LT5706B - Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases - Google Patents
Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases Download PDFInfo
- Publication number
- LT5706B LT5706B LT2009032A LT2009032A LT5706B LT 5706 B LT5706 B LT 5706B LT 2009032 A LT2009032 A LT 2009032A LT 2009032 A LT2009032 A LT 2009032A LT 5706 B LT5706 B LT 5706B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- dna
- methyltransferase
- biomolecule
- hmc
- targets
- Prior art date
Links
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 10
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 144
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims description 14
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical group NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 108010005512 Cytosine 5-methyltransferase Proteins 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 10
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 8
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 7
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 7
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 4
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- VSYJKCYIIMVYOK-NYNCVSEMSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methyloxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C1=CC(N)=NC(=O)N1[C@@]1(C)C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 VSYJKCYIIMVYOK-NYNCVSEMSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 claims 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 abstract description 17
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 35
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 35
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 27
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 12
- -1 hnRNA Proteins 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- ZKZBPNGNEQAJSX-REOHCLBHSA-N L-selenocysteine Chemical compound [SeH]C[C@H](N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 101710188297 Trehalose synthase/amylase TreS Proteins 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 229930182853 L-selenocysteine Natural products 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010063593 DNA modification methylase SssI Proteins 0.000 description 5
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 5
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 102220482909 Myotubularin-related protein 1_C81S_mutation Human genes 0.000 description 5
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 4
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NOYYUQCJSFZZIM-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-(2-hydroxyethyl)-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CCO NOYYUQCJSFZZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 150000001543 aryl boronic acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 150000002576 ketones Chemical group 0.000 description 3
- 125000005439 maleimidyl group Chemical class C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 3
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000836313 Moraxella sp Type II restriction enzyme MspI Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 150000002443 hydroxylamines Chemical class 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000010651 palladium-catalyzed cross coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 125000002327 selenol group Chemical group [H][Se]* 0.000 description 2
- 150000003962 selenoxides Chemical class 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 150000007970 thio esters Chemical group 0.000 description 2
- 150000000177 1,2,3-triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 125000000424 1,2-diol group Chemical group 0.000 description 1
- 150000000180 1,2-diols Chemical class 0.000 description 1
- LLVWLCAZSOLOTF-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-[1,4,4-tris(4-methylphenyl)buta-1,3-dienyl]benzene Chemical group C1=CC(C)=CC=C1C(C=1C=CC(C)=CC=1)=CC=C(C=1C=CC(C)=CC=1)C1=CC=C(C)C=C1 LLVWLCAZSOLOTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HMUOMFLFUUHUPE-XLPZGREQSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-(hydroxymethyl)pyrimidin-2-one Chemical compound C1=C(CO)C(N)=NC(=O)N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 HMUOMFLFUUHUPE-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- COHVJBUINVIGOI-UHFFFAOYSA-N 4-amino-4-methyl-1,3-dihydropyrimidin-2-one Chemical compound CC1(N)NC(=O)NC=C1 COHVJBUINVIGOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDBGXEHEIRGOBU-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxymethyluracil Chemical compound OCC1=CNC(=O)NC1=O JDBGXEHEIRGOBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWKOSDCHEMAPQI-UHFFFAOYSA-N 5-methylpurin-6-amine Chemical compound N1=CN=C(N)C2(C)C1=NC=N2 FWKOSDCHEMAPQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 244000308180 Brassica oleracea var. italica Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001492658 Cyanea koolauensis Species 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108091062167 DNA cytosine Proteins 0.000 description 1
- 230000028937 DNA protection Effects 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical class S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004435 EPR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-M Methanesulfonate Chemical compound CS([O-])(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710149004 Nuclease P1 Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 125000000066 S-methyl group Chemical group [H]C([H])([H])S* 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical group [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 1
- 238000003477 Sonogashira cross-coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000006069 Suzuki reaction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001263 acyl chlorides Chemical group 0.000 description 1
- 238000003450 affinity purification method Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000000218 anomalous X-ray scattering Methods 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003286 aryl halide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001502 aryl halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000010462 azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 150000001541 aziridines Chemical class 0.000 description 1
- 150000005347 biaryls Chemical class 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012866 crystallographic experiment Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- HMUOMFLFUUHUPE-UHFFFAOYSA-N dhmC Natural products C1=C(CO)C(N)=NC(=O)N1C1OC(CO)C(O)C1 HMUOMFLFUUHUPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 150000002240 furans Chemical class 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical group 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical group 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003003 phosphines Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001021 polysulfide Polymers 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003346 selenoethers Chemical class 0.000 description 1
- 150000003958 selenols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical group ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 150000003548 thiazolidines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003585 thioureas Chemical class 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/91005—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- G01N2333/91011—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Šis išradimas susijęs su metiltransferazių orientuojama sekai specifine kovalentine alfahidroksialkilintų liekanų modifikuotoje biomolekulėje konversija, būtent, išradimas apima
i) metiitransferazės orientuojamą alfa-hidroksialkilintų grupių pašalinimą, susidarant nemodifikuotoms liekanoms ir ii). metiitransferazės orientuojamą alfa-hidroksialkilintų grupių derivatizaciją, prijungiant nekofaktorinius nukleofilinius junginius minėtoje modifikuotoje biomolekulėje.
Tiksliau, šis išradimas apima alfa-hidroksialkilintų liekanų biomolekulėje tikslinės konversijos būdą, o taip pat alfa-hidroksialkilintų liekanų biomolekulėje tikslinio žymėjimo būdą; alfa-hidroksialkilintų taikinių biomolekulėje nustatymo (aptikimo) būdą ir rinkinį, skirtą šiems būdams atlikti. Visus išradimo objektus jungia alfa-hidroksialkilintų liekanų konversijos idėja, panaudojant kofaktoriaus neturinčią metiltransferazę.
Šis išradimas yra paremtas pavyzdžiais, naudojant DNR metiitransferazės (MTazes). Tačiau jis gali būti naudojamas su RNR metiltransferazėmis, arba metiltransferazėmis, kurių substratai yra kitos biomolekulės.
Šiame aprašyme terminas „metiltransferazė apibūdina fermentus, kurie paprastai perneša metilo grupę nuo S-adenozil-L-metionino (AdoMet) ant savo substratų. Metiltransferazė yra fermentas, kuris geba metilinti DNR, RNR ar (poli)peptidus. Tiksliau, metiltransferazė yra DNR citozino-5 metiltransferazė, kuri, naudodama kovalentino aktyvavimo mechanizmą, perneša metilo grupę ant taikinio citozino C5 atomo. Dar tiksliau, metiltransferazė yra pasirinkta iš M.Hhal, M.Sssl, M.HpalI, M.AIul arba jų darinių. Terminas „M.Hhal nurodo DNR metiltransferazę, patalpintą Svrissprot duomenų bazėje ir turinčią deponavimo numerį P05102. Visos šiame išradime panaudotos MTazės yra neturinčios kofaktoriaus, t.y. MTazių preparatai turi mažiau nei 2 mol.% surišto endogeninio kofaktoriaus AdoMet.
Terminas „biomolekulė“ reiškia DNR, RNR arba (poli)peptidą. Terminas „(poli)peptidas“ nurodo peptidą arba polipeptidą. Tiksliau, biomolekulė yra chromosominė arba genominė DNR. Biomolekulės gali būti visiškai natūralios (t. y. nemodifikuotos), sintetinės arba modifikuotos ir gali egzistuoti kaip kompleksai. Pavyzdžiui terminas „nukleorūgščių molekulė“ apima DNR ir RNR molekules arba RNR/DNR hibridus bei modifikuotas DNR ir RNR molekules. DNR gali būti cDNR ar genominė DNR. RNR gali būti, pavyzdžiui, mRNR, hnRNR, tRNR, rRNR ir t.t.
Terminas modifikuota biomolekulė reiškia biomolekulę, kuri turi modifikuotų liekanų. Modifikuotos liekanos yra tos, kurios turi papildomų modifikuojančių cheminių grupių (modifikuojančių šoninių grandinių), lyginant su įprastais biomolekulių pagrindiniais komponentais. DNR normaliai susideda iš keturių pagrindinių nemodifikuotų liekanų (C, T, A, G), nors tam tikra C ir A liekanų dalis yra randama modifikuota ir natūralioje DNR. Tokios modifikacijos dažniausiai atsiranda dėl viduląstelinių fermentų veiklos (žiūrėti žemiau).
Terminas modifikuotos liekanos konversija reiškia arba modifikuojančios grupės pašalinimą, susidarant nemodifikuotai liekanai, arba tolimesnę šios modifikuojančios grupės derivatizaciją (cheminį prailginimą), susidarant derivatizuotai liekanai.
Terminas pašalinimas reiškia cheminį junginio skilimą, suardant stabilią kovalentinę jungtį (tokią kaip C-C arba N-C), susidarant nemodifikuotai liekanai ir mažai molekulei, dažniausiai aldehidui.
Terminas derivatizacija reiškia biomolekulės prailginimą, prijungiant cheminių junginių fragmentus, pavyzdžiui, anglies grandines, chemiškai aktyvias grupes arba reporterines grupes, prie biomolekulės, pavyzdžiui DNR, kitais atžvilgiais nepakeičiant taikinio biomolekulės.
Terminas „prijungimas“ reiškia cheminį junginių prijungimą, susidarant stabiliam kovalentiniam ryšiui (pavyzdžiui C-C ryšys, C-0 ryšys, C-S ryšys, C-Se ryšys arba C-N ryšys). Prijungimo reakcija gali būti viso egzogeninio junginio prijungimas prie taikinio biomolekulės arba jo kondensacija, kai biomolekulės taikinio hidroksilo grupė yra pakeičima visa egzogeninio junginio molekule, atskylant vandens molekulei.
Išradimo technikos lygis
Daugumos gyvų organizmų DNR be tradicinių keturių nukleobazių (C, A, G ir T) dar randami nedideli kiekiai metilintų nukleobazių: 5-metilcitozino (5mC), Λ/4-metilcitozino ir Λ/5-metiladenino. Šie metilinti nukleozidai atsiranda dėka fermentų DNR metiltransferazių (MTazių), kurios katalizuoja aktyvuotos metilo grupės pernašą nuo kofaktoriaus S-adenozil-L-metionino (AdoMet) ant DNR atpažinimo sekose, susidarant prieš tai paminėtiems metilintiems nukleotidams (Cheng, (1995) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 293-318). Nustatyta, kad DNR metilinimas yra svarbus biologinis mechanizmas, reguliuojantis genų raišką stuburiniuose gyvūnuose, įskaitant žmogų (Bird, (2002) Genes Dev. 16, 6-21), Goll, M.G. & Bestor, T.H. Annu. Rev. Biochem. 74, 481-514 (2005). Bakterijose DNR metilinimas yra specifinis rūšiai. Genominė DNR kartais turi 5-hidroksimetilintų pirimidino nukleobazių 5-hidroksimetilcitozino ir 5hidroksimetiluracilo (hmC ir hmU) (Gommers-Ampt, J.H. & Borst, P. (1995) FASEB J. 9, 1034-1042).
Tam tikrų bakteriofagų ir Afrikinės tripanosomos 5-hidroksimetilo grupių glikozilinimas apsaugo šių parazitų genomą nuo šeimininko apsauginių sistemų. Anksčiau hmC buvo aptiktas ir gyvūnų smegenų DNR (Penn ir kt., (1972) Biochem. J. 126, 781-790). Paskutiniai žmogaus neuronų ir smegenų (Kriaucionis, S. & Heintz, N. Science publikuota Internete, doi:10.1126/science. 1169786) bei pelės embrioninių kamieninių ląstelių (Tahiiiani, M. ir kt. Science publikuota internete. doi:10.1126/science.1170116) DNR tyrimai parodė, kad hmC radikalas yra CG sekose, ir jie atsiranda greičiausiai dėl mC radikalo oksidacijos. DNR 5-hidroksimetilo grupės gali įtakoti ląstelės baltymų, kurie dalyvauja genų aktyvumo epigenetinėje kontrolėje, sąveiką su DNR (Valinluck, V. ir kt., (2004) Nucleic Acids Res. 32, 4100-4108), o didesni hmU kiekiai DNR koreliuoja su padidėjusiu krūties vėžio dažniu (Djuric, Z. ir kt., (1996) Cancer 77, 691-696). Aukščiau paminėtų faktų visuma iškelia prielaidą, kad 5-hidroksimetilintos nukleobazės, o ypač hmC, gali dalyvauti svarbiuose biologiniuose procesuose, pavyzdžiui embrioniniame vystyme, smegenų funkcijos užtikrinime, vėžio genezėje. Tačiau nei hmC lokalizacija chromosomose, nei pagrindiniai biologiniai mechanizmai šiuo metu nėra žinomi ir yra reikalingi tolimesni tyrimai, kad daugiau būtų sužinota apie šią fundamentinę problemą. Svarbiausia, kad šie tyrimai yra apriboti, nes trūksta adekvačių analitinių metodų, kurie leistų nesunkiai išanalizuoti hmC liekanas DNR.
Šiuo metu egzistuojantys analitiniai metodai, kuriais galima tirti citozino modifikacijas žinduolių DNR, yra paremti dviejų citozino padėčių buvimu CG sekose: nemodifikuoto citozino (C) ir 5-metilcitozino (5mC). Iki dabar buvo išvystyta nemažai 5mC identifikacijos ir lokalizacijos DNR metodų (Schumacher et ai. (2006) Nucleic Acids Res. 34, 528-542). Auksinis standartas, identifikuojant ir lokalizuojant indvidualias 5mC padėtis genominėje DNR, yra bisulfitinis sekos nustatymas (Frommer ir kt. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89, 1827-1831) bei daugybė jo atmainų. Šis metodas yra paremtas bisulfito ir C tarpinio produkto dezamininimu iki U; 5mC radikalas yra inertiškas šiai reakcijai ir todėl po bisulfitu veiktos DNR standartinio sekvenavimo matyti 5mC leikanos C-takelyje, o T ir C liekanos - T-takelyje. Veikiant bisulfitu, hmC virsta citozino 525 metilsulfonatu, kuris dezamininasi dar lėčiau nei 5mC (Hayatsu, M. & Shiragami, M. (1979) Biochemistry 18, 632) ir todėl atsiranda C-takelyje. Taigi hmC liekana negali būti atskirta nuo mC liekanos, naudojant standartinį bisulfito sekos nustatymo protokolą. Panašiai, kitos aukšto našumo viso genomo analizavimo technologijos, pavyzdžiui mDiP (methylated DNA immunoprecipitation, metilintos DNR imunoprecipitacija) (Weber ir kt. (2005) Hum Mol Genet 14, R11-R18), kurios yra paremtos m5C turinčios
DNR fragmentų specifiniu atpažinimu ir surišimu m5C specifiniais antikūnais arba metodai, paremti metilinimui jautrių restrikcijos endonukleazių naudojimu, taip pat nėra tinkami hmC padėtims aptikti. Apibendrinant, kadangi visos egzistuojančios technologijos buvo sukurtos atskirti dviem skirtingoms citozino padėtims (metilintas prieš nemetilintą) (Schumacher ir kt., (2006) Nucleic Acids Res. 34, 528-542), jos visiškai nenustato arba labai prastai nustato hmC liekanas genominėje DNR.
Neseniai buvo aprašytas DNR derivatizacijos būdas, naudojant nekofaktorinius junginius ir DNR metiltransferazes (patentinė paraiška LT2009023, paduota
02.04.2009). Ši technologija, veikiant metiltransferazėms, leidžia sekai specifiškai kovalentiškai prijungti formaldehidą (arba kitą alifatinį aldehidą) metiltransferazės taikinio citozino C5 padėtyje, susidarant 5-hidroksimetilcitozinui (arba 5hidroksialkilintiems citozinams). Šioje paraiškoje taip pat yra aprašyti būdai, skirti tolimesnei hmC liekanų derivatizacijai įvairiose DNR molekulėse, kai, veikiant kreipiančiajai metiltransferazei, yra sekai specifiškai kovalentiškai prijungiami nukleofiliniai junginiai, tame tarpe ir tioliai. Ši reakcija iš principo įgalina hmC liekanų derivatizaciją DNR molekulėje, prijungiant įvairias funkcines ir reporterines grupes, numatant jų atsiradimą kreipiančiosios metiltransferazės taikiniuose. Kadangi stuburinių gyvūnų, tame tarpe ir žmonių, genominėje DNR hmC liekanos yra randamos CG sekose, kai kurios derivatizacijos reakcijos gali būti naudingos, vystant taip reikalingas hmC analizės technologijas. Vis dėlto dar nebuvo įvertintas šių derivatizacijos reakcijų tinkamumas, chemiškai manipuliuojant ir analizuojant hmC liekanas įvairiuose DNR tipuose, tame tarpe ir žinduolių gemoninėje DNR.
Aišku, jog yra labai reikalingi nauji, patikimi ir patvirtinti hmC liekanų genomineje DNR analizės metodai.
Išradimo esmė
Šių problemų sprendimas pasiekiamas, realizuojant siūlomo išradimo apibrėžties 1-14 punktus.
Pagrindinė šio išradimo idėja apima biomolekulėje esančių hidroksialkilintų liekanų tikslinę konversiją veikiant kreipiančiajai metiltransferazei. Šio išradimo autoriai parodė, kad tokios hidroksialkilintos liekanos biomolekulėje, kurios yra kreipiančiosios metiltransferazės taikiniai, yra selektyviai paverčiamos į nemodifikuotas liekanas arba į derivatizuotas liekanas, veikiant metiltransferazei. Substratą aktyvuojančių metiltransferazių pavyzdys yra pirimidinui-5 specifinės metiltransferazės, kurios natūraliai katalizuoja metilo grupės pernešimą į 5-tą citozino ar uracilo padėtį DNR, RNR arba laisvuose nukleotiduose, susidarant tarpiniam kovalentiniam ryšiui su 6-tąja pirimidino žiedo padėtimi.
Šis išradimas apima kofaktoriaus neturinčios metiltransferazės panaudojimą modifikuotos biomolekulės tikslinei konversijai, kai modifikuojanti grupė formulės CH(OH)-R, kur R yra vandenilis arba CU-Ci2-alkilas, optimaliai vandenilis arba žemesnysis alkilas, yra paverčiama nemodifikuota biomolekule, pašalinant minėtą modifikuojančią grupę metiltranferazės taikinyje.
Šis išradimas taip pat apima modifikuotos biomolekulės tikslinės konversijos būdą, apimantį modifikuotos biomolekulės, turinčios modifikuojančią grupę formulės CH(OH)-R, kur R yra vandenilis arba CU-C^-alkilas, optimaliai vandenilis arba žemesnysis alkilas, inkubaciją su kofaktoriaus neturinčia metiltransferaze sąlygomis, užtikrinančiomis metiltransferazės fermentinį aktyvumą. Minėta modifikuotos biomolekulės tikslinė konversija vyksta: i) kovalentiškai pašalinant minėtą modifikuojančią grupę liekanose, kurios yra metiltransferazės taikiniai; arba ii) vykdant minėtos modifikuojančios grupės derivatizaciją liekanose, kurios yra metiltransferazės taikiniai, kovalentiškai prijungiant nekofaktorinius nukleofilinius junginius bendros formulės HQ-LX, kur X žymi funkcinę grupę ar reporterinę grupę, prijungtą per jungtuką L, ir Q yra pasirinktas iš S, Se, O, N, C.
Optimaliame šio išradimo įgyvendinimo variante R yra vandenilis arba -CH3 ir Q yra S arba Se. Biomolekule yra nukleorūgšties molekulė, optimaliai DNR. Minėta metiltransferazė yra DNR citozino-5 metiltransferazė, pasirinkta iš grupės, susidedančios iš M.Hhal. M.Sssl irHpail arba jų darinių.
Šiame išradime naudojama modifikuota biomolekulė yra natūraliai ar dirbtinai modifikuota biomolekulė, kuri turi aukščiau minėtą modifikuojančią grupę taikinio vietoje.
Šio išradimo būdas taip pat taikytinas modifikuotos biomolekulės tiksliniam žymėjimui, apimant reporterinės grupės, kuri yra tinkama kaip žymė ir kuri leidžia identifikuoti pažymėtą biomolekulę tarp kitų nežymėtų molekulių, tiesioginį prijungimą arba prijungimą paeiliui
Šis išradimas taip pat apima hidroksimetilintų taikinių biomolekulėje nustatymo būdą, apimantį biomolekulės derivatizaciją arba žymėjimą, prijungiant nekofaktorinius nukleofilinius junginius, aprašytus šiame išradime, veikiant kofaktoriaus neturinčiai metiltransferazei ir nustatant ar minėtos metiltransferazės taikiniai buvo modifikuoti, kur metiltrasferazės taikinių modifikavimas nurodo hidroksimetilinto taikinio buvimą. Šio išradimo būdas apima atvejus, kur (modifikuojančio) junginio(-ių) prijungimas yra galimas prie 5-hidroksimetilcitozino liekanos DNR, bet jo prijungimas yra negalimas prie
5-metilcitozino arba citozino liekanų.
Galiausiai, šio išradimo objektas yra rinkinys, skirtas atlikti bet kurį aukščiau paminėtą būdą, kuris apima kofaktoriaus neturinčią kreipiančiąją metiltransferazę arba kofaktoriaus neturinčią kreipiančiąją metiltransferazę ir nekofaktorinį nukleofilinį junginį(ius), tinkamus buferio komponentus ir papildomai gali turėti aldehidą surišančius junginius.
Brėžiniu aprašymas
Siekiant iliustruoti pagrindinius šio išradimo požymius šis aprašymas apima :
Fig. 1: Fermentiškai sufragmentuoto dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido, gauto po inkubacijos su M.Hhal, atvirkščios fazės HPLC analizė. Dvigrandė DNR l:ll (13 μΜ), turinti hmC, buvo inkubuojama su M.Hhal (15 μΜ) 2 vai 37°C (takelis 2). Į kontrolinę reakciją (takelis 1) nebuvo pridėta M.Hhal. Stačiakampiu apibrėžtos smailės parodo dC ir hmdC.
Fig. 2: Fermentiškai sufragmentuoto dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido, gauto po modifikacijos su M.Hhal, atvirkščios fazės HPLC analizė. hmC turinti dvigrandė DNR l:li (13 μΜ) buvo inkubuojama su 1 mM L-selenocisteinu (takelis 3) esant 15 μΜ M.Hhal 1 vai kambario temperatūroje. Kontrolinė reakcija (takelis 1) buvo inkubuojama be egzogeninio junginio. Rodyklėmis nurodyti nauji modifikacijos produktai.
Fig. 3: TLC analizė fermentiškai sufragmentuoto dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido 2'-deoksiribo-5'-mononukleotidų, žymėtų33-P ir inkubuotųsu M.Hhal, M.Hpali ir M.SssI. 20 nM taikinyje turintis hmC dvigrandis oligodeoksiribonukleotidas buvo inkubuojamas su katalitiškai aktyviu arba neaktyviu C81S mutantiniu M.Hhal fermentu (takeliai 2, 3), su katalitiškai aktyviu arba karščiu inaktyvuotu M.Hpali fermentu (takeliai 5, 6) arba katalitiškai aktyviu (mutantinis fermento variantas O142A/N370A) arba karščiu inaktyvuotu M.SssI fermentu (takeliai 8, 9) vieną valandą kambario temperatūroje.
Fig. 4: TLC analizė fermentiškai sufragmentuoto dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido
2'-deoksiribo-5'-mononukleotidų, žymėtų 33-P ir inkubuotų su cisteinu arba selenocisteinu esant M.Hhal. 20 nM dvigrandis oligodeoksiribonukleotidas, GCGC taikinio vietoje turintis C, 5mC arba hmC, o nespecifinėje sekoje CCGG turintis C arba hmC buvo inkubuojamas su M.Hhal (takeliai 1-6) ir 50 mM L-cisteino (takeliai 1-5) arba 1 mM L-selenocisteino (takelis 6) 1 vai. kambario temperatūroje.
Fig. 5: 618 bp DNR fragmento, turinčio 5-hidroksialkilcitoziną, restrikcinė analizė, po nuo metiltransferazės priklausomos modifikacijos. DNR fragmentas (100 nM), turintis hmC (kairė pusė) arba heC (dešinė pusė) taikinio GCGC sekoje, buvo inkubuojamas su M.Hhal (laukiniu tipu arba mutantiniu C81S baltymo variantu) 2 vai. 37°C. Modifikuota
DNR buvo sufragmentuota su restrikcijos endonukleze R.Hin6l ir analizuota agarozės gelyje.
Fig. 6 : 618 bp DNR fragmento, turinčio 5-hidroksialkilcitoziną, restrikcinė analizė, po nuo metiltransferazės priklausomos modifikacijos. DNR fragmentas (100 nM), turintis hmC CG taikinyje, buvo inkubuojamas su M.Sssl (O142A/N370A mutantinis baltymas) (takeliai 1, 2) arba Hpall (takeliai 3, 4) 2 vai 37°C. MTaze veikti mėginiai (takeliai 2 ir 4) arba neveiktos kontrolės (takeliai 1, 3) buvo sufragmentuotos su restrikcijos endonukleaze R.Hin6l (takeliai 1, 2) arba R.HpalI (takeliai 3, 4) ir analizuotos agarozės gelyje.
Fig. 7: TLC analizė fermentiškai sufragmentuotų genominės DNR 2'-deoksiribo-5'mononukleotidų, žymėtų 33P ir inkubuotų su M.Sssl. Žmogaus genominė DNR buvo inkubuojama su M.Sssl (mutantinis baltymo O142A/N370A variantas) 2 vai 37°C, po to sufragmentuota su restrikcijos endonukleazėmis R.Hpall arba R.MspI, 5’ gale pažymėta 33P, sufragmentuota iki 5'-mononukleotidų ir analizuota TLC (takelis 3). Kontroliniai mėginiai (takeliai 1 ir 2) nebuvo veikti M.Sssl.
Detalus išradimo aprašymas
Pagrindinis šio išradimo objektas yra metiltransferazių panaudojimas alfahidroksialkilintų liekanų modifikuotoje biomolekulėje tikslinei konversijai, kovalentiškai pašalinant arba prailginant alfa-hidroksialkilintas šonines grandines biomolekulės taikiniuose.
Pagrindinis šio išradimo alfa-hidroksialkilintų liekanų biomolekulėje tikslinės konversijos principas yra paaiškintas žemiau pateiktoje Schemoje 1, kuri parodo 5-alfahidroksialkilcitozino liekanų DNR konversijos galimybes, veikiant DNR citozino-5 metiltransferazėms (MTazėms).
Schema 1. Sekai specifinė alfa-hidroksialkilintų liekanų DNR konversija, veikiant DNR metiltransferazėms pagal šį išradimą. Reakcija 1: alfa-hidroksialkilo grupių tikslinis pašalinimas taikinio citozino liekanose DNR; Reakcija 2: taikinio citozino liekanų DNR alfa-hidroksialkilintų grupių tikslinė derivatizacija.
DNR
Pagrindžiant šio išradimo naujumą ir išradimo lygį pažymėtina, kad:
1) alfa-hidroksialkilo grupių pašalinimo nuo citozino liekanų reakcija pagal šį išradimą 10 (Reakcija 1 Shemoje 1) yra nauja ir nėra akivaizdi šios srities specialistams. Ši reakcija yra nebūdinga MTazėms, kurios natūraliai katalizuoja nuo kofaktoriaus priklausomą taikinių transmetilinimą (nukleofilinis pakeitimas SN2), įskaitant ir reakcijas su AdoMet analogais.
2) 5-alfa-hidroksialkilo grupių, tame tarpe ir 5-hidroksimetilo grupių,tikslinis pašalinimas nuo citozino liekanų DNR (Reakcija 1 Shemoje 1), negali būti pasiekimas jokiomis kitomis žinomomis priemonėmis.
3) citozino 5-alfa-hidroksialkilo (įskaitant hmC) derivatizacija DNR, tikslingai prijungiant 20 nukelofilinius junginius (Reakcija 2 Shemoje 1) buvo aprašyta ankščiau kaip dviejų stadijų procedūros, skirtos nemodifikuotos DNR sekai specifinei derivatizacija'!, antra stadija (LT2009023). Šiame išradime yra parodyta, kad natūraliai esančios DNR hmC liekanos taip pat gali būti derivatizuotos ir po to pažymėtos panašiu būdu.
Šio išradimo optimaliame įgyvendinimo variante R apima H ir -CH3, o -QH apima -SH ir
SeH. Tačiau šios srities specialistams yra aišku, kad R gali būti lengvai praplėstas iki C1-C12 alkilo, alkeno, alkino, o -QH - apimtų mažiausiai -OH, -NH2, -NHNH2 arba ONH2, N3H, NCH (arba atitinkamas druskas, kuriose vandenilio atomas yra pakeistas jonu, pavyzdžiui metalo ar amonio jonu), o taip pat ir kitus tinkamus nukleofilus, kurie yra pakankamai aktyvūs vandeniniuose buferiniuose tirpaluose pH intervale 4-10. Šio išradimo optimaliame įgyvendinimo variante, L yra -CH2CH(CO2H)-, bet kvalifikuotiems srities specialistams suprantama, kad L taip pat apima kitas tinkamas grupes, pradedant nuo vien kovalentinių jungčių ir baigiant linijinių, ciklinių ir/arba aromatinių radikalų kombinacijomis, nebūtinai sujungtais su -NHCO-, -0-, -S- jungtukais, (poli)etilenglikolio grandinėmis -(CH2CH2O)n- n = 1-100, ir t.t.
5-hidroksialkilcitozino turinčios DNR reakcija su egzogeninių nukleofiliniu junginiu HQLX (kur LX yra chemiškai aktyvi arba reporterinė grupe X, prijungta per jungtuką L) veikiant kreipiančiajai DNR citozino-5 metiltransferazei leidžia sekai specifiškai prijungti minėtą junginį, įterpinat LX grupę prie taikinio citozino liekanų per tiometi.lo inkarą (kai
QH = -SH). Chemiškai aktyvi grupė X po to gali būti naudojama kovalentiniam prijungimui tinkamų junginių, turinčių reporterinę grupę (žiūrėti žemiau).
Kai QH = SeH, analogiškai pasiekamas LX grupės įterpimas DNR taikiniuose per selenometilo inkarą, kaip pademonstruota pavyzdžiuose 2 ir 5. Chemiškai aktyvi grupė X gali būti po to naudojama tinkamo junginio, turinčio reporterinę grupę kovalentiniam prijungimui. Selenidai, kurie yra selenometilo inkaro dalis, gali būti lengvai oksiduojami H2O2 arba NalO4 iki selenoksidų. Kadangi su selenoksidais gali būti atliekama eliminacijos reakcija, skylant Se-C jungčiai (VVirth, T. (2000) Angew. Chem. Int. Ed. 39, 3740-3749; Gieselman ir kt. (2002) ChemBioChem 3, 709-716), selenometilo inkaras gali būti naudojamas kaip chemiškai nukerpamas kovalentinis jungtukas žymėtų biomolekulių giminingumo gryninime. Iš kitos pusės, dėi žymaus rentgeno spindulių anomalaus išbarstymo Se atomo buvimas prijungtoje grupėje gali būti naudingas, pavyzdžiui, biomolekulių struktūrą kristalografiniuose tyrimuose, taikant daugybinio bangos ilgio anomalaus išsklaidymo (MAD) metodą. 77Se branduolio buvimas (natūralus paplitimas 8%), kurio magnetinis sukinys yra S=1/2, taip pat gali būti pritaikomas BMR ir
EPR spektroskopijoje (Zelakiewicz ir kt. J. Am. Chem. Soc., 2004,126, 8112-8113).
Tolimesnis hmC liekanų DNR siūlomo tikslinės konversijos būdo vystymas yra biomolekulės tikslinio žymėjimo būdas, apimantis biomolekulės derivatizaciją (modifikavimą) pagal LT2009023 aprašymą ir toliau vykdant tinkamos žymėjimui ir leidžiančios identifikuoti žymėtas biomolekulės tarp kitų nežymėtų molekulių grupės prijungimą.
Šio išradimo optimaliame įgyvendinimo variante sekai specifinis DNR žymėjimas buvo pasiektas dėka DNR metiltransferazės orientuojamo L-cisteino (tiolio) prijungimo, po kurio seka chemoselektyvus prijungimas, pavyzdžiui giminingumo žymių, tokių kaip su aminais reaguojančio biotino.
Schema 2. Selektyvus sekai specifinis kovalentinis hmC liekanų DNR žymėjimas, naudojant DNR metiltransferazes pagal siūlomą išradimą. Prijungta reporterinė grupė parodyta rutuliuku.
CG·
GC'
CG·
GCOH
(V
O O
CG· GC· CG > -GC·
CO,H hmC turinti DNR žymėta DNR
Schema 2 aukščiau viršuje parodo pagrindinį hmC turinčios genominės DNR sekai 25 specifinio žymėjimo principą, kur žymėjimas yra pasiekiamas (1) apdorojant hmC turinčią DNR su L-cisteinu esant Hhal metiltransferazei, po kurio seka (2) amino selektyvus reporterinės grupės prijungimas su N-hidroksisukcinimido esteriu.
Šio išradimo optimaliame įgyvendinimo variante (a) nekofaktorinis nukleofilinis junginys arba jo tolimesni dariniai turi fluorescuojančią žymę; ir (b) hidroksimetilinti taikiniai yra aptinkami dėka minėtos nukleorūgšties molekulės fluorescencijos.
Kitame šio išradimo optimaliame įgyvendinimo variante, minėta analizuojamo junginio žymė yra aptinkama (a) dėka antikūno specifinio jungimosi prie minėto analizuojamo junginio žymės arba (b) naudojant avidino arba streptavidino specifinį jungimąsi prie analizuojamo junginio žymės.
Kaip minėta, remiantis šiuo išradimu atsiveria daug būdų tikslinio biopolimerų žymėjimo arba derivatizacijos galimybių. Šiam tikslui pasiekti nekofaktorinis nukleofilinis junginys turi turėti cheminį fragmentą LX (R= LX or Z= LX, žiūrėti Schemą 2 ir 3), kur X apima funkcinę grupę arba reporterinę grupę, kuri yra prijungta per jungtuko grupę L.
Yra žinoma daug chemoselektyvių grupių, kurios apibrėžia reaktyvią grupę X ir yra naudojamos žymės prijungimui prie modifikuotų biomolekulių vandeniniuose tirpaluose. Klasikinės priemonės (Garman, (1997) Non-radioactive labeltng, A practical introduction, Academic Press) apima pirminių aminų grupes, kurios gali reaguoti su aminų reaktyviomis grupėmis, pavyzdžiui tokiomis kaip hidroksisukcinimido esteris, acilo azidas, acilo nitrilas, acilo chloridas, pentafluorfenilo esteris, tioesteris, sulfonilo chloridas, izotiocianatas, imidoesteris, aldehidas ar ketonas, kurie duoda stabilius amidus, sulfonamidus, tiokarbamidus, imino eterius ar iminus, kurie gali būti redukuojami iki stabilių antrinių aminų. Tioliai specifiškai reaguoja su halogenacetamidais, maleimidais, aziridinais arba kitais tioliais, susidarant tioeteriams ar bisulfidų junginiams, o 1,2-tioliai gali būti modifikuojami su arilboroninėmis rūgštimis. Hidrazinai ar hidroksilaminai gali kondensuotis su aldehidais ar ketonais, susidarant hidrazonams ir oksimams. 1,2-aminotioliai selektyviai reaguoja su aldehidais ar tioesteriais, sudarydami tiazolidinus (pavyzdžiui polipeptidu N-galinės cisteino liekanos,
Liu ir Tam, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6584-6588) arba stabilias amino jungtis (pavyzdžiui polipeptidų N-galinės cisteino liekanos, gamtinis cheminis peptidų sujungimas, Dawson ir kt., (1994) Science 266, 776-779); azidai gali reaguoti su alkinais (Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition, Lewis ir kt. (2002), Angew. Chem. Int. Ed.
41, 1053-1057) arba su fosfinų esteriais (Staudinger ligation, Saxon ir Bertozzi, (2000)
Science 287, 2007-2010), sudarydami 1,2,3-triazolus arba amidus; Diels-Alder ciklo prijungimas tarp aktyvuotų dienų ir dienofilų (pavyzdžiui furanų ir maleimidų, Graham ir kt., (2002) Tet. Lett. 4785-4788) yra įmanomas vandeniniuose tirpaluose. Kita moderni technika remiasi paladžio katalizuojama arilhaiogenidų ir galinių alkinų kryžminio kopuliavimo reakcija (Sonogashira coupling, Casalnuova ir Calabrese, (1990) J. Am. Chem. Soc. 112, 4324-4330; Dibovvski ir Schmidtchen, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. 37, 476-478; Bong ir Ghaderi, (2001) Org. Lett. 3, 2509-2511), arba reakcija tarp arilhaiogenidų ir arilboroninių rūgščių (Suzuki coupling, casalnuova and Galabrese, (1990) J. Am. Chem. Soc. 112, 4324-4330; DeVasher at ai., (2004) J. Org. Chem. 69,
7919-7927), susidarant arilalkinams ar biarilams. Be to, vario katalizuojamos alkinų prisijungimo reakcijos tarp galinių halogenalkinų, galinių alkinų arba galinių silicio alkinų, susidarant konjuguotiems dienams, gali vykti vandeniniuose tirpaluose. Galiausiai fluoro turintys derivatizavimo reagentai, pavyzdžiui 4-halogen-7-nitrobenzofurazanas, Nmetiiizotoinis anhidricfas arba aktyvuoti bimanai, reaguoja su tioliais, aminais ir hidroksilo grupėmis ir gali būti naudojami tiesioginiam šių grupių žymėjimui.
Nukleorūgštys paparastai neturi labai nukleofilinių ar elektrofilinių centrų, Taigi, šalia ciklo prijungimo reakcijų, paladžio katalizuojamų kryžminių kopuliavimo reakcijų ar vario katalizuojamų alkinų prijungimo reakcijų, daugybė kitų reakcijų tarp nukleofilų ir elektrofilų su pakeičiama reaktyvia grupe X gali būti naudojama nukleorūgštims sekai specifiškai pažymėti.
Kitame siūlomo išradimo įgyvendinimo variante, X apima bent vieną funkcinę grupę, pasirinktą iš pirminio amino grupės, tiolio grupės, 1,2-diolio grupės, haloacetamido grupės, maleimido grupės, aldehido grupės, ketono grupės, azido grupės, alkino grupės, 1,3-dieno funkcinės grupės, dienofilo funkcinės grupės, arilhalido grupės, galinės alktno grupės, arilboroninės rūgšties grupės, galinės haloalkino grupės ir galinio silicio alkino grupės bei apsaugotų amino, tiolio, 1,2-diolio, hidrazino, hidroksiamino, aldehido, ketono ir 1,2-aminotiolio grupių. Dėl tikslinio biopolimerų žymėjimo, X taip pat apima sunkiuosius atomus ar sunkiųjų atomų grupes, tinkamas X spindulių difrakcijos duomenų fazėms nustatyti; radioaktyvius ar stabilius retuosius izotopus; fluoroforų, fluorescencijos gesintojų, chromoforų, giminingumo žymenų, sukinio žymių (stabilios paramagnetinės grupės) radikalus; tarpgrandinines sąsajas formuojančius agentus, grupes, karpančias nukleorūgštis, haptenus, nanodaleles ir rutuliukus.
Dvi pagrindinės strategijos gali būti naudojamos hmC liekanų identifikavimui genominėje DNR (Schema 3).
Schema 3. Sekos specifinė natūralios DNR konversija pagal šį išradimą analitiniam hmC liekanų nustatymui, veikiant DNR metiltransferazėms.
A. hmC liekanų konversija į nemodifikuotus citozinus;
B. hmC liekanų derivatizacija arba žymėjimas.
Citozino (C) ir jo C-5 modifikacijos produktai DNR (hmC ir 5mC)
A. Viena strategija yra paremta selektyvia hmC liekanų konversija į nemodifikuotas citozino liekanas. Šis būdas gali būti naudojamas kartu su egzistuojančiais analizės metodais, kurie normaliai gali parodyti 5mC ir nemodifikuoto C padėtis DNR, bet neatsikiria hmC nuo 5mC. Pavyzdžiui, bisulfitinis sekvenavimas parodytų 5mC + hmC liekanų padėtis C-takelyje ir nemodifikuotų citozinų padėtis T-takelyje. Selektyvi MTazės nukreipiama hmC konversija į C ir tolesnis konvertuotos DNR bisulfitinis sekvenavimas tada parodytų 5mC liekanų padėtis C-takelyje ir hmC + C liekanų padėtis T-takelyje. Dviejų duomenų paketų palyginimas parodytų hmC liekanas kaip juosteles, migravusias iš C-takelio į T-takelį dėl fermentinės konversijos.
t
B. Kita strategija yra paremta tokia selektyvia hmC liekanų derivatizaciją, kad jas galima būtų tiesiogiai atskirti nuo 5mC ir C liekanų. Pavyzdžiui, selektyviai prijungus tiolius arba selenolius veikiant nukreipiančiąja! DNR MTazei, susidaro atitinkamai tiometilo ar selenometilo dariniai. Tokie dariniai gali būti naudojami reporterinės ar giminingumo grupės prijungimui (žiūrėti Schema 2).
Kitame šio išradimo optimaliame įgyvendinimo variante, (a) prijungta grupė trukdo nukleorūgščių padauginimui metiitransferazės atpažinimo taikiniuose; ir (b) hidroksimetilinti taikiniai yra aptinkami testuojant, ar nukleorūgščių molekulių padauginimas metiltransferazių atpažinimo taikiniuose yra uždelstas. Padauginimo uždelsimas galimas dėl pradmenų prisijungimo arba grandinės liginimo trukdžių padauginimo reakcijos metu.
Taikant šio išradimo būdus gali būti atliekama nukleorūgčių sekoskaita. Gali būti naudojami visi žinomi sekoskaitos metodai.
Šio išradimo optimaliame įgyvendinimo variante, PGR yra tikro laiko PGR. Kitame šio išradimo įgyvendinimo variante nukleorūgčių padauginimui naudojamas tikro laiko PGR metodas.
Šio išradimo kitame optimaliame įgyvendinimo variante, (a) nukleorūgščių molekulės, modifikuotos metiltransferazių atpažinimo sekose, yra gryninamos giminingumo gryninimo būdais; ir (b) šio išradimo junginiai, kurių formulės (I) arba jų dariniai, turi giminingumo žymenį.
Optimaliame įgyvendinimo variante šio išradimo būdai po biomolekulių tikslinio modifikavimo stadijos turi papildomą DNR molekulės sekos nustatymo stadiją. Gali būti naudojami visi žinomi sekos nustatymo metodai.
Šio išradimo pavyzdžiuose (Pavyzdys 4, Fig. 4) parodyta, kad egzogeninio nukleofilinio junginio arba jo darinio prijungimas yra galimas prie 5-hidroksimetilcitozino liekanų DNR, bet prijungimas negalimas prie 5-metilcitosino liekanos arba citozino liekanos.
Dar kitame šio išradimo optimaliame įgyvendinimo variante, DNR molekulės identiškumas yra nustatomas DNR sekos nustatymo, hibridizacijos, MALD1-TOF metodais arba analizuojant nukleozidų sudėtį po fermentinės fragmentacijos ir chromatografijos.
Galiausiai, viename iš optimalių įgyvendinimo variantų rinkinys pagal siūlomą išradimą apima metiltransferazę arba metiltransferazę ir nekofaktorinį nukleofilinį junginį atskiruose konteineriuose ir gali turėti papildomai informacinį lapelį ar naudojimo instrukciją.
Tam tikri surišantys junginiai taip pat gali būti rinkinio dalimi, kurie galėtų chemiškai surišti reakcijoje išsilaisvinusius aldehidus, taip, kad neleistų jiems vėl dalyvauti grįžtamoje reakcijoje. Visos klasės vandenyje tirpių junginių, kurie reaguoja su aldehidais (tioliai, pirminiai aminai, hidroksilaminai, hidrazinai) gali būti naudojami. Šie junginiai taip pat gali būti pateikti chemiškai pakeista forma, pavyzdžiui modifikuoti apsaugine grupe, turintys erdviškai dideles grupes (užkertant kelią aktyvių nukleofilų reaktyvumui biomolekulės atžvilgiu), oligomerinėje arba polimerinėje formoje, išsilaisvinant junginį (-ius), patalpinus tinkamoje terpėje, pavyzdžiui metiltransferazės buferyje, arba imobilizuojant polimere arba rutuliukuose. Pavyzdžiui, tioliai egzistuoja oksiduotose formose kaip disulfidai arba polisulfidai ir t.t., kurie lengvai verčiami įtiolius redukcinėmis sąlygomis. Pagalbinės biomolekulės, turinčios aukščiau minėtas funkcines grupes (pavyzdžiui tokie baltymai kaip jaučio serumo albuminas ir kt.) taip pat gali būti su rišančiais agentais, jei jie neturi kreipiančiosios MTazės taikinių.
Kitas šio išradimo optimalus įgyvendinimo variantas taip pat apima rinkinį, turintį metiltransferazę ir/arba diagnostinį preparatą(-us), paruoštą aukščiau aprašyto pagrindu. Diagnostinio preparato skysta kompozicija yra vienas iš šio išradimo optimalių įgyvendinimo variantų. Diagnostinės kompozicijos optimalus tirpiklis paprastai yra vandeninis. Be to, preparatas gali turėti kitų ingredientų ar nešiklių, kurie modifikuotų ar palaikytų pH, osmosinį slėgį, klampumą, skaidrumą, spalvą, sterilumą, stabilumą, tirpumo greitį ar kvapą. Panašiai, preparatas gali turėti dar kitų farmakologiškai priimtinų ingredientų, kurie modifikuotų arba palaikytų diagnostinės kompozicijos stabilumą, tirpimo greitį, atpalaidavimą ar absorbciją. Kai diagnostinis preparatas yra paruoštas, jis gali būti laikomas steriliuose indeliuose tirpalo, suspensijos, gelio, emulsijos, kietu arba dehidratuotu ar liofolizuotų miltelių pavidalu. Šie preparatai gali būti laikomi iškart naudojimui tinkamose formose arba rekonstruojami prieš pat naudojimą.
Praktikoje ruošiant nemodifikuotas biomolekulės pagal šį išradimą atlieka tokias stadijas,:
a) sumaišo (kartu sudeda) modifikuotą biomolekulę ir kofaktoriaus neturinčią MTazę, tinkamame vandeniniame buferyje, kuriame metiltransferazė yra fermentiškai aktyvi (pavyzdžiui: 50 mM MOPS, 50 mM MES pH 7.5, 1 mM Na2EDTA, 15 mM NaCl, 0.2 mg/ml jaučio serumo albumino, 5% glicerolio; arba 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.5 mM Na2EDTA 0.2 mg/ml jaučio serumo albumino, 5% glicerolio; arba kitas panašus buferis, rekuomenduojamas MTazių gamintojų);
b) 5-120 min inkubuoja reakcijos mišinį temperatūroje, kuri yra tinkama metiltransferazių fermentiniam aktyvumui (pagal MTazės gamintojo rekomedaciją);
c) sustabdo reakciją (pridedant slopinančio junginio, skiedžiant reakciją tinkamu tirpikliu, staigiai atšaldant iki - 20°C arba žemesnės temperatūros ar inaktyvuojant metiltransferazę, pašildžius 40°C aukštesnėje nei optimali reakcijos temperatūra 5-20 min);
d) išskiria nemodifikuotą biomolekulę, jei reikia.
Derivatizuotos biomolekulės paruošimui pagal šį išradimą atlieka tokias stadijas,:
a) sumaišo (kartu sudeda) biomolekulę, neturinčią kofaktoriaus MTazę ir nekofaktorinį nukleofilinį junginį tinkamame vandeniniame buferyje (žiūrėti aukščiau);
b) 5-120 min inkubuoja reakcijos mišinį temperatūroje, kuri yra tinkama metiltransferazių fermentiniam aktyvumui;
c) sustabdo reakciją (žiūrėti aukščiau);
d) išskiria nemodifikuotą biomolekulę, jei reikia.
Paprastai kreipiančiosios MTazės yra pridedami ekvimoliariniai kiekiai, lyginant su biomolekulės taikinių kiekiu. Nekofaktorinio nukleofilinio junginio koncentracijos paprastai yra milimoliarinės.
Išradimo įgyvendinimo pavyzdžiai
Toliau pateikiami išradimo įgyvendinimo konkretūs pavyzdžiai. Išradimo apimtis neapribojama, bet tik iliustruojama šiais pavyzdžiais.
Pavyzdys 1-2. Sekai specifinė dvigrandžių oligodeoksiribonucleotidų, turinčių hmC, modifikacija veikiant DNR citozino-C5 metiltransferaze Hhal
Modifikacija pirmiausiai buvo atliekama, naudojant DNR citozino-C5 metiltransferazę Hhal (M.Hhal) ir trumpus dvigrandžius oligodeoksiribonukleotidus. M.Hhal atpažįsta DNR seką 5'-GCGC-3' ir natūraliai perneša metilo grupę nuo S-adenozil-L-metionino (SAM arba AdoMet) ant vidinio citozino liekanos (pabrauktas) C5 atomo. Po fermentinės modifikacijos reakcijos, dvigrandis oligodeoksiribonukleotidas buvo fermentiškai sufragmentuotas iki 2‘-deoksiribonukleozidų ir analizuotas atvirkščios fazės
HPLC aparatūra, sujungta su ESI-MS.
Dvigrandis oligodeoksinukleotidas 1:11 buvo paruoštas, vandenyje sumaišant komplementarius viengrandžius oligonukleotidus I (SEQ ID NO:1) (5’TAATAATGCGCTAATAATAATAAT) ir II (SEQ ID NO:2) (3'TTATTACGCGATTATTATTATTA) kaip aprašyta LT2009023. hmC modifikacijos įvestos fermentiniu būdu kaip aprašyta LT 2009023. Modifikacijos pašalintos inkubuojant hmC-modifikuotą dvirdandį oiigonukleotidą l:ll (13 μΜ) su M.Hal (15 μΜ) 2 vai 37°C temperatūroje. Derivatizacijos reakcijos vykdytos, inkubuojant modifikuotą dvigrandį oiigonukleotidą 1:11 (13 μΜ) su 1 mM L-selenocisteino esant M.Hal (15 μΜ) 1 vai 20°C temperatūroje. Nukleozidų sudėties nustatymui DNR buvo išskirta kaip aprašyta LT2009023 ir veikiama nukleaze P1 (2 vnt, Sigma, Vokietija) 2 vai 60°C temperatūroje ir veršiuko žarnyno šarmine fosfatazė (30 u, Fermentas Life Sciences,
Lietuva) per naktį 37°C, Gauti nukleozidai buvo analizuojami atvirkščių fazių HPLC (Discovery C18 75 x 2.1 mm, 3 pm kolonėlė sujungta su Supelguard Discovery C18 20 x 2.1 mm, 5 pm prieškoloniu, Supelco, Vokietija) sujungtu su masių spektrometriniu detektoriumi (HP 1100 series ESI-MS sujungtas su vienu gvadrupoliu). Junginiai buvo eliuojami linijiniu A ir B tirpalų gradientu (A: 20 mM amonio formiatas pH 3.5 arba 20 mM amonio acetatas pH 5.5; B: 80% metanolio vandeninis tirpalas), eliujuojant 0.3 ml/min greičiu esant 30°C temperatūrai; 0-20 min, 0-20% B; 20-22 min, 20-100% B; 22-27 min, 100% B. Iš kolonėles išplaunami junginiai detektuojami UV absorbciniu diodinės matricos detektoriumi. UV absorbcijos spektrai buvo užrašyti (190-400 nm bangos ilgių intervale) smailių viršūnėse, o tirpiklio indėlis eliminuotas atėmus fono spektrus prieš ir po smailių. Iš kolonos ištekantis srautas buvo nukreipiamas į masių spektrometrą. 2‘-deoksicitidinų ir jo darinių jonizacijos padidinimui buvo naudojamas tirpalas C (96 %, metanolio, 4 % skruzdžių rūgšties ir 1 mM natrio formiato; tekėjimo greitis 0,3 ml/min). Masių spektrometre analizuojami susidarę teigiamai įkrauti jonai, esant kapiliaro įtampai - 5000 V, fragmentacijos įtampai 100-120 V, džiovinančių dujų tekėjimo greičiui 10-12 l/min ir temperatūrai 300-350°C. Masių spektrai matuojami intervale 50-600 m/z, 0.05 tikslumu. Didelės skiriamosios gebos masių spektrai gauti atitinkamas HPLC frakcijas išanalizavus LTQ Orbitrap masių spektrometru (Thermo Electron), kuris sujungtas su nanoelektroišpurškimo įtaisu (Proxeon NanoSpray ESI).
Pavyzdys 1: hmC turinčio dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido nukleozidų sudėties analizė po inkubavimo su M.Hhal
Modifikuoto dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido (l:ll) nukleozidų sudėties HPLC analizė parodė, kad šalia dG, dT ir dA nukleozidų randami taip pat dC ir dCCH20H (hmC 2'-deoksinukleosidas), kurių išėjimo laikai yra atitinkamai 3.7 ir 4.2 min. (žiūrėti Fig. 1).
Šie junginiai buvo išanalizuoti ESI-MS (m/z: 250 [M + Na]+, 134 [citosinas + Naf ir m/z: 280 [M + Naf, 164 [5-hidroksimetilcitozinas + Naj+). Nustatytos masės leidžia teigti, kad atitinkamai susidaro 2'-deoksicitidinas dC ir 5-hidroksimetil-2'-deoksicitidinas dCCH20H. Pastarasis junginys buvo beveik visiškai konvertuotas į nemodifikuotą dC, inkubuojant su M.Hhal (Fig. 1, lyginti santykinius C ir hmC smailių didžius takeliuose 1 ir 2). Taigi, hidroksimetilo grupė yra pašalinama nuo 5-hidroksimetilcitozino liekanų DNR, veikiant M.Hhal .
Pavyzdys 2. HmC turinčio dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido nukleozidų sudėties analizė po inkubacijos su L-selenocisteinu ir M.Hhal
HmC turinčio dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido (1:11) nukleozidų sudėties HPLC analizė parodė, kad šalia dC, dG, dT ir dA nukleozidų randamas dar vienas pikas, kurio išėjimo laikas yra 4.2 min, atitinkantis hmC (žiūrėti Fig. 2, takelis 1). Po inkubacijos su M.Hhal ir L-selenocisteinu, šis naujas produktas buvo iš dalies konvertuotas į naują junginį xC, kurio išėjimo laikas yra 3.1 min. Šis naujas produktas buvo išanalizuotas
HR-MS (rasta m/z: 409.0621, suskaičiuota [M + Hf, C^iN^Se: 409.0621). Nustatyta masė leidžia teigti, kad susidaręs naujas junginys yra 5-(Seselenocisteinil)metil-2'-deoksicitidinas dcCH2SeCH2CH(CO2H>NH2. Taigi L-selenocisteinas yra prijungiams prie 5-hidroksimetilcitozino liekanų DNR, veikiant M.Hhal.
Pavyzdžiai 3-7. Sekai specifinė viduje žymėto ir hmC turinčio dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido modifikacija buvo tirta veikiant DNR citozino-5 MTazėms
M.Hhal, M.Sssl arba Hpall. M.Hhal atpažįsta dvigrandę DNR seką 5’-GęGC-3’ ir natūraliai perneša metilo grupę nuo S-adenozil-L-metionino (SAM arba AdoMet) ant vidinio citozino (pabraukta). Atitinkamai, kitos DNR metiltransferazės atlieka panašią reakciją, bet atpažįsta skirtingus DNR taikinius: M.Sssl (atpažinimo taikinys CG) arba M.Hpall (atpažinimo taikinys CCGG). Taikinio citozinų modifikacijos analizė, esant DNR citozino-C5 metiltransferazėms, buvo atlikta, naudojant viduje pažymėtą dvigrandį oligodeoksiribonukieotidą. Viduje pažymėtas dvigrandis oligodeoksiribonukleotidas turi
DNR metiltransferazių atpažinimo sekas, kuriose taikinio citozinas buvo pažymėtas 33P (M.Hhal atveju buvo pažymėti abu taikinio citozinai). hmC modifikacija buvo atlikta fermentiškai, inkubuojant dvigrandį oligodeoksiribonukieotidą su formaldehidu (13 mM) ir atitnkama MTaze.
Siekiant išanalizuoti sudėtį, dvigrandis oligodeoksiribonukleotidas buvo fermentiškai sufragmentuojams iki 2‘-deoksiribonukleozid-5‘-monofosfatų, kurie analizuoti TLC ir autoradiografija, kas leižia atrankiai stebėti tik taikinio nukleotido modifikacijas. Dvigrandžiai oligodeoksiribonukleotidai lll:IV (nemetilintas M.Hhal DNR substratas), V:VI (hemimetilintas M.Hhal DNR substratas), VlkVIII (DNR substratai M.Hpail ir M.Sssl) ir IX:X (DNR substratas M.AIul) buvo paruošti sumaišius lygius molinius kiekius (150 μΜ) atitinkamų komplementarių viengrandžių oligodeoksiribonukleotidų: III (SEQ
ID NO:3) (5'-TCGGATGTTGTGGGTCA) ir IV (SEQ ID NO:4) (3'GCCTACAACACCCAGTCGCGTACTATCACAT); V (S'-TCGGATGTTGTGGGTCAG)
| (SEQ ID NO:5) | ir VI (SEQ | ID | NO:6) | (31- |
| GCCTACAACACCCAGTCGMGTACTATCACAT); VII | (SEQ | ID NO:7) | (5'- | |
| TGACCCACGCTCGCC) | ir VIII (SEQ | ID | NO:8) | (3'- |
| ACTGGGTGCGAGCGGGCCTCTATTTAATACA); IX | (SEQ | ID NO:9) | (5'- | |
| CGCGCCATTCCTGCGA) | ir X (SEQ | ID | NO:10) | (3'- |
GCGCGGTAAGGACGCTCGAAATCCTAT) vandenyje, pašildžius 95°C temperatūroje 5 min ir lėtai atvėsinus iki kambario temperatūros. Žymėti DNR substratai buvo paruošti sumaišant dvigrandžius DNR substratus (400 nM), dATP, dGTP ir dTTP (kiekvieno 33 μΜ, [a-33P]CTP (1.5 μΜ, Hartmann Analytic, Vokietija) ir Klenow Fragmentą (0.16 u/pL,
Fermentas Life Sciences) ir inkubuojant 37°C temperatūroje 30 min Klenow reakcijos buferyje; po to sekė polimerazės inaktyvacija 75°C temperatūroje 15 min. 20-100 dvigrandžio DNR substrato buvo inkubuojama su 125 nM M.Hhal, 1000 nM M.HpalI arba 120 nM M.Sssl (variantas O142A/N370A) buferiniame tirpale (5 -20 pL, 50 mM MOPS, 50 mM MES pH 7.0 (M.Hhal) ir pH 7.5 (kitos metiltransferazės), 1 mM Na2EDTA, 15 mM NaCl, 0.2 mg/ml jaučio serumo albumino, 5% glicerolio) su 13 mM formaldehido 1 vai kambario temperatūroje. Modifikacijos nuėmimo reakcijos buvo atliktos inkubuojant 20 nM dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido su atitinkama DNR metiltransferaze (2 μΜ M.Hhal, 2 μΜ M.HpalI arba 1.2 μΜ M.Sssl) 2-5 vai 37°C buferiniame tirpale (10 mM Tris-HCI pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.5 mM Na2EDTA 0.2 mg/ml jaučio serumo albumino, 5% glicerolio). Po reakcijos DNR buvo išsodinta 3 tūriais etanolio, ištirpinta nukleazės BAL31 buferyje (5 pL) su nukleaze BAL31 (0.4 u)(Fermentas Life Sciences), inkubuota 1 vai 30°C temperatūroje, o po to 0.5-3 μΙ tirpalo buvo užnešta ant TLC plokštelės (PEI CelluloseF, 20 x 20 cm, Merck). Naudotas TLC kilimo tirpalas: izosviesto rūgštis/ vanduo/ kone. amoniakas (66:17:4, vol/vol/vol). Plokštelės buvo džiovinamos per naktį, radioaktyvios dėmės eksponuotos su fotoekranu (Fujifilm, Japan), kuris nuskanuotas skaitytuvu FLA-5100. Radioaktyvumo kiekis dėmelėse kiekybiškai įvertintas, naudojant MultiGauge programa (Fujifilm). Modifikuoti
2‘-deoksiribocitidino-5‘-monofosfatai (dXMP) buvo detektuojami atsiradus naujoms radioaktyvumo dėmėms šalia pagrindinės 2'-deoksiribocitozino-5'-monofosfato (dCMP) dėmės. Modifikuoto nukleotido (dMXP) padėtis buvo nustatoma išmatavus jo nueitą kelią TLC plokštelėje ir palyginus jį su citozino (dCMP) nueitu keliu (Rc(X) = Rf(dXMP)/Rf(dCMP)).
Pavyzdys 3. HmC turinčio dvigrandžio oligodeoksiribonueleotido nukleotidų analizė po inkubavimo su DNR citozino-5 metiltransferaze (M.Hhal)
Modifikacijos produktų, gautų po hmC turinčios DNR inkubavimo su M.Hhal, TLC analizė parodė, kad hmC ir C nukleotidų santykis mažėja (Re vertė 0.85 ir 1.0, atitinkamai) (žiūrėti Fig. 3, takeliai 1 ir 2). Kontrolinė reakcija (takelis 3) buvo inkubuojama su katalitiškai neaktyviu M.Hhal mutantiniu baltymu (C81S). Taigi, 5hidroksimetilo grupė yra pašalinama nuo taikinio hmC liekanos, susidarant nemodifikuotam citozinui, veikiant katalitiškai aktyviai M.Hhal.
Pavyzdys 4. Dvigrandžio oligodeoksiribonucleotido taikinio nukleotido analizė, taikinyje turinčio hmC, C arba 5mC, po inkubacijos su L-cysteinu ir DNR citozino-5 metiltransferaze (M.Hhal) nM dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido V:VI (specifinis-C), V:VI-metilintas (specifinis-5mC), V:VI-hidroksimetilintas (specifinis-hmC), VILVIII (nespecifinis-C) arba
VlkVIII-hidroksimetilintas (nespecifinis-hmC) (Fig. 4, takeliai 1-5, atitinkamai) buvo inkubuojama su 50 mM L-cisteino ir M.Hhal (120 nM) 1 vai kambario temperatūroje. Dar viena radioaktyvi dėmė (Rc=0.55), atitinkantį prijungtą produktą Cys-hmC, buvo matoma (takelis 3) tik, kai substratu buvo naudota specifinė hidroksimetilinta DNR. Taigi M.Hhal prijungia egzogeninį nukleofilą sekai specifiškai prie hmC, bet ne prie C, arba
5mC.
Pavyzdys 5. HmC turinčio dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido taikinio nukleotidų analizė po inkubavimo su su L-selenocisteinu ir DNR citozino-5 metiltransferaze (M.Hhal)
Modifikuotų produktų, gautų po hmC turinčio specifinio dvigrandžio DNR substrato inkubavimo su L-selenocisteinu ir M.Hhal, TLC analizė parodė, kad atsiranda naujas modifikuotas nukleotidas SeCys-hmC (Re reikšmė 0.6; Fig. 4, lyginti takelius 6 ir 7). Taigi L-selenocisteinas yra prijungiamas prie taikinio 5-hidroksimetilcitozino liekanų DNR, veikiant M.Hhal.
Pavyzdys 6: HMC turinčio dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido taikinio nukleotidų analizė po inkubacijos su DNR citozino-5 metiltransferaze (M.Sssl)
Modifikacijos produktų, gautų po hmC turinčios DNR inkubavimo su M.Sssl (variantas O142A/N370A), TLC analizė parodė, kad hmC ir C nukleotidų santykis mažėja (žiūrėti
Fig. 3, palyginti takelius 7-8). Kontrolinė reakcija (takelis 9) buvo inkubuojama su termiškai inaktyvuotu M.SssI. Taigi, 5-hidroksimetilo grupė yra pašalinama nuo taikinio hmC liekanos, susidarant nemodifikuotam citozinui, veikiant katalitiškai aktyviai M.SssI.
Pavyzdys 7: HMC turinčio dvigrandžio oligodeoksiribonukleotido taikinio nukleotidų analizė po inkubacijos su DNR citozino-5 metiltransferaze (M.HpalI)
Modifikacijos produktų, gautų po hmC turinčios DNR inkubavimo su M.HpalI, TLC analizė parodė, kad hmC ir C nukleotidų santykis mažėja (Fig. 3, palyginti takelius 4-5). Kontrolinė reakcija (takelis 6) buvo inkubuojama su termiškai inaktyvuotu M.HpalI. Taigi, 5-hidroksimetilo grupė yra pašalinama nuo taikinio hmC liekanos, susidarant nemodifikuotam citozinui, veikiant katalitiškai aktyviai M.HpalI.
Pavyzdys 8-11. Didelių DNR molekulių, turinčių 5-hidroksialkilintą taikinio citoziną, sekai specifinė modifikacija veikiant DNR citozino-C5 metiltransferazėmis
Sekai specifinė modifikacija veikiant DNR citozino C5 metiltransferazėms Hhaį Sssl ir
Hpall buvo tirta, naudojant DNR apsaugojimo metodą. Šis metodas paremtas tuo, kad DNR metiltransferazių katalizuojama nukleobazių modifikacija tam tikrame taikinyje, kuris yra atpažįstamas restrikcijos endonukleazių, apsaugo DNR nuo šių fermentų hidrolizės. Nemodifikuoti taikiniai DNR yra greitai fragmentuojami restrikcijos endonukleazių, tuo tarpu kovalentinė taikinių modifikacija blokuoja DNR skėlimą. Po to fragmentacijos pobūdis yra analizuojamas agaroziniame gelyje.
DNR substratui buvo naudotas 618 bp plazmidės pUC19 (pUC-618) fragmentas su vienu M.Hhal taikiniu, 2 M.HpalI taikiniais ir 32 M.SssI taikiniais. pUC-618 buvo paruoštas PGR padauginimo metodu naudojant pUC19 plazmidę (Fermentas Life Sciences), du pradmenis Dir (5'-AACGTTGTTGCCATTGCTAC) (SEQ ID No:11) ir Rev (5'-GCTCATGAGACAATAACCCTGA) (SEQ ID No:12) ir Taq DNR polimerazę (Fermentas Life Sciences). PGR fragmentas buvo išgrynintas sefakrilu S-400 (GE Healthcare) ir išsodintas etanoliu.
HmC modifikacijos GCGC atpažinimo sekose buvo įvestos inkubuojant. 100 nM pUC618 ir 50 nM M.Hhal buferiniame tirpale (50 mM MOPS, 50 mM MES pH 7.0, 1 mM
Na2EDTA, 15 mM NaCl, 0.2 mg/ml jaučio serumo albumino, 5% glicerolio) su 13 mM formaldehido 1 vai kambario temperatūroje. 5-hidroksietilcitozino (heC) modifikacijos
GCGC atpažinimo sekose buvo įvestos inkubuojant 100 nM pUC-618 su 50 nM M.Hhal su 800 mM acetaldehido 1 vai kambario temperatūroje kaip aprašyta aukščiau. hmC modifikacijos CG atpažinimo sekose buvo įvestos inkubuojant 200 nM pUC-618 su
1200 nM M.Sssl (Q142A/N370A) ir 13 mM formaldehido 1 vai kambario temperatūroje kaip aprašyta aukščiau. hmC modifikacijos CCGG taikinyje buvo įvestos inkubuojant 200 nM pUC-618 su 2000 nM M.Hpall ir 13 mM formaldehido 1 vai kambario temperatūroje kaip aprašyta aukščiau. Reakcijos buvo sustabdytos, pašildant 75°C temperatūroje 20 min. DNR po to buvo išsodinta 3 tūriais etanolio ir vieną kartą perplauta 75% etanoliu. Modifikacijos nuėmimo reakcijos buvo atliktos inkubuojant pUC-618 su atitinkama DNR metiltransferaze 2 - 5 vai 37°C buferyje (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM NaCI, 0.5 mM NaaEDTA 0.2 mg/ml jaučio serumo albumino, 5% glicerolio).
DNR karpymas restrikcijos endonukleazėmis buvo atliktas pagal gamintojo rekomendacijas (Fermentas Life Sciences). Mėginiai buvo praskiesti 1/6 tūrio 6x užnešimo dažu (Loading Dye Solution, Fermentas Life Sciences) ir analizuoti 2% agarozės gelyje.
Pavyzdys 8. 618 bp DNR fragmento, turinčio hmC, sekai specifinė modifikacija, esant
M.Hhal
Fig. 5 (takeliai 1-4) rodo, kad dėl hmC modifikacijos pUC-618 fragmentas yra nekarpomas R.Hin6l (takeliai 1 ir 2). Inkubuojant šį fragmentą su laukinio tipo M.Hhal, GCGC taikiniai yra karpomi R.Hin6l (takelis 3), tačiau inkubuojant su katalitiškai neaktyviu M.Hhal mutantu C81S, DNR ir toliau yra nekarpoma (takelis 4). Taigi, 525 hidroksimetilo grupės yra efektyviai pašalinamos nuo GCGC taikinių DNR fragmente, veikiant katalitiškai aktyviai M.Hhal.
Pavyzdys 9. 618 bp DNR fragmento, turinčio 5-hidroksietilcitoziną, sekai specifinė modifikacija, esant M.Hhal
Fig. 5 (takeliai 5-8) rodo, kad dėl heC modifikacijos pUC-618 fragmentas yra nekarpomas R.Hin6l (palyginti takelius 5 ir 6). Inkubuojant šį fragmentą su laukinio tipo
M.Hhal, GCGC taikiniai yra karpomi R.Hin6l (takelis 7), tačiau inkubuojant su katalitiškai neaktyviu M.Hhal mutantu C81S, DNR ir toliau yra nekarpoma (takelis 8).
Taigi, 5-hidroksietilo grupės yra efektyviai pašalinamos nuo GCGC taikinių DNR fragmente, veikiant katalitiškai aktyviai M.Hhal.
Pavyzdys 10. 618 bp DNR fragmento, turinčio hmC, sekai specifinė modifikacija, esant M.Sssl
Fig. 6 rodo, kad dėl hmC modifikacijos pUC-618 fragmentas yra iš dalies nekarpomas R.Hin6l (takelis 1). Inkubuojant šį fragmentą M.Sssl (variantas Q142A/N370A), GCGC taikiniai yra daugiau karpomi R.Hin6l (padaugėja karpymo produktų takelyje 2). Taigi, 5hidroksimetilo grupės yra pašalinamos nuo GCGC taikinių DNR fragmente, veikiant M.Sssl.
Pavyzdys 11. 618 bp DNR fragmento, turinčio hmC, sekai specifinė modifikacija, esant M.HpalI
Fig. 6 rodo, kad dėl hmC modifikacijos pUC-618 fragmentas yra iš dalies nekarpomas R.HpalI (takelis 3). Inkubuojant šį fragmentą su M.HpalI, CCGG taikiniai yra daugiau karpomi R.Hin6l (padaugėja karpymo produktų takelyje 4). Taigi, 5-hidroksimetilo grupės yra pašalinamos nuo CCGG taikinių DNR fragmente, veikiant M.HpalI.
Pavyzdys 12. Sekai specifinė hmC konversiją į citozinus žmogaus genominėje DNR, naudojant DNR citozino-5 metiltransferazę M.Sssl
90 ng žmogaus genominės DNR (gDNA) (izoliuotos iš mirusių žmonių smegenų) buvo inkubuota 25 pi buferiniame tirpale ( 50 mM MOPS, 50 mM MES pH 7.5, 1 mM Na2EDTA, 15 mM NaCI, 0.2 mg/ml jaučio serumo albumino, 5% glicerolio) su 1200 nM M.Sssl (variantas O142A/N370A) per naktį 37°C. DNR buvo išgryninta naudojant rinkinį (Oiagen Nucleotide Removal Kit) ir fragmentuota su R.MspI arba R.HpalI (20 u) (Fermentas Life Science) 3 vai 37°C. Tada buvo pridėta RnazėsA (5 pg) ir FastAP (0.5
u) ir inkubacija pratęsiama dar vieną valandą. DNR vėl buvo išvalyta per rinkinį (Oiagen
Nucleotide Removal Kit) ir pažymėta, naudojant T4 polinukleotidkinazę (Fermentas Life
Science) ir [y-33]ATP (Hartmann Analytic). Po to DNR buvo išsodinta 3 tūriais etanolio ir degraduota su Lambda egzonukleaze (5 u) 1 vai 37°C. 0.5-3 pi mėginio buvo užnešta ant TLC lėkštelių (PEI CelluloseF, 20 x 20 cm, Merck), naudotas TLC kilimo tirpalas izosviesto rūgštis/ vanduo/ kone. amoniakas (66:17:4, vol/vol/vol). Plokštelės buvo džiovinamos per naktį, o radioaktyvios dėmelės autografuotos, naudojant fotoekranus (Fujifilm, Japan), kurie nuskanuoti su FLA-5100 fotoskaitytuvu. Vaizdai apdoroti Multigauge programa (Fujifilm). Fig. 7 rodo, kad genominėje žmogaus smegenų DNR yra hmC ir 5mC antrame citozine CCGG taikinyje (pabrauktas), nes hmC ir 5mC turintys taikiniai yra perkerpami R.Mspi ir pažymimi ties antru nukleotidų (žiūrėti takelį 2 ir atitinkamai juodą radioaktyvumo profilį dešinėje), tuo tarpu R.Hpail nekerpa tokių taikinių, todėl jie nepasižymi (Kriaucionis, S. & Heintz, N. Science published online, doi:10.1126/science.1169786). Genominę DNR inkubuojant su M.Sssl, detektuojamas hmC kiekis CCGG sekose sumažėja (takelis 3 ir atiitnkamai pilkas radioaktyvumo profilis dešinėje). Taigi 5-hidroksimetiio grupė yra pašalinama nuo taikinio citozino CCGG sekose žmogaus genominėje DNR, veikiant M.Sssl.
Claims (14)
1. Kofaktoriaus neturinčios metiltransferazės panaudojimas modifikuotos biomolekulės, turinčios modifikuojančią grupę formulės -CH(OH)-R, kur R yra vandenilis arba C1-C12alkilas, optimaliai vandenilis arba žemesnysis alkilas, geriausiai vandenilis arba -CH3,
5 tikslinei konversijai į nemodifikuotą biomolekulę, pašalinant minėtą modifikuojančią grupę metiltransferazės atpažinimo taikiniuose.
2. Modifikuotos biomolekulės tikslinės konversijos būdas, apimantis modifikuotos biomolekulės, turinčios modifikuojančią grupę formulės -CH(OH)-R, kur R yra vandenilis arba C^-C^-alkilas, optimaliai vandenilis arba žemesnysis alkilas, geriausiai
10 vandenilis arba -CH3, inkubaciją su kofaktoriaus neturinčia kreipiančiąja metiltrasferaze sąlygomis, užtikrinančiomis metiltransferazės fermentinį aktyvumą, kur minėta tikslinė konversija vyksta:
i) kovalentiškai pašalinant minėtą modifikuojančią grupę liekanose, kurios yra metiltransferazės taikiniai; arba
15 ii) vykdant minėtos modifikuojančios grupės derivatizaciją liekanose, kurios yra metiltransferazės taikiniai, kovalentiškai prijungiant nekofaktorinius nukleofilinius junginius bendros formulės
HQ-LX, kur X žymi funkcinę grupę ar reporterinę grupę, prijungtą per jungtuką L, ir Q yra
20 pasirinktas iš S, Se, O, N, C.
3. Būdas pagal 2 punktą arba panaudojimas pagal 1 punktą, kur minėta biomolekulė yra nukleorūgšties molekulė, optimaliai DNR, ir minėta metiltransferazė yra DNR citozino-5 metiltransferazė, pasirinkta iš grupės susidedančios iš M.Hhal, M.Sssl ir M.Hpali arba
25 jų darinių.
t
4. Būdas pagal 2 arba 3 punktą, kur modifikuota biomolekulė yra natūraliai ar dirbtinai modifikuota biomolekulė, turinti modifikuojančią grupę, apibrėžtą 2 punkte, kur R yra vandenilis arba -CH3; ir Q yra S arba Se.
5. Modifikuotos biomolekulės tikslinio žymėjimo būdas, apimantis reporterinės grupės,
5 kuri yra tinkama kaip žymė ir kuri leidžia identifikuoti pažymėtą biomolekulę tarp kitų nežymėtų molekulių, tiesioginį prijungimą arba prijungimą paeiliui.
6. Būdas pagal 5 punktą, kuriame žymė yra pasirinkta iš fluoroforų, fluorescencijos gesintojų, chromoforų, giminingumo žymenų, stabilių paramagnetinių grupių,
10 radioaktyvius arba retus stabilius izotopus turinčių grupių, grupių, turinčių sunkiuosius atomus, tinkamus kristalografinių difrakcijos duomenų fazėms gauti, tarpgrandininius ryšius formuojančių agentų, nukleorūgštis karpančių grupių, haptenų, nano-dalelių ir rutuliukų.
15
7. Hidroksimetilintų taikinių biomolekulėje nustatymo būdas, apimantis biomolekulės derivatizaciją arba žymėjimą, prijungiant nekofaktorinį junginį, apibrėžtą 2 punkte, esant kofaktoriaus neturinčiai metiltransferąžei ir nustatant, ar minėtos metiltransferazės taikiniai buvo modifikuoti, kur minėtos metiltransferazės taikinių modifikavimas nurodo hidroksimetilinto taikinio buvimą.
8. Būdas pagal 7 punktą, kuriame prijungiamas junginys trukdo nukleorūščių padauginimui metiltransferazės atpažinimo sekose; ir hidroksimetilinti taikiniai yra nustatomi testuojant, ar būta nukleorūgščių molekulės padauginimo uždelsimo metiltransferazės atpažinimo sekose.
9. Būdas pagal 7 ar 8 punktus, kuriame prijungiamas junginys turi fluorescencinę žymę, ir hidroksimetilinti taikiniai yra nustatomi, matuojant fluorescencijos buvimą arba kiekį minėtoje nukleorūgšties molekulėje.
10. Būdas pagal bet kurį iš 7-9 punktų, kur junginio prijungimas yra galimas prie 5hidroksimetilcitozino liekanos DNR, bet jo prijungimas yra negalimas prie 5metilcitosino ar citozino liekanų.
5
11. Būdas pagal bet kurį iš 5-6 arba 7-10 punktų, kur prijungiamas junginys ar žymė derivatizuotojoje biomolekulėje, optimaliai DNR molekulėje, yra identifikuojamas DNR sekoskaita, hibridizacija, masių spektrometrija arba nukleozidų sudėties analize po fermentinės fragmentacijos ir chromatografijos.
12. Rinkinys, skirtas atlikti būdą pagal bet kurį iš punktų 2-4, 5-6 arba 7-11, apimantis
10 kofaktoriaus neturinčią kreipiančiąją metiltransferazę arba kofaktoriaus neturinčią kreipiančiąją metiltransferazę ir nekofaktorinį (-ius) junginį (-ius) atskiruose konteineriuose.
13. Rinkinys pagal 12 punktą, papildomai turintis pašalintą grupę surišantį junginį(-ius) atskiruose konteineriuose ir, nebūtinai, naudojimo instrukciją.
15 14. 2’-deoksicitidino darinys susidaręs DNR, kuris yra 5-(Se-selenocisteinil)metil-2'deoksicitidinas.
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2009023A LT5708B (en) | 2009-04-02 | 2009-04-02 | Derivatization of biomolecules by covalent coupling of non-cofactor compounds using methyltransferases |
| LT2009032A LT5706B (en) | 2009-04-02 | 2009-05-08 | Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases |
| US13/262,340 US8822146B2 (en) | 2009-04-02 | 2010-04-01 | Derivatization of biomolecules by covalent coupling of non-cofactor compounds using methyltransferases |
| EP10712086.7A EP2414527B1 (en) | 2009-04-02 | 2010-04-01 | Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases |
| PCT/EP2010/054436 WO2010115846A1 (en) | 2009-04-02 | 2010-04-01 | Derivatization of biomolecules by covalent coupling of non-cofactor compounds using methyltransferases |
| EP10714602.9A EP2414528B1 (en) | 2009-04-02 | 2010-04-01 | Derivatization of biomolecules by covalent coupling of non-cofactor compounds using methyltransferases |
| US13/262,738 US8889352B2 (en) | 2009-04-02 | 2010-04-01 | Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases |
| PCT/EP2010/054437 WO2010115847A1 (en) | 2009-04-02 | 2010-04-01 | Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases |
| US14/542,770 US9505797B2 (en) | 2009-04-02 | 2014-11-17 | Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases |
| US15/293,232 US20170067093A1 (en) | 2009-04-02 | 2016-10-13 | Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2009023A LT5708B (en) | 2009-04-02 | 2009-04-02 | Derivatization of biomolecules by covalent coupling of non-cofactor compounds using methyltransferases |
| LT2009032A LT5706B (en) | 2009-04-02 | 2009-05-08 | Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2009032A LT2009032A (lt) | 2010-11-25 |
| LT5706B true LT5706B (en) | 2011-01-25 |
Family
ID=42300437
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2009023A LT5708B (en) | 2009-04-02 | 2009-04-02 | Derivatization of biomolecules by covalent coupling of non-cofactor compounds using methyltransferases |
| LT2009032A LT5706B (en) | 2009-04-02 | 2009-05-08 | Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2009023A LT5708B (en) | 2009-04-02 | 2009-04-02 | Derivatization of biomolecules by covalent coupling of non-cofactor compounds using methyltransferases |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US8822146B2 (lt) |
| EP (2) | EP2414527B1 (lt) |
| LT (2) | LT5708B (lt) |
| WO (2) | WO2010115847A1 (lt) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010037001A2 (en) | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Immune Disease Institute, Inc. | Selective oxidation of 5-methylcytosine by tet-family proteins |
| LT5708B (en) | 2009-04-02 | 2011-01-25 | Biotechnologijos Inst | Derivatization of biomolecules by covalent coupling of non-cofactor compounds using methyltransferases |
| US20120064521A1 (en) * | 2010-09-09 | 2012-03-15 | James Yen | Detection of dna hydroxymethylation |
| AT511856A1 (de) * | 2011-09-01 | 2013-03-15 | Univ Graz Tech | Mittel und verfahren zur alkylierung |
| GB201119903D0 (en) | 2011-11-17 | 2011-12-28 | Univ Vilnius | Nucleic acid production and sequence analysis |
| GB201119904D0 (en) * | 2011-11-17 | 2011-12-28 | Univ Vilnius | Analysis of methylation sites |
| ES2872073T3 (es) | 2011-12-13 | 2021-11-02 | Univ Oslo Hf | Procedimientos y kits de detección de estado de metilación |
| ES2669512T3 (es) | 2012-11-30 | 2018-05-28 | Cambridge Epigenetix Limited | Agente oxidante para nucleótidos modificados |
| EP3280793A4 (en) * | 2015-04-06 | 2018-10-03 | The Regents of the University of California | Methods for determining base locations in a polynucleotide |
| US11459573B2 (en) | 2015-09-30 | 2022-10-04 | Trustees Of Boston University | Deadman and passcode microbial kill switches |
| WO2020013712A1 (en) * | 2018-07-09 | 2020-01-16 | Victoria Link Limited | Inhibitors of dnmt1 as anticancer therapeutic agents |
| GB2580963C (en) | 2019-02-01 | 2025-09-03 | Hemispherian As | Cancer therapies |
| CN110470754B (zh) * | 2019-07-31 | 2021-05-04 | 武汉大学 | 一种高效液相色谱法测定虫草中虫草素含量的方法 |
| MX2023001142A (es) | 2020-07-30 | 2023-05-25 | Cambridge Epigenetix Ltd | Composiciones y metodos para analisis de acidos nucleicos. |
| CN112730554B (zh) * | 2020-12-09 | 2022-09-09 | 山东师范大学 | 一种电极、包含该电极的生物传感器的制备及其在检测甲基转移酶中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LT2009023A (lt) | 2009-04-02 | 2010-10-25 | Biotechnologijos Institutas | Biomolekullių derivatizacija nekofaktoriniais junginiais esant metiltransferazėms |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI981790A0 (fi) | 1998-07-14 | 1998-08-20 | Markku Rosnell | Väline siiman käsittelmiseksi |
| ES2211138T3 (es) | 1998-07-29 | 2004-07-01 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Nuevos cofactores de metiltransferasas. |
| EP1712557A1 (en) | 2005-04-14 | 2006-10-18 | RWTH Aachen | New s-adenosyl-L-methionine analogues with extended activated groups for transfer by methyltransferases |
| US7465544B2 (en) | 2006-01-11 | 2008-12-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Synthetic cofactor analogs of S-adenosylmethionine as ligatable probes of biological methylation and methods for their use |
-
2009
- 2009-04-02 LT LT2009023A patent/LT5708B/lt not_active IP Right Cessation
- 2009-05-08 LT LT2009032A patent/LT5706B/lt not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-04-01 WO PCT/EP2010/054437 patent/WO2010115847A1/en not_active Ceased
- 2010-04-01 US US13/262,340 patent/US8822146B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-04-01 WO PCT/EP2010/054436 patent/WO2010115846A1/en not_active Ceased
- 2010-04-01 US US13/262,738 patent/US8889352B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-04-01 EP EP10712086.7A patent/EP2414527B1/en not_active Not-in-force
- 2010-04-01 EP EP10714602.9A patent/EP2414528B1/en not_active Not-in-force
-
2014
- 2014-11-17 US US14/542,770 patent/US9505797B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-10-13 US US15/293,232 patent/US20170067093A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LT2009023A (lt) | 2009-04-02 | 2010-10-25 | Biotechnologijos Institutas | Biomolekullių derivatizacija nekofaktoriniais junginiais esant metiltransferazėms |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CHENG X.: "Structure and function of DNA methyltransferases.", ANNU REV BIOPHYS BIOMOL STRUCT., 1995, pages 293 - 318 |
| GOLL MG, BESTOR TH.: "Eukaryotic cytosine methyltransferases.", ANNU REV BIOCHEM., 2005, pages 481 - 514 |
| PENN NW ET AL.: "The presence of 5-hydroxymethylcytosine in animal deoxyribonucleic acid.", BIOCHEM J., 1972, pages 781 - 790 |
| Retrieved from the Internet <URL:doi:10.1126/science.1169786> |
| VALINLUCK V ET AL.: "Oxidative damage to methyl-CpG sequences inhibits the binding of the methyl-CpG binding domain (MBD) of methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2).", NUCLEIC ACIDS RES., 2004, pages 4100 - 4108 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LT5708B (en) | 2011-01-25 |
| LT2009023A (lt) | 2010-10-25 |
| WO2010115846A1 (en) | 2010-10-14 |
| EP2414527A1 (en) | 2012-02-08 |
| EP2414527B1 (en) | 2015-05-20 |
| US20120088238A1 (en) | 2012-04-12 |
| US8889352B2 (en) | 2014-11-18 |
| LT2009032A (lt) | 2010-11-25 |
| EP2414528B1 (en) | 2014-05-07 |
| US20170067093A1 (en) | 2017-03-09 |
| EP2414528A1 (en) | 2012-02-08 |
| US9505797B2 (en) | 2016-11-29 |
| US20120094280A1 (en) | 2012-04-19 |
| US20150093752A1 (en) | 2015-04-02 |
| WO2010115847A1 (en) | 2010-10-14 |
| US8822146B2 (en) | 2014-09-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| LT5706B (en) | Conversion of alpha-hydroxyalkylated residues in biomolecules using methyltransferases | |
| US20100317005A1 (en) | Modified Nucleotides and Methods for Making and Use Same | |
| Dai et al. | Quantification and mapping of DNA modifications | |
| EP2694686B2 (en) | COMPOSITION AND METHODS RELATED TO MODIFICATION OF 5-METHYLCYTOSINE (5mC) | |
| Grosjean et al. | Detection and quantification of modified nucleotides in RNA using thin-layer chromatography | |
| Song et al. | Mapping recently identified nucleotide variants in the genome and transcriptome | |
| CN110383071B (zh) | 用于质谱的试剂 | |
| Rudenko et al. | Analogs of S-adenosyl-L-methionine in studies of methyltransferases | |
| Roberts et al. | Determination of apurinic/apyrimidinic lesions in DNA with high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry | |
| Gines et al. | On-bead fluorescent DNA nanoprobes to analyze base excision repair activities | |
| Dietzsch et al. | Chemoselective labeling and site‐specific mapping of 5‐formylcytosine as a cellular nucleic acid modification | |
| Zou et al. | 5-Formyluracil as a cornerstone for aluminum detection in vitro and in vivo: a more natural and sustainable strategy | |
| Panahi et al. | Next-generation sequencing approaches for the study of genome and epigenome toxicity induced by sulfur mustard | |
| Wei et al. | Tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 excises the 3′-DNA-ALKBH1 cross-link and its application for 3′-DNA-ALKBH1 cross-link characterization by LC-MS/MS | |
| TWI235766B (en) | Fluorescent intensity assaying method for protein or peptide binding to nucleic acids | |
| Qing et al. | Quantitation and mapping of the epigenetic marker 5‐hydroxymethylcytosine | |
| US12359243B2 (en) | DNA adductomics by mass tag prelabeling | |
| EP3668994B1 (en) | Method of detection of dna end(s) and its use | |
| KR20010103630A (ko) | Ｄｎａ 수복 분석 방법 및 테스트 키트 | |
| Finke et al. | Analysis of DNA methylation content and patterns in plants | |
| Chadt et al. | Monitoring of dimethyl sulphate-induced N3-methyladenine, N7-methylguanine and O6-methylguanine DNA adducts using reversed-phase high performance liquid chromatography and mass spectrometry | |
| Schlagenhauf et al. | Non-enzymatic quantification of polyphosphate levels in platelet lysates and releasates | |
| US20050260630A1 (en) | Rapid methods for detecting methylation of a nucleic acid molecule | |
| Dai et al. | Evaluation of UDP‐GlcN Derivatives for Selective Labeling of 5‐(Hydroxymethyl) cytosine | |
| JP2003116581A (ja) | 標識核酸及びその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20210508 |