KR960002652B1

KR960002652B1 - 항종양 효과를 갖는 추출조성물

Info

Publication number: KR960002652B1
Application number: KR1019920015492A
Authority: KR
Inventors: 한영복; 문정조; 경홍기; 김종배; 김경태; 김정한; 김춘원
Original assignee: 한영복; 사단법인한국창조과학회; 김영길
Priority date: 1992-08-27
Filing date: 1992-08-27
Publication date: 1996-02-24
Anticipated expiration: 2012-08-27
Also published as: KR940003562A

Abstract

내용 없음.

Description

항종양 효과를 갖는 추출조성물

제1도는 본 발명의 추출 공정도.

제2도 S-180 결절성 종양에 대한 체중변화.

제3도 Ehrlich 결절성 종양에 대한 체중변화.

제4도 본 발명품에 대한 여러 암세포주에 대한 효과.

제5도 본 발명품에 대한 여러 암세포주에 대한 효과.

제6도 본 발명품의 종양치료 효과에 대한 스펙트럼.

제7도 본 발명품의 S-180 결절성 종양에 대한 치료효과.

제8도 본 발명품의 Ehrlich 결절성 종양에 대한 치료효과.

제9도 본 발명품의 S-180 종양에 대한 연명효과.

제10도 본 발명품의 Ehrlich 종양에 대한 연명효과.

본 발명은 항 종양 효과를 갖는 치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리시니 세멘(Ricini Semen)의 탈지한 전분질과 콥티스(Coptis)속 식물 뿔리를 혼합하여 추출한 추출물로서 항암 효과를 갖는 항암제에 관한 것이다. 근래, 항암 치료제로서는 1종의 화학물질로서 질환을 치료하기 위한 항암 약물이 개발 출현되고 있다.

그러나 일반적인 항암제는 제암효과가 강할수록 독성도 강하므로 종양질환의 증상보다는 항암 화학요법제에 의한 중독 작용이 심할 때가 많다. 그 일예로서 Alkylating agent계 약물은 식욕부진, 구토, 골수억제, 주사부위의 혈전성 정맥염 등이 일어나고, 대사길항제에 있어서도 골수억제백혈구 감소나 면역 억제작용에 의한 악성종양화, 특히 림프종의 발생빈도가 증가되고 있다.

이에 본 발명은 지금까지 전혀 시도된 바 없는 두가지 식물속을 이용한 추출물을 이용함으로서 생체 전체의 각 대사기능을 활성화가능한 기능으로 함과 함께 영양대사를 저해하는 효과에 의해 종양 증식을 억제하는 항암물질로서 안전성이 높아 장기간 투여할 수 있는 항암 추출물을 제공하고자 한다. 본 발명품은 리시니 세멘(Ricini Semen)의 식물과 콥티드(Coptis)속 식물의 뿌리를 혼합한 추출물로서, 이와같은 두가지 식물속(植物屬)을이용한 항 후천성 면역결핍증 바이러스 증식을 억제하는 AIDS 치료제로서 본 발명자가 국내특허출원(92-10894호)한 바 있다.

이에 본 발명자는 기 출원한 바 있는 AIDS 치료외에 실험적 연구를 통해, 상기한 2종의 식물의 조성이 항암 작용에 탁월한 약리작용을 가진 것을 발견하기 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 기본 목적은 종양질환과 그의 관련된 질환에 대하여, 예방과 치료효과를 가지는 신규약물을 제공하는 것이다. 여기서 본 발명에 의하 신규약물이 병태성 화학치료효과에 관한 용어에서, 종양 즉 신생물(neoplasm)은 정상의 분화, 증식의 프로그램에서 이탈된 세포의 과잉증식이라 할 수 있다.

인간의 종양 발생은 세포성 oncogene에 환경인자가 관여되는 것으로서, 세포의 transformation과 화학적 발음물질 즉 음식물, 공기(배기가스, 담배연기), 직엽디스매스트, 염화비닐, 의약품 등으로 일어날 수 있고, 자외선, 방사선, 종양 비루스 등에 의해 발중되는 질환이라 할 수 있다.

이와같은 질환에 대하여 본 발명은 다음과 같은 신규 약물을 제공하는 것이다. 본 발명에 사용되는 식물원료중 리치니 세멘은 30-50%의 지방과 글로블린(globulin), 뉴클레오 알부민(nucleoalbumin), 글루코프로테인(glucoprotein), 리신(ricin), 리파제(lipase) 등의 단백질과 독성 알카로이드 리시닌(alkaloid ricinine) 등이 함유된 식물로서, 이는 인도 및 열대 아프리카 원산으로 한대지방을 제외하고는 세계적으로 널리 분포되어 있다.

특히 동북지방에서 대량 재배되며 아메리카 및 자바 등에서도 많이 재배된다. 열대 및 난대지방의 것은 작은 수목이고 온대지방의 것은 일년생 초본이다.

이 식물의 대표적인 것은 리시너스 콤무니스 엘(Ricinus Communis L)(피마자)이다. 또한 본 발명에 사용되는 다른 식물로서, 콥티스(활倍)속 식물은 아시아 각국의 야산에서 자생 또는 재배되는 다년생 초본이다.

중국산은 콥티스 차이넨시스 프란치(Coptis chinensis FRANCH), 콥티스 델토이디스시 와이 챙 애 히사오(Coptis deltoidid C. Y. CHENG et HSIAO), 콥티스 퀴인퀘섹타 더블유 티 왕(Coptis quinquesecta W. T. WANG), 콥티스 테토이드 씨 와이 챙(Coptis teetoide C. Y. CHENG) 콥티스 차이넨시스 프란치 바 브레비세팔라 더블유 티 왕 애 히사오(Coptis chinensis FRANCH var brevisepala W. T. WANG et HSIAO) 등이 있고, 인도 및 네팔산은 콥티스 테타 웰(Coptis teeta WALL), 그리고 일본산은 콥티스 자포니카 마키노 바 디섹타 나카이(Coptis japonical MAKINO var dissecta NAKAI), 콥티스 자포니타 마카노 바 자포니카 사타케(coptis japonica MAKINO var japonica SATAKE)가 있다.

그리고 한국산은 제퍼소미아 두비아 벤탄 에 후커(Jeffersomia dubla BENTHEN et HOOKER) 등을 포함한다.

이와 같은 콥티스 식물 뿌리의 황색 또는 황갈색 물질은 주로 알카로이드 베브베린(Alkaloid berberine)이며 그 밖에 팔마틴(palmatine), 라테오리진(rateorrhizin), 캅티신(captisin), 마그노플로린(magnoflorine) 등이 포함되고 있다.

이 성분들은 담즙 및 췌액분비 촉진작용과 동맥경화에 대한 예방효과 그리고 항염작용 등이 인정되고 있다. 따라서 콥티스식물은 임상적으로 소염성 고미건위 및 진정약으로 충혈 및 염증에 응용되고 있다. 이하 본 발명을 설명한다. 본 발명은 리시니 세멘 식물을 탈지한 전분질(Farinaceous)과 콥티스속 식물의 뿌리를 일정 비율 혼합하여 추출한 항 종양 효과를 갖는 추출물로서 종양, 특히 암증식 억제작용이 양호한 항암 치료제이다.

이와 같은 본 발명에 사용되는 리시너스 콤뮤너스 엘과 콥티스속 식물뿌리를 혼합하여 추출하지 않고 하나의 식물 만을 추출한 추출물 만을 사용하는 경우 항암효과는 있으나 독성이 크므로 약제로 사용하기는 바람직하지 않다. 이와같이 본 발명은 상기의 두식물을 혼합 추출하여 사용하는 데 특징이 있다.

본 발명품은 바람직하기로는 리시니 세멘 식물; 콥티스 식물의 혼합 조성비가 2:5-5:2의 비율로 이루어지며, 더욱 바람직하게는 4:5-5:4 비율로 혼합되며, 이런 추출물 중 독성을 갖는 단백 리신(ricin) 및 독성 알카로이드 리시닌(alkaloid ricinine)은 다음에서 설명되는 제1도의 공정 중 분해 제거되어 이루어진다.

제1도는 본 발명품에 대한 추출 공정도로서 이에 따라 설명한다. 본 발명은 리시너스 콤뮤니스 엘을 탈지한 전분질과 콥티스속 식물 뿌리를 2:5-5:2의 중량 비율로 혼합하고 여기에 지방산의 에스테르 중 1종 이상의 유기 용매를 사용하되 바람직하기로는 클로로포름(chloroform)이나 헥산(hexane)용매를 가하여 20-25℃의 실온에서 20-25시간 교반하면서 용출하고 상기 용출액을 반복하여 감압여과 분리하여 잔사를 얻는 공정과, 이 잔사를 건조하여 상기 유기 용매를 제거한 다음 여기에 증류수 약 5000㎖를 넣고, 100℃에서 3-4시간 동안 가열 추출하는 공정과, 이 추출액을 1500㎖가 될 때까지 감압하여 농축하고 이 농축액을 증기압으로 포화시켜서 생긴 침전물을 제거하는 공정과, 이 추출여액에 다시 클로로포름등의 유기 용매를 넣고 진탕하여, 분리시켜 클로로포름층은 제거하고, 남은 수용액층에 헥산을 가해 기름성분을 모두 헥산층으로 이행시켜 수용액층 만을 분취하여 유기용매를 제거하는 공정과, 이렇게 분취한 수용액층을 탈크로 정제하는 공정과, 이어서 감압여과하여 여액을 얻고, 이 여액을 막 여과(membrane filter)장치로 여과한후 동결 건조하여 황갈색 분말을 얻는 공정으로 이루어진다.

상기 제조 공정 중에서 이용되는 유기용매는 지방족, 방향족 알코올, 탄소수가 1-8인 동종 또는 이종 할로겐을 1-6개 포함한 할로겐(F,Cl,Br,I) 탄화수소, 메틸 또는 에틸, 프로필, 부틸 및 아밀을 포함한 지방산의 에스테르, 초산 에스테르, 탄소수가 1-8개의 지방족 또는 방향족, 방향족 원자단을 가진 케톤, 지방족 또는 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 사용할 수 있다. 상기와 같은 전공정을 통하여 독성을 갖는 단백질 리신(ricin)과 알카로이드 리신(alkaloid ricinine)이 제거된다.

이와같은 제조방법에 의해 얻어진 추출물은 사람에게 투여 가능한 제제의 형태로 만들어 투여할 수 있으며 이때는 바람직하기로는 증류수나 생리 식염수에 용해하여 주사제로서 사용할 수 있다.

이와같이 얻어진 추출물은 정상세포에 대해서는 무해함과 동시에 종양세포를 선택적으로 억제작용을 발휘하는 기전을 가진다. 이하 실시예를 통하여 설명한다.

[실시예 1]

리시너스 콤뮤니스 엘(Ricinus Communis L)을 탈지한 전분질 200g과 콥티스 차이넨시스 프란치(Coptis chinensis FRANCH) 뿌리 200g으로 조성되는 혼합물을 분쇄한 후 헥산(hexan) 및 클로로포름(CHCl₃) 1:1의 혼합 유기 용매 1000㎖를 가하여, 20-30시간 동안을 실온에서 교반한 다음에, 정치하고, 이를 감압여과하여 유기용매를 제거한다. 남은 잔사를 어두운 곳에서 풍건하여, 용매를 완전히 날려 버린다. 이렇게 해서 얻은 잔사에 5000㎖의 증류수를 넣고, 100℃에서 3-4시간 동안 추출하고, 추출액은 다른 용기에 옮겨놓고, 재추출하기 위하여 증류수 3000㎖를 넣고, 같은 방법에 의해 추출한다.

추출액은 합하여, 전량이 1500㎖가 되도록 감압 농축시킨 다음에, 이 농축액을 121℃, 20psi의 증기압에 30분 동안 포화시킨다.

이때 생성된 침전물을 원심 분리하여 제거하고, 여액은 분획 누루장치에서 클로로포름(CHCl₃) 500㎖를 가하여 진탕한 후 클로로포름(CHCl₃)층은 따라내고 다시 클로로포름(CHCl₃) 500㎖를 넣고 반복용출하여 클로로포름(CHCl₃)를 따라낸다. 남은 수용액에 다시 헥산(hexan) 300㎖을 넣고, 흔들어 기름성분을 모두 헥산층으로 이행시키고 수용층 만을 따라내어 환류 냉각장치에서 유기용매를 회수한다. 이런 공정에서 얻은 수용액은 다시 증기압에서 포화시켜서 생긴 침전물을 원심분리하여 제거하고, 여액은 탈크로 정제한 다음에 감압여과 하고 동결 건조하여 황갈색 분말을 약 40g 얻었다.

[실시예 2]

실시예 1의 잔사에 증류수 5000㎖을 놓고, 80-90℃의 항온에서 10-15시간 동안 추출한다. 추출액은 실시예 1에서와 같은 방법에 의해 실시한 결과에서도 약 40g의 황갈색 분말을 얻었다.

[실시예 3]

리치너스 콤뮤니스 엘(Ricinus Communis L)를 탈지한 200g과 콥티스 자포니카 마키노(Coptis japonica MAKINO) 뿌리 200g으로 조성되는 혼합물을 분쇄한 후, 실시예 1에서 같은 방법에 의해 실시한 결과에서도 황갈색분말 36g을 얻었다.

[실시예 4]

생체실험 및 시험관내 실험에서 항암효과를 나타낸 실시 예로서, 본 발명품은 정상 세포에는 하등의 영향을 주지않고, 종양세포를 선택적으로 저해하는 항암작용을 발휘하는 효과, 즉 종양세포의 축소 또는 관해효과를 월등하게 발휘한다.

본 발명품의 항암효과를 측정하기 위하여 생체실험으로 마우스의 사르코마-180 종양세포(Sarcoma 180, ATCC : TIB 66, 이하 S-180이라함), 에르리히 복수 간암세포(Ehrilich-cettre Ascites, ATCC CCL 77 이하 EAC라 함), L1210, P388등의 백혈병 종양세포를 이식하고, 시험관내 실험으로서는 마우스 골수종양 세포 Sp2/0-Ag(ATCC : CRL 1581), 사람의 임파종 Raji, daudi, 사람의 유방암 Hs-587T, 사람의 간암 HE P-G2, HEP-3B, 사람의 백혈병 HL-60, 마우스의 백혈병 L1210, P388, L5178Y, 사람의 폐암 3LL등의 종양세포를 실험하여 종양 치유 및 연명효과를 관찰하였든 바 아래 실험과 같이 탁월한 효과를 나타냈다.

[암세포에 대한 실험관내실험]

본 실험을 위해 사용한 암 세포주는 미국 NCI(national cancer institute)에서 추천한 것으로 Sp2/0-Ag(ATCC : CRL 1571), Raji, Hs-587T, HEP-G2, HEP-3B, HL-60, L1210, P388, L5178Y, 3LL, Daudi 등의 사람과 마우스의 종양세포이다. 배양액은 ATCC에 따라 Hs-587T는 IMDM을 사용했으며, 나머지는 RPMI-1640(10% FBS)를 사용했고 각 세포의 선형 성장 조사 결과에 따라 96 well에 접종하여 본 발명품을 3, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025㎎/㎖씩 첨가하여 2일 후 세포의 생존율을 세포내 미토콘드리아의 탈수소효소 측정을 이용한 MTT 방법으로 수행하였다.

그 결과는 제4도 및 제5도에 나타냈다. 위의 결과를 종합적으로 볼때 본 발명품의 50% 유효량(ED₅₀)은 약 0.05㎎/㎖이었다. 또한 투여량 0.07㎎/㎖을 넘으면 현저한 생존율의 감소를 볼 수 있다.

이와 같은 현상은 투여량에 비례되고 있으며, 세포에 따른 특이성을 보여준다. 즉, Raji, 3LL, Hs-587T, HL-60, P388, L5178Y 세포에 더 좋은 효과를 나타내는 것으로 보아 임파종, 폐암, 유방암, 백혈병 등의 암종에 본 발명품이 아주 유효한 것임을 알 수 있다.

[본 발명품의 유효 스펙트럼 실험]

본 발명품의 항암효과 및 독성에 대한 실험 약리학적 기초를 통하여 생물반응과 약용 용량과의 관계를 이용, 정량적 비교를 하기위하여 항종양 스펙트럼 실험을 행하였다. 결절성 고형 종양세포인 S-180과 Ehrlich를 각각 1×10⁷개씩 마우스 후족 서경부의 피하에 주입시키고, 본 발명품을 농도별로 30-250㎎/㎏을 투여하여 치료를 개시하였다.

그 결과는 표 1과 제8도에 나타난 바와 같이 최저 50-110㎎/㎏에서 항 종양효과를 나타냈고, 그의 최대 유효용량은 140-180㎎/㎖이었으며, 최적 유효량은 110-140㎎/㎖이었다.

[표 1]

제암 효과에 대한 유효량

비고 : +(30%), ++(50%), +++(70%)

◎(유효량), ●(최적 유효량)

[S-180, Ehrlich 고형암에 대한 실험]

S-180, Ehrlich 암세포 1×10⁷개씩을 DDY계 마우스(♂, 21±1g)의 후족 서경부피하에 주입시키고 그후 24시간, 7일 부터 각각 치료를 개시했다. 치료방법은 125㎎/㎏을 1일 1회씩 60일간 계속해서 복강내 주사를 했으며, 그 결과는 제2도를 비롯한 제3도, 7-10도 및 표 2와 같은 효과를 보았다.

표와 그림에서 보는 바와 같이 대조군은 이식 후 급격히 증식하고 증대되어 암시되는데 반하여, 치료군은 종양으로서의 증식이 대체로 억제되면서 이식 30일 후부터 점진적으로 축소, 퇴축되어가는 효과를 나타내었다.

즉, 제8도에 나타난 바와 같이 종양 이식 후 60일간의 치료기간에 나타난 대조군의 증식된 종양의 크기는 직경이 32㎜(992㎟)로 증대되었는데 비하여, 치료군은 직경 8㎜(56㎟)이내의 퇴축된 효과를 보였다.

그리고 도표로는 제시하지 않았지만, 증식된 종양의 무게에 있어서도 대조군은 평균 13g이나 증식되었는데 반하여, 치료군은 불과 4g이내로 퇴축된 치료효과를 볼 수 있었다.

본 실험의 항암효과에 대한 판정은 제2도 및 제3도에 나타난 바와 같이 60일까지 75% 정도의 제암효과를 나타내었고 그 후 계속 투여시 80% 이상의 효과를 볼 수 있었다. 그리고 본래의 수명(2-2.5년)을 다하는 완치율은 30% 이상이나 되었다.

[표 2]

결절성 종양에 대한 항암효과 판정(본발명품)

[유암 F3A에 대한 치료실험]

DBA/2계 마우스(♂, 21±1g)에 F3A 유암세포 1×10⁷개씩을 복강 내 주사하였으며, 치료는 125㎎/㎏을 1일 1회씩 24시간 후부터 14회 투여한다. 그 다음날 복강 내의 복수를 모두 채취하여 원심분리법으로 종양세포의 용적을 구한다.

그리하여 대조군에 대한 치료군의 종양세포 용적비를 구해 종양 성장률을 계산하고 그에 따른 제암효과를 판정한다. 그 결과로는 표 3과 같이 71%정도의 효과를 보았다.

[표 3]

유암 F3A에 대한 제암효과

[백혈병 L1210에 대한 실험]

L1210, P388 종양 세포주는 치사률이 극히 높다. 따라서 치료군이 대조군에 비해서 130% 이상의 연명효과가 관찰되면, 일단 유효한 종양치료 약물로 판정한다.

L1210, P388, 종양실험은 CDF1 마우스(♂, 21±1g)에 각각 1×10⁵, 1±10⁶개씩을 복강 내 주입시켜 급성 백혈병을 발증시킨다.

여기에 대조군과 본 발명품군을 나누어 실험하되, 신물질은 24시간 후부터 1일 1회씩 12회 복강 내 주사한다. 결과는 본 발명품을 처리한 마우스의 생존시간 대를 생리 식염수를 처리한 대조군 마우스의 생존시간에 비례해서 표 4, 5와 같은 결과를 얻었다.

[표 4]

L1210에 대한 연명효과

[표 5]

P388에 대한 연명효과

Claims

리시니 세멘(Ricini semen)의 식물을 탈지한 전분질과 콥티스(Coptis)속 식물의 뿌리로 조성된 혼합물로부터 추출하여 이루어진 항 종양 효과를 갖는 추출 조성물.
제1항에 있어서, 리시니 세멘 전분질과 콥티스속 식물의 뿌리로 부터 추출된 추출물이 2:5-5:2의 비율로 혼합되어 이루어진 항 종양 효과를 갖는 추출조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 추출물중 단백 리신(ricin)과 알카로이드 리시닌(alkaloid ricinine)이 제거되어 이루어진 항종양 효과를 갖는 추출조성물.
제1항에 있어서, 리치니 세멘 식물이 리치너스 콤무니스 엘(Ricinus communis L)로 이루어진 항종양 효과를 갖는 추출 조성물.
제1항에 있어서, 추출물중 베르베린(berberine) 및 베르베린 유도체가 함유된 항 종양효과를 갖는 추출조성물.
제1항에 있어서, 추출물이 주사제, 수액제, 캅셀제, 정제의 형태로 투여하는 데 유용한 항 종양 효과를 갖는 추출 조성물.
제1항 또는 제6항에 있어서, 추출 조성물이 항암제로 사용됨을 특징으로 하는 추출 조성물.
하기 단계들로 이루어지는 항 종양효과를 갖는 추출물의 제조방법 ; (a) 리시니 세멘의 탈지한 전분질과 콥티스속 식물의 뿌리를 2 : 5 내지 5 : 2의 중량비로 혼합하는 단계 ; (b) 얻어지는 혼합물을 유기용매를 사용하여 20 내지 250℃의 온도에서 20 내지 25시간 동안 추출하는 단계 ; (c) 얻어지는 추출물을 반복하여 감압 여과하여 여액과 잔사를 얻는 단계 ; (d) 잔사를 건조하여 잔존 유기용매를 제거한 다음 증류수를 가하는 단계 ; (e) (d) 단계에서 얻어진 수성 현탁액을 100℃에서 3 내지 4시간 동안 가열하여 수성 추출물을 얻는 단계 ; (f) 수성 추출물을 감압 농축하고 이 농축액을 증기압으로 포화시켜 침전물을 제거하는 단계 ; (g) 침전물을 제거된 수성 추출물에 클로로포름을 가하고 진탕한 다음 층분리를 행하는 단계 ; (h) 클로로포름층을 제거하고 남은 수용액층을 헥산을 사용하여 추가로 추출하는 단계 ; (i) (h) 단계에서 얻은 수용액층을 탈크로 정제하고 정제된 수용액층을 감압 여과하여 여액을 얻는 단계 ; (j) 얻어진 여액을 여과한 후 동결하여 황갈색 분말을 얻는 단계.
제8항에 있어서, 리시니 세멘의 탈지한 전분질과 콥티스속 식물의 뿌리의 중량비를 4 : 5 내지 5 : 4인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 리시니 세멘 식물이 리시너스 콤뮤니스 엘인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항, 9항, 10항중 어느 한항의 방법으로 제조된, 단백 리신 및 알카로이드 리시닌이 제거되었고 베르베린 또는 베르베린 유도체를 함유하는 항 종양효과를 갖는 조성물.