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KR960013600B1 - 면역분석법에 이용되는 시스테인 티올-보호 펩티드 - Google Patents

면역분석법에 이용되는 시스테인 티올-보호 펩티드 Download PDF

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KR960013600B1
KR960013600B1 KR1019910701744A KR910701744A KR960013600B1 KR 960013600 B1 KR960013600 B1 KR 960013600B1 KR 1019910701744 A KR1019910701744 A KR 1019910701744A KR 910701744 A KR910701744 A KR 910701744A KR 960013600 B1 KR960013600 B1 KR 960013600B1
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hiv
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htlv
peptides
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블레이크 제임스
코울 캐롤-앤
코울맨 패트릭
몬지 노부오
피. 몬타나 존
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제네틱 시스팀스 코포레이션
마크 시엑즈카락
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Abstract

내용 없음.

Description

면역분석법에 이용되는 시스테인 티올-보호 펩티드
본 발명은 면역분석법에 이용되는, 에피토프를 모방하는 펩티드 조성물, 더욱 구체적으로는, 에피토프 제시가 향상되고, 천연 단백질에 반응하여 생산되는 항체와의 특이적 면역반응성이 향상된, 개선된 펩티드 조성물에 관한 것이다.
현재, 인체 면역결핍 바이러스(HIV : Human Immunodeficiency Virus)와 반응하는 항체의 보유 여부는 통상적인 샌드위치 ELISA 포맷의 면역분석법으로 결정한다. 이 분석은 HIV 항체를 함유하는 것으로 여겨지는 혈액이나 혈청과 고정화 바이러스 용균물(lysates)을 접촉시키는 것으로 된다. 현존하는 상용 테스트는 혈액 제품을 통한 HIV 전파를 크게 감소시킨 것으로 보여지지만, 바이러스 용균물에 기초한 테스트는 몇가지 심각한 결점을 갖는다. 이들 결점이란, 살아있는 감염성 바이러스를 대량으로 배양 및 조작해야 한다는 점 ; 살아있는 바이러스가 테스트 물질에 혼입될 가능성이 있다는 점 ; 결과되는 용균물의 다양한 특성 ; 및 거짓 양성 및 거짓 음성 결과가 실질적인 숫자로 존재함으로 인해 웨스턴 블롯과 같은 부가적인 조합 테스트가 요구된다는 점등이며 물론 이들로 국한되는 것은 아니다.
본문에 참고 삽입된 Cosand의 공동소유 미국특허 4,629,783호에는, 면역적으로 반응성인 바이러스 단백질 에피토프를 모방하는 몇가지 합성 펩티드가 개시되어 있다. 이들중, gp 41의 아미노산 26개의 배열로 이루어진, 펩티드 39라 표시되는 펩티드는 시험된 공지의 모든 HIV-1양성 혈청과는 반응성이며 시험된 음성 샘플과는 반응하지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 몇몇 연구단체는 Cosand에 의해 유력한 항원결정기를 함유하는 것으로 규정된 펩티드 39영역의 중요성을 인식하게 되었다. 참조 Wang, J.J.G.외, Proc. Natl. Acad. Sci. 83 : 6159(1986), Shoeman, R.L.외, Analyt. Biochem. 161 : 370(1987), Gnann, J.W.외, J. Virol. 61 : 2639(1987), 및 Gnann, J.W.외, J. Infect. Dis. 156 : 261(1987).
합성 펩티드는 바이러스 용균물보다 탁월한 장점을 제공한다. 이러한 장점이란, 특이성, 순도, 제조의 용이성등을 말하여 이들로 한정되는 것은 아니다. 잠재적인 단점으로는 모든 바이러스 주(strain)를 검색하기 위해서는 펩티드를 한가지 이상 사용할 필요가 있다는 것 ; 및 펩티드가 본래 크기가 작고, 고체상에 고정될 경우 면역반응성의 상실이 우려된다는 점등이다.
면역학적 분석에서 고정 항원으로서 사용되는 작은 펩티드는 일반적으로 고상법(solid phase method), 즉 펩티드를 구성하는 각각의 아미노산을 보호된 형태로 순서대로 첨가하면서, 늘어나는 펩티드 사슬을 불용성 수지 지지체상에 고정시키는 방법으로 합성한다. 합성공정이 진행되는 동안, 늘어나는 사슬을 구성하는 특정 아미노산들의 측쇄는 완성된 펩티드가 불용성 수지 지지체로부터 제거될 때까지 남아있게 되는 여러 가지 화학 반응기에 의해, 대개 진한 불화수소산이나 트리플루오로초산과의 반응에 의해 보호, 블록된다. 분해시 대다수의 보호기가 제거되며, 완성된 펩티드는 기술분양에 잘 알려진 여러 방법으로 정제시킨다.
다음, 직접 콘쥬게이션, 가용성의 비면역 반응성 단백질이나 기타 불활성 분자에의 콘쥬게이션 또는 고상에의 직접 흡착등과 같은 여러방법에 의해 조(粗) 또는 정제 펩티드를 고상에 고정시킨다. 미국특허 4,629,783호에는 이러한 방법의 예가 여러 가지 기재되어 있다.
레트로바이러스 역할면에 있어서 HIV-1의 gp 41에 필적할만한 것으로 믿어지는 당단백질인 HIV-2의 gp 36 단백질로부터의 에피토프를 모방하는 펩티드들이 1987. 3. 25자 및 1987. 4. 7.자의 공동 소유 미국특허 출원(각각 030,403호 및 035,408호)에 개시되어 있으며, 이를 본 출원에 참고 삽입하였다. 이들중, HIV-1의 펩티드 39의 영역과 유사한 영역에 암호화된 26개의 아미노산으로 구성된, 41-2-1이라 표시되는 한 펩티드는 시험된 모든 공지의 HIV-2 양성 혈청과는 반응성이고, 시험된 음성 샘플과는 적절한 컷-오프 수준 이상으로 반응하지 않는 것으로 밝혀졌다. 펩티드 41-2-1의 단축 버전인 41-2-3, 즉, 펩티드 41-2-1의 카르복실 말단으로부터의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 역시 HIV-2 혈청과 반응성이었으며 어떤 경우에는 펩티드 41-2-1보다 그 기능이 더 우수한 것으로 밝혀졌다.
펩티드 39, 41-2-1 및 41-2-3 각각은 그들의 아미노산 배열내에 2개의 시스테인 잔기를 갖는다. 펩티드 배열내의 시스테인 잔기의 존재로 인해 정제, 고정화, 및 탈보호 펩티드의 장기간 보존시 분자내 및 분자간 디술파이드 결합 형성이 가능하게 된다. 따라서, 이러한 펩티드 조성물은 대개 모노머, 다이머 및 여러 크기의 폴리머를 포함하여, 다양한 산화적 형태의 혼합물로서 고상에 고정된다. 일반적으로 고상에 고정된 펩티드의 산화적 형태를 조절하기 위한 예방책은 취해지지 않는다. Rosen, J.I.등은(WO 87/06005) Cosand에 의해 동정된(상기 문헌 참조), 시스테인 잔기를 하나이상 함유하는, HIV-1의 고항원성 영역으로부터 유도된 어떤 펩티드들이 다양한 산화형태의 혼합물로서 고정되었음을 인식하고 펩티드의 산화형태, 특히 폴리머가 어떤 펩티드의 반응성에 중요한 영향력을 행사한다고 시사하였다. Rosen등은 몇가지 경우에서 어떤 펩티드의 시클릭 형태가 폴리머 형태보다 고체표면에 결합하는데 덜 효율적임을 개시하고 있다. 펩티드의 여러 가지 산화 형태는 민감한 면역분석에 있어서의 다양성의 근원일 수 있으며 이는 또한 이러한 분석에 기초한 결과에 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 본 기술분야에 있어서 개선된 반응성을 가지며, 가능한한 거짓양성 및 거짓음성 결과를 내지않게 하는 펩티드 조성물이 절실히 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 목적 및 기타 요구성을 만족한다.
본 발명에 따라 HIV 바이러스에 대한 항체 또는 HIV 바이러스의 검색에 유용한 개선된 펩티드 조성물이 제공된다. 면역분석법에 있어서 항원으로서 고상에 고정하기 전후에 상기 조성물을 구성하는 펩티드의 산화형태의 통제를 가능케하는 개선된 펩티드 조성물의 제조방법 역시 제공된다. 산화 형태의 통제로 인해, 특이성 및 감도에 의해 측정되는 바와 같이 개선된 면역 반응성을 갖는 펩티드 조성물을 제공케 한다. 통상적으로 사용되는 시스테인 티올기의 S-벤질 보호대신 높은 산성분해 조건내 내성인 화학적 가역 보호수단을 이용한 것을 제외하고는 포준 고상 펩티드 합성법을 이용하여 펩티드를 합성한다. 화학적 가역 보호수단에는 예컨대 에틸카르바모일, 아세트아미도메틸, 3-니트로-2-피리딘술피닐, 디페닐-4-피리딜-메틸, 등이 포함된다.
아미노산 배열의 조립 후 시스테인 티올기의 가역보호가 제공되는 경우에는 대안적인 구체예가 존재한다. 보호전에 디술파이드 결합이 전혀 남아있지 않도록 하기 위해 펩티드의 보호에 앞서 펩티드 조성물을 환원시키는 것이 필요하다. 또한, 고정화 전에 시스테인 티올 보호를 제거할 수 있으며 이 경우 펩티드의 탈보호 및 산화는 산화 펩티드 조성물을 고상에 고정화 하기 전에 용액에서 수행한다. 산화조건은 분자내(intramolecular) 디술파이드 결합이 생성에 적절한, 즉, 매우 묽고 중성 내지 약알카리성 조건이 되도록 선택한다.
본 발명의 특정 구체예에서 펩티드들은 대기 다음의 아미노산 배열로 구성된다 :
상기중, X는 OH 또는 NH2, Y는 펩티드의 반응성을 증진하기 위해 첨가되는 부가적인 아미노산이며 Cys*는 화학적 가역수단에 의해 보호된 티올기를 포함한 시스테인 잔기이다. 특히 바람직한 구체예는 Y가 Cys-Gly-Gly 배열인 경우이다.
용액 또는 고상에 고정된 펩티드 조성물이 다양한 면역분석 프로토콜에 이용될 수 있다. 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 플루오로카본 폴리머, 셀룰로스 및 실리카의 라텍스(미립자)를 포함하여 여러 가지 고상이 이용될 수 있다. 고상, 예컨대 실리카, 셀룰로스, 플루오로카본 폴리머, 나일론, 폴리아크릴아미드 및 폴리스티렌과 같은 고상 역시 이용가능하다. 고상에의 고정화는 흡착 또는 공유 결합에 의할 수 있다.
체액중의 HIV 바이러스의 항원이나 HIV 바이러스에 대한 항체의 존재여부를 결정하는데 있어서 본 발명에서 개시되는 한가지 면역분석 프로토콜은, 대체로 (a) 고정화 허용조건하에서 다음의 아미노산 배열을 갖는 펩티드를 하나 이상 함유하는 조성물을 고상과 접촉시키고;
(상기중 X는 OH 또는 NH2, Y는 펩티드의 반응성을 증진시키기 위해 첨가되는 부가적인 아미노산이며 Cys*는 화학적 가역수단에 의해 보호된 티올기를 갖는 시스테인 잔기이다); (b) 고정된 펩티드의 시스테인 티올기로부터 화학적 가역 보호수단을 제거한 다음 ; (c) 디술파이드 결합이 형성되기에 알맞은 조건하에서 고정 펩티드를 인큐베이트시키고 ; (d) 면역특이적 결합이 일어날 수 있는 조건하에서 체액과 고정 펩티드를 접촉시켜 반응 혼합물을 만든다음; (e) 고정 펩티드와 체액의 항체성분 사이에 면역특이적 결합이 일어났는지를 검색(여기서 면역특이적 결합의 검출은 체액중 HIV 바이러스에 대한 항체가 존재함을 지칭한다)하는 단계로 이루어진다.
제2의 면역분석 포맷은 (a) 시스테인 티올기의 화학적 가역보호 수단을 제거하고 ; (b) 분자내 디술파이드 결합 형성에 알맞은 조건하에서 탈보호된 펩티드를 인큐베이트시켜 펩티드 조성물을 생성하고 ; (c) 고상에 펩티드 조성물을 고정시킨다음 ; (d) 면역특이적 결합을 허용하는 조건하에서 체액과 고정화 펩티드 조성물을 접촉시켜 ; (e) 고정 펩티드와 체액의 항체성분 사이에 면역특이적 결합이 일어났는지를 검색(여기서 면역특이적 결합의 검출은 체액중 HIV 바이러스에 대한 항체가 존재함을 지칭한다)하는 단계로 이루어진다.
면역특이적 결합은 면역반응 혼합물중에 생성된 반응 생성물로부터 비결합 성분을 제거하고, 검색가능한 시그날을 제공하는 표지가 붙은, 반응 생성물의 성분에 면역특이적으로 결합할 수 있는 표지된 항체를 면역반응 혼합물에 첨가함으로써 검색할 수 있다. 비결합 성분은 여과에 의해 반응 혼합물로부터 제거할 수 있다.
본 발명의 기타 측면은 다음의 상세한 설명과 첨부된 청구범위를 참고로 더욱 명확해질 것이다.
본 발명은 항체 또는 항원의 정량 및/또는 검색을 위한 면역분석법에 이용하기 위한 개선된 펩티드 조성물에 관한 것이다. 어떠한 구체예에서, 이 펩티드들은 바이러스 항원이나 그에 대한 항체, 더욱 구체적으로는, 레트로바이러스, 예컨대 HIV-1와 HIV-2 및 렌티바이러스의 관련집단과 관계된 항원 또는 항체를 검색하는데 이용된다. 본 발명에 따라 제조되는 기타 예시적인 펩티드들은 HTLV-I 및 HTLV-II의 에피토프 영역을 모방한다.
외래 숙주에 도입된 단백질에 의해 유도된 항체와 결합가능한 펩티드들이 동정될 수 있다. 몇가지 경우에 있어서 Cys 잔기는 항체를 인식하고 이에 결합하는 펩티드 에피토프(들)의 일부분을 구성한다. 이들 펩티드 합성이 Cys 잔기를 보호하면 펩티드의 산화형태발달이 방해받으며, 민감성 및/또는 특이성 증가에 의해 측정되는 바와 같이, 펩티드의 면역학적 반응성이 증대된다.
본 발명의 펩티드 조성물은 그의 배열내에, 예컨대 산화와 같은 반응으로부터 가역적으로 보호될 수 있도록 화학적으로 변형된 시스테인 잔기를 갖는다. 따라서 본 발명에서 유용한 펩티드는 천연 단백질에 의해 야기되는 항체에 결합가능한 펩티드의 구조에 기여하는 Cys 잔기를 일반적으로 2개이상 갖는다. 대체로 Cys 잔기가 2개 이상이면 분자내 디술파이드 결합을 형성할 수 있다. 분자내 결합을 형성하기 위해서는 Cys 잔기들이 적어도 1 아미노산 잔기이상, 보통 2개이상, 더욱 일반적으로는 약 3개 내지 약 15개 이하의 잔기만큼 떨어져 있는다. 어떠한 바람직한 구체예에서는 Cys 잔기들이 약 5개 내지 8개 잔기마큼 서로 떨어져 있다. 사슬내(intra-chain) 디술파이드 결합 형성에 의해 인접(vicinal) Cys 잔기는 루프, 또는 고리형 펩티드를 제공하며 이는 면역반응성 증진에 중요한 것일 수 있다.
본 발명의 펩티드는 여러 가지 방법으로 제조될 수 있다. 본 펩티드들은 대개 약 6 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 더욱 일반적으로는 약 6 내지 약 35개의 아미노산 잔기로 구성된다. 이들의 길이가 비교적 짧기 때문에 이들은 통상적인 기술에 따라 용액내 또는 고체 지지체상에서 합성될 수 있다. 예컨대, Stewart 및 Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 제2판, Pierce Chemical Company, 1984; 및 Tam외, 1983, J.Am. Chem. Soc. 105 : 6422 참조. 이들은 본문에 참고 삽입되었다.
다른 한편, 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주세포내에 소망되는 펩티드를 발현시키는데 하이브리드 DNA 기술을 사용할 수 있다. 예컨대, Maniatis등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. 1982, 참조. 물론, 펩티드라 함은 적어도 약 6개의 아미노산, 대개는 10개 이상, 200개 이상의 아미노산, 전체 단백질을 포함하는 배열을 의미하는 것으로 한다. 다음 발현된 펩티드를 분리하여 기술된 바와 같이 보호할 수 있다.
본 발명의 펩티드의 시스테인 티올 측쇄의 가역적 화학보호는 펩티드 조성물의 화학적 합성에 의해 펩티드 배열의 조립중에 수행할 수 있다. 본 발명의 펩티드 조성물을 표준 고상기술에 의해 배치하는 경우, 수지 고상으로부터 펩티드를 분해하는데 사용되는 산의 높은 농도 및 아미노산 첨가 사이클중 사용되는 조건에 대한 내성에 대해 화학적 가역 보호수단이 선택된다. 입수가능한 몇가지 티올-보호기중, 특정 합성에 대한 선택은 합성되는 펩티드의 구조와 합성되는 기타 보호 또는 블로킹기의 특성 및 수지로부터 펩티드를 분리하는데 선택되는 특정 시약에 따라 의존할 것이다. 본 발명에 사용되는데 적합한 보호수단은 예컨대, 아세트아미도메틸(Stewart 및 Young, 상기 문헌), 3-니트로-2-피리딘술피닐(Matsueda외, 1986, Int. J. Peptide Res. 28 : 167, Ridge, R.J.등 1986. Int. J. Peptide Res. 19 : 490), 및 디페닐-4-피리딜메틸(Coyle, S.외, 1976, J. Chem. Soc. Chem. Comm. pg. 980) 참조. 특히 바람직한 보호수단은 S-(N-에틸 카르바모일)이다. 예컨대 St. Gutmann(Helv. Chim Acta.(1966) 49 : 83) 및 Storey H.T.등(J. Amer. Chem. Soc.(1976) 94 : 6170) 참조. 전술한 각 문헌들은 본문에 참고삽입되었다.
다른 한편, 시스테인 티올기들은 아미노산 배열의 조립후에 가역적으로 보호될 수도 있다. 이 구체예에서, 정제되거나 또는 고리형 또는 폴리머형으로 보강된 펩티드들, 디술파이드 결합이 행여라도 남아있지 않도록 하기 위해 펩티드의 보호에 앞서 환원시킨다.
티올-보호된 펩티드는 면역분석에 사용하기 위해 탈보호시킨다. 이 펩티드는 용액중에서, 담체에 결합되거나 또는 유리형태로, 혹은 고상에 흡착시켜 사용할 수 있다. 펩티드를 고상에 부착시키려 하는 경우, 시스테인 티올보호기는 고정화전에 제거가능하며, 여기서 펩티드의 탈보호 및 산화는 용액에서 행한다. 탈보호수단은 대부분 사용된 특정 보호기에 상응하게 되며 기술분야에 잘 알려져 있다. 다른 한편, 탈보호 및 산화는 고정화중 또는 후에 수행할 수 있다. 산화조건은 분자내 디술파이드 결합형성에 알맞도록, 즉, 매우 묽고 중성 내지 약알칼리 조건으로 선택한다.
HIV, 특히 HIV-1에 대한 항체의 검색 및/또는 정량에 있어서, HIV-1 당단백질, gp 41을 모방할 수 있다. 예시적인 펩티드는, 다음의 펩티드 배열을 포함하며, 여기서, 적어도 약 7개 이상 및 50개 미만의 아미노산의 올리고펩티드는 다음 배열에 포함될 것이다 :
상기중 X는 OH 또는 NH2, Y는 펩티드의 반응성을 증진시키기 위해 첨가되는 임의로 존재하는 아미노산이며 Cys*는 화학적 가역수단에 의해 보호된 티올기를 갖는 시스테인 잔기이다.
HIV-2에 대한 항체의 검색 및/또는 정량에 있어서, HIV-2 당단백질인 gp 36을 모방할 수 있는 예시적인 펩티드에는 다음의 펩티드 배열이 포함하며, 여기서 적어도 약 7개 이상 및 50개 미만의 아미노산의 올리고펩티드가 다음 배열에 포함될 것이다 :
상기중 X는 OH 또는 NH2, Y는 펩티드의 반응성을 증진시키기 위해 첨가되는 임의로 존재하는 아미노산이며 Cys*는 화학적 가역수단에 의해 보호된 티올기를 갖는 시스테인 잔기이다.
HTLV-I 및 HTLV-II에 대한 항체의 검색 및/또는 정량에 있어서, HTLV-I 및 -II 트랜스멤브레인 당단백질(두자기 모두 gp 21로 표시됨)을 모방할 수 있는 예시적인 펩티드에는 다음의 펩티드 배열이 포함하며, 여기서 적어도 약 7개 이상 및 50 미만의 아미노산의 올리고펩티드가 다음 배열에 포함될 것이다 :
상기중 X는 OH 또는 NH2, Y는 펩티드의 반응성을 증진시키기 위해 첨가되는 임의로 존재하는 아미노산이며 Cys*는 화학적 가역수단에 의해 보호된 티올기를 갖는 시스테인 잔기이다.
본 발명의 펩티드 조성물은 그것이 에피토프를 모방할 수 있고 따라서, 예컨대 HIV-1의 적어도 한 스트레인 이상의 gp 41 당단백질과 같은 천연 단백질이나 HIV-2의 적어도 한 스트레인 이상의 천연 gp 36 당단백질과 어느 정도까지 면역학적으로 경쟁하는 것이며, HIV 폴리펩티드 배열과 같은 특정한 단백질 또는 레트로바이러스 배열과 동일할 필요는 없다.
예컨대, 대개 20넘버% 미만, 보다 흔히는 10넘버% 미만의 아미노산이 교환되는 보존적 또는 반보존적 치환을 이용함으로써 관심있는 펩티드를 변형시킬 수 있다. 예컨대 상이한 레트로바이러스 균주와 같은 천연 단백질의 다른 에피토프를 보다 효과적으로 모방하기 위해 하나이상의 특정 아미노산을 바꾸는 것이 요망될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 폴리펩티드를 삽입, 결실 및 보전적 또는 반보존적 치환과 같이 여러 가지로 변환-이러한 변화가 그들의 용도에 어떠한 유리점을 제공하는 것이면-시킬 수 있다. 보전적 치환이라함은 giy, ala; val, ile,leu ; asp, glu ; asn, gln ; ser, thr ; lys, arg ; 및 phe, try과 같은 조합을 의미하는 것으로 한다. 대개, 이 배열은 본 펩티드가 예컨대 편리하게 고정될 수 있도록 “아암(arm)”을 제공하기 위해 어느쪽 말단에 부가적인 아미노산을 첨가하는 경우를 제외하고는 HIV 상의 적어도 한 스트레인의 배열과 20% 이상 다르지는 않을 것이다.
또한, 이 펩티드 배열은 예컨대 암모니아, 메틸아민등 말단 카르복시 아미드화, 티오글리콜산 아미드화 또는 아세틸화와 같은 아실화에 의한 말단 NH2의 변형에 있어 본래의 배열과 다를 수 있다. 몇가지 경우에 있어서, 이 변형들은 지지체나 다른 분자에의 연결부위를 제공할 수 있다.
상술한 바와 같이, 아미노산 아암은 펩티드 또는 올리고펩티드의 C- 및/또는 N-말단에 제공될 수 있다. 존재하는 경우, 아암은 대개 1개 아미노산 이상일 것이며 아마도 50개 이상, 더욱 흔히는 1 내지 10개 아미노산, 바람직하게는 합성의 용이성을 위해 5개 미만의 아미노산으로 될 것이다. 이 아암은 펩티드를 담체에 부착시키고, 펩티드를 고상에 고정시키는 등, 스페이서로서, 다양한 목적에 이용될 수 있다. 담체, 고상에의 연결을 위한 유용한 수단을 제공하기 위해, 또는 이량체, 삼량체 또는 기타 다량체와 같은 보다 고차원 구조를 형성하기 위해, 티로신, 시스테인, 아스파르트산 등과 같은 아미노산을 펩티드 또는 아암의 C- 및/또는 N-말단에 제공될 수 있다. 에피토프 제시(epitope presentation)를 증진시키기 위해, 특히 흥미로운 것은 C- 및/또는 N-말단에 1 내지 10개, 더욱 바람직한 것은 1 내지 5개, 가장 바람직하게는 약 1 내지 3개의 아미노산의 존재이다. 본문에 기재된 특정 펩티드의 특히 바람직스러운 구체예는 3개의 아미노산이 대개 N-말단에 아암의 N-말단잔기가 바람직하게는 Cys인 아암으로서 첨가되는 경우 얻어진다. 예시적인 구체예에 있어서 펩티드와 말단 관능기 사이의 스페이서 잔기는 Gly이다. 따라서, 특히 바람직한 펩티드 Cys-Gly-Gly(여기서 Cys는 N- 또는 C-말단 잔기임)로 이루어진 아암을 갖는다. 말단의 Cys 잔기는 또한 디술파이드 결합을 통해 디티오- 또는 티오-관능기 지지체에 연결되거나 또는 티오에테르 결합을 통해 활성화 올레핀 지지체에 연결될 수 있다.
HIV-1에 대한 항체 검색에 특히 흥미로운 펩티드 배열은 Cosand(상기 문헌)에 의해 규정된 펩티드 39의 배열로부터 유도된다. 펩티드 39GC는 상기의 펩티드 39의 26 아미노산으로 이루어지며, 여기서 Y는 Cys-Gly-Gly-배열이고 X는 -NH2로 이루어진다. 그러므로 이 펩티드는 다음의 아미노산 배열을 갖는다 :
상기중 Cys*는 화학적 가역수단에 의해 보호된 시스테인 잔기이다.
마찬가지로, HIV-2에 대한 항체 검색에 특히 흥미로운 펩티드 배열이 펩티드 41-2-1의 배열로부터 유도되며, 여기서 Y는 Cys-Gly-Gly-배열이고 X는 -NH2로 이루어진다. 그러므로 이 펩티드는 다음의 아미노산 배열을 갖는다 :
상기중 Cys*는 화학적 가역수단에 의해 보호된 시스테인 잔기이다.
펩티드 41-2-3GC는, 상술한 41-2-3 배열로 구성되며, 여기서 Y는 Cys-Gly-Gly-배열이고 X는 -NH2이며 다음 아미노산 배열로 나타내진다 :
상기중 Cys*는 화학적 가역수단에 의해 보호된 시스테인 잔기이다.
HTLV-I에 대한 항체 검색에 특히 흥미로운 펩티드 배열이 펩티드 IV의 gp 21 배열로부터 유도된다. 바람직한 구체예인 펩티드 121-1GC1에서, Y는 Cys-Gly-Gly-배열이고 X는 -NH2이다. 그러므로 이 펩티드는 다음 아미노산 배열로 표시된다 :
상기중 Cys*는 화학적 가역수단에 의해 보호된 시스테인 잔기이다.
HTLV-I에 대한 항체 검색에 특히 흥미로운 펩티드 배열이 펩티드 V의 gp 21 배열로부터 유도된다. 바람직한 구체예인 펩티드 221-1GC1에서, Y는 Cys-Gly-Gly-배열이고 X는 -NH2이다. 그러므로 이 펩티드는 다음 아미노산 배열로 표시된다 :
상기중 Cys*는 화학적 가역수단에 의해 보호된 시스테인 잔기이다.
본문에 기재된 HTLV-I 및 HTLV-II 펩티드 사이의 실질적인 배열 상동상으로 인해, 이 펩티드들간에 어떤 교차 반응성이 기대될 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명에 따라 제조된 펩티드가 사용되는 면역분석 포맷은 항체 또는 항원이 측정될 것인가의 여부에 의존한다. 항체 또는 항원을 검색하기 위해 고안된 면역분석 포맷은 기술분야에 잘 알려져 있다. 그러나, 샘플을 펩티드와 반응시키기 전 또는 도중에, 펩티드의 화학적 보호수단을 제거하고 디술파이드 결합 형성에 알맞은 조건하에 인큐베이트 시킨다. 고상에 펩티드를 고정시키는 분석 포맷에서 고정화 단계 전 또는 후에 분자내 디술파이드 결합 형성에 알맞은 조건하, 용액내에서 펩티드 시스테인 잔기를 탈보호할 수 있다.
본 펩티드 조성물은 그의 적용에 따라 표지시키거나 표지시키지 않은 채 사용할 수 있다(표지라 함은 직, 간접적으로 검색가능한 시그날을 제공하는 분자를 의미한다). 라디오뉴클라이드, 효소, 형광물질, 화학발광물질, 효소기질, 코팩터 또는 저해제, 마그네틱 입자와 같은 입자, 예컨대, 아비딘 및 바이오틴과 같은 리간드 및 섭수체의 조합체등 여러 가지 표지를 이용할 수 있다. 또한, 마이크로타이터플레이트, 유리 또는 라텍스비이드, 시험관, 필터, 크로마토그래피 표면, 예컨대 종이, 셀룰로스, 실리카겔 등과 같은 표면계의 결합을 위해 본 발명 폴리펩티드들은 여러 방법으로 변형될 수 있다. 기타 화합물 또는 고상 표면에 연결될 수 있는 특정 방식은 통상적이며 여러 문헌에 풍부하게 기재되어 있다. 예컨대 미국특허 4,371,515 ; 4,487,715 ; 및 그 안에 이용된 특허 참조, 이러한 목적을 위해 p-말레이미도벤조산, p-메틸디티오벤조산, 무수 말레산, 무수 숙신산, 글루타르알데히드, 헤테로-이관능 교차 결합체등의 시약이 흔히 이용된다.
레트로바이러스 단백질에 대한 항체나 또는 레트로바이러스 단백질 자체의 존재 여부를 검색하는데 여러 가지 분석 프로토콜을 사용할 수 있다. 이 펩티드는 검색가능한 시그날을 내는 표지가 부착된 시약으로서는 이용될 수 있다. 다른 한편, 이 펩티드는 표면위에 직접 또는 간접적으로 고정될 수 있으며 여기서 샘플내의 펩티드에 대한 항체는 표면 위에서 펩티드에 결합되게 될 것이다. 다음 예컨대 Rf 인자 또는 S.aureus 단백질 A와 같은 면역복합체에 특이적인 표지된 단백질이나 또는 보통 인체 igG 및 IgM 두가지 모두의 인체 면역글로분린에 특이적인 이종이식(xenogeneic) 항체를 이용함으로써 펩티드에 결합된 사람의 항체의 존재 여부를 결정할 수 있다.
경쟁적 또는 비경쟁적인 여러 가지 이질적인 프로토콜을 사용할 수 있다. 펩티드를 표면 또는 지지체에 결합시켜 제한된 양으로 존재하는 결합 펩티드를 두고 표지된 항체와 샘플내의 항체가 경쟁하도록 한다. 지지체에 결합된 표지량은 샘플내의 경쟁적인 항체량과 관계될 것이다.
항체는 지지체 및 표지된 펩티드와 결합된 샘플에 결합될 수 있다. 반응 혼합물과 결합 항체와의 접촉 후, 지지체에 결합된 표지량은 샘플내의 기원이 같은(cognate) 항체의 양에 관계될 것이다.
예컨대 IgG 및 IgM(면역글로불린)의 Fc에 대한 항체와 같은 이종이식 항-인체 항체가 지지체에 결합되었을 것이다. 샘플은 면역글로불린 및 표지 펩티드에 접착될 것이며, 이로인해, 지지체에 결합된 표지 펩티드의 양은 기원이 같은 항체가 존재함을 가리키는 것이 될 것이다.
분석기술의 예로는 예컨대, 여과와 같은 면역농도 이용을 들 수 있으며, 여기서는 예컨대 라텍스 비이드와 같은 고상에 공유적 또는 비공유적으로 본 발명의 펩티드 조성물 또는 그의 콘쥬게이트를 흡착시킨다. 예컨대, 타액, 소변, 뇌척수액, 혈액, 혈장 또는 혈청등의 생체액 샘플을 인산염, 트리스등의 여러 가지 완충액중 하나를 이용하는 수성 완충매질인 분석매질로 희석함으로써 전처리할 수 있으며, 필터막이 구비된 용기내의 항원피복 라텍스 비이드와 결합시켜 펩티드(들) 및 샘플내의 기원이 같은 항체 사이에 복합체가 형성되기에 충분한 시간동안 정치시킨다. 상등액을 필터를 통해 통과시키고, 피복 비이드가 고정되어 있는 필터를 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 제거한다.
이 복합체에 특이적으로 결합하는, 표지된 특이 결합 단백질을 이용하여 검색한다. 적절한 완충 매질중의 , 인체 면역글로불린, 특히 항-(인체 IgG 및 IgM)에 대한 이종이식 항혈청을 면역반응성 막에 첨가할 수 있다. 이 이종이식 항혈청은 보통 효소나 라디오뉴클라이드와 같은 검색가능한 표지로 표지시킨다. 항혈청 대신, 예컨대 S. aureus 단백질 A와 같은 면역 복합체에 특이적인 단백질도 사용가능하다. 다음 표지를 검색 할 수 있다. 예컨대, 효소의 경우, 비특이적으로 결합된 호소 표지를 제거한후, 디벨로퍼 용액을 첨가한다. 디벨로퍼 용액은 효소기질 및 가능하게는 효소 코팩터, 크로모젠등, 반응후, 비색적 또는 형광적으로 검색가능한 착색 또는 형광생성물을 제공하는 것들을 함유한다.
다음의 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 본 발명은 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.
티올-탈보호된 펩티드는 HIV-1 및 HIV-2에 대한 항체를 검색한다.
펩티드 합성
0.40mmol p-메틸벤즈히드릴아민 수지(Applied Biosystems Inc., Foster City, 캘리포니아)에 t-부틸옥시카르보닐-보호 아미노산을 순서적으로 커플링 시킴으로써 펩티드 39의 유도체들을 조립하였다 아미노산 측쇄 보호는 표준의 벤질에 기초한 기에 의하였다. 포르밀 부분까지 트립토판을 보호하였다. 시스테인 잔기의 화학적 가역 보호수단이 요망되었을 때 에틸카르바모일 보호를 이용하여 보호수단을 제공하고 글루타민이나 아스파라긴에서 사용되는 바와 같은 포준 히드록시벤조트리아졸 에스테르 화학을 이용하여 커플링 시켰다.
N-t-부틸옥시카르보닐-S-에틸-카르바모일시스테인은 St. Gutmann, Storey등(상기 문헌)의 방법으로 제조하였다. 간단히 설명하면, 트리플루오로초산 15.3ml를 0℃에서 계속 교반하면서 1-시스테인(유리 베이스) 24.2g과 디메틸포름아미드(DMF) 200ml와의 혼합물에 적가하였다. 다음 에틸 이소시아네이트(17.8ml)를 적가하고 실온에서 18시간동안 혼합물을 교반하였다. 얻어진 혼합물을 진공하에 증발시키고 잔사를 물 180ml에 용해시켰다. 0℃로 냉각한 에테르(100ml)의 2부분을 이용하여 수용액을 세척하고 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 7.0으로 조정하였다. 순수 에탄올(550ML)을 첨가하고, 생성물을 4℃에서 밤새 결정화시켰다. 여과후 차가운 20% 에탄올/물 및 에테르로 이 결정성 고체를 세척하여 S-에틸카르바모일 시스테인 18.9g을 얻었다.
N-t-부틸옥시카르보닐 유도체를 만들기 위해, S-에틸카르바모일 시스테인 18.9g, 디메틸 술폭시드 180ml 및 디이소프로필에틸아민 16.4ml의 격렬한 교반 혼합물에 고상 디-t-부틸 디카르보네이트 23g을 서서히 첨가하였다. 빙수 400ml와 포화염화나트륨 100ml를 첨가하기 전에 이 혼합물을 실온에서 2시간 교반하였다. 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 2.0으로 조정하고, 수성 혼합물을 2부분의 200ml 에틸 아세테이트로 세척하였다. 유기 추출물을 결합하여 진공증발시켰다. 에틸 아세테이트/헥산으로부터 잔사를 재결정시키고 이어서 20% 에탄올/물로부터 재결정하였다. N-t-부틸옥시카르보닐-S-에틸카르바모일시스테인 19.4g을 얻었다.
클로로포름/아세트산(15 : 1) 용매로 시리카겔상에서 박층 크로마토그래피 시키자 이 최종 생성물은 균질한 것으로 나타났다 ; Rf 0.25. 이 생성물의 융점은 144-146℃로, 이는 앞서 보고된 139-140℃와 유사한 것이다(Storey 참조, 상기 문헌).
완성된 펩티드를 탈보호시키고 표준의 고 HF 방법이나 또는 Tam등의 저-고 HF 방법에 따라 이를 수지로부터 떼어내었다(J. Amer. Chem. Soc, 105 : 6442, 1983). 50% 아세트산 중에서 펩티드를 수지로부터 추출하여 G-25 Sephadex상에서 20% 아세트산에서 겔 크로마토그래피시켰다. 펩티드를 함유하는 분획을 끌어내어 동결건조시켰다.
면역학적 반응성
흡착 또는 공유결합에 의해 펩티드를 라텍스 비이드상에 고정시킨 시험관 분석에 의해 펩티드 39 및 그의 동족체의 면역학적 반응성을 테스트하였다.
펩티드 39GC 및 탈보호된 펩티드 39GC의 라텍스 비이드상에의 흡착은 먼저 비이드(5mg, IDC, Interfacial Dynamics Corporation, Portland. 오레곤, 1㎛직경)를 증류수로 세척하고 pH 7.4 1.0M HEPES 0.5ml에 격렬히 혼합하여 재현탁시킴으로써 수행하였다. 4mg/ml 6M GuHCl 원액으로 부터의 희석 펩티드를 최종 용적 550㎕가 될 때까지 세척 비이드(25-200㎍ 펩티드)에 첨가하였다. 혼합물을 30초동안 격렬히 교반하고 밤새 덜 격렬하게 혼합시켰다. 하룻밤 정치후 증류수 500㎕를 첨가하고 원심분리에 의해 비이드를 수집하였다. 이 비이드를 증류수 1ml로 세척하고 증류수 100㎕에 현탁한 다음 0.5N NaOH 100㎕를 첨가하여 즉시 혼합함으로써 흡착된 펩티드의 시스테인 잔기를 탈보호시켰다. pH 7.4, 0.25N HEPES 1ml를 첨가함으로써 탈보호반응을 정지시켰다.
실온에서 하룻밤 펩티드/비이드 용액의 공기 산화를 수행하였다. 페리시안화 칼륨을 펩티드/비이드 용액에 첨가하여 산화를 완결시켰다. 튜브를 원심분리시키고 1ml 증류수로 비이드를 3회 세척하였다. 펩티드/비이드 복합체는 즉시 사용할 수 있으며 또는 6개월까지는 반응성의 큰 손실없이 4℃에서 수성 현탁액으로서 보전할 수 있다.
pH 8.0의 0.2M Tris 0.9ml에 재현탁시킨 라텍스 비이드(상기와 같이 제조함)에 6M 구아니딘-HCl 중의 펩티드 39의 2mg/ml 펩티드 원액 0.1ml를 첨가함으로써, 라텍스 비이드에 X가 -OH, Y가 -NH2이고 시스테인 티올기가 EC 보호되지 않은 펩티드 39를 흡착시켰다. 펩티드 라텍스 비이드 현탁액을 45℃ 수조에서 밤새 정치시켰다. 정치후 원심분리시켜 비이드를 모으고 이를 pH 7.0, 0.01M PBS에서 1회 세척하였다.
필요한 경우, 비특이적 결합을 예방하기 위해, 0.84%[w/v] 피복 비이드 현탁액 20㎕를 1% 소의 혈청 알부민(BSA) 1ml에 첨가하고 격렬히 혼합함으로써, 펩티드 피복 비이드를 블로킹시킬 수 있다. 원심분리에 의해 비이드를 수집하고 상등액을 제거하였다. 이어서 세척단계를 2회 반복하였다.
테스트할 혈청이나 혈장을 샘플 희석 완충액(pH 7.2, 0.15M 염화나트륨, 0.01M 인산나트륨중 0.01% 포말방지제 A, 2.5%[w/v] 무지방 건조밀크, 15ppm Kathon(G)으로 1 : 80으로 희석하고 100㎕를 보텍스로 혼합하면서 블로킹된 펩티드/라텍스 비이드 콘쥬게이트에 첨가하였다. 샘플을 펩티드/라텍스 비이드 콘쥬게이트와 함께 실온에서 15분간 정치시키고 0.9ml 세척액(Tris-염수중 0.05% Tween 20, 1mM 염화마그네슘)을 첨가한 후 보텍스로 교반하고 원심분리하여 펩티드/비이드 콘쥬게이트를 모았다. 다시 펩티드/비이드 콘쥬게이트를 세척하고 원심분리로 수집하여 희석 완충액중 항인체-IgG, A 및 M-알칼라인 포스파타제 콘쥬게이트의 1/100 희석물 100㎕를 15분간 실온에서 첨가하였다. 펩티드/비이드 콘쥬게이트를 다시 한번 상기와 같이 세척하였다.
알칼라인 포스파타제 활성에 의해 핍티드의 면역학적 반응성이 간접적으로 검색되었다. 효소 완충액(0.8ml, 0.1M Tris-HCl/0.1M NaCl/5mM MgCl2, pH9.5)을 첨가하고 기질(효소 완충액증 9mg p-니트로페닐 포스페이트) 100㎕을 첨가하였다. 37℃에서 15분간 기질을 정치시키고 3n 수산화나트륨을 100㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 원심분리에 의해 비이드를 펠렛화하고 450nm에서 분광광도계를 상등액의 흡수도를 측정하였다. 펩티드 39GC 및 탈보호 39GC는 이 분석 포맷에서 펩티드 39에 비해 실질적으로 개선된 것으로 나타났다.
다른 한편, 카르복실 말단을 통해 라텍스 비이드상에 펩티드를 공유적으로 고정시켰다. 다음의 배열로 이루어진, 39-I이라 표시되는 펩티드 39의 한가지 동족체에 대해 카르복실 말단 콘쥬게이션을 수행하였다 :
시스테인 잔기를 에틸카르바모일 보호하여 상술한 바와 같이 펩티드를 합성하였다. 0℃, 진공하에 90% 히드로플루오르산/10% 아니솔을 이용하여, 교반하면서 고상으로부터 완결된 펩티드를 분리시켰다. 히드로플루오르산을 증발시키고 에틸 아세테이트로 잔사를 세척한다음 6M Gu-HCl/0.4M 인산칼륨에 조펩티드를 용해시켰다. Blake등의 방법(Int. J. Peptide Res. 1981, 17 : 273, Proc. Natl. Acad. Scr. USA 1981, 78 : 4055, 두가지 모두 본문에 참고 삽입함)으로 조질의 펩티드를 시트라코닐화시킨다음 중탄산암모늄 완충액에서 겔 여과시켰다. 얻어진 펩티드, 39-IX는 아미노말단 및 시트라코닐화된 리신잔기, 포르밀-트립토판, 에틸카르바모일-시스테인 및 C-말단 티오글리신 잔기로 이루어졌다.
카르보디이미드 활성화를 통해 카르복실화 라텍스 비이드(Seradyne, 1.1㎛직경, 0.01meq/g)에 콘쥬게이트된 펜타리신의 유리 아미도기에 펩티드 39-IX를 콘쥬게이트시켰다. 비이드 현탁액의 1분취액(0.3ml)을 원심분리시켜 비이드를 수집하였다. 증류수로 비이드를 1회 세척하고, 수집한 다음, 물증의 H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-아미드 용액에 현탁시켰다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 첨가하기 전에 pH를 5.0과 5.5사이로 조정하였다. 하룻밤 정치시킨후 비이드를 수집하고 상기와 같이 증류수로 세척하였다.
실온에서 2시간 동안, pH 7.4에서 0.1M N-히드록시숙신이미드 및 질산은의 수용액중의 펩티드 39-IX 27㎍/ng 비이드로, 얻어진 비이드의 절반을 처리하였다. 비이드를 0.2M 시안화나트륨으로 세척하고 1% 수성 아세트산에 밤새 보존하여 시트라코닐기를 제거하였다. 0.2N 수산화나트륨으로 간단히 처리하여 에틸카르바모일 및 포르밀 보호기를 제거하였다. 시스테인 잔기를 하룻밤 공기 산화시킨다음 산화를 종결시키기 위하여 페리시안화 칼륨과 반응시켰다.
질산은을 첨가하지 않은 것을 제외하고 나머지 펩타리신 콘쥬게이트된 라텍스 비이드를 상기와 동일한 방식으로 처리하였다. 얻어진 비이드를 비교용 블랭크로 이용하였다.
펩티드 39 유도체 역시 카르보디이미드 활성화를 이용하여 아미노 말단을 통해 카르복시 변형 라텍스 비이드(Polysciences)에 공유적으로 고정시켰다. 마이크로퓨지 튜브에 라텍스 비이드 8mg을 넣고 증류수 0.5ml를 첨가하였다. 원심분리에 의해 비이드를 수집하고 상등액은 제거하였다. 0.2M EDC(38.2mg/ml) 0.5ml와 0.1M N-히드록시숙신이미드(22mg/ml)를 첨가하여 실온에서 회전 혼합시키면서 90분간 반응을 진행시킴으로써 활성화시켰다. 활성화된 비이드를 상기와 같이 수집하고 상등액은 50㎕만 남기고 제거하였다. 펠렛을 분산시키고 다양한 농도로 펩티드 39를 함유하는, pH 7.5 1M HEPES 250㎕를 첨가하였다(190-760㎍). 펩티드를 회전 혼합시키면서 실온에서 하룻밤 활성화 비이드와 반응시켰다. 비이드를 상기와 같이 수집하고 0.1M HEPES, pH 7.5로 세척하였다. Tris-염수(0.1M, pH 7.4)중의 1% BSA로 2번 더 세척하고 0.5ml의 1% BSA/트리스-염수에 펩티드/라텍스 비이드를 재현탁시켰다.
티오에테르 결합 형성을 통해 다른 한편 N-말단 공유 고정을 수행하였다. 펩티드 39-GC를 NH2변형 라텍스 비이드(Pandex, Mundelein, 일리노이)에 콘쥬게이트시켰다. 비이드 5mg을 증류수로 1회 세척하고 pH 7.4의 0.1M HEPES 200㎕에 재현탁시켰다. N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC, DMF중 1mg/100㎕의 100㎕)를 비이드 현탁액에 첨가하고 실온에서 계속 혼합하면서 2시간동안 반응시켰다. 활성화 비이드를 상기와 같이 수집하고, 증류수를 2회 세척한다음, 5mM EDTA를 함유하는 0.1M HEPES, pH 7.4로 1회 세척하였다. HEPES 완충액중의 활성화 비이드의 현탁액 200㎕를 제조하고 100㎕의 6M GuHCl중의 펩티드 39-GC 200㎍을 첨가하였다. 로테이터내에서, 실온에서 밤새 콘쥬게이션시켰다. 상기와 같이 펩티드 콘쥬게이트된 비이드를 수집하고, 증류수에서 3회 세척한 다음 중류수로 0.84%로 현탁하였다. 상술한 바와 같이 면역학적 교차-반응성을 테스트하였다.
면역학적 교차 반응성 시험의 대안 방법도 이용하였다. 이러한 방법들 중 한 방법에서 미국특허 4,629,783에 이미 기재된 바와 같이 펩티드 39 및 39GC를 ELISA로 테스트하였다. 간단히 펩티드 39 및 39-GC의 원액을 6M Gu-HCl중에 제조하였다. 원액을 0.05 탄산염/중탄산염 완충액(pH 9.5)으로 희석함으로써 각각의 20㎍/ml 및 6㎍/ml 작업 희석액을 제조하였다. 마이크로타이터 플레이트의 웰에 펩티드의 작업 희석액 100㎕를 충전시키고 실온에서 하룻밤 정치시켰다. 코팅 용액을 제거하고 0.5M 에탄올아민을 함유하는 블로킹 용액(상기 문헌) 300㎕를 실온에서 시간동안 첨가하였다. 블로킹 용액을 제거하고 플레이트를 즉시 사용하거나 또는 건조시켜 후에 사용할 수 있도록 보존하였다.
샘플 희석 완충액(상기)에 혈장 샘플을 희석하고(표 1참조) 각 웰에 100㎕씩 첨가하였다. 37℃에서 샘플들을 30분간 정치시킨 후 제거하고, 웰을 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20으로 6회 세척하였다. pH 7.0의 구연산염 완충액에 100㎕의 염소 항사람 g-호스래디쉬 과산화효소 콘쥬게이트를 희석시켜, 각 웰에 37℃에서 30분간 1% 보통의 염소 혈청을 첨가하고 상기와 같이 6회 세척하였다. 실온에서 30분간 100㎕/웰의 기질용액(시티딘/인산염 왕충액, pH 6.0중 0.0015% 과산화수소, 80㎍/ml 테트라메틸 벤지딘)을 첨가함으로써 ELISA 분석을 전개하였다. 웰당 1N H2SO4를 100㎕ 첨가하여 반응을 정지시키고, 450nm에서의 광학밀도대 630nm에서의 광학밀도의 비율을 자동 ELISA 리더로 측정하였다. 양성 결과의 컷오프값은 세가지 공지의 음성 샘플에서 얻어진 평균 흡수도 값보다 0.225 흡수단위(Absorbance Units)만큼 높게 책정되었다. 표1의 결과는 펩티드 39GC가 보다 높은 희석물에서 펩티드 39보다 양성 결과를 낼 수 있음을 보여준다.
별도 실험에서 티올-보호 펩티드 39GC는 티올-탈보호펩티드 39GC에 비해 면역반응성이 현저히 저하된 것으로 나타났다. 유사한 결과가 HIV-2 펩티드인 41-2-3GC의 경우에도 관찰되었다.
실시예 II
탈보호 펩티드를 이용한 HIV-1에 대한 항체의 막농도 면역분석
본 발명의 개선된 방법 및 조성물을 이용함으로써 변형된 마이크로입자 분석법에 의해 여러 가지 공지의 혈청 및 혈장 샘플의 면역 교차-반응성을 스크리닝하였다. 본 발명의 펩티드 조성물을 라텍스 비이드상에 고정시키고 HIV에 대한 항체의 측정 및/또는 정량을 위해 흡착물질 정상부의 미세다공성 막위에 트래핑시켰다. 이러한 면역분석 정치 및 방법의 예는 미국특허 4,633,901호 및 4,727,019호 및 4,727,019호에 개시되어 있으며 두가지 모두 본문에 참고삽입되었다. 막농도 면역분석법은 총 분석시간 10분으로 되는 3가지 인큐베이션을 포함한다. 테스트되는 펩티드를 상기 방법에 따라 라텍스 비이드에 흡착시켰다.
1.2㎛ 포어크기의 나일론 막 위의 3스폿으로 이루어진 여과 유닛상에서 각 샘플을 테스트하였다. 1스폿은 테스트 펩티드/라텍스 비이드 조제, 1스폿은 양성 프로시져 콘트롤, 나머지 하나는 음성 프로시져 콘트롤이었다.
펩티드 라텍스 비이드 조제를 pH 7.2의 0.1M Tris 완충액, 0.15M NaCl, 0.01M MgCl, 10% 수크로스, 2% 송아지 태아혈청에 현탁시켰다. 펩티드/비이드 조제의 0.1-0.2% 현탁액으로 막을 스폿팅하였다. 음성 프로시져 콘트롤 스폿은 BSA와의 흡착에 의해 피복된 라텍스 비이드로 이루어졌다. 반면, 양성 프로시져 콘트롤 스폿은 염소 항인체 면역글로불린과 함께 흡착됨으로써 피복된 라텍스 비이드로 이루어졌다.
혈청 또는 혈장샘플(40㎕)을 희석 완충액(20mM 구연산나트륨 완충액(pH 7.4)중 10% 열 불활된 정상적인 염소 혈청, 1% 덱스트란 황산염, 0.2% Tween 20, 2.5% 무지방 건조 밀크, 15ppm Kathon CG, 0.005% 포말방지제 A)에서 1:10으로 희석하였다. 희석된 표본을 막표면에 첨가하고 완전히 흡착시켰다. 표본 첨가후부터 2분간 기다린 후, 1ml의 세척 완충액(0.01M Tris 완충염수, pH 6.0, 0.05M NaCl, 0.005M MgCl, 0.1% 아지드나트륨, 10㎍/ml 니트로 블루 테트라졸륨, 0.5M 티오시아네이트 칼륨)을 첨가하여 막을 통해 완전히 흡수시켰다. 약 5분 후, pH 7.4 약 0.5M EDTA 1ml를 막을 통해 통과시켜 반응을 정지시켰다. 용액이 완전히 흡착된후 유닛을 육안으로 읽거나 굴절률에 의해 반정량적으로 읽었다.
결과는 양성 콘트롤 스폿이 발색하는 징후를 조금이라는 나태내고 테스트 스폿과 음성 콘트롤 스폿이 색상을 전혀 발색시키기 않았을 때에만 음성이었다. 테스트 스폿이 어느 정도로 색상을 발색하고(트레이스 내지 4+) 양성 콘트롤 스폿이 발색하고 음성 콘트롤 스폿은 발색하지 않은 경우 양성결과로 나타났다. 모든 스폿이 발색하거나 ; 또는 양성 콘트롤에서 발색되지 않거나, 또는 음성 콘트롤 스폿이 발색하는 경우에는 시험이 부당한 것으로 고려되었다.
테스트 항원으로서 바람직한 펩티드 39 동족체, 펩티드 39-GC에 대해 여러 가지 양성, 음성, EIA 양성/웨스턴 블롯 비정형(atypical) 및 면역감수성을 갖는 표본을 시험하였다. 양성 표본은 0.5+에서 4+까지의 반응성 등급을 나타내었다. 명확히 규정된 모든 타당한 테스트는 깨끗한 백색 배경상에 착색된 스폿을 결과시켰다. 음성 콘트롤은 전혀 발색하지 않았으며 양성 콘트롤은 약 2+ 착색도를 나타내었다.
1. 자기면역 샘플은 천식환자 11명, 스요그렌 증후군(Sjogren's syndrome) 환자 11명, 전신·홍반성 낭창 환자 7명, 강직성 척추염 환자 4명, 미지 증상의 3명 및 잡다한 증후군/질환의 환자 15명을 포함하였다.
2. 황달, 지방혈증, 균혈증, 아스코르브산 및 여러 가지 항응집 처리된 샘플.
본 발명의 여러 가지 펩티드 조성물을 상술한 몇가지 분석 포맷을 이용하여 테스트하였다. 표 3에 ELISA 및 막농도 면역분석에 의한 비정형 샘플에 대한 펩티드 39와 총 바이러스 ELISA의 비교결과를 나타내었다.
11개의 비정형 샘플중 10개가 전체 바이러스 ELISA에 의해 양성으로 테스트되었으며 웨스턴 블롯을 의해서는 양성으로 확인되지 않았다. 고정 항원으로서 펩티드 39가 사용된 경우에는 ELISA 및 막농도 면역분석 두가지 모드에 의해 모두 음성으로 밝혀졌다.
ELISA 및 막농도 면역분석에 의한 펩티드 39GC 및 2개의 혈청 전환 패널상에 ELISA에 의한 펩티드 39와의 총 바이러스 ELISA의 결과를 표 4에 나타내었다. 펩티드 39GC 및 펩티드 39는 총 바이러스 ELISA 보다 먼저 양성결과를 냈다. 펩티드 39GC는 하나의 혈청 전환 패널상에서 펩티드 39보다 먼저 양성결과를 냈다.
막농도 면역분석
실시예 Ⅲ
탈보호 펩티드를 이용한 HIV-2에 대한 항체 검색
보호된 시스테인 티올기로 합성된 HIV-2 펩티드의 면역반응성을 측정하였다. 실시예 I에 기재된 바와 같이 HIV-2 펩티드를 합성하여 Cys기를 보호하고, N-말단 Cys-Gly-Gly를 갖는 펩티드 41-2-3GC를 만들었다. HIV-1 및 HIV-2의 바이러스 용균물과 펩티드 39GC(HIV-1) 및 41-2-3GC를 이용하여 바이러스 용균물과 펩티드 39GC(HIV-1) 및 41-2-3GC를 이용하여 상기한 바와 같이 EIA를 수행하였다. 뉴욕의 환자로부터 수득된 2가지 HIV-2 양성혈청, F504282와 파스퇴르 연구소가 제공한 “GOM”의 희석물에 대해 반응성을 측정하였다. 표 5에 나타난 결과는, 이 합성 펩티드가 HIV-1과 HIV-2를 명확히 구별하며 총 바이러스 용균물 EISs로 얻어진 결과와 대조했을때 특히 향상된 특이적인 면역반응성을 제공함을 보여준다.
# §
#ND=결정되지 않음.
§선은 컷오프를 표시한다. 선 위의 값은 양성. 선 아래의 값은 음성으로 고려.
실시예 IV
탈보호 펩티드를 이용한 HTLV-I에 대한 항체의 검색
HTLV-I 트랜스멤브레인 당단백질, gp 21의 영역은 HIV-1 및 HIV-2의 트랜스멤브레인 영역에 상응하는 것으로 동정되었으며 따라서 잠정적으로 면역우세적이다. HTLV-I의 공지의 아미노산 배열에 기초하여 합성 펩티드를 만들었다. 실시예 I 에 개략된 바와 같은 공정에 따라 펩티드를 합성 및 보호시켰다. 대체로 실시예 I 및 II에 설명된 바와 같이 분석을 수행하였다. 결과를 다음의 표 7에 나타내었다.
-라텍스 미립자에의 펩티드의 피복수준은 50㎍ 펩티드/5mg 비이드/550㎕ 용적이었다.
-혈청 샘플 40359 및 0435는 희석하지 않고 사용된 HTLV-I EIA 양성 콘트롤 혈청이고; 032EC1은 HTLV-I EIA 음성 콘트롤이다.
*-표는 합성시 Cys 잔기가 에틸카르바모일 보호에 의해 보호되었음을 표시한다.
펩티드 121-1GC1의 분석 결과를 다른 HTLV-I/II 테스트, 예컨대 폴리머라제 연쇄반응(PCR : Polymerase chain reaction), 방사능면역침전(RIP : radioimmunoprecipitation), 웨스턴 블롯(WB : Western Blot), 및 바이러스 용균물 EIAs와 같은 테스트 결과와 비교하였다. 샘플 2방울을 사용하고 2배 더 높은 농도에서 콘쥬게이트를 이용한 것을 제외하고는 펩티드 121-1GC1에 대해 실시예 II에 설명된 공정을 이용하였다. HTLV-I 및/또는 HTLV-II에 대한 항체를 함유하는 것으로 의심되는 10가지 혈청 샘플에 대해 분석을 수행하였다. HTLV-II에 대한 PCR 분석은 PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplication(편집 H.A. Ehrlich, Stockton Press, N.Y.(1989))에 따라 수행하였다.
결과를 표 8에 나타내었다.
피복수준 : 80㎍ 펩티드/5mg 비이드/550㎕ 용적
-vw는 매우 약한 반응을 의미함.
-Ind는 미결정 상태를 의미함.
다른 실험에서, HTLV-I/II 양성인 것으로 생각되는 환자들의 혈청 패널에 대한 여러 가지 형태의 HTLV-I 펩티드의 스크리닝 결과는 RIP, 웨스턴 블롯, 및 시판되는 HTLV-I EIA 분석에 의한 결과와 비교했을 때 결정적이지 않은 결과를 냈다. 몇몇 테스트에 의해 양성된 것으로 알려진 몇가지 샘플은 펩티드 121-1GC1을 이용한 경우 음성이었다. 이러한 결과는 아마도 여러 인자에 기인하는 것일 것이며, 그러한 인자들에는 다음과 같은 가능성, 즉, 펩티드 121-1GC1에는 음성으로, 기타 시험에 의해서는 양성으로 판명되는 샘플들이 트랜스멤브레인 당단백질 항원이 아닌 바이러스 핵 항원과 반응성인 항체를 함유했을 수 있는 가능성도 포함된다.
지금까지 보다 명확한 이해를 돕기 위해 몇가지 구체예를 들어 본 발명을 설명하였으나, 첨부된 청구범위 내에서 어떠한 변화 및 변형이 가해질 수 있을 것임은 분명하다.

Claims (14)

  1. 7 내지 50개의 아미노산 배열로 이루어지고 다음의 각 배열로부터 선택되는 7개 이상의 인접한 아미노산을 갖는, 천연적인 레트로바이러스 단백질 HIV-1 gp 41, HIV-2 gp 36, HTLV-I gp 21 또는 HTLV-II gp 21에 대한 항체와 면역반응성인 펩티드 :
    여기서, 상기 배열은 비-Cys 아미노산 잔기 2개 이상 및 20개 미만의 사이를 두고 서로 떨어져 있는 2개의 Cys 잔기를 포함하며 이 펩티드의 Cys 잔기의 티올기는 산화로부터 가역적으로 보호되어 있다.
  2. 제1항에 있어서, Cys 잔기가 에틸카르바모일, 아세트아미도메틸, 3-니트로-2-피리딘술피닐 또는 디페닐-4-피리딜메틸에 의해 산화로 부터 보호된 것이 특징인 펩티드.
  3. 제2항에 있어서, Cys 잔기가 에틸카르바모일에 의해 산화로부터 보호된 것이 특징인 펩티드.
  4. 제1항에 있어서, N-말단에 산화로부터 보호되지 않은 Cys 잔기가 추가로 함유된 것이 특징인 펩티드.
  5. 제4항에 있어서, N-말단 아미노산이 Cys-Gly-Gly로된 것임이 특징인 펩티드.
  6. 제4항에 있어서, C-말단 아미노산이 아미드화된 것이 특징인 펩티드.
  7. 제1항에 있어서, Cys 잔기들이 약 4개 내지 6개의 비-Cys 잔기만큼 서로 떨어져 있는 것이 특징인 펩티드.
  8. 제1항의 티올-보호 펩티드를 합성하고 ; 보호된 이 펩티드를 고상에 고정시킨 다음 ; 고정된 펩티드로부터 화학적-가역 보호수단을 제거한 후 ; 상기 고정된 펩티드를, 디술파이드 결합을 형성하도록 인큐베이션 시키는 것으로 이루어지는, 천연적인 레트로바이러스 단백질 HIV-1 gp 41, HIV-2 gp 36, HTLV-I gp 21 또는 HTLV-II gp 21에 대한 항체의 면역학적 검색 또는 정량을 위한 펩티드-코팅 고상의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 펩티드 합성전에 시스테인 티올기를 보호시키는 것이 특징인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 고상이 라텍스, 실리카, 셀룰로스, 플루오로카본 폴리머, 나일론, 폴리아크릴아미드 또는 폴리스티렌인 것이 특징인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 펩티드가 분자내 디술파이드 결합을 형성하도록 상기 펩티드를 탈보호시킨 다음 이를 고상에 고정화시키는 것이 특징인 방법.
  12. 제8항에 따라 제조된 고정된 펩티드와 체액을 접촉시켜 반응 혼합물을 생성한 다음 ; 면역특이적인 결합이 일어났는지를 검색함으로써, 체액내에 하기 항체나 항원이 존재하는지를 결정하는 단계로 됨을 특징으로 하는, 체액중 HIV-1, HIV-2, HTLV-I 또는 HTLV-II에 대한 항체나 그의 항원의 존재여부를 결정하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 면역반응 혼합물로부터 비결합 성분을 분리한 후, 반응생성물의 성분에 결합가능한 표지된 항체를 첨가한 다음, 표지된 항체가 반응생성물에 결합하는지의 여부를 검색함으로써 면역특이적 결합을 겸색하는 것이 특징인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 여과에 의해 분리를 수행하는 것이 특징인 방법.
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