PL160027B1 - Sposób jednoczesnego otrzymywania kwasu cytrynowego i kwasu izocytrynowego PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób jednoczesnego otrzym ywania kwasu cytrynowego i kwasu izocytrynowego z podloza produkcyjnego zawierajacego glukoze, droga biosyntezy z wykorzystaniem kultur droz- dzy, znamienny tym, ze biosynteze prowadzi sie kultura szczepu Yarrowia lipolytica A-101. PL

Description

Przedmiotem wynalazku Jest sposób Jednoczesnego otrzymywania kwasu cytrynowego i kwasu izocytrynowego z surowców zawierających glukozą.

Znane są sposoby otrzymywania kwasu cytrynowego z czystej glukozy przy udziale drożdży w hodowlach periodycznych 1 różnych systemach ciągłych. Jednym ze znanych sposobów jest produkcja kwasu cytrynowego przez szczep Saccharomycopsis lipolytica 0 1805 (w 1982 roku nazwa gatunkowa Saccharomycopsis lipolytica zmieniona została na Yarrowia lipolytica). Szczep ten zdeponowany Jest w Institut National de Recherche Agronomiąue w Paryżu. Produkcją przy udziale tego szczepu prowadzi sią w 5-cio litrowym fermentorze zawierającym 2 litry podłoża pro^du^kcyjne^go o s^kła^dzie: ^(gl^{-1) NH}^N^Oj - 5^,0; KH^jPO^ - ^A,0; M^gS^O^ x 7 HjO - ^2,0^; EeS^O4 x 7 ^0 - 0,1; MnSO* - 0,052; tiamina - 0,0002; glukoza - 100,0. W czasie fazy produkcji kwasu cytrynowego periodycznie dodaje sią roztwór glukozy. W czasie 200 godzin prowadzenia hodowli, przy pozⁱomⁱe ^biomasy ¹⁹ .gl¹, otrzymuje si^{ą 95 g}l^{-1 k}wasu cytrynowe^go ¹ 10 gl^{1 k}wasu ⁱzocytrynowe^go. ^Hła^ścⁱaa sz^ybko^{ść p}ro^du^kcji ^kwas^ów c^ytr^ynow^ych wynos^{i 0,}0^{Al h}*\ w^ydajno^ść sumy ^kwas^ów w^ynosi Y » ^{0,75 gg-1} (Uriffaud ^J., ^En^gesser ^M^ ^Biotec^hno^lo^gy Bioeng^eeMn^ 1^979, 21, S.20B3).

Znany Jost również sposób ciągłej produkcji kwasu cytrynowego z glukozy w bloreaktorze z recyrkulacją komórek drożdżowych przez szczep Saccharomycopsis lipolytica NRRL Y 7576 (depozyt: Northern Reglonal Research Laboratories, Peoria, USA). Szczep ten produkuje w tym systemie ^kwas cytr^ynowy i ^kwas ⁱzocytr^ynowy z wła^ściwą sz^ybkości^{ą 0,}04^{5 h} prz^y w^ydajności ^Y = ^0,86 g^g_l. W odbieran^ym ^płynie ^po^ho^dowlanym s^tężenⁱe ^kwas^ów w^ynos^{i 75} g^l\ prz^y czym 70¾ masy stanowi kwas cytrynowy. Szybkość produkcji kwasów cytrynowych Jest stała przez ponad 200 godzin prowadzenia procesu. W hodowli stacjonarnej szczep ten charakteryzuje sią po^dobną akt^ywności^ą kwasotwórczą ^0,044 h'\ ^które o^bniża s^{ią gdy} stąpnie ^kwas^ów osiąga 1O^{5 gl_l}. (Enzminger J.D., Asejno J.A. Bⁱo^techno^log^y ].etters, 19^86, B s. 7-12).

W innym znanym sposobie produkcji kwasu cytrynowego z glukozy szczep Candida Lipolytica EH 59, nazwa gatunkowa tego szczepu również została zmieniona na Yarrowia lipolytica (depoz^{yt: I}nstitut fur Technische Chemie w L^sku^ tworz^{y d}o 120 gi ^kwasu cytrynowego ⁱ kwasu izocytrynowego, z czego 77¾ masy stanowi kwas cytrynowy. Właściwa szybkość produkcji tych kwas^ów w^ynosⁱ 0,1 ^h* ^prz^y w^yda^jno^śc^{i Y} = ⁰,^{9 gg (}S^tottmeis^ter ^Zeⁱtsc^hr^{ift f}u'r Allgemeⁱⁿe

Microbiologie, 1979, 19,10, s. 763).

Sposób według wynalazku polega na Jednoczesnym otrzymywaniu kwasu cytrynowego 1 kwasu izocytrynowego w podłożu produkcyjnym zawierającym glukozą, przy pomocy szczepu drożdży Yarrowia lipolytica A-101. Korzystnie Jest gdy podłoże produkcyjne zawiera glukozą techniczną lub hydrol glukozowy, który Jest produktem ubocznym wytwarzania glukozy metodą enzym 160 027 enzym, zawierającym przeciętnie 37 - 40% glukozy, a podłoże produkcyjne szczepi 9lę 48-godzinną hodowlę lnokulacyjną szczepu Yarrowia lipolytlca A-101 w ilości 5 - 10% objętościowych w stosunku do podłoża produkcyjnego. Szczep Yarrowia lipolytlca A-101 został wyizolowany z gleby pochodzącej z terenu myjni samochodów we Wrocławiu przez twórców wynalazku i zidentyfikowany. W badaniach taksonomicznych hodowli szczepu A-101 zastosowano metody zalecane przez Kreger van Rij w The yeast. A taxonomlc study”, III wyd., Elsevier Science Publishers Amsterdam, 1984. Charakterystyka hodowlana, morfologiczna i fizjologiczna szczepu A-101 odpowiada standardowemu opisowi dla gatunku Saccharomycopsis lipolytlca w The yeast.

A taxonomic study”, wyd. III pod redakcją Kreger van Rij str. 406-408. Wcześniej gatunek ten był opisywany Jako Endomycopsl9 lipolytlca, którego niedoskonałą formą Jest Candida lipolytica. Obecnie zalecaną nazwą Jest Yarrowia lipolytlca, pozycję systematyczną tego gatunku ustalili van der Walt i von Arx (Antonie van Leeuwenhoek, 1980, 46, 317-321).

Podczas wzrostu na ekstrakcie maltozowym 10*81g pączkujące komórki szczepu A-101 są owalne i mają średnicę 2,3 - 6,2 x 5 - 7,5 mikrometrów. Na agarze ziemniaczanym wyróżniają się: pseudogrzybnia i grzybnia właściwa. Obecne są blastospory układające się w małe łańcuszki. Artospory nie są obecne. Po miesiącu na agarze maltozowym rysa Jest kremowa, wilgotna, miękka, silnie zbrużdżona. Szczep A-101 jest aneuploidem lub diploidem nie wykazującym askosO porulacji. Poziom ONA w komórkach w zakresie 1,25 - 1,38 mlkrogramów dozoksyadenozyny 10° komórek jest blisko 2-krotnie wyższy w porównaniu do standardowych haploidów gatunku Candida lipolytlca (Gaillardin C.M., Charoy V., Heslot H.,: Arch. Microbiol., 1973, 92, 69-83). Szczep A-101 nie fermentuje cukrów. Asymiluje w charakterze jedynego źródła węgla: galaktozę, D-rybozę, erytrytol. rybitol, 0-mannitol, kwas cytrynowy, bursztynowy. Nie asymiluje: sacharozy, maltozy, celobiozy, trehalozy, laktozy, rafinozy, skrobi rozpuszczalnej, 0-ksylozy, L-arabinozy, 0-rybozy, L-ramnozy, inozytolu. Dodatkowo asymiluje n-alkany o długości łańcucha od C^^ do Cjg, n-alkeny, tłuszcze roślinne, etanol, glicerol i kwas octowy. Nie rozkłada arbutyny, nie korzysta z azotanów jako Jedynego źródła azotu. Wymaga Jako witamin tylko tiaminy. Rośnie przy stężeniu 4% etanolu, toleruje 15% NaCl w środowisku. Nie wykazuje wzrostu przy 37*C.

Szczep A-101 wyróżnia się od innych producentów kwasu cytrynowego znanych z literatury większą wydajnością i szybkością właściwą tworzenia kwasu w syntetycznych podłożach glukozowych, na melasie buraczanej i hydrolu glukozowym. Wykazuje zdolność wydajnej produkcji ^kwasów cy^trynowyc^h (Y^ - ^1,14 - 1^,28 ^gg_1) na oteju rze^pal<owym ^gdy inne szczep^y gatu^nku ^Yarrowⁱa Hpol^Hca gorzej rosn^{ą i} produkuj^{ą k}was^y z w^ydajności^ą nie ^prze^kraczaj^ącą ^{0,5 gg-1} na tym 1 podobnych olejach o wysokiej liczbie jodowej (J.Ferment. Technol., 1975, 53/10/, 752; Nippon Nogeikagaku Kaishi, 1969, 43, 154).

Szczep Yarrowia lipolytlca A-101 jest zdeponowany w kolekcji drożdży Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Akademii Rolniczej we Wrocławiu.

Podłote pro^du^kc^yjne stenowi ^poż^yw^ka s^ynte^tyczna o składzie: (^gl_1) ^glu^koza teciinkzna 150-250 lub hydrol glukozowy 350-550; NH^Cl 1 - 3; KH₂P0₄ 0,2 - 1,0; MgSO^ x 7 H_?0 0,5 - 1,0; ekstrakt drożdżowy 0,5 - 1,0; woda wodociągowa do 1 litra. Hodowlę prowadzi się w systemie okresowym lub okresowym z zasilaniem w temperaturze 28 - 30*C, przy pH 5,0 - 5,5 automatycznie regulowanym przy pomocy 10 n NaOH. Natlenienie utrzymuje się w zakresie 80 - 40% stanu nasycente ⁰9. ^W c^iągu ⁹⁶ - ^{144 g}c^dzin o^trz^ymuje s^ię 90 - ^{130 gl_1} jednowodnego ^kwasu cytr^yl -i nowego i 7 - 12 gl kwasu izocytrynowego w formie wolnej i związanej w postaci soli sodow^yc^h. ^Ja^ko pro^du^kt utioczn^y o^trz^ymuje s^{ię 13} - ^{18 g}l¹ suc^hych drożiJż^ zawleraj^ąc^yc^h 20 25% białka w suchej masie, które mogą być przeznaczone na paszę.

Sposób według wynalazku w porównaniu ze znanymi sposobami charakteryzuje się znacznie większą szybkością produkcji kwasów cytrynowych z glukozy, przy podobnej lub większej wydajności produktu. Ponadto, stosowanie szczepu Yarrowia lipolytlca A-101 umożliwia produkcję

160 027 kwasów cytrynowych przy wysokich stężeniach glukozy w podłożu produkcyjnym sięgającym 250 gl'¹.

Przykład I. Pomoże ^oł^acyjne o objętości ⁵⁰⁰ ml zawierające: (gl^-1) glukoza - 60,0; NH^Cl - 6,0; KH^PO^ - 0,5; MgSO^ x 7 H?O - 1,0; ekstrakt drożdżowy - 1,0; CaCOj - 40,0; woda wodociągowa - do 1,0 litra, zaszczepia się drożdżami Yarrowla lipolytica A-101 i prowadzi hodowlę przez 48 godzin w kolbie płaskodennej o objętości 2000 ml, w temperaturze ²8*^C na w^ytrz^ęsaczu ro^tac^yjn^ym przy 1⁶° ot>r. x min^-1. ^Hodow^la ta stanowi materiał szczepienny właściwej hodowli produkcyjnej, którę przeprowadza się w 10-litrowym fermentorze^, zaw^rającym ^{5 lit}r^ów poroża ^pro^du^kc^yjne^go o slcła^^: (gl*¹) ^glu^koza - w^yj^ściowe stężenie 130; NH^Cl - 3,0; KH?PO^ - 0,5; HgSO^ x z H?O - 1,0; ekstrakt drożdżowy - 1,0; woda wodociągowa - do 1,0 litra. Oo utrzymywania pH środowiska hodowlanego na poziomie 5,5 stosuje się 10 n NaOH. M trakcie procesu utrzymuje się stałą temperaturę 28*C, natlenienie środowiska na poziomie 50¾ stanu nasycenia 0. oraz periodycznie dozuje się 80¾ roztwór glukozy do uzyskania stężenia 250 gl w odniesieniu do początkowej objętości 5 1 pożywki. Po 144 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy objętość hodowli wzrasta do 6,2 1 z tytułu ^zasilanⁱa rozporem ^glu^koz^{y i ł}ugiem do nau^aHzacji. W ¹ 1 poż^yw^ki o^trz^ymuje s^ię I2^{3 gl-1 j}ednowodnego kwasu cytrynowe^go ¹ 12 ^{gl_1 k}wasu lzocytr^ynowe^go w formie wo^lnej i zwi^ązanej w pos^tacⁱ soU sodow^ych oraz ^do^da^tkowo ^{15 g}l^-1 suc^hych droż^dż^y. ^Pro^dukcja kwas^ów rozpocz^yna się po zakończeniu logarytmicznego wzrostu drożdży, początkowa szybkość właściwa tworzenia ^się ^kwas^ów jest wysoka ⁱ w^ynos^{i 0,}19 - ^0,122 ^h*\ potem stabiHzuje si^ę na ^poziomie ^0,098 h¹ 1 p^rzy końcu tiodowH o^bn^iża s^{ię d}o ^{0,06 h_1}. V^ydajnoś^ć sumy ^kwas^ów w przeoczeniu na z^uż^yt^ą glu^kozę wynos^{i 0,88 gg-1,} w^ydajnoś^{ć bi}omas^y wynosi ^{0,42 gg-1}.

Przykład II. Hodowlę lnokulacyjną prowadzi się w temperaturze 30*C przez 48 g^odz^ na wytrzęsaczu ro^tac^yjn^ym przy sz^ybko^ścⁱ 160 obr. x min.*^1, w ²⁵⁰ ml Itolb^ Erlenmeyera zaw^rającej ⁵⁰ ml ^podło^ża ^o^lacy^ego o składzie.· ^(gl^{-1) hyd}rol ^glukozow^y 120,0; NH^Cl - 2,5; KH2P04 - 0,5; MgSO* x 7 H?0 - 1,0; ekstrakt drożdżowy - 1,0; CaCOj 20,0; woda wodociągowa - do 1,0 litra, przy czym pH równym 5,5. Hodowlą tą szczepi się pod^łoZ^e produkcyjne o s^kła^dzⁱe: ^{(gl-1) hyd}rol ^glukozow^y - ³50^,0; NH^Cl - ^3,0; KH?PO* - 0^,2^; MgSO* x 7 HjO - 1,0; ekstrakt drożdżowy - 1,0; woda wodociągowa - do 1 litra. Właściwą hodowlę produkcyjną prowadzi się w 1-litrowym fermentorze, zawierającym 0,8 litra podłoża, przy temperaturze 29*C, i przy pH równym 5,5 utrzymywanym za pomocą 10 n NaOH oraz natlenieniu w fazie produkcji kwasów równym 60¾ stanu nasycenia 0-. Po 96 godzinach uzyskuje się _-1 _-1 *

90,4 gl jednorodnego kwasu cytrynowego i 7,0 gl kwasu izocytrynowego, w formie wolnej 1 zwⁱązanej w postać soO so^dow^ych. ^nad^ o-trzymuje się I^{3,5 gl-1} such^ych ^droŻ^dŻ^y z w^{y dajn}oścⁱą ^{γ a} 0,^{38 gg-1}. ^Wydajnośó ^bios^yn^tez^{y k}was^ów cytrynow^yc^h w^ynos^{i 0,9 gg-1}. dłaśc^a ^szybkoś^ć pro^du^kcj^{i k}was^ów w^ynosⁱ 0^,U ^h** ⁱ u^trz^ymuje s^{ię p}rzez cały czas ^prowa^dzenⁱa ^hodowli.

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób jednoczesnego otrzymywania kwasu cytrynowego i kwasu izocytrynowego z podłoża produkcyjnego zawierającego glukozę, drogą biosyntezy z wykorzystaniem kultur drożdży, znamienny tym, że biosyntezą prowadzi sią kulturą szczepu Yarrowia lipolytica A-101.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że substratern do biosyntezy

   Jest glukoza techniczna lub hydrol glukozowy.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do podłoża produkcyjnego dodaje sią 3 - 10¾ objętościowych hodowli inokulacyjnej, w stosunku do ilości podłoża.

   A. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podłoże produkcyjne szczepi sią AB-godzinną hodowlą inokulacyjną szczepu.

   ·«·