kompozycja naturalnego alfa interferonu wytworzona z ludzkich leukocytów krwi obwodowej, zawiera również zgodnie z wynalazkiem białko alfa interferonu wybrane z grupy obejmującej gatunki interferonu α 8, α 4, α7, α 10, α 16, α 17, α 21 i ich allele, oraz ich kombinacje, w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku, przy czym wymieniona kompozycja zasadniczo jest pozbawiona gatunku interferonu a2 i wykazuje większą aktywność przeciwwirusową in vitro niż gatunek interferonu α2 i/lub jego allele. W tej kompozycji białko alfa interferonu jest wyselekcjonowane korzystnie z gatunku interferonu α 2 i jego alleli.

Sposób wytwarzania kompozycji naturalnego alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej według wynalazku polega na tym, że (a) przygotowuje się leukocyty z ludzkiej krwi obwodowej przez zebranie kożuszka po lizie czerwonych krwinek; (b) zawiesza się leukocyty przy gęstości komórkowej 1-10 x 10⁶ komórek/ml w środowisku indukcyjnym, w którym są zawieszone leukocyty o pH około 7,4, wzbogaconym L-glutaminą, aminokwasami, wodorowęglanem sodu, ludzką surowicą agamma między 0,1 to 1,5 mg/ml; do wyboru witaminą B3 i/lub C oraz, ewentualnie środkami hamującymi wzrost mikroorganizmów; (c) dodaje się surowy lub oczyszczony interferon, jako primer, do leukocytów zawieszonych w środowisku indukcyjnym; (d) inkubuje się zawiesinę w temperaturze około 36°Ć podczas mieszania; (e) dodaje się do zawiesiny między 50-500 jednostek HA na mililitr wirusa Sendai; (f) inkubuje się w temperaturze około 36°C podczas mieszania; (g) odwirowuje się w celu usunięcia komórek i odpadów; oraz (i) odbiera się surowy alfa interferon jako produkt, bez wydzielania jednego podtypu alfa interferonu z innych podtypów obecnych w mieszaninie alfa.

Korzystnie etap rozcieńczania zawiesiny leukocytów przeprowadza się po etapie (f), do uzyskania końcowego stężenia około 1-5 x 10⁶ komórek/ml w środowisku indukcyjnym.

Wynalazek obejmuje więc kompozycję zasadniczo czystego alfa interferonu zawierającą naturalną mieszaninę gatunków i podgatunków ludzkiego alfa interferonu. Ta kompozycja charakteryzuje się bardzo wysoką aktywnością właściwą około 4 x 10⁸ jedn./mg i

176 408 zdolnością oddziaływania terapeutycznego u ludzi, przy zasadniczym zredukowaniu działań ubocznych normalnie związanych z interferonami alfa.

Wynalazek jest stosowany do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych zawierających jako jeden składnik aktywny, skuteczną ilość kompozycji alfa interferonu w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Kompozycja farmaceutyczna może zawierać kompozycję alfa interferonu w połączeniu z innymi tradycyjnymi środkami farmaceutycznymi przydatnymi w leczeniu wybranych chorób i zaburzeń.

Wynalazek obejmuje nowy sposób wytwarzania kompozycji alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej, opisanej powyżej, który polega na przeprowadzeniu, w optymalnych warunkach, etapów indukcji i oczyszczania, pozwalających na skuteczną i ekonomiczną produkcję znacznych ilości kompozycji.

Kompozycja oczyszczonego alfa interferonu według wynalazku stosowana jest do leczenia różnych chorób lub zaburzeń układu odpornościowego, raka i/lub chorób wirusowych. Wymienione metody leczenia obejmują podawanie pacjentom kompo zycji farmaceutycznych bądź samych bądź w połączeniu z innymi lekami.

Poniżej opisane są szczegółowo inne aspekty i korzyści wynalazku oraz przykłady wykonania uwidocznione na rysunkach, na których fig. 1 ilustruje miano interferonu i produktywność leukocytów w funkcji gęstości komórek. Produktywność oznaczono tu jako jednostki IRMA na 10⁶ leukocytów; fig. 2 ilustruje miano interferonu jako funkcję wzbudzenia objętości hodowli w 6 litrowej kolbie okrągłodennej; fig. 3 obrazuje typowy profil elucji IFN a-n3a z chromatografii kolumnowej na Superose; fig. 4A obrazuje typowy profil IFN α-n3a stosując wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconą fazą, zwaną dalej RP-HPLC z pól preparatywnej kolumny C4(10 x 250 mm) ilustrujący piki la, 1b i 2-6; fig. 4b obrazuje profil ślepej próby porównawczej gradientu RP-HPLC; fig. 5 obrazuje korelację między biologiczną aktywnością i hydrofobowością białek w pikach RP-HPLC; fig. 6 ilustruje zabarwione na niebiesko Coomassie SDS-PAGE IFN α-n3a w warunkach nie redukujących. Kolumna A ilustruje zabarwione wstępnie niskocząsteczkowe markery (Biorad). Kolumna B jest IFN a-n3a (infrakcjonowanym). Kolumna C jest pikiem la RP-HPLC. Kolumna D jest pikiem 1b RP-HPLC. Kolumna E jest pikiem 2 R.P-HPLC. Kolumna F jest pikiem 3 RP-HPLC. Kolumna G jest pikiem 4 rP-HPLC. Kolumna H jest pikiem 5 RP-HPLC. Kolumna I jest pikiem 6 RP-HPLC; fig. 7 ilustruje niebiesko zabarwione Coomassie SDS-PAGE IFN α-n3a w warunkach redukujących. Kolumny są takie jak zdefiniowano powyżej na fig. 6; fig. 8 ilustruje immunobarwioną plamkę Western IFN α-n3a w warunkach nieredukujących. Kolumny są takie jak zdefiniowane powyżej na fig. 6; fig. 9 ilustruje immunobarwioną plamkę Western IFN α-n3a w warunkach redukujących. Kolumny są takie jak zdefiniowane powyżej na fig. 6.

Szczegółowy opis wynalazku.

Wynalazek obejmuje ulepszoną w stosunku do znanych kompozycję alfa interferonu, dla uproszczenia nazywaną dalej IFN α-n3a i sposób wytwarzania kompozycji IFN α-n3a. Wynalazek jest stosowany do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia chorób podatnych na leczenie alfa interferonem.

1. Kompozycja

Kompozycja alfa interferonu według wynalazku stanowi oczyszczoną mieszaninę naturalnych gatunków i podgatunków ludzkiego alfa interferonu. Jak opisano szczegółowo poniżej, kompozycja według wynalazku różni się od innego naturalnego produktu, tj. IFN α-n3a więcej niż dwukrotnie wyższą przeciwwirusową aktywnością właściwą, co najmniej pięciokrotnie niższymi zanieczyszczeniami i co najmniej pięciokrotnie niższym działaniem pirogennym.

Populacja białek IFN α-n3a zawiera białka definiowane ich sekwencjami aminokwasowymi, które mogą być identyfikowane sekwencjami genu interferonu podanymi w literaturze. W szczególności, kompozycja IFN α-n3a zawiera mieszaninę co najmniej sześciu gatunków białka ludzkiego alfa interferonu. Bazując na N-terminalnym sekwencjonowaniu opisanym poniżej, co najmniej jeden gatunek gatunek alfa interferonu dobranyjest spośród α2b, ale lub kombinacji obu gatunków. Co najmniej drugi gatunek dobrany jest z jednego

176 408 lub kombinacji a4a, α 4b i/lub α 16. Trzeci z sześciu gatunków dobrany jest spośród jednego lub kombinacji gatunków α7a, α7b i/lub a7c. Czwarty z gatunków dobrany jest spośród jednego lub kombinacji α8a, α8b i/lub α8ο. Piąty gatunek jest mieszaniną a 10a. W końcu szósty gatunek alfa interferonów w mieszaninie jest jednym z kombinacji α17a, α17^ cci7c, al7d, α21ίΐ i/lub α21Κ Sekwencje wszystkich tych gatunków interferonów są dostępne w różnych handlowych bazach danych, łącznie z bazą danych. Genbank [Intell Genetics, IN., Mountain View, Ca]. Mieszanina białek w IFN α-n3a nie zawiera gatunków IFN-α 14, IFN-α 2a ani IFN-αΙ.

Wyżej wymienione gatunki lub podgatunki alfa interferonu obecne w kompozycji charakteryzowano stosując wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconą fazą (RP-HPLC) w celu rozdzielenia gatunków interferonu według ich względnej hydrofobowości jak opisano szczegółowo w przykładzie 3. Kompozycja IFN α-n3a ma hydrofobowość, mierzoną na kolumnie RP-HPLC, eluującą między 40 - 60% acetonitrylu. Zarówno sekwencje N-terminalne jak i C-terminalne dla wyżej identyfikowanych gatunków lub podgatunków alfa interferonu były identyfikowane w tej kompozycji, jak opisano szczegółowo w przykładzie 6, części B i D.

Według wynalazku kompozycja IFN α-n3a jest również charakteryzowana jej aktywnością w kilku próbach biologicznych. Jak opisano szczegółowo w przykładzie 4A, próbę antywirusową [patrz np. Linnette i wsp., Cancer Therapy and Control, 1: 109-120 (1990)] przeprowadzono na komórkach ludzkich, bydlęcych i króliczych. Przeciwwirusowa aktywność właściwa IFN α-n3a na komórkach ludzkich i bydlęcych w próbie wynosiła od 1-10 x 10⁸ jedn./mg i na ogół wynosi >2 x 10⁸ jedn./mg. Jednostka interferonu w tej próbie jest definiowana jako wielkość odwrotna rozcieńczenia przy 50% punkcie końcowym i jest doprowadzana do standardu odniesienia NIH (International Leukocyte Interferon Reference Preparation, Ga 23-902-530). Przeciętna przeciwwirusowa aktywność wobec ludzkich komórek HEp-2 wynosi około 4 x 10⁸ jedn./mg.

Wykazano, że gatunek IFN α-n2, reprezentowany przez podgatunki α2b i α2ο, obecny jest w pikach 1a i 1b i stanowi około 50% całkowitej masy białka IFN α-n3a, ale jest odpowiedzialny tylko za około 25% całkowitej aktywności przeciwwirusowej kompozycji przy oddzielnym oznaczeniu pików w tej próbie (patrz tabela 4). Ponadto, jak opisano szczegółowo w przykładzie 8, IFN α-n3a jest 10 -100 krotnie silniej działający niż rekombinowany interferon α2 w tych samych stężeniach oznaczony in vitro na przeciwwirusowe działanie przeciw HIV w monocytach.

Działanie biologiczne oznaczono również w próbie przeciwrozrostowej na komórkach ludzkich, jak opisano w poniższym przykładzie 4B [patrz np. Gillis i wsp., J. Immunol., 12:2027 (1978)]. Aktywność właściwa wynosiła od 1 -10 x 108 jedn./mg, a ogólnie > 1 x 10⁸ jedn./mg. Przeciętna przeciwrozrostowa aktywność właściwa wobec ludzkich komórek Daudiego wynosi około 1,5 x 108 j_ed_n./_mg. Jednostka interferonu w tej próbie jest identyfikowana jako wielkość odwrotna rozcieńczenia przy 50% punkcie końcowym.

Bioaktywność (> 99%) kompozycji, według oznaczenia w próbie antywirusowej, można zneutralizować za pomocą owczej poliklonalnej surowicy odpornościowej (wyhodowanej do oczyszczonego IFN α^3) specyficznej wobec ludzkich interferonów leukocytowych w standardowej próbie neutralizacji [Y. Kawade, Meth. Enzymology, 119:558-573 (1986)].

Ponadto, w próbie na ciała pirogenne na króliku [Pyrogen Test, USP XII/NF XVII, United States Pharmacopeial Convention, Inc. str. 1515 (1990)] wzrost przeciętnej temperatury ciała królika o około 0,2°C wskazuje na bardzo niską zawartość pirogenu w kompozycji. W rzeczywistości, taki rezultat jest co najmniej pięciokrotnie niższy od wyników dla IFN α - 3n.

Oznaczono również własności fizyczne kompozycji IFN α-n3a według wynalazku. Na przykład, kompozycja jest zasadniczo czysta; to znaczy, że składa się z więcej niż około 95% białek ludzkiego alfa interferonu. Mniej niż 5% tej kompozycji zawiera zanieczyszczenia takie jak białka alfa interferonu nie człowieka, inne kwasy nukleinowe lub enzymy, lipidy i podobne. Bardziej szczegółowo, kompozycja tajest o czystości >98% białek

176 408 ludzkiego alfa interferonu. Najkorzystniej, ma ona czystość około 99% białek ludzkiego alfa interferonu.

Czystość kompozycji mierzy się zarówno za pomocą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodowego (SDS-PAGE) jak i procedurami plamki Westerna, jak omówiono szczegółowo w przykładzie 5 poniżej. W nawiązaniu do metody oczyszczania opisanej poniżej, to oczyszczanie tłumaczy do około 8000-krotnie oczyszczanie od pierwszego etapu NK2 oczyszczania powinowacyjnego, i około 2 krotne od drugiego etapu oczyszczania za pomocą Superose. Całkowite oczyszczenie IFN α-n3a jest około 12.000 krotne w stosunku do surowych materiałów z leukocytów, jak opisano szczegółowo poniżej.

Analiza plamek Westerna (fig. 8 i 9) kompozycji w warunkach nieredukujących i redukujących, wykazuje odpowiednio, że wszystkie pasma białka są identyczne z interferonami ludzkimi o poziomie zanieczyszczeń w niefrakcjonowanym interferonie około 1% lub mniej. Kolejne frakcjonowanie na RP-HPLC nie wykazuje wykrywalnych zanieczyszczeń, w którymkolwiek piku.

Dwuwymiarowe analizy żelowe dla niefrakcjonowanego IFN α-n3a wskazują, że istnieje wiele plamek wykrytych dla małych próbek, wszystkie rozpoznane przez monoklonalne przeciwciało LIT-1 (patrz przykład 5, część A, poniżej) wskazując, że są to białka interferonu. Pozorny ciężar cząsteczkowy kompozycji zawarty jest w granicach 16 - 27 kilodaltonów według pomiaru na żelu SDS-PAGE. Kompozycja charakteryzuje się również punktem izoelektrycznym w zakresie między 0,5 a 7,5, a korzystniej między 5,5 a 6,5. Liczba plamek i ciężarów cząsteczkowych w każdym piku zestawiona jest w przykładzie 5, w tabeli 8 poniżej.

Własności biochemiczne kompozycji interferonu według wynalazku, np. oznaczone za pomocą analizy aminokwasów, i sekwencjonowania amino- i karboksylo-terminalnego opisane są szczegółowo w przykładzie 6. Sekwencjonowanie amino- i karboksylo-terminalne wskazuje, że kompozycja interferonu zawiera nietknięte cząsteczki interferonu, które składają się z około 165-166 reszt aminokwasowych na cząsteczkę. Kompozycja zawiera również dwa wiązania dwusiarczkowe.

Produkt charakteryzowano również w celu oznaczenia zawartości węglowodanów np. aminocukrów, cukrów obojętnych i kwasów sialowych. Jest to również opisane szczegółowo w przykładzie 6C. Kompozycja charakteryzowana jest za pomocą glikozylowania Q-połączonego węglowodanu kompozycji węglowodanowej składającej się z galaktozoaminy (GalN), glukozaminy (GlcN), galaktozy, glukozy, mannozy i kwasu sialowego. Przeciętnie, kompozycja zawiera >6 moli cukrów/mol białka interferonu i przeciętnie między 1-3 mola cukru/mol interferonu. Glikozylowanie IFN α-n3a musi być w miejscu innym niż reszta Asn odpowiedzialna za glikozylowanie N-połączone, ponieważ IFN α-n3a nie zawiera IFN-α 14, jedynego gatunku alfa interferonu o potencjale N-glikozylowania przy reszcie Asn. Miejsce O-połączonego glikozylowania oznaczono za pomocą trawienia enzymowego i następnego sekwencjonowania aminokwasowego. Wyniki pokazują, że threonina w pozycji 106 jest w miejscu glikozylowania (przykład 6C).

Inne własności biochemiczne miejsc wiążących kompozycji IFN α-n3a według wynalazku obejmują obecność miejsc wiążących dla monoklonalnego przeciwciała, NK2 [Celtech, W. Bryt.]. NK2 informująco rozpoznaje tylko podgrupę gatunku alfa interferonu, np. α 2(a/b/c), α 8(a/b/c), α 10a, α 17(a/b/c), α 7(a/b/c), α 6 i a21(a/b). Nie rozpoznaje ono gatunku interferonu α 1, α 5, α 10b, α 14 lub -omega 1. Kompozycja IFN α-n3a jest również trwała przez pH między około 2 a 9. Kompozycja ma trwałość termiczną w temperaturze 56°C przez okres czasu > 2 godziny.

Kompozycje IFN α-n3a α interferonu według wynalazku znacznie różnią się od innych alfa interferonów zarówno rekombinowanych jak i naturalnych, które obecnie są dostępne w handlu lub stosowane w próbach klinicznych. Najbardziej uderzającą różnicą jest niewspółmiernie niska toksyczność IFN α -n3a w porównaniu ze znanymi kompozycjami alfa interferonowymi. W perspektach i literaturze opisującej IFN α-n3 podano, że naturalny

176 408 produkt α-interferonowy pochodzący od PBL daje w znacznym procencie badanych pacjentów typowe działania uboczne alfa interferonu.

Istnieją również inne różnice między produktem według niniejszego wynalazku, a znanym naturalnym interferonem takie jak wykazano powyżej. W porównaniu ze znanym produktem IFN α-n3 stosowanym w badaniach klinicznych, obecna kompozycja IFN α-n3a ma 2 krotnie wyższą aktywność właściwą w próbie antywirusowej około 4 x 10⁸ jedn./mg. Obecna kompozycja ma co najwyżej 2% zanieczyszczeń w stosunku do poziomu zanieczyszczenia poprzedniego produktu wynoszącego między 5-10%. Ponadto, obecna kompozycja ma bardzo niskie wyniki testu na pirogen np. około 0,2°C w stosunku do wyniku poprzedniego produktu IFN α-3n wynoszącego około 1°C.

Różnice istnieją również w sposobach wytwarzania tych dwóch produktów.

Różnice w toksyczności między kompozycją, a interferonem rekombinowanym są jeszcze bardziej uderzające. Poza faktem, że kompozycja według wynalazku według wynalazku stanowi mieszaninę gatunków alfa interferonu w stosunku do gatunku pojedynczego w produkcie rekombinowanym, naturalny alfa interferon nie jest sporządzany w bakteriach, jak interferony rekombinacyjne, a zatem nie posiada zanieczyszczających bakteryjnych produktów ubocznych prawdopodobnie wywołujących działania ubocznych u ludzi.

W odniesieniu do zredukowania działań ubocznych wykazywanych przez kompozycję według wynalazku w przykładzie 7, podano szczegóły badań toksyczności przeprowadzonych na kompozycji według wynalazku zgodnie postępowaniem stosowanym tradycyjnie przez Światową Organizację Zdrowia i opisaną przez Abramsa i wsp., w The Clinical Research Process in Pharmaceutical Industry, G. M. Matoren, wyd. Marcel Dekkev, Inc., rozdział 10, str. 195-216 (1984). Badania toksyczności przeprowadzone na pacjentach podają, że kompozycja według wynalazku prawie nie posiada działań ubocznych.

Faktycznie, w tabeli 16 podanej poniżej, porównano działania uboczne podawane dla innych znanych produktów alfa interferonowych w stosunku do działań ubocznych kompozycji według wynalazku stosowanej w badaniach klinicznych. Dane te wykazują, że kompozycja według wynalazku znacznie redukuje działania uboczne, co jest niezwykle ważne przy podawaniu jej pacjentom przez długie okresy. Ponadto, dzięki temu pacjentom mogą być podawane wyższe dawki kompozycji według wynalazku przy zredukowanych działaniach ubocznych w porównaniu ze znanymi produktami interferonowymi.

Wynalazcy nie wiedzą dokładnie, dlaczego kompozycja według wynalazku wykazuje taki nieoczekiwany stopień redukcji działań ubocznych. Mimo, że nie chcą być związanymi z jakąś teorią przyjmują, że przyczyna istotnego zredukowania toksyczności i działań ubocznych, oraz wynikająca stąd skuteczność leczenia kompozycją, może bazować na fakcie, że różne gatunki ludzkiego interferonu obecne w kompozycji według wynalazku przyłączają się do więcej niż jednego epitopu lub receptora w komórkach pacjenta, któremu, podawana jest kompozycja. Ponadto bardzo niska zawartość zanieczyszczeń obecnych w tej kompozycji może również się wiązać z nieoczekiwanymi własnościami kompozycji.

Ponadto, z uwagi na to, że aktywność właściwa w próbach przeciwwirusowych i przeciwrozrostowych jest wyższa niż znanych interferonów, pacjentom mogą być podawane niższe dawki, które to mniejsze dawki prawdopodobnie są niższe od dawek toksycznych kompozycji, jeśli w ogóle są.

Ponadto, glikozylacja post-translacyjna białek w niniejszej kompozycji może przyczyniać się do braku agregowania, co daje mniejsze działania uboczne. Obróbka może dać mniej utlenione lub mniej chemicznie modyfikowane reszty aminokwasowe w białkach alfa interferonu. Węglowodan w białkach alfa interferonu może być właściwie zachowany w trakcie produkcji tej kompozycji, a zatem zachowane jest podobieństwo do białek naturalnego alfa interferonu w organizmie człowieka. Wynikiem procesu może być również głównie powstawanie aktywnych monomerów alfa interferonu i nikłe powstawanie nieaktywnych oligomerów alfa interferonu lub agregatów białek.

176 408

2. Sposób wytwarzania kompozycji

W skrócie, sposób wytwarzania kompozycji alfa interferonu obejmuje zarówno proces indukcji jak i oczyszczania. Proces indukcji opisany jest szczegółowo poniżej w przykładzie 1, a proces oczyszczania w przykładzie 2.

a. Indukcja interferonu.

W procesie indukcji, IFN α-n3a produkowanyjest przez wzbudzenie zawiesin ludzkich PBL z wirusem Sendai. Głównym czynnikiem, który znacząco wpływa na ilość leukocytu alfa interferonu, IFN α-n3a, produkowanego z leukocytów krwi obwodowej (PBL), są gęstość komórek w trakcie wzbudzania, stężenie wodorowęglanu sodu w środowisku wzbudzania, stężenie ludzkiej surowicy agamma, stężenie i typ primera, kinetyka wzbudzenia, objętość hodowli w kolbach, szybkość mieszania hodowli, temperatura wzbudzenia, skład środowiska i stężenie oraz charakterystyka wirusa Sendai.

Zgodnie z procesem wzbudzania, krew pobiera się od zdrowych dawców krwi i sporządza się ludzkie PBL przez zebranie górnej jaśniejszej warstwy skrzepu krwi zawierającej osocze i krwinki białe, a następnie lizę czerwonych krwinek chlorkiem amonu, korzystnie 0,83% chlorkiem amonu. Wówczas, leukocyty zawiesza się w środowisku wzbudzania o pożądanej gęstości komórek.

Gęstość komórek może wynosić od około 1-10 x 10⁶ komórek/ml. Wydajność względna produkcji alfa interferonu może być określana ilością interferonu produkowanego na komórkę przy dowolnej gęstości właściwej komórek. Wynalazcy określili, że podczas gdy, ilość wytwarzanego alfa interferonu wzrasta proporcjonalnie ze wzrostem stężenia komórek, optymalną produktywność alfa interferonu z ludzkich leukocytów otrzymuje się przy gęstości komórek 4 x 10⁶ komórek/ml. Produktywność ta może być mierzona za pomocą próby immunoradiometrycznej (IRMA) [Celltech Ltd.] lub w próbie efektu cytopatycznego (CPE) opisanego poniżej. W próbie tej, miana podano jako IRMAjedn./ml, dla próby CPE jako IU/ml (jednostki międzynarodowe/ml) w porównaniu ze standardem opisanym poniżej. Mimo, że maksymalne miano interferonu (około 50.000 IRMAjedn./ml, równoważne około 100.000 CPE jedn./ml) obserwuje się przy zastosowaniu 1 x 10⁷ leukocytów/ml w trakcie wzbudzania, najwyższą produktywność interferonu (około 43.000 IRMA jedn./ml równoważne około 86.0ϋ0 CPE jedn./ml) otrzymuje się przy 4 x 10⁶ komórek/ml. Zatem, produktywność komórek przy gęstości 107 komórek/ml wynosi około połowę stwierdzonej przy 4 x 106 komórek/ml. Patrz np., fig. 1.

Środowisko wzbudzenia jest minimalnym istotnym medium (MEM), korzystnie o mocy między 0,5X do 1,5X i zawierającym sól Earla, pH 7,4, uzupełnione L-glutaminą, aminokwasami niepotrzebnymi do wzrostu komórek, 4,46 mg/ml Tricine i 24 ^ug/ml siarczanem Neomycyny. Obecne dane sugerują, że miano wzbudzenia jest najwyższe przy stężeniu 0,85X do 1,15XMEM, którego osmolarność zbliżona jest do warunków fizjologicznych.

Wymagane jest również, ażeby środowisko indukcyjne do wywarzania alfa interferonu zawierało ludzką, rzeczywiście zubożoną surowicę IgG (surowicę agamma). Skuteczne stężenie surowicy do produkcji interferonu zawarte jest w zakresie 0,1 do około 1,5 mg/ml, a korzystniej 0,1 do około 1,0 mg/ml. Korzystnie stosuje się stężenie około 0,4 mg/ml.

Wyższe stężenia surowicy nie są korzystne dla produkcji interferonu, przypuszczalnie z uwagi na obecność czynników inhibitujących w preparatach surowicy. Stwierdzono, że optymalne stężenie surowicy w niniejszym procesie produkcyjnym jest znacznie niższe niż zalecane stężenie 2,4 mg/ml w metodzie Cantella. Zastosowanie niższego stężenia surowicy przy indukcji może znacznie przyczynić się do zredukowania zanieczyszczających białek surowicy w dalszych procesach oczyszczania interferonów.

Proces indukcji optymalizuje się przez włączenie kilku innych składników do środowiska. Pożądane jest, aby środowisko wzbudzania zawierało wysokie stężenie wodorowęglanu sodu (NaHCOa) w przeciwieństwie do znanych sposobów, które nie stosują lub stosują niskie stężenie wodorowęglanu sodu. Zwiększenie stężenia wodorowęglanu w MEM ma znaczący wpływ (np. 3 lub 4 krotne zwiększenie) na wydajność wytwarzanego interferonu. Korzystne stężenia wodorowęglanu wynoszą między około 0,3 do około 2,5 mg/ml. Korzystniej, zakres ten wynosi od około 1,7 do 2,2 mg/ml. Stężenie

176 408

2,2 mg/ml wodorowęglanu sodu co najmniej podwaja miano interferonu wyprodukowanego zgodnie z wynalazkiem.

Jednym z czynników ograniczających szybkość w trakcie syntezy interferonu z PBL może być istotny czynnik żywieniowy takijak rzadkie minerały, witaminy i kwasy tłuszczowe. Dodanie niektórych witamin do hodowli wzbudzającej w obecnym wynalazku działa w kierunku zwiększenia produkcji interferonu. Dodanie witaminy C i witaminy B3 (niacyny), indywidualnie, do hodowli indukcyjnej zwiększa wydajność interferonu o o 20-30% w porównaniu z hodowlami bez którejkolwiek z tych witamin. Skuteczne stężenia witaminy C do zwiększenia produkcji interferonu zawarte jest pomiędzy około 0,0002 do około 2 mg/ml. Wyższe stężenia witaminy C niż 2 mg/ml inhibituje produkcję interferonu z PBL. Skuteczne stężenia witaminy B3 do zwiększenia produkcji interferonu zawarte są między około 0,5, a około 1000 wg/ml. Stwierdzono, że inne związki takie jak siarczan żelaza, kwas masłowy, fosforan tokoferolu, tokoferol, glukoza i cholesterol bądź nie mają wpływu bądź inhibitują produkcję alfa interferonu.

Obecny wynalazek podaje sposób wytwarzania interferonu w szerokim zakresie objętości. Objętość wzbudzenia na kolbę może być różna, od 150 ml do 6 litrów lub więcej. Objętość wzbudzenia hodowli może być zwiększona do pełnej objętości w kolbie (lub zmniejszona) zależnie od życzenia, bez wpływu na wydajność interferonu. Ponadto, ponieważ kolba może być całkowicie wypełniona, sposób według wynalazku pozwala na powiększenie skali produkcji interferonu przy minimalnej liczbie kolb, redukując tym sposobem przestrzeń i koszt produkcji interferonu. Indukcja na dużą skalę, aż do tysięcy litrów może być osiągnięta przez zastosowanie wielu dużych kolb lub bioreaktorów w podobnych warunkach wzbudzania opisanych w niniejszym wynalazku.

Surowy lub oczyszczony leukocytowy interferon alfa dodaje się następnie jako primer (czynnik zapoczątkowujący) do PBL zawieszonych w środowisku wzbudzenia. Zarówno surowy jak i oczyszczony naturalny leukocytowy alfa interferon zastosowany jako primer wzbudza podobne ilości interferonu z białych krwinek. Leukocyty można primować pomiędzy 1 do około 100.000 (jednostek międzynarodowych) IU/ml, a korzystnie około 10-100 IU/ml supernatantu surowego interferonu alfa. Przez interferon surowy należy rozumieć IFN α-n3a otrzymany z opisanych tutaj metod zarówno wzbudzenia jak i oczyszczenia.

Przewiduje się, że inne interferony mogą być stosowane jako primery np. IFN-beta, IFN-gamma i ewentualnie inne cytokiny. Na przykład, naturalny ludzki IFN-gamma w stężeniach 100 do 1000 jedn./ml może stymulować produkcję alfa interferonu, ale daje niższy wzrost syntezy alfa interferonu niż obserwowany wówczas, gdy jako primery zostaną użyte bądź surowe bądź oczyszczone alfa interferony.

Stwierdzono, że optymalny czas zapoczątkowania wynosi w przybliżeniu 2 do 3 godzin przed dodaniem wirusa Sendai w temperaturze około 36°C. Różne czasy zapoczątkowania mogą powodować znaczne zmiany w ilości interferonu wydzielanego z leukocytów. Zapoczątkowanie leukocytami przez krótsze okresy czasu niż 1 godzina powoduje zmniejszenie wydajności interferonu. Zapoczątkowywanie przez dłuższy czas niż 3 godziny może nie dawać jakichś dostrzegalnych korzyści.

Korzystnie, w etapie primowania, leukocyty w stężeniu 10⁷ komórek/ml zapoczątkowuje się 20 IU/ml surowego interferonu przez około 3 godziny.

Po zapoczątkowaniu do zawiesiny leukocytów dodaje się wirus Sendai, który jest ważnym środkiem wzbudzającym interferony. Produktywność interferonu może się znacznie zmieniać przy różnych partiach lub preparatach wirusa. Różnice we wzbudzalności interferonu może być spowodowana różnymi ilościami cząsteczek Defective Interfering (DI) (wadliwie ingerujących) wirusa Sendai w różnych preparatach wirusa. Wysoka ilość cząsteczek DI może grać rolę inhibitującą przy produkcji interferonu.

Na ogół, adsorpcja wirusa Sendai do leukocytów jest najwydajniejsza przy opisanej powyżej wysokiej gęstości komórek ze stężonym wirusem. Optymalne stężenie wirusa wymagane dla maksymalnego wzbudzenia interferonu musi być określone doświadczalnie, i zwykle jest w zakresie około 50 do około 500 jednostek hemaglutyniny (HA) na ml

176 408 w końcowym stężeniu w płynie hodowli komórkowej. Korzystniej, stężenie wirusowe zmienia się od 50-250 jedn. HA/ml.

Wytwarzanie interferonu maksymalizuje się przez zastosowanie metody Absorpcja/Rozcieńczenie, w której stężone hodowle komórkowe rozcieńcza się. Według tej metody, wirus Sendai w stężeniu końcowym około 375 jedn. HA/ml adsorbuje się do leukocytów przy gęstości komórek 10⁷ komórek/ml przez około jedną godzinę w temperaturze w przybliżeniu 36°C. Korzystnie, hodowlę następnie rozcieńcza się około 2,5 krotnie, środowiskiem indukcyjnym uzupełnionym surowicą agamma do końcowego stężenia komórek 4 x 106 komórek/ml i stężenia wirusa Sendai około 150 jedn. HA/ml. W każdych warunkach, stwierdzono, że wzbudzenie przy użyciu metody Adsorpcja/Rozcieńczenie dawało około 10% wyższe miano niż wytwarzane bez zastosowania metody Adsorpcja/Rozcieńczenie. Środowisko rozcieńczane może być bądź w temperaturze pokojowej, bądź podgrzane do 36°C i ewentualnie może zawierać primery.

Wzbudzanie można, ewentualnie przeprowadzić bez zastosowania metody Adsorpcja/Rozcieńczenie. W tych przypadkach, produkcja we wskazanej gęstości komórek leukocytów (1-10 x 106 komórek/ml) może być primowana surowym interferonem przez około 3 godziny, po czym dodaje się wirus Sendai we wskazanych stężeniach. Hodowle inkubuje się następnie przez 15-16 godzin i interferony mogą być odbierane podobnie.

Temperatury inkubacji hodowli leukocytowych w celu produkcji interferonu według wynalazku mogą być zawarte w zakresie od około 35°C do około 37°C. Jednakże, ustalono, że optymalna temperatura inkubacji wynosi 36°C. Metoda Cantella zaleca 37,5°C jako optymalną temperaturę produkcji interferonu [Mogensen i wsp., (1977); Cantell i wsp., Methods Enzymol., (1981); i Horowitz, (1986) - wszyscy cytowani powyżej]. Jednakże wynalazcy stwierdzili, że w temperaturze niższej od 37°C wytwarza się więcej interferonu. Wyniki z indukcji w trzech kolbach 6 litrowych przy 4 bądź 5 x 106 komórek/ml, inkubowane w temperaturach 35°C, 26°C lub 37°C w trakcie całego procesu wykazały, że inkubacja w temperaturze 36°C daje o 20% do 50% więcej interferonu niż w temperaturach 35°C lub 37°C.

Szybkość mieszania sztabką magnetyczną we wzbudzanej hodowli jest również ważna, ażeby utrzymać optymalne napowietrzenie i mieszanie składników. Przy 72 obr/min, wytwarzane jest około 17.000 jedn. IRMA/ml interferonów w średniej wielkości kolbie (500 ml) przy 4 x 106 komórek/ml. Gdy szybkości mieszania zwiększa się do około 170 do 250 obr/min, ilość produkowanych interferonów znacznie wzrasta do około 30.000 jedn. IRMA/ml. Zatem, szybkość mieszania pomiędzy 100 a 300 obr/min, a korzystnie około 170 obrotów/minutę jest konieczna dla maksymalnej produkcji interferonu na etapach indukcji.

Całkowity czas inkubacji po dodaniu wirusa Sendai może być zawarty pomiędzy 1 do 48 godziny, a korzystnie między 15 a 22 godziny. Po odpowiednim czasie inkubacji w temperaturze 36°C, zawiesinę wiruje się przy szybkości 2.500 obr/min w celu usunięcia komórek i substancji odpadkowych i odbiera się surowy alfa interferon.

W poniższej tabeli 1 zestawiono różnice między sposobem wytwarzania alfa interferonu według wynalazku (A) a sposobem znanym (B) [Cantell i wsp., (1981) cytowany powyżej].

Tabela 1

Środowisko indukcji

A. Środowisko MEM Eagle'a uzupełnione solami Earle'a, L-glutaminą, aminokwasami niepotrzebnymi do wzrostu komórek, 4,6 mg/ml Tricine, 24 //g/ml neomycyny przy pH 7,4.

B. Środowisko MEM Eagle'a bez fosforanu i uzupełnione 3 mg/ml Tricine, 24 //g/ml neomycyny przy pH 7,4.

NaHCO 3, ludzka surowica agamma i uzupełnienia

A. 0,1 do 2,5 mg/ml NaHCO, 0,1 do 1,5 mg/ml surowicy i witamina C lub witamina B3 (niacyna).

176 408

B. Tylko 2,4 mg/ml surowicy.

Objętość kolby

A. ΐ5θ ml, 500 ml, 2 litrowe, 6 litrowe kolby. Objętość hodowli może być różna od 5% do 100% pojemności kolby.

B. 2 litrowa lub 6 litrowa kolba. Objętość hodowli wynosi mniej niż 50% pojemności kolby.

Gęstość komórek

A. 10⁷ komórek/ml przy zapoczątkowaniu i fazie adsorpcji wirusa z następnym rozcieńczeniem do około 4 x Kr komórek/ml przez 1 godzinę po dodaniu wirusa. Albo około 4 x 10⁶ komórek/ml przy zapoczątkowaniu adsorpcji wirusa i w ciągu całonocnej inkubacji.

B. 10⁴ komórek/ml.

Primer i warunki zapoczątkowania

A. Supematant surowego α interferonu lub oczyszczony interferon a w stężeniu 10-50 jedn.m./ml: primowanie 3 godziny w temperaturze 36°C.

B. Supematant surowego a interferonu w stężeniu 100-200 jedn.m./ml, primowanie 2 godziny w temperaturze 37,5°C.

Wirus Sendai

A. 125-500jedn. HA/ml w fazie adsorpcji wirusa, a następnie rozcieńczenie do 50-200 jedn. HA/ml.

B. 100-150jedn. HA/ml.

Szybkość mieszania i warunki inkubacji

A. 130-250 obr/min; 15-20 godzin w temperaturze 36°C.

B. Szybkość mieszania nie podana; 17 godzin w temperaturze 37,5°C.

Po indukcji, miano interferonu jest następnie oznaczane bądź za pomocą oznaczenia immunoradiometrycznego przy użyciu zestawu IRMA [Celltech; Berkshire, W. Bryt.] bądź za pomocą próby działania cytopatologicznego (CPE) z zastosowaniem ludzkich komórek epidermoidalnych HEp-2 (AtCC CCL 23) oraz wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV, szczep Indiana ATCC # VR-158) jako wirusa ryzyka według opublikowanej metody [Linette i wsp., Cancer Therapy and Control, 1:109-120 (1990)]. Miano oznaczone za pomocą próby IRMA podaje się w jedn. IRMA/ml lub po prostu jedn./ml, a miano otrzymane z próby CPE podaje się w IU/ml (jednostkach międzynarodowych/ml) jako porównanie z leukocytowym standardem odniesienia (Ga 23-902-530) National Institute of Health. W oznaczeniu IRMA jako przeciwciało wykrywające stosowane jest radioznaczone monoklonalne przeciwciało NK-2. Bazując na gatunku rozpoznawanym przez NK2, miano IRMA ogólnie będzie niższe od miana CPE. Na ogół obserwuje się, że miano IRMA surowego interferonu z indukcji jest w przybliżeniu równe połowie miana CPE.

b. Oczyszczanie surowego interferonu.

Surowy interferon oczyszczany jest według protokołu opisanego szczegółowo w przykładzie 2. W skrócie, proces ten przebiega następująco. Najpierw surowe hodowle leukocytowe z indukcji albo odwirowuje się z szybkością w przybliżeniu 2900 x g przez około 15 do 20 minut, albo przesącza przez odpowiednie układy wkładek filtracyjnych. Układy wkładek filtracyjnych składają się na przykład ze sterylizowanych wstępnie wysokowydajnych wkładek filtracyjnych Polygard-CR o wielkości porów 0,1 μ połączonych szeregowo z filtrami Polysep-TP o wielkości porów 0,5 μ (Millipore Corporation, Bedford, MA).

Otrzymany supematant surowego alfa interferonu zatęża się następnie od około 10 do 100 krotnie, stosując na ogół układ filtracyjny o przepływie stycznym. Korzystne jest zatężenie 50 krotnie. Zatężony supematant może być następnie wirowany w warunkach około 9000 x g przez około 30 minut. Jednak, nie jest wymagane żadne dodatkowe wirowanie, jeśli stosowano układ filtracyjny jako sposób odbioru produktu.

Surowy zatężony alfa interferon z tego etapu przeprowadza się przez pierwszą kolumnę chromatograficzną (Kolumna powinowactwa przeciwciała NK2), z której eluuje się interferon przy pH 2 po intensywnym przepłukaniu. Chromatografia powinowactwa przeciwciała usuwa większość białek surowicy ludzkiej i inne zanieczyszczenia. Odzyskuje się

176 408 około 80-90% aktywności IRMA interferonu i interferon z tego etapu oczyszczony jest 8.000 krotnie. Czystość interferonu na tym etapie jest zwykle > 90%.

Wyeluowany interferon alfa poddaje się inkubacji kwasowej przez 5 dni w temperaturze 4°C, następnie neutralizuje, zatęża i poddaje filtracji w żelu w kolumnie chromatograficznej (Superose 12 Column) otrzymując kompozycję według wynalazku. Filtracja w żelu usuwa zanieczyszczenia o wysokim i niskim ciężarze cząsteczkowym, takie jak mysi IgG wyciekły z kolumny NK2, ludzki IgG, oligomery interferonu lub zdegradowane IFN.

Typowy profil elucji chromatografii filtracyjnej w żelu przedstawia fig. 3, gdzie interferony eluują w głównym piku absorbancji. Całkowite oczyszczenie po obu etapach chromatografii powinowactwa i filtracyjnej w żelu daje odzyskanie 60-70% aktywności IRMA interferonu i w sumie 12.000 krotne oczyszczenie. Końcowy oczyszczony interferon ma czystość około 99% według oznaczenia SDS-PAGE i analizy plamek Westerna, oraz ma przeciwwirusową aktywność właściwą około 4 x 108 pu/mg (patrz przykład 4A).

3. Kompozycje farmaceutyczne, w których stosowana jest kompozycja według wynalazku.

Oczyszczony alfa interferon IFN α-n3a, według wynalazku, może być stosowany do leczenia różnych chorób układu odpornościowego, nowotworów i/lub chorób wirusowych. Przy użyciu interferonu alfa według wynalazku przewiduje się, ale nie ogranicza się do nich, traktowanie stanów chorobowych Condyloma acuminata, zapalenie wątroby B, zapalenie wątroby C, białaczki kosmatokomórkowej, AIDS, nowotworu Karposi'ego, objawu przewlekłego zmęczenia, opryszczki narządów płciowych, brodawki narządów płciowych, dysplazji szyjki macicy, raka szyjki macicy i kfykciny pochwowej. Produkt może być również podawany do leczenia stanów podatnych na leczenie interferonem.

Kompozycje wytwarzane sposobem według wynalazku, zawierające skuteczną ilość alfa interferonu w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, mogą być podawane pacjentowi, u którego stwierdzono stan chorobowy reagujący na leczenie alfa interferonem.

Lecznicze i farmaceutyczne kompozycje, w których stosuje się kompozycję alfa interferonu według wynalazku, zawierają zatem terapeutycznie skuteczną ilość IFN α-n3a w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Kompozycje farmaceutyczne o działaniu przeciwwirusowym, przeciwrakowym lub immunomodulującym mogą być stosowane w preparatach typu tradycyjnego takich jak roztwory, syropy, emulsje, preparaty do iniekcji, tabletki, kapsułki, preparaty domiejscowe lub czopki.

Odpowiednie nośniki są dobrze znane fachowcom w dziedzinie farmacji (patrz np. Remington's Practice of Pharmacy). Przykładowe nośniki obejmują sterylną solankę i cukry takie jak ksylit, gliceryna, laktoza i sacharoza. Innymi komponentami nośnikowymi są fosforan wapnia, żelatyna, dekstryna, agar, celuloza, hydroksyetyloceluloza (do stosowania domiejscowego), wazelina, glikol polietylenowy, pektyna, olej arachidowy, olej z oliwek, olej sezamowy, skwalen i woda.

Ponadto, nośnik lub rozcieńczalnik może zawierać materiał opóźniający taki jak monostearynian glicerylu lub distearynian glicerylu sam lub z woskiem. Ewentualnie, dla poprawienia trwałości preparatu farmaceutycznego można stosować odpowiednie stabilizatory chemiczne. Odpowiednie stabilizatory chemiczne są dobrze znane fachowcom i obejmują na przykład kwas cytrynowy i inne środki do ustalania pH, środki chelatujące lub wiążące i przeciwutleniające.

Preparaty kompozycji farmaceutycznej zawierającej IFN α-n3a mogą być sporządzane dogodnie w postaci jednostkowych dawek i mogą być wytwarzane dowolną z tradycyjnych metod. Alternatywnie, kompozycja może być w postaci przystosowanej do powolnego uwalniania in vivo, jak jest to znane. Wszystkie metody obejmują etap doprowadzenia do połączenia składnika aktywnego z nośnikiem, który może stanowić jeden lub więcej składników towarzyszących.

Ilość oczyszczonego produktu, która będzie skuteczna w leczeniu danego zaburzenia lub stanu chorobowego, zależeć będzie od charakteru zaburzenia lub stanu chorobowego i może być oznaczona standardowymi technikami klinicznymi. Dla oznaczenia cytotoksycz176 408 ności typu guza, przed testowaniem i zastosowaniem u ludzi byłoby pożądane, aby przeprowadzono traktowanie in vitro, a następnie na przydatnych układach modelu zwierzęcego.

Metody wprowadzania obejmują korzystnie, podawanie do miejsca uszkodzonego, doskóme, domięśniowe, dootrzewnowe, dożylne, podskórne, domiejscowe, doustne i donosowe.

Ponadto, może być pożądane podawanie kompozycji farmaceutycznych, lokalnie do obszaru gdzie traktowanie jest potrzebne. Można to osiągnąć metodami obejmującymi, ale nie ograniczającymi się do lokalnych infuzji w trakcie zabiegu chirurgicznego, iniekcji, przez kateter lub przez inplant, przy czym stosuje się wymieniony implant z materiału porowatego, nieporowatego lub żelatynowego, łącznie z membranami takimi jak membrany sialastyczne lub włókna.

Wynalazek obejmuje również kompozycje farmaceutyczne zawierające IFN α-n3a podawane poprzez lipozomy, mikrocząsteczki lub mikrokapsułki. W różnych wykonaniach wynalazku, może być przydatne stosowanie takich kompozycji do uzyskania podtrzymywanego uwalniania substancji. W specyficznym wykonaniu, pożądane może być wykorzystanie lipozomów nacelowanych poprzez przeciwciała do specyficznych zdolnych do zidentyfikowania antygenów guza (np. powierzchnia komórek antygenów selektywnych dla niedojrzałego nerwiaka lub SCLC) [Leonetti i wsp., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 87:2448-2451 (1990); Renneisen i wsp., J. Biol. Chem., 265:16337-16342 (1990)].

Alfa interferon według wynalazku może być również stosowany, sam lub w połączeniu z innymi środkami leczniczymi lub diagnostycznymi przydatnymi w bezpośrednim lub pośrednim traktowaniu niektórych nowotworów, zaburzeń odpornościowych lub chorób wirusowych. Bierze się pod uwagę, że IFN α-n3a może być stosowany w kombinacji z innymi środkami np. metabolitami, środkami alkilującymi, alkaloidami vinca, antybiotykami przeciwnowotworowymi, pochodnymi platyny, podstawionymi mocznikami, adrenokortykosterydami, cytokinami, interleukinami, AZT, ddl, ddC, innymi interferonami, innymi środkami przeciwwirusowymi lub przeciwrakowymi lub przeciwciałami.

Reżim dawkowania związany z podawaniem skutecznej ilości IFN α-n3a w sposobie traktowania wyżej opisanych stanów będzie określony przez prowadzącego lekarza biorąc pod uwagę różne czynniki, które modyfikują działanie leków np. stan, wagę ciała, płeć i dietę pacjenta, ostrość raka, czas podawania i inne czynniki kliniczne. Dawkowanie kompozycji według wynalazku zastosowane do leczenia określonych stanów chorobowych opisanych tutaj może być różne w zależności od danej choroby i stanu choroby. Na przykład, oczekuje się, że dla brodawek kompozycja stosowana będzie w równej, lub mniejszej, dawce IFN α-n3 wynoszącej 0,25 miliona jednostek (MU)/brodawkę. Do leczenia AIDS lub innych chorób wymagających bardziej agresywnego traktowania, odpowiednia dawka może być znacznie mniejsza od 30-36 MU wskazanych dla obecnie zatwierdzonych alfa interferonów. Bardziej szczegółowo, przewiduje się, że dawka dla takich stanów powinna być w zakresie między około 1 miliona jednostek do 15 milionów jednostek.

Dawki na ogół mogą być podawane trzy razy na tydzień. Inne dawkowania i reżimy mogą być określone przez doświadczonego specjalistę.

Poza leczeniem zaburzeń u ssaków opisanych powyżej, kompozycja i sposób jej wytwarzania, według wynalazku mogą być wykorzystane dla celów weterynaryjnych w leczeniu nowotworów, zaburzeń immunologicznych lub chorób wirusowych, które dotykają na przykład konie, świnie, bydło, psy, koty i ptactwo. Zaburzenia te mogą być traktowane ilościami związku, które mogą być stosowane w leczeniu zaburzeń u ssaków opisanych powyżej.

Przykład 1- Sposób wytwarzania IFN α-n3a - indukcja.

Dla przygotowania kożuszka tj. górnej jaśniejszej warstwy skrzepu krwi zawierającego osocze i krwinki białe, pobrano 500 jednostek ludzkiego PBL ze stacji krwiodawstwa zatwierdzonej przez FDA. Następnie komórki czerwonych krwinek poddano lizie traktując chlorkiem amonu (0,83%) według Cantella i wsp. (1981), cytowanego powyżej.

Kożuszek traktowany chlorkiem amonu zawieszono ponownie w 1 x MEM Eagle'a zawierającym sole Earle'a (Gibco 410-1500), L-glutaminę, aminokwasy, 4,46 mg/ml Tricine (Aldrich), pH 7,4,2,2 mg/ml wodorowęglanu sodu (Fisher), 24 mg/ml siarczanu neomycyny

0,4 mg/ml ludzkiej surowicy agamma (NABI).

Leukocyty (107 komórek/ml) zawieszono w 1 x MEM i dodano 20 jedn./ml surowego alfa interferonu jako primera. Surowy alfa interferon jest produktem otrzymywanym w opisanych tutaj etapach indukcji, bez oczyszczania, doprowadzonym za pomocą HCl do pH na pięć dni w celu zdezaktywowania jakichkolwiek przypadkowych czynników lub potencjalnych zanieczyszczeń wirusowych.

Zawiesinę inkubowano w 6 litrowej sterylnej kolbie szklanej. Leukocyty primowano na 3 godziny w temperaturze 36°C, po czym dodano wirus Sendai (szczep Cantella z SPAFAS; Storr, CT) do stężenia końcowego 150 jedn. HA/ml.

Po 1 godzinie inkubowania, aby pozwolić na przyłączenie się wirusa, leukocyty rozcieńczono do 4 x 10⁶ komórek/ml (2,5 krotnie) tym samym środowiskiem zawierającym surowicę agamma, wodorowęglan sodu i primer. Następnie inkubowano przez dodatkowe 15 godzin w temperaturze 36°C. Komórki i substancje odpadowe usunięto następnie przez odwirowanie przy 2.500 obr/min (Beckman model J6-B), po czym oznaczono miana surowego interferonu za pomocą oznaczeń IRMA lub CPE, tak jak opisano powyżej.

Przykład 2 - Sposób wytwarzania IFN α-n3a - oczyszczanie.

Wszystkie etapy oczyszczania, o ile nie zaznaczono inaczej, przeprowadzono w temperaturze 2-8°C.

A. Odbieranie/Zatężanie surowego interferonu.

Po inkubowaniu przez 15-20 godzin, usunięto leukocyty z hodowli indukcyjnych z przykładu 1 przez odwirowanie przy około 2900 x g przez 15-20 minut. Supernatant (surowy roztwór interferonu) zachowano, a leukocyty odrzucono. Jeśli supernatant nie był od razu przerabiany, przechowywano go w sterylizowanych pojemnikach w temperaturze 4°C.

Surowy roztwór interferonu zatężono 50 krotnie, stosując układ filtra z przepływem stycznym o nominalnym odcięciu ciężarów cząsteczkowych 10.000. Zatężony interferon wirowano następnie przy około 9.000 xg przez około 30 minut. Zatężony interferon może być magazynowany w temperaturze -70°C.

B. Oczyszczanie z wykorzystaniem powinowactwa.

1. Przygotowanie kolumn chromatograficznych.

W tej metodzie oczyszczania wykorzystuje się monoklonalne przeciwciało specyficzne wobec ludzkich interferonów alfa, np. NK2 produkowane przez Celltech Limited (Slough, Anglia). Monoklonalne przeciwciało sprzężono z Sepharose 4B aktywowanym CNBr (np. Reselete NK2) i przechowywano w temperaturze 4°C. Wielkość kolumny powinowacyjnej zależy od zdolności wiążącej żelu powinowactwa względem interferonu, który określonyjest dla każdego preparatu. Kolumny sporządzono przez przelanie odpowiedniej ilości żelu Sepharose-przeciwciało do odpowiedniej kolumny szklanej. Kolumnę z monoklonalnym przeciwciałem przemywano roztworem zawierającym 0,1 m kwasu cytrynowego i 0,3 m chlorku sodu o pH 2 w ilości około 5 krotnej objętości kolumny. Następnie zneutralizowano pH kolumny do 7,4 przez przemycie 3 objętościami kolumny solanki buforowanej fosforanem (PBS). Cykl przemywania wstępnego może być powtórzony kilkakrotnie.

2. Przygotowanie stężonego surowego IFN.

Stężony surowy interferon klarowano przez odwirowanie przy około 17.700 x g przez 60 minut i przed wprowadzeniem do kolumny z monoklonalnym przeciwciałem przesączono stosując odpowiednie wkładki filtrów 0,22 lub 0,45 mikrometrowe.

3. Oczyszczanie powinowacyjne.

W przybliżeniu 150 milionów jednostek surowego przesączonego interferonu załadowano na ml powinowacyjnego żelu. Jednostki interferonu oznaczono za pomocą IRMA (Celltech Ltd.). Kolumnę przemyto około 1,5 objętością kolumny roztworem solanki buforowanej fosforanem, a następnie 10 objętościami kolumny 20 mM buforem fosforanowym (pH 7,4) zawierającym 50% (wag/wag) glikolu etylenowego i 1,5 M chlorku sodu. Popłuczyny zebrano z końcowymi 10-30 objętościami kolumny solanki buforowanej fosforanu. Interferon eluowano z kolumny powinowacyjnej roztworem zawierającym 0,1 M kwas cytrynowy i 0,3 M chlorek sodu (pH 2).

176 408

4. Regeneracja kolumny powinowacyjnej.

Kolumnę z monoklonalnym przeciwciałem przemyto 3-5 objętościami kolumny solanki buforowanej fosforanem, aż do obojętnego pH eluatu. Do przechowywania kolumny, kolumnę przemyto 3-5 objętościami solanki buforowanej fosforanu zawierającej 0,1% azydku sodu.

C. Inkubacja kwasowa i neutralizacja.

Roztwór interferonu (około pH 2) wyeluowany z kolumny monoklonalnego powinowactwa inkubowano w temperaturze 4°C przez minimum 5 dni. Ten etap inkubacji kwasowej jest konieczny do dezaktywowania jakichkolwiek potencjalnych przypadkowych czynników, takich jak HIV-1. Po 5 dniowym okresie przechowywania roztwór doprowadzono do pH 7,4 za pomocą 1,0 Tris.HCl (hydroksymetylo-aminometan). Białko interferonu w roztworze zatężono do około 1-3 mg/ml.

D. Filtracja na żelu.

Do chromatografii filtracyjnej na żelu stosowano perełki Superose 12 jakości preparatywnej (Pharmacia, Piscataway, NJ). Zatężony interferon do 5% objętości kolumny załadowano i eluowano solanką buforowaną fosforanem. Wszystkie frakcje stanowiące główny pik zebrano razem aseptycznie. Oczyszczony interferon przesączono stosując 0,2 mikrometrowy lub mniejszy nisko wiążący filtr i przechowywano w temperaturze -70°C.

E. Wyniki.

Wyniki z typowej procedury oczyszczania pokazano w tabeli 2 pokazującej etap oczyszczania, całkowitą objętość i masę białek, całkowitą aktywność, która jest wskazana jako liczba w kolumnie pomnożona przez 10⁹ jednostek, % wydajność według oznaczenia całkowitego jednostek IRMA odzyskanych w każdym etapie, aktywność właściwą (Aktywność właściwa) mierzoną w milionach jednostek (MU)/mg i krotność oczyszczania (Krotność oczyszczania) Aktywność interferonu oznaczono za pomocą immunoradiometrycznej próby [Celltech. Ltd.] z zastosowaniem radioznaczonego NK2 jako wykrywającego przeciwciała.

Tabela 2

Wydajność oczyszczania interferonu w typowym doświadczeniu

Białko	Aktywność interferonu
			Razem
Etap	Objętość	Masa	Całkowita	%	Aktywność	Krotność
oczyszczania	(I)	(mg)	aktywność	wydajność	właściwa (MU/mg)	oczyszczania
Surowy IFN	212,4	8,5x104	4,6	100	0,054	1
Stężenie	5,15	7,1x104	4,5	99	0,064	1
Chromatografia powinowactwa NK2	0,073	9,4	4,0	87	430	7,990
Stężenie neutralizujące	0,0073	7,3	3,4	74	470	8,740
Chromatografia na Superose	0,045	4,8	3,2	70	660	12,200

Przykład 3 - Oznaczenie RP-HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconą fazą).

W przykładzie tym gatunek a interferonu w kompozycji oddzielono według jego względnej hydrofobowości za pomocą RP-HPLC [Janssen i wsp., J. Chromatografie Sci., 22:234 (1984); Stone i wsp., J. Chrom., 359:203 (1986)]. Rozdzielenie uzyskano przez zwiększanie stężenia acetonitrylu. Najmniej hydrofobowe gatunki interferonu eluowały jako wcześniejsze piki, a najbardziej hydrofobowy interferon eluował później.

Typowy profil RP-HPLC otrzymano z wycieku z kolumny półpreparatywnej, jak pokazano na fig. 4 następująco. W przybliżeniu 1-2 mg oczyszczonego interferonu IFN

176 408 α-n3a frakcjonowano na półpreparatywnej kolumnie HPLC z odwróconą fazą Vydac C4 (10 x 250 mm). Stosowany gradient dla półpreparatywnej Gt RP-HPLC pokazano poniżej w tabeli 3. Gradient był liniowy, z następującym buforem: A: 90% H2O/10% ACN/0,1% TFA obj/obj/wag: i B: 90% ACN/10% H₂O/0,1% TFA obj/obj/wag.

Tabela 3

Czas	Szybkość przepływu	%A	%B
początkowy	5,0 ml/min.	95	5
15 min.	5,0 ml/mm.	60	40
59 min.	5,0 ml/min.	50	50
60 min.	5,0 ml/min.	10	90
65 mm.	5,0 ml/min.	10	90
66 min.	5,0 ml/min.	95	5
76 min.	5,0 ml/min.	95	5
79 min.	0,04 ml/min.	95	5

Oczyszczony interferon rozfrakcjonowano na 7 pików, np. piki la, 1b, 2, 3, 4, 5 i 6. Pierwszy pik rozdzielił się na dwa częściowo zachodzące na siebie piki tj. 1a i 1b. Te dwa piki charakteryzowano oddzielnie we wszystkich oznaczeniach. Białka z każdego piku zbierano indywidualnie.

Tabela 4 przedstawia proporcje względne każdego piku z typowym profilem RP-HPLC.

Tabela 4 % obszaru pików interferonu IFN o-n3a z RP-HPLC

pik nr	% całości
la	13
1b	36
2	4
3	15
4	5
5	10
6	17

Jak wskazano powyżej, piki 2 i 4 zawierają małe ilości materiału. Pik 2 nie był dalej oznaczany na skład aminokwasów i zawartość węglowodanu. Pik 4 nie był dalej oznaczany na zawartość aminokwasów po hydrolizie HCl.

Po liofilizacji, interferon z każdego piku był przywrócony do pierwotnej postaci w 25 mmolowym buforze Tris-Cl przy pH 7,0. Materiał przywrócony do pierwotnej postaci zebrano razem odpowiednio ze wszystkich wycieków z kolumny do następnej analizy.

Przykład 4 - Oznaczenia biologiczne.

A. Próba przeciwwirusowa

Oznaczenie przeciwwirusowe przeprowadzono przy użyciu trzech różnych linii komórkowych: 1) komórek ludzkich HEp-2 [ARCC CCL 23], 2) bydlęcych MDBK [ATCC CRL 6071], i 3) króliczych K-13 [ATCC CCL 37]. Interferon był seryjnie 2-krotnie rozcieńczany na płytkach o 96 wgłębieniach, po czym dodano 30.000 komórek na płytkę. Po całonocnej inkubacji, komórki zainfekowano VSV (szczep Indiana ATCC # VR-158), po czym inkubowano przez noc. Działanie cytopatyczne (CPE) sprawdzono mikroskopowo na próbie kontrolnej wirusa, kontrolnej komórki i komórkach, które otrzymały interferon. Komórki zabarwiono kryształem fioletu, gdy wgłębienia zawierające standardowy interferon wykazały właściwe CPE. Dla wszystkich próbek, 50% działania cytopatologicznego zmierzono optycznie, a miano interferonu obliczono przez porównanie z wzorcami laboratoryjnymi, które uprzednio standardyzowano wobec porównawczego standardu interferonu NIH (Ga 23-902-530). Wyniki podano w tabeli 5 poniżej.

176 408

B. Próba przeciwrozrostowa.

Oznaczenie przeciwrozrostowe przeprowadzono na ludzkich komórkach limfoblastoidalnych. Interferony seryjnie 5-krotnie rozcieńczano w 96-wgłębieniowych płytkach (100/zl/wgłębienie), po czym dodano 10⁴ komórek Daudi'ego/płytkę (w 100 μ 1). Po 40 godzinnej inkubacji, komórki zadano 1,5 /zCi/wgłębienie (w 25 μΐ) ³H-tymidyny na 7 godzin. Pobór tymidyny mierzono przez zbieranie i przemycie komórek wodą na filtrze z włókna szklanego, a następnie przez pomiar wprowadzonej radioaktywności przy użyciu licznika scyntylacyjnego. Ponownie miana obliczono i skorygowano wobec wzorców laboratoryjnych.

C. Wyniki prób.

Własności przeciwwirusowe i przeciwrozrostowe niefrakcjonowanego IFN α-n3a i pików z RP-HPLC przedstawiono poniżej w tabeli 5.

Tabela 5

Aktywności właściwe IFN a-n3a pików z RP-HPLC MU/mg IFN

CPE AE

Pik nr	HEp-2	MDBK	RK-13	Daudi
la	252,0	262,9	0,08	86,9
1b	195,6	265,0	0,17	109,4
2	269,8	278,1	0,77	127,5
3	377,3	316,8	7,09	175,7
4	589,9	345,1	2,63	216,4
5	298,6	362,7	1,56	205,5
6	884,1	447,7	0,59	237,9
N iefrakcjonowany IFN α-nSa	502,0	426,7	19?	W

Biologiczną aktywność właściwą przedstawiono jako liczbę jednostek biologicznych na mg wszystkich obecnych białek. Dane w tabeli 5 pokazują, że aktywności właściwe CPE komórek ludzkich HEp-2 i bydlęcych MDBK są podobne w każdym piku. Przeciwrozrostowa aktywność właściwa wobec komórek Daudi’ego jest w przybliżeniu 2 krotnie mniejsza od aktywności przeciwwirusowych w każdym piku. Gdy interferon oznaczano na komórkach nerkowych królika (RK-13), wykryto niewielką aktywność CPE. Aktywność właściwa jest co najmniej 100 do 1000 krotnie niższa niż wobec komórek ludzkich lub bydlęcych. Interesujące jest to, że interferon z piku 3 ma najwyższą aktywność właściwą wobec komórek RK-13.

Dane przedstawione w tabeli 5 pokazując również, że wcześniej eluujące piki, takie jak piki 1a i 1b zawierały niższe aktywności właściwe wobec HEp-2, MDBK i komórek Daudi’ego. Gdy w tej próbie badano piki 1 (a i b) stanowił on tylko 25% całkowitej aktywności przeciwwirusowej kompozycji IFN α-n3a. Później eluujący pik 6 zawiera najwyższe aktywności właściwe. W rzeczywistości, gdy wykreśli się aktywność właściwą w zależności od % acetonitrylu w gradiencie elucji (patrz fig. 5). widzi się bezpośrednią korelację między wzrostem aktywności właściwej, a względnym zwiększeniem hydrofobowości białka alfa interferonu. Im bardziej hydrofobowy jest interferon, tym ma wyższą aktywność właściwą. Może rozważać, że bardziej hydrofobowe podgatunki interferonu mogą wiązać receptor(y) interferonu o wyższym powinowactwie lub inicjować zderzenia komórkowe bardziej skutecznie, a zatem wykazywać wyższą aktywność właściwą.

Przykład 5 - Własności fizyczne IFN «-n3a.

Białka interferonu z siedmiu pików frakcjonowanych na HPLC z odwróconą fazą charakteryzowano za pomocą SDS-PAGE.

A. Jednowymiarowy SDS-PAGE.

1. Sposób.

Analizę jednowymiarowej elektroforezy na żelu SDS poliakryloamidowym (SDS-PAGE) przeprowadzono przy użyciu procedury podobnej do opisanej przez Laemmli'ego,

176 408

Nature, 277:680 (1970). IFN <2-n3a analizowano w 14,.5% SDS-PAGE zarówno w warunkach redukujących jak i nieredukujących. Pasma białek uwidaczniano metodą Coomassie 'go barwienia na niebiesko. Plamka Westema podwojonego żelu SDS była immunobarwiona mysim monoklonalnym przeciwciałem LIT-1 specyficznym wobec ludzkiego IFN alfa i wywoływana jak opisano [Towbin i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 26:4350 (1979); i Haid i wsp. Meth. Enzymol.. 96:192 1983)].

2. Wyniki.

Dane dla profili nieredukującego i redukującego SDS-PAGE zestawiono poniżej w tabelach 6 i 7, odpowiednio. Ponadto na fig. 6 i 7 pokazano profile barwionych na niebiesko SDS-PAGE metodą Coomassie'go w warunkach redukujących i nieredukujących, odpowiednio.

Tabela 6

SDS-PAGE (Nieredukujące)

Względne ciężary cząsteczkowe i procenty obszaru % obszaru względnego

Ciężar cząsteczkowy	Niefrakqonowany IFN	Piki interferonu z RP-HPLC
(KD)		la	1b	2	3	4	5	6
19,3	17,1	-	-	17,8	-	36,5	1,6	29,8
19,0	27,4	-	-	-	-	-	1,2	70,2
18,5	26,3	93,8	93,1	-	-	-	-	-
18,0	6,5	6,2	4,8	-	-	-	-	-
17,8	-	-	2,1	18,3	17,1	52,0	21,0	-
17,7	19,2	-	-	-	82,9	-	-	-
17,5	3,4	-	-	57,2	-	11,6	76,2	-
17,2	-	-	-	6,8	-	-	-	-

Tabela 7

SDS-PAGE (Redukujące)

Względne ciężary cząsteczkowe i procenty obszaru % obszaru względnego

Ciężar cząsteczkowy	Niefrakcjonowany IFN	Piki interferonu z RP-HPLC
(KD)		la	1b	2	3	4	5	6
27,7	-	-	-	-	-	-	2,3	-
27,5	-	-	-	0,9	-	-	-	-
27,0	23,8	-	-	-	-	34,3	-	100,0
22,3	-	-	-	-	16,8	-	-	-
21,7	58,1	-	-	-	83,2	17,6	-	-
21,5	-	92,4	80,8	73,4	-	-	40,8	-
20,8	9,4	7,6	13,2	-	-	41,7	-	-
20,0	4,1	-	2,8	-	-	6,4	56,9	-
19,4	1,3	-	3,2	-	-	-	-	-
19,0	1,5	-	-	-	-	-	-	-
18,6	1,7	-	-	22,4	-	-	-	-
13,0	-	-	-	3,3	-	-	-	-

Dane z tabel 6 i 7 wykazują heterogeniczność (tj. istnienie więcej niż jednego pasma białka) w większości pików. Jedynie w warunkach redukujących pik 6 okazuje się zawierać pojedyncze pasmo białka tą metodą. Piki 1a i 1b zawierają białka o podobnych ciężarach cząsteczkowych zarówno w warunkach redukujących jak i nieredukujących. Te dwa piki 1a i 1b zawierają również ten sam główny gatunek interferonu tj. IFN-α2b, jak wykazano za pomocą cząstkowego sekwencjonowania aminokwasu.

176 408

Względną liczbę pasm białek interferonu w każdym piku oznaczono za pomocą densytometru laserowej. Względne ciężary cząsteczkowe obliczono przez porównanie z markerami ciężaru cząsteczkowego.

Wyniki z analiz plamek Westerna przedstawiono na fig. 8 i 9 w warunkach nieredukujących i redukujących, odpowiednio. Dane pokazują, że każde pasmo białka wykrywalne za pomocą barwienia na niebiesko Commassie'go było rozpoznawane przez monoklonalne przeciwciało LIT-1. Pokazuje to, że wszystkie pasma białek w każdym piku identyfikowane są jako ludzkie interferony alfa. Poziom zanieczyszczenia niefrakcjonowanego interferonu wynosił w przybliżeniu 1%. Po frakcjonowaniu na RP-HPLC ten niski poziom zanieczyszczeń był niewykrywalny w żadnym z pików.

Charakteryzację kontynuowano za pomocą dwuwymiarowej analizy na żelu.

B. Dwuwymiarowa SDS-PAGE.

1. Sposoby.

Dwuwymiarowa elektroforeza na żelu obejmuje ogniskowanie izoelektryczne w pierwszym wymiarze i SDS-PAGE w drugim wymiarze. Dla pierwszej analizy wymiarowej, 5-10 mg interferonu z każdego piku RP-HPLC naniesiono na żel akryloamid/mocznik odlewany w szklanej rurze (2 x 180 mm). Żel w rurze poddano stałemu napięciu 400 voltów przez 16 godzin, a następnie 800 voltów przez 1 godzinę. Do analizy izoelektrycznego ogniskowania stosowano amfoliny (Millipore) o pH w zakresie między 3 i 10. Rurowy żel wypchano z rury szklanej, zrównoważono buforem w próbce SDS i rozwarstwiono na płycie 15% żelu SDS-poliakrylamid do drugiej analizy wymiarowej. SDS-PAGE wprowadzono do buforu Tris/glicyna o pH 8,3 przy stałym prądzie 35 mA. Białka w żelach 2-D wizualizowano przez barwienie srebrem. Białko interferonu identyfikowano za pomocą immunobarwienia monoklonalnym przeciwciałem LIT-1.

2. Wyniki.

Wyniki analiz dwuwymiarowych żelu dla niefrakcjonowanego IFN α-n3a, jak również białka w każdym z pików z RP-HPLC pokazują, że dla wszystkich próbek wykryto wiele plamek. Niefrakcjonowany IFN α-n3a ma w przybliżeniu 30 plamek w analizie 2-D na żelu. Wszystkie plamki były rozpoznane przez monoklonalne przeciwciało LIT-1, wskazując, że są one rzeczywiście białkami interferonu. Liczbę plamek i ciężarów cząsteczkowych białek w każdym z pików zestawiono w tabeli 8 poniżej. Punkty izoelektryczne dla wszystkich białek interferonu w IFN α-n3a znajdują się w zakresie pi 5,0 do 7,5.

Tabela 8

Analiza profili na żelu 2-D

Pik nr	Liczba plamek	Ciężar cząsteczkowy (Kdal)
** IFN	30-35	17,7 - 27,8
la	8-10	20,6 - 22,8
1b	8-11	18,9 - 22,8
2	3-4	22,8
3	4-5	21,9 - 22,8
4	6-9	21,9 - 27,8
5	5-7	21,9 - 22,8
6	1(plama)	27,8

Barwiony srebrem i immunobarwiony N iefrakcj onowany

Profile z żelu 2-D dla pików la i 1b okazują się bardzo podobne. Jest mała różnica wielkości cząsteczek i ładunku. Mogą one eluować oddzielnie na RP-HPLC z uwagi na niektóre modyfikacje białek nie związane z ładunkami. Gele 2-D dla reszty pików znacznie różnią się od siebie. Profil każdego piku ma swoją własną charakterystykę. Wiele plamek obecnych w każdym piku wskazuje na heterogeniczną populację białek. Ta heterogeniczność może wynikać z różnic w translacyjnych i/lub post-translacyjnych modyfikacjach białek.

Przykład 6 - Biochemiczne własności IFN α-n3a.

A. Skład aminokwasów.

Białko interferonowe hydrolizowano w 6n HCl w temperaturze 104°C przez 24 godziny w bloku grzewczym Pico-Tag. Hydrolizaty suszono pod próżnią i przekształcono w pochodne z 10% fenyloizocyjjinianem (PITC) w roztworze 70% etanolu, 10% wody i 10% trietyloaminy. Otrzymany fenylocyjanian aminokwasów (PTC) oddzielono przy użyciu kolumny C18 HPLC Pico-Tag. Elucję PTC-aminokwasów prowadzono w liniowym gradiencie 0-60% acetonitrylu w wodzie zawierającej 140 mmola octanu sodu (pH 6,4) i 0,05% trietyloaminy. Absorbancję PTC aminokwasów mierzono przy 269 nm. Dane absorbancji z każdej analizy przekształcano numerycznie i przechowywano w mikrokomputerze. Reszty aminokwasów, cystyna i tiyptofan nie uległy modyfikacji przez PITC w tej reakcji, a zatem nie dały sygnału. Dane następnie analizowano na identyfikację aminokwasów i ich oznaczenie ilościowe przy użyciu oprogramowania Water's Expert package.

Wyniki z analizy składu aminokwasów dla alfa interferonu i indywidualnych pików RP-HPLC przedstawiono w tabeli 9. Tabela 9 pokazuje, że ogólnie składy aminokwasów z indywidualnych pików podobne do interferonu niefrakcjonowanego i do gatunku rozpoznawanego przez monoklonowe przeciwciało NK-2. Gdy skład każdego piku porówna się ze składem teoretycznym specyficznych podgatunków identyfikowanych przez sekwencjonowanie N-terminalne, istnieje zgodność ± 1 reszty. Dane te silnie popierają identyczność głównych podgatunków oznaczonych przez sekwencjonowanie N-terminalne.

176 408

Skład Aminokwasów z IFN a-n3a oraz piki RP-HPLC

'o Z U.

2lb

cn

Os CM

Ό

cn

O

00

Os

Vł

cn

00

sr

Os

Os

Z

o

CM

α pj

<n

Os CM

χρ

Vł

cn

O

oo

Os

sn

cn

00

sn

Os

OO

2

2

CM

Ό β Z u.

Ό a

SO CM

tn

^P

•sr

sn

00

00

V

sn

Os

so

'sr

so

o CM

Os

oo

cn

Podgatnnki Alfa Interferonu

Ρ» ΰ z u.

u

CM

Os CM

cn

^p

CM

OS

Os

sn

V

p*

•V

00

Os

CM

Os

CM

-O r·

CM

O <n

cn W«4

cn

cn

00

Os

sn

p*

sn

^p

00

Os

CM

00

CM

Λ r*

CM

Os CM

cn

*<r

•’Τ

CM

oo

Os

sn

P*

sn

00

Os

CM

Os

CM

p» *3 Z LL

-o r·

Os CM

cn

sn

cn

«4

OS

Os

so

sf

Ό

sn

^p

00

CM

Os

00

CM

u c*·

*r

Os CM

sn

cn

-

Os

Os

sn

P

SO

sn

ST

00

CM

Os

00

CM

-O p*

Os CM

^p

sn

cn

o

Os

Os

sn

V

sO

sn

p

Os

CM

Os

00

CM

w p*

Os CM

’Ρ

sn

CM

o

Os

Os

Ό

MP

SO

sn

'sr

Os

CM

Os

00

CM

^p ¢3 Z LL

A V

<n

00 CM

Tp

sn

sn

Os

Os

-'t

P

00

O-

•sp

00

O CM

O

co

CM

Λ

tn

OS CM

•^p

«η

sn

M

00

O W4

*sr

P*

rp

P

00

O CM

O

00

CM

o *0 2 u.

A O

•Μ-

Os CM

cn

sn

cn

cn

00

Os

sn

^p

r*

''P

•V

w*

Os

Os

P*

CM

Λ O

•«M

Os CM

V)

cn

cn

r*

OS

sn

’Τ

r*

P

o

o C<

Os

r-

CM

o 00

Ό

r- CM

sn

rł

cn

Os

so

Os

V

sn

r*

sn

P

o

PM

O

co

-

0 2 u.

JO 00

m

00 <M

so

es

cn

o

SO

Os

^p

sn

r*

sn

P

o

a

O

O

«·

<« 00

\o

00 CM

«Π w*

<S

cn

o

SO

Os

sr

sn

t*

sp

p

o «4

s

O

o

-

cm a Z u-

o CM

Oj

SO CM

^p

sn

ts

-

w* w·

00

sn

sn

c*

sn

P

00

CM

o

o

ts

A CM

cj

so CM

sn

cn

o

00

sn

sn

P*

sn

P

00

•4 cs

o

o

CM

«0 CM

CM

Ό CM

Tp

ΜΊ

cn

Os

-

00

sn

*n

P*

sn

P

oo

CM

o

CM

1 N 03 P4

ta Ami- ||

3 Λ 3 □ rf

X ot <

X 5

u t) co

>> 5

Vł Z

00 u <

u {S

<9 <

ε α.

w H

*3 >

** o 2

«1 ►» U

ja

3 J3

O -C CU

Irt X

e· H

I £_j O S 'z, W ,2 a

<s

cn

•φ

sn

Ό

p*

00

Os

o

-

PM

cn

p

sn

so

r*

00

176 408

Tabela 9 (a)

Skład Aminokwasów z IFN Q-n3a oraz piki RP-HPLC

Numer kolumny	Niefrakcjonowany IFN «-n3a	Piki RP-HPLC
la	1b	2	3	4	5	6
1	12	11.6	10.3	NA	13.4	13.7	7.7	14.8
2	25.2	23.5	22.1	NA	27.8	23.9	24.2	27.8
3	14.1	14.7	14.7	NA	13.0	14.6	15.4	14.2
4	4.7	5.5	5.7	NA	5.3	4.2	ND	2.5
5	2.8	3.1	2.6	NA	2.7	2.8	3.0	3.0
6	10.4	10.4	10.6	NA	11.9	11.0	11.3	10.2
7	8.9	10.7	10.7	NA	6.3	6.8	8.9	5.6
8	9.3	8.8	8.7	NA	8.7	8.5	9.7	9.0
9	9.1	4.9	6.0	NA	8.3	ND	4.5	5,0
10	4.4	5.0	5.8	NA	4.0	4.0	5.1	5.4
11	6.0	6.1	6.2	NA	5.4	5.4	5.5	5.4
12	4.8	5.4	5.5	NA	3.9	5.0	5.4	5.2
13	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
14	7.6	7.7	8.7	NA	8.4	7.8	9.8	9.5
15	19.5	16.8	16.8	NA	20.3	23.8	18.3	17.7
16	9.6	10.7	11.0	NA	9.2	10.4	12.1	10.4
17	9.1	11.0	11.1	NA	7.3	9.2	9.9	10.4
18	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND

B. N-terminalna sekwencja aminokwasu.

Procedury stosowane do analizy N-terminalnej sekwencji aminokwasu są podobne do opisanych uprzednio. [Edman, Acta Chem. Scant. 4:283 (1950); Edman i wsp. Eur. J. Biochem. 1:80 (1967)].

Dla każdego piku RP-HPLC załadowano w przybliżeniu 500 pmoli białka na uprzednio przygotowany do cyklu filtr i sekwencjonowano przez 30-35 cykli. Sekwencjonowanie przeprowadzono na urządzeniu do sekwencjonowania Applied Biosystems ABI-470A wyposażonym w hydantoinowy analizator aminokwasów do bezpośredniego oznaczania. Procedura sekwencjonowania w tym instrumencie bazuje na degradacji Edmana.

N-terminalne sekwencjonowanie bazujące na degradacji Edmana jest bardzo skuteczne przy identyfikowaniu i ilościowym oznaczaniu reszt o stosunkowo krótkich sekwencjach peptydowych (tj. < 20). Jednak dla długich sekwencji (tj. >30) identyfikacja reszt bliższych końcowi C białka lub polipeptydu staje się niejednoznaczna. Ta zwiększona niejednoznaczność wynika z powtarzającego się plonowania, które jest ogólnie mniejsze od 95%, a zatem prowadzi do komulującej się straty sygnału dla każdego dodatkowego cyklu.

Z tego powodu, piki białek 1a i 1b zostały odszczepione przez hydrolizę przy reszcie metioniny przy użyciu CNBr w porządku potwierdzającym, że są to podgatunki. Odszczepianie przeprowadza się najpierw przez rozpuszczenie białka alfa interferonu w 70% kwasie mrówkowym, a następnie dodanie CNBr do stężenia 1 m i inkubowanie w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Reakcję odszczepienia kończy się przez liofilizację w urządzeniu speed-vac, usuwając tym sposobem z rury reakcyjnej wszystkie rozpuszczalniki łącznie z CNBr. Wysuszone fragmenty CNBr rozpuszczono w 10% TFA i wstrzyknięto do kolumny C18 (0,2 x 25 cm, Phenomenex). Elucję fragmentów przeprowadzono stosując wielostopniowy' gradient 0,1% TFA/H₂O (rozpuszczalnik A) i 0,1% TFA/acetonitryl (rozpuszczalnik B) przy szybkości przepływu 0,2 ml/min. Wielostopniowe gradienty liniowe stosowano jak następuje: 1) 0% do 40% rozpuszczalnika B przez 60 minut, 2) 40% do 60% rozpuszczalnika B przez 50 minut,

3) 60% do 100% rozpuszczalnika B przez 13 minut i 4) stały 100% rozpuszczalnik B przez

176 408 następne 5 minut. Wykrywanie eluujących fragmentów prowadzono przez monitorowanie absorbancji przy 214 nm. Rozdzielone fragmenty sekwencjonowano jak wskazano powyżej.

W wyniku tego rozszczepiania uzyskano sześć fragmentów, które rozdzielono za pomocą RP-HPLC. Pik eluujący w 75-80 minucie sekwencjonowano i stwierdzono, że zawiera dwie sekwencje. Jedna sekwencja mogła być uszeregowana z sekwencją fragmentu CNBr #2 złożonego z aminokwasów od pozycji 22 do pozycji 59 IFN-α2b; podczas gdy druga sekwencja uszeregowana jest zgodnie z fragmentem CNBr #5 złożonym z aminokwasów od pozycji 112 do pozycji 148 IFN-α 2b.

3. Wyniki.

N-terminalne sekwencje niefrakcjonowanego IFN α-nSa i frakcjonowane piki RPHPLC przedstawiono w tabeli 10. Wyniki pokazują, że niefrakcjonowany alfa interferon jak również indywidualne piki zawierają wiele sekwencji. Wszystkie te sekwencje identyfikowane są jako gatunek ludzkiego interferonu. Główne sekwencje w każdym piku w tabeli 11.

Tabela 10

N-terminalne sekwencje IFN «-n3a i piki RP-HPLC

Cykl nr	IFN »-n3a	Pik la	Pik 1b	Pik 2	Pik 3
1	2	3	4	5	6
1	ND* (Cys)	ND	ND	ND	ND
2	Asp	Asp	Asp	Asp	Asp
3	Leu	Leu	Leu	Leu	Leu
4	Pro	Pro	Pro	Pro	Pro
5	Gln	Gln	Gln	Gln	Gln
6	Thr	Thr	Thr	Thr	Thr
7	His	His	His	His	His
8	Ser	Ser	Ser	Ser	Ser
9	Leu	Leu	Leu	Leu	Leu
10	Gly	Gly	Gly	Gly	Gly
11	Asn, Ser	Ser	Ser	Asn, Ser	Asn
12	Arg	Arg	Arg	Arg	Arg
13	Arg	Arg	Arg	Arg	Arg
14	Ala, Thr	Thr	Thr	Ala	Ala
15	Leu	Leu	Leu	Leu	Leu
16	Ile, Met	Met	Met	Ile	Ile
17	Leu	Leu	Leu	Leu	Leu
18	Leu	Leu	Leu	Leu	Leu
19	Ala, Gly	Ala	Ala	Ala	Gly
20	Gln	Gln	Gln	Gln	Gln
21	Met	Met	Met	Met	Met
22	Arg, Gly	Arg	Arg	Gly, Arg	Gly
23	Arg	Arg	Arg	Arg	Arg
24	De	Ile	Ile	Ile	ND
25	Ser	Ser	ND	Ser	ND
26	Pro	Leu	Leu	His	ND
27	Phe, Pro	Pro	Pro	Phe	ND
28	Ser	ND	Ser	Ser	ND
29	ND (Cys)	ND	ND	ND	ND
30	ND	Leu	Leu	Leu	ND
31	ND	ND	Lys	ND	ND

176 408

Tabela 10 - ciąg dalszy

1	2	3	4	5	6
32	Asp	Asp	Asp	Asp	ND
33	Arg	Arg	Arg	Arg	ND
34	His	His	His	His	ND
SEKWENCJA ID NO:	5	6	7	8	9

ND = nieoznaczone

Tabela 10 (a)

N-terminalne sekwencje IFN «-n3a i piki RP-HPLC

1	ND*	ND	ND
2	Asp	Asp	Asp
3	Leu	Leu	Leu
4	Pro	Pro	Pro
5	Gln	Gln	Gln
6	Thr	Thr	Thr
7	His	His	His
8	Ser	Ser	Ser
9	Leu	Leu	Leu
10	Gly	Gly, Arg	Gly
11	Asn	Asn	Asn
12	Arg	Arg	Arg
13	Arg	Arg	Arg
14	Ala	Ala	Ala
15	Leu	Leu	Leu
16	Ile	Ile	Ile
17	Leu	Leu	Leu
18	Leu	Leu	Leu
19	Ala	Ala	Ala
20	Gln	Gln	Gln
21	Met	Met	Met
22	Arg, Gly	Gly	Arg
23	Arg	Arg	Arg
24	Ile	Ile	Ile
25	Ser	Ser	Ser
26	Pro	Pro	Pro
27	Phe	Phe	Phe
28	Ser	Ser	Ser
29	ND	ND	ND
30	Leu	Leu	Leu
31	Lys	ND	Lys
32	Asp	Asp	Asp
33	Arg	Arg	Arg
34	His	His	His
SEKWENCJA ID NO.	10	11	12

T

ND = nieoznaczone

176 408

Tabela 11

Główne gatunki interferonu w oparciu o N-terminalne sekwencjonowame

Pik nr	Główne podgatunki IFN
la	<x2(b/c)
1b	o2(b/c)
2	«4(a/b); α16
3	«l0a
4	«8(a/b/c); «21(a/b); «17(a/b/c/d)
5	«17(a/b/c/d); «21(a/b); «7(a/b/c)
6	«8(a/b/c)

Istnieje w sumie 18 potencjalnych podgatunków w IFN α-π3ίΐ według oznaczenia sekwencjonowaniem N-terminalnym. Sekwencje te składają się z podgatunków interferonu rozpoznawanych przez monoklonalne przeciwciało NK2jak zostało opisane przez Celltech, Ltd. IFN-α 2b i α 8 (a/b/c) są głównymi sekwencjami oznaczonymi w interferonie alfa-n3a. Stwierdzono, że IFN-α 2b obecne jest przede wszystkim w pikach 1a i 1b i w mniejszych ilościach w piku 2. IFN-α 2c znajdowanyjest w śladowych ilościach w piku la. IFN-α 8(a/b/c) znajdowany jest przede wszystkim w pikach 4 i 6.

Innymi podgatunkami interferonu obecnymi w mniejszych ilościach są α 4(a/b) i/lub a 16, które są znajdowane w piku 2. Podgatunek o10a znajdowany jest w piku 3. Podgatunek α 16 znajdowany jest w śladowych ilościach w piku 2. Podgatunki ff17(a/b/c) i α 21(a/b) znajdowane są przede wszystkim w piku 5 i w śladowych ilościach w piku 4. Podgatunki α 7(a/b/c) znajdowane są przede wszystkim w piku 5. Ponieważ analiza sekwencyjna była prowadzona do 30-35 cykli, trudno jest wyróżnić niektóre podgatunki, które mają sekwencyjną identyczność z cyklami 30-35. Podane N-terminalne sekwencje wszystkich podgatunków ludzkiego interferonu alfa wykazują, że α 21(a/b) i «17(a/b/c/d) mają podobne sekwencje N-terminalne (aż do aminokwasu pozycji 33); tak samo .α4(a/b) i α 16 (aż do aminokwasu pozycji 33); oraz α 2b w porównaniu z α2α Zatem, nie można wykluczyć niektórych podgatunków występujących w mniejszej ilości z uwagi na ograniczenia analizy.

Mniejsze różnice, które mogą istnieć w sekwencji aminokwasu indywidualnych białek interferonu mogą wynikać z różnic gatunków białka alfa interferonu, lub genetycznego allelizmu. Ten ostatni może wynikać z podobieństwa wyglądu białka z modyfikacją aminokwasu w pojedynczym miejscu.

Produkt dalej oznaczano, ażeby ustalić, które z podgatunków IFN-α 2 obecne są w produkcie interferonowym. Poprzednio donoszono o trzech podgatunkach IFN-α 2: IFN-α2a, IFN-α2b i IFN-rHc. Różnice w N-terminalnej sekwencji dla tych trzech podgatunków FN-α 2 znajdujące się w cyklach 23 i 34 są zilustrowane w tabeli 12.

Tabela 12

Różnica w sekwencji podgatunku IFN-«2

Cykl	o2a	o2b	α2ο
23	Lys	Arg	Arg
34	His	His	Arg

Dane sekwencjonowania zarówno nietkniętego białka jak i CNBr fragmentu #2 dla pików 1a i 1b aż do 35 cykli (tabela 9 powyżej) pokazują, że IFN-α2b jest głównym składnikiem obecnym w pikach 1a i 1b RP-HPLC. Uwolnionymi aminokwasami PTH w cyklach 23 i 34, zgodnie z oczekiwaną sekwencją dla IFN-α 2b, są arginina (Arg) i histydyna (His), odpowiednio. Nie ma znaczącego uwalniania lizyny (Lys) w cyklu 23, co wskazuje, że IFN-α 2a nie jest obecny w pikach 1a i 1b lub w dowolnym innym piku z RP-HPLC dla IFN α-n3a.

Wyniki te zostały zweryfikowane przez odwzorowanie peptydowe i N-terminalne sekwencjonowanie peptydów uwodnionych po odszczepieniu CNBr. Ponadto, dla wykrycia IFN-α 2c, fragment CNBr na przestrzeni od Arg w pozycji 22 do Met w pozycji 60 wyodręb28

176 408 niono i rozszczepiono trypsyną. Peptydy trypsynowe rozdzielono za pomocą RP-HPLC i sekwencjonowano. Oznaczenie ilościowe tych sekwencji wykazało, że więcej niż 90% IFN-α2 w IFN α-n3a jest IFN-r^b. IFN-«2c może być obecne w preparacie, ale jego stężenie znajduje się poniżej pewności wykrycia.

C. Zawartość węglowodanów.

Próbkę białka interferonu (150 μ g) dializowano 2 logs wobec 0,1 m kwasu octowego i zredukowano jego objętość do około 300 ml. Zatężoną próbkę podzielono na trzy równe części i odparowano do sucha. Próbki te następnie hydrolizowano w 1) 2 m kwasie trifluorooctowym (TFA) w temperaturze 100°C przez 4 godziny dla oznaczenia cukru obojętnego, 2) 6 n HC1 w temperaturze 100°C przez 4 godziny dla oznaczenia aminocukrów, lub 3) 0,1 n HCl w temperaturze 80°C przez 1 godzinę dla oznaczenia kwasu sialowego. Hydrolizaty odparowano do sucha i pozostałość rozprowadzono w 170 /d wody jakości HPLC i ogrzewano krótko w temperaturze 80-100°C w celu ułatwienia rozpuszczenia.

Monosacharydy tj. węglowodanowe standardy zawierające 2,5 μ g/ml glukozy, galaktozy, glukozaminy, galaktozoaminy, fruktozy i mannozy sporządzono w wodzie jakości HPLC. Do rozdzielenia monosacharydów stosowano układ Dionex HPLC wyposażony w anionowymienną kolumnę CarboPac PA1. Urządzenie Pulsed Amperometric Detector skalibrowano 19 mmolowym NaOH przy szybkości przepływu 1 ml/min i następnie stabilizatorem po kolumnie (0,5 m NaOH) przy szybkości przepływu 0,5 ml/min przez 2 godziny. 90 /il standardu lub próbkiwstrzykiwano za pomocą automatycznego injektora i eluowano cukry w warunkach izokratycznych 19 mmolowym NaOH.

Standard kwasu sialowego o stężeniu 2,5 /zg/ml sporządzono w wodzie jakości HPLC. Kwas sialowy eluowano w tym samym układzie co wymieniony powyżej Dionex. Urządzenie Pulsed Amperometric Detector skalibrowano przy użyciu 250 mM NaOH. 90 /d standardu lub próbki hydrolizatu wstrzyknięto i eluowano w warunkach izokratycznych 250 mM NaOH.

Zawartość węglowodanu obliczono jako stosunek molowy cukru do moli białka interferonu. Dane z analizy węglowodanów aminocukrów, cukrów obojętnych i kwasów sialowych przedstawiono w tabeli 13.

Tabela 13

Zawartość węglowodanu i kwasu sialowego w IFN «-n3a oraz pikach RP-HPLC

Piki	Ga1N	GlcN	Gal	Glc	Man	Sial	Razem
Niefrakcjonowany IFN	0,39	0,31	0,48	0,65	0,20	0,61	2,64
la	0,49	0,67	1,51	0,36	0,00	0,33	3,36
1b	0,41	0,34	1,15	0,35	0,07	0,44	3,26
2	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA
3	0,33	0,00	0,37	1,22	0,00	0,00	1,92
4	0,00*	0,05	0,84	2,03	0,00	0,00	2,92
5	0,27	0,17	0,29	0,68	0,00	0,00	1,41
6	0,08	0,00	0,34	0,41	0,00	0,00	0,83

* NA = nie dostępny dla analizy * Oznaczony za pomocą próbki hydrolizowanej TFA

Niefrakcjonowany IFN α-n3a jak również wszystkie indywidualne piki zawierają węglowodany w zakresie 1-3 moli cukru na mol interferonu. Piki 1a i 1b, zawierają większość węglowodanu w porównaniu z później eluującymi pikami. Pik 6, tj.IFN-α 8(a/b/c) zawiera najmniejsze ilości węglowodoru. Nie ma wykrywalnych ilości mannozy lub kwasu sialowego w ostatnich pikach 3 do 6. To zjawisko jest nieodłącznie związane z hydrofobowością białek. Niższa zawartość węglowodanu w białku powoduje wyższą hydrofobowość i tym sposobem białko jest eluowane później. Białka w piku 2 nie były analizowane z uwagi na brak materiału w tym piku.

W innej próbie dla oznaczenia miejsca glikozylowania, około 100 /ig białka z pików 1a i 1b zdenaturalizowano, zredukowano i alkilowano. Następnie białko poddano trawieniu

176 408 endopeptydazą kwasu glutaminowego (V8) w stosunku 1:100 (E:S). Otrzymane fragmenty V8 rozdzielono za pomocą HPLC i odebrano frakcje. Frakcje hydrolizowano w celu uwolnienia węglowodanów i poddano analizie na węglowodany. Stwierdzono, że frakcje 52-53 zawierają większość węglowodanów. Następnie te dwie frakcje sekwencjonowano N-terminalnie.

Sekwencją była sekwencja peptydu IFN-α 2 z sekwencją N-terminalnego regionu od pozycji 97 do około 109 AXViQGvGVXETP [SEQ ID nr 1], w której pierwsze X jest prawdopodobnie C, a drugie X prawdopodobnie T. Peptyd ten jest tworzony przez cięcie V8 przy E96 IFN-α 2b. Brak sygnału T przy pozycji 106, podczas gdy T w pozycji 108 jest wyraźnie wykrywany, wykazuje, że T w pozycji 106 musi być modyfikowane przez 0-przyłączone węglowodany. Tak więc, treonina 106 jest oznaczona jako miejsce glikozylowania dla IFN a2 (b/c).

D. Sekwencjonowanie aminokwasów przy końcu karboksylowym.

Piki 1a i 1b analizowano za pomocą metody sekwencjonowania dla karboksylowego końca białek przy użyciu karboksypeptydazy P. Karboksype-ptydaza P hydrolizuje aminokwasy szybciej i prawie nie ma preferencji dla jakiegoś określonego aminokwasu. Interferony z pików 2-6 nie były analizowane z uwagi na brak materiału.

Próbkę białka (10-30 /zg) dializowano wobec 50 mmolowego octanu sodu przy pH 5,5. Karboksypeptydazę P dodano w stosunku molowym enzym: białko wynoszącym 1:100 (wag/wag). Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C i pobierano części po 0, 5,1, 2, 5,10 i 60 minutach. Każde trawienie i analizę powtórzono co najmniej dwukrotnie.

Uwolnione aminokwasy po każdym punkcie czasowym przekształcono w pochodne z O-ftalaldehydem (OPA) w 2% SDS/0,4 m boranem litu na 30 sekund. Przekształcone w pochodne aminokwasy rozdzielono na kolumnie C18 Pico-Tag z odwróconą fazą stosując gradient metanolu w buforze octan sodu/tetrahydrofuran/ woda. Identyfikację i oznaczenie ilościowe uwolnionych aminokwasów przeprowadzono przez porównanie z profilem HPLC standardowych aminokwasów przekształconych w pochodne OPA.

Wyniki z analizy C-terminalnego sekwencjonowania IFN α-n3a, piki z RP-HPLC i podgatunki interferonu zestawiono w tabeli 14.

Tabela 14

C-Terminalne sekwenq'e gatunku alfa-interferonu, IFN <2-n3a i pików z RP-HPLC

Podtypy IFN-α	Cykle
-5 Leu	-4 Arg	-3	-2	-1
Konsensus [SEKW. ID Nr: 13]	Arg	Lys	Asp
«2(b/c) [SEKW. ID Nr: 14]	Leu	Arg	Ser	Lys	Glu
α8(ΗΜο) [SEKW. ID Nr: 15]	Leu	Lys	Ser	Lys	Glu
«4(a/b) [SEKW. ID Nr: 16]	Leu	Arg	Arg	Lys	Asp
a10a [SEKW. ID Nr: 17]	Leu	Arg	Arg	Lys	Asp
O21(A/B) [SEKW. ID Nr: 18]	Leu	Arg	Arg	Lys	Glu
«7(a/b/c) [SEKW. ID Nr: 19]	Leu	Arg	Arg	Lys	Asp
IFN «-n3a [SEKW. ID Nr: 20]	Leu	Arg	Ser (Arg)	Lys	Glu
Pik 1a [SEKW. ID Nr: 21]	Leu	Arg	Ser	Lys	Glu
Pik 1b [SEKW. ID Nr: 22]	Leu	Arg	Ser	Lys	Glu

176 408

Sekwencję identyfikowano na podstawie porządku pojawiania się i poziomej części wykresu reszt indywidualnego aminokwasu. Na przykład pojawienie się i część pozioma wykresu kwasu glutaminowego są wcześniejsze niż innych reszt, a zatem oznaczanyjestjako pierwsza reszta od końca C. Sekwencje innych cykli oznaczono stosując podobną zasadę. W przypadku niefrakcjonowanego alfa interferonu, główną C-terminalna sekwencję oznaczono jako Leu-Arg-(Ser/Arg)-Lys-Glu [SEQ ID nr 2].

Dla porównania w tabeli 14 przedstawiono również teoretyczne sekwencje dla tych podgatunków alfa interferonu. Wyniki pokazują, że główna C-terminalna sekwencja dla pików 1a i 1b jak również niefrakcjonowanego interferonu jest podobna do odpowiadającej części IFN-α2b. Pokazuje to, że niefrakcjonowany interferon i piki 1a i 1b zawierają nietknięty koniec karboksylowy. Stosowana tutaj C-terminalna analiza sekwencyjna jest znacznie mniej czuła od sekwencjonowania N-terminalnego. Jakieś mniejsze różnice mogą nie być wykryte. Na przykład, nie wykryto α 8 C-terminalnych reszt (Leu-Lys-Ser-Lys-Glu) [SEQ ID nr 3] w obecności głównych reszt C-terminalnych alb (Leu-Arg-Ser-Lys-Glu) [SEQ ID nr 41], gdzie te dwie sekwencje różnią się jedynie w cyklu-4. Obecność pomniejszego składnika interferonu z obciętym końcem C nie była wykrywana, jeśli ilość składnika była mniejsza od 20%.

Przykład 7 - Badania toksyczności fazy 1.

Badanie fazy 1 IFN α-n3a prowadzono na 20 bezobjawowych zainfekowanych HIV osobnikach z CD4+ liczba komórek T > 400/mm³. Kompozycja przed odpowiednim rozcieńczeniem zawierała 5 MU/ml IFN α-n3a w 3,3 mg fenolu, 1 mg albuminy (ludzkiej), pH 7,4, PBS, 8,0 ng/ml NaCl, 1,74 mg/ml dwuzasadowego fosforanu sodu, 0,2 mg/ml jednozasadowego fosforanu potasu i 0,2 mg/ml chlorku potasu.

Kompozycję podawano podskórnie w poniedziałek, środę i piątek (2 dni w tygodniu) przez 3 do 6 miesięcy w następujących dawkach; 5 osób 1 milion IU/dawkę, 10 osób 2,5 miliona IU/dawkę przez pierwszy tydzień, a następnie 5 milionów IU/dawkę i 5 osób z dawką podwyższoną do maksymalnej tolerowanej dawki. Pacjentów obserwowano w szpitalu przez pierwszy tydzień traktowania lekiem.

Wyniki tego badania przedstawiono w tabeli 15 poniżej. IFN α-n3a tolerowany był w dawkach < 17,7 miliona IU. Zasadniczo nie zaobserwowano objawów gorączkowych lub grypopodobnych, objawów zaburzeń przewodu pokarmowego lub wysypki skórnej. Wartości oznaczeń laboratoryjnych na całkowitą liczbę leukocytów, granulocytów i płytek wykazały, że są one wszystkie w granicach normy według wymagań WHO. Zastępcze markery dla aktywności alfa interferonu (zwiększona ekspresja klasy I MHZ leukocytów krwi; alfa interferon - ekspresja indukcyjna genu) obecne były w większości podmiotów.

Częstotliwości szkodliwych objawów i nienormalności testów laboratoryjnych podanych dla rekombinantu alfa interferonu nie zaobserwowano przy równoważnych dawkach kompozycji według wynalazku. Ten sprzyjający profil bezpieczeństwa i tolerancji, połączony ze stałym wynikiem aktywności przeciwwirusowej in vitro mniej oczyszczonego produktu uprzednio stosowanego w badaniach klinicznych, przedstawionych jako IFN α-n3 [patrz Alferon A wkładka obojętna, Interferon Sciences, Inc., New Jersey], wskazuje się przydatność kompozycji jako potencjalnie bezpiecznego środka przeciwwirusowego.

176 408

Tabela 15

Złe doświadczenia związane z próbami (%) iniekcja Alferonu N

Wczesna infekcja HIV

	Miliony jednostek i reżim
1 milion jednostek 3 razy w tygodniu	2,5/5 milionów jednostek 3 razy w tygodniu
Liczba p	acjentów
N = 5	N = 10
Gorączka	0	0
Ból głowy	0	0
Mięśniobóle	0	0
Zmęczenie	0	10
Dreszcze	0	0
Ból stawów	0	0
Zawroty głowy	0	0
Biegunka	0	0
Brak łaknienia	0	0
Nudności	0	0
Łysienie	0	0

Dla wykazania uderzających korzyści z niskiej toksyczności kompozycji według wynalazku w stosunku do znanych kompozycji alfa interferonu, porównano wyniki toksyczności w tabeli 16 poniżej w stosunku do wielu innych podanych alfa interferonów, zarówno naturalnych, pochodzących od komórek jak i rekombinanta. Dla łatwego porównania, IFN α-n3a porównano z kilkoma alfa, jak również beta i gamma interferonami indywidualnie opisanymi w następujących publikacjach:

1. G. M. Scott i wsp., British Medical Journal. 282:1345 (1981)

2. S. L. Sacks i wsp., Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 21:93 (1982)

3. J. H. Schiller i wsp. J. Clinical Investigation, 86:1211 (1990)

4. S. Ingimarsson i wsp., J. Infections Disease, 140:560 (1979)

5. H. C. Lane i wsp., Annals of Internal Medicine, 112:805 (1990)

6. R. Kurzrock i wsp., J. Clinical Oncology, 4:1101 (1986)

7. R. J. Spiegel, Clinical Overviev of α/IFN, page 627 (1987)

8. T. Taguchi, Cancer, 57:1705 (1986)

9. R. M. Bukowski i wsp., Cancer Research, 51:836 (1991)

10. H. G. Klingemann i wsp., Blood, 78:3306 (1991)

11. Roferon A, PDR 2006 (1993)

12. Intron A, PDR 2194 (1993)

13. R. J. Wells i wsp., J. Interferon Res., 8:309 (1988)

14. G. J. Jones i wsp., Cancer, 57:1709 (1986)

15. Alferon N Injection, Package Insert

176 408

T abela 16

o	s 1 a Pm H	<*»	10			10	o	20	o
<n	(U W ca. 1 § H	30 MU	11			45	36	45	σ>
n	Φ U1 00. £ pM H		10			10	o	20	o
CM	Pm H CU	2+20 MU/dawka l+2x/dzieri	38; 113		o M·	29	•m· CM			31
rH	NK2 IFNa	(M 6 ca rH rH	OC		1^ CO	co	56	89	r> co	78
rH	Pm H CU	CJ e cn rH	σ\		co r*	67	56	100	67	68
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	ss	OBJAWY GRYPOPODOBNE:	Gorączka	Zmęczenie	Mięśniobóle	Ból głowy	Zimno (dreszcze)	Złe samopoczucie	Infekcja górnych dróg oddechowych

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

cn	'z Cm H M	CO	10
n	Li <U ca ca. 1 Z Cm H	30 MU	11
M	Μ <D (Q ca. !S Cm H		10
CM	Cm W CL	(0 (β Ό Ό 0) £□ N S Ό O 4? CM CM + + CM i-l	38; 113		co
H	8 Z Cm H cm	OJ β CN rH * H	σι						33 i
r—ł	PIFa	1,3 MU/m2	σι						33 '
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	2	OŚRODKOWY & OBWODOWY UKŁAD NERWOWY:	Depresja	Zawroty głowy Niedowład	Drętwienie	Przejściowa impotencja	Trzęsienie j	Trudności koncentracj i

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

ro	rlFN-y	ro	10				O	o
n	<u 10 ca. 1 z H	30 MU	11				18	18 !
n	P (U (0 ca. CM H	n	10				o	o
	PIFa	2+20 MU/dawka l+2x/dzień	38; 113					co
rH	NK2 IFNa	Cl € Cl rd	Ch				33	33
tH	Cm H Λ	N β n H	Ch				22	33
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	&	OŚRODKOWY & OBWODOWY UKŁAD NERWOWY:	Bezsenność	UKŁAD ŹOŁĄDKOWO- ! JELITOWY:	Brak łaknienia	Nudności	Biegunka	Wymioty	Niestrawność/ zgaga

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

n	rlFN-r	n	O rd						<O 1	Ln ·>. x— 1	vr> c? 1
	(0
	(0
	00.
	1								tO	01
	2								K	•s.
	Em	o	rd						Cl	rd	o
C7	H	C7	rd						1	1	1
	M
	0)
	ω
	OL										C
									co	V0	rd
	25									K	*·
	EM		o						fd	rd	o
n	H	n	H						1	1	1
		a
		AJ
		<0 t!
		T3 Φ
		a n	m
		a ό	rd
		**>*	rd
	a	o x
	EM	Cl Cl	·«»
	H	+ +	co				rd
Cl	CU	Cl H	n				Cl
		OJ
		g
	a
	2
	fu
	H
		Cl
	Cl	rd
rd	2	rd	cn
		(M
		g
	a
	Em	M
	H
rd	CU	rd	σι
							1
							Φ
							•H >
	2						W O
	Em						>1 W	··
	H					a	>M 0	*4		a
							iM	H	a	•H i*—«»	a
	>1					Ό (U	Φ &	O	•Hn	Cn	-Hrt
AJ	C					AJ-H		O	G g	Φ g	C g
•H	a				a	10 0	o a	hI	Φ g	Ol g	Φ g
c	S			··	X	(U	•H +1	O	Oi·-	O	LM''*».
sn	O	a			CU	a n	u a		0«	μη	Oc
0	0)	AJ		K	>1	£3 Ό	SO M		AJ O	-P O	<w o
c	0	&		•o	(0	0 UP	O Φ -P	JB	0 H	P H	β H
Ό	+j	<d		w	>1	0 >	N -H 0	W	Φ X	Φ X	•Η X
o	co	Q	2	co	5	co a	υ c	2	►4	2	i-4

176 408

T^at^ela 16 - ciąg dalszy

	rIFN-y	ci	O rH		οί	to o t
	P 0) <o 00. 1					Ul
	s
	tz					-S«.
	Pm	o	rd		0*	«—ł
O)	H	oi	rH		1	1
	P
	<J)
	io
	00.				Ol
		tD			«r	1~ł
	z	§g			OJ
			o		rH	o
oi	H	oi	rH		1	1
		a
		£
		<d Ί3
		Ό <D
		£3 N	n
		s ό	rd
			H
	»	O X
	Pm	OJ OJ	♦*»
	t-d	+ +	00
OJ	Λ	OJ rd	01
		(M
		g
	a
	z	P
	Pm	5s
	H	Ol
	OJ	tH
tM	SS	rd	<31
		Cl
		g
		**x.
	a
		oi
	H
tH	O<	I-ł	<31
					Ό		ω
	fz				HO		c
	Pm			··	0		0 <d
	H				s		rM >
				H	0 ~	-P	id 0
	>1			O	AJo>	>1	-rd N
Ai	C			O	-p e	P	0 -rd		Ό
Ή	<d			u	>1 g	Ai ~	£ H		H3
c	£			o	•M ***s,	0 <fl rd	-rd (fl		A4
-w	0	<d		H	Pf)	P -Η Ό	0 P	··	0
o	10	A4			0 O	(fl β''	(U 4J	w	a
c	0	3		g	fM rM	β (Drd	n α	5ζ	<u
Ό	P	id		Pm	<d X	Φ fi fi	P 0)	z	•H
O	ω	O	z	Z	s —	ffi <	Or C	H	Z

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

O	1 z & H M	n	10
r>	Φ ra 00. 1 z Cu H	30 MU	11
	Φ W 00.
O	IFN	CO	|- 10
Cl	a Cu H CU	2+20 MU/dawka l+2x/dzień	| 38; 113			ττ
tH	a z Cu H N	CM 6 Ol rM H	cn							ί·
rH	a Cu H CU	cn »“ł	σ>							56
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	Z	INNE:	Suchość i zapalenie gardła	Utrata wagi	Zmiana smaku	Zatrucie nerkowe	Uaktywnienie opryszczki narządów płciowych	Bóle krzyża

176 408

Ta^t5<eaa 16 - ciąg dalszy

ro	rlFN-y 1	ro	10
ro	M Φ U) ca. Z Cm H	30 MU	11
ci	L Φ (0 ca. 2 Cm H	Cl	10
cm	PIFa	2+20 MU/dawka l+2x/dzień	38; 113
rH	a 2; (M H CM	Cl β CM r4 rH	01		56
T“ł	a Cm H Λ	Cl e ro rH	Ol		33
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	2	INNE:	Bóle stawów	Zatrucie wątrobowe	Ból miejscowy	Katar	Wątłość	Poty/ Pocenie/ Obfite pocenie się	Zesztywnienie

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

σι	Naturalny IFN-β		34	75
co	CM 55 Pm 1 Z Pm H M	36 MU	•M·		100	50		in CM	50
r-	Λ CM a 1 z> Pm H	Różne	σ·		98	98	86	co σ»	98	86
co	>» Z Pm H U	Ό CM e o CM	0··		100	100	100	co	70
in	Λ CM a 1 'z Pm H M	35 MU/d	11		100	100	i 100 _	o o tH	100	100	73
•m*	a a Pm Pm Η H O PU	3 MU/d	29		62			O rH	38
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	s;	OBJAWY GRYPOPODOBNE:	Gorączka	Zmęczenie	rH 2 0 •H c Ό1 Ol· •rl 53	s· 0 rM tp i—1 o CQ	Zimno (dreszcze)	Złe samopoczucie	Infekcja górnych dróg oddechowych

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

σ>	Naturalny IFN-β		34
co	CM 8 Z Pm 1 Z Cm H Lł	36 MU	M·
	Λ CM 8 1 z Cm H P	Różne	fM			34	34	34	34	34
so	1 Z Pm H	Ό (U β o CM	c··								o
in	Λ CM 8 1 2 Cm H	35 MU/d	11		27						45
•M·	8 8 Cm Cm Η H U CL	3 MU/d	29
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	Z	OŚRODKOWY & OBWODOWY UKŁAD NERWOWY:	Depresja	Zawroty głowy	Niedowład	Drętwienie	Przejściowa impotencja	Trzęsienie	Trudności koncentracj i

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

Ch	Naturalny IFN-(3		ro			-4-
co	(fl CM a Z Cm 1 Ϊ5 Cm H M	36 MU L	M·				25	' ----------------------1 75 i
r-~	Ά CM a z Cm H L	Różne i....	O·				27	50	27	27
VO	1 Z Cm H L	Ό Cl β O CM	O.					36
in	Δ CM a 1 z Cm H L	35 MU/d	11				27		73
	a a Cm Cm H H U ft	3 MU/d i	29
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	Z	OŚRODKOWY & OBWODOWY UKŁAD NERWOWY:	Bezsenność	UKŁAD ŹOŁĄDKOWO— JELITOWY:	Brak łaknienia	Nudności	Biegunka	Wymioty	N iestrawność/ zgaga ....... ....... — 1

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

oi	Naturalny IFN-/3		34
co	(β Cl a z Cu 1 z Cu H 0	n	^3·							<#> σ>
	Λ Cl a z Cu H	Φ c 'N Ό	C·		04 rH	04 rH	·«*		<w> Ul r-	Ul Cl
u>	i® Z Cu H M	Ό Ol β O Cl	C·
ui	Λ Cl a 1 z Cu H U	Ό ui n	rH		> Cl		Ul M*			Ul Ul
•<3·	a a Cu Pu Η H υ cu	Ό Cl	Ol Cl			H	CO Cl
Odnośnik	Stosowany IFN	<0 <0 Q	Z	·· s •o CQ	10 X Ol >1 Ul tu Εε	Sucha skóra/ swędzenie	Częściowe łysienie (utrata włosów)	HEMATOLOGIA:	(0 —X •rln c g 0) g Ol On Λ4 O 0 H Φ X ul	(0 •rl Cn φ g Ol g o 0« •p o 0 «-· Φ X z	10 •rln c g Φ g OlOn *ł-J o g H -Η x ►4 —

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

σ>	Naturalny IFN-β		34
co	rt CM 8 Z Pm 1 Z Cm H	36 MU				38%
r-	Λ CM 8 1 Z Pm H Li	Różne	σ·		25%
ID	rIFN-y	Ό o CM	σ·				o
in	Λ CM 8 1 Z Pm H Li	35 MU/d	11						> CM
m·	8 8 Cm Pm H I-I U CL	3 MU/d	29
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	Z	HEMATOLOGIA:	so o S o ~ P g >1 g Of) 0 o m X g'-'	Hematokryt/ Anemia (ml/dl)	Przeciwciało neutra1i z owane	INNE:	Niepokój

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

σι	Naturalny IFN-β		34
co	(0 CM a z Pm 1 Z Pm H	36MU	M·
Γ	Λ CM a 1 z Pm H	Różne	0··			M·
co	b» Z Pm H Pm	Ό β O CM	0··					42
w	Λ CM a 1 z Pm H Pm	35 MU/d	11					27
	a a Pm Pm Η H U PU	3 MU/d	29
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	Z	INNE:	Suchość i zapalenie gardła	Utrata wagi	Zmiana smaku	Zatrucie nerkowe	Uaktywnienie opryszczki narządów płciowych	Bóle krzyża

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

σι	Naturalny IFN-β		34 1_
00	(0 CM a z Cm Z Cm H U	36 MU	«$·			to
	Λ CM a 1 z Cm H,	Różne	C'·
ΙΟ	h» 1 Z Cm (—t h	Ό N fi — o CM	0·			91
in	Λ CM a 1 z Cm H	35 MU/d	1 11			45
m·	a a Cm Cm H W □ CM	3 MU/d	29				38	r-t	10	10 1	10
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	Z	INNE:	Bóle stawów	Zatrucie wątrobowe	Ból miejscowy	(fl +> (fl Z	Wątłość	Poty/ Pocenie/ Obfite pocenie się	Zesztywnienie

176 408

Tabete 16 - ciąg dalszy

in rH	cn C a 1 z Pm H	1,25 MU/In	104		o Ί*	M* rH	tn rt·	31	rH	σι
	(0
	cm
	a	§
	|	rt
	z	G CM	oc
	Cm	-n r-	rH
	H	•O 1	o		co	o	r»	co	CM
rH	Pm	PS cn	rH		co	σ»	in	TT	CO
	rH
	G	tn
	a	rt hn
	1	G 1 β
	z	mm tn
CO	Pm	«Ο -g	CM		co	tn			<n
rH	H	PS CM s	H		co	CM			co
	Λ
	CM	CI
	a	ε
	1	*·*Χ^
	z	Β
	fM	§	tn
CM	H		S·		co	rH	cc	oc	co
rH	Pm	CM	rM	D	co	co	cn	cn	•M·
	rt
	CM
	a	Ό
	1
	z
		§
rH	H				co	cn	cn	rH	•M·
rH	Pm	ω	n·		cn	co			CO
		(Μ
	Λ	β
	CM
	a	g
	1	52
	z
	Pm	tn
o	H	*»				tn
rH	Pm	rH	M·		o		o	o
	Z										1 1
	Cm			O							Pm Ό
	H			PM			cu			1	O O
				pM			rH			0	tn
	>1			PS		<U	o	>1	CU	CU	IP.G
a:	G			o ·.	rt	•rt	ia		N	o	rt O ϋ
-H	(β			w	AS	G	0	O	O	ε	-rn Pm >t
c	3			>1 z	N	<u	•rt	•M	N	rt cu	ϋ Ό 3
-m	0	rt		3 «	0	N	G	tP	o ω	ω Ή	AS 0
0	ω	AS		< o	ar	ϋ	MO		C CU	0	(U £5 £
c	0	3		b o	Pm	au	(U*	rH	β Pm	Φ G	Ή 0 U
Ό	-P	rt		pa o	0	β	•H	Ό	•rt Ό	rM N	G >i <U
O	M	Q	Z	O PU	O	N	s	pa	N	n o	H G Ό

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

15	n C a 1 2 Cm H	1,25 MU/Inj	104		Cl	σ>
14	a n a 1 2 Cm H	Różna 3-72 MU	1019		6,5		t				12
13	IFN-anl	tn a rłM c i g -N tn •o 'B K Cl s	12
12	Λ Cl a 1 2 Cm H h	03 β CM	145		to	12	to				<5
11	a Cl a 1 2 Cm H	3 MU/d	c·		23	21	to	to	to	<3	<3
10	Λ Cl a 1 2 Cm H L	N g tn rd
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	2	OŚRODKOWY & OBWODOWY UKŁAD NERWOWY:	Depresja	Zawroty głowy	Niedowład	Drętwienie	Przejściowa impotencja	Trzęsienie j	Trudności koncentracj i

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

15

m C 8 1 z Pm H

1,25 MU/Inj

104

CM

M·

CM

cn

cn

14

rt CM 8 Z Pm H Li

Różna 3-72 MU

1019

89

53

34

30

13

IFN-anl

in rt hn β 1 g Ό -5 Pi CM s

12

58

12

Λ CM 8 1 Z Pm H Li

Cl g CM

145

19

21

18

10

11

rt CM 8 1 Z Pm H Li

3 MU/d

c··

Λ CM 8

10

rlFN-

w

•M·

50

25

Odnośnik

Stosowany IFN

Dawka

Z

OŚRODKOWY & OBWODOWY UKŁAD NERWOWY:

Bezsenność

UKŁAD ŹOŁĄDKOWOJELITOWY:

Brak łaknienia

Nudności

Biegunka

Wymioty

| Niestrawność/

zgaga

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

in iH	r> c a 1 Z Pd t-d	1,25 MU/Inj	104			CN
14	cd Ol a 1 z Pd t-d P	Różna 3-72 MU	1019				10
13	IFN-anl	Różna 2,5-15 MU/m	U2
12	Λ OJ a 1 Z Pd H P	Cl g OJ	145
11	cfl Ol a 1 z (P H P	3 MU/d	o·		18	i- 13	00
10	Λ Ol a 1 z Pd H P	CM g in rH	Tf	O					50%
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	Z	SKÓRA:	Wysypka	Sucha skóra/ swędzenie	Częściowe łysienie (utrata włosów)	HEMATOLOGIA:	cd — •Hn C g Φ g On A! O 3 rd Φ X PI	(0 -rd r— Cm Φ g a g 0 pM 4-> O 3 rd Φ X Z	<0 -rdM C g Φ g a^ On «ld O g rd •rd X PI

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

15	n C a 1 z Cu H	1,25 MU/Inj	104
14	(0 CM a 1 z Cu H Su	Różna 3-72 MU	1019				27,4
13	IFN-anl	Różna 2,5-15 MU/m	12
12	Λ CM a z Cu H Su	OJ g 04	145
11	(0 CM a 1 z Cu H Su	3 MU/d	r·
10	Λ CM a 1 z Pu H Su	^g in rH			75%	75%
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	Z	HEMATOLOGIA:	Ό sn o 0 ~ Aśn •P g >ig rM Or» o o rM rd «3 X s —	Hematokryt/ Anemia (ml/dl)	Przeciwciało neutra1i zowane	INNE:	Niepokój

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

15	<*> c a 1 z Cm H	1,25 MU/Inj	104
rH	(fl CM a 1 H Cl	Różna 3-72 MU	1019			13			cr>
13	IFN-anl	Różna 2,5-15 MU/m	12
12	XI CM a z Cm H	(M g CM	145							OM
11	(fl CM a 1 Z Cm h	3 MU/d	σ·			14	13		α
10	Λ CM a • z Cm H Jm	fi in	M·			50		o
Odnośnik J	Stosowany IFN	Dawka	Z	INNE:	Suchość i zapalenie gardła	Utrata wagi	Zmiana smaku	Zatrucie nerkowe	Uaktywnienie opryszczki narządów płciowych	Bóle krzyża

176 408

Tabela 16 - cig dalszy

1 15	n 0 a 1 2 (m H	1,25 MU/Inj	104		w					Cl
14	a Cl a 2 Pm H i-t	Różna 3-72 MU	1019		12
13	IFN-anl	Różna 2,5-15 MU/m	12			25	TT ^i·
12	Λ Cl a 2 Cm H	w g Cl	145		co					co
11	a Cl a 1 2 Cm H P	3 MU/d	c·		in					co
10	n Cl a 2 Cm H	g w rd				75
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	2	INNE:	Bóle stawów	Zatrucie wątrobowe	Ból miejscowy	Katar	Wątłość	Poty/ Pocenie/ Obfite pocenie się	Zesztywnienie

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

σ» ri	0 CM 8 ł Z Cm H	~2 MU/Inj	21		>50	CM		ri		O
		CJ_
	i»	g
	1	'-χ,
	Z	{□
	Cm	s
¢0	H		10		cn			0)
r-t	P	ri	r-t		ri	Ό	10	ri		10
		Ό
		β
		H
	rt
	CM	£□
	8	g
	Z	co
	Cm	ri
	H	1	lf)		cn	ri	n
ri	P	co	i—1		co	M·	ri		O
		Ό
		β
	rt	H
	cn
	β	B
	o					<W>	Λ»			cN>
	z	in				O	O	O		O
VO	Cm	1	lf)		Λ»	ri	ri	ri	Λ»	ri	<W>
ri	H	H	ri		o	V	V	V	O	V	O
	Z										1 1
	Cm			o							P Ό
	H			Pm			Φ			1	Ό 0
							ri			0	tP
	>.			Z		Φ	Ό	>.	Φ	Pm	tP43
	β			o ··	rt	•ri	Λ	3	co	o	rtso O
•rl	rt			w		β	0	O	o	g	•np >
β	£			>m z	N	Φ	-rl	rM	CO	rt Φ	ort &
so	0	rt		3: EP	O	CO	β	tP	O (0	CO -H	a: o
0	(0	*		< O	rt*	0	sn		β Φ	0	Φ £! Λ
β	o	3		h) Q	P	Φ*	Φ»	ri	g P	Φ β	<W O O
τ)	P	rt		EP O	0	g	•rl	o	•rl Ό	rM CO	β >1 Φ
o	w	O	z	O CL	o	tO	g	EP	to	to O	Η β Ό

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

σ\ rd	0 CM a • z Pm H	-2 MU/Inj	rd CM
00 rd	h» Z Cm H L	nj g rd	rd
r* rd	(0 CM a z Cm H	8-18 MU/Inj	in rd	ω
kO rd	(fl cn C a 1 z Cm H	1-5 MU/Inj	in rd			<x> o	o	o	<10%	Λ» o	<10%
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	z	OŚRODKOWY & OBWODOWY UKŁAD NERWOWY:	1 Depresja	Zawroty głowy	Niedowład	Drętwienie	Przejściowa impotencja	Trzęsienie	Trudności koncentracj i

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

rH	0 CM « Z Fm H	~2 MU/Inj	21					O
		ni
		e
	1
	Z	B
		§5
co	H		«3					n		m
rł	U	rd	rd					rd		rd
		Ό
		3
		H
	<d	'—
	CM	?D
	a	K
	z	co
	Pm	rd
r~	H	|	in					cn
rd	M	co	rH				CO	rd	o
		•m
		3
	(β	H
	cn
	3
	a	£
	1
	Z	in
o		1	in		<x>		<X>	<X>		«X»	«X»
rd	H		rd		o		o	O	o	o	o
				1		1 o
				03		s	(0
	55			O		o	•rd				***«.
	Pm			O		54	3				S)
	H			i« *£		o	<u				sn
				2	S)		•H				0
				>< 54	sn	p] ··	c				3
44	s			? P ··	o	O £	44	•H	<d		s
H	(0			O £	c	•N S	id	0	X	>1	3
3	p			W £ s	3	o	<M	sn	3	4->
SQ	o	id		oso	0)	O H		0	3	O	+J cd
0	(0	44		OOP	(0	3 H	44	c	tp	•»d	ω tp
3	o	P		<4 O «	N	pj O	(d	Ό	0)	e	Φ 3
Ό	-P	(0		•w O W	0)	54 W		3	•H	>1	-H tP
O	w	Q	55	OSZ	0Q	O b	03	z	CQ	s	Z n

176 408

Taleda 16 - ciigg dalszy

rd	0 CS a 1 2 Pm H	~2 MU/Inj	21		CO rd
		03
		g
	2	£
	Em	jg*							Λ»
co	H		to						n
rd	h	rd	rd						rd
		•m
		β
		H
	a
	cs	&
	a	2
	1
	2	co
	Pd	rd
t	H	1	in
rd		co	rd
		·(“·»
		β
	a	I-I
	<*)
	fi
	a	s
	1				<«>	<#>
	2	w			o	o
to	Em	1	in		rd	rd	<x>		<w>	Λ»	<M>
rd	H	rd	rd		V	V	o		o	O	o
							ie- w)
	2						a ό
	Em						>, a	··
	H					a	•M 0	<		a
						h	ΛΙ	H	a	•Η «*“*	a
	>1					Ό <U	<u >	O	•i-m	βη	•rdCO
X	β					a; -h		o	β g	α> g	β g
•H	a				a	a β	o a		0) g	CU g	0) g
c				··	Ai	<υ	-H +)	o	CU.	O .	CU.
SO	0	a			su	a n	o a		Oo	Cin	On
o	a			«		£3 Ό	SO Cl		AJ O	+-> O	<H O
c	o			•o	a	□ α>	αχ· <u u-»	Jsj	β rS	0	β H
Ό	+>	a			>1	β >	N -H 3	w	0) X	ω x	•Η X
O	w	Q	2	w		u) a	O fi ~	K	i-4	2 ~	►4

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

O rH	0 Cl a 1 z Pu H	1 -2 MU/Inj	21
		Ol
	i»	g
	1
	z
	Pa	§
co	H		vo
i—ł	P	r4	r4
		•ΓΊ
		β
		H
	(0
	Cl	p
	a	Ss
	1
	z	co
	Pa	tH
	H	I	tn
i—1	Su	co	H
		ΤΊ
		β
	10	H
	n
	β
	a
	1								Λ»
	z	w							O
kO	Pu	1	in		<H>	<#>			H
rH	H	tH	rH		o	o			V
					Ό		Φ
	Z				Ό1		β
	Pa			··	0		0 10
	H						rM 5
				H	0 —	P	10 0
	>1			O	A5«	>1	•rł N
a:	β			o	P g	P	O-H		•n
•H	10			t-1	tu g	Ai —	£ rd		Ό
β				o	rM	0 10 r-U	-tU flj		Ai
U/l	0	10		Eu	0r>	Ρ -Η Ό	0 P	··	0
0	(0	X			0 o	10 gx	Φ P	w	CU
c	0	£		§		g ω H	N β	z	Φ
Ό	P	10		2	10 X	0 β g	Ρ Φ	z	•H
O	w	Q	z	z	Z	K < —	CU β	H	z

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

Oł rd	0 CM a 1 z Cm H	~2 MU/Inj	rd CM
		Cl
	1»	fi
	|
	z
	Pd	£
co	H		CO
rd	fi	rd	rd
		•ΓΊ
		β
		H
	(0
	CM	p
	a	2
	z	co
	Pd	rd
t-~	H	1	in
rd	fi	co	rd
		ΤΛ
		β
	(fl	H
	n
	β	p
	a	2
	z	W
co	Jm	|	in		<*>	<w>	Λ>	<#?	<Η>	<Η>
rd	H		rd		O	ο	ο	Ο	Ο	Ο
					(fl				1
	z				1 «Μ			I	(fl 1
	Cm				(fl Ό		β	fi	Φ β 0
	H				N fi	•fi		φ	•Η ·Η	(0
					(fl	θ’	(fl	β	fi-fi 0	•Ν
	>1				•H tP	(fl	fi		Φ β	>1
X	β						(0	φ	-η ν η,	Ν
•H	(fl				Ό 0)			•Η	β 0	fi
β	£				MO -H	(ΰ	(fl	ο	5 Ν s	X
HO	0	(fl		♦ ·	O β	4J	β	β	μό
0	U]			w	β 0)	(0	(fl	fi φ	-μ >ιΌ β	Φ
β	0	5		z	0 Η	fi	•Η	Ρ >	β fi πΤ ϋ	rd
Ό	+J	(fl		z	β (fl	-Ρ	fi	(fl 0	(fl &Ν >,	Ό
O	w	Q	z	H	ω a	β>	Ν	Ν β	Ο 0 fi >	«

176 408

Tabela 16 - ciąg dalszy

19 1	o Ol a z Pd H	-2 MU/Inj	21
CO rH	1 Z Pd H P	rł	1 16
17	<e Ol a 1 z Pd H P	8-18 MU/Inj	15
16______	<fl n C a 1 z Pd H	1-5 MU/Inj	15		<10%	<10%	ύΡ O	o	0%	<#> o	0%
Odnośnik	Stosowany IFN	Dawka	Z	INNE:	Bóle stawów	Zatrucie wątrobowe	Ból miejscowy	Katar	Wątłość	Poty/ Pocenie/ Obfite pocenie się	Zesztywnienie

176 408

Przykład 8 - Działanie przeciw HIV-1 interferonu α-n3a.

Interferony znane są ze swojego działania przeciwwirusowego zarówno in vivo jak i in vitro. Gatunek interferonu IFN α-n3a przebadano na jego działanie przeciwwirusowe przeciw ludzkiemu wirusowi braku odporności 1 (HIV-1) w szeregu prób in vitro. Aktywność względną IFN α-n3a porównano z rekombinantowymi postaciami alfa interferonu (tj. IFN α-2a i EN α-2b).

A. Hodowla komórkowa i próby odwrotnej transkryptazy.

Komórki stosowane w tych badaniach były normalnymi ludzkimi monocytami odzyskanymi z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) dawców o seronegatywnych wynikach HIV i zapalenia wątroby B, po leukaforezie i oczyszczeniu za pomocą przeciwprądowego wirówkowego rozdzielenia zawiesin o różnej masie frakcji bogatych w leukocyty jednojądrzaste komórek krwi. Zawiesiny komórkowe oznaczano i stwierdzono, że mają > 98% monocytów i były hodowane w postaci przylegających monowarstw (1,5 x 10' komórek/ml) w DMEm (Gibco, Grand Island, NY) z 10% termicznie aktywowaną ludzką surowicą A+, 50 //g/ml gentamycyny i 1000 jedn/ml wysoce oczyszczonego rekombinanta M-CSF (FAP-809, Cetus Corp., EmerywUle, CA). Wszystkie reagenty hodowli badano i stwierdzono, że są ujemne wobec zanieczyszczeń endotoksycznych.

Przytwierdzone monocyty hodowano przez 7 dni pod nieobecność interferonu i przed dodaniem monocytowego szczepu tropikalnego HIV-1 (ADA). Zainfekowane komórki inkubowano aż do 4 tygodniowej hodowli w obecności i pod nieobecność dodanego interferonu. Połowę środowiska hodowlanego wymieniano co 2 do 3 dni.

Interferon stosowany w tych próbach pochodził z różnych źródeł i stąd najpierw oznaczano jego miano wobec innego wirusa, tj. Vesicular Stomatitis Virus (VSV) w oznaczeniu CPE przy użyciu komórek MDBK. Interferony normalizowano w tym oznaczeniu CPE, do tej samej liczby jednostek przeciwwirusowych/ml hodowli w tej próbie. Gdy IFN dodano w tym samym czasie co wirus, lub tuż przedtem, miało miejsce zależne od dawki inhibitowanie produkcji HIV przez interferon.

Odwrotna transkryptaza (RT) aktywności w replikacji hodowli komórkowych, i związana z wirusem HIV-1 stosowana była do ilościowego oznaczenia poziomów ekspresji wirusowej w tych próbach. Płyny hodowli tkankowej, zebrane w różnym czasie, dodawane były do mieszaniny reakcyjnej składającej się z 0,05% Nonidetu P-40 (Sigma Chemical Co.,), 10//g/ml poli (A), 0,25 jedn./ml oligo (dT; Pharmacia, Piscataway, NJ), 5 mmoli dithiothreitolu (Pharmacia), 150 mmoli KCl, 15 mmoli MgCh i ³H-dTTP (2 Ci/mmol, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) w buforze pH 7,9 TRIS-HC1 przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Wprowadzoną radioaktywność wytrącono za pomocą zimnego TCA, przemyto i odebrano w automatycznym odbieralniku komórek (Skatron, Inc., Sterling, VA) na krążkach szklanego filtru. Radioaktywność mierzono w cieczy licznikiem scyntylacyjnym.

B. Porównawcze działanie interferonów na infekcję HIV-1ada w hodowlach monocytowych.

Zależne od dawki działanie IFN α-n3a badano in vitro na monocytach zainfekowanych HIV-1 w porównaniu z dwoma innymi dostępnymi źródłami IFN tj. rekombinantem IFN α -2a (Roferon® A, Hoffman-La Roche, Nutley, NJ) i rekombinantem IFN α-2b (Intron ® A, Schering Plough, Kenilworth, NJ). Wzrastające dawki IFN (tj. 0 do 500 IU/ml) dodawano do monocytów zainfekowanych HIV-iADA (MOI = 0,01) i inkubowano przez 12 dni. Wyniki przedstawione poniżej w tabeli 17 są wynikami przeciętnymi z potrójnego oznaczenia i pokazują, że IFN α-n3a jest silniej działający, jednostka na jednostkę, w oznaczeniu inhibicji HIV-1 w monocytach, niż dwa badane rekombinanty IFN.

176 408

Tabela 17

Aktywność RTazy (CPM x 10'⁵) jako funkcja stężenia IFN

			IFN (IU/ml)
IFN	0,1	1	5	10	50	100	500
stosowany IFN «-2a	253	300	355	327	212	60	50
IFN «-2b	253	286	226	180	88	42	32
IFN a-n3a	253	230	138	58	58	21	18

* *

ID50 50% Dawka inhibicyjna

Oznaczenia te powtórzono wielokrotnie dla potwierdzenia tych wyników. Zestawione wyniki przedstawiono w tabeli 18 poniżej.

Tabela 18

Względne działanie inhibicyjne różnych postaci IFN

IFN stosowany	Liczba prób	ID50(+ SEM)
IFN «-2a	12	95,0 (25,0)
IFN «-2b	8	13,7 (1,1)
IFN «-n3a	6	1,2 (0,2)

Z wyników tych zaobserwowano, że w próbie tej IFN α-n3a był 10 krotnie silniej działający niż IFN α-2b i około 100 krotnie silniej działający niż IFN α-2a. Wyniki te uzyskano nawet po znormalizowaniu względnego stężenia interferonu w każdym preparacie do tego samego miana według oznaczenia w próbie CPE jak opisano powyżej.

C. Analizy działania przeciw HIV-1 w IFN α-n3a.

Źródło wyższej aktywności przeciw HIV-1 w IFN α-n3a w hodowli monocytowej badano za pomocą frakcjonowanych pików IFN α-n3a z zastosowaniem HPLC z odwróconą fazą. IFN α-n3a frakcjonowano na kolumnie RP-HPLC jak opisano poprzednio i każdy pik RP-HPLC aktywności IFN normalizowano na jego przeciwwirusową (np. VSV) aktywność CPE w komórkach MDBK przed zastosowaniem w tych próbach. Sześć regionów pików przebadano (tj. piki 1 [a+b], 2,3,4,5 i 6) po znormalizowaniu miana CPE. Do każdej próby stosowano sto (100) IU/ml i HIV-l moi < 0,02. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 19.

Tabela 19

Względna aktywność przeciw HIV-1 pików IFN «-n3a z RP-HPLC

Dodane IFN (100 IU/ml)	Brak	Pikł (a+b)	Pik 2	Pik 3	Pik 4	Pik 5	Pik 6
Inhibitowana aktywność HIV-1	0%	26%	95%	75%	87%	88%	98%

Wyniki te pokazują, że większość aktywności przeciw HIV-1 wydaje się być związana z gatunkiem IFN znalezionym w pikach 2 i 6 z RP-HPLC, przy czym piki 3,4 i 5 mają silne, ale mniejsze aktywności. Interesujące i nieoczekiwane było stwierdzenie, że gatunek IFN w piku 1 z RP-HPLC miał najniższą przeciw retrowirusową aktywność gatunku znalezionego w IFN α-róa. Gatunkami IFN znalezionymi w tym piku są IFN α2(b/c). Potwierdza to niską aktywność przeciw HIV-1 stwierdzoną dla obu IFN α-2a i IFN α-2b, przedstawioną powyżej.

Mimo, że wynalazek został szczegółowo opisany, oczywiste jest dla fachowców, że można zrobić wiele modyfikacji i zmian. Zatem obecny wynalazek nie jest ograniczony do pokazanych poszczególnych wykonań i zakres jego określony jest tylko poniższymi zastrzeżeniami patentowymi.

176 408

WYSZCZEGÓLNIENIE SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Test, Douglas

Liao, Mei-June Ferencz-Biro, Katalin Rashidbaigi, Abbas DiPaola, Mario Padhye, Manisha (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Ulepszona kompozycja interferonu i sposób jej wytwarzania z ludzkich leukocytów krwi obwodowej (iii) LICZBA SEKWENCJI: 22 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

(A) ADRESAT: Howson & Howson (B) ULICA: Spring House Corporate Center, P. O. Box 457 (C) MIASTO: Spring House (D) STAN: Pennsylvania (E) KRAJ: USA (F) ZIP: 19477 (V) FORMULARZ W POSTACI CZYTELNEJ DLA KOMPUTERA:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: IBM PC kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release # 1,0,

Wersja # 1,25 (vi) AKTUALNE DANE ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 07/835,030 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 10 LUTEGO 1992 (viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU:

(A) NAZWISKO: Bak, Mary E.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 31,215 (C) REFERENCJE/NUMER AKT: NPD92USA (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: 215-540-9206 (B) TELEFAX: 215-540-5818 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 10 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Cys (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 10 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Tyr

176 408 (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 1:

Ala Xaa Val lie Gln Val Gly Val Xaa Glu Thr Pro 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 3 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Arg (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 2:

Leu Arg Ser Lys Glu 1 5 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 3:

Leu Lys Ser Lys Glu 1 5 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 4:

Leu Arg Ser Lys Glu 1 5 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 1 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Cys (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 11 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Ser

176 408 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 14 (c) INNA INFORMACJA: /uwaga= ten aminokwas może być Thr (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 16 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Met (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 19 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Gly (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 22 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Gly (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 27 .

(C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Pro (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 29 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga= ten aminokwas może być Cys (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 5:

Xaa Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg

5 10

Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro

20 25

Phe Ser Xaa Xaa Xaa Asp Arg His (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 6:

Xaa Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg

5 10

Thr Leu Md Leu Leu AA GA Md AA Arr Ile Ser Leu

20 25

Pro Xaa Xaa Leu Xaa Asp Arg His (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 7:

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana

176 408 (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 7: Xaa Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 1 5

Gly Ser Arg Arg 10

Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Xaa Leu 15 20 25

Pro Ser Xaa Leu Lys Asp Arg His 30 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 8:

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 11 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Ser (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 22 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Arg (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 8:

Xaa Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg 1 5 10

Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His 15 20 25

Phe Ser Xaa Leu Xaa Asp Arg His 30 (2) INFORMACJA DLA SEK NR: 9:

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 9:

Xaa Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg

10

Ala Leu Ile Leu Leu Gly Gln Met Gly Arg Xaa Xaa Xaa

20 25

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa (2) INFORMACJA DLA SEKID NR: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region

176 408 (B) LOKALIZACJA: 22 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Gly (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 10:

Xaa Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg 1 5 10

Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro 15 20 25

Phe Ser Xaa Leu Lys Asp Arg His 30 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (c) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 10 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Arg (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 11:

Xaa	Asp	Leu	Pro	Gln Thr His Ser Leu	Gly	Asn Arg Arg
1			5	10
Ala	Leu	Ile Leu	Leu Ala Gln Met Gly	Arg	Ile Ser Pro
	15			20	25
Phe	Ser	Xaa	Leu	Xaa Asp Arg His

(2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENOI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 12:

Xaa Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg

5 10

Ala Leu Ile Leu Leu Ala Xaa Met Arg Arg Ile Ser Pro

20 25

Phe Ser Xaa Leu Lys Asp Arg His (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (c) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 13:

Leu Arg Arg Lys Asp

5

176 408 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 14: Leu Arg Ser Lys Glu

5 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 15: Leu Lys Ser Lys Glu

5 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 16: Leu Arg Arg Lys Asp

5 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA.: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 17: Leu Arg Arg Lys Asp

5 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 18: Leu Arg Arg Lys Glu

5

176 408 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 19:

Leu Arg Arg Lys Asp

5 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Region (B) LOKALIZACJA: 3 (C) INNA INFORMACJA: /uwaga = ten aminokwas może być Arg (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 20:

Leu Arg Ser Lys Glu 1 5 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 21:

Leu Arg Ser Lys Glu

5 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) SPLECENIE: nieznane (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) DESKRYPCJA SEKWENCJI: SEK ID NR: 22:

Leu Arg Ser Lys Glu

5

176 408

IFN Miano Produktywność (xl000 Jedn./Milion Komórek)

FIG. I

Gęstość Komórek (Milion Komórek/ml)

E

Miano IFN

Produktywność

176 408

Miano IFN IRMA (xl000 Jedn./ml)

fi		flS /
/		/
/		/
/		/
/		/
/		/
/		/
!		/
/		/

fil /

/ /

!

!

/ /

/ /

/ /

/ /

/ .25.5 1.0 2.0 3.0 4.0

Objętość Kolby (Litry)

5.0

6.0

FIG. 2

Przykład 1 Przykład 2 Przykład 3 □

176 408

FIG. 4

176 408

Aktywność Właściwa (MU/mg)

Acetonitryl % ^AAP, DAUDI “'“CPE, MDBK CPE, HEp2

FIG. 5

Mr (Kdal)

97.4

66.2

42.7

31.0 > ł ** ~— * 9· < >

‘•Λ* Ε’ί'Τ.'· iWr‘Λ;

,?ΐ<- J-,-21.5 aż-

14.4 br

N ieredukcyj ne

FIG. 6

176 408

Mr (Kdal)

B C D E F G Η I

97.4

66.2

42.7

31.0

21.5

14.4

Redukcyjne

FIG. 7

Nieredukcyjne

FIG. 8

176 408

Mr (Kdal)

130

E. F G H

Redukcyjne

FIG. 9

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja naturalnego alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej, znamienna tym, że zawiera alfa interferon w postaci mieszaniny gatunków α 2 i α 8 oraz ich alleli co najmniej 50% i co najmniej jeden gatunek wybrany z grupy obejmującej α 4, α7, α 10, α 16, α 17 i α21 oraz ich allele w dowolnym farmaceutycznie akceptowalnym nośniku, przy czym kompozycja wykazuje poziom toksyczności u ludzkich pacjentów znacząco zredukowany w odniesieniu do kompozycji zawierających pojedyncze gatunki interferonu lub inne mieszaniny gatunków interferonu.
2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ma zawartość węglowodanu między 1 a 6 molami cukru na mol białka interferonu, czystość co najmniej 95% białek ludzkiego alfa interferonu, względną masę cząsteczkową pomiędzy 16 Οθ0 a 27 000 daltonów, co najmniej jedną N-terminalną sekwencję przedstawioną w tabeli 10 oraz co najmniej jedną C-terminalną sekwencję przedstawioną w tabeli 14.
3. 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ma hydrofobowość mierzoną elucją w 0,1% kwasie trójfluorooctowym z kolumny (C4), przy stosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą, w liniowym gradiencie między 40 - 60% stężenia acetonitrylu jako rozpuszczalnika, dając profil OD280 przedstawiony na fig. 4 oraz jak przedstawiono w tabeli 4, we względnej proporcji w siedmiu pikach, jako procent średniego obszaru, przy stosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą, przy czym zawartość węglowodanu mieści się w zakresie 1 do 6 moli cukru na mol białka interferonu, natomiast aktywność właściwa kompozycji mieści się w przedziale 1-10 x 10⁸ IU/mg według pomiaru in vitro w próbie przeciwwirusowej z zastosowaniem komórek ludzkich i bydlęcych, oraz N-terminalną sekwencję przedstawioną w tabeli 10 i C-terminalną sekwencję przedstawioną w tabeli 14.
4. 4. Kompozycja naturalnego alfa interferonu wytworzona z ludzkich leukocytów krwi obwodowej, znamienna tym, że zawiera białko alfa interferonu wybrane z grupy obejmującej gatunki interferonu α8, α4, α7, α 10, α 16, α 17, α21 i ich allele, oraz ich kombinacje, w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku, przy czym wymieniona kompozycja zasadniczo jest pozbawiona gatunku interferonu α2 i wykazuje większą aktywność przeciwwirusową in vitro niż gatunek interferonu α2 i/lub jego allele.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że białko alfa interferonu jest wyselekcjonowane z gatunku interferonu α 8 i jego alleli.
6. 6. Sposób wytwarzania kompozycji naturalnego alfa interferonu z ludzkich leukocytów krwi obwodowej, znamienny tym, że (a) przygotowuje się leukocyty z ludzkiej krwi obwodowej przez zebranie kożuszka po lizie czerwonych krwinek; (b) zawiesza się leukocyty przy gęstości komórkowej 1-10 x 10⁶ komórek/ml w środowisku indukcyjnym, w którym są zawieszone leukocyty o pH około 7,4, wzbogaconym L-glutaminą, aminokwasami, wodorowęglanem sodu, ludzką surowicą agamma między 0,1 to 1,5 mg/ml; do wyboru witaminą B3 i/lub C oraz, ewentualnie środkami hamującymi wzrost mikroorganizmów; (c) dodaje się surowy lub oczyszczony interferon, jako primer, do leukocytów zawieszonych w środowisku indukcyjnym; (d) inkubuje się zawiesinę w temperaturze około 36°C podczas mieszania; (e) dodaje się do zawiesiny między 50-500 jednostek HA na mililitr wirusa Sendai; (f) inkubuje się w temperaturze około 36°C podczas mieszania; (g) odwirowuje się w celu usunięcia komórek i odpadów; oraz (i) odbiera się surowy alfa interferon jako produkt,

   176 408 bez wydzielania jednego podtypu alfa interferonu z innych podtypów obecnych w mieszaninie alfa.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że przeprowadza się etap rozcieńczania zawiesiny leukocytów po etapie (f), do uzyskania końcowego stężenia około 1-5 χ 10⁶ komórek/ml w środowisku indukcyjnym.