PL167668B1

PL167668B1 - Sposób wytwarzania mieszaniny N,O-siarczanów heparosanów PL PL PL

Info

Publication number: PL167668B1
Application number: PL91292624A
Authority: PL
Inventors: Jean C Lormeau; Bruno Chevallier; Marc L V Salome; D Estais Guy E M Tenaille
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1990-12-03
Filing date: 1991-12-03
Publication date: 1995-10-31
Also published as: PT99671B; ES2099145T3; SI9111886B; CA2056878A1; DK0489647T3; FR2669932A1; KR100214752B1; MX9102353A; AR248429A1; SI9111886A; NZ240838A; AU8836191A; IE914197A1; US5550116A; YU48680B; NO914751D0; FI103050B1; TW216396B; FI103050B; DE69125109D1

Abstract

1. Sposób wytwarzania mieszaniny N ,O-siarczanów heparosanów, skladajacej sie z lancuchów lub miesza- niny lancuchów o masie czasteczkowej 1500-15000, cha- rakteryzujacych sie powtarzajaca sie struktura dwusa- charydowa o wzorze 1, w którym E oznacza, w 0-80% wymienionych jednostek dwusacharydowych N ,O-siarcza- nów heparosanów, grupe acetylowa, a w pozostalych jednostkach dwusacharydowych grupe siarczanowa i ewentualnie atom wodoru, G oznacza atom wodoru lub grupe siarczanowa, ewentualnie w postaci ich farmaceu- tycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, ze w pier- wszym etapie poddaje sie hodowli szczep Escherichia coli (K5), nastepnie otrzymany w pierwszym etapie N-acetylo- heparosan, skladajacy sie z lancuchów lub mieszaniny lancuchów o masie czasteczkowej 1500-15000, charakte- ryzujacych sie powtarzajaca sie struktura dwusachary- dowa o wzorze 2, w drugim etapie wyodrebnia sie i pod- daje oczyszczeniu, ewentualnie z zastosowaniem oczysz- czania wstepnego, po czym, w trzecim etapie, tak otrzy- many oczyszczony N-acetyloheprosan poddaje sie czes- ciowej dezacetylacji przez reakcje z czynnikiem dezacety- lujacym, a nastepnie zdezacetylowany heparosan, sklada- jacy sie z lancuchów lub mieszaniny lancuchów o masie czasteczkowej 1500-15000, charakteryzujacych sie powta- rzajaca sie struktura dwusacharydowa o wzorze 3, w którym R' oznacza, w 0-80% jednostek dwusacharydo- wych, grupe acetylowa WZÓR 1 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mieszaniny nowych N,O-sizacranów heparosanów. Związki te mają działanie terapeutyczne.

Wiadomo, że glikozzminoglikann są produktami podatnymi na ekstrahowanie ich z tkanek zwierząt. Niektóre z tych glikozaminoglikanów mają własności antykozgulacyjae i bardzo interesujące własności paześiwzakrzepowe. Typowymi produktami z tej rodziny są heparyna, jej fragmenty i jej pochodne, jak również siarczan heparanu i siarczan dermzSzau, które jednakże mają tę niedogodność wynikającą z ich pochodzenia, że są bardzo drogie.

W szczególności wiadomo, że aizaśzzn dermatanu należy do rodziny polimerów o zmiennym stopniu polimeryzacji, utworzonej z powtarzających się jednostek składających się z grupy kwasu uranowego (iduronylu lub glukoranylu) i z grupy aceSylosulfonylo-4-galakSoazzminylu [H. W. Stuhlsatz „The Meshodology of ConneśSive Tissue Research (1976), 137-146].

Naturalny siarczan deamztanu ma ciężar cząsteczkowy w zakresie 20.000-40.000. Produkt ten jest szczególnie interesujący jako środek antykoagulaśyjay i przeciwzzkazepnwn (F. Feanaadez i wsp. Baitiah Jnuanal of Haematology/1986/, 64, 309-317).

Z drugiej strony wiadomo, (I. Bjork i U. Lindahl, „Molecular and Cellular Biochemistiy /1982/, Dr. W. Junk Publishers Holandia), że koagulacja krwi stanowi zjawisko fizjologicznie złożone, którego mechanizm może być przedstawiony schematycznie i zreasumowany w sposób przedstawiony na załączonym schemacie.

Niektóre bodźce, takie jak aktywacja kontaktowa i czynniki tkankowe wyzwalające sukcesywną aktywację szeregu czynników koagulacji obecnych w plaźmie krwi oznaczone są cyframi rzymskimi na powyższym schemacie a obecność wskaźnika oznacza formę aktywną (wskaźnik obecny) lub nieaktywną (wskaźnik nieobecny) czynnika danej koagulacji.

Jakikolwiek bądź jest charakter bodźca, etapy końcowe są jednakowe: czynnik Xa aktywuje czynnik II (nazywany również protrombiaą), który w swojej postaci aktywnej (czynnik Ila nazywany również trombiną) wywołuje częściową proteolizz rozpuszczalnego fibannnuenu z uwolnieniem nierozpuszczalnej fibryny, głównego składnika zakrzepu krwi.

W warunkach fizjologicznie normalnych regulujące białka takie jak aatySrombina III (AT III) i kofaktor II heparyny (HC II) również są obecne w plaźmie.

AnSySrombiaa III wywiera działanie hamujące na zespół czynników koagulacji oznaczonych gwiazdką (*) na powyższym schemacie. Hamowanie to jest wzmocnione w bardzo silny sposób w obecności heparyny lub oligosacharydów z syntezy typu heparynowego (D. H. Atha i wsp. Bi_och_emi_a, /1985/, 24, 6723-6729).

167 668

Kofaktor II heparyny wywiera wpływ inhibitujący tylko na czynnik Ila (trombinę), który katalizuje ostatni etap koagulacji. Ta aktywność jest w sposób istotny wzmożona w obecności heparyny lub siarczanu dermatanu (D. M. Tollefsen, J. Biol. Chem. /1983/, 258, 6713-6716).

Hamowanie czynnika Xa lub czynnika IIa stanowi pośrednie uprzywilejowanie dla uzyskania działania antykoagulacyjnego i przeciwzakrzepowego, ponieważ te dwa czynniki pośredniczą w dwóch ostatnich etapach koagulacji, które są niezależne od bodźca wyzwalającego.

Dla uzyskania hamowania samego czynnika IIa szczególnie interesująca możliwość polega na wykorzystaniu specyficzności kofaktora II heparyny i na poszukiwaniu wzmocnienia jego aktywności hamującej. Siarczan dermatanu jest produktem znanym posiadającym bardziej skuteczną wzmocnioną aktywność tego typu.

Wiadomo jest również, że zestaw składników głównego łańcucha heparynowego sporządza się w dwóch etapach. Najpierw przeprowadza się biosyntezę heparyny z prekursora proteoglikanowego, którego część sacharydowa składa się z rodziny polimerów o różnym stopniu polimeryzacji, utworzonych z powtarzających się jednostek /J-D-glukuronylo-1,4-cr-N-acetylo-D-glukozamylowych-(1,4) (jednostki dwusacharydowe) o masie cząsteczkowej 379. Ta część sacharydowa zwykle nazywana jest N-acetyloheprosanem (J. Navia, Anal. Bioclh^r^m,/1983/, 135,134-140). Ten pierwszy etap biosyntezy jest jedynym momentem gdzie naprawdę można mówić o jednostkach dwusacharydowych, ponieważ drugi etap biosyntezy będzie modyfikował ten szkielet w sposób głęboki (L'heparine, fabrication, structure, proprie'te's, J. P. Duclos,/1984/str. 81-83, Masson Ed. -Francja).

W rezultacie heparyna naturalna, otrzymana z biosyntezy jest polisacharydem składającym się z cząstek kwasu glukuronowego i kwasu iduronowego (kwasy uronowe) ewnetualnie w postaci siarczanu w pozycji 2, zasocjowanego z cząsteczką glukozaminy, mającego ewentualnie w pozycji 6 grupę siarczanową a przy aminie w pozycji 2 grupę siarczanowaną lub acetylową.

Struktura heparany może być statystycznie przedstawiona wzorem 4, w którym A ozancza H i SO 3, B oznacza SO₃ i COCH3, zaś n oznacza liczbę całkowitą w zakresie 20 i 30, co odpowiada ciężar owi cząsteczkowe mu 120(00-18000 (EP-A-0116801).

Wyrażenia H i SO~3 oraz SO 3 i COCH3 stosowane odpowiednio w odniesieniu do podstawników A i 13, wakozuż^{O 0}e w powyższyęh ⁰⁰-3° jedanstkac^o dwusacharydowych, /o w ^dewnych przypadkach oznaczą wo d^w r, a w isnych przypadkach grupę oraz arnlogiczn^te B w więkpzośd prz^adków ocnwcza SO^_3 a cc mnydi przyjradkach grapę acetylową.

Talk sanM wiⁿuoa^se przedstawione d^tyktem we wzorze ^u ozαpsza^{j w}e grupa COO^_, w 20-30 jednostaach dwnsąz^αary^pow^yeh w nicktⁿuyę^{p o}rzyⁿa^dkac^a ma kon^utaot^- przcdstawioną wzorem 5 (^pcn. kwasu D-gⁱukuroPhwu^oo), ó w wi^cksęo^cai a jednoko. konfi^iracj^e p3cddrtawioną wzor5m ^a (tan. kwasu L·i^pclonowe^go).

^wot em Ircp ar^a i je- frcgjdrdt^o takie jak otrzymywane różnymi metodami depolimeryzacji są makrocząst-czkawu caw^jerająoyrdi ę3c^kwaαZednośtki Icwcsu Odgromowego jalc ^sCednostki lewasu i^dczsoowego.

Nktoore metody depolimeryzacji pozwalają na uzyskiwanie fragmentów heparyny o ciężarze cząstece^p3w^o m w ry^ęresie 2°°0-%0^{ζ u} o ttn^c>niu siαrczynowαnⁱo w^kse.m w -o najmętej 20% o^{0 p}z^uasya^p wyś^sc^tnwe1. Tski e ^rprzeriarc zasowcnu “ he^paccoⁿ w^iawi zą w og^^emu patj ntowym as EP-A-0 1 ^8^ i dla Zednostek uranowych pasiadaj. wyżsi wymiwnione i^iu stauktuwy o wzorp-A 5 i 6.

W.adomo również, że niektóre bakterie z gatunku Escherichia coli produkują polisacharydy toreb^Aowats, zwykk nuzywazt mtygemm K5, korne stanowią roolzm¹ ^limąraw zto.nną w jjowtarzwjący c^z si^p jednośtyk ^s0tDs³lo⁰csonylo-^t,4-rl-Ns3CCtylo-D-glokozamy^jow^óch-t^łj4), (W. R Vann ^j węp. Euu. J. Rocfcm., DI⁰¹^ HE 3^-364).

^wolis aw^ryd ie j, o tym samym 9hara⁶6erze ch3mic znym co część polisacharydowa proteoglikanowego p-cSwasosa a3worelm, itacywany tutaj -odzie N-occty1aUepcrosap-mi yraduCl ten ma picCow oząs taczPowo w -opciśd: 1 0⁵ tę· 1OŚ t ua poęiomie jednośtrh kwara neonowego, ztrudtorc cardzo wioń onp Witącznie z kwasu D-aioOuoaoywego ( W. F. Vann i wopEur. J.

Oloaarm._t 0980), lio oraz ogtoz—n-c pstotazwe EP-A-o 333.43).

668

W zgłoszeniu patentowym EP-A-0 333 243 opisano O-siarczanowany polisacharyd K5 jak również niektóre jej fragmenty złożone wyłącznie z 4, 6 lub 8 jednostek „cukrowych również O-siarczanowane. Produkty te mają działanie antyangiogeniczne i przeciwnowotworowe o korzystnym stosunku tych aktywności w stosunku do własności antykoagulacyjnych. W dokumencie tym opisano również fragmenty N-acetyloheparosanu złożone odpowiednio z 4, 6, 8 lub 10 jednostek „cukrowych.

W europejskim opisie patentowym nr 333 243 opisano również pentasacharyd mający strukturę O-siarczanowego N-acetyloheparosanu sporządzany drogą całkowicie chemicznej syntezy.

Stwierdzono, że N,O-siarczany heparosanów o różnym ciężarze cząsteczkowym w zakresie 1500-15000 mają działanie antykoagulacyjne w stosunku do kofaktora II heparyny oraz aktywność anty-Xa bardzo podwyższoną.

N,O-siarczany heparosanów wytworzone sposobem według wynalazku różnią się więc od innych produktów już opisanych w literaturze swoją oryginalną strukturą, zwłaszcza ich stopniem siarczanowania (posiadają grupy siarczanowe również przy grupie aminowej glukozaminy) i swoimi własnościami farmakologicznymi. Między innymi posiadają mocniejsze działanie antykoagulacyjne wobec kofaktora II heparyny (HCII) niż siarczan dermatanu i mają bardzo interesujące własności farmakokinetyczne. W rezultacie produkty wytwarzane sposobem według wynalazku, które są produktami otrzymywanymi za pomocą syntezy w połowie chemicznej, posiadają działanie farmakologiczne glikozaminoglikanów obecnie stosowanych w lecznictwie, zwłaszcza heparyny i mogą być stosowane do regulowania koagulacji, a bardziej szczegółowo, mogą znaleźć zastosowanie jako środki przeciwzakrzepowe.

N,O-siarczany heparosanów otrzymywane sposobem według wynalazku składają się z łańcuchów lub mieszaniny łańcuchów o ciężarze cząsteczkowym w zakresie 1500-15000 i charakteryzują się powtórzoną strukturą dwusacharydową o wzorze 1, w którym E oznacza w 0-80% jednostek dwusacharydowych wymienionych N,O-siarczanów heparosanów, grupę acetylową a w pozostałych jednostkach dwusacharydowych grupę siarczanową i ewentualnie atom wodoru, G oznacza atom wodoru lub grupę siarczanową; mogą one ewnetualnie występować w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Stopień siarczanowania N,O-siarczanów heparosanów wyrażony stosunkiem grup siarczanowych do karboksylowych korzystnie wynosi 1,5-3,0.

N,O-siarczany heparosanów wytwarzane sposobem według wynalazku mogą składać się z identycznych łańcuchów polisacharydowych o ściśle określonym ciężarze cząsteczkowym usytuowanym w przedziale 1500-15000. Mogą one również składać się z mieszaniny łańcuchów o różniącym się ciężarze cząsteczkowym, których ciężary cząsteczkowe zawarte są w zakresie 1500-15000. Rezultat ciężarów cząsteczkowych tych łańcuchów może mieć większe lub mniejsze znaczenie. W rezultacie otrzymane N,O-siarczany heparosanów mogą składać się z łańcuchów mających między sobą różnicę ciężarów cząsteczkowych maksymalnie około 13500, lub przeciwnie z łańcuchów mających między sobą różnicę ciężarów cząsteczkowych tylko około 300, co odpowiada jednostce o strukturze uronowej (kwas D-glukuronowy i jego pochodne) lub o strukturze glukozaminowej. Oczywistym jest również, że zależnie od składników każdego N,O-siarczanu heparosanu, ciężar cząsteczkowy łańcuchów mających bądź najmniejszy ciężar cząsteczkowy, bądź największy ciężar cząsteczkowy, może odpowiadać dowolnej wartości zawartej w zakresie 1500-15000.

Stosowane powyżej określenie „G oznacza atom wodoru i grupę siarczanową wskazuje, że G w jednostce dwusacharydowej oznacza dla pewnych pozycji atom wodoru, a w pozostałych grupę siarczanową. Tak samo E w niektórych jednostkach dwusacharydowych oznacza grupę acetylową, a w pozostałych jednostkach grupę siarczanową lub ewentualnie atom wodoru. Zatem jednostki dwusacharydowe N,O-siarczanów heparosanów nie wszystkie są identyczne.

Wzór 1 oznacza powtarzającą się strukturę dwusacharydową utworzoną z jednej jednostki glukozaminowej i jednej jednostki kwasu D-glukuronowego. Wymienione jednostki mogą być przedstawione, bardziej szczegółowo, jeśli przyjmie się, że struktura dwusacharydowa o wzorze 1 jest powtórzona n razy, to jednostka nieredukująca łańcuchów może być bez różnicy bądź jednostką glukozaminową taką, że oznacza we wzorze 1 z grupą hydroksylową w pozycji 4 jednostkę glukozaminową, która jest lub nie jest siarczanowana, bądź kwasem D-glukuronowym zawierającym ewentualnie podwójne wiązanie w pozycji 4C-5C, który jest lub nie jest siarczanowany.

167 668

Jednostką nieredukującą może być bez różnicy bądź kwas D-glukuronowy, taki jak reprezentowany we wzorze 1, podstawiony atomem wodoru przy tlenie anomerycznym, bądź glukozamina, bądź struktura 2,5-anhydromanno taka, jaką otrzymuje się w następstwie depolimeryzacji nitrującej (2,5-anhydro-D-mannoza) ewentualnie z następnym utlenieniem (kwas 2,5-anhydro-5mannozowy) lub redukcją (2,5-anhydro-D-mannit).

Korzystnymi produktami są te, których dwa końce, redukujący i nieredukujący, łańcuchów N,O-siarczanów heparosanów według wynalazku są jednostkami uronowymi ewentualnie siarczanowanymi, glukozaminy ewentualnie siarczanowanej, N-acetyloglukozoaminy, ewentualnie siarczanowanej lub jednostkami o strukturze 2,5-anhydromanno.

Korzystnie N,0-siarczany heparosanów stanowią łańcuchy, których dwa końce redukujący i nieredukujący są jednostkami uronowymi ewentualnie siarczanowanymi, glukozaminy ewentualnie nie siarczanowanej i N-acetyloglukozaminy ewentualnie siarczanowanej.

Sposobem według wynalazku wytwarza się mieszaninę N,0-siarczanów heparosanów składających się z łańcuchów lub mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej 1500-15000, charakteryzujących się powtarzającą się strukturą dwusacharydową o wzorze 1, w którym E oznacza, w 0-80% wymienionych jednostek dwusacharydowych N,0-siarczanów heparosanów, grupę acetylową, a w pozostałych jednostkach dwusacharydowych grupę siarczanową i ewentualnie atom wodoru, G oznacza atom wodoru lub grupę siarczanową, ewentualnie w postaci ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Sposób według wynalazku polega na tym, że w pierwszym etapie poddaje się hodowli szczep Escherichia coli (K5), następnie otrzymany w pierwszym etapie N-acetyloheparosan, składający się z łańcuchów lub mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej 1500-15000, charakteryzujących się powtarzającą się strukturą dwusacharydową o wzorze 2, w drugim etapie wyodrębnia się i poddaje oczyszczaniu, ewentualnie z zastosowaniem oczyszczania wstępnego, po czym, w trzecim etapie, tak otrzymany oczyszczony N-acetyloheparosan poddaje się częściowej dezacetylacji przez reakcję z czynnikiem dezacetylującym, a następnie otrzymany częściowo zdezacetylowany heparosan składający się z łańcuchów lub mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej 1500-15000, charakteryzujących się powtarzającą się strukturą dwusacharydową o wzorze 3, w którym R' oznacza w 0-80% jednostek dwusacharydowych, grupę acetylową, a w pozostałych jednostkach dwusacharydowych atom wodoru, w czwartym etapie, przez reakcję z czynnikiem siarczanującym:

— bądź częściowo N,O-siarczanuje się tę kompozycję heparosanu, — l3^<źź Ν,Ο-siarczanuje się częściowo tę kompozycję heparosanu, a w następnym etapie przeprowadza się N-siarczanowanie całkowite, — bądź N-siarzzauuj e sęę.całkowici e lu b cęęściowo, p o zymn w następyym etapie Osiarczanuje się całkowicie lub częściowo, przy czym po zakończeniu każdego z czterech etapów ewentualnie otrzymane produkty poddaje się jedno- lub kilkakrotnie frakcjonowaniu mas cząsteczkowych, zaś otrzymane produkty pośrednie lub produkt końcowy ewentualnie przeprowadza się w ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

W sposoUśc według wynalazku korzystnie jako szczep Escherichia coli stosuje się szczep Escherichia coli SEBR 3282. Szczep ten jest szczepem pochodzącym od szczepu Bi8337-41 (010:K5:H4)ATCC 23506 [opisanego D. S. Guptaiwsp. FEMS MicroUiology Letters(1982), 14,75 i 78 i W. Vann, Eur. J. Biochem, (1891), 116, 39, 359-364].

Szczep Escherichia coli SEBR 3282 reaguje dodatnio w teście typowania specyficznym fagiem K5 według metody B. Kaisera i wsp. [J. Clin. Mircobiol., (1984), 19, 2,264-266]. Chodzi zatem o szczep Escherichia coli (K5). Szczep ten jest zdeponowany w CNCM przy Instytucie Pasteura, Paryż, Francja, pod nr 1-1013. Można również stosować mutant bądź spontaniczny bądź indukowany z tego szczepu, jak również inne odpowiednie szczepy Escherichia coli (K5), na przykład BŚ626-42 (012:K5NM) ATCC 23508.

Jako środowisko hodowlane korzystnie stosuje się środowisko bogate w substancje azotowe, na przykład bogate w ekstrakt drożdży i hydrolizat kazeiny, środek mało kosztowny dla dostarczenia potrzebnej ilości aminokwasów.

Hodowlę szczepu Escherichia coli (K5) prowadzi się korzystnie co najmniej przez dwie godziny po wstrzymaniu przyrastania biomasy.

167 668

Wyodrębnianie i oczyszczanie N-acetyloheparosanu w celu otrzymania N-acetyloheparosanu składającego się z mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej 1500-15000, charakteryzujących się strukturą dwusacharydową powtarzającą się, o wzorze 2, przeprowadza się korzystnie sposobem obejmującym co najmniej jeden etap wytrącania i jeden etap chromatografii jonowymiennej. Etap ten korzystnie realizuje się na kolumnie Q-Sepharose lub na kolumnie równoważnej. Wytrącanie prowadzi się odpowiednim rozpuszczalnikiem organicznym, a zwłaszcza alkoholem, korzystnie etanolem. Podczas tego procesu N-acetyloheparosan może być w postaci soli, korzystnie w postaci soli sodowej.

Przykładowo, korzystny sposób wyodrębniania i oczyszczania można schematycznie przedstawić następująco:

— etap aj: wytrącanie etanolem, — etap bi: dializa, — etap ci: wytrącanie etanolem a następnie odwodnienie i suszenie, — etap di: oczyszczanie za pomocą chromatografii anionowymiennej, — etap ei: wytrącanie etanolem eluatu otrzymanego w etapie di, odwodnienie, suszenie i rozdrobnienie.

W odniesieniu do etapów ai, bi i ci kolejność w jakiej są one przeprowadzane nie ma większego znaczenia. Jeden z etapów ai lub ci w ogóle może być wyeliminowany.

W etapie ei wytrącanie etanolem nie jest niezbędne. Można N-acetyloheparosan wyodrębnić innymi metodami, takimi jak na przykład odparowanie próżniowe eluatu otrzymanego w etapie di.

Wyodrębnianie i oczyszczanie N-acetyloheparosanu w celu otrzymania możliwie najczystszego N-acetyloheparosanu składającego się z mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej w zakresie i500-i5000 można również, przeprowadzić w sposób następujący:

— etap a/: dializa, — etap bi': oczyszczanie w środowisku kwaśnym, wyeliminowanie zanieczyszczeń nierozpuszczalnych w roztworach wodnych o pH 3,5 i pH i,8, — etap ci: wytrącanie etanolem następnie odwodnienie i suszenie, — etap di': hydroliza alkaliczna i dializa, — etap ei: oczyszczanie za pomocą chromatografii anionowymiennej, — etap fi': oczyszczanie za pomocą chromatografii ekskluzyjnej.

Ten sposób wyodrębniania i oczyszczania jest także korzystnym sposobem według wynalazku.

Hydrolizę alkaliczną przeprowadza się roztworem NaOH w temperaturze w zakresie 30-80°C.

Przy tych sposobach wyodrębniania i oczyszczania można stosować jako produkt wyjściowy bądź zawiesinę otrzymaną przy końcu hodowli i w tym przypadku potrzebna jest wstępna filtracja, bądź produkt, który jest już poddany oczyszczaniu wstępnemu przeprowadzonemu sposobem obejmującym następujące etapy:

— etap ai': odwirowanie zawiesiny otrzymanej pod koniec hodowli, — etap bi: kontaktowanie fazy wierzchniej z roztworem alkalicznym, — etap ci: filtracja wstępna, — etap di: zatężanie na membranie przepuszczającej cząsteczki o ciężarze cząsteczkowym poniżej i000, — etapei: dializa.

Etap ei nie jest niezbędny. Jako roztwór alkaliczny można stosować 0,i n NaOH.

W korzystnym sposobie postępowanie przeprowadza się oczyszczanie wstępne produktu otrzymanego na końcu hodowli, sposobem opisanym powyżej.

Hodowla szczepów Escherichia coli (K5) i sposoby wyodrębiania i oczyszczania, jak również etap oczyszczania wstępnego wymieniony powyżej, pozwalają na uzyskanie mieszaniny Nacetyloheparosanów zawierającej 70-i00% N-acetyloheparosanu składającego się z mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej i500-i5000 i charakteryzującego się powtarzającą się strukturą dwusacharydową o wzorze 2.

W rezultacie dzięki sposobom wyodrębniania i oczyszczania opisanym powyżej i etapowi oczyszczania wstępnego, możliwe jest uzyskanie mieszaniny N-acetyloheparosanów zawierającej co najmniej 80-i00% N-acetyloheparosanu stanowiącego mieszaninę łańcuchów o masie cząsteczkowej i500-i5000.

167 668

N-acetyloheparosany składające się z mieszaniny łańcuchów o ciężarze cząsteczkowym zawartym w 1500-15000 są produktami nowymi.

Dwa końce redukujący i nieredukujący nowych N-acetyloheparosanów takich jak otrzymywane wyżej wymienionym sposobem przy użyciu szczepu Escherichia coli SEBR 3282 lub innego odpowiedniego szczepu, jak wymieniono powyżej, stanowią jednostki uronowe lub N-acetyloglukozoaminowe.

W większości łańcuchów końcówka nieredukująca stanowi jednostkę uronową o wzorze 7.

Ewentualne wzbogacenie otrzymanej kompozycji w N-acetyloheparosan składający się z mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej 1500-15000, mających powtarzającą się strukturę dwusacharydową o wzorze 2, można przeprowadzić w różnym stopniu, a zwłaszcza aż do wyizolowania wymienionego N-acetyloheparosanu. Wzbogacenie przeprowadza się technikami klasycznymi frakcjonowania mas cząsteczkowych, takimi jak chromatografia permeacyjna na żelu i ultrafiltracja [A. A. Horner, Biochem. J., (1989), 262, 953-958; G. Pyler i wsp., J. Biol. Chem. (1988), 262,11,5197-5201 i U. Lindahl i wsp., J. Biol. Chem. (1984), 259,20,12368-12376]. Można również stosować metodę frakcjonowania etanolowego (zgłoszenie patentowe EP-A-0 287 477). Ta ostatnia metoda frakcjonowania jest szczególnie zalecana spośród innych metod branych pod uwagę.

Opisane powyżej N-acetyloheparosany stosowane są jako produkty pośrednie dla otrzymania finalnych N,O-siarczanów heparosanów otrzymywanych według wynalazku, jak również dla wytwarzania innych pochodnych.

Częściową dezacetylację N-acetyloheparosanu składającego się z mieszaniny łańcuchów o ciężarze cząsteczkowym 1500-15000, charakteryzujących się powtarzających się strukturą dwusacharydową o wzorze 3 zdefiniowanym powyżej, prowadzi się przez zadanie środkiem dezacetylującym.

Jako środki dezacetylujące można wymienić pięciosiarczek fosforu, fluoroboran trójetylooksoniowy, wodorotlenek sodu lub hydrazynę. Te dwa ostatnie środki są szczególnie zalecane. Można również stosować mocne kwasy mineralne, takie jak kwas chlorowodorowy, kwas siarkowy itd. Czas trwania reakcji zależy od wybranych warunków roboczych, a zwłaszcza od temperatury i od stężenia środka dezacetylującego w środowisku reakcji.

Wzbogacenie kompozycji heparosanu złożonego z łańcuchów lub mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej zawartej w zakresie 1500-15000 charakteryzujących się powtarzającą się strukturą dwusacharydową o wzorze 3 przeprowadza się przez zastosowanie klasycznych technik frakcjonowania ciężarów cząsteczkowych wzmiankowanych powyżej (chromatografia permeacyjna na żelu, ultrafiltracja i frakcjonowanie etanolowe). W tym przypadku otrzymuje się kompozycje zawierające 90-100% wagowych heparosanu składającego się z mieszaniny o masie cząsteczkowej 1500-15000, a powtarzającej się strukturze dwusacharydowej o wzorze 3.

W celu sporządzania heparosanów złożonych z mieszaniny łańcuchów o ciężarze cząsteczkowym w zakresie 1500-15000, możliwe jest również zastosowanie N-acetyloheparosanów o wysokim ciężarze cząsteczkowym.

Heparosany złożone z mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej w zakresie 1500-15000, charakteryzujące się powtarzającą się strukturą dwusacharydową o wzorze 3, w którym R' oznacza, w 0-80% jednostek dwusacharydowych, grupę acetylową, a w pozostałych grupach dwusacharydowych atom wodoru, są produktami nowymi.

Korzystne heparosany otrzymane sposobem według wynalazku są haparosanami złożonymi z mieszaniny łańcuchów o ciężarze cząsteczkowym w zakresie 1500-15000, charakteryzujących się powtarzającą się strukturą dwusacharydową o wzorze 3, w którym grupa acetylowa (R') obecna jest w stopniu niższym lub równym 60%.

Przed etapem N,0-siarczanowania częściowego, heparosany mogą być przekształcone w sól zasady organicznej lub czwartorzędową sól amoniową. W celu tworzenia czwartorzędowych soli amoniowych heparosanów, korzystnie stosuje się grupy tetrabutyloamoniowe.

Etap N,O-siarczanowania częściowego realizuje się sposobem opisanym we francuskim opisie patentowym nr 2 584 728 i przeprowadza się w polarnym rozpuszczalniku nieprotonowym, takim jak dimetyloformamid, sulfotlenek dimetylu, heksametylofosforoamid lub acetonitryl lub w mieszaninie tych rozpuszczalników, z pomocą na przykład kompleksu bezwodnika siarkowego

167 668 (trójtlenek siarki: SO 3) z zasadą organiczną, taką jak trimetyloamina, trietyloamina lub pirydyna. Etap ten można przeprowadzić również stosując kwas chlorosulfonowy w roztworze w pirydynie. Korzystnie stosuje się kompleks trójtlenek siarki - pirydyna.

Można również stosować inne środki do siarczanowania, zwłaszcza te, które opisał E. E. Gilbert w Chemical Review, (1962), 62,549-589. Reakcję N,O-siarczanowania na ogół przeprowadza się w temperaturze 0-100°C, korzystnie 10-50°C przez okres 6-14 godzin.

Podczas procesu, korzystnie, pod koniec reakcji częściowego N,O-siarczanowania, N,Osiarczan heparosanu wytrąca się przez dodanie chlorku sodu aż do otrzymania roztworu o stężeniu 0,33 m w stosunku do chlorku sodu, po czym odpowiedniej ilości etanolu. Wytrącony osad rozprowadza się w roztworze 0,5 m chlorku sodu. Roztwór ten następnie zobojętnia się. Po dodaniu odpowiedniej ilości etanolu wytrącony osad wyodrębnia się, rozpuszcza się w wodzie uprzednio poddanej ultra-oczyszczaniu, dializuje wobec niej, liofilizuje i suszy.

Etap N,0-siarczanowania, jak również oczyszczania kompozycji N,0-siarczanu heparosanu opisanej powyżej, można powtórzyć raz lub kilka razy. Podany proces oczyszczania jest przykładowym i nie wyklucza się innych procesów równoważnych.

Po tym etapie N,O-siarczanowania korzystnie przeprowadza się etap siarczanowania całkowitego, realizowany na ogół w rozpuszczalniku wodnym, korzystnie przy pH zasadowym, środkiem siarczynującym, takim jak kompleks bezwodnika siarkowego z zasadą organiczną, na przykład trietyloaminą.

Na końcu etapu całkowitego siarczanowania kompozycję N,0-siarczanu heparosanu wytrąca się przez dodanie chlorku sodu aż do uzyskania roztworu 0,5 m wobec chlorku sodu i przez dodanie metanolu. Wytrącony osad rozprowadza się następnie w 0,5 m roztworze chlorku sodu, ponownie wytrąca się etanolem, po czym rozprowadza w ultra oczyszczonej wodzie, dializuje wobec niej i suszy.

Wzbogacenie środowiska reakcyjnego N,O-siarczanu heparosanu w N,O-siarczan heparosanu realizuje się za pomocą technik klasycznych frakcjonowania ciężarów cząsteczkowych, takich jak wymienione powyżej.

N,0-siarczany heparosanów korzystnie otrzymuje się sposobem obejmującym końcową reakcję N-siarczanowania, E oznacza wówczas w powtarzającej się strukturze we wzorze 1 grupę acetylową i grupę siarczanową.

Możliwe jest również otrzymywanie N,O-siarczanów heparosanów przeprowadzając najpierw N-siarczanowanie, a następnie O-siarczanowanie. Jest to korzystny wariant postępowania.

N-siarczanowanie przeprowadza się z pomocą kompleksu trójtlenku siarki z zasadą organiczną, taką jak trietyloamina, trimetyloamina lub pirydyna. Przeprowadza się je również za pomocą kwasu chlorosulfonowego w roztworze w pirydynie. Korzystnie stosuje się kompleks trójtlenku siarki z trimetyloaminą i reakcję N-siarczanowania prowadzi się w temperaturze 20-80°C w wodnym środowisku alkalicznym. Na końcu reakcji N-siarczanowania otrzymany tym sposobem produkt wytrąca się przez dodanie odpowiedniej ilości etanolu. Wytrącony osad rozprowadza się w ultra oczyszczonej wodzie, dializuje wobec niej, liofilizuje i suszy. Powyższe procesy oczyszczania stanowią jedynie korzystne przykłady i nie wykluczają stosowania procesów równoważnych. Etapy oczyszczania mogą być powtórzone kilkakrotnie.

W sposobie według wynalazku korzystnie przed etapem O-siarczanowania, N-siarczan heparosanu przekształca się w sól zasady organicznej lub w czwartorzędową sól amoniową. W celu utworzenia czwartorzędowej soli amoniowej, korzystnie stosuje się grupy tetrabutyloamoniowe.

Reakcję O-siarczanowania prowadzi się w formamidzie lub w innym rozpuszczalniku równoważnym chemicznie, za pomocą kompleksu trójtlenku siarki z zasadą organiczną, taką jak trimetyloamina, trietyloamina lub pirydyna. Korzystnie stosuje się kompleks trójtlenek siarki-pirydyna. Reakcję O-siarczanowania na ogół prowadzi się w temperaturze 10-50°C.

N,O-siarczan heparosanu wytrąca się następnie przez dodanie do środowiska reakcji chlorku sodu aż do uzyskania roztworu 0,33 m NaCl, po czym odpowiedniej ilości etanolu, tak jak w przypadku N,O-siarczanowania. Następnie przeprowadza się oczyszczanie kompozycji N,Osiarczanu heparosanu. Różne etapy opisano już szczegółowo powyżej (wytrącanie etanolem, dializa itd.).

167 668

Według wynalazku, N^-siarczan heparosanu korzystnie zawiera co najmniej 90% wagowych łańcuchów o masie cząsteczkowej poniżej 11000. Zaleca się, aby ten N,O-siarczan heparosanu zawierał mniej niż 0,2 pmoli/mg grupy aminowej (NH 2).

Grupa acetylowa korzystnie oUecna jest w stopniu niższym lub równym 60% i zaleca się, _aby stopień siarczanowania wyrażony stosunkiem siarczap/kcrboksyl zawarty był w zakresie 1,5_-3,0.

Korzystnymi produktami otrzymywanymi sposoUem według wynalazku są NO-siarc^w heaarosapów składające się z łańcuchów o masie cząsteczkowej około 4000-7000 i o stopniu siarczanowania wyrażonym jako stosunek siarczan/kcrUoksyl w zakresie 1,7-3, jak również N,0siarczany heparosanów N-dezacetylowcne w około 80% (stopień obecności grup acetylowych około 20%), które składają się co najmniej w 70% wagowych z łańcuchów o masie cząsteczk_owej zawartej w zakresie 5000-7000 i mają stopień siarczanowania 1,8-2,5 lub jeszcze N^-siarczany heparosanów składające się co najmniej w 70% wagowych z łańcuchów o masie cząsteczk_owej zawartej w zakresie 10000-12000, N-dezacetylowape w około 80% (zawartość obecnych grupy acetylowych około 20%) i o stopniu siarczanowania 1,8-2,5; lub jeszcze N,O-siarczany hepar_osanów N-dezacetylowane w około 40% (zawartość obecnych grupy acetylowych około 60%) i składające się w około 70% wagowych z łańcuchów o masie cząsteczkowej zawartej w zakr_esi_e6000-8000 oraz mające stopień siarczanowania w zakresie 2,0-2,8.

Do korzystnych N,O-siarczanów heaarosanów wytwarzanych według wynalazku należą zwłaszcza:

— N heparosanów N-dezacetyoowane w około 80% (o zawartości obecnych grup acetylowych około 20%), składające się w co najmniej 80% wagowych z łańcuchów _{o mas}i_ecząsteczkowej w zakresie 2300-7200 i o stopniu siarczanowania 1,8-2,5;

— N,O-siarczany heparosanów N-dezacetyiowane w okoto 80% -stopień obecnych acetyiowych około 20%), składające się z co najmniej 80% wagowych z łańcuchów o masie cząsteczk_owej w zakresie 3300-7700 i o stopniu siarczanowania 1,8-2,5;

— N,O-siarccPzy hępakocpó0w Nądecaeetyiowpce w okoto 80% -siopień αowartośsi grup acetylowych około 20%), składające się w co najmniej 70% wagowych z łańcuchów o _masi_ecząsteczkowej w zakresie 6900-13500 i o stopniu siarczanowania Ί,8-2,5;

— N,O-siarzcpzy hępaiotpn0w NąCzcacetyiowPce w okoio 00% -stopjeń bCcczych grap acetylowych około 60%), składające się w co najmniej 80% wagowych z łańcuchów o masi_ecząsteczkowej w zakresie 4000-10300 i o stopniu siarczanowania 2,0-2,8.

Jako sole N^-siarczanów hcparosapów można wymienić wszystkie sole f_armaceutycznie dopuszczalne. Sole te otrzymuje się metodami klasycznymi w szczególności dla wytwarzani _soli heparyny (opis patentowy St. Zjedn. Am. 4 168 377).

Wyżej oaisapy, przykładowo sposób otrzymywania N,O-siarczanów heaagosanów pozwala na otrzymanie N,O-siarczanów heparosapów w aostaci soli sodowej. Wychodząc z ty_ch _soli, stosując metody wykorzystywane do wytwarzania różnych soli hepagapy lub heparanz nie będącej w postaci soli [„L'hepagine, fabrScatiop, structure, agopgietes, apalyses“,, J. P. Du_cl_os, (1984), str. 81-83, Masson Ed. - Francja] można otrzymać bądź inne sole N^-siarczanów heparosanów, bądź N,O-siarczany heparosanów nie będące w postaci soli.

N,O-siarczany heparosanów wytwarzane według wynalazku posiadają interesujące własności farmakologiczne i biochemiczne, przewyższające znane dotychczas.

Zwłaszcza w przeciwieństwie do produktów siarczanowanych antygenu K5 opisanego w europejskim opisie patentowym nr 333 243, które posiadają działanie aptyapgSogepiczne i prz_eci_wnowotworowe ze stosunkiem korzystnym dla tych aktywności wobec wła-pości antykoagulacyjnych, N,O-siarczany heparosapów wytwarzane według wynalazku posiadają dobre działanie regulujące koagulację. To działanie bardzo przewyższa działanie siarczanu dermatanu w odniesieniu do różnych parametrów koagulacji i może raczej być przyrównane do działania heparyny.

Bardziej szczegółowo, zależne działanie anty-IIa, AT III lub HCII produktów reprezentatywnych dla wynalazku zostało oznaczone metodami opisanymi przez D. Dupouy i wsp. w Thgombosis and Haemostatis (1988), 60,2,236-249 dla kofaktora II heparyny (HCII) i przez M. L. Larsena i wsp. w Thgymbosⁱs Research (1978), 13, 2, 285-288 dla αptytromb^tny (AT III).

167 668

W tych dwóch korzystnych przypadkach test obejmuje pomiar in vitro inhibitującego działania oczyszczonego produktu na oczyszczoną Srgmbiaę (czynnik IIa) w obecności HCII lub oczyszczonego ATIII w dawce czynności zmidolityczaej trombiny w stosunku do substratu chromogenowego. Ponieważ posiada on aktywność anty IIa HCII azjailaiej zależną, siarczan eeamasanu sporządzony metodą opisaną przez W. H. Stuhlsatha i wsp. w „The Methodology of ConneśSive Tissue Reaezrch“ (1976) 137-146 stosowany jest jako produkt porównawczy w teście pomiaru tego działania, w którym wynik wyrażony jest w mg siarczanu eermatznu (DS) równoważnego aktywności 1 mg badanego produktu (mg DS równoważ. /mg).

Aktywność anSy-Xz (miano Yin-Wesslerz) wymienionych reprezentatywnych produktów otrzymanych sposobem według wynalazku mierzono metodą opisaną przez E. T. Yina w J. Lab. Clin. Med. (1973) 81,2,298-310, podczas gdy ich globalną aktywność aatykoagulaśyjną mierzono według testu APTT opisanego przez R. R. Proctom i wsp. w Am. J. Clin. Path. (1961), 36,212-219.

Wszystkie badane produkty wykazały aktywność anty-IIz HCII zależną znacznie wyższą od aktywności siarczanu eermatznu. Zależna aktywność anty IIa AT III i miano Yin-Wesslera, jakkolwiek niższe niż heparyn okazały się wyższe niż siarczanu deamasanu. Ich miano w APTT jest około 2 do 20 razy wyższe niż siarczanu eermatznu i może dojść do 60% miana heaaaany.

N,O-aiarśrann heazrosznu wytwarzane według wynalazku wykazują zatem specyficzne działanie i aktywność zntykgagulacyjną szczególnie interesującą. Mała masa cząsteczkowa tych produktów nadaje im ponadto interesujące własności farmakokinetyczne.

N,O-sizrcrany heaaaosznów wytwarzane według wynalazku są bardzo mało toksyczne; ich toksyczność jest w całkowitej zgodzie ze stosowaniem ich jako środki lecznicze.

Związki te stosuje się korzystnie w postaci kompozycji farmaceutycznych zawierających jako główny składnik aktywny N,O-sizaczzn heparosanu, jedną z jego soli lub kompozycji N,Osiarczanu heparosanu zawierającej co najmniej 70% tego N,O-sizrczanu heaaansanu lub jego soli, w połączeniu z jedną lub kilkoma zarobkami farmaceutycznie dopuszczalnymi.

Te kompozycje farmaceutyczne przydatne są zwłaszcza do traktowania zapobiegawczego lub leczącego zaburzeń związanych ze ściankami naczyń, takich jak miażdżyca i stwardnienie tętnic oraz stanów zwiększonego krzepnięcia krwi obserwowanych na przykład w następstwie operacji chirurgicznych, rozwoju nowotworów lub rozregulowania koagulacji wywołanego aktywatorami bakteryjnymi, wirusowymi lub enzymatycznymi.

Dawkowanie może zmieniać się w szerokim zakresie zależnie od wieku, wagi i stanu zdrowia pacjenta, charakteru i ostrości choroby a także od drogi podawania.

Dawkowanie to obejmuje podawanie jednej lub kilku dawek około 1 mg do 1 g dziennie, korzystnie około 5-500 mg/dzień na przykład rzędu 20 mg/dzień drogą dożylną lub drogą podskórną, przy podaniu nieciągłym lub regularnym interwale czasowym, lub jedną dawkę codziennie rzędu 200-1000 mg/dzień drogą doustną.

Dawki te naturalnie mogą być dostosowane do każdego pacjenta w zależności od zaobserwowanych wyników i od przeprowadzonych uprzednio analiz krwi.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

N-zcetylohepaaosany

Przykład I. Wytwarzanie N-acetylohepaaosanu głównie o niskim ciężarze cząsteczkowym (sposób I).

1)Hodowla szczepu bakteryjnego Escherichia coli (K5) i wydzielenie przesączu zawierającego N-acetyłoheparosanu

Posiano 400 ml pożywki B o składzie podanym w poniższej tabeli 1 szczepem Es^eric^a coli SEBR 3282 (zdeponowanym przy CNCM Instytutu Pasteura w Paryżu, Francja, pod nr ^^1013) i inkubowaao mieszając przez 2 godziny w temperaturze 37°C.

Otrzymaną hodowlę· wstępną przeniesiono do fermentora o pojemności 18,5 litra zawierającego 11 litrów pożywki A o składzie podanym poniżej w tabeli 1 i inkubowzno przez 4 godziny w temperaturze 37°C przy pH równym 7,4, pod cząsteczkowym cięnieaiem tlenu utrzymywanym na poziomie 53,5 hPa przez regulowanie iniekcji powietrza (do 20L/mia.) i mieszanie. Następnie dodano glukozę wprowadzając w sposób ciągły sterylny roztwór zawierający 600 g/1 glukozy, w proporcji 250 ml/godzinę przez 8 godzin.

i67 668

Kontynuowano hodowlę w tych samych warunkach temperatury, pH i ciśnienia cząstkowego tlenu przez i0 godzin po zaprzestaniu dodawania glukozy. Następnie DO (λ = 600 nm) środowiska hodowlanego pozwoliło stwierdzić, że nie miał już miejsca przyrost biomasy przez ostatnie i2 godzin hodowli.

Wówczas ochłodzono pożywkę do temperatury 25°C, po czym przesączono przez membranę o porowatości 0,22gm. Tym sposobem otrzymano około i2 litrów przesączu zawierającego N-acetyloheparosan.

Tabela 1

Skład i przygotOTanie pożywki A i pożywki B

Pożywka A. Pożywkę A sporządza się przez pokjcze nie poniższych trzech sterylnych ro ztworów Roztwór i. W 700 ml ultra oczyszczonej wody rozpuszczono kolejno:

— Środek kompleksujący:

— Ν’- [ Trls-(hydIΌkcymetyio)mecyio]glicyna — (Tricine sprzedawany preez firmę Fluka^R) — FeSO4 · 7H₂O — CaCl₂’2H₂O — MgCl₂’6H₂O — K2SO4 — KCl — Hydroliza [ Rzzimy (główne źródto aminokwksów) — HY CASE SF (z firmy Sheffield”) — Ekstrakt drożdżowy (z firmy DifcoR) — Roztwór oligo-elementów (tabela 2 poniżej) — Srodek preeciwpianowy Snuko1 6733 — fc firmy Schli 11 Sellacher^R)

360 mg 280 mg 6,7 mg 1270 mg 500 mg

5000 mg

25000 mg 18000 mg i ml kilka kropli z pipety Pasteura.

Doprowadzono pH do 7,4 za pomocą roztworu KOH (d = 1,38) i uzupełniono do 850 ml wodą ultra oczyszczoną. Pożywkę umieszczono w autoklawie o temperaturze 120°C na okres 45 minut.

Roztwór nr 2. W około 40 ml ultra oczyszczonej wody rozpuszczono 5g K2HPO4 a naatępnie uzupełmono do 50 ml za pomocą tego samego rozpuszczalnika. Przesączono otrzymany roztwór przez filtr o porowatości 0,2 pm.

Roztwór nr 3. Rozpuszczono 20,7 g glukozy w odpowiedniej ilości wody ultra oczyszczonej i uzupełniono objętość do 100 ml tym samym rozpuszczalnikiem. Roztwór umieszczono w autoklawie w temperaturze 110°C na okree 30 minuu.

Pożywka B. Przygotowanie pożywki B jest identyczne jak pożywki A, z niewielką różnicą, że po dodaniu środka przząiwpίanowzgo należy dodatkowo dodać 20 g buforu pH = 7,2 (kwas 3-moifolinopropanosulfonowc).

Tabela 2

Sporządzenie roztworu obgo-elementów stosowanego przy sporządzaniu pożywek A i B

W 800 ml ultra oczyszczonej wody

rozpuszczono w podanym porządku:
^BO3	500 mg
Na2MOO4 · 2H2O	1930 mg
CoCl2 · 6H2O	11850 mg
CuSO4 · 5H2O	25 mg
ZnSO4 · 7H₂O	2000 mg
AlCb · 6H₂O	2410 mg

Dodaje się 100 ml kwasu solnego o gęstości 1,19 i uzupełnia do 1000 ml wodą ultra oczyszczoną.

Wyodrębnianie i oczyszczanie N-acetyloheparosanu głównie o małej masie cząsteczkowej.

Etap a - wytrącanie etanolowe. Do przesączu dodano około 48 litrów 95% (objętościowo) etanolu i pozostawiono mieszaninę do wytrącenia i edzkantowania w temperaturze 4°C na okres 8 godzin. Usunięto fazę wierzchnią przez odpompowanie, następnie odwirowano i osad po odwirowaniu rozprowadzono w około 1 litrze wody ultra oczyszczonej.

Etap b - dializa. Przez 24 godziny dializowano roztwór otrzymany w poprzednim etapie umieszczony w kiszce NOJAX 40 z membraną na bazie celulozy o porowatości 240 nm wobec ultra oczyszczonej wody (1 objętość roztworu/6 objętości wody odnanianej po 2, 8 i 16 godzinach). Operacja ta pozwoliła na wyeliminowanie małych cząstek obecnych w pożywce hodowlanej, takich jak soler cukry, aminokwasy, oligonukleotydy i oligopeptydy.

167 668

Etap c - wytrącanie, odwadnianie i suszenie: Do 1 objętości Oialirpwaaeuo roztworu dodano 0,5 m NaCl i 4 objętości etanolu. Pozostawiono do wytrącenia się osadu przez 5 minut w temperaturze otoczenia. Odwirowano przy 5000 g w ciągu 20 minut. Osad po odwirowaniu rozprowadzono w etanolu, mieszano otrzymaną zawiesinę i pozostawiono w spokoju na 1 godzinę w temperaturze otoczenia. Powtórzono operacje wirowania i zawieszania. Od nowa odwirowano przy 5000 g przez 20 minut. Osad po wirowaniu osuszono w suszarce próżniowej w temperaturze 40°C w przeciągu 24 godzin.

Etap d - rozdrabnianie do sproszkowania. Suszy osad po wirowaniu rozdrobniono z pomocą moździerza w warunkach bezwodnych.

Etap e - chromatografia αaiaowymienna. Sproszkowany osad po odwirowaniu rozprowadzono w roztworze buforowym nazwanym bufor D o składzie Tris-HCl 20 mmoli pH 7,5 w proporcji 100 ml/g. Otrzymany roztwór chromatografowano na kolumnie silnie anionowymiennżj zawierającej agarozową substancję podstawową sieciowaną suwartorzę0owymi grupami amoniowymi (szybkoprzepiywowa Q-Sepharose z firmy Pharmacia®) uprzednio równoważoną buforem D, w proporcji 50 ml żelu na 1 g proszku. Żel przemyto odpowiednią ilością buforu D w celu powrotu do linii podstawowej detekcji UV do 214 nm, po czym 25 mmolowym roztworem piperazyny, którego pH doprowadzono do 3,5. Eluowano roztworem o pH 3,5 składającym się z: 0,5 m NaCl i 25 mmola piperazyny. Eluat zobojętniono za pomocą NaOH 5 n.

Etap f - wytrącanie, odwadnianie, suszenie i rodrabnianie. Potworzono operacje opisane powyżej w etapach c i d bez dodawania chlorku sodu.

N-acjtyloheparosaa otrzymany w odcieku z etapu f nazwany jest partią A.

Wariant postępowania przy oczyszczaniu przy podanej kolejności etapów a, c, b, d, ż, i f daje N-acetyloheparosan, który nazwano partią B.

3) Oznaczenie N-acetyloheparosanu otrzymanego z różnych etapów oczyszczania

Widmo magnetycznego rezonansu jądrowego (RMN).

Widma RMN protonu i węgla 1³C porównano z widmami N-acetyloheparosanu opisanymi przez W. E. Vanna (Eur. J. Biochem., /1981/ 116, 59-364).

Badanie widm otrzymanych dla N-acetyloheparosanu z partii A i partii B potwierdza identyczność chemiczną produktu z N-acetyloheparosanem opisanym przez W. F. Vanna. Chodzi o łańcuchy polimerów składające się z powtarzającej się struktury .β-D-glukuroaylo-1l4-α-Nacżtylo-D-glukozaminylowej-(1,4). Oznaczenie rozkładu ciężarów cząsteczkowych za pomocą chromatografii ekskluzyjnej.

Rozkład ciężarów cząsteczkowych oznaczono za pomocą HPLC eks^u^^j w następujących warunkach:

* Kolumna wypełniona była kulkami krzemionki o średnicy 10 μιη i porowatości 2500 nm.

* Eluent: roztwór wodny siarczanu sodu 0,5 m.

* Przepfyw: 1 ml/mio.

* Detekcjw UV przy Λ = 205 nm * W^iencjwu^e jnop rowa^mu© za pomocą gamma oligosacharydowych pochodnych heparyn y o nas^tę^oująeys^r żiężawach pa^p)teczkow^och : 13^zW 1 88L 2436, jM-H, ^9⁾ 4535, 4995, Sżpa, ClCOo p542, 865c, ΙΟΟ^, Π561, cnkow, i980a,173eS Ϊ22674 Da.

N^¹5ży zważyć, że W5wzorcachgammabrane sąp oduwigę j7dyme masy cząsteczkowe 934-56^a03. Prwyjmuj ee ©, .w wykayte ^mtm^ optyczne s^o płoporcjodalne dm ilośd ⁹3⁴£^i^j^s^^u. Jectaakże do kładność metrd^p cnlpisisza o© w r^rób wykfodmezy d© w^okich hi^arów a5^zstżezkow^oc^o, a jw^laszczz pow^ż 20^ż00.

rówiU elużji a^poom9l ograin rkrklsp^ojnej partii A przedstawia fig.1. Badając fig.1 stwierdzonO^{r o}e r ozMadchso wij^lorrjprojaon^{5 z} Ce wyptępuj e pi^p w^kszwró ^ęowy przy dkoto 470¹. ©dea ^erakata wagowa ou na)mo^lp równa 70% partii A posiato ma^ w l^5C()-^ap0^p .

Ua róag podo^o n^a cłllomrsoglα m otomano p analizy ρϋ⁾° B. Pik wi^eWrżo^sż^rowy rozkładu wystBpuje o koto ^00. Jedma fra^a wz^wa co Μΐσιη^ rówBa 70% parni B ^siada mas⁵oo^ys^lęs5kop^a w zakresi e tóOO- 800^ O zwaczaw© co zMatóu ciężarów csąste cskowyzh metodą ^srofojczy ow żehi pal^jokry¹ażm^sąąwym.

l^{^}l^s5b^ai do 5ns^tiz^aśak równUó znzzznik końca migracji z błękitu bromofenolowego poddano elektoo^soraz^le w bufocza Tnwróora^wyn w rólu pzⁱiaksyl o ami^kowęm l^o% otr^pwπla^o ym pn^

167 668 polimeryzację mieszaniny 29/1 αkgzloamSdr i N,N'-metzlePo-bSs-αkryloamidu. Migrację prowadzono przy natężeniu 40 mA przez około 4 godziny w żelu o długości 18 cm do wyjścia znacznika końca migracji. Żel jest następnie barwiony na błękit alcian, po czym na srebrny techniką S. Pelkopepa i wsp. (J. Bact., /1983/, 170, 6, 2646) specyficzną dla aolSsachagzdów kwaśnych.

Analizę za pomocą elektroforezy przeprowadza się na produkcie częściowo oczyszczonym otrzymanym jako odciek z etapu a i na produkcie oczyszczonym, partia A lub partia B, otrzymanym z etapu końcowego, w celu zweryfikowania niewystępowania ważniejszej modyfikacji rozkładu mas cząsteczkowych N-acetzloheparosapów w trakcie procesów oczyszczania.

Obserwacje otrzymanych profili dla produktu częściowo oczyszczonego otrzymanego z etapu a i produktu oczyszczonego z etapu końcowego (partia A lub partia B) nie wykazała ważniejszych różnic (obecność pasm o intensywności porównywalnej tych samych odległości migracji). Zatem nie ma miejsca znaczniejsza modyfikacja rozkładu ciężarów cząsteczkowych N-acetzlohepagosanu w trakcie jego oczyszczania.

Oznaczanie kwasów uronowych. Ilość kwasu uranowego na jednostkę masy produktu oczyszczonego (partia A lub partia B) otrzymanego z etapu końcowego (Analytical Biochemistry, /1962/, 4, 330-334). Ta metoda oznaczania bazuje na reakcji glikozoaminoglikanów i karbazolem w środowisku kwaśnym na gorąco, co wywołuje zabarwienie różowe proporcjonalne do ilości uwolnionego kwasu uronowego.

Dla partii A, produkt częściowo oczyszczony otrzymany po etapie d i produkt oczyszczony otrzymany po etapie końcowym f mają odpowiednio zawartość kwasu uronowego 1,3 i 2,1 ;7moli/mg.

Dla partii B, produkt oczyszczony otrzymany z etapu końcowego również ma zawartość kwasu uronowego 2,1/z mola/mg. Spektrofotometria w zakresie ultra fioletu i widzialnym.

Oczyszczony produkt (partia A) rozpuszczono w wodzie ultra oczyszczonej i otrzymany roztwór (C = 1 mg/ml) umieszczono w zbiorniku o drodze optycznej 1 cm. Jego widmo absorpcyjne rejestgkwapk między 200 a 600 nm.

Otrzymane widmo pozwala stwierdzić, zwłaszcza na podstawie absorpcji przy 256 nm, że partia A zawiera mniej niż 1% ADN.

Oznaczanie całkowitych białek. Zestaw gotowy do „próby białkowej z firmy BIORAD zastosowano w celu oznaczenia białek całkowitych. Metoda oznaczania bazuje na fakcie, że fala o długości z maksimum aUsorbancji roztworu kwaśnego błękitu (brillant) de Coomassie g-250 przechodzi w zakresie 465-595, podczas gdy białka wiążą się (Reisner i wsp., Anal. Biochem, /1975/, 64, 509).

Zawartość białka całkowitego w partii A jest niższa niż 1,5%.

Oznaczanie wolnych grup aminowych (NH2). Oznaczanie to przeprowadza się metodą oaisapą przez Zeosaku Yosizawa i wsp. w Biochemica et Biophysica Acta, (1967), 141, 358-365.

Parametr zawartości Nh 2 (wyrażonej w zumolach/mg) jest wskaźnikiem ilości jednostek z3-Dglukuropylo-1,3-cr-N-acetylo-D-glukozamipzlowych-(1,4)dezacctylowanych i zanScszczzszczcń, które zawierają wolną grupę aminową.

Partia A i partia B, każda ma zawartość NH₂ 0,05 jumoli/mg. Stosunek NH₂/kwas glukuronowy =0,05/2,1 jest niższy niż 2,5%. Istnieje zatem (w molach) na 100 jednostkach j8-Dglukugopzlo-1,4-ff-N-acetyloglukozoaminylowych-(1,4) do 2,5 jednostek ąwusacharząowzch tego typu dezacetylowanych.

Przykładu. Wytwarzanie N-acetyloheparosanu głównie o małym ciężarze cząsteczkowym (sposó^r Π).

1) Hodowla szczepu bakteryjnego Escherichia coli (K5) i oddzielenie przesączu zawierającego N-acitylo^arasan.

Hodhwlę saczepu Escherichia coli SEBR 3282 i oddzielenie przesączu zawierającego Nacetyloheporo san Γeal^lzowaho spocobkm opisanymw prz^ładei ^{e i}

2o Wyr^ę^mnie i nozyszczanie Nsaczy^ylohęparocąnu głównie o małym ciężarze cząsteczkowy.

Et^w-dializa. 375 ml przesączu poddano dializie sposobem opisanym w przykładzie I [2) Wyo^·^m ank i nczysz5zynie N-ącnlylohepara sdnu gtownis u mafym cⁱ^żyroo ęząz^łecą^zΌwym, etap ^d]. ^Uo diahzte otzaⁿmano około 1020ml oka^arzczoóogo rozm^on^.

167 668

Etap b - oczyszczanie w środowisku kwaśnym. Do dializowanego roztworu dodano odpowiednią ilość 0,5 n roztworu HCl w celu otrzymania pH 3,5. Usunięto wytrącony osad przez odwirowanie, po czym roztwór zakwaszono tym samym kwasem (5 n HCl) dla otrzymania pH równego 1,8. Może wytrącać się osad, który zostanie usunięty przez odwirowanie. Następnie zobojętniono roztwór za pomocą 5 n roztworu NaOH.

Etap c - wytrącanie, odwadnianie i suszenie. Do zobojętnionego roztworu dodano odpowiednią ilość chlorku sodu dla otrzymania roztworu 0,5 m NaCl, po czym dodano 4 objętości etanolu. Pozostawiono na 5 minut w celu powstania osadu, w temperaturze otoczenia. Odwirowano przy 5000 g przez 20 minut. Osad po odwirowaniu rozprowadzono w etanolu, mieszano otrzymaną zawiesinę i pozostawiono na 1 godzinę w temperaturze otoczenia dla osadzenia się osadu. Powtórzono operacje wirowania i zawieszania. Odwirowano od nowa przy 5000 g przez 20 minut. Wysuszono otrzymany osad po wirowaniu w suszarce próżniowej w temperaturze 40°C w przeciągu 24 godzin.

Etap d - hydroliza alkaliczna i dializa. Produkt otrzymany w etapie poprzednim po wysuszeniu rozpuszczono do 2,5% (wag/obj) w 0,25 n roztworze NaOH. Tak otrzymany roztwór utrzymywano przez 2 godziny w temperaturze 50°C. Następnie zneutralizowano za pomocą 5 n roztworu HCl i roztwór zawierający polisacharyd poddano następnie dializie sposobem opisanym w przykładzie I [2) Wyodrębnienie i oczyszczanie N-acetylo głównie o małym ciężarze cząsteczkowym, Etap b]. Po dializie otrzymano około 990 ml roztworu.

Etap e - chromatografia anionowymienna. Do dializowanego roztworu dodano odpowiednie ilości piperazyny, EDTA i tritonu Χ-100 (Prolabo^R) dla uzyskania odpowiednich stężeń 25 mmoli piperazyny, 2 mmole EDTA i 0,2% objętościowych tritonu Χ-100. Następnie pH doprowadza się do 3,5 za pomocą 5 n HCl. Naniesiono ten roztwór na kolumnę Q-Sepharose Fast Flow 400 ml ekwilibrowaną buforem piperazynowym zawierającym 25 mmoli piperazyny, 2 mmole EDTA i 0,2 mmole Tritonu Χ-100 (pH = 3,5). Przemyto buforem piperazynowym, eluowano roztworem 0,5 m NaCl, po czym wytrącono 4 objętościami etanolu. Wysuszono pod próżnią w temperaturze 40°C. Tym sposobem otrzymano około 9,85 g N-acetyloheparosanu.

Etap f - chromatografia ekskluzyjna. Sporządzono roztwór z 4g produktu otrzymanego w etapie poprzednim w 60 ml roztworu buforowego o składzie 20 mmoli tris-HCl pH 7,5 i 1m NaCl, po czym przepuszczono przez kolumnę 200 ml oktylo SepharoseR uprzednio ekwilibrowaną tym samym buforem. Do frakcji nie zatrzymanej dodano 4 objętości etanolu. Przemyto wytrącony osad i wysuszono go w temperaturze 40°C pod próżnią. Tym sposobem otrzymano 3,90 g N-acetyloheparosanu.

3) Charakterystyka N-acetyloheparosanu otrzymanego z różnych etapów oczyszczania.

Widmo jądrowego rezonansu magnetycznego RNM.

Badanie widm RNM protonowego i węgla ¹³C otrzymanych z tym N-acetyloheparosanem potwierdziło identyczność chemiczną produktu z N-acetyloheparosanem opisanym przez W. F. Vanna (Eur. J. Biochem. /1986/, 116, 59-364).

Oznaczanie rozkładu ciężarów cząsteczkowych za pomocą chromatografii ekskluzyjnej.

Rozkład mas cząsteczkowych oznaczono za pomocą HPLC ekskluzyjnej metodą stosowaną do oznaczania rozkładu mas cząsteczkowych N-acetyloheparosanów opisaną w przykładzie I. Frakcja wagowa równa co najmniej 86% łańcuchów, która stanowi partię z przykładu II, posiada masę cząsteczkową w zakresie 1500-15000.

Oznaczanie kwasów uronowych.

N-acetyloheparosan pochodzący z etapu e ma zawartość kwasu uronowego 1,94 pmoli/mg.

Spektrofotometria w zakresie ultra fioletu i widzialnym.

Otrzymane widmo pozwala stwierdzić, że N-acetyloheparosan zawiera do 1% ADN.

Oznaczanie białka całkowitego.

Z_awartość całkowitego białka w tej partii N-acetyloheparosanu jest niższa niż 1%.

Oznaczanie wolnych grup aminowych (NH ₂).

Z_awartość NH ₂ jest niższa 0,1/łmola/mg.

P_rzykład III. Wytwarzanie N-acetyloheparosanu głównie o małej masie cząsteczkowej (Sposób III).

167 668

Hodowla szczepu Escherichia coli (K5).

Hodowlę szczepu Escherichia coli SEBR 3282 realizowano sposobem opisanym w przykładzie I. Otrzymano około 12 litrów hodowli zawierającej N-acetyloheparosan.

2) Lczyszczanie wstępne.

Etap a - wirowanie. Pod koniec hodowli odwirowano otrzymaną zawiesinę (12 litrów) przy 8000 obr/minutę (bądź w zakresie 11000 a 14000 g) przez 20 minut.

Etap b - kontaktowanie z roztworem alkalicznym. Po odwirowaniu otrzymany osad usunięto a warstwę wierzchnią kontaktowano z roztworem NaOH 0,1 n przez około 1 godzinę.

Etap c - filtracja wstępna. Otrzymany roztwór z etapu poprzedniego poddano filtracji wstępnej na filtrze 3M^R serii 300 z polipropylenu.

Etap d - zatężanie na membranie progowej określonego fragmentu. Przesącz otrzymany w etapie c zatężono na wkładce z drążonego włókna AmiconR, progu fragmentu 1000 lub ekwiwalentu. Tym sposobem otrzymano roztwór wzbogacony w N-acetyloheparosan o małej masie cząsteczkowej.

Etap e - dializa. Roztwór wzbogacony w N-acetyloheparosan o małej masie cząsteczkowej dializowano do ultra oczyszczonej wody stale na układzie AmiconR z bardzo wysokim współczynnikiem rozcieńczenia (>10000).

3) Wyodrębnianie i oczyszczanie N-acetyloheparosanu głównie o małej masie cząsteczkowej.

Postępowano tak jak podano w przykładzie I [2) Wyodrębnianie i oczyszczanie Nacetyloheparosanu głównie o małej masie cząsteczkowej, Etap - c Etap f] i otrzymano Nacetyloheparosan o charakterystyce podobnej do charakterystyki partii A lub jak podano w przykładzie II [2) Wyodrębnianie i oczyszczanie N-acetyloheparosanu głównie o małej masie cząsteczkowej.

Etap a -Etap f. N,0-siarczany heparosanów.

Przykład IV. Modyfikacje chemiczne N-acetyloheparosanu głównie o małym ciężarze cząsteczkowym z przykładu I.

1) Modyfikacje chemiczne partti B.

Etap a - częściowa dezacetylacja. Rozpuszczono 500 mg partii B w 10 ml 1n roztworu NaOH. Doprowadzono roztwór do temperatury 50°C i pozwolono, cały czas mieszając. Następnie zneutralizowano roztwór 2n roztworem HCl, dializowano do ultra oczyszczonej wody, po czym liofilizowano.

Etap b - tworzenie soli tetrabutyloamoniowej. Poprzedni liofilizat rozprowadzono w 20 ml wody ultra oczyszczonej. Otrzymany roztwór przeniesiono do kolumny jonowymiennej na bazie polistyrenu sieciowanego diwinylobenzenem (Dowex 50 W 8 z firmy Dow ChemicalR), uprzednio kondycjonowanej w środowisku kwaśnym tak, aby zregenerować postać kwasową produktu. Następnie roztwór zmieszano z 0,4 ml 40% roztworu tetrabutyloamoniowego. Liofilizowano.

Etap c - N,O-siarczanowanie częściowe. Rozpuszczono 421 mg soli otrzymanej w poprzednim etapie w 35 ml dimetyloformamidu i dodano 3,71 g kompleksu trójtlenku siarki - pirydyny (z firmy AldrichR pod oznaczeniem S755-6). Pozostawiono do przereagowania, mieszając, na 6 godzin w temperaturze otoczenia. Do jednej objętości środowiska reakcji dodano chlorku sodu aż do uzyskania stężenia 0,33 m, po czym 2 objętości etanolu. Pozostawiono do utworzenia się osadu. Odwirowano i usunięto warstwę wierzchnią. Osad po wirowaniu rozprowadzono w 0,5 m roztworze NaCl, który zobojętniono. Następnie dodano 2 objętości etanolu. Pozostawiono do utworzenia się osadu, odwirowano i osad po odwirowaniu rozprowadzono w wodzie ultra oczyszczonej. Dializowano do ultra oczyszczonej wody i liofilizowano.

Powtórzono zespół operacji opisanych w powyższym paragrafie. Otrzymano liofilizat o następującej charakterystyce:

* zawartość kwasu uronowego * zawastość wwlr^e^o NH2 * zawartość ugup siarucanowyrh : 1,11 /tmoii/mg : 1,01pmoii/mg : 2,64 na jednostkę dwusacharydową.

Zawartość kwasu uronowego i NH 2 mierzono tak jak podano w przykładzie I.

Zawartość grup siarczanowych (stopień siarczanowania) nazywany również stosunkiem siarcaan/katboksrl, jest przeciętną liczbą grup siarczanowych przez grupę karboksylową; pomiar

167 668 17 plzeclOdcdzono metodą PooacPtomotsycaną oanacaania orccę siarczanowej i grupę karOoksyt lowej ocisaną clzez B. Casu i wsp. w Cnibo-ędrate Resenich, (1975), 39, 168-176.

2) MayęfżkccZc c-odiczca pastu A

Pnitię A loaazisloco na tizy poicjo nazwane: partia A1, partia A2 i partia A3.

Etap c - aezacetylacja częściowa i filtracja żolowa. Partie A1, A2 i A3 traktowano tak jak opisaoo w etapie a dla powyższej partii B, z tą różnicą, że tylko paitia Al jest dinlizownon i liofilizowana. Paitae A1, A2 i A3 frakcjonowano nas3uwnie za pomocą liofilizacji na żelu (również nazywncej chromatogicfią z peimencżą żelową lub c-iomatogrcfią oPsPlcaęZną) w warudkach das3uwcZącęca:

Podłoże kulek o średnicę 25-75 μτη ca bazie allilodekstianu sieciownoooo N,N'-metęlono-OisaPsyloamidom (Sephaicęl S 300 HR z fismy Phnrmncia^R). Stosownoę eluoot: 0,5 m loatwór NaCl.

Spolząaaa się misszaniny frakcji odpowiadające Kav 0,46-1 dla aoparosnou z partii A1,0,43-1 dla howalosanu z partii A2 i 0,43-0,64 dla -eparosanu z partii A3. Frakcjo te naaśwnce są „heparosany filtiowace clzez żel“.

Kav jest współczęnniPiem stosowanym zwykle pizy chromatografii ekskluzyjnej i pozwala nc odtworzenio frakcjonowania zn pomocą chromatografii ekskluzyjneż. Jest określany wzorom:

Ve - Vt

Knv — _

Vo - Vt w którym: Vo oznacza objętość z elucji dnnoj frakcji Vo oznacza objętość z ekskluzji Vt ozonpza całkowitą objętość żolu.

Rozkład mas pząstepaPowśca -opniosanu z paitii A1 bozpośrednio po aozapetylacji pzuściodej jak łówcież hocarosaoów po filtracji nn żelu partii A1, A2 i A3 ozoncaono zn pomocą paromatogrnfii ePsPluzyZnej tec-ciką owisaną w przykładzie I.

Krzywo οΙ^Ζΐ otrzymaow plaed i po filtracji żelowej -opaiosnnu z partii Al przedstndiona oapowieanio na fig. 2 i 3. Niektóro dśoiPi dyprodadaooo z Proędśc- elucji zostnwiooo poniżej w tabeli 3, w której PMo ozoncan ciężar czue3eczPodś taki, żo jodon frakcja wagowa 1W produktu miała masę paustocaPodą węższą od PMo, PM1 oznacza ciężar cząstecaPodw taki, żo część wngowc 10W płoauPtu miała ciężar caąstocaPodw węższy od MP1, MP3 masa caąe3ocaPoda taka, że frakcja wagowa 10Wc produktu miała owsu caąstopaPodu niższą od PM3, PM2 oznncan masę cząstecaPodU odpowiadającą maksymnlooZ absorpcji.

Tabela 3

Rozkład ciężarów caą-toczPawwch hopwła-nnu z partii A1 (nie filtrawncoga nw żolu) i hopnra-nnów filtrowanych nn żolu z partii A1, A2 i A3,

	PMo	PM1	PM2	PM3
Hownła-nn nie filtrowany nn żolu z partii A1	41400	9600	4400	1400
Hopcła-nn filtrowany cw żolu z partii A1	—700	6900	4400	1600
Hopcra-nn filtrawncś on żelu z partii A2	12700	7000	4500	1500
Hewnła-no filtrowany on żolu z partii A3	—300	6900	4500	1500

Porównując figurę 2 i 3 stwioraaano, że filtracja żelowa pozdaln dśoliminować frakcję moioZsaościową o wysokim ciężarze caąstoczPowśm z hoparosnnu.

Tec wynik pokazał to jasno w tabeli 3, gdzie stwierdzono silne obniżenie PMo w nastupstdie plzeprodaazoneZ filtracji żelowej, Hewarosac każdej partii znwieia co cnZmcioZ 90W wagowych łańcuchów o masie pząstocaPowej poniżoj 7000.

Hepaiosanę filtrowane ca żolu z partii A1 i A2 traktowano onstępoio tak jak opisano w plZśPłndaie I [2) Wyodrębnianie i opaśszpzanie N-ccetyloheparoscou głównie o małym piężalzs pząstepzPodśm, Etap c].

167 668

Heparosan po filtracji żelowej z partii A3 oie wytrącano tylko ąiaiizowaoo do wody ultra ocnz-ncnkoej.

Zawartość kwasu uronowego i wolnych grup aminowych oznaczono sposobem opisanym w przykładzie I.

Otrzymane wyniki zestawiono poniżej w tabeli 4. Zawartość pozostałości grup acetylowych oceniono Uiorąc pod uwagę, że występują zarówno grupy glukurnziowe jak i glukozaminowe.

Stopień ączacetyla^ji obliczono jako równy stosunkowi zawartości wolnych grup aminowych do zawartości kwasu uronowego.

Widmo magnetycznego rezkoaoar jądrowego

Badanie widma magentycznego gcnooaosu jądrowego protonu otrzymanego dla heaarosanu po filtracji żelowej z partii A3 pozwoliło założyć, że produkt posiada oczekiwaną budowę.

Stopień ąezacetylacji obliczony przez całkowanie wyniósł 44%. Wartość ta jest bliska obliczonej ze stosunku zawartości wolnych grup aminowych do zawartości kwasu urooowego (41%).

Tabela 4

	ołoaczooc zawartość kwasu urookoego (z/mkli/mg)	oznaczona NH2 (μmkii/mg)	oUiiczkoa zawartość aozk-taikści grap acetyikoych (μ mon/mg)	stopień ączacety- lacji
Hepcgk-ao z partii A1 po filtracji żelowej	2,3	1,10	1,20	48%
Hepcrksco z partii A2 po filtracji żelowej	2,4	1,00	1,40	42%
Hepcgksco z partii A3 po filtracji żelowej	2,6	1,05	1,55	41%

Etap U - częściowe N,O-siarczanowaoie. Traktowano heaarosapy po filtracji żelowej z partii A1, A2 i A3 dezacetzlowane, w sposób kaisany powyżej dla partii B (Etap c - N^-siarczanowanie częściowe) z tą tylko różnicą, że oie powtórzono czynności opisanych w paragrafie pierwszym.

Dla heaogasanu z partii A3 po pierwszym wytrąceniu osad z odwirowania rozprowadzono w ultra oczzsnczonej wodzie, dializowano do wody ultra kczyszcnonej i pozostawiono w roztworze.

Charakterystykę N^-siarczanowanych produktów zestawiono poniżej w tabeli 5.

Tabela 5.

Charakterystyka N,O-sicgczcoóo heaagoscnów z partii A1, A2 i A3 po reakcji częściowego N,O-siarczaokwaoia

	Zawartość NH2 (pmoli/mg)	Stopień -iagcnaokocoia -tk-uock siarczan/kcrbkksyi
N,O--iarcnankwany heaarosao z partii A1	0,10	1,9
N,0-siarcnankwanz hcaarosan z partii A2	0,10	1,9
N,O-siagczankwanz heparosao z partii A3	0,10	1,9

Zwrócono uwagę, że po reakcji N^-siarczanowania zawartość aonostałzch grup NH2 (0,10 zumoli/mg) jest wyższa niż w ocnyszczknzch N-acetyloheparosanach (0,05 z/moli/mg). Siarczanowanie oie jest zatem kompletne przy atomie azotu.

Etap c - N-siarczanowapie całkowite. Zmieszano w objętości 20 ml ultra ocnysnczopej wody na gram użytego produktu N^-siarczanowanego, 1 część wagową produktu N^-siarczanowanego, 1 część wagową wodorowęglanu sodu, 1 c^^^ć wagową kompleksu trójtlenek siarki - pirydyna i aozostαwiook do przereagowapia w temperaturze 55°C mieszając przez 20 godzin. Następnie

167 668 rorcieńcrgao mieszaninę reakcyjną (wskaźnik rozcieńczenia 10), po czym dostosowano przewodnictwo otrzymanego roztworu do 0,5 m roztworu chlorku sodu. Następnie przeprowadzono wytrącanie przez dodanie 2 objętości etanolu, odwirowanie i rozprowadzenie osadu po wirowaniu w 0,5 m roztworem NaCl, po czym drugie wytrącanie przez dodanie 2 objętości etanolu. Po rozprowadzeniu w wodzie ultra oczyszczonej dSzlizowzao do wody ultra oczyszczonej, po czym produkty liofilizowano i wysuszono pod próżnią w temperaturze 40°C.

Widmo magnetycznego rezonansu jądrowego.

Badanie widma RMN1³C N,O-siarcranu hepzaoszau z azasii A3 wykazało, że w związku z tym alkohol w pozycji 6 grupy glikozaminylowej całkowicie przeszedł w postać estru siarczanowego.

Niektóre dane o otrzymanych N,0-siarczaazch heparasanów oznaczone metodami opisanymi poprzednio zebrano w tabeli 6 poniżej.

Tabela 6

Charakterystyka produktów otrzymanych po N-oizaśzznnwαaίu

całkowitym z partii A1, A2 i A3.
	Zawartość kwasu uranowego (p mol/mg)	Zawartość NH2 (praml/mg)	Stopień dezace-	Stopień siarcza- aowaaiz stosunek siaΓśzan/kzrbnkoyl
N,O-siarśzzn heazrooanu z partii A1	1,20	0,02	48%	2,2
N,O-siarśzza heaarooaau z partii A2	1,30	0,02	42%	2,2
N,0-siαrśzzn heazroaznu z partii A3	1,35	0,02	41%	2,1

Stwierdzono, że zawartość pozostałego NH 2 (0,02 μmnli/mg) jest mniejsza i niższa niż dla N-aceSylghepaaoaaau oczyszczonego (0,05 p/mola/mg dla aareiS A i dla azasii B) jak również N,O-siarśraau heaaaosznu otrzymanego z N,O-aizacrznnwaaiz częściowego (ściślej określonego w tabeli 5). Wykazują one całkowity charakter reakcji N-aizacrzaowznSa.

Rozkład ciężarów cząsteczkowych produktów otrzymanych po N-aizacrznowznSu aazlSzowano techniką opisaną w przykładzie I. Krzywą elucji otrzymaną dla produktu z partii A1 przedstawiono na fig. 4. Bardzo podobne profile elucji otrzymano dla produktów z partii A2 i A3. Niektóre rezultaty wywnioskowane z krzywych elucji zestawiono w tabeli 7. Definicje PMo, PM1, PM2 i PM3 są takie same jak podane w tabeli 3.

Tabela 7

Rozkład mas cząsteczkowych produktów otrzymanych po całkowitym N-siarczanowaniu partii A1,

A2 i A3.

	PMo	PM1	PM2	PM3
Partia A1	14700	9000	5700	2600
Partia A2	17500	10000	5800	3400
Partia A3	11600	7600	5000	1800

N,0-sizaczza hepzaoszau z każdej partii zawiera co najmniej 90% wagowych łańcuchów o masie cząsteczkowej poniżej 10000.

W rezultacie partie A1, A2 i A3 zawierają 80% łańcuchów o masie cząsteczkowej zawartej odpowiednio w zakresach 2600-9000, 3400-10000 i 1800-7600.

Przykłady. Modyfikacje chemiczne N-aśetnlohepzaosznu w większości o małym ciężarze cząsteczkowym z przykładu II. Wytwarzanie N,O-aiaacraaów hepzaoszaów, pochodnych Ndezzcetylowznych w 80%.

Stosowane N-zceSylohepzaosany sporządzono sposobem według przykładu II. Zawartość kwasu uranowego w tym produkcie wynosi 2,12 p/moli/mg. Oznaczanie rozkładu ciężarów cząsteczkowych przeprowadzono za pomocą chromatografii ekskluzyjnej sposobem opisanym w

167 668 przykładzie I. Jedna frakcja wagowa równa co najmniej 87,5% posiada łańcuchy o masie cząsteczkowej w zakresie 1500-15000. Pik większościowy rozkładu jest przy wartości około 4900. Ta partia N-acetylohenarosanu nazywana jest partią C.

Etap a - dzzacetylacja częściowa. Rozpuszczono 2,5 g partii C w 50 ml 2 n roztworem NaOH. Roztwór doprowadzono do temperatury 50°C i mieszając pozostawiono w tej temperaturze na 8 godzin do nreerzagowania. Doprowadzono pH do 8 za pomocą 2 n roztworu HCl, dializowano do ultra oczyszczonej wody, po czym liofilizowano. W ten sposób otrzymano 1,96 g produktu.

Stopień N-dezacetylacji.

Oznaczenie wolnych grup aminowych wskazuje, że N-acetyloheparosan został w 80% N-dzeacetylrwanc.

Etap b - N-siarczanowanie. Powyższy liofilizat rozprowadzono w 70 ml wody i dodano 2,5 g Na 2CO3 i 2,5 g kompleksu trójtlenku siarki-trójmetylraminc. Pozostawiono do przereagowania na 20 godzin w temperaturze 55°C.

Przewodnictwo roztworu reakcyjnego doprowadzono do wartości jaką ma 0,5 m roztwór NaCl, przez dodanie wody demineralieowanej i wytrącono 4 objętościami etanolu. Odwirowano. Ponownie rozpuszczono wytrącony osad w 0,5 m roztworze NaCl. Wytrącono 4 objętościami etanolu. Odwirowano.

Osad po odwirowaniu rozprowadzono wodą ultra oczyszczoną, dializowano ten roztwór sposobem już opisanym (przykład I) i liofilizowano. Tym sposobem otrzymano około 2g produktu.

Etap c - tworzenie soli tetrabutyloamoniowej. Lirfilieat otrzymany w poprzednim etapie przekształcono w sól tetrabutyloamoniową sposobem opisanym w przykładzie IV -1) Modyfikacje chemiczne partii B, Etap b]. Otrzymano 2,7 g soli.

Etap d - O-siarczanowania. Rozpuszczono 2,680 g soli otrzymanej w poprzednim etapie w 196 ml formamidu i dodano ii,27g kompleksu trójtlenek siarki - pirydyna. Mieszając pozostawiono do nreereagowania na 6 godzin w temperaturze 30°C. Dodano 1 objętość 2 m roztworu NaCl na 5 objętości roztworu reakcyjnego i doprowadzono pH do 7 za pomocą roztworu NaOH. Ponownie wytrącono 2 objętościami etanolu, odwirowano i osad po odwirowaniu ponownie rozpuszczono w 0,5 m roztworze NaCl. Następnie dodano 2 objętościami etanolu. Pozostawiono do wytrącenia się osadu, odwirowano i osad po odwirowaniu rozprowadzono w 80 ml wody ultra oczyszczonej. Dodano 20 ml 2 m NaCl, po czym 4 objętości etanolu. Pozostawiono do utworzenia się osadu i odwirowano.

Etap e - filtracja żelowa. Produkt otrzymany w etapie d rozprowadzono w wodzie ultra oczyszczonej, po czym frakcjonowano za pomocą filtracji na żelu zgodnie z warunkami opisanymi w przykładzie II -2) Modyfikacje chemiczne partii A, Etap a]. Oznaczono masy cząsteczkowe łańcuchów, które tworzyły kompozycję N,O-siarczanu heparosanu za pomocą chromatografii zksklueyjnej, sposobem opisanym w przykładzie I. Połączono z jednej strony frakcje zawierające łańcuchy o ciężarze cząsteczkowym w zakresie 1500-12000 -ROztwór C/A] i z drugiej strony frakcje zawierające N,O-siarczany heparosanów złożone z łańcuchów o ciężarze cząsteczkowym 2000-30000 -Roztwór C/M].

Do roztworu C(A) dodano 4 objętości etanolu. Pozostawiono do wytrącenia się osadu; odwirowano i osad po odwirowaniu rozprowadzono wodą ultra oczyszczoną. Dializowano do wody ultra oczyszczonej i liofilizowano. Otrzymano 1,8 g produktu.

N,O-siarczan heparosanu otrzymany tym sposobem nazwano partią Ci.

Niektóre cechy charakterystyczne tego N^-siarczanu heparosanu oznaczone metodami opisanymi poprzednio zestawiono poniżej w tabeli 8.

Tabela 8

Charakterystyka produktu odpowiadającego partii Ci

	Zawartość kwasu urnowego ([/mol/mg)	Zawartość NH2 (p mol/mg)	Stopień derαąe- tclaąji	Stopień sulfatacji stosunek grup
Partia Ci	1,6	0,013	80%	1,9

167 668 21

Rozkład ciężarów cząsteczkowych tego produktu oceniono techniką opisaną w przykładzie I. Niektóre wyniki wyprowadzone z krzywej elucji zestawiono w tabeli 9.

Tabela 9

	PMo	PM1	PM2	PM3
Partia C1	9600	7200	5621	2367

Definicja oznaczeń PMo, PM1, PM2 i PM3 jest taka sama jak podano dla tabeli 3.

N,O-siarczan heparosanu z partii Cl zawiera 95% wagowych łańcuchów w zakresie 1500-15000.

Widmo jądrowego rezonansu magnetycznego (RMN)

Otrzymano widma RMN protonu i węgla ¹³C potwierdziło oczekiwaną strukturę produktu. Dotyczyła ona N,O-siarczanu heparosanu.

Badanie stosunku intensywności protonów cukru do protonów acetylu widma protonowego prowadzi do zaproponowania stopnia dezacetylacji 84%. Ta wartość jest bliska wartości obliczonej z zastosowaniem stosunku zawartości wolnych grup aminowych do zawartości kwasu uronowego (80%).

Widmo RMN węgla potwierdziło zwłaszcza, że glukozamina jest prawie całkowicie

N-siarczanowa. Kwas D-glukuronowy nie jest siarczanowy w pozycji 2 i 3.

Etap f - filtracja żelowa. Do roztworu C(M) dodano 4 objętości etanolu, pozostawiono do wytrącenia się osadu, odwirowano, osad po wirowaniu rozprowadzono w wodzie ultra oczyszczonej, dializowano i liofilizowano.

Liofilizat rozpuszczono następnie w 0,5 m roztworze NaCl i frakcjonowano za pomocą filtracji na żelu w warunkach określonych w Etapie e.

Z jednej strony zebrano frakcje zawierające łańcuchy o masie cząsteczkowej w zakresie 1300-21000 [Roztwór C(B)] a z drugiej strony frakcje 14000-37000 [Roztwór C(C)].

Te dwa roztwory traktowano tak jak wskazano poprzednio dla roztworu C(A) i po liofilizacji przez roztwór C(B) otrzymano partię C2 a przez roztwór C(C) partię C3.

W tabeli 10 podano niektóre wyniki wynikające z krzywych elucji dla produktów z partii C2 i partii C3.

Tabela 10

Rozkład mas cząsteczkowych produktów odpowiadających partiom C2 i C3

	PMo	PM1	PM2	PM3
Partia C2	14600	9600	7597	5950
Partia C3	28656	17320	10512	7975

Określenia PMo, PM1, PM2 i PM3 są takie same jak podane przy tabeli 3.

N,O-siarczan heparosanu odpowiadający partii C2 zawiera około 99% wagowych łańcuchów o masie cząsteczkowej zawartej w zakresie 1500-15000 i N,O-siarczan heparosanu odpowiadający partii C3 zawiera około 73% wagowych łańcuchów o masie cząsteczkowej w zakresie 1500-15000.

Przykład VI. Modyfikacje chemiczne N-acetyloheparosanu w większości o małej masie cząsteczkowej z przykładu II - wytwarzanie N,O-siarczanu heparosanu; pochodnej N-dezacetylowanej do 40% mającej stopień sulfatacji 2,6.

N-acetyloheparosan stosowany jako substancja wejściowa sporządzono sposobem opisanym w przykładzie II. Zawartość kwasu uronowego w tym produkcie wynosiła 1,96 umol^mg. Tę partię nazwano partią D.

Etap a - dezacetylacja częściowa. Rozpuszczono 3,7 g partii D w 74 ml 1n NaOH i traktowano sposobem opisanym w przykładzie V (Etap a). Dezacetylację przeprowadzono w atmosferze azotu. Po liofilizacji otrzymano 2,91 g produktu.

Stopień dezacetylacji

Oznaczenie wolnych grup aminowych (NH 2) produktu otrzymanego po liofilizacji wskazuje, że N-acetyloheparosan został w 40% N-dezacetylowany.

167 668

Etap b - N-siarczanowanie. Produkt oStarmrer w etapie poprzednim zadano 3,7 g kompleksu trójtlenek siarki - StójeSrloamiea w obecności 3,7 g Na2CO3 i traktowano sposobem opisanym w przykładzie V (Etap b).

W ten sposób otrzymano około 3 g N-siarczanu heparosanu.

Etap c - tworzenie soli tettabutyloamoniowgj. Około 2g N-siarczanu heparosanu otrzymanego w etapie poprzednim przekształcono sposobem opisanym w przykładzie V (Etap c) w sól SeStαbutrloαmoeiową. Otrzymano 2,99 g liofilizatu.

Etap d - O-siarczanowanie. Poddano reakcji 2,98 g soli otrzymanej w etapie poprzednim z 14 g kompleksu trójtlenku siarki - ttójetrloamiea sposobem opisanym w przykładzie V (Etap d), po czym przeprowadzono wytrącanie i oczyszczanie tak jak opisano w przykładzie V (Etap d). Otrzymano 2,8 g produktu.

Etap e - filtracja żelowa. Produkt otrzymany w etapie poprzednim frakcjonowano za pomocą filtracji żelowej wykorzystując metodę i materiał opisany w przykładzie IV, [2) Modyfikacje chemiczne partii A, Etap a].

Rozkład ciężarów cząsteczkowych frakcji N^-siarczanu heparosanu określono za pomocą chromatografii ekskluzyjnej techniką opisaną w przykładzie I. Wyodrębnione frakcje składały się z N^-siarczanów heparosanów, których większość ma ciężary cząsteczkowe w zakresie 1500-15000.

Frakcje te następnie zatężono i poddano dializie do wody ultra oczyszczonej. Następnie przeprowadzono wytrącanie przez dodanie 5 objętości etanolu, wirowano, rozpuszczono wytrącone ciało w 0,5 m roztworze NaCl i powtórzono czynność wytrącania.

Tak otrzymany produkt oczyszczony poddano drugiemu frakcjonowaniu stosując tryb wymieniony na końcu tego etapu. Rozkład ciężarów cząsteczkowych frakcji oznaczono za pomocą chromatografii ekskluzyjnej sposobem opisanym uprzednio. Zebrano frakcje zawierające produkty o masach cząsteczkowych zawartych w zakresie 4000-8000.

Frakcje poddano dializie, po czym wytrącono produkty dodaniem etanolu. Wytrącony osad zebrano i rozpuszczono w 0,5 m roztworze NaCl. Tak otrzymany roztwór dializowano wobec wody ultra oczyszczonej, po czym liofilizowano. W ten sposób otrzymano 1 g N,O-siarczanu heparosanu nazwanego partia D1.

Charakterystyka i rozkład mas cząsteczkowych tego N^-siarczanu heparosanu podano odpowiednio w tabelach 11 i 12.

Tabela 11

Charakterystyka produktu odpowiadającego partii D1

	Zawartość kwasu uronowego (μ mol/mg)	Zawartość NH2 (umol/mg)	Stopień dezace- tylacji	Stopień sulfatacji stosunek siarczan/ /karboksyl
Partia D1	1,53	0,01	40%	2,60

Tabela 12

Rozkład mas cząsteczkowych produktu odpowiadającego partii D1

	PMo	PM1	PM2	PM 3
Partia D1	15430	10305	6850	4047

Definicja PMo, PM1, PM2 i PM3 jest taka sama jak podano przy tabeli 3.

NO-siarczan heparosanu z partii D1 zawiera 80% wagowych łańcuchów w zakresie 404710305 i około 98,5% wagowych łańcuchów o masie cząsteczkowej zawartej w zakresie 1500-14600. Fig. 5 przedstawia krzywą elucji otrzymaną dla tego N,O-siarczanu heparosanu.

Widmo jądrowego rezonansu magnetycznego (RMN)

Otrzymano widma RMN protonu i węgla 1³C N^-siarczanu heparosanu z partii D1 (widma realizowano na AMX 500, rozpuszczalnik D2O).

Badanie widma RMN protonu i węgla ¹³C potwierdziło strukturę oczekiwanego produktu, to jest N^-siarczanu heparosanu.

167 668 ₂₃

Widmo RMN węgla ^C potwierdziło zwłaszcza, że żadna z grup aminowych motywu glukozoaminowego nie jest w postaci wolnej grupy aminowej (NH2). Glukozamina jest w całości zsulfatowana w pozycji 6, natomiast przeciwnie, wszystkie grupy hydroksylowe kwasu glukuronowego nie są zsulfatowane.

Przykład VII. Modyfikacje chemiczne N-acetyloheparosanu w większości o małej masie cząsteczkowej z przykładu II. Wytwarzanie N,O-siarczanu heparosanu; pochodne N-dezacetylowana w 40% mająca stopień sulfatacji 3.

Jako surowiec stosowano partię N-acetyloheparosanu sporządzonego według sposobu opisanego w przykładzie II. Partię tę nazwano partią E i ma ona zawartość kwasu uronowego 2 umole/mg.

Rozkład ciężarów cząsteczkowych N-acetyloheparosanu oceniono techniką opisaną w przykładzie I. Ten N-acetyloheparosan zawiera około 75% wagowych łańcuchów w zakresie 150015000 a przeciętna masa tych łańcuchów wynosi około 10900. Dla tego przypadku większościowa masa cząsteczkowa wynosi 5135.

Etap e - dezacetylacja częściowa. N-acetyloheparosan w 40% N-dezacetylowano trybem podanym w przykładzie VI (Etap a). Dla przeprowadzenia tej N-dezacetylacji użyto 2,5 g substancji wyjściowej, którą rozpuszczono w 50 ml 1n NaOH. Pod koniec reakcji pH środowiska reakcji doprowadzono do 6 za pomocą HCl, po czym zatężono.

Stopień N-dezacetylacji.

Oznaczenie wolnych grup aminowych (NH 2) wykazało, że N-acetyloheparosan został w 40% N-dezacetylowany.

Etap b - filtracja żelowa. Stosowano kolumnę Sephacryl S 300 HR (5 cm X 100 cm) doprowadzoną do stanu równowagi za pomocą 0,5 m NaCl.

Rozkład mas cząsteczkowych heparosanu zawartego w różnych frakcjach oznaczono za pomocą chromatografii ekskluzyjnej. Zgrupowano frakcje zawierające łańcuchy o ciężarze cząsteczkowym 6000-20000, zatężono na Rotavapor, wytrącono 4 objętościami etanolu i wysuszono wytrącony osad. Tym sposobem otrzymano około 1 g produktu.

Etap c - tworzenie soli tetrabutyloamoniowej i częściowe N,O-siarczanowanie. W celu utworzenia soli tetrabutyloamoniowej, użyto 300 mg produktu otrzymanego w poprzednim etapie i zastosowano postępowanie opisane w przykładzie IV [1) Modyfikacje chemiczne partii B, Etap b]. Otrzymano 490 mg soli, którą rozpuszczono w 30 ml formamidu. Dalej przy N,0-siarczanowaniu częściowym postępowano według sposobu opisanego w przykładzie IV [1) Modyfikacje chemiczne partii B, Etap c - paragraf pierwszy].

Wychodząc z 490 mg soli, którą poddano reakcji z 2,25 g kompleksu trójtlenek siarki pirydyna, otrzymano 400 mg N,O-siarczanu heparosanu.

Etap d - N-siarczanowanie całkowite i filtracja żelowa. 372 mg produktu otrzymanego w etapie powyższym rozpuszczono w 15ml roztworu Na2CO3 5% i zadano 372 mg kompleksu trójtlenku siarki - trójetyloaminy, sposobem opisanym w przykładzie IV [2) Modyfikacje chemiczne partii A, Etap c].

Produkt otrzymany po całkowitej N-sulfatacji frakcjonowano następnie za pomocą filtracji żelowej stosując kolumnę Sephacryl S 300 HR (2,5 cm X 100 cm) i stosując tryb już opisany.

Frakcje mające ciężar cząsteczkowy 6000-2000 zgrupowano, zatężono na Rotavapor, dializowano ekstensywnie do wody ultra oczyszczonej ochłodzonej i liofilizowano. Tym sposobem otrzymano 260mg N,O-siarczanu heparosanu nazwanego partią E1. Charakterystykę tego produktu zestawiono w tabeli 13.

Tabela 14 wskazuje rozkład mas cząsteczkowych łańcuchów tworzących partię E1.

Ten N,O-siarczan heparosanu zawiera około 75% wagowych łańcuchów o masie cząsteczkowej 1500-15000 i około 65% wagowych łańcuchów o masie cząsteczkowej w zakresie 7700-15000.

Tabela 13

	Zawartość kwasu uronowego (pmol/mg)	Zawartość NH₂ (umol/mg)	Stopień dezace- tylacji	Stopień sulfatacji stosunek siarczan/ /karboksyl
Partia E1	1,35	0,01	40%	3

167 668

Tabela 14

Rozkład mas cłą-tccłkoozch produktu odpowiadającego partii E1

	PMo	PM1	PM2	PM3
Partia E1	31238	19671	12029	7748

Definicja PMo, PM1, PM2 i PM3 jest takie same jak podane przy tabeli 3.

Przykład VIII. Wytwarzanie dwóch partii N^-siarczanu heaagosanr; pochodne ącnacctzlowaoe w 80% mające stopień sulfatacji 2,25 i 2,4. Sto-koana substancja wyjściowa, partia F, jest partią N-acctylohepagosaou sporządzonego metodą kaisaoą w przykładzie II. Oznaczenie rozkładu mas cząsteczkowych łańcuchów składających się na teo związek przeprowadzono za pomocą chromatografii ekskluzzjoej według metody oai-aoej w przykładzie I. Badanie profilu krzywej pozwoliło oa stwierdzenie, że partia F zawiera 92% wagowych łańcuchów, których masa cząsteczkowa zawarta jest w zakresie 1500-15000.

Pik większościowy usytuowany jest w pobliżu 4800. Jedna frakcja wagowa partii F co najmniej równa 80% aosiaąa masę cząsteczkową w zakresie 2388-18880.

Zawartość kwasu morowego tego produktu wznk-i 2,4zumole/mg.

Etap a - ąezacetylacja częściowa. Postępowano tak jak opi-αoo w przykładzie V (Etap a) stosując 2,5 g partii F i 50 ml NaOH 2o. Otrzymano 1,6 g ąenacctylowanego w 80%.

Sposób ąenacetylacji oceniono przez oznaczenie wolnych grup aminowych.

Etap U i c - N^-siarczanowanie i tworzenie skh tetgαUutzloamoniowej. Oba te etapy są identyczne z etapami b i c opisanymi w przykładzie V. Otrzymano 4,7 g soli tetrabutyloamoniowej.

Etap d - O-siarczanowanie. Rozpuszczono 2,9 g soli otrzymanej powyżej w 290 ml formamidu i dodano 17,4g kompleksu trójtlenek siarki - pirydyna.

Postępowano tak jak opisano w Etapie d, przykładu V.

Otrzymany po drugim wirowaniu rozpuszczono w wodzie ultra oczyszczonej, po czym dialinooaoo do ultra oczysncnooej wody i liofilizowano. Tym sposoUem otrzymano 3,68 g produktu.

Etap e - filtracja żelowa. Produkt otrzymany w poprzednim etapie rozpuszczooz w 0,5 m roztworze NaCl, po czym napiesiono na kolumnę Sephacryl S 300 HR doprowadzoną do stanu równowagi za pomocą 0,5 m NaCl. Odciek odbierano do kolektora frakcji.

Frakcje mające masę cząsteczkową w zakresie 1488-1808 zgrupowano i natężono na wyparce aotavapog. Wytrącono 4 objętościami etanolu, odwirowano, osad rozprowadzono w wodzie ultra ocnysnczonej, roztwór dializowano ckstcosyonie do wody ultra oczyszczonej, liofilizowano i ozsr-zono. Tym sposobem otrzymano 1,6g N,O-siagcłαnr heparosanu nazwanego partią F1.

Frakcje odpowiadające ciężarom cząsteczkowym w zakresie 500-35000 zebrano, natężono w aotαvapog i do tak otrzymanego roztworu dodano 4 objętości etanolu, odwirowano, osad rozprowadzono w wodzie, tak otrzymany roztwór ąiaiizowαoo do wody ultra oczzsncnonej i liofilizowano. Liofilizat teo od nowa poddano frakcjonowaniu metodą podaną na początku tego etapu.

Rozkład mas cząsteczkowych różnych frakcji oznaczono za pomocą chromatografii ekskluzyjoej według metody oaisanej w przykładzie I. Zgrupowano frakcje, które zawierają N^-siarczan hepagosaoów o masie cząsteczkowej w zakresie 2000-26000. Wytrącono 4 objętościami etanolu, odwirowano i ponownie rozpuszczono osad po odwirowaniu w wodzie destylowanej, dializowano i liofilizowano.

Tym saosoUem otrzymano 0,6 N,O-siαgcnαor heaagosaou nazwanego.

Charakterystyki partii F1 i F2 arzed-tawiooo w tabeli 15. Wyniki wyprowadzone z profilów krzywych elucji zestawiono w tabeli 16.

Tabela 15

Cha]ckterzstzkl N,O-siC]cnaoóo hcpcrk-coóo odpowiadające partiom F1 i F2

	Zawartość kwasu uranowego (zimol/mg)	Zawartość NH2 (ii mol/mg)	Stopień ącłcce- tziccjl	Stopień -uifctacjl stksuock siarczan/ /karbokszi
óc]tίc F1	1,58	<0,01	80%	2,4
Partia F2	1,58	<0,01	80%	2,25

167 668

Tabela 16

Rozkład mas szosleszaomyoh produktów oWsPWiadajoscs9 partiom F1 i F2

	PMo	PM1	PM2	PM3
Partia F1	10700	7700	5800	3300
Partia F2	24400	16325	8600	6900

Definicja PMp, PM1, PM2 i PM3 są jednakowe z podanymi przy tabeli 3.

N,0-siarcrαa5 hepa^^nu z partii F1 zawiera około 99% wagowych łańcuchów o masie cząslecrapwjj w zakresie 15000-15000 a partia F2 zawiera około 84,6% wagowych łańcuchów o masie croslecrkpmej 1500-15000 i około 70% wagowych łańcuchów o masie czosleszkowej w zakresie 6900-13500.

Wi0wρ wαuażtcczaeup rezonansu jądrpmeuρ (RMN)

WiOwa RMN protonu i węgla 1³C otrzymano dla N,O-siarcranu hepa^^nu partii F1 (widma realizomaaj na AMX 500, rozpuszczalnik D 2O).

Badanie widma protonu a zwłaszcza stosunek inlensywaości proloaóm cukrów do protonów dezacetclasji prowadzi do wniosku, że około 20% motywów glukoraminomcch jest N-acetylowaacc9.

Badanie widma ¹³C potwierdza, żż motowy glukozaminowe są N-siarczanowane. Kwas glukuroapwc w większości struktur Owusacharcdowych nie jest O-siarczanowany w pozycji 2 i 3. Preparaty

Preparat A. Wytwarzanie N-9żsarosau głównie o małej wasSż cząsSec5kowżj.

(Sposób I).

1) Ho0owia rczżS5u Es90rri9aia oi^li (K5) i o05ajejaaje ^soczłu jowjrjujożuoo NjOeeirPo9żsarpoαa.

Zaszczepiono 400 ml pożywki D o składzie podanym poniżej w tabeli 17, szczepem Escherichia coli SEBR 3282 i inkubowano mieszając przez 2 godziny w temperaturze 37°C.

Otrzymaną hodowlę wstępną przeniżsioap następnie do Οζ^οι^^ o pojemności 18,51 zawierającego 11 litrów pożywki C o składzie podanym również poniżej w tabeli 17 i inkubowaao przez 6 godzin 30 minut w temperaturze 37°C i przy pH 7,2, pod ciśnieniem parcjalnym tlenu na poziomie 53,5 hPa za pomocą regulacji iniekcji powietrza (do 20 1/min) i mieszano. Następnie dodano glicerynę wprowadzając w sposób ciągły roztwór sterylne zawierający

500 g/litr glicerynę w stosunku 18 g/godzinę przez 16-17 godzin.

Prowadzono hodowlę w tych samych warunkach temperaturę, pH i ciśnienia cząstkowego tlenu aż do prawie całkowitego zużycia glicerynę. Śledzenie DO (λ = 600 nm) zawiesiny hodowli po końcowym dodaniu gliceryny, wykazało stan stacjonarne lub lekką lizę, aż do zatrzymania hodowli w 0ermentorre po 28-30 godzinach.

Ochłodzono następnie pożywkę do temperatury 25°C, po czym przesączono przez membranę o porowatości 0,22ęm. Tęm sposobem otrzymano 12 litrów przesączu zawierającego Nacelylo9osarosaa głównie o wysokiej masie cząsteczkowej.

Tabela 17

Skład i sporządzenia ρ1⁷γ\ν& C i D

Opżemaa C

W 900 ml wpWy ultra pozyszsrpaoj
rozpuszczono w spWanym porządku:
NTA (kwas ailrelptrójpolowy)	1000 wg
K2HPO4	790 wg
Kwas glutaminowy	1100wg
MgCk · 6H2O	500 wg
K₂SC>4	450 wg
FeSO4 · 7H2O	18 mg
CaCk·2H2O	2 wg
NaCl	500 wg
KCl	5000 wg
Roztwór oligp-olowealóm
(z tabeli 2, przykład I)	1 wl
Gliceryna	10000 wg

167 668

Doprowadzono pH do 7,2 za pomocą stężonego wodorotlenku potasu o gęstości 1,38 i uzupełniono na 1000 ml wodą ultra oczyszczoną. Przeprowadzono filtrację sterylizującą przez membranę 0,2 gm.

Roztwór gliceryny. Rozpuszczono 50 g gliceryny w odpowiedniej ilości wody ultra rąecseczonej i doprowadzono do objętości 1000 ml tym samym rozpuszczalnikiem. Przeprowadzono filtrację sterylizującą nreee membranę 0,2 [zm.

Jako środek ni'zząiwpianowy w trakcie fermentacji stosowano Struktol J 673 (Schill i

Pożywka D. Wytwarzanie pożywki D jest identyczne jak pożywki C z tą tylko różnicą, że dodatkowo dodaje się bufor (pH 7,2): kwas 0-morfrlinopronαnosulfonowy po dodaniu środka przeciw pienieniu.

2) Wyodrębnianie i oczyszczanie N-acetyloheparosanu głównie o wysokiej masie cząsteczkowej

N-αcetylohznαrosan głównie o wysokim ciężarze cząsteczkowym wyodrębniano i rązcseceano sposobem według postępowania opisanego w przykładzie II -2) Wyodrębnianie oraz oczyszczanie N_-acZtylohenarosanu głównie o małej masie cząsteczkowej, Etap a - Etap f].

3) Charaketyrstyka otrzymanego N-acetyloheparosanu.

Oe_naczaniz rozkładu mas cząsteczkowych za pomocą chromatografii zksklueyJnej.

WAęto pod uwagę aktualnie stosowane wzorce i rozkład mas cząsteczkowych oceniono w sposób przybliżony.

N-acetyloheparosan otrzymany dla tego preparatu składa się z łańcuchów o masie cząsteczk_owej w _zak_resie 20000-500000 i przeciętnej masie usytuowanej około 100000-200000.

Oznaczanie kwasów uronowych.

Zawartość kwasu uronowego w oczyszczonym produkcie z etapu końcowego wynosi 2,2 [zmoli/mg.

Spektrofotometria w zakresie ultra fioletu i widzialnym.

Otrzymane widmo pozwala stwierdzić, że ta partia zawiera mniej niż 0,5% ADN.

Oznaczanie białek całkowitych.

Zawartość białek całkowitych jest niższa od 0,5%.

Oznaczanie wolnych grup aminowych NH ₂.

Zawartość NH ₂ jest mniejsza od 0,1 [zmola/mg.

Preparat B. Wytwarzanie N-acetylohenarosαnu głównie o wysokiej masie cząsteczkowej (Spo_sób II).

1) Hodowla szczepu Escherichia coli (K5).

Hodowlę szczepu Escherichia coli SEBR 3282 prowadzono sposobem opisanym w Preparacie A. Otrzymano około 121 hodowli zawierającej N-acetyloheparosan głównie o wysokiej masie cząsteczkowej.

2) Oczyszczanie wstępne.

Postępowano tak jak opisano w przykładzie III -2) Oczyszczanie wstępne] stosując w etapie d wkładkę z włókna drążonego AmiconR o progu odcięcia 30000 lub równoważną.

3) Wyodrębnianie i oczyszczanie N-acetyloheparosanu głównie o wysokim ciężarze cząsteczkowym.

Postępowano tak jak wskazano w przykładzie II -3) Wyodrębnianie i oczyszczanie Nacetylohzparrsanu o małym ciężarze cząsteczkowym].

Preparat C.

Modyfikacje chemiczne N-acztylohznαrosαnu głównie o wysokim ciężarze cząsteczkowym z Preparatu A. Jako materiał wyjściowy dla różnych modyfikacji chemicznych stosowano Nαcztcloheparosan nazwany partią G sporządzony sposobem opisanym w przykładzie A. Zawartość kwasu uronowego tego produktu wynosi 2,41 [zmoli/mg.

167 668

Etap a - dezace^^^ częściowa. Rozpuszczono 1,9 g partii G1 w 38,5 ml 2 n NaOH. Roztwór doprowadzono do temperatury 50°C i pozwolono na ptzgtgagowαnie w tej temperaturze w ciągu 8 godzin w atmosferze azotu.

Doprowadzono pH do 8,25 przez dodanie 2 n HCl. Dializowano do ultra oczyszczonej wody, po czym liofilizowano. Tym sposobem otrzymano 1,6 g produktu.

Stopień N-dgzacgSrlacj^.

Oznaczono wolne grupy aminowe (NH 2). N-acetyloheparosan N-dgzaceSylowanr jest w 80%.

Etap b - N-siarczanowanie. Rozpuszczono 1,8 produktu otrzymanego w poprzednim etapie w 57 ml wody ultra oczyszczonej, dodano 1,9 g Na 2CO3 i 1,9 g kompleksu trójtlenku siarki - trójetyloamier i doprowadzono do temperatury 55°C na okres 20 godzin. Następnie doprowadzono przewodnictwo roztworu do przewodnictwa 0,5 m NaCl przez dodanie wody dgminetalizowαngj i wytrącono 4 objętościami etanolu. Wirowano, rozprowadzono osad otrzymany po wirowaniu roztworem 0,5 m NaCl, wytrącono 4 objętościami etanolu i odwirowano.

Osad rozpuszczono w ultra oczyszczonej wodzie i dializowano do wody ultra oczyszczonej sposobem opisanym w przykładzie I, po czym liofilizowano. Otrzymano tym sposobem 1,809 g N,O-siarczanu heparosanu.

Etap c - tworzenie soli tettabusyloamoniowgj. Roztwór ten naniesiono na kolumnę jonitową Dowex 50 W 8 i postępowano tak jak opisano w przykładzie IV [1) Modyfikacje Chemiczne partia B, Etap b].

Po liofilizacji otrzymano około 1,3 g soli.

Etap d - O-siarczanowanie. Sól otrzymaną powyżej rozpuszczamy w 80 ml formamidu, dodano 5,6 g kompleksu trójtlenek siarki - pirydyna. Pozostawiono do przgteagowaeia na 6 godzin w temperaturze 30°C, po czym dodano 16 ml 2m NaCl. Doprowadzono pH do 7 i wytrącono 2 objętościami etanolu. Osad rozprowadzono 0,5 m roztworem NaCl, ponownie wytrącono 2 objętościami etanolu, dializowano do wody ultra oczyszczonej i zatężono na RoSavaporzg.

Etap e - filtracja żelowa. Zatężony roztwór otrzymany w etapie poprzednim frakcjonowano za pomocą filtracji na żelu stosując kolumnę Sephacryl S 300 HR i stosując jako eluent 0,5 m roztwór NaCl.

Wyodrębniono frakcje, które odpowiadają masom cząsteczkowym w zakresie 10000-500000.

Dodano 2 objętości etanolu, po czym zatężono. Następnie dostosowano przewodnictwo do przewodnictwa 0,5 m roztworu NaCl, dodając wody.

Powtórzono frakcjonowanie na żelu i zebrano frakcje zawierające N,O-siarczan heparosanu składający się z łańcuchów o przeciętnych masach cząsteczkowych 100000-200000, jak również frakcje zawierające N,0-siarczan heparosanu składający się z łańcuchów mających przecętne masy cząsteczkowe około 50000 i około 12000.

Do każdej z tych trzech frakcji dodano 5 objętości etanolu, poddano dializie do ultra oczyszczonej wody i roztwory otrzymane po dializie poddano liofilizacji.

Tym sposobem otrzymano 3 partie N^-siarczanów heparosanów:

— prrti a G 1 ess t N,O-srurzαeg/m gppuśureuu tkrddająr/Insi ę z rańcuchσw o masee zząsSgcakowej przeciętnej 100000-200000. Wyodrębniono 0,140g tej partii.

— arma G jess t N,O-siurzreg/m gppnśureuu tkrdPaZąr/msię z rańcucóaw o masee zz-steczkowei przeciętnej około 50000. Wyodrębniono 0,350 g tego N^-siarczanu heparosanu.

— paΓtia G 3 esst N,O-siurareg/m gppuśureuu tkidPająr/m się z rańcucóWv mają^ch przeciętną masę cząsteczkową 12000. Wyodrębniono około 0,100 g tej ostatniej partii.

Charakterystyki tych trzech partii N^-siarczanu heparosanu opisanych w tym przykładzie zestawiono w tabeli 18.

Tabela 18

Charakterystyki N^-siarczanów heparosanów odpowiadające partiom G1, G2 i G3.

	Zawartość kwasu Uumol/mg)	Zawartość NH₂ (umol/mg)	Stopień dezace- srlaąji	Stopień sulfatacji stosunek siarczan/ /karboksyl
Partia G1	1,48	<0,01	80%	2,6
Partia G2	1,45	<0,01	80%	2,6
Partia G3	1,45	<0,01	80%	2,6

167 668

WZÓR 1

CH OH COOH

NHCOCH3 OH

WZÓR 2

NHR' OH

WZÓR 3

WZÓR 5 WZÓR 6

WZÓR 7

Działanie kontaktowe

Czynnik XII Czynnik XIIa

Czynnik XI — Czynnik XI a

I ,

Czynnik IX —Czynnik IXa* j Czynnik ^tkankowy

Czynnik X —Czynnik Χθ—-CzynnikX

Protrombina II Trombina*IIa

I

Fibrynogen ——Fibry na XHIa

SCHEMAT odczytany sygnat

odczytany sygnat

odczytany sygnat ( mV )

_ _ _ masa cząsteczkowa

FIG.3 ro.;

odczytany sygnat

masa cząsteczkowa

FIG.4 ^(D*’ odczytany sygnat ( mV )

FIG.5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 150 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania mieszaniny N,O-siarczanów heparosanów, składającej się z łańcuchów lub mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej 1500-15000, charakteryzujących się powtarzającą się strukturą dwusacharydową o wzorze 1, w którym E oznacza, w 0-80% wymienionych jednostek dwusacharydowych N,O-siarczanów heparosanów, grupę acetylową, a w pozostałych jednostkach dwusacharydowych grupę siarczanową i ewentualnie atom wodoru, G oznacza atom wodoru lub grupę siarczanową, ewentualnie w postaci ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że w pierwszym etapie poddaje się hodowli szczep Escherichia coli (K5), następnie otrzymany w pierwszym etapie N-acetyloheparosan, składający się z łańcuchów lub mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej 1500-15000, charakteryzujących się powtarzającą się strukturą dwusacharydową o wzorze 2, w drugim etapie wyodrębnia się i poddaje oczyszczeniu, ewentualnie z zastosowaniem oczyszczania wstępnego, po czym, w trzecim etapie, tak otrzymany oczyszczony N-acetyloheprosan poddaje się częściowej dezacetylacji przez reakcję z czynnikiem dezacetylującym, a następnie zdezacetylowany heparosan, składający się z łańcuchów lub mieszaniny łańcuchów o masie cząsteczkowej 1500-15000, charakteryzujących się powtarzającą się strukturą dwusacharydową o wzorze 3, w którym R' oznacza, w 0-80% jednostek dwusacharydowych, grupę acetylową, a w pozostałych jednostkach dwusacharydowych atom wodoru, poddaje się, w czwartym etapie, przez reakcję z czynnikiem siarczanującym, bądź częściowemu N,0-siarczanowaniu, bądź częściowemu N,O-siarczynowaniu z następnym etapem całkowitego N-siarczanowania, bądź całkowitemu lub częściowemu N-siarczanowaniu z następnym etapem całkowitego lub częściowego O-siarczanowania, przy czym po zakończeniu każdego z czterech etapów ewentualnie otrzymane produkty poddaje się jedno- lub kilkakrotnie frakcjonowaniu mas cząsteczkowych, a otrzymane produkty pośrednie lub produkt końcowy ewentualnie przeprowadza się w ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
2.Sposób wedhig zasrrz . 1 , znamienny tym , żejako sczzep Escherichia coli (K5 ) stosuje się szczep SEBR 3282 (zdeponowany przy CNCM Instytutu Pasteura w Paryżu, Francja, pod nr I-1013) lub mutant tego szczepu bądź spontaniczny bądź indukowany.
3. Spoób b weduu g zastrz. 1, eayniieeyy yym, ż e oodowl ę sczżeu u Escżerichi a oo)i (K5 ) kontynuuje się co najmniej dwie godziny po zatrzymaniu się przyrastania biomasy.
4.Spoóób weduuę astm. , , enymieeyy yym , ee podzzos wyodrębnżarae i ozzyrczzanie Nacetyloheparosanu przeprowadza się co najmniej jeden etap wytrącania alkoholem etylowym i co najmniej jeden etap chromatografii jonitowej.
5. Spoóób weduuę ast^z . , , eaymieeyy yym, ż e podzzo s wyodrębnianie i ozzyrczzanie N acetyloheparosanu przeprowadza się sekwencję następujących etapów: w etapie a1 realizuje się wytrącanie etanolem, w etapie b1 dializuje się, w etapie c1 przeprowadza się wytrącanie etanolem, a następnie odwadnianie i suszenie, w etapie d1 przeprowadza się oczyszczanie za pomocą chromatografii anionitowej, w etapie ż1 wytrąca się etanolem eluat otrzymany z etapu d1, odwadnia się, suszy i rozdrabnia, przy czym jeden z etapów a1 lub c1 może zostać wyeliminowany.

Ó.Spoóób wedto) ast^z. , , enyInieeyy yym, ee podrzos wyodrębniarae i ozzyrczzanie Nacetylohesarosanu przeprowadza się sekwencję następujących etapów: w etapie a/ dializuje się, w etapie b1 oczyszcza się w środowisku kwaśnym, usuwa zanieczysrczeaia nierozpuszczalne w roztworach wodnych o pH 3,5 i 1,8, w etapie c1 przeprowadza się wytrącanie etanolem, po czym odwadnia się i suszy, w etapie d1 przeprowadza się hydrolizę alkaliczną i dializuje, w etapie e? oczyszcza się za pomocą chromatografii anipnitowżj, w etapie fi' oczyszcza się za pomocą chromatografii anionitowżj, w etapie f1 oczyszcza się za pomocą chromatografii ekskluzyjnej.
7.Sposóe wedłgę ast^z . Ί , eaymieeyy yym, e e Njażstytohepatojan orrzymane z hoPowl i szczepu Escherichia coli (K5) przed wyodrębnianiem i oczyszczaniem poddaje się oczyszczaniu wstępnemu realizowanemu za pomocą sekwencji etapów obejmujących: w etapie a/' odwirowanie

167 668 zawiesiny otrzymanej pod koniec hodowli, w etapie bi kontaktowanie warstwy wierzchniej z roztworem alkalicznym, w etapie ci filtrację wstępną, w etapie di zatężanie na membranie przepuszczającej cząsteczki o ciężarze cząsteczkowym poniżej 1000, w etapie ei dializę, przy czym etap ei może być wyeliminowany.
8. Sposbb według zastrz. 1 , zaamienny tym , ee etap N,Ossiarzznnowania zzęściowego , po którym następuje N-siarczanowanie całkowite przeprowadza się za pomocą bezwodnika siarkowego z zasadą organiczną w rozpuszczalniku wodnym o pH zasadowym.
9. anosbb wdduu g zastrz. 1, zzamizayy ymn, e e o o etapie Nasiaśzzagowania załnowiteo o przeprowadza się frakcjonowanie mas cząsteczkowych.
10. Sposób według zastrz. 1, zazmieaay tym, że etap trzeci stanowi 80% dezacesnlzcję sodem i że etap czwarty obejmuje 4 etapy, a mianowicie: N-siarczanowanie za pomocą kompleksu trójtlenek siarki-pirydyna, wytwarzanie soli setrabutylozmnniowej, O-siarczanowanie za pomocą kompleksu trójtlenek siaaki-pirneyna tak, aby otrzymać stopień siarczanowania, wyrażony stosunkiem grup siarczanowych do grup karboksylowych, w uraniśaśh 1,5-3,0, oraz frakcjonowanie mas molekularnych za pomocą chromatografii ekskluzyjnej.