PL176407B1 - Kompozycja farmaceutyczna zawierająca dimer lizozymu - Google Patents

Abstract

1. Komjraoycja farmaceutyczrnza\weraj2ąa dimerlizOzzroujćO<o substtoicję aktywnai farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję aktywna,zawiera dimer iizozymuwilości 33 ng-10 mg/mi, korzystnie 0,001 -10 mg/ml, a zwłaszcza 0,01 -10 mg mg/ml, ewentualnie w mieszaninie ze skutecznąilościąantybiotyku, przy czym w przypadku zawartości dimeruiizozymuwgranicach 0,001-10 mg/mi, akorzystnie 0,01 -10 mg/mi, kompozycja ta zawiera jako substancję aktywną zawsze dimer iizozymu w mieszaninie z antybiotykiem.

Description

Obecny wynalazek dotyczy nowej kompozycji farmaceutycznej zawierającej dimer lizozymu.

Enzymy w postaci monomerycznych znane sąjuż od długiego czasu ze swej efektywności terapeutycznej w leczeniu różnorodnych chorób.

Lizozym został odkryty przez Fleminga w 1922 r. ale dopiero około roku 1950 ujawnione zostały jego enzymatyczne właściwości. Od tego czasu związek był przedmiotem licznych prac badawczych, wynikiem których były doniesienia o jego wielorakich skutkach terapeutycznych. Wśród wielu innych, stwierdzono właściwości przeciwwirusowe, antybakteryjne przeciwzapalne i antyhistaminowe. Terapeutyczne zastosowanie lizozymu było jednak ograniczone ze względu na negatywne efekty uboczne postaci monomerycznej.

Powyższe ograniczenie praktycznego wykorzystania lizozymu oraz innych aktywnych terapeutycznie enzymów zostało przezwyciężone pod koniec lat osiemdziesiątych, kiedy stwierdzono, że wyizolowane formy dimeryczne enzymów, zachowując wszystkie korzystne cechy znanych postaci monomerycznych nie przejawiajążadnych skutków ubocznych przy zastosowaniach leczniczych. Przeciwwirusowe i antybakteryjne kompozycje zawierające jako składnik aktywny dimer lizozymu lub inne zdimeryzowane enzymy opisano w publikacji międzynarodowej nr WO/11294. W zgłoszeniu tym doniesiono, że w testach prowadzonych in vitro dimer lizozymu hamował proliferację szeregu kolonii bakterii wyhodowanych na próbkach pobieranych od pacjentów, w stężeniu 5-20 mg/ml hodowli. Doniesiono również, że dimer okazał się skuteczny w leczeniu infekcji parwowirozy u psów (CPV) przy podawaniu doustnym dwa razy dziennie w dawce 1-2 mg/kg masy ciała.

176 407

W oparciu o to ujawnienie, w Polsce udzielona została ochrona przejściowa na środek farmaceutyczny, przyznająca prawo wyłącznego wytwarzania i sprzedaży produktu Nr 1. Chroniona tym prawem kompozycja zawiera dimer lizozymu w stężeniu 0,001 do 20 mg/ml farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika dostosowanego do podawania dożylnego, doustnego, pozajelitowego miejscowego, i ogólnoustrojowego, domacicznego, dopochwowego, dowymieniowego oraz zewnętrznego i ma postać roztworu, maści, tabletek, kapsułek, czopków, kropli lub olejku.

Prace badawcze nad dimerem lizozymu kontynuowane były przez twórcę powyższego rozwiązania. Odkryte zostały dalsze atrakcyjne cechy dimeru lizozymu i opracowano nowe terapeutyczne zastosowania tego środka, w szczególności do leczenia pewnych dysfunkcji naturalnych mechanizmów obronnych.

W testach klinicznych prowadzonych w celu potwierdzenia skuteczności działania przeciwbakteryjnego i przeciwwirusowego dimeru lizozymu, nieoczekiwanie stwierdzono, że dimer ówjest niespodziewanie skuteczny w leczeniu ostrych postaci chorób układu pokarmowego i oddechowego. Przeprowadzono nowe badania mające na celu określenie działania dimeru lizozymu w takich stadiach różnych chorób, w których zawodzą naturalne mechanizmy obronne. Przeprowadzono także badania nad możliwościąłączenia klasycznej terapii opartej na antybiotykach z użyciem dimeru lizozymu.

Powszechnie wiadomo, że toksyny bakteryjne stanowiąjedną grupę licznych czynników agresywnych, wskutek działania których bakterie powodują choroby. Najnowsze badania toksyn bakteryjnych koncentrują się na ich oddziaływaniu na system immunologiczny gospodarza. Oddziaływanie to przede wszystkim polega na immunomodulacji a następnie na uwalnianiu cytokin i innych mediatorów, co jest powodem wielu zaburzeń fizjologicznych wywoływanych przez toksyny. Ten ostatni efekt badany był przede wszystkim pod kątem działania endotoksyn, które odgrywają ważną rolę w patogenezie sepsy wywoływanej przez bakterie gram-negatywne (porównaj D.F. Bayston, J. Cohen: “Bacterial endotoxins and current concepts in the diagnosis and retreatment of endotoxaemia” J. Med. Microbiol. 1990, 31:73-83.). Chociaż rola egzotoksyn w infekcjach wywoływanych przez gronkowiec złocisty - Staphylococcus aureus, i paciorkowiec ropny Streptococcus pyogenes, od dawna była znana, to jednak dopiero wyodrębnienie syndromu gronkowcowego wstrząsu toksycznego doprowadziło do zwiększenia zainteresowania egzotoksynami produkowanymi przez te organizmy.

Wstrząs toksyczny jest ciężką chorobą charakteryzującą się wysoką gorączką, obniżonym ciśnieniem, wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym, rozległą erytrodermią, rumieniem błon śluzowych, niewydolnością nerek, hypokalcemią, hypoalbumincmią i przemijającymi wysypkami (zaczerwienieniami skóry ulegającymi złuszczaniu). Wiele przypadków wstrząsu toksycznego związanych było ze stosowaniem tamponów pochwowych w okresie menstruacji, lecz obecnie nasilają się opisy tego syndromu w przypadkach nie związanych z cyklem menstruacyjnym, u pacjentów obu płci, często po zabiegach chirurgicznych, gdy tamponadę pozostawia się na dużej (przykładowo przy tamponowaniu nosa po operacjach plastycznych nosa lub ostrych krwotokach). Wykazano, że szczepy gronkowca wyizolowane z pochw pacjentek, u których stwierdzono syndrom wstrząsu toksycznego (TSS), produkują toksynę 1 syndromu wstrząsu toksycznego (TSST-1), ale źródłem mikroorganizmu produkującego TSST-1 może być również nieujawniona infekcja. Początkowa bakteriemia może mieć przebieg utajony lecz po kilku tygodniach lub miesiącach doprowadzić może do zlokalizowanych infekcji. Ujawnieniu się takich infekcji towarzyć mogąobjawy świadczące o wystąpieniu syndromu sepsy lub wstrząsu septycznego. Rzadsza lecz bardziej dramatyczna bakteriemia może wystąpić, gdy brak jest wrót infekcji lub towarzyszących zlokalizowanych infekcji i w takich przypadkach wstrząs, zapalenie wsierdzia, rozsiana koagulopatia śródnaczyniowa oraz niewydolność jednoczesna wielu organów mają gwałtowniejszy przebieg (porównaj D.L. Stevens i wsp.: Gram-positive shock; Curret Opinions in Infectious Diseases 1992, :355-363).

176 407

Znane są podobne obserwacje w przypadkach bakterii gram-dodatnich. Przykładowo, infekcji wywołanej przez paciorkowiec ropny - Streptococcus pyogenes, towarzyszy wstrząs, a śmiertelność wynosi 30%. Paciorkowiec Streptococcus pneumoniae, jest przyczyną zapalenia płuc, które zdokumentowano jako wysoce odporne na penicylinę i wykazujące tendencję do rozwoju syndromu wstrząsu. Ponadto, pacjenci z AIDS mają wyższą zapadalność na pneumokokowe infekcje niż cała populacja.

Infekcje wywoływane przez bakterie gram-ujemne mogą również prowadzić do wstrząsu septycznego. Gram-ujemne laseczki i pałeczki oraz przecinkowce stanowią źródło najważniejszych enterotoksyn. Enterotoksyna jest lipopolisacharydowym (LPS) komponentem zewnętrznej membrany ścianek komórek bakterii gram-ujemnych. Enterotoksyny wywierają wpływ przede wszystkim na układ jelitowy i zazwyczaj wywołują biegunkę. Najczęstszymi infekcjami spowodowanymi bakteriami gram-ujemnymi u ludzi i zwierząt są infekcje spowodowane przez pałeczkę okrężnicy - Escherichia coli. Silne odwodnienie towarzyszące takim infekcjom może być przyczyną śmierci zainfekowanego osobnika. Według danych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), ostre biegunki zabijają corocznie około 3,2 miliona dzieci w krajach rozwijających się. Około 30% wszystkich przypadków sepsy jest wywołanych przez bakterie gram-ujemne.

Sepsa spowodowana infekcjami bakteryjnymi wywołanymi przez bakterie gram-dodatnie i gram-ujemne jest zawsze groźnąchorobą, występującąwe wszystkich krajach. W Stanach Zjednoczonych odnotowuje się około 400 000 przypadków rocznie, a śmiertelność wynosi około 50%.

W ostatnich latach sepsa i wstrząs septyczny były przedmiotem licznych publikacji. Zaobserwowano, że w patofizjologii szoku septycznego, endotoksemii i innych chorobach, mediatory intoksykacji bakteryjnej odgrywają istotną rolę. Zalicza się do nich czynnik nekrozy nowotworów (TNF), interleukinę-1 (IL-1), interferon (IFN), czynnik aktywności płytek (PAF) i eikosandoidy (pochodne kwasu arachidonowego), przy czym najistotniejszym z nich jest TNF, który oddziałuje na metabolizm jak i na układ immunologiczny i fagocytamy (porównaj F.E. Berkowitz: Bacterial toxins in pathogenesis of infections; Current Opinions in Infectious Diseases, 1991 4:332-337). Wykazano, że osobniki, które nie przetrwały wstrząsu septycznego miały wyższe stężenia TNF i interleukiny-1. Wielu autorów donosiło, że pacjenci z Szokiem septycznym mieli podwyższony poziom TNFot w plazmie oraz we krwi. Zauważono jednocześnie, że toksyczne skutki TNF-α nie zależą tak wyraźnie od stężenia TNF jak od stałej obecności (nadmiernej) obecności w ciele. Wielu autorów badało możliwości modulowania kaskady cytokin w sepsie i wstrząsie septycznym. Propozycje skutecznych rozwiązań obejmują stosowanie monoklonalnych przeciwciał TNF oraz neutralizację lipopolisacharydów za pomocą anty-lipopolisacharydów. Przeciwciała, jednakże nie wzmagają usuwania szczątków bakteryjnych. Częściowo korzystne efekty obserwowano również w przypadkach wykorzystania takich środków jak deksametazon i pentoksyfilina blokujących produkcję TNF przez makrofagi.

Wiadomo również, że inne cytokiny mają też swój udział we wstrząsie septycznym. W tej sytuacji sposoby leczenia, które modulują kaskadę cytokin we wstrząsie szoku septycznym mają możliwość oddziaływania na rozwój infekcji, ponieważ obrona gospodarza zależna jest od tych samych cytokin zapalnych. Znalezienie środka zapobiegającego szokowi septycznemujest zadaniem nadrzędnym z uwagi na potencjalną korzyść jaką mogłoby to przynieść wielkiej liczbie pacjentów. W poszukiwanym rozwiązaniu kontrolowanie poziomu TNF zdaje się być kwestią zasadniczą.

Podobnie krytyczną rolę odgrywa TNF w innym mechanizmie obronnym jakim jest gorączka, będąca fizjologicznąodpowiedziąna infekcje typowe dla wszystkich wyższych gatunków zwierząt i ludzi. Dotychczas rozpoznano pięć cytokin pirogennych (interleukina-1, TNF interferon, interleukina-2 i interleukina-6) jako główne endogenne mediatory reakcji gorączkowej, inhibitujące preoptyczne wrażliwe na ciepło neurony, które normalnie umożliwiająutratę ciepła i obniżenie wytwarzania ciepła w organizmie ludzkim. Gorączka i jej mediatory mają zdolność

176 407 uszkadzania zarówno organizmów inwazyjnychjak i organizmu gospodarza. Zgromadzono liczne dane w ostatnich latach sugerujące, że interleukina-1, TNF i interleukina-6 są mediatorami patofizjologicznych nieprawidłowości w przebiegu infekcji. Ponieważ endogenne pirogeny przyczyniaj ą się do procesów patologicznych w licznych infekcj ach zarówno mediatory jak i reakcja gorączkowa są potencjalnie szkodliwe dla organizmu gospodarza. Najbardziej przekonujące dowody na to twierdzenie zgromadzono w trakcie badań nad gram-ujemnąsepsą. Istnieją dowody, że endogenne pirogeny są mediatorami układowych i lokalnych przejawów sepsy spowodowanej gram-dodatnimi bakteriami, AIDS, infekcjami krętkowymi, zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych, niewydolnością układu oddechowego u dorosłych, ropnym zapaleniem stawów i mykobakteriozą. Chociaż cytowane dane są w sprzeczności z obserwowanym zjawiskiem, że reakcja gorączkowa zwiększa odporność zwierząt doświadczalnych na infekcje, tym nie mniej zachowanie gatunku w większym stopniu niż utrzymanie przy życiu pojedynczych osobników, stanowi istotę procesu ewolucji. Uznaje się za możliwe, że ten sam mechanizm może powodować występowanie szkodliwych skutków układowych cytokin pirogennych na wynik ogólnych infekcji (przykładowo gram-ujemnej sepsy) oraz przejawiać się w mniej piorunujących infekcjach jako dobroczynnymi lokalnymi skutkami gorączkowymi. Zatem przez przyspieszenie zgonu beznadziejnie zainfekowanych osobników natura zabija osobniki, stanowiące zagrożenie dla gatunku. Tym sposobem gatunek jako całość może być chroniony przed chorobami epidemicznymi (porównaj P.A. Maćkowiak: Mechanism of fever; Current Opinions in Infectious Diseases, 1992, 5:348-354).

Zgodnie z podstawową koncepcją patogenów gorączki, egzogenne pirogeny, niezależnie od ich pochodzenia lub budowy powodują gorączkę poprzez indukowanie komórek organizmu gospodarza (przede wszystkim makrofagów) do produkowania endogennych pirogenów. Zatem, metody terapeutyczne oparte na zastosowaniu przeciwciał anty-endogennych pirogenów i antagonistów receptorów endogennych pirogenów, mogą być skuteczne w takich wypadkach. Jedną z możliwości jest blokowanie syntezy TNF. Badania prowadzone na zwierzętach wykazują, że TNF może być syntezowany przed IL-1 i innymi cytokinami w kaskadowej odpowiedzi organizmu na infekcję. W związku z tym dla wielu naukowców hamowanie biosyntezy TNF oznacza również hamowanie syntezy IL-1. Ale jednocześnie hamowanie biosyntezy TNF oznacza również zatrzymanie szkodliwych skutków niektórych piorunujących i beznadziejnych infekcji.

TNF jest również rozpoznany j ako j eden z mediatorów procesów zapalnych. Zapalenie jest w wielu przypadkach pierwszym etapem choroby, z której przy naturalnym przebiegu rozwij a się wstrząs septyczny. W sytuacjach przerwania ciągłości tkanek, takichjak rany narażone na zainfekowanie, obrażenia wojenne, zwłaszcza rany brzuszne (zapalenie otrzewnej), choroby układu pokarmowo-trawiennego takie jak ostre zapalenia towarzyszące rozlaniu wyrostka robaczkowego, ostre infekcje bakteryjne i wirusowe takie jak występujące w pogrypowym zapaleniu płuc, chorobach nowotworowych, zwłaszcza w fazie rozpadu guzów nowotworowych i tym podobnych, stan zapalny jest pierwszym objawem wzrostu produkcji TNF. Kontrolowanie poziomu TNF stanowiłoby zatem pożądany model leczenia takich infekcji.

Jeszcze donioślejsza jest rola TNF w AIDS jako takim. AIDS charakteryzuje się istotnym osłabieniem odporności immunologicznej. Znamienną cechą zespołu AIDS jest obniżona ilość limfocytów CD4+. Ilość komórek zainfekowanych wirusem HIV, będącym czynnikiem etiologicznym AIDS - jest stosunkowo niewielka (< 1 na 100-1000) nawet pośród jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC) u pacjentów z AIDS. Podczas gdy limfocyty CD4+ są infekowane w sposób preferencyjny, komórki te nie są wyłącznym celem ataku w infekcjach wirusem HIV. Ostatnie badania wykazały, że spektrum docelowych komórek ataku wirusa HIV jest stosunkowo szerokie. Zaobserwowano wyraźne różnice skutków infekcji wirusem HIV wmonocytach/makrofagach w porównaniu z limfocytami T. Podczas gdy limfocyty T przejawiają tendencję do ulegania zniszczeniu, monocyty/makrofagi pozwalająna trwanie infekcji. Wirus HIV może zatem rozwijać się i tworzyć skupiska w monocytach/makrofagach jak również w innych komórkach ciała. Ten rodzaj odpowiedzi na infekcję wirusem HIV jaki jest właściwy dla mono6

176 407 cytów/makrofagów może być odpowiedzialny za utajone nosicielstwo wirusa przez organizm gospodarza; reakcja ta może również powodować patogeniczne następstwa wywoływane przez rozpuszczalne czynniki produkowane przez zainfekowane komórki (porównaj Toshifumi Matsuyama i wsp.: Cytokines and HIV infections: Is AIDS a Tumor Necrosis factor disease?; AIDS 1991,5:1405-1417). Sądoniesienia licznych naukowców stwierdzające, że linie ludzkich komórek T zainfekowane HTLV-1 są wysoce podatne na infekcję wirusem HIV, co daje dramatyczny skutek cytopatyczny w połączeniu ze wzmożoną replikacją wirusa HIV. Ponadto, komórki zainfekowane wirusem HIV sąpodatne na uszkodzenie pod wpływem supematantów tych komórek. Ustalając miano wirusów po zadaniu takim supematantem stwierdzono, że czynnik produkowany przez komórki T (MT-2) wzmaga replikację wirusa HIV. Czynnik ten zidentyfikowany został jak TNF-β i to stwierdzenie jest zgodne z raportami informującymi, że komórki T (MT-2) produkują TNF-β. Ten sam skutek obserwuje się gdy stosuje się TNF-α. Oba czynniki TNF-α i TNF-β selektywnie zabijają komórki zainfekowane wirusem HIV i wzmagają replikację tego wirusa. Doniesiono również, że linie komórek T zainfekowanych wirusem HIV oraz PBMC świeżo wyizolowane od osobników zarażonych wirusem HIV dająodpowiedź na TNF polegającąna wzroście jego poziomu. Sugeruje to, że takie samo wzmożenie ekspresji wirusa HIV może następować również in vivo. Oczywiście wzmagające działanie TNF może być neutralizowane przez przeciwciała anty-TNF. Wzmożenie replikacji wirusa HIV po zadaniu TNF-α i TNF-β jest ponad dziesięciokrotne (porównaj A. Yakamam i wsp.: Tumor necrosis factor (α,β) induced by HIV -1 in peripheral blood mononuclear cells potentate virus replication; AIDS 1990,421 -427).

Potwierdzono również, że różnorodne cytokiny mogą mieć wpływ na produkcję HIV. Stosując oczyszczone fagocyty jednojądrowe z normalnej krwi obwodowej obserwowano indukcję IL-6 oraz TNF-α w kilka godzin po wystawieniu na atak wirusa HIV. Taką samą indukcję cytokin obserwowano przy użyciu wirusa HIV inaktywowanego termicznie. Bazując na tych i szeregu podobnych obserwacjach oraz doniesieniu Toshifumi Matsuyama i wsp. (op.cit.) można nabrać przekonania, że AIDS jest chorobą zależną od cytokin lub TNF. W sieci cytokinowej AIDS, zarówno TNF-α jak i TNF-β jawią się jako węzłowe cząsteczki wzmagające replikację wirusa HIV oraz indukujące ich własną ekspresję oraz ekspresję innych cytokin. Wykazano, że TNF-α stymuluje uwalnianie innych cytokin w komórkach różnych typów, a więc jest kluczową cytokiną kaskady cytokin w podstawowym mechanizmie obrony.

Sugeruje się, że wiele symptomów towarzyszących AIDS może być wyjaśnionych uwalnianiem cytokin o różnych biologicznych funkcjach. Zwiększona produkcja IL-1 i TNF-α dwóch znanych pirogenów może wyjaśnić gorączkę obserwowaną u pacjentów z AIDS. TNF-α może mieć związek z towarzyszącą AIDS kacheksją. Oba TNF-α i TNF-β funkcjonują jako immunomodulatory i cząsteczki efektorowe w cytotoksyczności z monocytami jako mediatorami. Ponadto, TNF jest odpowiedzialny za aktywację odpowiedzi immunologicznej i może bezpośrednio zabijać komórki zainfekowane HIV przyczyniając się do replikacji wirusa HIV. Mechanizm immunologiczny zaproponowany został także do wyjaśnienia zjawiska zmniejszenia ilości komórek CD4-T u pacjentów AIDS (Matsuyama i wsp., op. cit.). Donoszono również, że mięsak Kaposi'ego indukowanyjest przez TNF-α: TNF-α może być produkowany z keratynocytów pod wpływem bodźca fizjologicznego, takiego jak światło nadfioletowe, które może przyczyniać się do indukcji IL-6 w skórze i rozwoju mięsaka Kaposi'ego w przebiegu AIDS. W testach in vitro, TNF-α może powodować uszkodzenie mieliny i oligodendrocytów; także niektóre linie komórkowe pochodzące z glejaka są jak wykazano, podatne na antyproliferacyjny wpływ TNF-α. Te obserwacje mogą prowadzić do wniosku, że dysfunkcja centralnego układu nerwowego u pacjentów z AIDS jest wynikiem działania TNF-α. W wielu doniesieniach potwierdzono, że poziom TNF-α i IL-1 w surowicy ulega istotnemu podwyższeniu wraz z rozwojem AIDS i ARC (kompleks związany z AIDS), podczas gdy u bezobjawowych nosicieli wirusa HIV utrzymuje się na poziomie takim samym jak w grupie kontrolnej złożonej ze zdrowych ludzi. Według Matsuyama i wsp. (op. cit.), AIDS jest w równym stopniu chorobą związaną z TNF jak i z wirusem HIV. Wykazuje to, iż osiągnięcie kontroli nad indukcjąiUF może prowadzić do skutecznej terapii dla pacjentów z AIDS.

176 407

Celem wynalazku jest opracowanie kompozycji przydatnej w profilaktyce i terapii wyżej opisanych stanów chorobowych.

Cel ten został osiągnięty zgodnie z wynalazkiem, dzięki nieoczekiwanemu ustaleniu, że:

1. dimer lizozymu inhibituje syntezę TNF,

2. dimer lizozymu stymuluje syntezę IFN-α,

3. dimer lizozymu pobudza aktywność fagocytarną, a więc przejawia aktywność umożliwiającąjego wykorzystanie w związku z wyżej opisanymi stanami patologicznymi, w tym w leczeniu, łagodzenie przebiegu a nawet w pewnym zakresie w profilaktyce chorób związanych z nadmiernie wysokim poziomem TNF, opisanych powyżej.

Kompozycja farmaceutyczna zawierająca dimer lizozymu jako substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, według wynalazku cechuje się tym, że jako substancję aktywną zawiera zdimeryzowaną postać lizozymu w ilości 33 ng -10 mg/ml, korzystnie 0,001 10 mg/ml, a zwłaszcza 0,01 -10 mg/ml, ewentualnie w mieszaninie ze skuteczną ilością antybiotyku, przy czym w przypadku zawartości dimeru lizozymu w granicach 0,001 -10 mg/ml, a korzystnie 0,01 - 10 mg/ml, kompozycja ta zawiera jako substancję aktywną zawsze dimer lizozymu w mieszaninie z antybiotykiem.

Kompozycj a według wynalazku, zawieraj ąca dimer lizozymu i antybiotyk cechuj e się tym, że w badaniu in vitro w obecności surowicy bydlęcej aktywności antybiotyku jest do 100% wyższa niż w takim samym badaniu bez dodatku dimeru lizozymu.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku zawiera dimer lizozymu zasadniczo wolny od monomerycznej, trimerycznej i oligomerycznej postaci lizozymu.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku zawiera dimer lizozymu w ilości 33 ng - 0,001 mg/ml.

W przypadku gdy kompozycja według wynalazku zawiera antybiotyk jak jeden ze składników aktywnych, zawiera antybiotyk wybrany z grupy obejmującej penicylinę, neomycynę, erytromycynę, cefalosporynę.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku zawierająca dimer lizozymu i antybiotyk ma postać roztworu i zawiera dimer lizozymu w ilości zapewniającej oddziaływanie dimeru lizozymu na komórkę mikroorganizmu w stężeniu 5 pg/ml.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku jest dostosowana do podawania w jednej lub kilku dawkach 0,02 mg/kg masy ciała.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku ma postać roztworu do iniekcji, odpowiedniego do podawania dożylnego.

Dimer lizozymu stanowiący składnik aktywny kompozycji według wynalazku posiada zdolność modulowania naturalnych mechanizmów obronnych, poprzez co najmniej jedno działanie wybrane z grupy obejmującej: podwyższenie aktywności fagocytarnej, podwyższenie syntezy interferonu, obniżenie poziomu czynnika nekrozy nowotworów (TNF), supresję wydzielania czynnika nekrozy nowotworów (TNF) i inhibitowanie biosyntezy czynnika nekrozy nowotworów (TNF) u zwierząt i ludzi.

Szczególnie korzystne działanie dimer lizozymu ma w stosunku do chorób związanych z rosnącym lub nadmiernie wysokim poziomem czynnika nekrozy nowotworów (TNF), w tym także chorób niebędących infekcjami wirusowymi lub bakteryjnymi. Jednym ze stanów chorobowych tego rodzaju jest infekcja wywołana przez wirusa HIV, w przebiegu której występują stadium bezobjawowe oraz kompleks ARC związany z AIDS. Kontrola uwalniania czynnika nekrozy nowotworów w tych stadiach może opóźnić wystąpienie pełnych objawów AIDS.

Innymi stanami chorobowymi tego rodzaju są stany zapalne i towarzysząca im gorączka, a także sepsa, wstrząs septyczny i kacheksja.

Zgodnie z wynalazkiem dimer lizozymu stosuje się łącznie z antybiotykiem. Terapia za pomocą dimeru lizozymu towarzyszyć może także typowemu leczeniu za pomocą AZT.

176 407

Antybiotyk podawany łącznie z dimerem lizozymu jest skuteczniejszy niż podawany samodzielnie. Skuteczna dawka antybiotyku ulega obniżeniu o około 33% do około 50% w stosunku do dawki skutecznej tego samego antybiotyku w znanych kompozycjach zawierający sam antybiotyk. W szczególności dotyczy to penicyliny, neomycyny, erytromycyny i cefalosporyny (SEFRIL).

Kompozycja według wynalazku zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik dostosowany do podawania dożylnego, doustnego, pozajelitowego miejscowego, i ogólnoustrojowego, domacicznego, dopochwowego, dowymieniowego oraz zewnętrznego i ma postać roztworu, maści, tabletek, kapsułek, czopków, kropli lub olejku.

Korzystnie, nośnikiem jest apyrogenna sterylna kompozycja obejmująca fizjologicznie dopuszczalny rozpuszczalnik i dopuszczalny farmaceutycznie środek konserwujący. Korzystnie apyrogenną, sterylną kompozycją zawierającą co najmniej jeden fizjologicznie akceptowalny rozpuszczalnik i/lub co najmniej jeden dopuszczalny farmaceutycznie środek konserwujący jest apyrogenna sterylizowana woda lub wodny roztwór PBS jako rozpuszczalnik i tiomersal jako środek konserwujący dopuszczalny do stosowania w farmaceutycznych środkach białkowych. Korzystnie kompozycja według wynalazku ma postać roztworu do iniekcji, odpowiedniego do podawania dożylnego.

Kompozycja według wynalazku w formie zastrzyków może być podawana także domięśniowo i podskórnie. W niektórych zastosowaniach właściwe może być jednoczesne lub niezależne podawanie tej samej ciekłej kompozycji domacicznie lub dowymieniowo - lub lokalnie ewentualnie w powiązaniu z innymi zewnętrznymi preparatami.

Inną korzystną formą użycia lizozymujest zastosowanie tamponu lub opatrunku aseptycznego jako stałego nośnika skutecznej terapeutycznie dawki tej substancji czynnej. Szczególnym przykładem są tampony dopochwowe, do użytku w czasie menstruacji.

Jako zdimeryzowanąpostać lizozymu korzystnie stosuje się wyizolowany oczyszczony dimer lizozymu. W niektórych zastosowaniach możliwe jest wykorzystanie kompozycji, które oprócz dimeru lizozymu zawierają niewielkie frakcje trimerów i wyższych oligomerów tego enzymu.

Zdimeryzowanąpostać lizozymu otrzymuje się w procesie kontrolowanej polimeryzacji monomeru enzymu, po którym prowadzi się staranne oczyszczanie, w szczególności usuwanie formy monomerycznej o znanych toksycznych skutkach ubocznych oraz frakcji trimerów i wyższych oligomerów z mieszaniny poreakcyjnej. Dowolna znana metoda prowadzenia polimeryzacji może być przydatna do otrzymania postaci zdimeryzowanej. Jeden z możliwych sposobów, obejmujący także etapy oczyszczania opisano w międzynarodowej publikacji nrW0 91 /10731.

Wcześniej prowadzone badaniaprzedkliniczne dimeru lizozymu nie ujawniły właściwości mutagennych ani teratogennych, jak również wykazały brak lub jedynie niewielką tolerancję. Toksyczności oznaczonej dla pojedynczej dawki (toksyczność ostra) przy podaniu doustnym lub zewnętrznym - LD₅₀ nie udało się ustalić (>2000 mg/kg), a przy podawaniu dożylnym - LD₅₀ wyniosła ona> 1000 mg/kg.

Ujawnione obecnie nowe zastosowania dimeru lizozymu mają solidne podstawy potwierdzone w testach prowadzonych in vitro i potwierdzających je klinicznych zastosowaniach in vivo. Przeprowadzono także pewne badania porównawcze.

Uważa się, że wpływ inhibitujący na uwalnianie TNF okazał się tak skuteczny z uwagi na szersze spektrum aktywności dimeru lizozymu, w szczególności z uwagi na jego zdolność indukowania uwalniania IFN oraz wzmagający wpływ na fagocytozę. Obie wymienione dodatkowe właściwości są istotnymi czynnikami w naturalnych mechanizmach obronnych. Tak więc efekty terapeutyczne i profilaktyczne w opisanych wyżej nowych zastosowaniach dimeru lizozymu wspomagane sąnaturalnymi mechanizmami obronnymi wzmaganymi przez dimer tego enzymu.

176 407

Obecny wynalazek zostanie dodatkowo objaśniony w poniższych przykładach, w których czynione będą wzmianki o załączonych rysunkach graficznie ilustrujących wyniki badań o szczególnym znaczeniu. Na rysunkach:

Figura 1 ilustruje supresję uwalniania TNF teście prowadzonym in vitro, w hodowli limfocytów stymulowanych suboptymalną dawką ConA w obecności dimeru lizozymu w różnych rozcieńczeniach.

Figura 2 ilustruje poziom TNF w krwi cieląt (oznaczony doświadczalnie), a

Figura 3 ilustruje INF w krwi cieląt (oznaczony doświadczalnie) w badaniu porównawczym skuteczności terapeutycznej środka leczniczego według wynalazku.

Przykład I.

W celu oznaczenia immunoaktywności dimeru lizozymu zastosowano testy prowadzone na limfocytach ludzkiej krwi obwodowej PBL, których wyniki oceniano stosując metodę analityczną FACS.

Stymulacja mitogeniczna ludzkich limfocytów krwi obwodowej jest powszechnie stosowaną metodą badania reaktywności większości komórek systemu immunologicznego. W celu zbadania wpływu substancji leczniczych na aktywację i proliferację limfocytów od zdrowych dawców krwi, mitogen wprowadza się w dawkach suboptymalnych i ostatecznie mierzy się odpowiedź limfocytów ilościowo oceniając właściwe, immunologicznie istotne parametry. Otrzymane wyniki ocenia się porównując je z wynikami otrzymanymi dla hodowli kontrolnych bez dodatku substancji leczniczych.

Do stymulacji limfocytów używano ConA w stężeniu 20 pg/ml pożywki. Początkowe stężenie komórek wynosiło 10⁶ komórek/ml. Krótkoterminowe hodowle inkubowane w atmosferze CO₂ prowadzono przez jeden (IL-2 receptory na limfocytach oraz HLA-Dr) lub dwa dni (wszystkie pozostałe testy). Dokonywano pomiaru następujących parametrów, dla oceny aktywności komórkowej:

- neopteryna (marker aktywacji immunologicznej)

- β-2-mikroglobulina (także marker aktywacji)

- interleukina-2 (autokrynna i parakrynna substancja pochodząca od limfocytu T-helper)

- interleukina-6 (komórkowy hormon dyferencjacji)

- czynnik nekrozy nowotworów - TNF (naczyniowoaktywna wielokierunkowa interleukina)

- interferon-α (czynnik różnicujący zwłaszcza dla limfocytów B)

- kinaza tymidynowa (enzym, pobudzony w procesie proliferacji komórek)

- leukocytowy receptor interleukiny-2 (cząstka akceptorowa dla autokrynnej i parakrynnej

IL-2)

- limfocyt Ki-67 (antygen podlegający ekspresji w aktywowanych zproliferowanych komórkach)

- limfocyt HLA-Dr (antygen histokompatybilności klasy II, pobudzony podczas odpowiedzi immunologicznej).

W supematantach prowadzonych hodowli poczyniono następujące obserwacje:

Neopteryna - produkowana przez limfocyty T podczas odpowiedzi immunologicznej oraz w stymulowanych hodowlach - w obecnych doświadczeniach nie była wyraźnie podwyższona pod wpływem dimeru lizozymu w porównaniu z wartością kontrolną obserwowaną w komórkach stymulowanych CoA bez dodatku badanego dimeru. Ze wzrostem stężenia badanego dimeru wartości neopteryny były nieznacznie podwyższone.

Podobnie wartości β-2-mikroglobuliny przy wszystkich stężeniach dimeru lizozymu oscylowały wokół wartości kontrolnych.

Receptory IL-2 - eliminowane z powierzchni limfocytu podczas hodowli i dające informację o całkowitej ilości przekształconych receptorów IL-2 - były na poziomie porównywalnym z

176 407 receptorami IL-2 na powierzchni limfocytów (patrz niżej) i przejawiały wyraźną supresję przy wyższych stężeniach badanego dimeru.

Interleukina-6 przejawiała przy wyższych stężeniach wyraźną tendencję do wyższych wartości, zależną od dawki. Ta cząstka jest bardzo ważna w hemopoezie, różnicowaniu komórek i odpowiedzi immunologicznej. W prowadzonym teście pierwsze trzy wartości musiały być ekstrapolowane, ponieważ najwyższy wzorzec odpowiadał 2000 pg/ml.

Wyniki dotyczące innych cząstek otrzymane w prowadzonych badaniach przedstawiono poniżej w tabeli 1. Odmiennie niż Interleukina-6, TNF-α zawarty był w supematantach hodowli w dramatycznie obniżonych stężeniach, za wyjątkiem dwóch ostatnich stopni rozcieńczenia, które okazały się nieskuteczne jeśli idzie o supresję stężenia TNF.

Tabela 1

Wpływ dimeru lizozymu na limfocyty krwi obwodowej człowieka

Nr	Próbka	HLA-Dr/CD3	EL-2 Rec	Ki-67/CD8	Ki-67/CD4
	kontrola	3,3	8,9	6,0	2,7
1.	1 mg/ml	2,2	2,6	4,8	5,3
2.	0,3 mg/ml	1,9	6,3	4,1	3,0
3.	0,2 mg/ml	3,0	6,1	6,5	(6,9)
4.	33 pg/ml	3,0	5,9	6,3	3,0
5.	10 pg/ml	3,4	6,0	7,7	3,7
6.	3,3 pg/ml	2,4	5,0	7,5	3,7
7.	1 pg/ml	2,5	4,9	7,0	4,1
8.	0,3 pg/ml	3,3	5,8	7,5	3,9
9.	0,1 pg/ml	2,8	4,0	7,9	3,8
10.	33 ng/ml	3,1	4,6	8,0	4,1

Wpływ dimeru lizozymu na limfocyty krwi obwodowej człowieka

Nr	Próbka	TNF	Kinaza tymidynowa	IFN-α
	kontrola	205,11	9242	4,97
1.	1 mg/ml	38,07	923	8,81
2.	0,3 mg/ml	17,19	10914	9,44
3.	0,1 mg/ml	13,75	7254	17,96
4.	33 pg/ml	36,11	9525	3,67
5.	10 pg/ml	22,22	5492	7,54
6.	3,3 pg/ml	54,91	5198	6,26
7.	1 pg/ml	18,47	5840	33,91
8.	0,3 pg/ml	14,47	6839	10,07
9.	0,1 pg/ml	94,16	3672	4,97
10.	33 ng/ml	172,46	7312	10,07

Kinaza tymidynowa mierzonajest w cytoplazmie limfocytowej po zamrożeniu i rozmrożeniu masy komórkowej. Kinaza tymidynowajest pobudzona do wzmożonej syntezy w dzielących się komórkach, co sprawia, że jest dobrym markerem proliferacji komórek. Dane z tabeli 1 wykazują że przy najwyższych badanych stężeniach dimeru lizozymu występuje tłumienie, a przy pozostałych rozcieńczeniach nie można stwierdzić żadnej wyraźnej tendencji. Z kolei interferon-α w tych samych warunkach przejawia wartości wyższe niż kontrolna wartość osiągana w przypadku samej konkawaliny A (ConA), w wyższych badanych stężeniach. Wyraźny wzrost jest widoczny przy przejściu od drugiej wartości do trzeciego rozcieńczenia.

176 407

Markery limfocytowe:

HLA-Dr/CD3, będący markerem histokompatybilności, podlega ekspresji na aktywowanych limfocytach T podczas reakcji immunologicznej. Otrzymane rezultaty wskazują na pewien procent aktywowanych komórek T w hodowli kontrolnej; przy różnych wartościach stężeń dimeru lizozymu w hodowlach obserwowane wartości zmieniają się lecz oscylują wokół wartości obserwowanej w hodowli kontrolnej.

Receptory IL-2 na limfocytach: Interleukina-2 jest cytokinąprodukowanąprzez limfocyty typu T-helper po aktywacji przez IL-2. Występuje IL-2 autokrynna i parakrynna. Limfocyty typu T-helper nie tylko produkująIL-2 lecz także sąpobudzane do proliferacji przez tę cząstkę. Receptory IL-2 na powierzchni limfocytów typu T-helper są pobudzone do wzmożonej syntezy pod wpływem aktywacji. Z danych tabeli 1 wynika, że przy najwyższych stężeniach dimeru lizozymu występuje wyraźna supresja receptorów IL-2 na limfocytach, zaś pozostałe wartości nie różnią się między sobą bardziej niż w granicach biologicznej szerokości pasma. Tabela 1 zawiera także dane dotyczące Ki-67/CD8 i Ki-67CD4. Ki-67 jest molekułąproliferacyjnąpojawiającąsię w komórkach ulegających mitozie. Ki 67 jest ważnym parametrem dla oceny stymulowanych komórek oraz w diagnozowaniu nowotworów. Z przedstawionych wyników widać, że lekkie inhibitowanie proliferacji komórek na podstawie komórek (CD8) supresji Ki-67+ przy najwyższych dwóch dawkach dimeru lizozymu. W limfocytach typu helper (CD4) przy najwyższym stężeniu obserwuje się istotny wzrost procentowy komórek dodatnich. Przy niższych dawkach procent komórek powodujących ekspresję Ki-67/CD4 jest nieznacznie wyższy niż w przypadku hodowli kontrolnej.

Wyraźna supresja TNF zilustrowana jest na rysunku fig. 1.

Parametry immunologiczne wymienione wyżej i wybrane ze względu na ich potencjalną doniosłość w odpowiedzi immunologicznej analizowano metodą opartą na testowaniu wpływu substancji badanej na limfocyty krwi obwodowej ludzkiej stymulowane suboptymalnie konkawaliną A (ConA), dobrze znan<ą o dużej czułości i pozwalającąna ocenę wielu różnych parametrów Przy pewnych stężeniach dimeru lizozymu wystąpiły wyraźne różnice badań w porównaniu z wartościami obserwowanymi dla limfocytów stymulowanych jedynie ConA, zaś w przypadku przykładowo TNF i INF-α obserwowano wyraźne efekty przy wszystkich badanych stężeniach.

Przykład II. Przeprowadzono badania laboratoryjne mające na celu ustalenie wpływu dimeru lizozymu na aktywność fagocytamą mleka i krwinek in vitro. Wcześniej ustalono, że w standardowych testach in vitro dimer lizozymu nie hamuje proliferacji mikroorganizmów wyizolowanych z zainfekowanych gruczołów mlecznych krów. Ponieważ w badaniach klinicznych stwierdzono, że dimer lizozymu przy podawaniu dowymieniowym i jednocześnie dożylnym eliminuje infekcję gruczołów mlecznych krów, stało się jasne, że antybakteryjnym mechanizmem w gruczołach mlecznych krów jest fagocytoza. Użyto zatem krwi i mleka krów zarówno zdrowych jak i zainfekowanych w testach in vitro mających na celu zbadanie wpływu dimeru lizozymu na fagocytozę. Dla porównania prowadzono badania z tą samą ilością badanej substancji i tym samym czasem inkubacji używając komórek wyizolowanych ze zdrowych i zainfekowanych krów, a nawet z zainfekowanych i zdrowych ćwiartek gruczołów mlecznych tej samej krowy w celu wyeliminowania różnic osobniczych w obserwowanych reakcjach.

Do badań użyto zarówno oczyszczonąpostać zdimeryzowanego lizozymujak i mieszaninę dimeru i niewielkich frakcji trimerów oraz wyższych oligomerów lizozymu. Substancje badane dodawano do krwi lub mleka zdrowych i zainfekowanych krów w stężeniach 25 - 0,25 pg/ml i inkubowano mieszaniny w 37°C przez 0,5-24 godzin. Procent komórek fagocytujących (indeks fagocytamy według metody Wiśniewskiego i wsp.) oraz procent granulocytówNTB-pozytywnych (według Park'a) oznaczano dla każdej próbki.

176 407

Dimer lizozymu wzmaga aktywność fagocytarną leukocytów w testach in vitro. Obserwowane wyniki zależne są od dawki oraz od czasu inkubacji. Wyższe stężenia dimeru lizozymu są konieczne do zaktywowania leukocytów w mleku niż do zaktywowania leukocytów we krwi. Nadmiernie wysokie stężenia dimeru lizozymu redukują aktywność fagocytarną in vitro. Wybrane wyniki doświadczeń - wykazujące, że zasadniczo jak długo mieszanina poreakcyjna nie zawiera cytotoksycznej formy monomerycznej lizozymu uzyskuje się wyniki porównywalne dla wysoko oczyszczonego dimerujak i dla mniej dokładnie oczyszczonej postaci dimeru - przedstawiono w poniższych tabelach 2 i 3, w których określenie “dimer lizozymu +” używane jest dla oznaczenia mieszaniny zawierającej niewielkie frakcje trimeru i wyższych oligomerów lizozymu, o których wspomniano wyżej.

Tabela 2

Wpływ dimeru lizozymu na aktywność fagocytarną leukocytów z mleka od zdrowych krów (stężenie dimeru 20 pg/ml, czas inkubacji 3 godziny)

Leukocyty z mleka zdrowych krów
Parametr	preparat	Krowa nr 477	Krowa nr 463
	kontrola	77,8	80,0
% fagocytozy	dim.er lizozymu+	100	100
	dimer lizozymu	92,6	100
	kontrola	2,7	4,1
indeks	dimer lizozymu+	4,4	6,4
fagocytamy	dimer lizozymu	4,8	8,4
	kontrola	3,4	2,5
% redukcji NBT	dimer lizozymu+	5,7	3,8
	dimer lizozymu	3,4	6,8

Tabela 3

Wpływ dimeru lizozymu na aktywność fagocytarną leukocytów z mleka od krów zainfekowanych (stężenie dimeru 20 pg/ml, czas inkubacji 30 minut)

Leukocyty z mleka krowy zainfekowanej (Nr 490)
Parametr	preparat	ćwiartka zakażona */	ćwiartka zdrowa
	kontrola	98	58
% fagocytozy	dimer lizozymu+	98	90
	dimer lizozymu	100	100
indeks	kontrola	10,9	2,7
fagocytarny	dimer lizozymu +	8,7	14,9
	dimer lizozymu	10,9	8,9
	kontrola	4,2	4,2
% redukcji NBT	dimer lizozymu +	5,9	8,4
	dimer lizozymu	5,5	7,0

*/ pomiary w momencie wystąpienia zakażenia krowa nieleczona

Z powyższego jasno wynika, że stopień oczyszczenia dimeru lizozymu nie ma istotnego wpływu na obserwowanąaktywność fagocytarnąleukocytów z mleka. Możejednak okazać się w dalszych badaniach, że komórkami efektorowymi mogą być granulocyty.

176 407

Daisze przykłady zawierają raporty z badań in vivo. W badaniach kiinicznych używano kompozycję zawierającą2 mg dimeru iizozymu w 10 mi roztworu PBS. Kompozycję tę oznaczono KLP-602.

Przykład III. Wykazano, że przy podawaniu dożylnym dimer iizozymu - KLP-602 stymuiuje aktywność aagoccyarnągranuiocytów krwi u zdrowych i chorych cieiąt oraz u zdrowych źrebiąt, jak również u krów miecznych po podaniu środka dowymieniowo. Skutek ten przejawia się poprzez zwiększone miano neutrofiii i zwiększoną zdoiność absorbowania gronkowców oraz redukowania NBT. Zj awisko to ma miej sce przede' wszystkim w czasie pierwszych 12-24 godzin po wstrzyknięciu środka. Wpływ KLP-602 na aktywność fagocytarną w wymieniu zaieży od dawki i postaci środka oraz od odpowiedzi osobniczej danego zwierzęcia.

Dimer iizozymu stosowany był w ieczeniu chorób zakaźnych u bydła, trzody chiewnej, koni i psów'. Badany środek podawany był w różnych dawkach i w różnych interwałach czasowych dożyinie, domięśniowo, podskórnie, dowymieniowo i domacicznie. Środek podano 346 krowom, 274 cieiętom, 110 maciorom i knurom, 294 prosiętom, 709 prosiętom nieodsadzonym, 35 źrebiętom i 107 psom. Grupy kontroine ieczone były metodami aiternatywnymi, żadne zwierzę nie zostało pozostawione bez ieczenia z uwagi na zagrożenie upadkiem. Tym nie mniej można czynić na podstawie przeprowadzonych badań wnioski porównawcze przyjmując za punkt odniesienia obraz kiiniczny ieczonych chorób znany z iiteratury weterynaryjnej.

Przykład IV. W badaniach przeprowadzonych na cieiętach mierzono poziom IFN i TNF we krwi u zwierząt zdrowych i zainfekowanych. Zwierzęta chore pozostawały bez ieczenia przez pierwsze 12 godzin infekcji, następnie były ieczone antybiotykami i dimerem iizozymu o wysokim stopniu oczyszczania. Uzyskane wyniki są graficznie ziiustrowane na rysunkach fig. 1 i 2 przedstawiających wyniki otrzymane dia TNF i IFN odpowiednio. Oba rysunki przedstawiają prawdziwe rezuitaty uzyskane u czterech indywiduainie zidentyfikowanych cieiąt. Na obu rysunkach iinia 1 odpowiada -wynikom uzyskanym dia zdrowego cieięcia. iinia 2 - dia cieięcia chorego i nieieczonego (wartość IFN w 12. godzinie równa 45 U/mi nie została pokazana, iecz na wykresie nachyienie iinii 2 odpowiada kierunkowi wyznaczonemu przez tę wartość), po 12 godzinie zwierzę poddano ieczeniu znaną metodą; iinia 3 - dia cieięcia ieczonego antybiotykami a iinia 4 - dia cieięcia ieczonego KLP-602.

W innym doświadczeniu, w grupie cieiąt ieczonych dimerem iizozymu - jedną iub dwoma iniekcjami KLP-602, wyieczono ponad 90% cieiąt cierpiących na nieżyt żołądkowo-jeiitowy oraz ponad 85% przypadków odoskrzeiowego zapaienia płuc. Typowe było szybkie ustąpienie objawów takich jak gorączka i biegunka. Leczenie badanym środkiem nie wymagało uzupełniania płynów ustrojowych. Czas i szybkość powrotu do zdrowia były iepsze niż w grupie kontroinej ieczonej antybiotykami.

Przykład V. KLP-602 był najskuteczniejszy w ieczeniu chorób trzody chiewnej. 100% iub niemai 100% zwierząt odzyskiwało zdrowie w następujących chorobach: poporodowa bezmieczność (syndrom MMA), czerwonka, ropne zapaienie macicy, grypa i zakażenia pałeczką okrężnicy. Podawanie badanego środka w przypadkach choroby obrzękowej o odoskrzeiowego zapaienia płuc miało mniej spektakuiarny skutek, iecz mimo to uzyskane wyniki były zdecydowanie iepsze niż wyniki uzyskiwane znaną metodą. Obserwowano szybkie ustąpienie biegunki (zwykie w ciągu pierwszych 24 godzin) i gorączki jak również powrót iaktacji - szczegóinie istotny w przypadkach poporodowego zapaienia wymienia i macicy (ratujący życie prosiąt). Skuteczność ieczenia KLP-602 w porównaniu z wynikami ieczenia aiternatywnego ziiustrowano poniżej danymi w tabeii 4.

Przykład VI. Przy stosowaniu ieczenia preparatem KLP-602 100% źrebiąt cierpiących na nieżyt jeiit oraz 83% źrebiąt z odoskrzeiowym zapaieniem płuc odzyskało zdrowie szybciej niż zwierzęta w grupie kontroinej ieczone tradycyjnie.

176 407

Przykład VII. Przeprowadzono próby zastosowania KLP-602 w leczeniu niektórych chorób u psów, takichjak zapalenie mieszków włosowych (100% wyleczeń), infekcje górnych i dolnych dróg oddechowych, oraz infekcje przewodu pokarmowo-trawiennego objawiające się biegunką. W tej grupie dominowała parwowiroza, o której wiadomo, żejest chorobąpraktycznie nieuleczalną Tym nie mniej w około 75% przypadków parwowirozy osiągnięto powrót do zdrowia.

W testach przeprowadzonych na zwierzętach dotkniętych przez choroby powstałe na skutek naturalnych zakażeń, opisanych wyżej, poczyniono szereg ważnych obserwacji:

1. Terapia okazała się skuteczna i bardzo prosta w leczeniu chorób o wieloczynnikowej etiologii i patogenezie (choroby tego rodzaju dominująw populacjach zwierząt hodowlanych i są trudne do zwalczenia, zwłaszcza w hodowlach, gdzie epidemiczne rozprzestrzenianie się chorób jest bardzo łatwe). Takie wyniki dowodzą modulacyjnego oddziaływania dimeru lizozymu na naturalne mechanizmy obronne.

2. Terapia okazała się skuteczna w chorobach, których naturalny rozwój może przebiegać przez etap wstrząsu endotoksycznego lub takich zaburzeń jak wysoka i długotrwała gorączka, wpływająca na stan zwierzęcia przez długi okres po powrocie do zdrowia jak to ma miejsce w przypadku koni (źrebiąt) hodowanych z przeznaczeniem do udziału w wyścigach i innych sportach oraz innych zwierząt hodowanych z przeznaczeniem dla przemysłu spożywczego, w przypadku których koszt chowu ma istotne znaczenie. Szybkie powroty do zdrowia oznaczać będą istotne obniżenie kosztów leczenia takich chorób.

3. Rezultaty obserwowane in vivo potwierdzają obniżony poziom TNF w różnych występujących naturalnie infekcjach leczonych dimerem lizozymu przez co potwierdza zastrzegane cechy wynalazku.

Przykład VIII. Badano wpływ dimeru lizozymu na aktywność antybiotyków w stosunku do różnych mikroorganizmów; w celu wyselekcjonowania bakterii do dalszych testów, ustalenia dawek antybiotyków najskuteczniejszych względem wyselekcjonowanych mikroorganizmów i ustalenia przedziału stężeń dimeru lizozymu, w którym można spodziewać się uzyskania zakładanych skutków. W tych badaniach posłużono się dwoma seriami liofilizowanego oczyszczonego dimeru lizozymu: j edna wyprodukowana w 1991 r, a druga wyprodukowana w 1992 r. W badaniach stosowano antybiotyki dostępne na polskim rynku, produkcji POLFY, polskiego wytwórcy środków farmaceutycznych, takiejak penicylina, neomycyna, erytromycyna, cefalosporyna (SEFRIL).

Antybiotyki brane do prób zawieszano w buforowanym roztworze NaCl (PBS - Biomed) lub w surowicy bydlęcej. Do zawiesiny dodawano następnie dimer lizozymu w taki sposób, aby w próbkach do badań jego stężenie w badanych próbkach wynosiło zawsze 5 pg/ml. Stężenia badanych antybiotyków były różne w każdej próbie z uwagi na różną wrażliwość stosowanych mikroorganizmów. Wpływ samego antybiotyku lub antybiotyku w połączeniu z dimerem lizozymu na Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus i Streptococcus uberis wyizolowane z chorych zwierząt badano in vitro stosując zawiesiny mikroorganizmu w PBS lub surowicy bydlęcej. Laboratoryjne szczepy Sarcina lutea 9341 ATCC i Staphylococcus aureus 209 P były także stosowane w eksperymentach.

Tabela 4

Zwierzęta leczone KLP	Zwierzęta leczone innymi środkami
Liczba przypadków	Czas (dni)	Uzdrowione	Nieuzdrowione	Liczba przypadków	Stosowany preparat	U	% Uzdrowień 1
liczba	%	liczba	%
I. Kolibacyloza u prosiąt
434	1-2	421	97	13	3	400*/	antybiotyki glukoza, witamina B	3-5	75-80*/

176 407 cd. tabeli 4

II. Czerwonka u prosiąt
29	1-2	29	100	-	-	219	antybiotyki STOLMED RIDOWET	5-9	75
III. Poporodowa bezmleczność
30	1-2	30	100	-	-	40*/	antybiotyki kortizon, sulfamidy	3-5	80*/
IV. Grypa prosiąt
38	1-5	38	100	-	-	200*/	antybiotyki (preparaty o przedłużonym działaniu)	3-9	60-80*/
V. Choroba obrzękowa -
82	1-3	78	95	4	5	120*/	antybiotyki penicylina, tetracyklina, witamina B, płyny + glukoza	3-6	6-*/

*/ dane przybliżone

Z uwagi na wstępny charakter prób każdy antybiotyk badano przeciwko 1,2 lub 3 różnym rodzajom bakterii w następujący sposób:

1. Przygotowanie płytek

Porcje 0,05 ml 18 godzinnej brzeczki hodowlanej badanego szczepu bakterii dodawano do 14 ml próbki wzbogaconego agaru (Biomed). Całość mieszano i wylewano na szalki o średnicy 10 mm. Po oziębieniu i zestaleniu agaru umieszczono na nim sterylne cylinderki i wypełniono je roztworem badanego antybiotyku.

2. Przygotowanie roztworów antybiotyków mg próbkę badanego antybiotyku rozpuszczano najpierw w PBS a następnie dodawaną niezbędną ilość tego roztworu do wcześniej określonej objętości PBS lub surowicy bydlęcej aby otrzymać stężenie antybiotyku w roztworze tak bliskie jak to możliwe wartości MIC (minimalnego stężenia inhibitującego); zawsze przygotowywano roztwory o trzech różnych stężeniach.

3. Przygotowanie roztworu dimeru lizozymu mg liofilizowanego dimeru lizozymu początkowo rozpuszczono w 10 ml PBS. Dalsze rozcieńczenia przygotowano stosując albo PBS albo surowicę bydlęcą. Rozcieńczone roztwory wprowadzano do roztworu antybiotyku przygotowanego w sposób wyżej opisany. Badano następujące kombinacje:

- antybiotyk/PBS

- antybiotyk/PBS + dimer lizozymu

- antybiotyk/surowica

- antybiotyk/surowica + dimer lizozymu

Stężenie antybiotyku było takie samo w każdym cylinderku; stężenie dimeru lizozymu wynosiło 5 pg/ml. Po napełnieniu cylinderków roztworami płytki pozostawiano w temperaturze pokojowej na dwie godziny a następnie hodowle inkubowano w temperaturze 37°C.

4. Odczytanie wyników i ocena aktywności:

Płytki wyjmowano z suszarki po 18 godzinach inkubacji i mierzono średnicę strefy hamowania wzrostu bakterii (brak kolonii) wokół cylindrów.

Nie zaobserwowano różnic w wielkości stref hamowania wzrostu bakterii wokół cylindrów z zawiesinami antybiotyków w PBS bez dodatku i z dodatkiem dimeru lizozymu w stężeniu 5 pg/ml. Wielkość stref hamowania była jednak zmniejszona wokół cylinderków wypełnionych zawiesiną antybiotyku w surowicy bydlęcej oraz powiększona wokół cylinderków wypełnionych

176 407 zawiesiną, antybiotyku z dodatkiem dimeru lizozymu w surowicy bydlęcej. Wielkość tych stref była większa niż stref wokół cylinderków wypełnionych zawiesinami w PBS oraz większa niż wokół cylinderków wypełnionych zawiesiną samego antybiotyku w surowicy bez dodatku dimeru lizozymu.

Opisane zjawisko wystąpiło w testach z penicyliną stosowaną przeciwko Sarcina lutea. Ampicylina wykazywała synergizm w połączeniu z dimerem lizozymu w hamowaniu wzrostu in vitro bakterii Escherichia coli, Salmonella enteritidis i Staphylococcus epidermidis. Zaobserwowano wzrost aktywności erytromycyny w obecności dimeru lizozymu w stosunku do Staphylococcus aureus 209 P i Streptococcus uberis, a także SEFRILu - przeciwko Staphylococcus aureus 209 P. Escherichia coli i Salmonella enteritidis były odporne na ten antybiotyk. Wzrost aktywności przeciwbakteryjnej badanych antybiotyków obserwowano jedynie wówczas, gdy jako rozpuszczalnik stosowano surowicę bydlęcą. Zasadniczo, wzrost aktywności wynosił średnio 50% ale w niektórych przypadkach obecność dimeru lizozymu powodowała 100% wzrost aktywności antybiotyku.

Wnioski:

Dimer lizozymu (bez konserwanta) w stężeniu 5 pg/ml przejawia in vitro synergizm z pewnymi antybiotykami stosowanymi w stężeniu MIC (minimalne stężenie inhibitujące) w obecności surowicy bydlęcej w hamowaniu wzrostu bakterii. Otrzymane dotychczas wyniki świadczą że istotne będzie dalsze prowadzenie badań.

Przykład IX. Synergizm z AZT w leczeniu pacjentów z AIDS

W niedawnym doniesieniu Ito i wsp. że TNF-α może antagonizować antywirusową aktywność AZT wobec wirusa HIV (M. Ito i wsp. “Tumor necrosis factor antagonizes inhibitory effect of azidothymidine on human immunodeficiency virus (HIV) replication in vitro” Biochem. Biophys. Res. Commun, 1990,166; 1095-1101). Pacjenci z AIDS w zaawansowanym stadium choroby ulegają licznym oportunistycznym infekcjom. Niektóre czynniki chorobotwórcze mogą indukować podwyższenie TNF-α, IL-6 i innych cytokin, które może mieć skutek immunosupresyjny albo może wzmagać replikację wirusa HIV.

Z tych względów leczenie samym AZT nie jest dostatecznie skuteczne. W celu zwiększenia przeciwirusowej aktywności AZT w stosunku do wirusa HIV proponuje się obecnie połączenie terapii opartej na AZT z podawaniem dimeru lizozymu w celu hamowania syntezy TNF czynnika antagonizującego przeciwwirusową aktywność AZT względem wirusa HIV.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca dimer lizozymujako substancję aktywna farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera dimer lizozymu w ilości 33 ng-10 mg/ml, korzystnie 0,001 -10 mg/ml, a zwłaszcza 0,01 -10mgmg/ml, ewentualnie w mieszaninie ze skuteczną ilością antybiotyku, przy czym w przypadku zawartości dimeru lizozymu w granicach 0,001 -10 mg/ml, a korzystnie 0,01 -10 mg/ml, kompozycja ta zawiera jako substancję aktywną zawsze dimer lizozymu w mieszaninie z antybiotykiem.
2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera dimer lizozymu zasadniczo wolny od monomerycznej, trimerycznej i oligomerycznej postaci lizozymu.
3. 3. Kompozycj a według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera dimer lizozymu w ilości 33 ng - 0,001 mg/ml.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako antybiotyk zawiera antybiotyk wybrany z grupy obejmującej penicylinę, neomycynę, erytromycynę, cefalosporynę.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że ma postać roztworu i zawiera dimer lizozymu w ilości zapewniającej oddziaływanie dimeru lizozymu na komórkę mikroorganizmu w stężeniu 5 pg/ml.
6. 6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jest dostosowana do podawania w jednej lub kilku dawkach 0,02 mg/kg masy ciała.
7. 7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ma postać roztworu do iniekcji, odpowiedniego do podawania dożylnego.