KR970011386B1 - 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-d-아리비노-푸라노실)-5-에틸우라실을 이용한 간염 비루스 감염질환의 치료방법 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

요약 없음

Description

1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아리비노-푸라노실)-5-에틸우라실을 이용한 간염 비루스 감염질환의 치료방법 및 치료용 조성물

제 1 도는 만성 감염질환을 앓는 우드척 내에서의 WHV DNA 폴리머라제활성을 예시한다.

제 2 도는 FMAU 및 FEAU로 처리한 우드척내에서의 WHV증식 억제를 비교한 것이다.

제 3 도는 보다 적은 투여량의 FMAU 및 FEAU로 처리한 우드척내에서의 WHV증식 억제를 비교한 것이다.

제 4 도는 FEAU를 경우 투여한 경우에 있어서의 우드척 내에서의 WHV 증식억제를 예시한다.

본원은 1987년 9월 3일 출원된 미합중국 특허출원 일련번호 제092,446호의 CIP출원건으로서, 참고로 상기 특허출원건의 내용도 본 명세서 내에서 인용하기로 한다.

본 발명은 그 일부가 국립 암 연구소의 연구보조금 제 CA-08748,18601 및 18856호, 보건후 생성의 CA-44094호, 베테랑 어드미니스트레이숀(Veterans Administration), 국립 알러지 및 감염성 질환 연구소의 연구보조금 제 NO-Al-62521호를 기금으로 하여 수행된 것으로서, 따라서 미합중국 정부가 본 발명에 있어서의 일정한 권리를 갖는다.

발명의 배경

본원에서는 각종 간행물들을 참고자료로 이용하였으며, 이들을 괄호내에 아라비아숫자로 표기하였다. 이들 참고자료들에 관한 상세한 설명은 본명세서 후미의 특허청구의 범위 바로앞에 기재되어 있다. 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 실정을 보다 정확하게 기술하기 위한 목적으로 이들 간행물들의 내용을 그대로 본원에서도 인용하여 참고하기로 한다.

본 발명은 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노-푸라노실)-5-에틸우라실(FEAU)을 이용한 간염 비루스 감염질환의 치료방법 및 치료용 조성물에 관한 것이다. FEAU는 5-치환된-1-(2'-데옥시-2'-치환된-베타-D-아라비노푸라노실)군의 일원으로서, 종래 항헤르페스 비루스 제제로서 공지되어 왔으며, 로페즈(Lopez)등에게 허여된 미합중국 특허 제4,211,773호에도 발표된 바 있으나, FEAU 자체가 상기 특허에 기술되어 있지는 않다.

그러나 FEAU 및 그의 항헤르페스 활성에 관하여는 폭스(FOX)등이 "헤르페스 비루스 및 비루스 화학요법"(R. Kano, A. Nakajima, eds.)(Excerpta Medica, 53-56 페이지(1985))에서 발표한 바 있다.

상기군에 속하는 다른 화합물들의 예로서는 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-메틸우라실(FMAU)및 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-요오도시토신(FIAC)을 들 수 있다.

항헤르페스 비루스 제제가 간염 치료에 있어서도 또한 효과가 있으리라는 예상을 한 바는 없으나, 이들 화합물들을 대상으로 간염치료제로서의 유용성에 대한 연구가 수행되었다. 그와같은 연구중에 FEAU가 간염치료에 특히 이상적인 것으로 밝혀졌다. FMAU는 간염 비루스의 증식을 억제하는 데 있어서 효과적이고, 때로는 보다 큰 유효성을 나타내긴 하였으나 치명적인 강한 독성을 유발하는 부작용들을 수반하였다. 그러나 FEAU는 심각한 독성 부작용을 유발함이 없이 간염 비루스의 증식을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.

간염의 특히 공통적인 한가지 유형이 B형 간염 비루스(HBV)이다. 상기 HBV는 데인(Dane)입자로서도 또한 공지되어 있으며, 외부의 지방단백질 코우트(B형 간염표면 항원, HBsAg)와 내부핵(B형 간염핵항원 HBcAg)으로 구성된 42nm의 구형 복합체 입자이다. 상기 핵은 원형의 부분 이중-가닥 DNA와 DNA폴리머라제를 함유한다. 시험관 내에서 DNA폴리머라제는 게놈(genome)내의 커다란 단일-가닥 부위를 메꾸어 게놈내에 완전한 이중-가닥 부위를 생성시킨다. 데인 입자와 관련된 DNA폴리머라제의 구체적인 특성은 아직 명확히 알려지지 않고 있다. 인터칼레이팅(intercalating)제제, 피로포스페이트 동족체 및 아라비노푸라노실 뉴클레오티드에 의한 HBV DNA폴리머라제의 선택적인 억제가 공지되어 있으며, 그로부터 만성 B형 간염을 앓고 있는 환자에게 있어서 B형 간염 비루스 증식을 억제하는 기능을 부여하고 있다.

HBV와 매우 밀접한 제제가 우득척(woodchucks) : 우드척 간염 비루스 (WHV)에서도 공지되어 있다. 동일한 부류의 비루스에 속하는 상기 비루스들 둘다를 때로는 Hepa-DNA비루스로 명명하기도 한다.

종래 제안된 바와 같이, HBV 및 WHV DNA 폴리머라제는 동일한 기본적인 특성들을 공유한다. 따라서, 초기의 시험관 내에서 수행한 연구에서는 WHV DNA폴리머라제의 활성이 HBV의 그것과 병행되어 조사되었다. Hepa-DNA 비루스의 종류중에서 HBV와 WHV만이 만성 활성 간염 및 간세포암을 유발하는 것으로 공지되어 있다. 일반적으로, 우드척에게 있어서의 WHV 감염과 인체에 있어서의 HBV감염이 비루스학적으로 또한 조직병리학적으로 서로 유사하다.

B형 간염 비루스와 간세포암을 서로 연관시킬 수 있는 증거로서 우드척간염 비루스(WHV)/우드척 모델을 들 수 있다. 출생시에 WHV를 접종하여 실험적으로 우드척내에서 간세포암을 유발시키는 것이 가능하다. 이러한 재료들은 WHV의 암유발 기능을 실험적으로 뒷받침할 뿐만 아니라 나아가 인체내에 있어서의 B형간염 비루스의 발병 모델로서의 우드척간염 비루스의 용도도 또한 입증한다.

발명의 요약

본 발명은 치료 대상 체내에서 간염 비루스의 증식을 억제하는데 유효한 양의 하기 구조를 갖는 화합물 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-에틸우라실, 또는 그의 프로드럭(prodrug) 형태 또는 약학적으로 허용되는 염과 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는, 치료 대상에게 있어서의 간염 비루스 감염질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 치료 대상 체내에서 간염 비루스의 증식을 억제하는 데 유효한 양의, 하기 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 프로드럭형태 또는 약학적으로 허용되는 염을 치료 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 대상에게 있어서의 간염 비루스 감염질환의 치료방법도 또한 제공한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 치료 대상 체내에서 간염 비루스의 증식을 억제하는 데 유효한 양의, 하기 구조를 갖는 화합물 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-에틸우라실(FEAU), 또는 그의 프로드럭 형태 또는 약학적으로 허용되는 염과 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는, 특히 인체에 있어서의 간염 비루스 감염질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 명세서내에서 사용하는 용어 "프로드럭(prodrug)형태"란 치료 대상에게 투여할 경우 용이하게 FEAU로 전환될 수 있는 모든 화합물을 총칭한다. FEAU의 프로드럭 형태의 예로서 당의 5' 위치에 존재하는 히드록실기가 모노-또는 디-포스페이트기로 전환된 것들을 들 수 있다.

본 명세서내에서 사용하는 용어 "약학적으로 허용되는 염이란 FEAU의 임의의 알칼리 또는 알칼리 금속염과 같은, FEAU대신에 사용 가능한 FEAU의 모든 통상적인 염을 총칭한다. 마지막으로, 용어 "약학적으로 허용되는 담체"란 멸균용액, 정제, 피복정제 및 캡슐과 같은, 모든 표준적인 약학적 담체를 총칭한다. 통상적으로 그와같은 담체는 전분, 우유, 당, 특정한 종류의 점토, 젤라틴, 스테아린산 또는 그의 염, 스테아린산마그네슘 또는 칼슘, 탈크, 식물성 지방 또는 오일, 고무, 글리콜과 같은 부형제, 또는 기타 다른 공지의 부형제들을 함유한다.

상기 담체들은 또한 풍미 및 착색첨가물 또는 기타 다른 성분들을 함유할 수도 있다. 이들 담체를 함유하는 조성물은 주지의 종래방법들로 조제된다. 현재 바람직한 구체예는 경우 투여용 조성물이다.

본 발명이 교수하는 바에 따라, 간염 비루스는 A형 간염, B형 간염 또는 비-A형, 비-B형 간염 비루스일 수도 있으며, 특히 B형 간염 비루스를 주된 대상으로 한다.

또한, 본 발명이 교수하는 바에 따라, 조성물내에 배합하는 화합물의 양도 광범위하게 달라질 수 있다.

정확한 양을 결정하는 방법은 본 발명이 속하는 당해기술분야에 숙련된 이들에게 있어서 주지되어 있으며, 특히 치료하고자 하는 대상, 특정한 약학적 담체, 이용하는 투여경로 및 조성물의 투여빈도에 좌우된다.

일반적으로 감염비루스의 증식을 억제하는 데 유효한 조성물내의 화합물 양은 1일 치료 대상의 체중 1kg 당 약 0.01mg-100.0mg, 바람직하기로는 1일 치료 대상의 체중 1kg 당 약 0.04mg이상, 예를 들면 약 0.04-50.0mg이다.

본 발명은 또한 치료 대상 체내에서 간염 비루스의 증식을 억제하는 데 유효한 양의, 하기 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 프로드럭 형태 또는 약학적으로 허용되는 염을 치료 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 대상에 있어서의 간염 비루스 감염질환의 치료방법도 제공한다.

그와 같은 방법에 있어서, 화합물의 투여는 경구, 정맥내, 근육내 및 피하투여를 비롯하여(이들로만 제한되지 않음)임의의 주지 방법들로 실시할 수 있다. 이때, 화합물을 경구 투여하는 것이 바람직하다. 상술한 본 발명 방법을 실시하는 데 있어서, 비루스의 증식을 억제하는 데 유효한 화합물의 양은 조성물 내에서와 마찬가지로서, 즉 일반적으로 1일 치료 대상의 체중 1kg당 약 0.01mg-약 100.00mg, 바람직하기로는 0.04mg이상, 예를 들면 약 0.04-약 50.0mg이다.

마지막으로, 본 발명 방법을 이용하여 치료가능한 간염 비루스로서는 A형 간염, B형 간염, 또는 비-A형, 비-B형 간염 비루스를 들 수 있으며, 특히 B형 간염 비루스를 주된 대상으로 한다.

실험디테일

이하에는 실시예들을 기술하여 본 발명의 이해를 돕고자하며, 단 이들 실시예들이 본원의 특허청구범위에서 정의하는 본발명을 어느 면으로든지 제한하기 위한 것이 아니며, 아울러 제한하는 것으로 해석되어서도 아니된다는 것을 밝혀두는 바이다.

재료 및 방법

시험관내 시험

비루스 입자의 제조

HBsAg에 대하여 양성을 나타내는 면역결손 환자의 혈청으로 부터 DNA 폴리머라제 활성을 함유하는 HBV 입자들을 정제한다. 비루스 만성 보균자인 5마리 우드척(마르모타 모낙스 : Marmota monax)의 혈청푸울로 부터 WHV를 수득한다. 초기에 펜실바니아로부터 수입된 우드척들은 한츠(Hantz)등 [J. Virol. Metho. 7 : 45-55(1983)]이 발표한 바와같이 혈청학 시험시 1년 이상 콜로니를 형성한다. 슈크로오스 및 같은 밀도의 CsCl농도구배로 원심분리를 실시하여 비루스를 정제한다.

화합물

시험관내 시험에 있어서는 3인산염을 사용한다.

상기 3인산염은 예상되는 세포 대사 공정들에 기인되어 그 사용이 요구된다. 표지시키지 않은(unlabeled)뉴클레오시드 트리포스페이트는 미합중국 미조리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴패니(Sigma Chemical Company)로 부터 입수하였다.

데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 [³H]dTTP(30Ci/밀리몰), [³H]dATP(24 Ci/밀리몰), [³H]dCTP(17Ci/밀리몰) 및 [³H]dCTP(9.5Ci/밀리몰)는 아머샴(Amersham, 프랑스공화국)으로 부터 입수하였다.

ACV는 노올쓰 캐롤라이나 챠펠 힐에 소재하는 버로우즈 웰컴(Burroughs Welcome)으로 부터 입수하였으며, BVdU의 합성은 클레르크(Clerq)드이 Proc.Natl.Acad.Sci(미합중국) 76권 2947-2951페이지(1979)에 기술한 바에 따라 실시한다. FIAC의 합성에 관하여서는 로페즈(Lopez)등이 미합중국 특허 제4,211,773호에 발표한 바 있다. FEAU의 합성에 관하여서는 와타나베(Watanabe)등이 저어널 오브 메디칼 케미스트리(J. Med. Chem.) 27권, 91-94페이지(1984)에 기술한 바에 따른다. 3가지 뉴클레오시드 동족체 모두를 알리우딘(Allaudeen)등이 Proc, Natl, Acad, Sci. (미합중국)78권 2698-2702페이지(1981)에 기술한 방법에 따라 상응하는 그들의 5'-트리포스페이트로 전환시킨다. 브루커(Bruker)HX-270분 광계로 'H NMR을 측정하고 알텍스(Altex) 모델 332 농도구배 액체 크로마토그라프로 고속 액체 크로마토그래피를 실시하여 트리포스페이트의 순도를 조사한다.

DNA폴리머라제 분석

카플란(Kaplan)등이 저어널 오브 바이롤로지(J. Virol)12권, 995 페이지(1973)에 발표한 방법을 약간 변형시켜 DNA폴리머라제를 분석한다. 50mM트리스-HCl(pH7.5), 40mM MgCl₂, 60mM NH₄Cl., 각각 100μM의 dATP, dCTP 및 dGTP, 0.2-0.7μM[³H]dTTP(30Ci/밀리몰), 10mM 2-메르캅토에탄올, 0.5% 노니데트(Nonidet) p-40 및 효소를 함유하는 반응 혼합물 50㎕ 중에서 분석을 실시한다. 2-메르캅토에탄올 및 노니데트 P 40과 함께 비루스 입자들을 첨가하여 반응을 개시시킨다. 37℃에서 1시간동안 배양한 후, 유리섬유 필터(GF/C 와트만)로 산 불용성 방사능 물질을 수거한다. 필터를 10mM소듐 피로포스페이트를 함유하는 냉 5% 트리클로로아세트산 및 이어서 95% 에탄올로 5회 세정한다.

건조시킨 필터의 방사능을 액체 신틸레이션 계수기내에서 측정한다.

[³²P] DNA의 아가로스 겔 전기영동

섬머즈(Summers)등이 Proc., Nat1. Acad, Sci.(미합중국)72권, 4597-4601 페이지(1975)에 기술한 바에 따라 아기로스 겔 전기영동을 실시하여 내생 DNA 폴리머라제 반응의 [³²P]DNA 생성물을 분석한다. 표지된(labeled) 뉴클레오티드로서 1μM[³²P]dCTP (500 Ci/밀리몰)와 표준 DNA폴리머라제 혼합물 15㎕ 중에서 반응을 진행시킨다. 37℃에서 2시간동안 배양한 후, 20㎕의 10mM 트리스, 10mM EDTA, 단위 ml당 0.1mg의 프로테이나제 K.0.1%(중량/부피)소듐 도데실술페이트를 가하여 반응을 종결시키고, 다시 37℃에서 60분간 배양한다. 5㎕의 5%(중량/부피)슈크로오스, 1% 브로모페놀 블루를 가하고, 혼합물 전체를 65℃에서 60분간 가열한 후, 즉시 4℃로 냉각시키고, 이어서 1% 아가로스 수평 슬랩 겔상에서 전기영동을 실시하여 분석한다. 전기영동후, 겔을 건조시키고, 자동방사선 사진술로 전개시킨다.

HBV 및 WHV DNA 폴리머라제 반응의 생성물

내생 반응중에 합성된 표지된 DNA를 분석하여 HBV 및 WHV 입자 제제내에서의 DNA폴리머라제의 특이성 및 효능을 조절한다. DNA 폴리머 라제 분석은 표지된 뉴클레오티드로서 [³²P]dCTP를 갖는 재료를 사용하여 상술한 방법으로 실시한다. 이어서 반응 생성물을 아가로스 겔 전기영동 및 자동방사선 사진술로 분석한다. 결과로서 반응개시 15,30,120 및 180분 경과후 HBV 및 WHV DNA의 점진적인 합성이 관찰 되었다. HBV에 있어서는 완전한 3.3kb길이의 DNA와, 비루스 게놈의 단일-가닥 부위가 불완전하게 충전된 것에 상응하는 보다 작은 형태의 것(1.8-2.8kb)이 수득되었다. WHV DNA 폴리머라제 반응의 생성물은 보다 불균질하고 약간 빠르게 이동하였으며, 반응개시 180분 경과후 보다 긴 형태의 WHV DNA가 3.1kb 길이었다.

HBV 및 WHV DNA 폴리머라제의 ACVTP, FIACTP 및 BVDUTP에 대한 상대적인 감수성

과량의 뉴클레오티드를 이용하여 ACVTP, FIACTP 및 BVdUTP에 대한 2가지 효소들의 상대적인 감수성을 비교한다. 각각의 억제제에 대하여 상응하는 방사 트리포스페이트의 농도를 Km치의 2-3배로 유지시키고, 잔류 뉴클레오티드는 보다 과량(50μM)으로 유지시킨다.

결과로서, FIACTP가 가장 강력한 HBV DNA 폴리머라제 억제제이고, ara-CTP가 가장 효능이 적은 억제제인 것으로 나타났으며, BVdUTP와 ara-TTP는 비슷한 수준으로 억제시켰다.

WHV DNA 폴리머라제에 있어서도 유사한 결과들이 수득되었다.

HBV 및 WHV DNA 폴리머라제 50%를 억제하는 데 필요한 트리포스페이트의 농도를 측정한 결과, FIACTP의 ID₅₀은 매우 낮았으며(0.5μM), 그와 비교하여 BVdUTP 및 ACVTP에 대하여 수득된 값들은 각각 5배 및 18배가 보다 컸다.

억제운동(kinetics)

각종 화합물들에 있어서 작용방식이 서로 상이한 것으로 공지되어 있긴 하나, HBV 및 WHV DNA 폴리머라제가 관하여는 비루스 DNA 합성에 대한 ACVTP, FIACTP 및 BVdUTP의 억제특성을 기질의 농도를 증가시키면서 억제정도를 측정함으로써 조사하였다. ACVTP에 대한 분석에 있어서, [³H]dGTP가 속도제한 기질인 반면 나머지 3가지 뉴클레오티드는 과량으로 존재한다. FIACTP에 있어서는 [³H]dCTP를 사용하고 BVdUTP억제에 있어서는 [³H]dTTP를 사용하여 동일한 조건들로 실시한다. 라인위버-버어크(Lineweaver-Burk) 도표로 부터 ACVTP, FIACTP 및 BVDUTP에 의한 HBV LNA 폴리머라제의 억제가 dGTP, dCTP 및 dTTP 각각과 경쟁적으로 일어난다는 것을 알 수 있다. WHV DNA 폴리머라제에 대하여서도 유사한 결과들이 수득되었다.

2가지 비루스들의 DNA 폴리머라제에 대한 dGTP, dCTP, dTTP의 Km치 및 ACVTP 및 BVdUTP의 ki값을 측정하였다. WHV DNA 폴리머라제가 ACVTP, FIACTP 및 BVdUTP에 대하여 HBV DNA 폴리머라제에 비하여 보다 낮은 친화도를 나타냈으나, Km/Ki비는 2가지 효소들에 있어서 서로 필적하였다.

시험관내에서의 DNA 합성에 대한 BVdUTP, FIACTP 및 ACVTP의 효능

비루스 DNA합성에 대한 3가지 동족체들의 효능을 측정하기 위하여 HBV DNA 폴리머라제를 사용하여 시간에 따른 실험을 실시하였다. 표지된 기질로서는 [³H]dATP를 사용한다. 4가지 뉴클레오시드트리포스페이트 기질 모두를 사용하여, 반응을 60분간 비례적으로 진행시킨다. 반응 혼합물로 부터 dTTP, dCTP 또는 dGTP를 제외시킬 경우, 현격히 DNA합성이 관찰되지 않았다.

dTTP를 BVdUTP로 치환시킨 경우에 있어서는 반응개시 3시간 후 대조용에 비해 비루스 DNA합성이 46%이하이었다. 상기 값은 반응개시 4시간 후 최고활성이 67%로 증가하였다. 그러나 유사한 실험에서 dTTP를 ara-TTP로 치환한 경우에는 DNA 합성이 별로 관찰되지 않았다. dCTP 대신에 FIACTP를 사용하여 상술한 실험을 행할 경우, [³H]dAMP의 배합율이 낮은 것으로 관찰(반응개시 3시간 후 대조용의 약 10%)되는 반면, dCTP 대신에 ara-CTP를 사용한 경우에 있어서는 별다른 배합이 관찰되지 않았다. dGTP를 ACVTP로 치환시킬 경우, HBV 및 WHV DNA 폴리머라제중 선택적인 기질에 대한 상기 서로 다른 동족체들의 효능에 의해 나타나는 바와같이 중합공정이 증대되지 않았다. BVdUTP가 2가지 효소들에 대하여 가장 유효한 선택적인 기질이었다. 선택적인 기질로서 BVdUTP를 사용하여 합성된 DNA를 아가로스 겔전기영동으로 분석한다. BVdUTP를 사용할 경우 HBV 또는 WHV DNA의 단일-가닥 부위가 불완전하게 충전된 것만 수득되었다.

HBV DNA 합성에 미치는 ACVTP의 효능 또한 시간에 따른 실험으로 조사하였다. 표지시킨 기질은 [³H]dTTP이고, dGTP를 사용하지 않거나 또는 dGTP 대신에 5μM ACVTP를 사용하여 반응을 개시시킨다.

이들 조건들하에서는 [³H]dTMP의 배합을 전혀 측정할 수 없었다. 반응개시 120분 경과후, 100μM의 dGTP를 가한다. dGTP만을 제외시킨 분석에서 dGTP의 첨가는 예상대로 DNA합성을 증가시켰다. 그러나 처음 dGTP디신에 5μM ACVTP를 사용하여 분석을 실시한 경우에 있어서는 100 μM dGTP 첨가후에 DNA 합성이 관찰되지 않았다.

비교목적으로, 100 μMdGTP 첨가후에 DNA 합성이 관찰되지 않았다. 비교목적으로, 동일한 비율의 ACVTP(5μM)와 dGTP(100μM)를 사용하여 반응을 개시시킨 경우에는 상당한 DNA합성이 관찰되었다. ara-ATP 및 ara-CTP를 사용하여 유사한 실험들을 수행하였으며, 2가지 경우 모두에서 반응개시 120분후 동족체 존재하에 정상기질(dATP 및 dCTP)을 가할 경우 HBV DNA합성이 증대되었다. 따라서 천연트리포스페이트 기질인 dGTP 대신에 ACVTP를 가할 경우 DNA합성이 강화되지 않고, 오히려 DNA합성 연장이 차단되는 것으로 추론되었다.

HBV 및 WHV DNA 폴리머라제에 대한 뉴클레오시드 동족체의 억제효능

항비루스 활성을 발휘하는 뉴클레오시드 동족체를 세포내에서 자체의 트리포스페이트 유도체로 전환시켜 비루스 DNA합성을 방해하도록 하여야 한다. ACVTP, BVdUTP 및 FIACTP에 의한 헤르페스 단순포진 비루스 DNA 폴리머라제의 우선적인 억제에 관하여 발표된 바 있으며, 이는 부분적으로 나마 뉴클레오시드 동족체 ACV, BVdUTP 및 FIAC의 선택적인 항비루스 활성을 설명한다.

상술한 시험관내 실험으로 부터 3가지 화합물들 모두가 HBV 및 WHV의 DNA 폴리머라제를 억제한다는 것과 상기 억제작용은 상응하는 천연 트리포스페이트 기질들과 서로 경쟁적으로 작용한다는 것을 알 수 있다.

ACVTP, BVdUTP, FIACTP 및 2가지 다른 뉴클레오티드 동족체인 ara-CTP 및 ara-TTP 각각의 억제활성들을 비교한 결과, HBV 및 WHV DNA 폴리머라제의 활성이 FIACTP, BVdUTP, ara-TTP, ACVTP, ara-CTP순으로 저하되는 것으로 나타났다.

생체내 시험

우드척에 있어서의 만성활성 간염에 대한 FMAU의 생체내 시험

화합물 FMAU는 물에 용해된다. 따라서, 상기 화합물을 투여하기 위한 용매로서 물 또는 수성용액이 바람직하다. FMAU의 용해도는 24℃에서 66mg/ml이고, 28℃에서 81mg/ml이며, 분자량은 260이다.

만성활성 간염 비루스(Hantz)를 갖고 있는 모든 우드척들에게 다음과 같은 투여량으로 FMAU를 복강내주사하여 1일 2회 FMAU를 투여한다.

결과로서, 4마리 동물 모두에게 극적인 또한 즉각적인 우드적 간염 비루스 증식의 억제가 관찰되었다. 상술한 투여량으로 투여한 후 1주일 경과하여 우드척 간염 비루스 DNA 폴리머라제가 바닥치로 떨어졌다. FMAU는 우드척 간염 비루스의 증식을 억제시켰으며, 그와 같은 억제작용은 치료중단후에도 20-50일간 지속되었다.

아시클로비르 또는 ara-AMP를 유사한 투여량으로 투여하여 또 다시 실험을 수행한 결과, 비루스 증식이 격감되었다. 그러나, 치료중단후 곧바로 치료전 수준으로 환원되었다.

다음과 같은 또 다른 피리미딘 뉴클레오시드 화합물 : FIAC(2'-플루오로-2'-데옥시-아라비노실-5-요오드시토신)및 FIAU(2'-플루오로-2'-데옥시-아라비노실-5-요오도우라실)을 사용하여 간염 비루스를 갖고 있는 우드척에 대한 시험을 수행하였다.

FMAU와 마찬가지로 물이 바람직한 담체이다. 이들 화합물들은 또한 다음과 같이 물에도 용해된다.

필요하다면, 수성용매에 산 또는 염기를 가하여 화합물 FMAU, FIAC 및 FIAU의 용해도를 증가시킬 수도 있다. 이와같은 방법으로 약 1몰 당량의 염산을 가함으로써 FIAC의 용해도를 약 250mg/ ml로 증가시킬 수도 있으나, 다소 보다 덜 농축시킨 염산을 사용하는 것이 바람직하다. FIAU에 있어서는 1당량의 수산화나트륨을 첨가함으로써 용해도를 높은 배수로 증가시킬 수 있으며, 이때 상기 FIAU는 나트륨염을 형성한다.

FEAU의 생체내시험

본 실시예에서는 2'-플루오르-치환된 아라비노실피리미딘 뉴클레오시드인 FMAU 및 FEAU의 생화학적 및 항비루스 활성을 비교 조사하였다. 생화학적 연구 결과는 FEAU가 FMAU에 비해보다 덜 독성을 지닌 선택적인 항헤르 페스 비루스 제제인 것으로 나타났다. FEAU에 대하여 아프리카 녹색 원숭이에서 발병하는 원숭이 수두 비루스 감염질환에 대한 효능을 평가한 결과, 30,10 또는 3mg/kg/일의 투여량으로 10회 정맥내 투여하였을 때 별다른 유독성을 나타냄이 없이 피진을 예방하고 비루스 혈증을 저하시키는데 커다란 효능을 나타내었다. 이들 원숭이들에게 10, 3 및 1mg/kg/일의 투여량으로 10회 경구투여하였을 때도 동일한 효과가 수득되었다.

FEAU가 헤파-DNA 비루스에 대하여 시험한 뉴클레오시드 동족체들중에서 가장 유효한 것으로 나타났으며, 본 발명에 따라 B형 간염 비루스에 대한 임상학적 효능이 입증되었다.

1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)잔기를 갖는 각종 5-치환된 피리미딘 뉴클레오시드의 합성 및 항헤르페스 비루스 활성에 관한 최초의 발표논문(1) 아래로, 구조-활성에 관한 조사결과 "상부"(아라비노)배위에 존재하는 2'-플루오로 치환기가 2'-OH, 수소 또는 기타 다른 2'-할로겐에 비해 보다 강력한 항비루스활성을 부여하는 것으로 밝혀졌다(2). 또한, 또 다른 연구로부터(3.4)전기음성을 띄는 2'-치환기에 의한 N-글리코실 결합의 안정성이 증대됨에 기인하여 2'-플루오로 뉴클레오시드가 뉴클레오시드 포스포릴라제에 의한 이화절단에 대한 저항성을 갖는 것으로 나타났다. 합성된 여러 2'-플루오로-5-치환된-아라비노실 피리미딘 뉴클레오시드(1) 중에서, 면역결손 암환자들에게 있어서 FIAC[1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-요오도시토신]이상 1(5)에서는 헤르페스 비루스 감염질환에 대하여, 및 상2(6)에서는 수두 대상포진 비루스에 대하여 임상학적 효능을 나타냈다.

상응하는 티민 동족체, 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-베틸우라실[FMAU]이 그의 유효 투여량에서 유독성을 나타냄이 없이 헤르페스 단순포진 비루스(HSV)타입 1 및 2에 의해 감연된 생쥐에게 있어서보다 강력한 것으로 나타났다.

FMAU는 또한 항백혈병 제제인 아리비노푸라노실시토신[Ara-C]에 대한 내성을 갖는 P-815 및 L-1210 백혈병 세포주에 대하여서도 시험관내 및 생체내 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 암질환을 앓는 환자에 대한 상 1의 FMAU 시험에서는 투여량-제한 독성으로 인해 약제-유도 중추신경계(CNS)기능 장해가 나타났다(7).

유도화합물로서 FMAU를 사용하여 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-에틸우라실(FEAU)을 비롯한 다른 5-알킬 치환된 2'-플로오로-아라-우라실의 합성을 실시 하였다. 이하의 표 I에 나타낸 바와같은 HSV-1 및 HSV-2 감염된 배양 베로(Vero)세포에 대하여 FMAU보다 FEAU가 약 1log 정도 덜 강력하나, 후자가 숙주세포 독성을 훨씬 더 적게 나타내므로 극히 바람직한 치료지수를 갖는다(9, 10).

[표 Ⅰ] 베로세포내에서의 플라아크 감소 분석에 있어서의 FMAU 및 FEAU의 항 HSV활성 비교

^*보정계수 0.86.

# 급속히 분열된 세포에서 측정된 세포독성 효과.

HSV-2-를 뇌내에 접종한 생쥐에게 있어서의 FMAU·FEAU 및 5-에틸-2'-데옥시우리딘(EDU)의 항비루스 활성을 비교하여 이하의 표 II에 나타내었다(10).

FEAU는 50mg/kg/일의 투여량으로 4일간 투여하였을 때 활성을 나타내었으며, 이들 생쥐의 치사율을 감소시키는데 있어서 100-200mg/kg/일의 투여량이 고도로 유효하였다.

상기 투여량 범위내에서 독성은 관찰되지 않았다. 정상적인(감염시키지 않은)생쥐에게 있어서 FEAU를 800mg/kg/일의 투여량으로 1일 2회, 4일간 투여할 경우 비독성을 나타내었다. 또한, 단지 2'-플루오로 치환기가 없다는 점에서 FEAU와 구조적으로 다른 EDU가 상기 HSV-2 생쥐 뇌염 모델에 있어서 FEAU에 비해 훨씬 덜 유효하다는 것도 주목할 만하다. 이와같은 발견은 상술한 아라비노푸라노실-피리미딘 뉴클레오 시드에 의해 발휘되는 항-HSV활성에 있어서 2'-플루오로 치환기의 중요성을 주장한 종래의 보고(1)와 일치한다.

종래(11)에는 HSV-2에 의해 유발되는 생쥐 뇌염의 치료에 있어서 FMAU가 가장 강력하고도 선택적인 항비루스 화합물로 간주되어 왔으며, 따라서 인체에 있어서의 HSV뇌염 치료목적으로 신생아 및 성인들에게 적은 투여량으로 투여할 수 있는 중요한 제제로서 생각되어 왔다고 결론지을 수 있다. FEAU에 대하여 표 I 및 II에 기술된 예비자료들은 이 화합물도 또한 유사한 효과를 갖는 가치있는 것으로서 뒷받침하고 있다(10). 이와같은 종래의 발견(10) 및 생화학적인 예비 보고(12)를 기초로 하여 FMAU 및 FEAU를 사용하여 아프리카 녹색 원숭이에게 있어서의 원숭이 수두 비루스 및 우드척 동물 모델에 있어서의 간염 비루스에 대한 상대활성을 비롯하여 생화학적 및 항비루스 활성을 비교 조사하였다.

[표 Ⅱ] HSV-2를 뇌내에 접종한 생쥐(균주 G)에게 있어서의 FEAU·FMAU 및 EDU의 항비루스 효능

^*뇌내접종하고 5시간 경과후에 투여

투여 스케줄 : 1일 2회씩 4일간 투여

^**21일째날에 계산

# 괄호내의 숫자는 1마리 동물이 치사되었다는 것을 나타낸다.

§ 첫번째 날과의 비교치

+ 1마리의 동물만이 생존하였을 때를 기준으로 함.

생화학적 비교 연구

포유류 세포의 성장에 미치는 FEAU와 FMAU의 상대효능에 관한 생화학적 연구결과(13)가 이하의 표 3에 나타내어져 있다. 베로 세포(아프리카 녹색원숭이로 부터 유래)뿐만 아니라 인체 프로골수구 백혈병 세포주(HL-60)에 대하여서도 FEAU가 FMAU에 비해 훨씬 더 작은 성장-억제 효능을 가지며, 이러한 사실은 표 I에 나타낸 시험관내 연구 결과와 좋은 비교가 된다.

마찬가지로 설치류동물 세포주(P-815, L-1210 및 쥐의 골수세포)에 대하여서도 FEAU가 FMAU에 비해 실질적으로 보다 작은 성장-억제 효능을 갖는다.

FEAU 및 FMAU에 의한 L-1210 세포의 DNA내로의 천연 전구체 배합을 억제하는 세포운동상수(Ki)를 측정하였다. 기질로서 삼중수소-표지된 천연 전구체(티미딘, 2'-데옥시우리딘 및 2'-데옥시시티딘)를 사용하여 상술한 포유류 세포들내에서의 천연 뉴클레오시드 이화작용에 있어서 FEAU가 FMAU에 비해 보다 약한 억제제인 것으로 입증되었다. 2-¹⁴C-표지된 FEAU 및 FMAU의 포유류 세포 DNA내로의 배합에 관한 연구결과는 현격하게 다른 차이점들을 나타냈다(표 IV).

L-1210 및 베로 세포주의 DNA내에서 배합된 FEAU방사능은 모두 검출되지 않았으나, FMAU의 방사능은 실제적인 양이 두가지 세포주의 DNA모두내로 배합되었다. HSV-1 감염된 베로세포를¹⁴C-표지된 FEAU 및 FAAU에 노출시킬 경우, 2가지 뉴클레오시드 모두가 상술한 비루스 감염된 세포들의 DNA내로 배합되었다. 이러한 조건들하에서, HSV-1-감염된 베로세포내로의 FMAU의 배합은 FEAU에서 관찰되는 것보다 7배가 크다.

[표 Ⅲ] 포유류 세포내에서의 FEAU 및 FMAU의 효능 비교

[표 Ⅳ] [2-¹⁴C] FEAU 또는 [2-¹⁴C] FMAU의 포유류 세포 DNA 내로의 배합

^*100μM에서 검출되지 않음

이와같은 배합 차이점은 비루스 -코오디이 DNA폴리머라제에 대한 FMAU의 보다 큰 친화도에 기인되며, 이들의 시험관 내에서의 항-헤르페스효증의 차이점 크기와 필적한다(13).

일반적으로 2'-플루오로-아라비노실피리미딘 뉴클레오시드의 선택적 인 항-헤르페스 활성이 HSV-특이성 티미딘 키나아제(TK)에 대한 좋은 기질로서 인지되는 자체의 기능을 측정하는 기준과 연관되어 있으나, 숙주 TK와는 무관하다(14, 15). 이하의 표 V에 나타내는 바와 같이, FMAU는 HSV-1 및 HSV-2유래 TKs 뿐만 아니라 HL-60인체 세포주로부터 유래한 시토졸 및 미토콘드리아 TK'S에 대하여서도 우수한 기질(상대적으로 티미딘과 비교하여)이다. 이와는 대조적으로, FEAU는 숙주 HL-60유래 TKs에 대하여 매우 불량한 기질이다(13).

이와같은 자료들은 FEAU가 베로 세포 TK에 대하여는 매우 낮은 친화도를 가지나(티미딘과 비교하여) HSV-1 및 HSV-2 코오딩 Tk's에 대하여는 높은 친화도를 갖는다는 것을 밝힌 만수리(Mansuri)등이 발표한 최근의 보고(16)와 일치한다. 이들 자료는 또한 감염되지 않은 베로세포내에서 FEAU는 티미딘 존재하에 매우 낮은 비율로 포스포릴화 된다는 것도 나타낸다.

상술한 생화학적 연구(10, 12-6)결과들은 FEAU가 자체의 항비루스활성 면에서 보다 더 선택적이며, 따라서 보다 적은 숙주 독성을 나타낸다는 것을 뒷받침한다.

생쥐를 사용한 생체내 실험(10.13)결과는 FMAU 및 FEAU 둘다가 비교적 비독성이라는 것을 나타낸다. 그러나, FMAU는 개에 있어서 강한 신경독성을 나타내고(치사량 2.5mg/kg일, 정맥내×5회), 반면에 FEAU를 50mg/kg/일의 투여량으로 개에게 10회 투여한 예비조사에서는 단지 중간정도의 독성을 나타냈다(치사량 100mg/kg/일×10).

전술한 바와같이, FMAU는 심한 암질환을 앓는 환자에게 0.8mg/kg일×5의 투여량으로 정맥내 투여할 경우 투우량에 좌우되며 CNS독성을 나타냈다.

[표 Ⅴ] 각종 티미딘 키나아제에 의한 FEAU 및 FMAU의 포스포릴화 백분율(티미딘^*에 대한 상대치)

^*티미딘 농도 400μM

원숭이에게 있어서의 원숭이 수두 비루스에 대한 비교조사

원숭이 수두 비루스(SW) 감염된 아프리카 녹색 원숭이를 대상으로 한 FEAU 및 FMAU의 활성 비교 조사를 델타 기죠날 프라이미드 리서어취 센타(Delta Regional Primate Research Center)에서 수행하였다.

이하의 표 VI에 나타낸 바와 같이, 처리하지 않은 3마리의 대조용 원숭이 들은 심한 비루스혈증을 나타내며 11일째되는 날에 죽었다.

반면에 FEAU의 투여량을 3가지로 다르게하여 투여한(정맥내)원숭이들은 30mg/kg/일×10의 보다 높은 투여량에 있어서 조차도 별다른 독성을 나타내지 않았다. 처리한 모든 원숭이들에 대한 혈액학 시험 및 혈청 화학 결과들은 정상이었으며, 3mg/kg/일의 적은 투여량으로 투여한 경우에 있어서조차도 비루스혈증은 미소한(대조군과 비교하여) 정도였다. 대조군의 원숭이들이 심각한 피진현상을 일으킨 반면, FEAU-처리한 원숭이들은 상술한 투여량 범위내에서 전혀 피진현상을 나타내지 않았다. 또 다른 연구 결과에서는 보다 낮은 투여량인 1mg/kg/일로서 피진발생을 예방할 수는 있으나 3마리중 2마리의 원숭이에게 있어서 비루스혈증을 억제시키지 못하는 것으로 나타났다. 이러한 자료는 FEAU계에서 최소 유효투여량이 약 1mg/kg/일이라는 것을 뒷받침한다.

동시에 수행한 FMAU에 관한 조사에서는 SW에 대하여 40배보다 강력한 것으로, 즉 최소 유효투여량의 약 0.04mg/kg/일×10인 것으로 나타났다.

FEAU는 또한 경구투여시에도 원숭이 수두 비루스를 치료하는데 있어서 고도로 유효하다. 10.3또는 1mg/kg/일×10의 투여량별로 경구 투여할 경우 피진을 예방하고(표 VII)비루스혈증을 현저히 저하시켰다. 1mg을 투여한 경우에 있어서 조차도 피진이 거의 완전히 예방되었으며(9일째되는 날에 2개의 소포가 생성되었으며, 곧바로 사라졌다), 또한 10mg/kg/일×10의 투여량을 경구투여하여도 독성이 관찰되지 않았다. 따라서 FEAU는 SW감염질환을 치료하는데 있어서 정맥내 및 경구투여 경로 둘다를 이용할 수 있으며, 고도로 유효하고 선택적인 항비루스 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

[표 Ⅵ] 아프리카 녹색원숭이에게서 발병하는 원숭이 수두 비루스 감염질환의 치료에 있어서의 FEAU의 효능 비루스혈증에 대한 효능

^*처리는 비루스를 접종하고 48시간 경과후부터 매일 2회씩 10일간 정맥내 주사로 투여한다.

^**비루스혈증은 감염시킨 후(P.I.)지시된 날에 헤파린화한 혈액 3ml로 부터 수거한 임파구를 배양하여 측정하였다. 평균 PFU는 각각의 임파구 현탁액을 접종한 베로 세포 공동-배양물 2플라스크내에 존재하는 플라아크의 평균수를 나타낸다.

[표 Ⅶ] 아프리카 녹색원숭이에게서 발병하는 원숭이 수두 비루스 감염질환의 치료에 있어서의 FEAU의 경구투여효능

피진# 에 대한 효능

^*처리는 비루스를 접종하고 48시간 경과후부터 매일 2회씩 10일간 정맥내 주사로 투여한다.

# 피진 심각성은 4+까지 ±로 등급을 매겼다. ±피진은 여러개의 소포가 관찰될 때이며, 4+피진은 체표면 전체에 걸쳐 피진이 넓게 형성되었음을 나타낸다.

(a) 소포 대상포진 비루스(VZV, 인체 헤르페스 비루스군의 일종)에 대한 FIAC 및 FMAU의 시험관내 활성(15,17), (b) 면역결손된 환자에 대한 상2 시험에서 나타난 소포 대상포진 비루스 치료에 있어서의 FIAC의 효능(6) 및 (c) 본 명세서 및 기타 다른 문헌들에 발표된 원숭이 소포 비루스에 대한 FMAU 및 FEAU의 시험관내활성(18)을 고려할 때, 인체에서 발병하는 VZV에 대하여서도 FEAU가 중요한 선택적인 활성을 발휘할 것으로 예상된다.

실시예 2

우드척에 있어서의 항간염 비루스에 대한 비교연구

본 실시예에서는 만성 감염질환을 앓는 우드척(인체에 있어서의 중요한항-B형 간염 비루스 제제 평가용으로 선택되는 동물모델)에 있어서의 우드척 간염 비루스(WHV)에 대한 FEAU 및 FMAU의 효능을 조사 한다. FEAU는 시험한 모든 동물들에게 있어서 2 및 0.2mg/kg/일×10으로 투여 처리함으로써 WHV 증식을 억제하였다. 상기 억제효능은 즉각적이고, 비-독성을 나타냈으며, 장기간 지속되었다.

예비 연구결과는 FEAU가 경구투여시에도 또한 유효하다는 것을 나타낸다. FMAU도 또한 2 및 0.2mg/kg/일×5의 투여량에서 WHV증식에 대하여 즉각적인 억제효능을 나타냈으나, 상기 투여량 범위에서 FMAU는 허용할 수 없는 독성이 관찰되었다.

헤파-DNA비루스의 일종인 B형 간염 비루스(HBV)는 인체에 있어서 급, 만성 간염질환을 유발하며 약 20억 인구가 상기 비루스의 보균자인 것으로 추정되고 있다. HBV는 간세포 암을 유발하는 가장 주된 요인이다(19). 헤파-DNA 비루스는 우드척(마르모타 모낙스 : Marmota Monax)과 같은 다른 동물들에서도 또한 발견된다.

우드척 간염 비루스(WHV)와 HBV간에 관찰되는, 핵산 상동성(20)을 비롯하여 밀접한 구조적 및 임상병리학적 유사성들로 부터 우드척이 지속성 간염비루스 감염질환, 뿐만 아니라 간암(21)으로 진전되는 이들의 상호관계를 연구하는데 있어서 유용한 모델로 제안되고 있다.

HBV와 마찬가지로, 우드척 간염 비루스도 자체의 증식 및 복제면에 있어서 매우 유사한 DNA폴리머라제를 갖는다. 따라서, 강력한 항-HBV제제는 만성-보균 우드척 및 B형 간염 표면항원에 대하여 양성을 나타내는 면역결손된 환자로 부터 제조된 혈청으로 부터 수득한 내생 WHV 또는 HBV DNA 폴리머라제에 대한 억제활성으로 평가된다.

이와같은 연구는 상술한 내생 비루스 DNA폴리머라제에 대한 특정한 뉴클레오시드 트리포스페이트의 억제효능을 측정하기 위한 목적으로 프랑스 리용에 소재하는 간염 비루스 유니트(INSERE)에서 수행되었다.

일련의 분석(22,23)에서 각종 뉴클레오시드 트리포스 페이트에 대한 HBV 및 WHV의 상대적인 감수성을 측정하였다.(표 VIII).

조사한 6개의 뉴클레오시드 트리포스페이트 중에서 FMAU가 HBV 및 WHV DNA 폴리머라제 둘다에 대하여 가장 효능이 큰 억제제로 나타났으며, 그 다음은 FIAC로서 근소한 차이를 나타냈다. 또한 HBV 또는 WHV DNA폴리머라제에 대한 6개 트리포스페이트 각각의 효력(ID₅₀)이 서로 동일하지는 않으나 유사하였다. 보다 중요한 것은, 상술한 비루스 폴리머라제의 억제제로서의 효력순서가 동일하다는 것이었다.

이와같은 결과들은 HBV와 WHV간의 명백한 유사성을 뒷받침하여, 아울러 유효한 항-B형 간염 비루스 제제(23)로서의 생체내 효능 평가 목적으로 선택되는 동물 모델로서의 우드척의 가치를 입증한다.

또한, 천연적으로 우드척 간염 비루스에 감염되어 만성질환을 앓는 우드척(24)을 이용한 동물 모델에 있어서의 FMAU 및 FEAU의 효능 평가시험도 실시하였다. 상술한 뉴클레오시드들은 동물체내에서 뉴클레오시드 트리포스페이트로 이화될 것으로 추정되었다. 도트-블롯(dot-blot) 하이브리드화 분석방법에 의한 WHV DNA 검출 및 내생 DNA 폴리머라제 활성을 이용하여 WHV증식을 측정하였다.

비처리한 우드척에게 있어서의 비루스 DNA폴리머라제 활성이 제 1 도에 도시되어 있다. 이때, FMAU 및 FEAU의 투여량을 3가지로 다르게 하여 조사하였다.

[표 Ⅷ] 인체 간염 비루스(HBV)와 우드척 간염 비루스(WHV)의 DNA 폴리머라제에 대한 뉴클레오시드 트리포스페이트 동족체들의 억제활성 비교

^*ID₅₀=DNA 폴리머라제의 활성을 50% 억제시키는 억제제의 농도.

2mg/kg/일×5로 투여한 FMAU(0일째부터 시작하여 복강내투여)는 WHV DNA폴리머라제의 활성을 완전히 억제시키는 것으로 나타난 바와같이 (제 2 도) WHV 증식을 현저히 억제하였다. 그러나 상기 투여량에서 때로는 치사에 까지 이르는 심각한 CNS독성이 관찰되었다.

FEAU를 2mg/kg/일×10의 투여량으로 복강내 투여한 경우에서도 또한 거의 즉각적인 WHV증식 억제가 나타났으며, 독성작용은 일으키지 않았다. 0.2mg/kg/일로 투여할 경우, FMAU(5회 투여시) 및 FEAU(10회 투여시)는 비루스 증식을 억제하는데 있어서 동일한 효과를 나타냈다(제 3 도).

상기 투여량에서 FMAU는 보다 덜 심각하고 지연된 독성을 나타낸 반면, FEAU는 또 다시 비독성을 나타냈다. 0.04mg/kg/일×10의 투여량으로 투여한 경우에 있어서조차도 FEAU는 여전히 다소 저하된 항-WHV효능을 나타내었다. 1마리의 우드척에게 FEAU를 0.2mg/kg/일×10의 투여량으로 경구투여하여 조사한 예비시험에서도 WHV증식이 현저히 억제되었으며, 독성은 전혀 관찰되지 않았다(제 4 도).

약제투여를 중단한 후, 0.2 또는 2mg의 투여량으로 투여한 FEAU의 억제활성은 6주에 걸쳐 상당히 유효하게 지속되었으며 그 기간동안 서서히 처리전 수준으로 환원되었다.

WHV증식에 대한 FEAU의 억제활성은 거의 즉각적이며, 6-데옥시-아시클로비르, DHPG 또는 아라-AMP와 같은 다른 항비루스 제제에 비해 현저히 보다 더 오래 지속되었다.

상술한 후자의 약제들은 WHV DNA 폴리머라제를 감소시켰으나 약제투여 중단후 곧바로 처리전 수진으로 환원되었다.

FMAU 및 FIAC에 대한 종래에 수득된 결과들(치사독성이 입증된 바 있음)과는 대조적으로, FEAU 처리후에는 단지 약 10 중량%의 감소만이 관찰되었다(24).

상술한 적은 투여량으로 우드척 간염비루스의 증식을 억제하는 것으로 관찰된 FEAU의 효능은 상당히 놀라운 발견이다. 헤르페스 단순포진 비루스에 대한 시험관내조사(9, 10), 생쥐에게 있어서의 헤르페스 뇌염 모델에 대한 생체내조사(10), 및 본 명세서내에 발표한 아프리카 녹색원숭이에 있어서의 원숭이 수두 비루스 조사를 근거로 하여 FEAU가 FMAU보다 훨씬 덜 강력한 것으로 예상된다.

이와같은 자료는 FEAU가 B형 간염 비루스에 대하여 임상적으로 유효한 제제하는 것을 뒷받침한다.

FEAU의 유효성 및 선택성으로 부터 FEAU가 지금까지 시험한 뉴클레오시드 동족체들중에서 가장 우수한 것으로 밝혀졌다.

실시예 3

실시예 2의 방법에 따라 FEAU를 우드척에게 위장 튜브를 거쳐서 각기 다른 투여량으로 경구투여하여 WHV증식 억제활성을 다시 조사하였다. 서로 다른 초기 WHV증식율을 갖는 2개군의 우드척에 대하여 시험을 실시하였다.

A. 높은 증식율군

WHV 증식율이 높은 7마리의 우드척을 실험대상으로 한다. 상술한 증식율이 높다는 것은 단위 분당 DNA 폴리머라제의 활성이 1000을 능가하며, 증식율이 1600이라는 것으로 정의된다.

7개 우드척들중 2마리는 대조군으로 하였으며, 이들은 다소 차이가 있긴 하나 실험개시후 60일간 동일한 WHV증식율을 나타냈다.

나머지 5마리의 우드척에게는 0.2 mg FEAU/kg/일의 투여량으로 경구투여 하였다. 23일째되는 날에 상기 우드척들 모두에게 있어서 증식율이 저하되었다. 그러나 5마리중 4마리는 여전히 단위분당 DNA 폴리머라제 활성이 50이상으로, 정상치를 능가하였다. 따라서, 24일째되는 날에 상기 4마리는 투여량을 1mg FEAU/kg/일로 증가시키고, 나머지 1마리는 0.2mg/FEAU/kg/일로 유지시켰다.

60일이 되기까지 5마리 모두에게서 독성 부작용이 나타남이 없이 증식이 완전히 억제되었다.

B. 낮은 증식율군

WHV증식율이 낮은 7마리 우드척을 실험대상으로 한다. 상술한 증식율이 낮다는 것은 단위분당 폴리머라제 활성이 1000보다 낮으며, 평균증식율이 600-800이라는 것으로 정의된다. 상기 우드척들중 2마리는 대조군으로 하였으며, 이들은 다소 차이가 있긴 하나 실험하는 60일간 동일한 WHV증식율을 나타내었다.

나머지 5마리 우드척에게는 0.04mg FEAU/kg/일로 경구 투여하였다.

23일되는 날까지 이들 우드척 모두에게 있어서 증식율이 저하되었다. 그러나, 5마리중 2마리는 여전히 정상치 보다도 높았다.

따라서, 24일째되는 날에 상기 2마리에게는 투여량을 0.2mg FEAU/kg/일로 증가시키고, 반면에 나머지 3마리의 투여량은 0.04mg FEAU/kg/일로 유지시켰다. 60일되는 날까지, 5마리 우드척 모두에게 있어서 독성 부작용이 나타남이 없이 증식이 완전히 억제되었다.

참고 자료

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1984년 9월 일본국 오이소에서 개최된 헤르페스비루스 및 비루스 화학요법에 대한 약리학적 및 임상학적 연구에 관한 국제 심포지움 회의록에 기초함.

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Claims (7)

1. 치료대상 체내에서 간염비루스의 증식을 억제하는데 유효한 양의 하기 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염과 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 치료대상에게 있어서의 간염비루스 감염질환 치료용 조성물.

   
2. 제 1 항에 있어서, 간염비루스가 A형 간염비루스인 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 간염비루스가 B형 간염비루스인 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 간염비루스가 비-A형, 비-B형 간염비루스인 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 화합물의 유효한 양이 1일 치료대상의 체중 1kg당 0.01mg-100.0mg인 조성물
6. 제 5 항에 있어서, 상기 화합물의 유효한 양이 1일 치료 대상의 체중 1kg당 0.04mg 이상인 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 화합물의 유효한 양이 1일 치료 대상의 체중 1kg당 0.04mg-50.0mg인 조성물.

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