LV15670B

LV15670B - Jauni adenozilmerkaptāna atvasinājumi kā vīrusu m-RNS kapinga metiltransferāžu inhibitori

Info

Publication number: LV15670B
Application number: LVP-21-16A
Authority: LV
Inventors: Olga BOBIĻEVA; Raitis BOBROVS; Iveta KAŅEPE; Gints KALNIŅŠ; Mihails ŠIŠOVS; Anna Līna BULA; Aigars Jirgensons; Kaspars TĀRS; Kristaps JAUDZEMS
Original assignee: Latvijas Organiskās Sintēzes Institūts
Priority date: 2021-03-10
Filing date: 2021-03-10
Publication date: 2023-11-20
Also published as: WO2022189846A1; LV15670A

Abstract

Izgudrojums attiecas uz medicīnu, galvenokārt uz vīrusu infekcijas ārstēšanu, konkrētāk uz vīrusu m-RNS kapinga metiltransferāzes inhibitoriem. Piedāvāti jauni adenozilmerkaptāna atvasinājumi, to farmaceitiskās kompozīcijas un to izmantošana par m-RNS kapinga metiltransferāzes inhibitoriem.

Description

IZGUDROJUMA APRAKSTS

[001] Izgudrojums attiecas uz medicīnu, galvenokārt uz vīrusu infekciju ārstēšanu, konkrētāk uz vīrusu m-RNS kapinga metiltransferāžu inhibitoriem. It īpaši izgudrojums attiecas uz jauniem adenozilmerkaptāna atvasinājumiem, to farmaceitiskām kompozīcijām un to izmantošanu par m-RNS kapinga metiltransferāžu inhibitoriem.

Zināmais tehnikas līmenis

[002] Koronavīrusi ir izveidojuši m-RNS kapinga sistēmu, lai aizsargātu 5’-galu ar kapinga grupu, kas neatšķiras no eikariotiskā m-RNS kapinga struktūras [1], Kapinga procesu veic metiltransferāzes Nspl4 unNspl6, kas modificē vīrusa m-RNS 5’-gala guanozīna N7 pozīciju un divu secīgo nukleotīdu 2’-OH grupas [2], m-RNS 5’-galaN7-metilguanozīna (m7G) kapings ir nepieciešams efektīvai vīrusa proteīnu translācijai, savukārt divu secīgo nukleotīdu 2'-Ometilēšana ir nozīmīga, lai izvārītos no saimniekorganisma imūnās atbildes [3,4],

[003] Pētījumi ar SARS-CoV-1 ir parādījuši, ka Nspl4 un Nspl6 gēnu mutācijas noved pie būtiski vājināta vīrusa, ko atpazīst iedzimtā (nespecifiskā) imūnsistēma [4,5,6],

[004] Bez tam, pētījumi ar Nspl4 un Nspl6 S-adenozilmetionīna (SAM) analogiem ir parādījuši, ka Nspl4 vai Nspl6 inhibīciju var izmantot, lai ārstētu koronavīrusu infekcijas [7], Tomēr, neskatoties uz līdzšinējām pūlēm, neviens no metiltransferāžu inhbitoriem nav attīstīts līdz klīniskajiem pētījumiem.

Izgudrojuma mērķis un būtība

[005] Vienā aspektā izgudrojums piedāvā metodi vīrusa infekciju ārstēšanai cilvēkiem vai dzīvniekiem, ievadot cilvēkam vai dzīvniekam, kam tas nepieciešams, terapeitiski efektīvu daudzumu savienojuma vai tā zāļu priekštečvielas, vai minētā savienojuma vai tā priekštečvielas farmaceitiski pieņemama sāļa, hidrāta, solvāta vai polimorfa, kur savienojums ir vīrusu m-RNS kapinga metiltransferāzes inhibitors.

[006] Otrā aspektā izgudrojums piedāvā farmaceitisku kompozīciju vīrusu infekciju ārstēšanai, kas satur terapeitiski efektīvu daudzumu kompozīcijas, kas satur (i) savienojumu vai tā zāļu priekštečvielu, vai minētā savienojuma vai tā priekštečvielas farmaceitiski pieņemamu sāli, hidrātu, solvātu vai polimorfu un (ii) farmaceitiski pieņemamu nesēju, kur savienojums ir vīrusu m-RNS kapinga metiltransferāzes inhibitors.

[007] Citā aspektā izgudrojums apraksta savienojuma vai tā zāļu priekštečvielas, vai minētā savienojuma vai tā priekštečvielas farmaceitiski pieņemama sāļa, hidrāta, solvāta vai polimorfa, kur minētais savienojums ir vīrusu m-RNS kapinga metiltransferāzes inhibitors, izmantošanu medikamenta ražošanā vīrusa infekciju ārstēšanai un profilaksei.

[008] Citā aspektā izgudrojums piedāvā savienojuma vai tā zāļu priekštečvielas, vai minētā savienojuma vai tā priekštečvielas farmaceitiski pieņemamu sāļa vai estera, kur minētais savienojums ir vīrusu m-RNS kapinga metiltransferāzes inhibitors, izmantošanu vīrusa infekciju ārstēšanā un profilaksē.

[009] Vienā no izgudrojuma realizācijas variantiem vīrusu m-RNS kapinga metiltransferāzes inhibitors ir savienojums ar formulu (I):

kur R¹, R², R³ R⁴ neatkarīgi ir H, Ci-6alkilgrupa, Cs-iacikloalkilgrupa, C3-i2cikloalkil-Ci6alkilgrupa, C2-6alkenilgrupa, C2-6alkinilgrupa, arilgrupa, biarilgrupa, Ci-6arilalkilgrupa, C26arilalkenilgrupa, C2-6arilakinilgrupa, heteroarilgrupa, Ci-6heteroarilalkilgrupa, C26heteroarilalkenilgrupa, R⁵O(CH2)_n, R⁵S(CH2)n, R⁵OC(=O)(CH2)n, R⁵N(R⁶)C(=O)(CH2)n, R⁵N(R⁶)(CH2)_n, -F, -Cl, -Br, -I, -CF3, -CH2CF3, -CF2CF2H, -OH, -L-OH,-O-L-OH, -OR⁵, -OL-NH2, -O-L-NHR⁵, -O-L-N(R⁵)R⁶, -L-OR⁵,-O-L-OR⁵,-OCF3, -OCH2CF3, -OCF2CF2H, -LOR⁵,-O-L-OR⁵,-OCF3, -OCH2CF3, -OCF2CF2H, SR⁵, SCF3, -CN, -NO2, -NO2, -NH2, -NHR⁵, NR⁵2, -N(R⁵)R⁶, -L-NH2, -L-NHR⁵, -L-NR⁵2, -L-N(R⁵) R⁶,-NH-L-NH2, -NH-L-NHR⁵, -NH-LN(R⁵)R⁶, -NH-L-N(R⁵)R⁶,-NR⁵-L-NH2, -NR⁵-L-NHR⁵, -NR⁵-L-N(R⁵)R⁶, -NR⁵-L-N(R⁵)R⁶, N(R⁵)R⁶, -C(=O)OH, -C(=O)OR⁵, -C(=O)NH2, -C(=O)NHR⁵, -C(=O)N(R⁵)R⁶, C(=O)N(R⁵)R⁶, -NHC(=O)R⁵, -NR⁵C(=O)R⁶, -NHC(=O)OR⁵, -NR⁵C(=O)OR⁶, -OC(=O)NH2, -OC(=O)NHR⁵, -OC(=O)N(R⁵)R⁶, -OC(=O) R⁵NR⁶, -OC(=O)R⁵, -C(=O)R⁵, -NHC(=O)NH2, NHC(=O)NHR⁶, -NHC(=O)NR⁵2, -NHC(=O)N(R⁵)R⁶, -NR⁵C(=O)NH₂, -N(R⁵)C(=O)NHR⁶, NR⁵C(=O)N (R⁵)R⁶, [010] kur:

n ir vesels skaitlis robežās no 0 līdz 1;

un optiskie izomēri, farmaceitiski pieņemami sāļi, hidrāti, solvāti un polimorfi. Izņemot gadījumus, kad: R¹, R², R³, R⁴ ir Η; n nav 0,

R¹, R², R⁴ ir H; R³ ir NO₂; n nav 0.

[011] Vienā variantā ārstēšana ir slimības vai disfunkcijas ārstēšana, kurā iesaistīta vīrusa mRNS kapinga metiltransferāze cilvēka m-RNS kapinga metiltransferāze.

[012] Vienā variantā ārstēšana ir slimības vai disfunkcijas ārstēšana, ko veicina vīrusa m-RNS kapinga metiltransferāze cilvēka m-RNS kapinga metiltransferāzes inhibēšana.

[013] Vienā variantā ārstēšana ir slimības vai disfunkcijas ārstēšana, kas ir ārstēta ar vīrusa mRNS kapinga metiltransferāzes vai cilvēka m-RNS kapinga metiltransferāzes inhibitoriem.

[014] Citā aspektā izgudrojums piedāvā komplektu, kas ietver adenozilmerkaptāna atvasinājumus, kā aprakstīts šeit, vēlams, nodrošināta kā farmaceitiskā kompozīcija un piemērotā konteinerā un/vai piemērotā iepakojumā.

[015] Citā aspektā izgudrojums piedāvā savienojumus, kas iegūstami pēc šeit aprakstītām sintēzes metodēm vai metodēm, kas satur šeit aprakstīto sintēzes metodi.

[016] Citā aspektā izgudrojums piedāvā savienojumus, kas iegūti, izmantojot šeit aprakstīto sintēzes metodi, vai metodi, kas satur šeit aprakstīto sintēzes metodi.

[017] Citā aspektā izgudrojums piedāvā jaunus starpproduktus, kas aprakstīti šeit un, kas ir piemēroti lietošanai šeit aprakstītajās sintēzes metodēs .

[018]Kā būs redzams šīs nozares speciālistam, izgudrojuma viena aspekta iezīmes un vēlamie varianti attieksies arī uz citiem izgudrojuma aspektiem.

Izgudrojuma detalizēts apraksts

[019] Vīrusa nestrukturālie proteīni (Nsp) ir identificēti kā daudzsološa bioloģisko mērķu grupa plaša spektra pretvīrusu zāļvielu izveidošanai pret koronovīrusiem [4,5,6,7].

[020] Testējot jaunus adenozilmerkaptāna atvasinājumus ar vispārīgo formulu (I) un iegūstot datus par to spēju inhibēt Nspl4 un Nspl6, mēs negaidīti atklājām, ka minētie atvasinājumi uzrāda izteiktas inhibitorās īpašības pret minētajiem nestrukturālajiem proteīniem, tāpēc tie ir nozīmīgi vīrusu infekciju ārstēšanā.

[021] Saskaņā ar šī izgudrojuma rezultātiem Nspl4 un Nspl6 inhibēšanas pētījumi demonstrē, ka adenozilmerkaptāna atvasinājumi ir jauna nestrukturālo inhibitoru klase. Vairāki savienojumi no šī izgudrojuma uzrāda nanomolāru vai zemu mikromolāru inhibitoro aktivitāti. Stereoķīmija

[022] Vairākām no šeit parādītajām struktūrām ir norādīta viena vai vairākas specifiskās stereoķīmiskās konfigurācijas. Tāpat vairākām no šeit parādītajām struktūrām nav attēlota stereoķīmiska konfigurācija. Līdzīgi daudzām ķīmiskām struktūrām parādītas stereoķīmiskās konfigurācijas vienā vai vairākās pozīcijās, savukārt citām pozīcijām konfigurācija nav attēlota vienā vai vairākās pozīcijās. Ja ķīmiskajai struktūrai stereoķīmiskā konfigurācija nav attēlota, tad jāuzskata, ka struktūra ietver visus iespējamos stereoizomērus gan individuāli, gan kā stereoizomēru maisījumu (piem., racēmiskos maisījumu).

Kombinācijas

[023] Šeit nepārprotami ir atklāta katra un jebkura saderīga iepriekšminēto variantu kombinācija tā, it kā katra un ikviena kombinācija būtu individāli un tieši uzskaitīta.

Izgudrojuma īstenošanas piemēri

[024] Sekojošie piemēri papildus ilustrē izgudrojumu, taču to nekādā veidā nevar interpretēt kā izgudrojuma pielietojuma ierobežojumu.

[025] Kā šī izgudrojuma piemēri tika iegūti šādi adenozilmerkaptāna atvasinājumi ar vispārīgo formulu (I):

ID	Savienojums	Struktūra
OBV-119	1.1	h₂n 1 L ^x> ^y^ci ^N. O C jT Z y ·' hct Sh
OBV-169	1.2	h₂n JL N ^N. O C X Z Z 'S^Z/^'CO₂H HCT ΌΗ
OBV-124	1.3	H₂N N ^;'ν^^ν ° X X γ V' s-^'^:^''CO₂h HCT ΌΗ
OBV-003	1.4	X CM o o 0 ω ° I ^H\^Z Y ¹j I z
OBV-081	1.5	X O ω V/λ ω ( X O J *

Vispārīgais sintēzes apraksts

[026] Savienojumi (1.11.4) ir iegūti, izmantojot 1. sintēzes shēmu. Vispirms adenozīnu (2) pārveidoja par hlorīdu (3), tad hlorīdu (3) izmantoja merkaptobenzoskābju alkilēšanas reakcijās.

1. shēma:

nh₂

Reaģenti un apstākļi: (a) i SOCb, piridīns, MeCN, 0 °C - istabas temperatūra; ii NH4OH, MeOH; (b) 3-merkaptobenzoskābe, CS2CO3, DMF, istabas temperatūra.

[027] Savienojuma (1.5) iegūšanai kā izejvielu izmanto aizsargātu adenozīnu (4) (2. shēma). Vispirms to pārveido par S-acetil-5'-tioadenozīnu (5), tad to deacetilē un alkilē, lai iegūst starpproduktu (6.1). Pēc acetonīda aizsarggrupas nošķelšanas iegūst mērķsavienojumu (1.5).

2. shēma:

Reaģenti un apstākļi: (a) DIAD, PPha, AcSH, THF, 0 °C; (b) RHal, NaOMe, MeOH, -30 °C istabas temperatūra; (c) LiOH, THF, H2O, istabas temperatūra; (d) HCOOH, ūdens, istabas temperatūra vai 50 °C.

5'-Hloro-5'-dezoksiadenozīns (3)

[028] Adenozīna (2) (1,50 g, 5,61 mmol) suspensijai sausajā acetonitrilā (6 ml) argona atmosfērā piepilina tionilhlorīdu (1,2 ml, 16,5 mmol) temperatūrā zem 4 °C, dzesējot reakcijas maisījumu ledus vannā. Tad pievieno piridīnu (0,9 ml, 11,1 mmol) temperatūrā zem 4 °C un maisa ledus vannā 3 stundas, tad istabas temperatūrā 16 stundas. Reakcijas maisījumam pievieno ūdeni (15 ml). Šķīdumu neitralizē, lēni pievienojot nātrija bikarbonātu līdz pH 5.

[029] Nogulsnes nofiltrē, mazgā ar aukstu ūdeni (2x5 ml), žāvē vakuumā un iegūst 1,36 g (77 %) sulfmiladenozīna. Sulfiniladenozīna (1,36 g) suspensijai metanolā (15 ml) pievieno amonija hidroksīdu (1,5 ml) un maisa 1 stundu. Nogulsnes nofiltrē, mazgā ar aukstu metanola un amonija hidroksīda šķīdumu (10:1,2x5 ml), tad žāvē vakuumā un iegūst 1,11 g (69 %) produkta (3). Balta cieta viela.

[030] Ή KMR (300 MHz, DMSO-cfe) δ 8,34 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,29 (br s, 2H), 5,93 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,60 (br d, 1H), 5,46 (br d, 1H), 4,75 (q, J= 5,2 Hz, 1H), 4,22 (d, J= 4,5 Hz, 1H), 4,26^1,18 (m, 1H), 4,14-4,05 (m, 1H), 3,94 (dd, J= 11,6; 5,0 Hz, 1H), 3,84 (dd, J= 11,6; 6,3 Hz, 1H).

[031] Savienojumu (1.1-1.4) iegūšana. Vispārīgā metode A.

3-((((25,35,47?,57?)-5-(6-amino-97T-purin-9-il)-3,4-dihidroksitetrahidrofuran-2il)metil)tio)benzoskābe (1.4)

[032] 5’-Hloro-5'-dezoksiadenozīna (3) (70 mg, 0,25 mmol), 3-merkaptobenzoskābes (42 mg, 0,27 mmol) un cēzija karbonāta (0,18 g, 0,55 mmol) maisījumu sausā DMF (1,2 ml) maisa slēgtā ampulā argona atmosfērā 5 stundas. Šķīdinātāju ietvaicē, tad atlikumu izšķīdina ūdenī (5 ml), atdzesē ledus vannā un neitralizē līdz pH 5 ar 1 N HC1. Nogulsnes nofiltrē, mazgā ar ūdeni (2x2 ml) un žāvē vakuumā. Atlikumu hromatografē uz apgrieztās fāzes C18, eluents acetonitrils - 0,1 % HCOOH, gradients 5-80 %, tad liofilizēja un ieguva 30 mg (30 %) produkta (1.4). Balta cieta viela. AEŠH tīrība 97 %.

[033] 'HKMR(400 MHz, DMSO-tZ6) δ 8,33 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,85 (t,J= 1,6 Hz, 1H), 7,73 (dt, 7,8; 1,3 Hz, 1H), 7,59 (ddd, J= 7,8; 1,9; 1,1 Hz, 1H), 7,41 (t, J= Ί,8 Hz, 1H), 7,29 (s, 2H), 5,89 (d, 5,9 Hz, 1H), 5,53 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 5,41 (d, J=4,9 Hz, 1H), 4,82 (q, J =

5,6 Hz, 1H), 4,23 - 4,18 (m, 1H), 4,01 (ddd, J = 7,0; 5,9; 3,3 Hz, 1H), 3,53-3,30 (m, 2H, pārklājas ar ūdeni). ¹³CKMR(100 MHz, DMSO-d6) δ 166,9; 156,1; 152,7; 149,5; 140,0; 136,8; 132,3; 131,7; 129,4; 128,4; 126,7; 119,3; 87,6; 82,8; 72,8; 72,6; 35,1. HRMS (ESI/TOF-Q) m/z: [M + H]⁺ aprēķ. C17H18N5O5S, 404,1029; atrasts: 404,1036.

Pec vispārīgās metodes A tika iegūti sekojoši savienojumi:

Nr	Struktūra
1.1	h₂n X , N Cl o XX ( > S^{y <}-^'CO₂H hc/ Sdh	Ή KMR (400 MHz, DMSO-J₆) δ 8,34 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,67 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,47 (dd, J = 8,5; 2,4 Hz, 1H), 7,42 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,29 (br s, 2H), 5,89 (d, J= 5,8 Hz, 1H), 5,53 (br s, 1H), 5,40 (br s, 1H), 4,844,78 (m, 1H), 4,22-4,17 (m, 1H), 4,00 (ddd, J= 7,0; 5,8; 3,4 Hz, 1H), 3,47 (dd, J = 5,8; 13,7 Hz, 1H), 3,42 - 3,35 (m, 1H, pārklājas ar ūdeni). ¹³C KMR (100 MHz, DMSO-ί/ό) δ 166,3; 156,1; 152,7; 149,5; 140,0; 135,6; 132,3; 131,6; 131,0; 129,5; 128,7; 119,2; 87,6; 82,6; 72,7; 72,6; 35,1. HRMS (ESI/TOF-Q) m/z: [M + H]⁺ aprēķ. C17H17N5O5SCI, 438,0633; atrasts: 438,0648.
1.2	h₂n λ N N' ' ^N'^^N 0 £T hc? £	’H KMR (400 MHz, DMSO-tZ₆) δ 13,48 (br s, 1H), 8,34 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,64 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,59 (d, 8,5 Hz, 1H), 7,39 (dd, J- 8,5; 2,4 Hz, 1H), 7,30 (br s, 2H), 5,89 (d, J= 5,9 Hz, 1H), 5,53 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 5,39 (d, 4,8 Hz, 1H), 4,81 (q, J= 5,5 Hz, 1H), 4,22-4,17 (m, 1H), 4,00 (ddd, J = 7,2; 5,8;

		3,4 Hz, 1H), 3,47 (dd, J= 13,8; 5,8 Hz, 1H), 3,39 (dd, J = 13,8; 7,2 Hz, 1H). ¹³C KMR (100 MHz, DMSOί/6)δ 166,9; 156,1; 152,6; 149,4; 140,0; 136,3; 134,4; 134,1; 131,4; 129,2; 119,2; 116,7; 87,5; 82,6; 72,7; 72,6; 34,9. HRMS (ESI/TOF-Q) m/z: [M + H]⁺ aprēķ. Ci7Hi7N₅O5SBr, 484,0128; atrasts: 484,0139.
1.3	h₂n A . N 0 ... XI Hc/ \)H	Ή KMR (400 MHz, DMSO-i/₆) δ 13,29 (br zs, 1H), 8,34 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,92 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,70 (dd, J=8,3; 1,9 Hz, 1H), 7,58 (d,J= 8,3 Hz, 1H), 7,29 (br s, 2H), 5,92 (d, J= 5,8 Hz, 1H), 5,54 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,45 (d, J= 4,6 Hz, 1H), 4,85 (q, J= 5,4 Hz, 1H), 4,27 (q, J= 4,4 Hz, 1H), 4,08 (ddd, J= 7,2; 5,8; 3,3 Hz, 1H), 3,54 (dd, J= 13,2; 5,8 Hz, 1H), 3,47 (dd, J = 13,2; 7,2 Hz, 1H). ¹³C KMR (100 MHz, DMSO-ί/ό) δ 166,3; 156,0; 152,6; 149,4; 140,0; 136,3; 135,5; 130,4; 129,8; 127,5; 127,1; 119,2; 87,7; 82,2; 72,9; 72,6; 34,0. HRMS (ESI/TOF-Ģ) m/z: [M + H]⁺aprēķ. C17H17N5O5SCI, 438,0633; atrasts: 438,0632.

[0341 5'-Acetiltio-5'-dezoksi-2',3'-O-izopropilidenadenozīns (5)

Diizopropilazidokarboksilātu (0,6 ml, 3,05 mmol) piepilina 5 min laikā trifenilfosfina (0,80 g, 3,06 mmol) šķīdumam sausajā THF (5 ml), dzesējot maisījumu ledus vannā. Pēc 30 min pievieno 2',3'-O-izopropilidēnadenozīnu (4) (0,47 g, 1,53 mmol) un turpina maisīšanu 0°C temperatūrā 10 min. Tad reakcijas maisījumam pievieno tioetiķskābes (0,22 ml, 3,08 mmol) šķīdumu sausajā THF (5 ml), maisa 1 stundu ledus vannā, tad sasilda līdz istabas temperatūrai. Šķīdinātāju ietvaicē un atlikumu hromatografe uz silikagela, eluents EtOAc:EtOH (3:1) petrolejas ēteris, gradients 20-80 %, iegūst 0,44 g (78 %) produkta (5). Balta cieta viela.

[035] Ή KMR (300 MHz, CDC1₃) δ 8,36 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 6,06 (d, J= 2,1 Hz, 1H), 5,72 (brs, 2H), 5,51 (dd,J=6,4; 2,1 Hz, 1H), 4,97 (dd, J = 6,4; 3,1 Hz, 1H), 4,34 (td, J= 6,9; 3,1 Hz, 1H), 3,29 (dd, J= 13,8; 7,2 Hz, 1H), 3,18 (dd, J= 13,8; 6,6 Hz, 1H), 2,34 (s, 3H), 1,60 (s, 3H), 1,39 (s, 3H).

[036] Savienojumu (6) iegūšana. Vispārīgā metode B.

3-(((((3 a5,45,6J?,6a/?)-6-(6-amino-9/7-purin-9-il)-2,2-dimetiltetrahidrofuro [3,4d][1.3]dioksol-4-il)metil)tio)metil)benzoskābe (6.1).

[037] 5'-Acetiltio-5'-dezoksi-2',3'-O-izopropilidēnadenozīna (5) (0,11 g, 0,30 mmol) un metilm3-(bromometil)benzoskābes estera (76 mg, 0,33 mmol) šķīdumam sausajā metanolā (1,5 ml) argona atmosfērā -30 °C temperatūrā piepilināja nātrija metoksīda šķīdumu metanolā (5,4 M, 0,12 ml, 0,65 mmol). Šķīdumu maisa 1 stundu -30°C temperatūrā, tad istabas temperatūrā 3 stundas. Šķīdinātāju ietvaicē. Atlikumu atšķaida ar EtOAc, mazgā ar pies. NH4CI šķīdumu, ūdeni, pies. NaCl šķīdumu, žāvē virs bezūdens Na2SO4 un ietvaicē.

[038] Atlikumu hromatografe uz silikagela, eluents EtOAc:EtOH (3:1) - petrolejas ēteris, gradients 20-60 %, iegūst 90 mg starpprodukta ar piemaisījumiem, kuru uzreiz izmantoja nākamajā reakcijā. Šo jēlproduktu maisa ar LiOH (14 mg, 0,58 mmol) THF (2 ml) un ūdeni (1 ml) istabas temperatūrā 22 stundas. Šķīdinātāju ietvaicē un atlikumu izšķīdina ūdenī (3 ml), paskābina līdz pH 3 ar 1 N HC1. Produktu ekstrahē ar EtOAc (2 xl5 ml), mazgā ar ūdeni, pies. NaCl šķīdumu, žāvē virs bezūdens NazSO4 un ietvaicē. Atlikumu mazgā ar metanolu, žāvē vakuumā un iegūst 70 mg (50 %) produkta (6.1). Balta cieta viela.

[039]'H KMR (400 MHz, metanols-^) δ 8,24 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,92 (t, J= 1,5 Hz, 1H), 7,83 (dt, J= 7,7; 1,4 Hz, 1H), 7,37 (dt, J= 7,7; 1,6 Hz, 1H), 7,29 (t, J= Ί,Ί Hz, 1H), 6,12 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,42 (dd, J= 6,4; 2,4 Hz, 1H), 4,94 (dd, J= 6,4; 3,2 Hz, 1H), 4,27 (td, J= 6,T, 3,2 Hz, 1H), 3,73 (s, 2H), 2,73 (dd, J= 13,8; 6,8 Hz, 1H), 2,66 (dd, J= 13,8; 6,6 Hz, 1H), 1,54 (s, 3H), 1,33 (s, 3H). ¹³C KMR (100 MHz, metanols-^) δ 169,6; 156,7; 152,9; 150,0; 142,2; 140,3; 134,5; 132,2; 131,1; 129,5; 129,4; 120,6; 115,5; 91,6; 88,2; 85,2; 85,1; 36,8; 34,5; 27,4; 25,5. HRMS (ESI/TOF-Q) m/z: [M + H]⁺ aprēķ. C22H24N5O5S, 458,1493; atrasts: 458,1500.

[040] Savienojuma (1.5) iegūšana. Vispārīgā metode C.

il)metil)tio)metil)benzoskābe (1.5).

Acetonīdu (6.1) (70 mg, 0,15 mmol) izšķīdina ledus aukstajā HCOOH šķīdumā ūdenī (50 %, 1 ml) un maisa istabas temperatūrā 20 stundas. Šķīdinātāju ietvaicē, atlikumu aplej ar EtOH un ietvaicē. Atlikumu mazgā ar karstu metanolu, tad ar acetonitrilu, žāvē vakuumā un iegūst 46 mg (72 %) produkta (1.5). Balta cieta viela. AEŠH tīrība 91 %.

[041] Ή KMR (400 MHz, DMSO-ūk) δ 12,95 (br s, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 7,89 (ī,J = 1,5 Hz, 1H), 7,80 (dt, J= 7,7; 1,5 Hz, 1H), 7,46 (dt, J= Ί,Ί-, 1,5 Hz, 1H), 7,39 (t, J = Ί,Ί Hz, 1H), 7,28 (s, 2H), 5,87 (d, J= 5,6 Hz, 1H), 5,48 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,30 (d, J= 5,1 Hz, 1H), 4,73 (q, J=5,6 Hz, 1H), 4,18-4,13 (m, 1H), 4,01 (td, J= 6,4; 3,9 Hz, 1H), 3,82 (s, 2H), 2,84 (dd, J= 13,9; 5,9 Hz, 1H), 2,70 (dd, J= 13,9; 6,9 Hz, 1H). ¹³C KMR (100 MHz, DMSO-J₆) δ 167,2; 156,1; 152,7; 149,4; 140,0; 139,2; 133,3; 131,0; 129,7; 128,6; 127,8; 119,2; 87,6; 83,6; 72,6; 72,5; 35,2; 33,4. HRMS (ESI/TOF-Q) m/z: [M + H]⁺ aprēķ. C18H20N5O5S, 418,1180; atrasts: 418,1189.

In vitro testi

[042] Savienojumiem pārbaudīta Nspl4 and Nspl6 inhibitoru inhibitora aktivitāte in vitro atbilstoši aprakstītai procedūrai.

[043] Methiltransferāzes aktvitāte noteikta ar EPIgeneous Methyltransferase Assay komplektu, kas mēra SAM konversiju SAH, atbilstoši ražotāja norādījumiem.

[044] Enzimātiskā reakcija veikta platēs ProxiPlate-384 Plus ar tilpumu 10 ml. Reakcijas buferis sastāvēja no 40 mM Tris-HCl pH 8,3 (pH 8,0 Nspl6) un 100 mM NaCl (vai 10 mM KC1 tikai Nspl6), 1 mM DTT, 2 mM MgCh, 0,01 % Tween20. Testa iedobēs, kas saturēja iepriekš izšķīdinātus inhibitorus pievieno 4 ml attīrīta rekombinantā proteīna Nspl4 ar 0,4 mM vai Nspl6 ar gala koncentrāciju 3 mM. Reakcija sākta ar 4 ml maisījuma, kas satur gan 4 mM GpppG (Jena Bioscience, kat.nr. NU854), gan ~5 μΜ m7GpppA-RNS (Nspl6 gadījumā) un SAM ar 10 mM gala koncentrāciju un inkubē 37 ° C 20 minūtes (2 stundas Nspl6).

[045] Visi savienojumi izšķīdināti 100 % DMSO (0,1 % gala DMSO) un testēti 100 μΜ divos eksemplāros. IC50 vērtības tika noteiktas savienojumiem, kuru inhibējošā iedarbība pārsniedza 50 %.

[046] Lai noteiktu atbrīvoto SAH daudzumu, reakcija tika apturēta pievienojot 2 ml EPIgēnu detektēšanas buferšķīduma. Pēc 10 min inkubēšanas istabas temperatūrā pievienoti detektēšanas reaģenti: vispirms 4 ml SAH-d2 konjugāta 1/16 atšķaidījumā, pēc tam 4 ml AntiSAH-Lumi4-Tb 1/100 atšķaidījumā. Homogēnās fluorescences ar izšķirtspēju laikā (HTRF) signāli reģistrēti, izmantojot Hidex Sense (Somija) ar ierosmes filtru pie 337 nm un fluorescences viļņa garuma mērījumiem pie 620 un 665 nm, integrācijas aizturi 150 ms un integrācijas laiku 400 ms.

[047] Rezultāti tika analizēti, izmantojot divu viļņu garuma signāla attiecību: [intensitāte (665 nm)/intensitāte (620 nm)] * 104 (HTRF attiecība).

Vidējā HTRF attiecību katram paraugam tika aprēķināta sekojoši:

Vidējais HTRF koeficients = vidējais parauga HTRF koeficients - tukšā HTRF attiecība, kur tukšais ir signāls ar savienojumu (vai DMSO kontrolparaugā) un Anti-SAH-Lumi4-Tb.

[048] Inhibīcija procentos tika aprēķināta, izmantojot šādu formulu katram inhibitora atšķaidījumam:

Inhibīcija, % = 100-(maksimālā signāla komp. - minimālā signāla komp.) * 100/(maksimālā signāla kontrole - min. signāla kontrole), kur “maksimālais signāls” ir signāla attiecība bez olbaltumvielām (negatīvā kontrole) un “min. signāls” signāla attiecība izlasē. IC50 vērtība aprēķināta, izmantojot programmu Graph Pad Prism® 8.0.

[049] 1. Tabula Adenozilmerkaptāna atvasinājumu bioloģiskā aktivitāte:

ID	Savienojuma Nr.	IC₅₀ Nsp 14 (uM)	ICso Nsp 16 (uM)
OBV-119	1.1	0,02	-
OBV-124	1.3	1,3	-
OBV-003	1.4	0,16	0,04
OBV-081	1.5	0,0080	0,004

Informācijas avoti

1. Decroly, et al. Nat. Rev. Microbiol. 2011, 10, 51

2. Bouvet, M et al. PLoS Pathog. 2010, 6, e 1000863

3. Decroly, E et al. PLoS Pathog. 2011, 7, el002059

4. Chen, Y. at al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2009, 106, 3484

5. Chen, Y. et al. J. Virol. 2013, 87, 6296

6. Menachery, V. D. et al. J. Virol. 2014, 88, 4251

7. Pugh, C. S. and Borchardt, R. T. Biochemistry 1982, 21, 1535

Claims

1. Savienojums ar vispārējo formulu (I):

kur:

R¹, R², R³ R⁴ neatkarīgi ir H, Ci-6alkilgrupa, C3-i2cikloalkilgrupa, C3-i2cikloalkil-Ci-6alkilgrupa, C2-6alkenilgrupa, C2-6alkinilgrupa, arilgrupa, biarilgrupa, Ci-6arilalkilgrupa, C2earilalkenilgrupa, C2-6arilakinilgrupa, heteroarilgrupa, Ci-6heteroarilalkilgrupa, C26heteroarilalkenilgrupa, R⁵O(CH2)n, R⁵S(CH2)n, R⁵OC(=O)(CH2)n, R⁵N(R⁶)C(=O)(CH2)n, R⁵N(R⁶)(CH2)_n, -F, -Cl, -Br, -I, -CF3, -CH2CF3, -CF2CF2H, -OH, -L-OH, -O-L-OH, -OR⁵, -OL-NH2, -O-L-NHR⁵, -O-L-N(R⁵)R⁶, -L-OR⁵,-O-L-OR⁵,-OCF3, -OCH2CF3, -OCF2CF2H, -LOR⁵,-O-L-OR⁵, -OCF3, -OCH2CF3, -OCF2CF2H, SR⁵, SCF3, -CN, -NO2, -NO2, -NH2, -NHR⁵, -NR⁵2, -N(R⁵)R⁶, -L-NH2, -L-NHR⁵, -L-NR⁵2, -L-N(R⁵) R⁶, -NH-L-NH2, -NH-L-NHR⁵, -NHL-N(R⁵)R⁶, -NH-L-N(R⁵)R⁶, -NR⁵-L-NH2, -NR⁵-L-NHR⁵, -NR⁵-L-N(R⁵)R⁶, -NR⁵-L-N(R⁵)R⁶, -N(R⁵)R⁶, -C(=O)OH, -C(=O)OR⁵, -C(=O)NH2, -CHJjNHR⁵, -C(=O)N(R⁵)R⁶, C(=O)N(R⁵)R⁶,-NHC(=O)R⁵, -NR⁵C(=O)R⁶, -NHC(=O)OR⁵, -NR⁵C(=O)OR⁶, -OC(=O)NH2, -OC(=O)NHR⁵, -OC(=O)N(R⁵)R⁶, -OC(=O) R⁵NR⁶,-OC(=O)R⁵, -C(=O)R⁵,-NHC(=O)NH2, NHC(=O)NHR⁶, -NHC(=O)NR⁵2, -NHC(=O)N(R⁵)R⁶, -NR⁵C(=O)NH2, -N(R⁵)C(=O)NHR⁶, -NR⁵C(=O)N (R⁵)R⁶, kur:

n ir vesels skaitlis robežās no 0 līdz 1;

un optiskie izomēri, farmaceitiski pieņemami sāļi, hidrāti, solvāti un polimorfi; izņemot gadījumus, kad: R¹, R², R³, R⁴ ir Η; n nav 0;

R¹, R², R⁴ ir H; R³ ir NO₂; tad n nav 0.

2. Savienojums saskaņā ar 1.pretenziju izmantošanai slimības ārstēšanai, kuru izraisījusi koronavīrusa infekcija.

3. Farmaceitiska kompozīcija, kas satur savienojumu saskaņā ar 1.pretenziju (i) adenozilmerkaptāna atvasinājumu vai farmaceitiski pieņemamu sāli, solvātu, morfoloģiskas formas un zāļu priekštečvielas un (ii) farmaceitiski pieņemamu nesēju.

12 LV 15670

4. Farmaceitiska kompozīcija saskaņā ar 3.pretenziju, kur minētais medikaments tiek ievadīts cilvēkam vai dzīvniekam.