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KR950010187B1 - 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법 - Google Patents

요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법 Download PDF

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KR950010187B1
KR950010187B1 KR1019910008959A KR910008959A KR950010187B1 KR 950010187 B1 KR950010187 B1 KR 950010187B1 KR 1019910008959 A KR1019910008959 A KR 1019910008959A KR 910008959 A KR910008959 A KR 910008959A KR 950010187 B1 KR950010187 B1 KR 950010187B1
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food poisoning
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요시나리 시라사끼
데쯔오 오하시
준 다다
시게루 후꾸시마
준이찌 기따
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가부시기가이샤 시마즈세이사구쇼
니시하찌죠 미노루
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Abstract

내용 없음.

Description

요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법
제1도는 실시예 1에서 실시된 균체의 분리방법 및 균체성분의 포집방법의 과정을 나타낸 도면.
제2도는 실시예 1에서 얻어진 전기영동패턴을 나타낸 도면.
제3도는 실시예 2에서 얻어진 전기영동패턴을 나타낸 도면.
제4도는 본 발명의 검사방법에 의한 균체 검사장치의 예시유형을 나타낸 도면.
제5도는 제4도에 도시한 균체 검사장치의 예비처리부를 개괄적으로 나타낸 도면이다.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
1 : 샘플용액 2 및 3 : 시린지
4 : 필터 5 : 용균제
6 : 마개 7 : 수욕
10 : 예비처리용 용기군 11 : 샘플 현탁액
12 : 세척용액 13 : 용균제
14 : 에탄올 15 : 필터
16 : 시린지(Syringe) 17 : 피스톤
18 : 항온실 19 : 계면활성제
20 : PCR 처리용 용기 21 : 인큐베이트
22 : 모세관역 전기영동(CZE : Capillary Zone electrophoresis)
본 발명은 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 요로감염유발 미생물을 포함하는 뇨샘플 및 식중독 유발 미생물을 포함하는 대변현탁샘플 등과 같은 다양한 샘플로부터 병원성 미생물을 모아 추출하고 균체 성분에서 DNA를 검출하는 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법에 관한 것이다.
임상 진단 및 연구분야에 생물학적 샘플비의 미생물 종류를 식별하거나 그 구성성분을 분석하기 위하여 다양한 방법으로 한천플레이트에 병원균을 배양하는 것은 통상의 관행으로 실시되어 왔다.
불용성 고형물 예컨대 음식 잔류물 및 장내 박리세포등을 함유하는 대변샘플 및 기타 생물학적 샘플의 식중독유발 미생물을 파쇄하거나 또는 뇨샘플의 요로감염유발 미생물을 파쇄함으로써 균체성분을 얻는 종래의 방법에서는 샘플현탁액을 몇일동안 배지에서 배양하고 얻어진 콜로니를 모아서 원심분리하여 분리하고 균체세포를 회수한다. 회수한 세포를 프로테이나아제 K와 같은 효소, 도데실황산나트륨과 같은 계면활성제 또는 수산화나트륨과 같은 알칼리로 파쇄하거나 초음파처리 또는 분쇄기와 같은 물리적 파쇄수단에 의하여 파쇄하는 것으로 균체성분을 얻는다.
균체 콜로니의 분리배양 및 동정하는 방법으로는 다음과 같은 것들이 있다 ; 특정 항생물질을 함유하는 한천 플레이트 또는 기타 배지에 상기에서 언급한 샘플을 뿌리고 생성된 콜로니를 분리한 후 또 다른 항생물질을 함유하는 배지에 다시 뿌려 분리하는 과정을 수차례 반복하는 균체 콜로니 분리배양법, 표적 균체에 고유 항체를 라텍스비드에 고정하여 상기 샘플에 첨가한 후 비드표면의 항체가 균체를 인식함으로써 비드가 응집하는 것을 이용하여 균체를 동정하는 라텍스 응집법, 제1항체를 폴리에틸렌 플라스틱 비드에 결합시키고 생성접합체를 균체 세포와 반응시킴으로써 항원-항체반응에 의하여 제1항체와 결합하는 균체 세포와 결합하지 않는 균체 세포를 분리하고 효소로 표지된 제2항체 또는 형광물질과 반응시켜 B/F분리 후 효소의 활성 또는 형광강도를 측정하는 것으로 동정하는 샌드위치-항체법, 상기 콜로니를 멤브레인 필터에 전이시키고 파쇄한 후 특정 DNA 단편을 효소 또는 방사선물질로 표지하여 제조한 DNA 프로브와 반응시킴으로써 DNA 프로브와 콜로니 DNA의 상보적 염기배열사이의 수소결합의 형성에 근거하여 유전자 레벨에서 표적 균체를 검출하는 DNA 프로브 방법.
그러나 균체 성분을 검출하는 상술한 방법들은 세포배양에 많은 시간을 요하기 때문에 균체 성분을 신속히 얻을 수 없다는 단점을 가진다. 특히, 예컨대 요로감염 또는 식중독을 유발하는 미생물의 경우에는 신속히 동정한 후 항생제를 투여하는 것이 병원균에 대한 예방 및 치료에 상당한 효과를 낼 수 있다. 또한 연구 목적으로 흔히 이용되어 온 핵산 정제방법은 원심분리기와 같은 고가의 장치 및 페놀과 클로로포름과 같은 위험한 유기용매를 필요로 하므로 실제 임상검사 현장에서 사용하기가 곤란하다.
본 발명의 목적은 병원균 및 기타 다양한 균체를 용이하고 안전하게 저렴한 비용으로 동정할 수 있는 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법을 제공하는 것이다.
따라서 본 발명 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법은 균체를 함유하는 현탁액으로부터 필터를 사용하여 균체성분을 모으고 이 균체성분을 포함하는 용액을 폴리메라아제 연쇄반응법에 작용시켜 표적 요로감염균 및 식중독균의 DNA를 증폭하고 증폭된 DNA를 사용하여 상기 현탁액의 표적 요로감염균 및 식중독균을 검출하는 것으로 이루어진다.
본 발명 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검출방법을 실행하기 위한 요로감염균 및 식중독균 검출장치는 요로감염균 및 식중독균을 함유하는 현탁액으로부터 필터를 사용하여 균체성분을 모으는 장치, 모은 균체성분을 함유하는 용액에서 DNA를 증폭하는 장치 및 증폭된 DNA를 검출하는 장치로 구성된다. 구체적으로 본 발명의 장치는 필터가 장착된 시린지(Syringe)에 샘플용액을 흡입하는 장치, 상기 시린지를 처리단계에 옮겨 상기 샘플액으로부터 균체성분에 포함된 DNA를 증폭하는 장치 및 증폭 DNA를 검출하는 장치로 구성된다.
본 발명 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법에 있어서, 먼저 요로감염균 및 식중독균을 함유하는 현탁액으로부터 필터를 사용하여 균체성분을 모은다. 이 과정은 필터홀더에 현탁액을 통과시켜 필터홀더에 있는 일단의 필터에 의하여 현탁액으로부터 균체를 분리하고 그 다음 용균제를 필터에 통과시켜 예컨대 요로감염을 유발하는 요로감염균의 검사에 있어서는 뇨샘플과 같이 이물질의 함량이 낮은 샘플에서 균체성분을 분리한다. 얻어진 균체성분에 대하여 표준방법에 의한 폴리메라아제 연쇄반응법을 이용하여 요로감염균 및 식중독균 검사벙법에 신속성과 용이성을 제공한다. 또한 결과의 신속한 판단으로 표적 요로감염균 및 식중독균에 특이적으로 작용하는 항생물질을 투여하는 것이 가능하게 된다.
대변등으로부터 예컨대 식중독균을 검출하기 위하여 음식잔류물 또는 장내 박리세포와 같은 불용성 고형물을 함유하는 대변 기타 샘플의 경우에 있어서 본 발명 요로감염균과 식중독균 검사방법은 이들 불용성 고형물의 분리단계와 같은 예비처리과정을 필요로 한다.
예비처리과정에 있어서 먼저 요로감염균과 식중독균을 함유하는 거친 현탁액을 제1필터에 통과시켜 불용성 고형물을 분리한다. 그 다음, 상기의 뇨 및 기타 샘플의 경우와는 달리, 여과액에 용균제를 첨가하여 균체성분을 유리시킨 후, 제2필터를 통과시켜 불용성 고형물의 세립입자를 제거한다. 이렇게 하여 얻어진 여과액에 핵산성분 응집제를 첨가하여 핵산성분을 침전시킨 후, 제3필터를 통과시켜 여과함으로써 핵산성분 즉 제3필터내에 균체성분을 모은다. 상기와 같은 방법으로 균체성분을 필터에서 모은 후 70% 에탄올 수용액으로 필터를 세정하고 다시 99% 에탄올 수용액으로 세정한 다음 물 또는 계면활성제를 제3필터안에 유입시켜 핵산성분을 용출시킨다.
상기와 같은 표준방법에 의하여 용출된 핵산성분에 대하여 폴리메라아제 연쇄반응을 사용하기 때문에 본 발명 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물 검사벙법에 신속성과 용이성을 제공한다.
PCR에 사용된 프라이머(Primer)는 병원성 표적 요로감염균 및 식중독균과 결합가능한 올리고뉴클레오티드이다. 증폭된 DNA를 검출하는 방법은 DNA 검출수단에 한정되지 않는다 ; 예컨대 에티디움 브로미드 염색법, 화학 형광법과 같은 형광강도에 의하거나 아가로스켈 또는 모세관역 전기영동분리 후 효소활성을 측정하여 검출할 수도 있다.
본 발명 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법을 자동적으로 실행하는 장치의 예시유형을 제4도 및 제5도에 개략적으로 도시하였다.
이 장치에는 개방된 하부에 필터가 장착된 시린지(16)가 있으며 시린지 아래에 배열되어 있는 일단의 예비처리용 용기군(10)은 시린지(16) 끝부분이 용기에 들어갈때까지는 상향으로 이동하여 있고, 시린지(16)내의 피스톤(17)이 용기의 샘플현탁액(11)을 시린지(16)내로 흡입한 다음에 예비처리용 용기군(10)은 출발위치로 하향하여 돌아온다.
이 장치의 필터(15)는 두 종류의 유리섬유 필터로 구성된다.
일정시간(예컨대 한 단계에 5분)동안 이 상태를 유지한 후 시린지를 처리단계의 결합위치로 이동시키고 이전의 단계에서 흡입한 샘플현탁액(11)을 일단의 용기(10)의 상향이동 및 시린지(16)내의 피스톤(17)의 작용으로 시린지에서 배출시킨 다음 세척용액(12)을 흡입하여 필터(15)에 모인 균체를 세척한다.
일단의 용기(10)는 샘플현탁액(11)이 담긴 용기, 세척용액(12)이 담긴 용기, 용균제(13)가 담긴 용기, 에탄올 침전에서 에탄올(14)이 담긴 용기 및 계면활성제(19)가 담긴 용기 등의 균체성분을 모으고 핵산을 얻기 위하여 필요한 각각의 처리용액을 담고 있는 다수의 용기들이 처리순서에 따라 배열되어 구성된다.
이와 같은 일련의 단계에 의하여 시린지(16)내에 샘플현탁액(11)을 흡입하여 균체를 세척하고, 필터(15)에 모인 균체를 파쇄처리하여 핵산성분을 얻는 등의 기타 처리과정의 자동화가 가능하게 된다.
시린지(16)은 항온실(18)을 통과하여 각 단계의 적정온도 예컨대 파쇄처리과정은 37℃, 60℃ 또는 95℃, 에탄올 침전과정은 0℃ 및 DNA 검출과정은 60℃에서 유지된다.
시린지(16)의 이동은 예컨대 벨트컨베이어 등에 의하여 이루어진다.
이와같은 과정을 통하여 얻어진 DNA를 PCR 처리용 용기(20)에 넣고 이 DNA의 상보적인 염기배열과 결합하는 두 올리고뉴클레오티드 프라이머, Taq 폴리메라아제 및 데옥시뉴클레오티드 삼인산(dATP, dCTP 및 dTTP)등의 폴리메라아제 연쇄반응에 필요한 성분들을 함께 첨가한다.
PCR 처리용 용기(20)는 인큐베이트(21)를 통과하면서 PCR의 각 반응에 적당한 온도로 조절된다. 특히 본 발명의 PCR 처리에서는 예컨대 열변성 반응을 위하여 94℃ 온도로 조절된 인큐베이트, 어닐링 반응을 위하여 37℃ 온도로 조절된 인큐베이트 및 프라이머 신장반응을 위하여 55℃ 온도로 조절된 인큐베이트 등 3개의 인큐베이트(21)가 배열되어 있다.
각 인큐베이트로의 용기의 이동은 예컨대 벨트컨베이어 등을 이용하여 단계적으로 이루어진다. 구체적으로 용기는 일정시간(예컨대 각 단계에 5분)동안 유지된 후 상기 벨트켄베이어와 같은 장치에 의하여 PCR단계의 결합위치로 이동된다.
한편, 인큐베이트(21)는 PCR 단계의 일단의 용기 아래에 배열되어 있으며 여기서 일단의 용기를 구성하는 각 용기는 벨트컨베이어 등의 이동수단에 의하여 단계적으로 이동되는 상기에서 언급한 PCR 처리용 용기(20)를 의미한다. 각 인큐베이트는 차례로 교환되어 PCR 반응이 열변성 반응, 어닐링 반응 및 프라이머 신장반응의 순서대로 실시될 수 있게 된다. 이와 같은 인큐베이트의 이동은 예컨대 카트(cart)등에 의해 이루어진다.
그 다음 이와 같이 증폭된 DNA에 대하여 모세관역 전기영동(CZE)(22)과 같은 전기영동장치에 의한 검출과정을 실행한다.
본 발명의 방법은 뇨샘플 및 불순물 함량이 매우 높은 생물학적 샘플 예컨대 대변 샘플로부터 DNA-함유 균체 성분을 신속하고, 안전하고, 용이하고 저렴한 비용으로 얻게하며 폴리메라아제 연쇄반응에 의해 균체 검사벙법에 편리함을 제공하므로 5시간내의 짧은 시간동안에 병원성 표적균체의 동정을 가능하게 한다.
[실시예]
이하에서 다음 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 예시하고자 하며 본 발명은 이들 실시예에 결코 한정적이지 않음을 명시하는 바이다.
[실시예 1]
(1) 균체의 분리과정
표적균체 105세포를 사람의 뇨 1ml에 현탁하여 샘플현탁액을 만들었다. 표적균체는 Escherichia coli ATCC 23519 또는 Proteus vulgaris JCM 1668이었다.
얻어진 샘플현탁액을 여과과정에 작용시켰다. 먼저 샘플현탁액(1)을 제1도에서와 같이 시린지(2)에 넣어 시린지(2)에 연결된 필터(4)를 통과시켜 여과하였다. 그 다음에 50mM 인산염 완충용액 pH 7.0(이하 PB로 언급함) 5ml로 필터를 세척하였다.
(2) 균체성분 포집과정
다음 용균제(5)(1mg/ml 프로테이나아제 K, 0.13% SDS 및 0.13% SLS를 PB에 용해한 용액)를 시린지(3)에 넣고 시린지를 필터(4)(MILLEX-PE 0.8㎛ 필터유니트, Millipore에서 생산)에 연결하였다. 용균제(5)를 시린지(3)의 작용으로 필터(4)에 도입하였다. 마개(6)로 막은 필터와 함께 10분간 60℃ 수욕에서 배양한 후 시린지(3)를 작용시켜 용균제(5)를 회수하였다.
얻어진 용출액 500㎕를 1.5-ml 마이크로테스트 튜브에 전이시키고 같은 양의 500mM KCI 수용액을 첨가하였다. 원심분리에 의하여 침전단편을 제거하여 용출물을 얻었다.
얻어진 용출물을 10분간 95℃에서 배양하여 프로테이나아제 K를 불활성시켰다.
(3) DNA 증폭과정
상기의 용출물 5㎕를 특정 목적으로 DNA를 증폭시키는 방법인 폴리메라아제 연쇄반응[PCR 반응, Saiki, P. K.외 다수, Science, 239, 487-491(1988)]에 4시간 동안 작용시켰다.
상기 PCR법은 이하의 조건으로 실시하였다.
항증발제로서 미네랄오일 100㎕를 증류수 26.5㎕, dNTP(각 dNTP 1.25mM) 8㎕, 두 종류의 프라이머 각각 2.5㎕(20㎛), 10배 완충용액(Perkin-Elmer-Cetus) 5㎕ 및 Tag 폴리메라아제(Perkin-Elmer Cetus) 2.5 유니트의 혼합액 50㎕에 첨가하고 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Cetus)에 작용시켰다. 사용한 프라이머는 이미 밝혀진 Escherichia coli 및 Proteus vulgaris를 위한 올리고뉴클레오티드이다. 10배 완충액은 50mM KCI 및 15mM MgCl2를 함유하는 100mM Tris-HCL 완충용액(pH 9.0)이다.
PCR 반응 각각의 온도사이클은 94℃에서의 변성단계 1분, 37℃에서의 어닐링 단계 1분 및 60℃에서의 사슬길이 신장단계 1분을 포함하여 5.7분으로 유지하였으며 이 사이클을 42회 반복하였다.
(4) 검출과정
상기의 PCR-처리용액 20㎕를 에티디움 브로미드를 함유하는 2% 아가로스겔 상에서 100V 전기영동에 35분간 작용시킨 후 겔을 트랜스일루미네이터에 전이시키고 320nm 파장의 UV 광선으로 조사하였다. 그 결과 PCR 반응으로 증폭한 DNA는 형광을 발하였다. 즉석 필름 카메라를 사용하여 이 형광결과를 촬영하였다. 그 결과는 제2도에 나타내었다. 1 및 5 레인은 샘플현탁액과 동일한 방법으로 균체가 없는 뇨를 처리하여 얻은 패턴을 나타낸다. 2 및 6 레인은 Escherichia coli 및 Proteus vulgaris 각각에 본 발명을 실시하여 얻은 패턴을 나타낸다. 3 및 7 레인은 각 박테리아의 양성 대조군으로부터 얻은 패턴을 나타낸다. 4 및 8 레인은 용출물이 없이 PCR에 의하여 얻은 패턴을 나타낸다. M은 제한효소 Hinc로 Φ×174 DNA를 완전 소화하여 얻은 분자량 표(Maker)이며, A, B, C 및 D는 해당 염기쌍의 수를 표시한다.
본 발명의 방법을 Escherichia coli를 함유하는 샘플(뇨)의 현탁액에 실시한 후 얻은 전기영동패턴은 제2도의 2 레인에 도시되어 있다. 결과적으로 띠는 491bp에 나타났다. 이 위치는 동시에 전기영동한 양성대조샘플(제2도의 3레인)의 위치와 동일하기 때문에 Escherichia coli는 특이적으로 검출되었음이 증명되었다.
여기서 언급한 양성 대조샘플은 예컨대 Escherichia coli ATCC 23519를 액체배지에서 순수배양하고 효소 또는 계면활성제로 파쇄한 후 파쇄세포를 페놀 또는 클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 작용시켜 얻은 DNA 용액이다. Proteus vulgaris의 경우에도 동일하게 적용하였다.
양성 대조샘플로부터의 띠와 동일 길이(461bp)의 띠가 나타났다는 사실은 표적균체가 특이적으로 검출되었음을 성공적으로 증명한다.
상기 결과로부터, 본 발명 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사법은 적어도 105의 Escherichia coli 또는 Proteus vulgaris 세포가 뇨 1밀리리터에 함유되었을 경우 5시간내의 짧은 시간안에 용이하고 신속하게 Escherichia coli 또는 Proteus vulgaris를 검출하는 것이 가능함을 분명히 알 수 있다.
제2도의 1레인부터 8레인에 있어서, 검출된 저분자량 DNA 띠는 PCR에 사용한 프라이머의 잔여분 또는 이것으로부터 유래하는 것이다.
[실시예 2]
(1) 균체의 분리과정
사람의 대변 0.4g 및 Bacillus cereus JCM 2152 균주의 106, 107또는 108/그램 분비물을 50mM 인산염완충용액(pH 7.0) 4ml에 현탁하여 샘플현탁액을 제조하였다.
얻어진 샘플현탁액을 여과과정에 작용시켰다. 샘플현탁액을 10-1ml 시린지에 넣고 시린지에 연결된 PP-47필터홀더(Advantech)에 부착된 구멍크기 10㎛의 나일론메쉬를 통과시켜 여과하였다.
(2) 균체성분 포집과정
상기에서 얻어진 여과액에 N-아세틸뮤라미다아제 및 아크로모펩티다아제를 각각 최종 농도 60㎍/ml 및 1㎍/ml로 첨가한 후 10분간 37℃에서 배양하였다. SDS 및 프로테이나아제 K를 각각 최종농도 1% 및 1mg/ml로 첨가한 후 30분간 60℃에서 배양하였다. 10분간 95℃에서 불활성화를 실시하여 프로테이나아제 K를 불활성시켰다.
얻어진 용액에 1/10 양의 2.5M KCI 수용액을 첨가하였다. SDS 성분을 응집시킨 후 용액 2ml를 MILLEX-PF 0.8㎛ 필터유니트 및 MILLEX GV 0.22㎛ 필터유니트에 통과시켜 불용성 단편과 SDS성분을 제거하였다.
얻어진 여과액에 1/10 양의 3M 아세트산 나트륨(pH 5.2) 및 2배량의 99% 냉에탄올을 첨가하였다.
GF/D(유리섬유 필터페이퍼, Whatman에서 생산)를 4mm 직경의 필터홀더(발명자가 제조)에 장착하여 얻어진 용액을 통과시켜 여과하였다.
상기 필터에 25㎕의 0.5% NONIDET P-40 및 0.5% Tween 20 수용액을 1-ml 시린지를 이용하여 유입시켰다. 50℃에서 배양한 후 시린지를 작동시켜 핵산성분을 회수하였다.
(3) DNA 증폭과정
상기의 용출액 5㎕ 또는 이것을 10배 또는 100배 희석한 용액을 폴리메라아제 연쇄반응에 4시간 동안 작용시켰다. PCR 법은 다음의 조건하에서 실시하였다. 항증발제로서 100㎕ 미네랄오일을 증류수 26.5㎕, dNTP(각 dNTP 1.25mM) 8㎕, 두 종류의 프라이머 2.5㎕(20㎛), 10배 완충용액(Perkin-Elmer Cetus) 5㎕ 및 Taq 폴리메라아제(Perkin-Elmer Cetus) 2.5유니트의 혼합액 50㎕에 첨가하고 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Cetus)에 작용시켰다. 10배 완충용액은 500M KCI 및 15mM MgCl2를 함유하는 100mM Tris-HCI 완충용액(pH 9.0)이다.
사용한 프라이머는 Cereus 균에 다음과 같은 특이적인 DNA 염기배열((a)~(e))을 가진다 ;
(a) (5')d-G G T T T A A G T A T T A C A A G C C (3') (SEQ ID No : 1)
(b) (5')d-G C A T A T A C A C C T A A T C G A G C (3') (SEQ ID No : 2)
(c) (5')d-C C A C T A A G T C T T C T T T C G (3') (SEQ ID No : 3)
(d) (5')d-T T C T G T A T G C C C T T T C C C T G (3') (SEQ ID No : 4)
(e) (5')d-A T T T C A G A A G C G C G T A A C G G (3') (SEQ ID No : 5)
모든 프라이머는 자동 DNA 합성기 NS-1(Shimadzu Corporation)을 사용하여 합성하였으며 역상 컬럼을 구비한 고성능 액체크로마토그래피를 이용하여 정제한 것을 사용하였다.
PCR의 각 온도사이클은 94℃에서의 변성과정 1분, 37℃에서의 어닐링 과정 1분 및 60℃에서의 사슬길이 신장과정 1분을 포함하여 5.7분간 지속하였으며 이 사이클은 42회 반복하였다.
(4) 검출과정
상기의 PCR-처리용액 24㎕를 에티디움 브로미드를 함유하는 2% 아가로스 겔상에서 100V 전기영동에 35분간 작용시킨 후 겔을 트랜스일루미네이터에 전이시키고 320nm 파장의 UV 광선으로 조사하였다. 그 결과 PCR 반응으로 증폭한 DNA는 형광을 발하였다. 즉석 필름 카메라를 사용하여 이 형광결과를 촬영하였다. 그 결과는 제3도에 도시하였다. Bacillus cereus를 함유하는 샘플(분비물)의 현탁액에 본 발명의 방법을 실시한 후 얻은 전기영동패턴은 제3도의 1내지 9레인에 도시되어 있다. 1,2 및 3레인은 분비물 그람당 106세포를 함유하는 분비물 현탁액으로 얻어진 패턴을 나타낸다. 4,5 및 6레인은 분비물 그람당 107세포를 함유하는 분비물 현탁액으로 얻어진 패턴을 나타낸다. 7,8 및 9 레인은 분비물 그람당 108세포를 함유하는 분비물 현탁액으로 얻어진 패턴을 나타낸다. 1,4 및 7레인에 도시된 패턴은 원용출액을 PCR에 작용시켜 얻은 것이다. 2,5 및 8레인에 도시된 패턴은 원용출액의 10배 희석액을 PCR에 작용시켜 얻은 것이다. 3,6 및 9 레인에 도시된 패턴은 원용출액의 100배 희석액을 PCR에 작용시켜 얻은 것이다. 10레인은 Bacillus cereus의 양성대조 샘플로 얻은 패턴을 도시한다. M은 제한효소 Hinc로 Φ×174 DNA를 완전 소화하여 얻은 분자량이며 A,B,C 및 D는 해당 염기쌍의 수를 표시한다.
결과로서 띠가 약 232 bp에 나타났다. 이 위치는 동시에 전기영동한 양성 대조샘플의 위치(제3도의 10레인)와 동일한 위치이기 때문에 Bacillus cereus가 특이적으로 검출되었음을 분명히 알 수 있다. 여기서 언급된 양성 대조샘플은 Bacillus cereus(ICM 2152 균주)의 표준균주를 순수배양하고 효소 또는 계면활성제로 파쇄한 후 파쇄세포를 페놀 또는 클로로포름 추출 및 에탄올 침전작용에 작용시켜 얻은 DNA 용액이다.
양성대조는 표적균체인 Bacillus cereus의 정제 DNA를 사용하고 있음에 비하여 기타 실험군에는 분비물을 사용하고 있으며, 분비물 중에는 담즙색소, 혈액 등에서 유래하는 PCR 저해인자군이 포함되어 있다. 따라서 분비물을 사용한 PCR 실험에서는 PCR 저해인자가 적어야 함과 아울러 검출한계 이상의 표적균체가 시료중에 포함되어 있어야 DNA의 검출이 가능하다.
본 실험에서 용출액 원액 및 10배 희석액으로는 표적균체의 DNA를 검출할 수 없었다. 즉 1,2와 4,5 및 7,8 레인에서는 아래측에 DNA 띠가 나타나지 않았다. 이는 PCR 저해인자의 농도가 높고 PCR이 진행되지 않았거나 또는 그때의 저해인자의 농도에 비하여 표적균체의 양이 적었기 때문이라고 생각된다.
분배물중에는 장내균에서 유래된 다종다량의 세균군이 포함되며, 이들은 표적균체의 DNA 양보다 다량으로 시료액중에 혼입되어 있으므로 경우에 따라서는 일부 균체의 DNA 단편과 비특이적인 PCR 반응을 일으킬 수 있다.
현실적으로 분비물중에 있는 세균수를 제어하거나 특정한 균체 DNA만을 배설물에서 추출하는 것이 매우 어렵기 때문에 본 실험의 결과로 나타난 바와 같이 비특이적 반응산물이 검출되지만 표적균체의 검출에 있어서의 표적균체의 DNA 띠가 정확하게 검출된다.
상기의 결과로부터 본 발명 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법이 적어도 108의 Bacillus cereus 세포가 분비물 1 그람에 함유된 경우에 5시간내의 짧은 시간동안 신속하고 용이하게 Bacillus cereus를 검출하는 것이 가능함을 분명히 알 수 있다.
배열리스트
SEQ ID NO : 1
배열길이 : 19염기
배열종류 : 핵산
가닥형 : 단일가닥
형태 : 선형
분자종류 : 게놈 DNA
가정 : 없음
안티센스 : 없음
원출처 :
유기체 : Bacillus cereus
특징 :
동정방법 : S
배열 : G G T T T A A G T A T T A C A A G C C
SEQ ID NO : 2
배열길이 : 20염기
배열종류 : 핵산
가닥형 : 단일가닥
형태 : 선형
분자종류 : 게놈 DNA
가정 : 없음
안티센스 : 없음
원출처 :
유기체 : Bacillus cereus
특징 :
동정방법 : S
배열 : G C A T A T A C A C C T A A T C C A G C
SEQ ID NO : 3
배열길이 : 18염기
배열종류 : 핵산
가닥형 : 단일가닥
형태 : 선형
분자종류 : 게놈 DNA
가정 : 없음
안티센스 : 없음
원출처 :
유기체 : Bacillus cereus
특징 :
동정방법 : S
배열 : C C A C T A A G T G T T G T T T G G
SEQ ID NO : 4
배열길이 : 20염기
배열종류 : 핵산
가닥형 : 단일가닥
형태 : 선형
분자종류 : 게놈 DNA
가정 : 없음
안티센스 : 없음
원출처 :
유기체 : Bacillus cereus
특징 :
동정방법 : S
배열 : T T C T G T A T G C C C T T T C C C T G
SEQ ID NO : 5
배열길이 : 20염기
배열종류 : 핵산
가닥형 : 단일가닥
형태 : 선형
분자종류 : 게놈 DNA
가정 : 없음
안티센스 : 없음
원출처 :
유기체 : Bacillus cereus
특징 :
동정방법 : S
배열 : A T T T C A G A A G C G C G T A A C G G

Claims (3)

  1. 요로감염균 및 식중독균을 함유하는 현탁액으로부터 필터를 사용하여 균체성분을 모으고 이 균체성분에 포함된 DNA를 폴리메라아제 연쇄반응(polymerase chain reaction)에 의하여 증폭하고 이 증폭한 DNA를 검출하는 단계로 이루어져 샘플에 표적균체가 존재하는지의 여부를 결정하는 것을 특징으로 하는 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법.
  2. 제1항에 있어서, 샘플에 존재하는 불용성 고형물을 분리하는 예비처리과정이 더 포함된 것을 특징으로 하는 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 필터가 샘플에 존재하는 균체를 포집하기 위한 두 종류의 유리섬유 필터로 구성된 것을 특징으로 하는 요로감염유발 미생물과 식중독유발 미생물의 검사방법.
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