KR950000303B1 - 조직 플라스미노겐 활성화 인자(tpa) 상사체를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

조직 플라스미노겐 활성화 인자(TPA) 상사체를 제조하는 방법

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자(TPA) 상사체를 기술한다. 그 상사체들은 재배열되거나, 삭제되거나, 첨가되거나 또는 이들이 조합된 자연 영역 지역들을 갖는 TPA-유사 분자들이다. 그 상사체들은 재조합 데옥시리보핵산(DNA)발현의 생성물이고 여기에 기술되어 있다. 덧붙여, 본 발명은 상기한 TPA-암호합 DNA서열을 포함하는 복제 및 발현 플라스미드와 적절한 플라스미드로 형질전환된 후 TPA상사체를 발현시킬 수 있는 적당한 숙주 미생물들을 기술한다.

[배경]

TPA는 혈병이 형성될 때 이들을 용해시키는 것을 도움으로써 혈액 혈병 치료에 치료학적 가치를 갖는다. 혈전 용해는 피브린 혈병 용해의 과정이다. 그 목적을 위해서 세린 프로테아제 플라스민이 그 불화성효소원인 플라스미노겐으로부터 형성된다. 플라스미노겐의 활성화는 플라스미노겐 활성화 인자로 불리는 세린 프로테아제 군에 의한 단백질 분해적 절단을 통해 성취될 수 있다. 이 활성화인자들은 대부분의 체액들속에 존재하고 플라스미노겐의 플라스민으로의 활성화를 개시시킨다. 이는 소량의 플라스미노겐 활성화인자가 다량의 플라스미노겐의 활성화를 개시시킬 수 있는 다발촉진(cascade)을 형성한다. 생체내에서, 플라스미노겐 활성인자는 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키고 있는 피브린 혈병을 파괴시키기 위해 작용한다. 혈병 분해에 생리학적으로 중요한 플라스미노겐 활성화 인자는 TPA이다.

TPA는 혈관 내피 세포들에 의해 생산되는 분자량이 거의 66,000 달톤인 세린 프로테아제이다. 이것은 글리코실화되고 그의 유일하게 알려진 단백질 기질은 플라스미노겐이다. TPA는 5 개의 영역을 갖는다 : 피브로넥틴 핑거 영역(fingerdomain)(F), 성장 인자 영역(greoth factor domain(G), 클린글 1 영역(kringle 1 domain)(K1)클린글 2 영역(kringle 2 domain)(K2) 및 활성 자리 영역(active site dowain)(A). 이들 영역들중 하나 또는 그 이상이 TPA의 유일한 피브린 결합 활성에 기여한다.

그의 피브린 친화성외에도, 플라스미노겐의 TPA활성화는 피브린 존재시 증진된다. 유로키나제 또는 스트렙토키나제와 같은 다른 혈병 용해 약제는 피브린 혈병에 대한 특이성을 갖지 않기 때문에 이 성질들로 TPA는 유용한 치료제가 된다.

영역들을 조작함으로, 피브린에 대한 자연효소의 친화성을 개선하고 생체내에서의 그 반감기를 연장시킬 수 있다. 더욱 특히, 크린글 2 또는 핑거 영역의 중복은 피브린 친화성을 증진시킨다. 성장 인자 영역을 제거하는 것도 생체내 반감기를 증진시킬 것이며 피브린 친화성을 증가시키기 위해서 핑거 지역 영역을 크린글 지역 1 또는 2 다음으로 놓을 수 있다.

[정보 문헌]

인간 TPA를 정제하여 그 물리적 성질을 연구 하였다. Rijken일행의 “배양물내의 인간 흑색종 세포들에 의해 분비된 플라스미노겐 활성화인자의 정제 및 확인” J. Biol.chem., vol.256, no. 13, pp.7035-41(1981. 7. 10) 인간 TPA의 실험적양은 인간 흑색종 세포들의 배지로부터 얻을 수 있다. Kluft, C. 일행의 생물공학 공정 진보에 있어서 “인간 흑색종 세포들로부터의 외래(조직-유형) 플라스미노겐 활성화 인자의 대규모 생산”, Eds. Mizrahi, A. 및 wezel, A.L.2 : 97-110(1983). 인간 TPA의 생활성이 연구되었고 이는 생명을 위협하는 혈액 혈병을 용해시키는 그 능력을 통해서 동물 모델 및 인간에 치료학적 유용성을 갖는다는 것을 설명하였다. Korninger일행의 “대퇴정맥 혈전증이 있는 개에 있어서 인간 외래(조직-유형)플라스미노겐 활성화인자에 대한 혈전분해”, J.Clin. Invest., vol.69, pp.573-580(1982.3); weimar일행의 “외래(조직-유형)플라스미노겐 활성화 인자 투여에 의한 장대퇴골 혈전의 특이적 용해”, The Lancet, pp. 1018-20(1987. 11. 7) ; 및 Van De Werf, F. 일행의 “발전적 심근성 경색증이 있는 환자에 있어서 조직-유형 플라스미노겐 활성화 인자에 의한 관상 혈전용해”, J. of N. Eng. Med., 310 : 609-613(1984) TPA의 반감기는 2-3 분으로 평가되고 실행할 수 있는 경우 이는 치료제로서 사용하는 것을 불편하게 한다. collen, D, 일행의 “조직-유형 플라스미노겐 활성화인자를 갖는 혈병-선택적 관상 혈전용해”, Science, 220 1181-1183(1983).

TPA의 효소 역학이 연구되었다. Rijken일행의 “1-사슬 및 2-사슬 인간 외래(조직-유형)플라스미노겐 활성화인자의 피브린 용해 성질”, J. Biol. chem., vol. 257 : 2920-2925(1982). 다른 동물들의 혈액 혈병대 인간 혈액 혈병의 인간 TPA의 결합 및 피브린 용해성 친화력이 알려졌다. korninger일행의 “시험관내의 여러 동물종들 및 인간 혈액내의 인간 외래(조직-유형) 플라스미노겐 활성화인자의 특이적 피브린 용해 효과에 대한 연구”, Thrombos, Haemostas., 46(2) : 561-565(1981). 피브린 용해 활성 및 친화력을 갖는 영역들의 구조적 관계도 기술되었다. Banyai, L. 일해의 피브로넥틴 및 조직-유형 플라스미노겐 활성화인자의 피브린-결합 구조의 보통의 진화적 근원, FEBS Lett. 163(1) : 37-41(1983) 및 Ny, T. 일행의 인간의 조직-유형 플라스미노겐 활성화인자 유전자의 구조 : 관능적이고 구조적인 영역들에 대한 인트론 및 엑손 구조들의 상관관계, Proc. NatlAcad. Sci USA 81 : 5355-5359(1984).

형질전환된 세균 및 효모에 의한 TPA의 발현도 알려졌다. 인간 TPA의 리보핵산(RNA)이 1982 년에 먼저 분리되었다. Opdenakker일행의 “인간 조직 플라스미노겐 활성화 인자의 전령 RNA”, .Eur. J. Biol., pp 269-74(1982). 세균은 Pennica일행의 “E. 콜리내의 인간조직-유형 플라스미노겐 활성화인자 cDNA의 클로닝 및 발현”, Nature, 301 : 214-21(1983)에 의해 TPA발현을 위해 형질전환 되었다. 인간 TPA를 발현시키는 효모의 형질전환 방법은 미합중국 특허 출원 SN 663,025 및 공개된 유럽 특허 출원 Ep 143,081 에 기술되어 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 유전자 재조합에 의한 단백질의 영역 지역들의 재배열을 통해 자연 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자의 개선된 약리학적 효과에 관한 것이다. 그 개선된 효과에는 더욱 긴 반감기 및 증가된 피브린 친화성이 있다. 여기에는 영역들을 편리하게 분열시키고 재배열하는데 유용한 TPA의 사이영역 지역들내의 유일한 제한 자리를 포함하는 DNA 서열이 기술되었다. 이 TPA암호화 DNA를 포함하는 플라스미드와 2 재배열된 TPA를 발현시키기 위한 적당한 숙주도 기술되었다. 최종적으로 재배열된TPA 단백질이 기술되었다.

특히 본 발명은 DNA 화합물이 (a) 영역 부위들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열내에는 존재하지 않는 비-자연 엔도뉴클리아제 제한 자리를 사이 영역 지역들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열내에 포함하고 (b) 분자량이 90,000달톤 보다 적고 어떤 영역도 두 번보다 더 많이 나타나지 않는 TPA-유사 단백질을 암호화하고;핑거 영역(F), 성장 인자 영역(G), 크린글 1영역(K1) 및 크린글 2영역(K2)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 영역들과 활성 자리를 포함하는 TPA-유사 단백질을 암호화 하는 뉴클레오티드 염기들로 구성된 DNA 화합물로서 DNA 화합물을 기술한다.

더욱 특히, 본 명세서에는 Xba자리가 뉴클레오티드 염기 187-198사이에 삽입되고 , Hpal 또는 Sphl자리 또는 그 조합이 뉴클레오티드 염기 328-342 사이에 삽입되고, EcoRV, Clal 또는 Smal자리 또는 그 조합이 뉴클레오티드 염기 442-462 사이에 삽입되고, BamHI 또는 Hpal 자리 또는 그 조합이 뉴클레오티드 염기 709-726사이에 삽입되고, MstI, SphI 또는 XmaⅢ자리 또는 그 조합이 뉴클레오티드 염기 973-997 사이에 삽입되는 상기 TPA-암호화 DNA화합물이 개시되어 있다.

상기한 TPA-암호화 DNA 서열들중에는 영역 지역들을 암호화 하는 뉴클레오티드 서열에 그 자연 배열이 순서, 발생 또는 둘다에 관하여 변경되어진 것들이 있다. 더욱 특히, 본 명세서에는 영역들이 아미노 말단으로부터(a) FA; (b) FGK1A1; (c) FGK2A; (d) FK2A; (e) FK1K2A; (f) FK2K2A; 및 (g)FGK1K2K의 순서이고, DNA가 TPA-유사 단백질을 암호하 하는 TPA 암호화 DNA서열이 기술되어 있다.

더욱이 TPA-유사 단백질을 암호화하는 서열들의 상류와 하류 둘다의 뉴클레오티드 서열들이 화합물을 적당한 숙주 세포내에서 유지될 수 있게 하는 상기한 TPA-암호화 DNA 서열들의 화합물들이 있다 더욱 특히 본 명세서에는 적당한 숙주 세포가 TPA-유사 단백질, 특히 영역 지역들이 그들의 순서, 발생 또는 둘다가 변경되고 발현된 단백질의 전체 분자량이 90,000달톤을 넘지않고 어떤 영역도 두 번보다 더 많이 나타나지 않는 그들의 상세체들을 발현시킬 수 있게 하는 그러한 화합물이 기술되었다. 더욱 특히, 본 명세서에는 영역들이 아미노 말단으로부터 (a) FA; (b) FGK1A; (c) FGK2A; (d) FK2A; (e) FK1K2A; (f) FK2K2A; (g) FK1A 또는 (h) FGK1K2A의 순서인 TPA-유사 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 및 복제 플라스미드(벡터)가 기술되었다.

상기한 프라스미드를 유지할 수 있고 재배열된 TPA단백질을 발현하는 적당한 숙주 미생물들도 본 명세서에 기술하였다. 예를들면 적당한 숙주가 (a)효모; (b) 이쉐리키아 종(Escherichia sp); 및 (c) 세포배양물 : 로 구성된 군으로부터 선택된 TPA-유사 단백질을 암호화하는 DNA서열을 포함하는 발현 및 비-발현 벡터들을 기술하였다. 더욱 특히, 본 명세서에는 적당한 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary (CHO) 세포인 TPA-유사 단백질들을 암호하는 DNA서열들을 포함하는 바람직한 발현 벡터가 기술되어 있다.

최종적으로 본 명세서에는 영역 지역들이 그 자연 배열에 있어 그들의 순서, 발생 또는 둘다에 관하여 변경되어지고 발현된 단백질의 전체 분자량이 90,000달톤을 넘지않고 어떤 영역도 두 번보다 더 많이 나타나지 않는, 핑거 영역(F), 성장 인자 영역(G), 크린글 1영역(K1) 및 크린글 2영역(K2)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 영역들과 활성 자리(A)로 구성된, TPA-유사 단백질들의 화합물이 기술되어 있다. 다음과 같은 TPA 영역들의 배열이 바람직하다;(a) FA; (b) FGK1A; (c) FGK2A; (d) FK2A; (e) FK1K2A; (f) FK2K2A; 및 (g) FK1A.

[상세한 설명]

본 발명은 여러 가지 공지 방법으로 성취할 수 있는 일련의 분자 유전자 조작을 포함한다. TPA의 영역들 사이에 독특한 엔도뉴클레아제 제한 자리들을 갖는 2 개의 원형 유전자는 부다페스트 조약에 따라 기탁하였다. 숙주 미생물들은 각각 챠트 10 과 11 에 나타낸 pTPA-B1, 2, 3 4(a) 및 pTPA-B1, 2, 3, 4로 표시된 플라스미드를 포함하는 E. 콜리 균주이다. pTPA-B1, 2, 3, 4(a)는 1986년 8 월 29 일에 미국 일리노이주 페오리아 노던 리저널 리서치 센타(USA. Illinois, Peoria, Northern Regional Research Center)에 기탁번호 NRRL B-18106으로 기탁되어 있고 한국 종균협회에 1987년 7 월 31 일에 기탁번호 KFCC-10405 로 기탁되었다. pTPA-B1,2, 3, 4는 1986 년 11월 28일에 미국 일리노이주 페오리아 노던 리저널 리서치센타(USA. Illinois Peoria, Northern Regional Research Center)에 기탁번호 NRRL B-18142 로 기탁되어 있고 한국 종균협회에 1987 년 7 월 31 일에 기탁번호 KFCC-10406 으로 기탁되었다.

기탁된 플라스미드는 어떠한 형식으로든 본 발명의 제한으로 해석되지 않는다. 편리한 출발 물질이 있더라도, 다음에서 대체적 출발 물질로부터 TPA상사체들을 만드는 여러 가지 방법들을 설명하고 이어서 바람직한 방법들의 특정 예들을 설명한다.

요약하면 필수적인 유전자 조작은 TPA의 cDNA획득, 사이 영역 지역들내에 선택된 제한 자리를 갖는 여러 가지 TPA영역들의 암호와 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 블럭들의 합성, E. 콜리내에서 영역들의 클로닝 및 복제, 소요의 TPA상사체의 발현으로 기술할 수 있다.

A. 도면

제 1 도는 자연 cDNA와 비교한 합성 TPA DNA의 특정 서열 및 염기 번호 위치를 나타낸다. 자연 영역들은 제 1 도내 그들의 자연적 순서로 모두 존재한다. 제 2 도는 자연 TPA의 아미노산 서열과 모든 자연 영역들을 그들의 정상 순서로 갖고 있는 TPA상사체(챠트 11조 참조)를 비교한다. 두 도면에서, 상부 서열들은 변형된 TPA를 반영하는 저급 서열들을 갖는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 자연 서열이다. 제 3 도는 TPA의 상사체들을 합성적으로 조립하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 제 4 도는 영역지역들 내에 포함된 아미노산 및 뉴클레오티드를 나타냄으로 TPA영역들의 자연 순서를 포함하는 챠트 11에 기술된 상차체에 자연 TPA단백질을 비교한다. 사이영역 지역들은 제 4 도에 묘시되어 있는 바와같이 영역들사이에 놓여있는 그 아미노산들이다. (정의 참조) 본 문헌을 통해, 뉴클레오티드 또는 아미노산에 대한 참고 번호는 이 도면들을 참고한다.

B. 일반적 방법

일반적으로, 본 출원에 필요한 술어 및 실험 방법들은 Maniatis, T. 일행의 1982, 뉴욕. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, Molecular Cloning A Laboratory Manual에서 볼 수 있다. manual은 이후에 Maniatis로 언급한다.

모든 E. 콜리 균주를 글루코오스와 산-가수분해된 카제인 아미노산이 보충된 M9 배지, 디프코의 항체 배지 #2 및 클루코오스가 있는 루리아(Luria) 육즙(LB)에서 배양한다. 항체에 대해 저항성을 갖는 균주들은 Maniatis에 기술된 약제 농도에서 유지시킨다. 형질전환은 Morrison, Bact의 D.A(1977), J., 132 : 349-351 또는 Clark-Curtiss, J. E. 및 Curtiss, R., 뉴욕, Academic Press, Wu, R., Grossman, L. 및 Moldave, K., eds., 효소학의 방법, 1983, 에 기술된 방법에 따라 수행한다.

모든 효소들은 제조업자의 지침에 따라 사용한다. 집락 교잡은 Grunstein, M. 일행의 Proc, Nat. Acad. Sci., 72, pp 3961-5(1975)에 일반적으로 기술된 바와같이 수행하지만 개조되어 다음의 방법을 제공할 수 있다. 상기 제조된 세포들의 집락들을 포함하는 니트로셀룰로오스 여과기를 만든다. 다음에 이 여과기들을 NaCl 1.5 M, NaOH 0.5 M 로 구성된 변성 용액내에 침지된 두께 5-8의 왓트만 3 MM 페이퍼판에 올려놓아 집락이 이동하게 한다. 변성물을 1-3 분간 EDTA 25mM 및 0.5M의 Tris HCl pH 7. 4, 2×SSC(1×SSC=0.15M NaCl ; Na 구연산염 0.015M : pH 7.1을 포함하는 중화 용액에 침지된 3 MM 페이퍼의 두 번째 판에 여과물이 옮겨지는 시간에서 1.5-2 분간 집락으로 상승확산시킨다. 다음에 여과물들을 완전히 공기 건조시키고 80℃에서 2-4 시간동안 진공에서 소성처리한다.

올리고뉴클레오티드 탐침을 위한 교잡 조건들은 Goeddel, D. V. 일행의 Nature, vol, 290, pp.20-26(1981)에 기술된 바와 같다.

교잡후, 용액을 포함하는 탐침물을 제거하여 건져내고, 여과기를 각각 400㎖로 5 번 바꾸면서 총 3 시간동안 0.1% SDS, 0.2×SSC로 씻는다. 여과기를 완전히 공기 건조시키고 올리고 -70℃에서 16 시간 동안 Kodak X-OMAT AR필름 및 Dupont Cronex Lightnening Plus intensifying 스크린을 사용하여 방사선 사진을 찍는다.

플라스미드의 서열화를 위해서는, Holmens, D. D. 일행의 Analyt, Biochem., vol.114, p. 193(1981)의 방법에 따라, 플라스미드 DNA의 미니조제물들을 제조한다. 디데옥시 서열화는 Sanger F. 일행의 “빠른 DNA서열화에 대한 보조제로서 한가닥 박테리오파지내의 클로닝”, J. Mol. Biol. 143 : 161-178(1977)에 따라 수행한다. 디데옥시 포함 반응물들을 90℃까지 2 분간 가열하고 얼음에 담금으로 전기영동시켜 제조한다. 선당 2-3㎕를 제조된 8% 서열화 변성 폴리아크릴아미드 겔상에 적하하고 Sanger 및 Coulson의 “DNA서열화를 위한 얇은 아크릴아미드 겔의 사용”, FEBS Lett. 87 : 107-110(1978)에 따라 가동시킨다. 겔들을 2-4 일간 실온에서 노출시키고 필름(Kodak XAR-5)을 제조업자의 추천에 따라 현상시킨다. 뉴클레오티드 크기는 킬로염기(kb)또는 염기쌍(bp)으로 나타낸다. 이들은 아가로스 겔 전기용동으로부터 유도된 평가이다.

C. TPA cDNA

TPA cDNA는 핵산 서열의 활성 자리 지역의 편리한 원(source)이다. 그러므로 활성 자리를 화학적으로 합성하는 것은 필요치 않다. TPA cDNA는 다수의 원으로부터 입수할 수 있다. 당업자들은 다량의 TPA, 특히 보우스 멜라노마(Bowes Melanoma)세포들을 생산하는 세포 배양물들로부터 분리된 전령 RNA로부터를 암호화하는 cDMA서열들의 분리, vol 80, pp 349-352(1983. 1) ; Gronow일행의 “세포 배양에 의한 인간 플라스미노겐 활성화인자의 생산”, 생물공학의 추세, vol 1, no 1, pp 26-29(1983) ; 및 Pennica일행의 “E. 콜리에 있어서 인간조직-유형 플라스미노겐 활성화 인자 cDNA의 클로닝 및 발현”, Nature, vol 301, pp 214-21(1983. 1. 20)

더욱 특히, Genentech, Inc는 각각 1982. 5. 5 ; 1982. 7. 14 및 1983. 8. 7에 출원된 미합중국 일련번호 374, 860 ; 398,003 및 483, 052dml 우선 출원에 의존하는 1983 년 5 울 4 일에 유럽 특허 출원 제 0093619 호를 출원하였고 이는 이후에 Genentech 출원으로 언급한다. Genentech출원은 TPA를 암호화하는 재조합 DNA화합물을 갖는 형질전환체인 ATCC 31446 의 E. 콜리 균주 294를 기술하였다. 더욱이, rDNA로 형질전환된 E. 콜리 K12 균주 W3110은 Genentech출원에 그로부터 TPA의 추출물이 피브린 용해 활성의 분석을 위해 제조된 ATCC 27325 로 기술되어 있다. 그러므로 이 기술내용에는 여기에 유용한 재조합 DNA화합물이 포함되어 있다. 유사하게, Genentech 출원의 기술 내용은 TPA를 발현하는 증폭을 위해 형질전환된 DHFR⁺CHO-KI(ATCC CL 61) 세포들을 제공한다. 그러므로, 다시 기탁물 ATCCL CL 61은 여기에 유용한 TPA를 암호화하는 재조합 DNA 뉴클레티드를 나타낸다.

제조 2 의 본 기술은 이 기술분야에 능숙한 사람에게 셈FMF 암호화하는 재조합 DNA화합물을 얻기위한 보우스 멜라노마 세포에 적용할 수 있는 이분야에 공지된 방법중 분리된 방법을 제공한다. 보우스 멜라노마 세포는 보통 공공에게 입수 가능하다.

[D. TPA영역들 합성]

상기한 바와같이, TPA상사체 DNA서열들의 부분을 cDNA로부터 제조한다 ; 그러나 대부분의 서열 및 전체 서열조차도 합성적으로 만들어낼 수 있다. 비용 및 편리성은 특정 TPA상사체의 서열을 만들어내는 방법을 결정함에 있어서 조절 매개변수이다. 소요의 상사체의 TPA영역들내에서 발견되지 않는 제한 자리를 선택함으로 또한 TPA의 사이영역 지역들내에 이 제한자리들을 삽입함으로, TPA DNA서열의 소요의 부분이 잘려나가는 것을 피하고 개개의 영역을 각각 용이하게 제거하고 삽입할 수 있게 한다.

TPA 유전자의 일부분을 화학적으로 합성함으로, 뉴클레오티드가 사용되는 염기 공정에 의해 염기를 결정한다. 다음의 이점들을 본 방법으로 얻는다. : (1) 전사 생성물내의 이차적 구조의 최소화 ; (2) 자체-상보상의 AT-GC 지역의 최소화 ; 및 (3) cDNA 서열을 따라 소요의 취치에 유일한 제한 자리의 배치.

올리고뉴클레오티드는 Needham VanDevanter, D.R., 일행의 Nucleic Acids Res 12 : 6159-6168(1984)에 기술된 바와 같이 ; 자동 합성기를 사용하여 Beaucage S. L 및 Caruthers, M.H.Tctrahedron Letts. 22(20) : 1859-1862(1981)에 기술된 고체상 포스포르 아미디테트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성한다. 올리고뉴클레오티드는 Pearson, J.D. 및 Regnier, F.E., J. Chrom., 255 : 137-149(1983)에 기술된 바와 같이 음이온-교환 HPLC또는 자연 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제한다.

올리고뉴클레오티드는 40 이하의 뉴클레오티드 길이로 화학적으로 합성한다. 각각의 단편은 그 관련 상보적 가닥에 대해 상보적인 것으로 고안되고 각각의 이중 가닥 단편은 연결을 최소화하기 위해서 접착성 말단을 포함한다. 다음의 기준들은 단편들의 합성을 위한 DNA분열시 고려되어야 한다 : 1) 올리고뉴클레오티드 단편들의 길이는 화학적 합성 및 정제의 용이성을 위해 길이가 40 이하의 염기이어야 한다. 2) 상보적 “상부” 및 “하부”올리고뉴클레오티드 단편들로부터 나온 최소의 6 개의 염기는 단편들의 최적의 배열 및 연결을 할 수 있게 한다. 3) 일차적 또는 상보적 서열과 연합할 수 있는 4 개 또는 그 이상의 염기의 지역들은 피해져야 한다.

합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 Maxam, A.M. 및 Gilbert, w, Crossman, L 및 Moldave, D., eds.,의 뉴욕, Academic Press, 효소학의 방법, 65 : 499-560(1980)의 화학적 분해 방법을 사용하여 입증할 수 있다. 대체적으로, 그 서열을 Maxam 및 Gilbert, 상기 참조의 방법 또는 wallance, R.B., 일행의 이중-가닥 주형 서열화를 위한 사슬 종단 방법 Gene, 16 : 21-26(1981)을 사용하여 올리고뉴클레오티드 단편들의 이중-가닥 DNA서열로의 회합후 확정할 수 있다.

87 개의 별개 올리고뉴클레오드(제 3 도)를 합성한다. 여기에 기술된 특정 회합 전략은 챠트(11)에 지시 된 바와같이, 선택된 제한 자리를 갖는 TPA 상사체의 5′부분을 암호화하는 첫 번째 1099염기쌍들을 조작하는 것이다. 다음에 이 합성 올리고뉴클레오티드를 활성 자리를 포함하는 위치 1287의 EcoRI 자리에서 TPA cDNA의 3′부분에 연결시킨다.

올리고뉴클레오티드 단편들을 이중-가닥 DNA로 회합시키기 위해서, 87 단편들 모두를 함께 어니일링 및 연결을 위해 혼합할 수 있다. 더욱 효과적인 연결을 위해서, 올리고뉴클레오티드를 4개의 블럭으로 나누는 것이 좋다. 각각의 블럭을 연결시키고 정제시킨 후, 4개의 블럭들을 어니일링하고 연결시켜 최종의 생성물을 얻을 수 있다. 회합된 블럭들 및 최종 생성물은 Maniatis에 기술된 바와같이 아크릴아미드 겔 전기영동으로 정제할 수 있다. 어니일링 및 연결을 수행하기 위해서, 또한 Maniatis에 기술된 일반적 방법들을 사용할 수 있다.

합성 TPA유전자의 개시 코오돈을 제공하는 것이 필수적이다. E. 콜리 계를 위해서는 F-met암호화 개시 코오돈 ATG가 필요하다. 개시 코오돈은 합성 유전자안으로 함입시키거나 소요의 발현 플라스미드에 의해 제공될 수 있다. 개시 코오돈외에도, E. 콜리에 대해서는 TPA의 합성 유전나내로 Dalgarno지역 및 개시 코오돈 사이에 충분한 간격을 제공하는 서열을 포함시키는 것이 편리하다.

서열을 적당히 선택하면 전사 및 해독을 방해하는 2 차적 구조를 최소화하고, 최대 코오돈 사용을 함입시키고(Grosjean H. 및 Fiers, W., Gene, 18 : 199-209 1982) ; 리보소옴 부착 자리 주위의 서열에서 발견되는 통계학적 오차(Cold, L., 일행의 Ann. Rev.Microbiol., 35:403, 1981)를 안정화시킨다. 본 발명의 특정서열은 그 실질적인 서열로 여기에 기술한다. 그러나 다른 숙주 세포들내에서 TPA 상사체들의 발현을 최고로 하기 위해서 대체적인 서열들을 사용할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

E. cDNA 및 TPA유전자의 합성 부분들의 클로닝

TPA부분들을 암호화하는 재조합 단편들의 복제를 위한 TPA 합성 부분들과 cDNA를 클로닝하는데 사용되는 방법들은 이 분야에 알려진 표준 공정들이 있다. 모든 것을 수행하기에 충분한 방법론을 포함하는 Maniatis소책자는 계속적 클로닝을 기술하였다. 모든 클로닝은 형질전환된 E. 콜리내에서 수행하고 임의의 잘 밝혀진 균주가 유용하다. 다른 언급이 없는 한 균주 HB101이 비람직하다.

E. 콜리를 형질전환시키는데 유용한 클로닝 벡터에는 pBR 322와 pKC7이 있다.

F. DNA-암호화 TPA내에 독특한 제한 자리 삽입

TPA의 사이영역 지역들을 위해 선택된 특정 제한 자리들은 챠트 10 및 11 에 기술되어있다. 이들은 본 발명에 유용한 유일한 제한 자리가 아니다. 제한 자리들은 TPA cDNA에 독특한 것을 근거로 선택된다. 사이영역 지역들내에 최소의 아미노산 변화를 도입하는 자리들이 바람직하고 아미노산 변화가 없는 것들이 가장 바람직하다. (제 1 도 및 제 2 도 참조)사이영역내에 서로 다른 해독 구조들을 갖는 다수의 자리들은 영역들이 발현을 위해 다른 영역들에 연결된 후 상내에 존재하는 것을 확정하기 위해 유용하다. 중복 제한 자리들은 그 자리를 단순히 잘라내고 말단을 뭉툭하게 만든 후 연결시킴으로 제거할 수 있다. 독특한 자리는 상업적으로 입수가능한 연결제들의 화학적 합성 또는 단일 자리 변이에 의해 도입시킬 수 있다.

자연 TPA cDNA는 챠트 10 및 11 에 기술된 두가지 원형의 TPA cDNA로 들어가는 이 자리들에 덧붙여 다음의 엔도뉴클리아제 제한 효소들에 의해 인식되는 자리들을 포함하지 않는다.

ACC1 AFL2 AFL3 AHA3

ASU2 AVA3 AVR2 CL1

BGL1 BSS H2 HIND3 KPN1

MLU1 MST2 NAE1 NCO1

NDE1 NHE1 NOT1 NRU1

NSI1 PVU1 SAC2 SAL1

SAU1 SFI1 SNA1 SNA B1

SPE1 XHO1

G. E. 콜리내 TPA상사체들의 발현 원핵계내에서 클로닝된 유전자

예를들면 변형된 TPA유전자가 높은 수준으로 발현되기 위해서, 최소한 mRNA전사를 지시하는 강력한 촉진유전자, 해독 개시 및 전사말단자를 위한 리보소음 부착 자리를 포함하는 발현 백터를 구성하는 것이 필수적이다. 유전자 생성물의 다량 축척은 흔히 세포성장을 저해하고 가끔 세포를 죽이기 때문에, 생성물의 합성을 지시하기 위해 선택된 촉진유전자는 세포성장이 촉진유전자 유도전에 고밀도에 도달할 수 있도록 하는 방식으로 조절되어야 한다. 이 목적에 적당한 조절 지역의 예에는 Yanofsky, C., Kelley, R.L. 및 Horn, V., J.Bacteriol., 158 : 1018-1024(1984)에 기술된 E. 콜리 트립토판 생합성 통로의 촉진 유전자 및 작동유전자 지역과 Herskowitz, I. 및 Hagen, D., Annu.Rev. Genet., 14 : 399-445(1980)에 기술된 파아지 람다(P_L)의 좌향 촉진유전자가 있다. E. 콜리내에 생산된 TPA는 다수의 시스테인 잔사들 때문에 적절히 포개지지 않는다. E. 콜리-생산 TPA는 먼저 변성되고 다음에 복원되어야 한다. 이것은 구아니딘 cDNA내에 E. 콜리-생산 TPA를 용해시키고 모든 시스틴 잔사들을 β-메르캅토에탄올로 환원시킴으로 성취할 수 있다. 다음에 단백질은 느린 투석 또는 겔 여과에 의해 복원된다. 미합중국 특허 제 4,511,503호.

H. 효모내의 TPA상사체들의 발현 효모내의 이종성 단백질들의 발현은 잘 알려져 있다. Cold spring Harbor Laboratory Sherman, F., 일행의 효모 유전학에 있어서의 방법은 효모내에서 TPA상사체들을 생산하는데 유용한 여러 가지 방법들을 나타내는 잘 알려진 조작이다.

효모내의 유전자의 높은 수준의 발현을 위해서, 원핵생물에서와 같이 유전자를 강한 촉진유전자 계에 연결시키고 효모 유전자로부터의 전사 종단/폴리아데닐화 서열을 충분히 제공하는 것이 필수적이다. 유용한 촉진유전자의 예에는 GAL1,10 (Johnst on M., 및 Davis, R.w., Mol 및 Cell. Biol., 4 : 1440-48, 1984), ADH2(Russell,D., 일행의 J.Biol, Chem.258 : 2674-2682, 1983),PHO5(EMBOJ.6 : 675-680, 198 2), 및 MFα1. 이 Lue-2, URA-3, Trp-1 및 His-3과 같은 선택적 표시자를 갖는 다중복사 플라스미드 또한 바람직하다.

세포가 글루코오스상에서 배양될 때, GAL 및 ADH2촉진유전자들이 억제되고 따라서 세포가 고밀도로 성장하게 된다. 반면에 GAL 촉진유전자들은 세포들을 갈락토오스 배지로 옮김으로 전환되고 ADH2는 모든 글루코오스가 세포들에 의해 사용된 후 전환될 것이다. PHO5 촉진유전자는 배지내의 인산염 농도를 조절함으로 스위치를 키거나 끌 수 있다. α교배-유형 숙주내의 MFα1 촉진유전자는 그 모든 시간에 있어서 작동중이지만 α교배-유형의 세포 또는 배수체내에서는 작동되지 않는다. 그러나 SIR위치의 하나에서 ts변이를 가지고 있는 숙주내에서 온도를 올리거나 내림으로 조절할 수 있다. α-유형 세포상의 35℃에서의 그러한 변이는 a교배-유형을 암호화하는 보통의 불활성 유전자를 작동시킨다. 불활성 a교배-유형 유전자의 발현은 다시 MFα1 촉진유전자의 작동을 멈춘다. 성장온도를 27℃로 낮출므로 전 공정을 역전시키고 a교배-유형을 중단시키고 MFα1을 작동시킨다.(Herskowitz, I, ＆ Oshima, Y.(1982), 효모 사카로마이세스의 분자 생물학, eds, Strathern, J.N., Jones, E.W., ＆ Broach, J.R., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor., NY, pp 181-209) 폴리아데닐화 서열은 ADH1, MFα1 또는 TPI와 같은 높게 발현된 유전자 중 임의의 3′-말단 서열에 의해 제공된다. (Alber, T. 및 Kawaski, G., J. of Mol. ＆ Appl, Genet. 1 : 419-434, 1982) YEp6, YEp13, YEp24와 같은 다수의 효모 발현 플라스미드가 벡터로 사용될수 있다. TPA와 같은 흥미있는 유전자는 상기한 임의의 촉진유전자와 연합되고 다음에 여러 효모 숙주내에서의 발현을 위해 플라스미드에 연결시킬 수 있다. 상기한 플라스미드는 문현에 잘 기술되어 있다.(Botstein, 일행 Gene, 8 : 17-24, 1979 ; Broach, 일행, Gene, 8 : 121-133, 1979)

상기한 플라스미드가 효모내에서 외래 유전자를 발현시키기 위해 사용될 수 있으나, 발현 벡터의 어러가지 성분들의 삽입 및 / 또는 절단에 대해 중대한 유연성이 있는 벡터들을 여기에 기술하였다. 그러한 한 예는 챠트 18 에 기술된 벡터 pα1-ADHt이다.

효모 세포들을 형질전환 시키는데 두 방법이 사용된다. 한 경우에 있어서, 효모 세포들은 자이몰레이스, 라이티케이스 또는 글루술레이스를 사용하여 먼저 프로토플라스트로 전환시키고 이어서 DNA 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 첨가한다. PEG-처리 프로토플라스트는 선택적 조건하 3% 한천 배지에서 복원된다. 이 방법의 상세한 것은 J.D.Beggs의 논문 Nature(London), 275 : 104-109(1978) ; Hinnen, A., 일행 Proc. Natl. Acad. Scil-USA, 75:1929-1933(1978)에 나타나 있다. 두 번째 방법들은 세포벽을 제거하지 않는다. 세포들을 리튬-클로라이드 또는 아세테이트 및 PEG로 처리하는 대신에 선택적 평판에 놓는다.(Ito, H., 일행, J Bact., 153 : 163-168, 1983)

TPA상사체들은 세포를 용해시키고 용해물에 표준단백질 분리기술을 적용함으로 분리할 수 있다. TPA상사체들은 웨스턴 블롯 기술(western blot techniques)또는 방사선면역분석법으로 검출할 수 있다.

[I. 세포 배양물내 발현]

TPA상사체 암호화 DNA를 숙주 세포 배양물을 형질전환시키는데 유용한 여러 가지 발현 벡터에 연결할 수 있다. 벡터는 모두 형질 전환될 숙주 세포와 양립가능한 TPA상사체의 전사 및 해독을 개시시킬 수 있는 유전자 서열들을 포함한다. 숙주세포가 고등 동물 세포, 예를들면 포유동물 세포일 때, TPA 유전자의 자연적으로 발행하는 전사 및 해독 유전자 서열을 사용할 수 있거나 자연적으로 발생하는 유전자 서열을 이종성 촉진 유전자 서열과 함께 사용할 수 있다. 더욱이 벡터는 바람직하게는 표시자를 포함하여 형질전환된 숙주 세포들을 선택하기 위한 표현형적 특징을 제공한다. 첨가적으로 복제 벡터는 레플리콘을 포함할 수 있다.

TPA상사체들 생산에 유용한 세포 배양물의 실례에는 곤충 또는 포유동물 발행의 세포들이다. 포유동물 세포계들은 포유동물 세포 현택액들이 사용될 수 있으나 흔히 세포들의 단일층 형태일 것이다. 포유동물 세포 라인의 실례에는 VERO 및 HeLa세포들, 차이니즈 햄스터 난소 C(HO) 세포라인, W138, BHK, COS-7 또는 MDCK세포라인이 있다. 곤충 세포라인의 실례에는 스포돕테라 스루기페르다(Spodoptera Ffrugiperda)(거염벌레에 속함)alc 봄빅스 모리(Bombyx mori)(누에)이 있다.

상기한 바와 같이, 벡터, 예를들면 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용되는 플라스미드는 바람직하게는 TPA유전자 서열의 전사 및 해독을 개시시키는 유전자 서열을 포함한다. 이 서열들은 발현 조절 서열들로서도 언급된다. 숙주 세포가 곤충 또는 포유동물 발생의 것일 경우, 실례적인 유용한 발현 조절 서열들은 SV-40 촉진자(Science, 222, 524-527, (1983)), CMV I.E촉진자(Proc Nat 1.Acad.Sci.,81: 659-663, 1984) 또는 메탈로티오네인 촉진사(Nature, 296, 39-42(1982))로부터 얻는다. 상기한 바와 같이, 숙주 세포가 포유 동물일 경우, TPA유전자의 발현 조절 서열을 사용할 수 있으나 TPA 상사체와 이종 전사개시 자리를 결합시키는 것이 바람직하다. 발현 조절 서열을 포함하는 복제 또는 통합 DND 물질 또는 플라스미드를 제한 효소들을 사용하여 절단하여 필요한 또는 바람직한 크기로 조절하고 이 기술분야에 잘 알려진 수단에 TPA 상사체를 암호화하는 cDNA와 연결시킨다.

효모에 있어서와 같이, 고등 동물 숙주 세포를 사용할 경우, 공지의 포유동물 유전자로부터의 폴리아데닐화 또는 종료암호 서열들을 벡터안으로 함입시킬 필요가 있다. 종료암호 서열의 예는 소의 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다.

첨가적으로, 숙주 세포내에서 복제를 조절하는 유전자 서열들을 소의 유두종 바이러스 유형-백터에 함입시킬 수 있다. Saveria-Campo, M., “소의 유두종 바이러스 DNA : 진핵세포 클리닝 벡터”버지니아 알링톤, IRL 프레스, DNA클로닝 Vo1II a Practical approach. Ed. D.M. Glover, 213-238(1985) 숙주 세포들은 여러 수단에 의해 형질전환되는 수용체 또는 보유적 수용체이다. DNA를 동물 세포에 도입시키는 여러 가지 잘 알려진 방법들이 있다. 이들에는 인산칼슘 침전, DNA를 포함하는 세균 포로토플라스트와 수여체 세포들의 융합, 수여체 세포들을 DNA를 포함하는 리포소옴으로 처리함 및 DNA를 직접적으로 세포에 마이크로 주입시킴이 있다.

형질전환된 세포들을 Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R.J., Dowden, Hutchinson and Ross, Inc.,(1977)의 이 기술분야에 잘 알려진 수단으로 배양하고 발현된 TPA 상사체들은 숙주 세포계를 예를들면 이 기술분야에 잘 알려진 기계적 또는 효소적 수단에 의해 분쇄시킨 후 숙주 세포 또는 세포 현탁액으로부터 단백질이 배출되는 그러한 계들내의 세포 배지로부터 수확한다.

[J. TPA상사체들의 평가]

TPA 및 그 상사체들은 두가지중 어느 하나에 의해 평가될 수 있다. 플라스미노겐을 플라스민으로 절단하는 상대적 능력을 평가할 수 있고 플라스민이 생산을 막는 저해제들의 상대적 능력을 평가할 수 있다. 다음의 상세한 것들은 그러한 평가 방법들을 나타낸다.

아미도분해 분석 · TPA 상사체들의 관능적 활성은 Verheijen, J.H 일행의, 혈장내 측정에 적용할 수 있는 외래(조직-유형) 플라스미노겐 활성화인자의 간단하고 민감한 분광광도적 분석·Thromb. Haemostas., 48 : 266-269(1982)에 기술된 커플링된 아미도분해 분석에 의해 측정한다. 간단하게 TPA 상사체들을 포함하는 샘플들을 플라스미노겐 및 CNBr-소화 피브리노겐 단편들과 혼합한다. 그러므로 형성된 플라스민은 외생적으로 첨가된 발색성 기질, S-2251(H-D-발릴-L-로이실-L-리신-니트로아닐리드 디히드로클로라이드 ; 스웨덴, 스톡홀롬, KABI)을 절단하여 분광광도법으로 감시되는 착색된 생성물을 생성한다. TPA 상사체들의 활성에 관한 프로테아제 저해제의 효과는 Verheijen, J.H., 일행, 인간 혈장 내의 조직-유형 플라스미노겐 활성화인자의 빠른-작용 저해제 발해제 발생의 증거, Thromb. Haemostas., 51 : 392-395(1984)에 기술된 분석의 변형법을 사용하여 평가한다. 첨가된 결합제는 TPA에 결합되고, 비가역적 복합체를 형성하고 이렇게 하여 TPA가 플라스미노겐을 활성화시키는 것을 방지한다. 예를들면 정제된 자연 TPA는 저해제-함유 샘플의 양을 증가시키면서 적정하고 잔류적 TPA활성은 상기한 바와같이 측정한다. 다음에 표준 곡선은 잔류적 TPA활성을 첨가된 저해제-함유 샘플의 양의 함수로 도표적으로 나타냄으로 발달시킨다. 유사한 방법으로, TPA상사체들을 저해제로 적정한다. 결과 형성된 곡선들을 TPA표준 곡선과 비교한다. 곡선들 사이의 유사한 정도는 저해에 대한 특정 상사체의 감도에 직접적으로 관계가 있다.

피브린 오토그라피 : TPA 상사체들의 분자량은 상사체를 포함하는 샘플들을 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 처리함으로 측정하고 다음에 아크릴아미드 겔을 플라스미노겐-함유 피브린 지시제 필름상에 놓는다. 상사체 단백질들이 아크릴아미드 겔로부터 지시 필름안으로 확산되어감에 따라 이들은 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키고 이것은 다른 반점 피브린 지시제내의 피브린 용해 투명 지역을 형성시킨다. 이 지역의 나타남은 아크릴아미드 겔내의 상응 위치에서의 활성 TPA상사체의 존재를 나타낸다. 이 기술은 또한 TPA 상사체들과 프로테아제 저해제사이의 상호작용을 평가하는데 사용될 수 있다. 상기한 바와같이, 이 상호작용은 효소-저해제 복합체를 형성하고 이는 그 상사체보다 높은 분자량을 갖는다. SDS-PAGE이후에, 복합체는 피브린 지시제 필름내에서 보여질 수 있는 자유적 TPA활성을 나타낸다. 이 기술의 상세한 것은 원래 Granelli Diperno, A.E.Reich, 생물 유액내 프로테아제 및 프로테아제-저해제 복합체 연구·J.Exp.Med, 148 : 223-234(1978)에 기술되어 있다.

TPA상사체 항원의 평가

샌드위치-유형 효소-연결 면역솔벤트 분석(S-ELISAs). TPA상사체들의 항원은 서로 다른 두가지 S-ELISAs로 면역학적으로 측정된다. 첫 번째는 인간 자궁 TPA에 특정적인 염소 폴리클론항체를 사용한다. 두 번째는 쥐의 모노클론항체를 사용한다. 이 모노클론항체는 특히 TPA활성에 필요한 에피토프에 대한 것이다. TPA의 활성-자리 영역에 특이적인 항체의 사용은 활성 자리 이외의 영역에서 그 일차적 구조가 개조된 임의의 TPA 상사체의 항원을 측정하는 효과적인 방법을 제공한다. 이 분석법은 Korninger, C. 일행의, 모노클론 항체를 사용하는 TPA항원을 위한 샌드위치 ELISA. Thromb.Res., 41 : 517-535(1986)에 기술된 것과 유사하다. 두가지 분석법에 대한 감도의 한계는 거의 TPA 1ng/㎖이다.

웨스턴 면역브롯팅 기술·TPA 상사체들의 저해제들과 복합체를 형성하는 능력은 Towbin, H. 일행·폴리아크릴아미드 겔로부터 니트로 셀룰로오스 시이트로 단백질의 전기영동적 이동 : Procedure and smom applications. Proc,Natl.Acad.Sci. USA, 76 : 4350-4354(1979)에 기술된 SDS-PAGE와 웨스턴 면역브롯팅 기술을 사용함으로 또한 평가될 수 있다. 간단하게, TPA상사체를 저해제와 상호작용시키고, 혼합물을 SDS-PAGE시키고, 단백질을 니트로셀룰로오스지에 영동시킨다. 합체되지 않은 유리 TPA 및 저해제가 있는 복합체내의 TPA는 TPA에 특이적인 정제된 폴리클론 염소 IgG와 염소 IgG에 대한 토끼 항혈청을 사용하여 검출할 수 있다. 다음에 TPA-함유 면역복합체는 I¹²⁵-표지 단백질 A 및 방사선 사진을 사용하여 볼수 있다.

[정의]

용어 “세포 배양물”은 세포들을 원래의 식물 또는 동물의 외부에서 살아있는 상태로 유지시키는 다세포 식물 또는 동물로부터 유도된 성장세포들의 함유물에 관한 것이다.

용어 “영역”은 특정기능과 같다고 생각되는 아미노산 서열의 분리된 연속 부분에 관한 것이다. TPA에 관해서는 상기의 참고문헌들이 영역지역들을 정의하고 있으며, 본 명세서에 제 4 도에는 영역들사이에 놓여있는 사이영역지역들의 중간지점들의 근접 위치들이 기술되어 있다.

용어 “하류(downstream)”는 발현 지시에서 더욱 진행된 서열 ; 예를들면 암호와 지역이 개시 코오돈으로부터 하류인 것을 나타낸다.

용어 “사이영역”은 영역들사이에 놓여있는 단백질의 아미노산 서열의 지역들에 관한 것이다. 이 적용에서, 사이영역 지역들은 제 4 도에 나타난 중간 지점들로붙의 +또는 - 5 아미노산 잔사들이다. 그러므로 핑거 및 성장 인자 영역들사이의 사이영역 지역은 아미노산 44-55를 포함하여 그 사이에 놓이고 ; 성장 인자 및 크린글 1 영역 사이의 사이영역은 아미노산 86-97을 포함하여 그 사이에 놓이고 ; 크린글 1 과 크린글 2 영역 사이의 사이영역은 아미노산 169-180을 포함하여 그 사이에 놓이고 ; 크린글 2 와 할성 자리사이의 사이영역은 아미노산 257-268을 포함하여 그 사이에 놓인다.

용어 “유지된”은 플라스미드가 자치적 복제체로 또는 숙주 게놈에 통합된 부분으로 존재하는 형질전환된 숙주내에 플라스미드가 안정하게 존재함을 말한다.

용어 “미생물”은 세균, 방선균류 및 효모와 같은 단세포적 원핵 및 진핵 유기체 둘다를 포함한다.

용어 “비-자연 엔도뉴클레아제 제한 자리”는 자연 cDNA서열의 같은 위치에서 발견되지 않는 엔도뉴클리아제 제한 자리에 관한 것이다. 이들은 독특한 및 독특하지 않은 자리 둘다를 포함한다.

용어 “오페론”은 조절 유전자 생성물에 의해 인식되어지는 DNA 내의 구조 유전자, 조절 유전자 및 조절요소를 포함하는 유전자 발현 및 조절의 완전한 단위체이다.

용어 “플라시미드”는 자치적으로 자기-복제되는 염색체의 고리형 DNA로 발현 및 비발현형 둘다를 포함한다. 재조합 미생물 또는 세포 배양물이 숙주화로 발현 플라스미드로 기술될때, 용어 “발현 플라스미드”는 염색체외의 고리형 DNA 및 숙주 염색체에 함입된 DNA 둘다를 포함한다.

용어 “촉진유전자”는 전사를 개시하는 RNA 폴리머라제가 결합하는데 관련되는 DNA지역을 말한다.

용어 “DNA서열”은 뉴클레오티드 염기들, 아데노신, 티미딘, 시토신 및 구아노신으로 구성된 단일 또는 이중 가닥 DNA 분자에 관한 것이다.

용어 “적당한 숙주”는 재조합 플라스미드와 양립할 수 있고 따라서 플라스미드를 복제하거나, 그 게놈내로 함입시키거나 또는 발현시킬 수 있는 세포 배양물 또는 미생물에 관한 것이다.

용어 “상류(upstream)”는 발현의 반대방향으로 나아간 서열로 ; 예를들면 세균 촉진유전자는 전사 단위의 상류에 있고 개시 코오돈은 암호화 지역의 상류에 있다.

본 출원에 유일한 챠트 1-27의 플라시미드와 단편들을 나타내기 위해 사용된 규약은 플라스미드와 그들의 단편들의 관례적 표시와 유사하다. 관례적 고리형 도면과는 달리, 챠트상의 단일 직선 도면들은 왼쪽에서 오른쪽으로(5′-3′)개시 또는 전사되는 고리형 및 직선 이중-가닥 DNA둘다를 나타낸다. 별표(*)는 플라스미드의 고리 형태를 완성시키는 뉴클레오티드의 가교를 나타낸다. 단편들은 이중-가닥 DNA의 직선 조각들이기 때문에 별표를 갖지 않는다. 엔도뉴클레아제 제한 자리들은 직선위에 나타냈다. 표시 유전자는 직선 아래에 나타냈다. 플라스미드 또는 단편들을 나타내는 도표 아래에 나타난 막대는 상대적 DNA상의 두 점 사이의 염기쌍들의 수를 나타내기 위해 사용하였다. 표시 유전자사이의 상대적 공간은 실질적인 거리를 나타내는 것이 아니고 단지 나타낸 DNA서열상의 그들의 상대적 위치를 지시하는 것이다.

[제조]

제조 1. 벡터-pSK4-챠트1-3

플라스미드 pSK4는 E. 콜리내에서 이종 단백질의 발현을 지시할 수 있는 발현 벡터이다. 이것은 전사를 매개하는 강한 조절가능한 촉진유전자와 해독 개시를 위한 강한 리보소옴 결합 자리를 갖는다. 특히 pSK4는 트립토판(trp) 오페론으로부터의 촉진유전자와 리보소옴 결합 자리(RBS)를 사용한다. RBS바로 하류의 유일한 ClaI 자리는 TPA와 같은 소요의 유전자 삽입용으로 유용하다(챠트 3).

플라스미드 pSK4를 제조하기 위해, 신규한 pTRZ1(챠트 1)과 공지의 pKC7(챠트 2)을 클로닝하는 것이 필요하다. Rao. R.N. 및 Rogers, S.G., Gene.,7 : 79-82(1979). 플라스미드 pTRZ1은 촉진유전자/작동유전자 지역을 포함하는 trp오페론 부분, 리보소옴 부착 자리, 및 trpLE융합 △LE1413 뿐만아니라 갈락토시데이스(loc Z)와 락토오스 퍼미에이스(lac Y)의 구조 유전자를 포함한다. 플라스미드 pKC7은 암피실린과 카나마아신에 대한 저항성을 특정화하고 다수의 유일한 제한 엔도뉴클리아제 자리들을 갖는 pBR322유도체이다.

pTRZ1 및 pKC7의 재조합 플라스미드는 pKC7내에 trp촉진유전자, RBS 및 LE를 갖는 pSK3을 생산한다. 다음에 플라스미드 pSK3은 일반적 발현 벡터 pSK4를 얻기위해 융합된 펩티드 서열 trpLE을 제거하도록 제조된다.

(1) pTRZ1의 조립-챠트 1

플라스미드 pTRZ1은 공지의 플라스미드 pMC1403 및 pVV1의 한 클론이다. 플라스미드 pMC1403은 pTRZ1의 lac Z 유전자-N-말단 8 아미노산을 제공하고 Casadaban, M.J., 일행의 J.Bacteriol, 1980,143 : 971-980에 상세히 기술되어 있다. 플라스미드 pMC1403은 3개의 독특한 제한 효소 절단 자리를 갖는다. 이것은 EcoRI으로 잘려지고, 세균 알카리성 포스파타제로 탈인산화되고 끝들을 E. 콜리 DNA 폴리머라제 I의 크레뉴(Klenow)단편으로 불활성으로 만든다. 플라스미드 pVV1는 trp촉진유전자 및 작동 유전자 서열을 제공하고 Nichols, B.P. 및 Yanofsky, C., 1983 효소학의 방법론, eds.L.Grossman 및 K.Moldave, 101 : 155-164, Academic Press, N.Y.에 상세히 기술되어 있다. 플라스미드 pVV1은 trpLE형성 trpE유전자 trp리더(leader)서열이 융합된 952 염기쌍이 삭제된(△LE1413) trp오페론을 포함한다. 플라스미드 pVV1은 PvuII 및 BglII으로 잘라서 제조 한천 겔 전기영동에 의해 분리되는 단편 2(323bp)를 생산한다. BglII는 크레뉴 효소로 채운다. 다음에 단편 2 는 pMC1403과 연결시켜 pTRZ1을 얻는다.

(2) pSK3의 조립

pTRZ1의 구조 유전자 LacY 및 LacZ는 pSK4의 조립에 불필요하고 이들을 삭제하여 더욱 독특한 클로닝 자리를 갖는 작은 플라스미드를 얻는다. 덧붙여서, LacY를 삭제하여 막-결합 단백질의 과잉생산의 해로운 효과를 피한다. 챠트 2 에 나타난 바와같이, trp서열(단편3)을 pTRZ1으로부터 EcoRI/BamHI다이제스천(digestion)에 의해 잘라내고 알카리성 포스파타제로 처리하여 재삽입을 최소로하고 다음에 다이제스천의 결과 더 이상 카나마이신에 대한 저항성을 특정화하지 않는 pKC7의 EcoRI/BamHI지역 단편 4 에 삽입시킨다. 앙시실린 저항성(AmpR) 및 카나마이신 민감성(KanS)을 갖는 클론을 trp촉진 유전자/작동 유전자서열의 삽입을 위한 제한 단편들에 대해 스크리닝한다. 이 플라스미드는 pSK3으로 불리며 그와 같은 것은 챠트 2 에 기술된 것과 같다.

(3) pSK4의 조립

pSK3의 trp촉진유전자에는 직접적인 발현 벡터의 조립에 불필요한 trpLE펩티드가 남아있다. trpLE단편은 하기 방법에 따라 잘라낸다. 챠트 3 에 기술된 바와같이, trp서열을 갖는 EcoRI/BamH단편 5를 pSk3으로부터 잘라내고 폴리아크릴아미드 겔로부터 전기용출에 의해 정제한다. 나타난 바와같이, 이 단편은 그중하나가 촉진유전자/작동 유전자 지역에 있고(TaqI") 또 하나가 리보소옴 결합 자리와 trpLE전사 개시 지역 사이에 있는(TaqI") 3개의 TaqI자리를 포함한다. 이 단편을 TaqI′로 부분적으로 소화시키고 단편들의 전부분들을 EcoRI 및 ClaI로 이미 절단된 pBR322와의 연결 반응에 사용한다.

TaqI는 T↓CGA(화살표는 가닥 절단 지점을 나타낸다)를 인식하고 ClaI는 AT↓CGAT를 인식한다. 이들 두 효소는 양립할 수 있는 결합성 말단들을 생성하기 때문에, 리보소옴 결합 자리와 trpLE사이의 TaqI′″에 대한 염기 5′는 A, CJ.(J. of Bact., 133 : 1457-1466)이고 ClaI말단에 대한 TaqI말단의 연결은 ClaI자리를 재생성한다. 이 클로닝 골격은 단일 TaqI절단들을 선택하고 또한 촉진유전자로부터 전사가 시계 방향으로 되도록 확정한다는 것을 주지한다. trp촉진유전자의 특정적 제한 패턴과 278bp EcoRI/ClaI 삽입물을 배열하는 클론을 선택하고 이는 pSK4의 등가물이 될 것이다. 이 클론은 ClaI자리에 삽입될 때 전사를 개시시킬 수 있는 단백질 서열의 발현에 유용하다.

제조 2. 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자를 암호화하는 전 길이 CDNA 분리

A. 물질 및 방법

(1) 보우스 흑색종 세포의 배양

보우스는 인간의 자연발생 흑색종으로부터 유도된 확립된 세포라인을 나타내고 뉴욕 의대 Dr Daniel Rifkin의 기증물이다. 세포를 공기 95%/CO₂5%를 사용하여 37℃의 습한대기에서 태아 소 혈장(깁코)10%와 겐타마이신(시그마)50㎍/㎖가 보충된 둘베코의 개조된 Eagle배지(깁코)에서 배양한다. 세포의 RNA제조물들을 수확하고 팥콘 150㎠플라스크에 합류하여 성장시킨다.

(2) TPA mRNA제조

보우스 흑색종 세포들로부터의 RNA를 근본적으로는 Lizardi등의 /tnal Biochem., vol 98, pp 116-122(1979)에 기술된 바와같이 분리한다.

DNA는 Aviv, H. 등의 Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 69, pp 1408-12(1972)에 기술된 바와같이 올리고데옥시티미딘-셀룰로오스(OdT셀루로오스-공동조사)컬럼을 통과시킴으로 풍부해진 폴리 A⁺이다. 분리된 OdT컬럼상에 두 번 선택된 10-150㎝^q2플래스크로부터의 전형적인 수득은 거의 50㎍ 폴리 A⁺mRNA이다.

폴리 A⁺mRNA를 15-30%직선 수크로오스 구배를 통해 원심분리하여 분류한다. 살균 증류수 200-400㎕에 용해된 폴리 A⁺mRNA(-300㎍)을 구배에 넣고 18 시간 동안 35,000 RPM에서 백크만 SW 41Ti로터내에서 원심분리시키고 0.5㎖ 분류물들을 브흘러 오토 덴시-플루우 모델 IIC(Buchler Auto Densi-Folw Model IIC)를 사용하여 수집, 상부에서 바닥까지 수확하고 길손 마이크로 분류기(Gilson Micro fractionator)(모델 FC 80-K)에 연결시킨다. 각각의 분류 물로부터의 분취액을 제노푸스 난모세포(Xenopus oocytes)에 주입하고 전사 생성물을 Miskin, R. 등의 Nuc, Acids Res. vol.9, pp 3355-63 에 기술된 것과 유사한 카제인-한천 평판법으로 플라스미노겐 활성화인자의 활성을 분석한다. TPA활성은 약 195에서 mRNA이동으로 나타낸다.

특히, 조직 플라스미노겐 활성화인자 TPA는 플라스미노겐의 카제인을 다이제스천하는 비-특이적 단백질 분해효소인 플라스민으로의 전환을 관찰함으로 분석한다. 이 분석은 다음과 같이 수행한다. 끊인 8% 카제인 0.5㎖를 2×MBS 1㎖와 혼합하고 50℃까지 가열한다. 3% 아가로스를 용융시키고 50℃까지 냉각시킨다. 3% 아가로스 0.5㎖를 카제인/MBS에 첨가하고 피페팅하여 혼합한다. 1㎎/㎖인간 플라스미노겐 100㎕를 혼합하면서 첨가하고(최종 농도가 50㎍/㎖이다) 이 물질을 직경 3.5㎝플라스틱 시계접시에 붓는다. 라가로스 용액을 실온으로 냉각시킨다(약 30분). 아마로스내의 직경 2㎜구멍을 바이오래드 커터 겔펀치로 자른다. 구멍은 사용직전에 만들고 벽은 MBS로 채운다. 분석전 적어도 6 시간에 TPA RNA를 주사한 하나 또는 두 개의 난모세포를 각각의 웰에 첨가한다. 습한 접시에서 12-24 시간 배양한다. 카세인 분해의 투명한 지역이 쉽게 관찰된다.

TPA mRNA가 풍부한 분류물에 에탄올 2 부피를 첨가하고 드라이 아이스에서 1 시간동안 항온처리하여 침전시킨다. 침전물을 에펜도르후 표(Eppindorf table)-상부 마이크로 퓨지내의 실온에서 원심분리하여 수집하고, 살균한 증류수에 용해시키고, 담그로, 재침전시킨다. 폴리A⁺mRNA가 풍부한 t-PA를 사용하여 클로닝을 위한 cDNA를 생성한다.

(3) cDNA합성

모든 반응은 얼음상에서 한다.

(A) OdT_12-18프라이머를 사용하여 첫 번째 가닥 합성

풍부 폴리 A⁺선택 보우스 mRNA(H₂O ㎕내) 10㎍을 MeHgOH(알파) 10mM 존재하에서 10 초간 실온에서 항온처리하여 2차 구조를 파괴시킨다. 계속적으로 다음 성분들을 첨가한다. : β-메르캅토에탄올 28mM까지 ; RNasin(Biotec Inc) 1 단위/㎕최종 단위 부피 : 75mM의 트리스 염기 pH 8.3 ; MgCl₂6mM ; KCL 50 mM ; 올리고데옥시티미딘(OdT_12-18공동조사) 10㎍ ; α-³²P-dCTP(아머삼) 100uCi ; dGTP, dTTP, 및 dATP 각각 50㎛까지 ; dCTP 250㎛까지(모든 뉴클레오티드는 P.L.Biochemicals로부터 입수, 100mM 트리스 염기 pH 8에 20mM용해되고 1.0M NaOH로 중화시킴) 및 역전사효소(Life Sciences Inc.) 50㎕의 최종반응부피에서 1 단위/㎍투입 RNA·반응은 42℃에서 60분간 항온처리한다.

(B) 플라이머로서 특정 15-mer올리고뉴클레오티드를 사용하여 첫 번째 가닥 합성(일반적으로 유사한 공저에 대해 Panabieres, F.등, Gene, Vol.19, pp 321-6(1982) 참조).

3′폴리 A꼬리에서 프라임된 mRNA로부터 TPA를 암호화하는 완전한 cDNA가닥을 얻는 것은 상기 공정을 사용하여 언제나 가능한 것은 아니다. 폴리 A 꼬리로부터 상류 서열을 프라이밍함으로 폴리 A 꼬리서열에서 개시되는 불완전한 cDNA와 결합될 수 있는 5′ TPA-암호화 cDNA서열을 얻는 것이 더욱 좋다.

세 개의 펜타데카머가 cDNA합성의 플라이머로서 또는 다른 탐침체로서사용하기에 바람직하다. 이들의 서열은 다음과 같다 :

5' 3' 3'TPA 위치에 대해 상보적인 것 ;

1. TCA CGG TCG CAT GTT 1759-1773

2. GGG GTT TGA GTC TCG 634-648

3. CCC ATC AGG ATT CCG 886-900

이들은 상기한 방법으로 합성하고 정체한다.

폴리 A⁺선택 RNA 25㎍을 90℃ 58㎕에서 EDTA 1.5mM과 프라이머(주형에 대해 프라이머 5-10 배 피코몰 과량) 1㎍과 함께 항온처리한다. 이 혼합물을 초기에 90℃까지 가열된 5㎖수욕에 침지시킴으로 서서히 실온으로 평형시킨다. 펜타데카머를 RNA주형에 어닐일링시킨 후, 다음 시약들을 첨가한다 : 디티오트레이톨(DTT) 2mM까지 : PNain 1 단윈/㎕ 최종 반응 부피 : 100mM 의 트리스염기 pH 8.3 : 11mM의 MgCl₂; KCl 50mM ; α-³²P-dGTP, 100μci ; dGTP, dTTP, 및 dATP 각각 50㎛ ; dCTP 50μM : 역전사 효소(Life Sciences Inc.) 1단위/㎍ RNA까지 20℃에서 3 시간동안 항온처리하고 이때 동량의 역전사효소를 더 첨가하고 반응을 50℃에서 30 분간 연속한다. 페놀추출로 반응을 종결짓고 RNA주형을 Maniatis에 상세히 기술된 바와같이 알카리성 가수분해로 제거한다.

(C) 두 번째 가닥의 합성

두 번째 가닥은 pH 7.5 KPO₄(K-포스페이트) 40mM ; MgCl₂6.6mM ; DTT 1mM ; dGTP, dTTP, D dATP 각각 500㎛ ; dCTP 250㎛ ; 3H-dCTP(아머삼) 100μCi 및 100㎕의 최종 부피내에 DNA폴리머라제 크레뉴 단편(BRL) 1 단위/투입 RNA ㎍으로 구성된 반응에서 합성된다. 반응은 15℃에서 4 시간동안 항온처리하고 이어서 3H-dCTP함입을 감시한다. 반응을 페놀 추출로 종결짓고 NH₄Ac를 첫 번째 에탄올 침전에 대해 2.5M(NaCl 0.3 몰까지 이외에)까지 첨가하는 것을 제외하고는 첫 번째 가닥 합성을 위해 상기한 바와같이 이중 가닥은 침전된다.

S₁을 사용하여 머리핀 구조를 제거한다. S₁반응은 Maniatis에 따라 수행한다. 머리핀을 성공적으로 제거하는 것은 TCA-용해성 수의 증가로 결정된다. 반응은 페놀 추출로 종결짓고 침전시키지 않는다. 수성 상들을 모으로 폴리 A⁺mRNA분류에 사용된 것들과 동일한 수크로오스 구배에 직접 넣는다. 분류물을 수집하고 5㎕ 분취액을 10㎖의 아쿠아플루어 신틸레이션 유동액(New England Nuclear)에 용해시키고³²P 및³H를 측정하여 분석한다. 관련 분류물로부터의 cDNA를 에탄올 2 부피를 첨가하고 드라이아이스에서 30 분간 항온처리하여 침전시킨다. 침전물을 에펜도르프 마이크로 퓨지내 실온에서 15 초간 원심분리하여 펠릿화한다. 펠릿을 살균한 0.3M NaCl에 용해시키고 모으로 재침전시킨다. 침전물을 펠릿화하고 건조시킨다.

(D) 벡터 DNA에 cDNA의 어니일링 및 꼬리화(tailing)

dCTP의 단입중합체 부분을 Maniatis에 기술된 방법에 따라 cDNA분자의 3'말단에 효과적으로 첨가한다. 이상적으로 dCTP의 10-30잔사가 클로닝 효과를 최대를 하기 위해 첨가되어야 한다.

벡터 DNA(pBR 322를 Pst1으로 완전히 소화하고 dGTP잔사의 단일중합체 부분을 첨가하여 제조됨)는 New England Nuclear로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 또한 벡터 DNA는 Maniatis에 기술된 방법에 따라 제조할 수 있다. 벡터 DNA와 cDNA를 어니일링하는 방법 또한 Maniatis에 기술되어 있다. 간단하게 꼬리화 cDNA는 pH 7.4의 트리스 10mM ; NaC1 0.4M ; EDTA 1mM을 포함하는 50㎕ 반응기내에 몰비 1:1로터와 혼합한다. 최종 DNA농도는 20-60㎍/ml이다. 1)65^o/10' ; 42^o/60' ; 37^o: 2시간 및 실온에서 2시간으로 구성된 항온 처리를 행하거나 2)수욕을 닫고 65°/10'에서 항온처리하고 서서히 실온으로 밤새 평형기킴으로 어니일링을 수행한다.

(E) 전 길이 TPA cDNA의 클로닝 및 서열 확정 챠트 4-5

cDNA함유 벡터를 상기한 형질전환공정을 사용하여 E.콜리내로 도입시킨다. 세균을 상기한 교잡 방법을 사용하여 현장에서 스크리닝한다.

여기에 기술된 집락 교잡은 탐침체로서 상기한 펜타데카머를 사용한다.교잡 탐침체로 사용하기 위해,15-mer 1μg을 트리스-염기(pH 7.6) 70mM ; KCl 100mM ; MgCl₂10mM; 디티오트레톨 5mM 및r³²P dATP 50μCi(P.L Biochemicals) 및 1ν T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (New England Biolads)로 구성된 50㎕ 반응 부피에서 인산화한다. 37℃에서 60분간 항온처리한다. 이 방식에서, 15-mer을 1×10⁸cpm/㎍의 특정 활성으로 표지할 수 있다.

탐침체에 상보적 서열을 나타내는 클론을 클론의 Pst1제한 분석을 사용하여 2 차 스크리닝을 위해 선택하여 소화 생성물이 제 1 도 또는 Pennica등의 “E.콜리내 인간 조직-유형 플라스미노겐 활성화 인자 cDNA의 클로닝 및 발현”,Nature, Vol.301, PP 214-21(1983. 1. 20)에 주어진 서열로부터 얻을 수 있는 Pst1제한 지도와 일치하는지 결정한다. 소요의 클로들은 TPA cDNA의 3′부분의 큰 부분을 갖는다. 소화시켜 원래의 pBR 322벡터, 1150bp단편, 80bp단편 및 78bp단편의 4 개의 단편을 생산한다. 이 결과들은 유전자의 3′-말단(뉴클레오티드 1250-2550)의 약 1300bp삽입 간격을 암시한다. 이 가정을 확정하기 위해서, 클론을 Pst1와 Dde1으로 이중으로 소화시킨다. 후자 효소는 78 또는 80bp 단편은 그대로 놔두면서 1150bp단편을 926bp단편과 229bp단편으로 절단하여야 한다. 그러한 이중 소화의 결과는 클론이 사실상 TPA 유전자의 3′-말단을 나타낸다는 결론을 지지한다.

마지막 증거로, DNA의 미니-제조물을 클론으로부터 분리하고 디데옥시 사슬 종단으로 서열화한다. 플라스미드 DNA의 미니 제조물을 일반적 방법 부분에 기술된 바와같이 제조한다. 디데옥시 서열화는 20 : 1 몰 초과량 주형에서 플라이머로서 펜타데카머 ＃1을 사용하여 일반적 방법 부분에 기술된 바와같이 수행한다. pTPA H로 고안된, 이 클론으로부터 유도된 서열 자료는 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자(챠트 4)의 Pennica등의 Nature, vol.301, PP.214-21(1983)에 나타난 서열 자료와 동일하다.

이제부터, 유전자의 5′-말단의 분리에 초점을 맞춘다. 이를 실행하기 위해서, cDNA를 OdT_12-18보다는 펜타데카머 ＃1로부터 뻗어있는 프라이머에 의해 두 번-선택된 폴리 A⁺mRNA로부터 합성한다. 이 접근에 의해 제공된 이점은 두배이다. 첫째로, 프라이밍은 TPA에 특이적이기 때문에 만들어지 cDNA의 높은 퍼센트가 TPA 특정 서열로 나타나야 한다. 둘째로, 프라이밍은 폴리 A 꼬리의 몇몇 800bp 5′이기 때문에, 첫 번째 가닥 합성을 프라임하기 위해 OdT_12-18에 의해 자리가 사용되어야 한다. 이것은 이 접근으로부터 유도된 cDNA가 pTPA H보다 5′에 더욱 뻗어 있는 전사물을 포함할 것이라는 것을 확정한다.

이 TPA-프라임 cDNA를 사용한 형질전환 효율은 형질전환체 2.5×10⁵/cDNA ㎍이다. 총 25,000 형질 전환체의 두 저장물을 생산한다. “유전자-작동”의 개념을 의도적으로 스크리닝에 적용한다. pTPA H5′-말단 80bp Pst1단편을 겔 분리하고 프라이머 확장 저장물로부터 유도된 28,000집락을 탐침하는데 사용한다. 이는 특히 pTPA H와 같이 먼 5′로 적어도 확장된 클론을 선택하고 또한 프라이머 확장 접근의 결과로 부가적 5′서열을 포함하는 클론을 선택한다.

현장에서 교잡에 의한 스크리닝은 다수의 양성을 산출한다. 가장 긴 TPA 삽입물은 Pst1 및 Dde1로 2 차 스크리닝에서 검출된다. 본 발명에서, pTPA 80-1로 고안된 클론을 삽입 간격 뉴클레오티드 550-1600(쳐투 4)를 포함한다.

제한 자료는 3′말단의 위치를 매우 정확하게(＋/－ －10%)결정하는 것을 가능하게 한다. 프라이밍이 뉴클레오티드 1759에서 시작되면, pTPA 80-1은 약 1600 위치에 3′말단을 가지며 클로닝시 다소의 지점에서 거의 160 염기쌍들이 손실된다. S₁엔도뉴클리아제는 손실 때문에 가장 좋다.

pTPA H와 pTPA 80-1의 방향을 결정한다. 플라스미드 pTPA H와 pTPA 80-1을 SacI 및 PvuI로 절단하여 단편들 7(1251bp)과 8(5.1kb)를 각각 산출하고 겔 분리한다. 단편들을 세균 알카리성 포스파타제로 처리하고 T4 폴리머라제를 사용하여 연결시켜서 TPA cDNA 550-2230염기 위치를 갖는 pTPA 3′ cDNA(6.3kb)를 생성한다. 새로운 조립물을 Pst1소화에 의해 증명한다.

pTPA 80-1이 첫 번째 프라이머 확장 저장물에서 발견된 양성물중 가장 긴 TPA 삽입을 나타내기 때문에, 아미노산 잔사 233-237(뉴클레오티드 886-900 ; 15-mer ＃2)의 암호화 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 5′말단을 완성하기 위해 다른 cDNA라이브러리를 생산하는데 사용한다. 이 특정 범위의 유전자를 선택하여 S₁이 전사물의 3′말단으로부터 200bp와 같이 많이 제거되고 pTPA 3′ cDNA와 충분히 겹쳐져서 단편들을 회합시킬 수 있도록 한다.

5′염기들을 포함하는 cDNA를 PstI절단 pBR322에 연결시키고 상기한 바와같이 E.콜리를 형질전환시킨다. 이 cDNA로 행한 형질전환 효율은 형질전환체 3.64 10⁴/cDNA ㎍이다. 이 라이브러리로부터의 집락을 뉴클레오티드 645-660(15-mer ＃3)으로 부터의 확장 암호화 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 스크리닝하고 불분명한 양성물들을 선택한다. 2 차 스크리닝을 Pst↑ 및 BglII으로 성취하고 pTPA 5′ cDNA로 고안된 한 클론은 잔존 5′서열 1-750을 포함하는 것으로 나타났다. 다시, 삽입 길이에 대한 S₁의 효과는 pTPA 5′ cDNA로 자명하다. 프라이밍이 뉴클레오티드 886에서 시작될 때, pTPA 5′ cDNA는 단지 약 750 뉴클레오티드로 확장되며 ; 우리의 작업은 약 136bp의 손실을 보인다.

두 집락(pTPA 3′와 pTPA 5′ cDNA)상의 유용한 전 TPA서열로, 회합체의 최종 작업을 한다. 방법은 차트 5 에 나타났다.

플라스미드 pTPA 5′ cDNA를 TaqI로 절단하여 단편 9(2194bp)를 생산한다. pTPA 5′ cDNA의 TPA서열내의 한 TaqI자리(위치 634)는 효소에 매우 저항성이다. 단편 9를 BglII 및 H HgaI로 절단하여 단백질의 성숙한 부분을 나타내는 TPA cDNA의 188-593염기를 갖는 단편 10(405kb)을 생산한다.

TPA cDNA의 중간 부분을 EcoRI 및 PuvII으로 pTPA 3′ cDNA를 먼저 절단하고 단편 11(1748bp)을 분리하여 얻는다. 다음에 단편 11을 HgaI로 절단하여 염기 594-802를 포함하는 단편 12(209bp)을 생산한다.

cDNA의 3′부분을 얻기 위해서, pTPA 3′ cDNA를 PvuI로 소화하고 6.3kb단편을 분리하고 T4 폴리머라제로 처리하고 EcoRI로 부분적으로 소화하여 염기 802-2230을 포함하는 단편 13(1871bp)을 생산한다.

cDNA의 세 부분을 연결시키는 것은 공적으로 입수가능하고 Rac, R.N., 및 Rogers.S.G., 플라스미드 pKC 7 : DNA부분 클로닝에 적당한 10 개의 제한 자리로 갖는 벡터, Gene 7 : 79-82(1979)에 상세히 기술되어 있는 pKC7의 사용을 포함한다. 플라스미드, pKC7을 BglII과 SmaI로 소화하고 세균 알카리성 포스파타제로 처리하여 단편 14(4.8kb)를 생산하고 이를 겔 분리한다.

단편 10, 12, 13 및 14를 단일 연결 푸울에서 연결시킨다. 이 방법의 한 특기할 만한 특징은 내부 단편의 알카리성 포스파타제 처리의 필요성이 없다는 것이다.

통상적으로 다중조각을(그 4 단편)연결시키면 단편들의 공동성에 기인한 매우 낮은 효율을 갖는 소요의 조립물이 생산된다. 적당한 방식으로 알카리성 포스파타제로 처리하면 이 문제를 최소로 하고 정확한 다중 조각 회합체의 효율을 극적으로 증가시킨다. TPA 단편들을 회합함에 있어서, 제한 엔도뉴클리아제, Hgal이 DNA를 절단하는 유일한 방법의 이점을 갖는다. 효소의 인식(결합)서열은 GACGC이지만 효소는 인식서열 이외의 지역에서도 절단한다. 결과적으로 Hgal로 절단된 단편들은 단지 그들의 원래의 인접한 대응물과 연결된다. Hgal걸침에 의해 촉진된 자기-연결을 발생할 수 없다. 4-조각 TPA 연결은 Hgal말단을 함유하는 두 개의 단편을 포함한다. 이는 알카리성 포스파타제로 벡터를 처리하는 것에 덧붙여서(자기-폐쇄를 최소로 함)올바르게 회합된 TPA유전자를 포함하는 형질 전환체 대부분을 초해한다. 정확한 회합은 제한 소화로 증명된다. TPA의 완전한 cDNA서열을 포함하는 플라스미드는 pTPA cDNA(7-4kb)로 고안된다.

[실시예 1]

합성 올리고뉴클레오티드의 제조

87 분리 올리고뉴클레오티드(제 3 도)를 상기 방법에 따라 합성한다. 기술된 방법은 187 위치의 BglII자리와 1287 위치의 EcoRI자리 사이의 합성 DNA의 1084 염기쌍들을 pTPA-B1, 2, 3 로 회합시킨다.(챠트 9)사이영역 지역내로 삽입시키기 위해 선택된 특정 제한 자리는 챠트 10 및 11 에 기술되어 있다. 각각의 블럭은 서열을 증명하고 E.콜리내에서 복제하기 위한 적당한 클로닝 벡터와 재조합된다. 사용된 모든 연결 및 클로닝 방법론은 상기한 Maniatis 등에 기술된 바와같다. 모든 클로닝된 서열은 서열을 증명하기 위해 생거 디데옥기 서열화 기술을 사용하여 서열화한다.

블럭 1

올리고뉴클레오티드 P1-P4, P8-P11을 어니일링하고 연결하여 올리고뉴클레오티드 P5-P7 및 P12-P14로 구성된 두 번째 조각에 연결된 이중 가닥 조각을 형성한다. 결과 형성된 블럭 1 은 핑거 영역 암호화 서열을 포함한다. 블럭스를 제조 1에 기술된 pSK4의 SphI자리로 클로닝한다.

블럭 2

핑거 영역 암호화 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 P15-P18 및 P19-P23 은 단일 단계 어니일링 및 연결시 함께 연결되어 블럭 2를 형성하고 pBR 322 의 SphI 및 ClaI자리로 클로닝된다.

블럭 3

올리고뉴클레오티드 P24-P28, P34-P38은 어니일링되고 연결되어 올리고뉴클레오티드 P29-P33 및 P39-P43으로 구성된 두 번째 조각에 연결된 이중가닥조각을 형성한다. 결과 형성된 블럭 3은 클린글 1 영역 암호화 서열을 포함한다. 블럭 3은 pBR 322의 ClaI 및 BamHI자리로 클로닝된다.

블럭 4

올리고뉴클레오티드 P44-P47 및 P67-P70 ; P48-P51 및 P71-P74 ; P52, P53, P92, P93 및 P75, P76, P94, P95 ; P57-P61 및 P80-P94 ; 및 P62-P66 및85-P89 각각을 5 개의 분리된 관에서 어니일링하여 이중 가닥 조각으로 만들고 다음에 이들은 한데 모으고 연결하여 블럭 4를 형성한다. 블럭 4 는 크린글 2 영역을 암호화하는 DNA서열을 포함한다. 블럭 4를 pBR 322의 BamHI 및 EcoRI자리로 클로닝한다.

[실시예 2]

블럭 1-4와 TPA cDNA의 활성 자리의 회합. 챠트 6-11

다음 실시예는 실시예 1의 여러 합성 블럭들을 생물학적으로 활성인 TPA를 암호화할 수 있는 유전자로 회합하는 데 필요한 단계들을 요약해 놓은 것이다. 두 개의 원형 유전자들을 기술하였다. 플라스미드 pTPA-B1, 2, 3, 4(a)는 크린글 2 영역과 활성 자리사이에 인공적으로-도입된 엔도뉴클리아제 자리를 갖지않는 TPA암호화 유전자를 갖는다. 플라스미드 pTPA-B1, 2, 3, 4 는 크린글 2 와 활성 자리사이에 인공적으로-도입된 엔도뉴클리아제 제한 자리를 갖는 TPA 암호와 유전자를 갖는다.

A. pTPA-B1의 조립-챠트6

플라스미드 pSK4를 ClaI와SphI로 소화하고 큰 4.1kb 단편 15를 분리하고 ClaI/XbaI연결자를 사용하여 블럭 1 단편으로 연결시킨다. 연결 혼합물을 Maniatis에 의해 기술된 염화칼슘 형질전환 방법을 사용하여 HB101을 형질전환시킨다. 형질전환체들을 Maniatis 등에 의해 기술된 결손 전사 방법을 사용하여 결손 전사 블럭 1 단편들로 스크리닝한다. 탐침체로 교잡시킨 형질전환체를 생거 디데옥시 서열화 기술을 사용하여 서열화하여 올바른 서열 및 방향을 증명한다. 이 새로운 형질전환체는 pTPA-B1(4.25kb)로 기록한다.

B. pTPA-B1,2의 조립-챠트 7

플라스미드 pTPA-B1을 EcoRI로 소화하고 단편 16(450bp)을 분리한다. 플라스미드 pBR322를 EcoRI 및 ClaI로 소화하고 큰 단편 17(4.35kb)를 겔 분리한다. 다음에 단편 16 및 17을 연결시켜 SphI/ClaI 블럭 2를 합성한다. 연결 혼합물을 HB101로 형질전환시키고 형질전환체를 결손 전사 블럭 2 로 스크리닝한다. 탐침체로 교잡시킨 형질전환체를 서열화하여 이들이 그 적당한 방향에서 블럭 2를 포함하는 것을 확정한다. 이 조립물은 pTPA-B1, 2(4.8 kb)로 표시한다.

C. pTPA-B1, 2(a)의 조립-챠트 8

플라스미드 pTPA-B1, 2(a)는 핑거 및 성장 인자 영역의 상류에 HindIII 및 BglII제한 자리를 포함한다. 플라스미드 pTPA-B1, 2를 XbaI 및 EcoRI로 소화하고 큰 4.5kb 단편 18을 겔 분리하고 HindIII 및 BglII자리를 포함하는 올리고뉴클레오티드 결합자로 연결시킨다. 연결 혼합물을 HB101로 형질전환시키고 형질전환체를 HindIII/BglII자리의 존재에 대해 스코리닝한다. 이 새로운 조립물은 pTPA-B1, 2(a)(4. 5 kb)로 표시한다.

D. pTPA-B1,2, 3 의 조립-챠트 9

플라스미드 pTPA-B1, 2(a)를 ClaI 및 BamHI로 소화시키고 큰 4.0 kb 단편 19를 분리한다. 이 단편을 연결시켜 블럭 3(270bp)을 포함하는 ClaI/BamHI 크린글 1 지역을 합성하고 HB101 내로 형질전환시킨다. 이 형질전환체를 결손 전사 블럭 3 으로 스크리닝한다. 블럭 3 으로 교잡된 형질전환체를 서열화하여 서열 및 방향을 확정한다. 이 새로운 조립물은 pTPA-B1, 2, 3(4.3kb)로 표시한다.

E. pTPA-B, 1, 2, 3, 4a의 조립-챠트 10

이 플라스미드는 효소적 활성을 갖는 TPA상사체 암호화 전체 원형 TPA유전자를 포함한다. 이 유전자에는 크린글 2 와 활성 자리사이의 사이영역 지역에 변화가 없다. pTPA-B1, 2, 3, 4a(4.2 kb)의 조립은 여러단계들을 필요로 한다. 플라스미드 pTPA cDNA(챠트 5)를 BcaI로 절단하고 TPA 유전자 3′말단을 암호화하는 단편 20(6.0 bp)를 겔 분리한다. 플라스미드 pTPA-B1, 2, 3(챠트 9)을 ScaI 및 BamHI로 절단하여 핑거, 성장 인자 및 크린글 1 영역들을 포함하는 단편 21(1100 bp)을 얻는다. BamHI 및 ScaI로 블럭 4를 절단하여 세번째 단편 4a(230bp)를 얻는다. T4 리가제를 사용하여 세개의 단편을 연결하여 pTPA-B1,2,3,4^＊를 얻는다. HindII 및 AatII를 사용하여 TPA 유전자로부터 pBr322를 잘라내어 2.2 kb 단편을 얻고 이를 pUC-19로 부클로닝한다. 플라스미드 pUC-19 는 여러 가지 원으로부터 상업적으로 입수가능하고 그 DNA 서열내에 TPA 영역 조작을 간편하게 만드는 제한 자리들의 선택을 포함한다.

F. pTPA-B1, 2, 3, 4의 조립-챠트 11

이 플라스미드는 효소적으로 활성인 TPA 상사체를 암호화하는 전체원형 TPA 유전자를 포함하다. 이 상사체에 있어서, 4개의 모든 영역들 및 활성 자리에는 크린글 2 와 활성 자리사이의 지역을 포함하는 모든 사이영역 지역들내로 공정처리된 유일한 제한 자리들이 존재한다. 이 플라스미드는 먼저 pTPA-B1, 2, 3, 4a를 EcoRI 및 BamHI로 절단하고 핑거, 성장 인자 및 크린글 1 영역들을 포함하는 큰 3.7kb단편을 분리함으로 조립한다. 합성하여 만들어진 블럭 4는 그 클론을 BamHI로 소화시키고 EcoRI로 부분적으로 소화시켜 560kb를 갖는 완전한 블럭 4를 생산함으로 얻는다. 두 단편들을 T4를 리가제를 사용하여 연결시킴으로 pTPA-B1, 2, 3, 4를 얻는다.

플라스미드 pTPA-B1, 2, 3, 4a 및 pTPA-B1, 2, 3, 4를 사용하여 여러 가지 합성 TPA 상사체들을 조립할 수 있다.

[실시예 3]

TPA상사체의 조립

A. pFK1K2A의 조립(성장 인자 영역 결손)

플라스미드 pTPA-B1, 2, 3, 4a를 EcoRV로 소화시키고 HpaI로 부분적으로 소화시켜서 334 자리는 소화시키나 724 는 소화시키지 않는다. 큰 단편(4.1 kb)를 분리하고 다시 연결시켜 pFK1K2A를 형성한다. 다음에 플라스미드 pFK1K2A를 HB101 또는 몇몇 다른 적당한 숙주로 형질전환시킨다. 다음에 이 플라스미드를 정확한 방향 및 서열에 대해 스키리닝한다.

B. pFK2A의 조립(성장인자 및 크린글 1 영역의 결손)

플라스미드 pTPA-B1, 2, 3, 4를 HpaI로 소화한다. 큰 6.5kb 단편을 분리하고 다시 연결시켜 pFK2A를 형성한다. 플라스미드를 HB101 또는 몇몇 다른 적당한 숙주로 형질전환시키고 정확한 방향과 서열에 대해 스키리닝한다.

C. pFK2K2A의 조립-챠트 12(성장 인자 및 크린글 1 의 결손과 크린글 2 의 중복)

플라스미드 pTPA-B1, 2, 3, 4(챠트 11)를 HpaI로 소화시켜서 단편 22(3.9 kb)를 얻고 이를 분리한다. TPA-B1, 2, 3, 4의 두 번째 샘플을 HpaI 및 MstI로 소화하고 결과형성된 크린글 2 영역을 포함하는 560bp단편 23을 분리한다. HpaI 소화 FK2A단편을 끝을 뭉툭하게 HpaI/MstI 단편과 연결시켜 pFK2K2A(4.1 kb)를 생산한다. 다음에 플라스미드 pFK2K2A를 HB101로 형질전환시키고 정확한 방향 및 정확한 서열에 대해 스크리닝한다.

D. E. 콜리내에서 플라스미드 pTPA Exp1발현-챠트 13

TPA상사체들의 발현은 챠트 7 에 나타난 pTPA-B1, 2, 챠트 6 에 나타난 pTPA-B1 또는 그 등가물의 발현 플라스미드를 사용하여 E. 콜리내에서 성취할 수 있다. 이들 상사체들중 어떤 것을 발현을 위해 XbaI 및 BamHI자리들 사이에 놓을 수 있다. E. 콜리내에서 pFK2K2A를 발현시키기 위해서는, pTPA-B1, 2(챠트 7) 및 pFK2K2A(챠트 12)를 XbaI 및 BamHI로 절단하고 단편 24(4.2 kb) 및 25(2.0 kb)를 겔 분리한다. 단편 24 및 25를 연결하여 발현 플라스미드 pTPA Exp1(6.2 kb)를 형성한다.

플라스미드 pTPA Expl은 Trp촉진 유전자 및 작동유전자를 포함하고 발현은 구성적이다. E. 콜리는 Maniatis(상기 참조)에 따라 배양한다. E. 콜리 배양물은 활성 TPA를 생산하지 못한다. E. 콜리에 의해 생산된 TPA는 자연 상태로 다시 포개져야 한다. 다음의 공지 시스테인 전환 방법에 의해서 활성 TPA를 얻을 수 있다. 미합중국 특허 제 4, 511, 502 호.

[실시예 4]

[A. 효모에서의 인간 TPA의 발현]

이 실시예는 MFα1 촉진 유전자 및 pre-pre 서열을 갖는 효모 발현 플라스미드 pα1-FK2K2A의 조립을 설명한다. 또한 균주는 효모내에서의 TPA상사체의 발현을 위한 배양 조건 및 바람직한 숙주를 제공한다.

(1) pα1-ADTt, 효모 발현 벡터의 조립

플라스미드, pα1-ADHt는 효모의 다목적 발현 벡터이다. 편리한 지점에서의 제한 자리들을 그 구조내로 공정처리하고 MFα1를 촉진 유전자가 일반적으로 높은 수준의 발현에 대해 병립하도록 조절한다. 다음 단계들은 pα1-ADHt의 조립을 설명한다.(챠트 14-18)

a. pYRep 3′B의 조립-챠트 14

플라스미드 pYRep 3′B는 2μ 플라스미드의 REPIII 및 복제 지점 서열을 pYIP31의 URA3유전자의 SmaI자리에 놓아서 편리한 카세트를 만들어 조립한다. 두 플라스미드 2μ 및 pYIP31은 공공으로 입수가능하고 문헌에 상세히 기술되어 있다. 2μ 플라스미드는 J.R.Broch, 효모 Saccharomyces cerevisiae의 분자 생물학[생활 주기 및 유전], pp 445-470에 상세히 기술되어 있고 RepIII지역은 세포 24 : 95-104(1983) 및 세포 35 : 487-493(1983)에 기술되어 있다. 플르스미드 pYIP31은 유전자 18 : 17-24(1979)에 기술되어 있다.

플라스미드 pYIP31을 먼저 SmaI로 절단하고 세균 알카리성 포스포타제로 처리하여 단편 26(5.4 kb)을 생산하고 이를 분리한다. 효모의 2μ 플라스미드를 PstI 및 XbaI로 절단하고 크레뉴로 채우고 단편 27(1.3 kb)을 분리한다. 단편 26과 27을 T4 리가제를 사용하여 연결시켜서 pYRep 3′B(6.7 kb)를 얻는다.

b. pADHt의 조립-챠트 15+16

플라스미드 pADHt(3.86 kb)는 효모 발현벡터를 회합하기 위해 유용한 제한 자리들을 제공하기 때문에 유용하다.

pADHt조립을 위한 출발 플라스미드는 pGG400(4.0 kb)이다. 플라스미드 pGG400은 공적으로 쉽게 입수 할 수 있는 플라스미드 pBR322 및 pML21로부터 조립할 수 있다. J. Bacter., 126: 447-453(1976) 특히, 테트라사이클린 저항성 암호화 pBR322 유전자는 카나마이신 저항성 암호화 pML21 부분으로 대치된다. 플라스미드 pBR322를 먼저 EcoRI 및 PvuII으로 절단하고 걸쳐진 EcoRI를 크레뉴효소로 채우고 아가로스 겔로부터 분리하여 단편 28(2.3 kb)을 얻는다. 플라스미드 pML21을 PuvII로 절단하여 카나마이신 저항성 유전자를 합유하는 단편 29(1.7 kb)를 얻는다. PuvII절단 자리와 채워진 EcoRI자리를 연결시켜서 연결후 EcoRI자리를 생성한다. 단편 28과 29를 연결시켜 pADHt조립에 사용되는 pGG400을 생성한다.(챠트 15)

PvuII 및 XhoI로 pGG400을 절단하고 크레뉴 효소로 처리함으로 단편 30(3.5 kb)을 얻고 이를 분리하여 플라스미드 pADHt를 조립한다. 효모 알코올 탈수소화효소 I(ADHI)의 3′말단을 pADHBC로부터 HincII 및 BamHI로 공공으로 입수가능하고 J. Biol. Chem. 257 : 3018-1025(1982)에 상세히 기술되어 있다. 단편 30과 31을 연결하여 다른 것들과 함께 pADHt를 얻고 E.콜리내로 형질전환시킨다. pADHt를 함유하는 이 형질 전환체들은 그들 플라스미드내에 재생성된 BamHI와 XhoI자리를 갖는다. 이 형질전환체들을 선택하고 클로닝된 ADHI 3′-말단의 확실성을 제한 효소 분석 및 서열화로 확정한다.(챠트 16)

c. pADHt-REPIII의 조립-챠트 17

플라스미드 pADHt-REPIII(6.2 kb)는 효모내에서 복제 및 발현을 용이하게 하기 위해서 URA3-REPIII-ori카세트를 pADHt내에 넣는 pADHt와 pYRep 31B의 조립물이다. 플라스미드 pADHT-REPIII은 EcoRI-HinDIII 또는 EcoRI-SmaI단편들이 적당한 효모 촉진 유전자를 함유하는 소요의 DNA단편으로 대치될 수 있거나 복제 기점, 선택성 표시유전자 및 효모 URA3 유전자의 3′말단을 함유하는 SalIXhoI단편을 제공하는데 사용할 수 있기 때문에 효모내에서 발현 벡터를 조립하는데 유용하다.

플라스미드 pADHt는 BamHI로 절단하고 그 끝을 크레뉴 효소로 채우고 8-mer SalI연결자를 채워진 BamHI자리에 삽입시킴으로 개조한다. 플라스미드 pADHt(개조된)를 SphI로 절단하고 그 끝을 T4 폴리머라제로 채워서 단편 32(3.8 kb)를 생산한다. 플라스미드 pARep 31B를 HindIII으로 절단하고 URA3의 3′말단과 안정성을 높이는 것으로 생각되는 2μ RepIII지역 및 복제의 기점을 포함하는 단편 33(2.4 kb)을 분리한다. 단편 32 및 33을 연결시키고 시계방향 전사를 허락하는 URA3 유전자 방향을 갖는 플라스미드를 포함하는 E. 콜리 형질전환체를 스크리닝하여 pADHt-REPIII을 얻는다.

d. pα1-ADHt의 조립-챠트 18

pα1-ADHt(6.5 kb)의 조립은 pADHt-REPIII의 EcoRI-HindIII 단편을 MFα1 유전자의 pre-pro 서열 및 촉진유전자를 포함하는 pα1으로 부터의 EcoRI-HindIII단편으로 대치시킴으로 완성한다, 플라스미드 pα1은 A. Singh일행의 핵산연구, 11 : 4049-63(1983) 및 J.Kurjan일행의 세포, 30 : 933-943(1983)에 상세히 기술되어 있다. 플라스미드 pADHt-REPIII,을 먼저 EorRI 및 HiNdIII으로 절단하고 단편 34(5.3 kb)를 생산하고 이를 분리한다. 또한 플라스미드 pα1을 EcoRI 및 HindIII으로 절단하고 단편 35(1.2 kb)를 생산하고 이를 분리한다. 다음에 단편 34 및 35를 T4 DNA리가제를 사용하여 연결시켜서 pα1-ADHt를 얻는다.

(2) 효모 발현 벡터내로 TPA 상사체 cDNA의 삽입, pα1-라2K2A의 조립-챠트 19

MFα1 촉진유전자를 갖는 효모내 TPA 상사체 생산을 위한 바람직한 발현 벡터는 pα1-FK2K2A로 표시한다. 플라스미드 pFK2K2A(챠트 12)를 BglII으로 절단하여 단편 36(2.0 kb)를 얻고 이를 겔 분리한다. 플라스미드 pα1-ADHt를 HindIII 및 XhoI로 절단하여 단편 37(5.6 kb)를 얻고 전사, 폴리아테닐화 및 해독 자리를 제공한다. 여기에 기술된 계는 성숙한 TPA단백질로부터 하류를 종단하고 결과 형성된 생성물은 효모 기점의 소수의 부가적 아미노산을 갖는다. TPA유전자의 정확한 말단에서 전사를 종결짓기 위해서는, 말단 코오돈을 제공할 수 있다.

상사체가 MFα pre-pro 서열의 해독구조와 함께 상내에 있다는 것을 확정하기 위해서, 상사체의 5′및 3'-말단을 변화시킨다. 5' 말단에서의 BglII자리는 MFα1 ‘pre-pro’서열과 함께 해독 구조를 상내에 유지하면서 다른 연결자를 삽입하거나 크레뉴(PoLI) 및 Mung Bean뉴클리아제의 조합으로 조작하여 HindIII자리를 생성할 수 있다. 이 실시예에서는, 단편 37의 BglII자리를 크레뉴를 사용하여 아데노신 및 구아노신으로 부분적으로 채운다. 다음에 부분적으로 채워진 자리를 Mung Bean 뉴클리아제로 뭉툭하게 만들고 pα1-ADHt의 HindIII자리에 연결시킨다. 단편 36 과 37(부분적으로 끝이 채워짐)을 연결하여 pFK2K2A(7.6 kb)를 생산한다. 다른 상사체 TPA유전자도 또한 해독 구조가 효모 서열과 함께 상내에 유지되는한 발현 벡터에 끝이 뭉툭하게 삽입될 수 있다.

(3) 효모에서 플라스미드 pα1-FK2K2A부터의 TPA상사체의 발현

효모 균주 YNN 227(α, ura3-52 trpl-289)을 pα1-FK2K2A로 형질전환시킨다. 형질전환체를 글루코오스 최소 배지(글루코오스 2%, 효모 질소 염기 0.7%, 카사미노산 1%, 아데닌 40㎍/㎖, 트립토판 50㎍/㎖)에서 10 시간동안 배양한다. 다음에 세포를 원심분리시켜 펠릿화한다. 세포를 유리 구슬로 휘저어 용해시킨다. TPA양은 웨스턴 블롯팅 기술 또는 방사성면역분석 또는 제노푸스 난모세포에 대해 초기에 기술된 한천내에서의 카제인 효모 분석을 사용하여 검출할 수 있다.

TPA는 효모 세포로부터 먼저 세포를 0.5㎜유리 구슬로 용해시키고 이어서 친화 컬럼상에서 정제함으로 분리할 수 있다. 표준 단백질 정제 골격은 더욱 정제할 수 있다.

B. 차이니스 햄스터 난소 세포내에서 TPA상사체들의 발현-챠트 20-22

다음 실시예는 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포에서 pFK2K2A를 발현시키는 바람직한 방법을 기술한다. 요약하면 여기에는 E. 콜리 및 CHO세포에서 표시유전자로서 각각 암피실린 저항성 및 디히드로플레이트 리덕타제 유전자를 사용하는 CHO 및 E. 콜리 세포내에서 복제하는 왕복 벡터 pSVCOW7이 기술되어 있다. 또한 플라스미드 pSVCOW7은 CHO세포에서 발현에 필요한 소성장 호르몬으로부터의 폴리아데닐화서열을 제공한다. 플라스미드 pSVCOW7을 먼저 절단하고 바이러스 촉진유전자 및 TPA상사체를 삽입시킨다. CHO세포에서 발현된 TPA의 형질전환 배양조건 및 추출 방법도 아래에 기술했다.

(1) pSVCOW7의 조립-챠트 20

출발 플라스미드 pSV2dhfr(미국형 배양 수집소로부터 구입할수 있고 또는 S.Subramani일행의 “Expression of the Mouse Dihydrofolate Reductase Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40”, Molecular’ and Cellular Biology 2 : 854-864(1981. 9)의 방법에 따라 제조될 수 있다)을 BamHI 및 EcoRI로 소화시켜서 암피실린 저항성 유전자, SV40기점 및 dhfr유전자를 포함하는 단편 38(5.0 kb)를 제공한다. pSVCOW7의 두 번째 부분은 플라스미드 pλGH2R2를 pSV2dhfr을 절단하는데 사용된 동일한 제한 엔도뉴클리아제로 소화하여 게놈 소 성장 호르몬 유전자의 3'말단, 즉, BGH gDNA를 포함하는 단편 39을 얻음으로 생성할 수 있다. 플라스미드 p2GH2R2는 일리노이스, 페오리아의 북구 연구 실험실에 기탁된(NRRL B-15154) E. 콜리 HB1 숙주로부터 공공으로 입수가능하다. 단편들 38 과 39를 연결하여 pSVCOW7(7.1 kb)를 얻는다.

(2) pTPA-cDNA, BamHI이 조립-챠트 21

pSVCOW7내로 TPA상사체를 용이하게 삽입시키기 위해서, 성숙 단백질 서열의 상류인 TAP의 리더 서열내에 편리한 BamHI자리를 삽입시키는 것이 필요하다. 이를 성취하기 위해서 pTPA 5′ cDNA(챠트 5)를 HgaI로 절단하고 염기 78-593을 포함하는 단편 40(517 bp)을 크레뉴 효소로 상기시킨다. 상기된(flush)말단을 10-mer BamHI연결자에 연결시키고 단편 40을 NarI로 절단하여 TPA cDNA의 염기 68-521을 갖는 단편 41을 생성한다.

플라스미드 pTPA-cDNA(챠트5)를 /VarI 및 BglII으로 절단하고 TPA cDNA의 3'부분을 포함하는 단편 42(ib44bp)를 겔 분리한다. 단편 41 및 42를 pkc7을 BamHI 및 BglII로 소화시켜 생성된 단편 43에 연결시켜 pTPA-cDNA, BamHI(6. 5kb)를 생성한다.

(3) pTPA-IE-PA의 조립-챠트 22

TPA영역들의 자연 배열을 갖는 TPA 개조 cDNA를 포함하는 플라스미드 pTPA-IE-PA는 CHO세포에 의해 발현될 수 있고 또는 TPA 상사체들을 포함하는 대체적 발현 플라스미드의 조립을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. pTAP-IE-PA의 회합은 두 단계로 성취할 수 있다. 첫째로, pTPA-cDNA로부터의 TPA·cDNA를 pSVCOW7내로 삽입하고 다음에 사이토메갈로 바이러스의 직접적 초기 촉진유전자를 TPA상사체의 초기 전사에 삽입시킨다.

[단계 1]

플라스미드 pSVCOW7을 EcoRI 및 PuvII로 절달하고 BGH유전자의 3′최고 엑손내 PvuII자리로부터 확장된 소 성장 호르몬의 폴리 아데닐화 서열을 함유하는 단편 44(600 bp)를 3′ 말단 하류의 EcoRI자리에 연결시킨다. BGH 폴리아데닐화 서열의 완전한 토의를 위해 다음 참고 문헌을 참조한다 ; (1) BGH 게놈 DNA의 특성 및 확인이 기술되어 있는 1984년 6월 27일에 공개된 유럽 특허출원 제 0112012 호 ; (2) Woychik, R.P 등의 “Requirement for the 3′ Flanking Region fo the Boving Growht Hormone Gene gor Accurate Polyadenglation”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3944-3948(1984. 7) ; 및 D.R.Higgs Nature 306 : 398-400(1983. 11. 24) 및 상기한 참고문헌.

pSVCOW7의 두 번째 샘플을 EcoRI 및 BamHI로 절단하여 단편 45을 얻는다. 단편 45 는 베테스다 연구 실험실로부터 입수할 수 있는 모(母) 플라스미드 pSV2dhfr로부터 EcoRI/BamHI 단편으로부터 대체적으로 유도될 수 있다. 단편 45 는 pBR 322로부터의 복제 기점 및 E. 콜리내에서 플라스미드를 선택할 수 있는 E. 콜리내에 플라스미드를 선택할 수 있는 E. 콜리내에 발현된 암피실린 저항성 유전자를 포함한다. 이 단편은 또한 포유류 세포내에서 발현할 수 있게 조립물에 쥐 디히드로폴레이트 리덕타제 cDNA를 포함한다.

Subramani등, Mol. Cell. Biol. 1 : 854-864(1981).

TPA cDNA는 pTPA-cDNA, BamHI를 BamHI 및 BalI로 절단하여 얻어진 단편 46(1.9 kb)으로부터 얻는다. 단편 46 은 TPA cDNA로부터의 전 암호화지역을 포함한다. BamHI절단은 mRNA의 5'비전사 서열을 함호화하는 cDNA내에 있고 BalI절단은 cDNA의 3'비전사 지역을 암호화하는 cDNA내에 있다.

단편 44, 45 및 46을 연결하여 E. 콜리와 CHO 세포사이를 왕복할 수 있는 복제 벡터인 pTPA-PA(8.4 kb)를 형성한다. 플라스미드 pTPA-PA를 E.콜리내로 형질전환시킨다.

[단계 2]

단계 2에서 pTPA-PA는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV.I.E. 촉진유전자)로부터의 직접적 초기 유전자 촉진자를 삽입시킴으로 발현 플라스미드 pTPA-IE-PA로 전환시킨다. CMV IE촉진유전자는 CMV게놈을 PstI로 소화시킴으로 얻는다. 주요한 직접적 초기 유전자(CMV IE)를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 게놈 지역의 제한 엔도뉴클리아제 절단 지도들은 Stinski등, J.Virol. 46 : 1-14, 1983 ; Stenberg 등., J.Virol 49 : 190-199, 1984 ; 및 Thomsen 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 659-663, 1984에 상세히 기술되어 있다.

이 참고문헌들은 주요한 직접적 초기 유전자의 촉진유전자를 그 서열내에 포함하는 2.0 킬로염기 PstI단편을 기술하고 있다. CMV I.E. 촉진유전자는 2.0 kb PstI 단편을 Sau 3AI로 분리 소화시킴으로 분리할 수 있고 이렇게 하여 소요의 760염기쌍 단편을 생성물 사이에서 얻는다. 01 760 염기쌍 단편은 그 크기 및 단편내에 SacI절단 자리 및 BalI 절단 자리의 존재로 다른 생성물들로부터 구별될 수 있다. 이것은 편리하게 확인될 수 있기 때문에, 이 Sau 3AI단편의 이용은 본 명세서에 기술된 바와 같은 CMV I.E촉진 유전자를 사용하는 바람직한 방법이다.

단계 1에서 조립한 플라스미드 pTPA-PA를 BamHI로 절단하고, CMV직접적 초기 촉진유전자를 포함하는 Sau 3AI단편을 BamHI자리에 연결시킨다. 촉진유전자로부터 전사가 TPA의 mRNA을 합성하는 방향으로 CMV 촉진유전자 단편을 포함하는 플라스미드는 이 플라스미드를 SacI로 절단함으로 확인할 수 있다. TPA cDNA의 5′-말단에 CMV I.E 촉진유전자를 갖고 그 3′-말단에 BGH 폴리아데닐화 신호를 갖는 결과 형성된 플라스미드는 pTPA-IE-PA로 표시한다.

(4) pTPA-IE-FK2K2A의 조립-챠트 23

pTPA-IE-FK2K2A의 조립은 두 단계 방법이다. 단계 1은 소요의 TPA 상사체, BGH로 부터의 폴리아데닐화 신호 서열 및 pSVCOW7의 선택성 표시유전자 및 리플리콘을 함유하는 pTPA-FK2K2A의 생성을 포함하고, 단계 2는 상기한 CMV I.E 촉진유전자의 삽입을 포함한다. 하기 실시예는 TPA 상사체 FK2K2A의 삽입을 기술하는 한편 다른 상사체들은 동일한 효소 및 방법을 사용하여 삽입시킬 수 있다.

[단계 1]

플라스미드 pTPA-IE-PA(챠트 22)를 BamHI 및 BglII으로 절단하여 TPA 리더 서열 염기 1-188을 포함하는 단편 47을 얻는다. BGH의 폴리아데닐화 신호 서열은 pSVCOW7(챠트 20)을 EcoRI 및 PvuII로 절단하여 단편 48(600 bp)을 생성함으로 얻을 수 있다. TPA 상사체 서열은 pFK2K2A(챠트 12)를 BglII 및 BalI로 절단하여 단편 49(20. kb)를 생성함으로 얻을 수 있다. pSVCOW7의 두 번째 샘플을 EcoRI 및 BamHI로 절단하여 pSVCOW7의 리플리콘 및 표시유전자를 포함하는 단편 50(5.8 kb)을 얻는다. 4 개의 단편들을 겔 분리하고 T4 리가제를 사용하여 연결시켜서 pTPA-FK2K2A(8.3 kb)를 생성한다.

[단계 2]

플라스미드 pTPA-FK2K2A를 BamHI로 절단하고 Sau3A 소화 CMV-IE 촉진유전자 서열을 삽입시켜 pTPA-IE-FK2K2A를 형성하고 이를 CHO세포에 침투시킬 때까지 E. 콜리에서 유지시킨다.

(5) CHO 세포들의 침투 및 배양

플라스미드 pTPA-IE-FK2K2A를 Graham 등의 Introduction of Macromolecules into Viable Mammalian Cells, Alan R. Liss INC., N. Y., 1980, pp 3-225 에 상세히 기술되어 있는 DNA의 세포내로의 침투를 위한 인산칼슘 방법을 사용하여 디히드로플레이트 리덕타제(hhfr)결핍 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포들내로 침투시킨다. 사용된 세포주는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 4216-4220, 1980 에 상세히 기술되어 있고 콜롬비아 대학의 L.Chasin으로부터 원래 입수가능한 변종 DXB-11이다. 침투를 위한 상기 방법들은 침투된 플라스미드를 포함하는 세포들이 더 이상 dhfr이 결핍되지 않고 둘베코의 개조된 어글스 배지＋프롤린에서 성장한다는 사실에 의존한다.

pTPA-IE-FK2K2A로 침투된 세포들로부터 클론을 분리하고, 이틀간 단일층에서 배양할 때 적어도 TPA 10ng/세포 10⁶을 합성된다. pIETPA-IPA-dhfr을 갖는 세포들로부터, 클론을 분리하고, 이는 적어도 TPA 100ng/세포 10⁶을 합성한다. TPA 상사체의 발현은 방사성면역분석 또는 웨스턴 브롯 기술로 검출될 수 있다.

TPA 상사체들은 Rijken 및 collen. Journal of Biological Chemistry 256 : 7035-7041(1979)의 방법에 따라 정제한다. 재조합 TPA 상사체들을 포함하는 CHO세포들을 혈장이 없는 배지에서 성장시킨다. 배양 배지를 72 시간 후에 수확하고 NaCI 1.0M 및 트윈 80 0.01%를 포함하는 pH 7.5의 Tris-HCl 0.02M로 평형된 아연-착화물 아가로스 컬럼에 적용한다. 컬럼을 동일한 완충액으로 씻고 TPA 상사체들을 동일한 완충액내 0-05M 이미다졸 직선 구배로 용출시킨다. TPA 상사체들을 포함하는 분류물을 한데 모으고 NaCl 1.0M 및 트윈 80 0.01%를 포함하는 pH 7.5의 인산염 완충액 0.01M로 평형된 콘카나발린 A-아가로스 컬럼에 적용한다. 동일한 완충액으로 컬럼을 씻은 후, TPA 상사체들을 트윈 80 0.01%, D-메틸만노시드 0.4M 및 티오시안산칼륨 2M을 포함하는 pH 7.5의 인산염 완충액 0.01M로 평형완충액의 직선 구배로 용출시킨다. TPA활성을 포함하는 분류물을 한데 모으고 고체 KSCN을 첨가하여 KSCN농도를 1.6M로 증가시킨다. 분류물을 거의 10배로 농축시키고 KSCN 1.6M 및 트윈 80 0.01%FMF 포함하는 pH 7.5의 인산염 완충액 0.01M로 평형된 세파덱스 G-150 컬럼에 적용시킨다. TPA 활성을 포함하는 분류물을 한데 모으고 NaCl 0.15M과 트윈 80 0.01%에 대해 투석시키고 -80℃에서 저장한다.

C. 스포돕테라 프루기페라(Spodoptera frugiperda)내에서의 발현

다음 실시예는 곤충 세포 배양물에서의 TPA 발현에 관한 것이다. 모든 방법들은 the college of Agricultural, Texas Agricultural Experiment Station, Texas Agricultural Extention Service, College Station, Texas, 1986, 에 의해 간행된 Summers, M.D. 및 Smith, G.E., A Manual for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures 에 상세히 기술되어 있다. 출발 플라스미드 pAC 373(7.1 kb)은 오토그래픽 칼리포르니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)의 다면제 촉진유전자의 하류인 유일한 BamHI자리를 갖는 일반적인 바쿠로바이러스 발현 벡터이다. 다면체 단백질은 바이러스 감염과 시험관내 복제에 대해 필수적이 아닌 매트릭스 단백질이다. 이 플라스미드는 Professor Max Summers of the Department of Entomology, Texas A8M University, College Station, Texas 77843으로부터 입수 할 수 있고 Molecular and Cell Biology, 3(12) : 2156-2165(1983)에 상세히 기술되어 있다.

(1) pAcTPA의 조립-챠트 24

출발 플라스미드 pAc 373을 유일한 BamHI자리내로 또한 유일한 BglII자리를 삽입함으로 TPA 상사체를 수용하도록 개조한다. 플라스미드 pAc 373을 먼저 BamHI로 절단하고 다음에 Mung bean 뉴클리아제로 처리하여 끝을 뭉툭하게 만든다. 다음에 GglII연결자를 그 끝에 연결시키고 끝들을 연합시켜 pAc 373, BglII을 생성시킨다. 챠트 21로 부터의 플라스미드 pTPA cDNA, BamHI를 BamHI로 완전히 소화 시키고 BhlII로 부분적으로 소화시키고 순전한 TPA cDNA를 암호화하는 단편 51(1.95 kb)을 생성한다. 단편 51을 겔 분리하고 pAc 373, BglII의 BglII자리로 삽입시켜서 S. 푸루기페르다내에서 자연 TPA를 발현시킬 수 있는 cAcTPA를 생성한다.

(2) pAcFK2K2A의 조립-챠트 25

이 발현 플라스미드에 대해서는 TPA 상사체 FK2K2A를 BglII를 사용하여 pFK2K2A(챠트 12)로부터 절단하고 TPA 상사체를 암호화하는 cDNA를 단편 53(2.0 kb)으로 겔 분리한다. 플라스미드 pAcTPA(챠트 24)를 BglII으로 절단하여 단편 52(7.15 kb)를 생성한다. 단편 52 와 53을 연결시켜 pAcFK2K2A(9.15 kb)를 생성하고 이를 S.프루기페로다에 침투시킬 때까지 E. 콜리내에 유지시킨다.

(3) S. 프루기페르다내로의 침투 및 배양

TPA 상사체들은 자연 ACNPV DNA로 S. 프루기페르다내로 동시에 침투시켜서 재조합한다. S. 트루기페르다(SF9 ; ATCC CRL 1711)를 그레이스 배지(Grace Media ; Gibco Lab. Livonia, MI 48150), 10% 태아 소 혈장 및 디프코 락트알부민 가수분해물 및 효모분해물로 보충된 곳에서 배양한다. 세포들을 ACNPV DNA 및 pAc TAPFK2K2A 각각 1μ/㎖ 및 2μ/㎖로 동시에 침투시킨다. 결과 형성된 바이러스 입자들은 배지를 수집하고 저속 원심분리에 의해 세포 물질을 제거함으로 얻는다. 다음에 바이러스 포함 배지를 S. 프루기페르다 침투에 사용한다. 바이러스 DNA 및 FK2K2A TPA 상사체를 암호화하는 cDNA로 재조합된 DNA 둘다를 포함하는 이들 바이러스 입자들을 사용하는 S. 프루기페르다의 계속적인 감염이 다면체 단백질 대신에 TPA 상사체를 발현시키는 몇몇 세포내에서 발생한다. TPA 상사체를 생산하는 감염된 세포 집락의 검출은 바이러스 함유 배지의 일련의 희석액(10^-1-10^-6)으로 1 시간 동안 미리 감염시킨 S. 프루기페르다의 단일층을 덮음으로 결정한다. 다음에 세포들을 피브리노겐 6㎎/㎖ 및 트롬빈 0.5 단위를 포함하는 저융점 한천 0.7%를 갖는 그레이스 배지에 얹는다. 활성 TPA를 생산하는 세포들은 감염 지점 주위의 투명한 반점을 형성할 것이다.

[실시예 5]

다음 상사체들을 CHO세포로부터 분리하고 활성 및 항원성을 평가한다 : FGK1K2A, FK1K2A 및 FK2A 표 1에 활성 및 항체 인식의 두 다른 시험관내 시험 결과를 요약해 놓았다. 상사체 FGK1K2A 및 FK2A는 소판(트롬빈-유도 소판 방출물)으로부터 플라스미노겐 활성화인자 저해제와 착화물을 형성한다. 상사체들의 분자량은 각각 약 62,000 및 40,000 달톤이다. 효소 저해제 착화물의 분자량은 각각 거의 110,000 및 85,000 달톤이다.

[실시예 6]

TPA 상사체들의 치료학적 적용

TPA는 트롬비 용해에 치료학적으로 유용한 것으로 알려져 있다. The Lancet, pp. 1018-20(1981. 11. 7) ; Science, 220 : 1181(1983) ; 및 N.Eng. J. Med., 310 : 609(1984). 관상 트롬비 환자에 TPA 상사체들의 투여는 상기 두 참고문헌에 기술된 일반적 방법에 따라 관내 또는 정맥내 통로를 따라 할 수 있다.

[표 1]

* 활성은 표준 TPA 제제에 대해 상대적으로 표시한다.

** 항원 측정치는 상기한 TPA에 대한 염소의 폴리클론 항체를 사용하여 얻는다.

[제 1a 도]

[제 1b 도]

[제 1c 도]

[제 1d 도]

잘 짝지워진 것 = 2526 잘못 짝지워진 것 = 15 짝지워지지 않은 것 = 12

길이= 2553 잘 짝지워진 것/길이 =99.0%

[제 2a 도]

[제 2b 도]

[제 2c 도]

[제 2d 도]

잘 짝지워진 것 = 556 잘못 짝지워진 것 = 7 짝지워지지 않은 것 = 3

길이= 566 잘 짝지워진 것/길이 =98.2%

[제 3 a도]

올리고뉴클레오티드

블럭 1= 핑거 영역

[제 2b 도]

블럭 2 = 성장 인자 영역

[제 2c 도]

블럭 3 = 크린글 1 영역

[제 2d 도]

블럭 4 = 크린글 2 영역

[제 2e 도]

[제 4a 도 ]

TPA영역들

영역들 자연 TPA

핑거 세린 ＃1→리신 ＃49

뉴클레오티드 190→336

성장인자 세린 ＃50→MFPDHSLS ＃91

뉴클레오티드 337→462

크린글 1 시스테인 ＃92→세린 ＃174

뉴클레오티드 463→711

크린글 2 글루타민산 ＃175→세린 ＃262

뉴클레오티드 712→975

활성자리 튜레오닌 ＃263→프롤린 ＃527

뉴클레오티드 976→1770

TPA 상상체(챠트 11)

핑거 세린 ＃1→발린 ＃49

뉴클레오티드 190→342

성장인자 알라닌 ＃51→알라닌 ＃91

뉴클레오티드 343→456

크린글 1 트레오닌 ＃92→시스테인 ＃175

뉴클레오티드 457→726

크린글 2 글루타민산 ＃176→알라닌 ＃266

뉴클레오티드 727→999

활성자리 시스테인 ＃267→프롤린 ＃530

뉴클레오티드 1000→1782

챠트 1. pTRZ1의 조립

(a) pMC1403을 EcoRI, 크레뉴 효소 및 세균 알카리성 포스파타제로 처리하여 단편 1을 생성한다.

단편 1

(b) pVV1을 PvuII, BglII 및 크레뉴 효소로 처리하고 이어서 trp촉진유전자 및 TrpLE를 포함하는 단편 2(323 bp)를 정제한다.

단편 2

(c) T4 DNA리가제를 사용하여 단편 1 과 2 를 연결하여 pRTZ1(10 kb)를 생성한다.

pTRZ1

AmpR = 암피실린 저항성

LacZ, LacY, LacA = 락토오스 오페론내의 유전자들

Ptrp = Trp촉진유전자/작동 유전자

trpLE =trpL 및 trpE의 융합

챠트 2. psk3(4.3 kb)의 조립

(a) pTRZ1(10 kb)를 BamHI 및 EcoRI 및 알카리성 포스파타제로 처리하여 단편 3(350 bp)을 생성한다.

단편 3

(b) pKC7(5.8 kb)를 BamHI 및 EcoRI로 처리하여 단편 4(4.0 kb)를생성한다.

단편 4

(c) 단편 3과 4를 연결하여 pSK3(4.3 kb)를 형성한다.

D = Trp 촉진유전자 작동 유전자

E = TrpL 리보소옴 결합 자리

F = trpLE 및 제한 자리

AmpR = 암피실린 저항성

챠트 3. pSK4의 조립

(a) pSK3을 EcoRI 및 BamHI로 절단하고 단편 5(322 bp)을 분리한다.

단편 5

(b) 분분 TaqI소화는 278 bp 단편 6 EcoRI 내지 TagI′″ 및 다른 단편들을 생성한다.

(c) 단편 6을 pBR 322내로 클로화하고 EcoRI 및 ClaI로 절단하여 pSK4(4.6 kb)를 생성한다.

D = Trp 촉진유전자/작동유전자

E = Shin-Dalgarno지역

챠트 4. pTPA 3′ cDNA의 조립

(a) pBR 322를 PstI으로 절단하고 꼬리화하고 1250-2530위치를 갖는 TPA cDNA의 3′지역을 삽입시킴으로 플라스미드 pTPAH(5.7 kb)를 얻는다.

(b) pBR 322를 PstI으로 절단하고, 꼬리화하고, 550-1600위치를 갖는 TPA의 cDNA를 삽입시킴으로 플라스미드 pTPA80-1(5.4 kb)를 얻는다.

(c) 플라스미드 pTPAH 및 pTPA80-1을 SacI 및 PvuI로 절단하고 단편 7(1251 bp) 및 8(5.1 kb)를 각각 겔 분리한다. 단편들을 세균 알카리성 포스파타제로 처리하고 T4로 연결하여 TPA cDNA의 550-2530 염기들을 갖는 pTPA 3′ cDNA(6.3 kb)를 형성한다.

TetR = 테트라사이클린 저항성

P = TPA cDNA의 550-802 염기 위치

A = TPA cDNA의 803-2530 염기 위치

N = TPA cDNA의 비전사된 3′ 지역

챠트 5. pTPA cDNA의 조립

(a) pBR322를 PstI으로 절단하고, 꼬리화하고, 1-750위치들을 갖는 TPA의 cDNA의 5′지역을 삽입시킴으로 플라스미드 pTPA5′ cDNA를 얻는다.

(b) 플라스미드 pTAP 5′을 TaqI으로 절단하여 단편 9(2194 bp)를 생성하고 이를 겔 분리하고 BglII 및 HgaI로 절단하여 TPA cDNA(성숙 TPA 단백질)의 염기 188-593을 포함하는 단편 10(405 bp)을 생성한다.

단편 10

(c) 플라스미드 pTPA 3′ cDNA(챠트 4)를 PvuII 및 EcoRI로 절단하고 단편 11(1748 bp)을 겔 분리한다. 단편 11을 HgaI로 절단하여 단편 12(209 bp)를 생성하고 겔 분리하고, 이는 염기 594-802를 포함한다.

단편 11

(d) 플라스미드 pTOA 3′ cDNA를 PvuI로 절단하고, 직선 6.3 kb 단편을 T4 폴리머라제로 처리하여 끝을 뭉툭하게 만들고 EcoRI로 부분적으로 소화시켜 pBR 322의 염기 802-2530과 123 bp를 포함하는 단편 139187 kb)을 생성한다.

단편 13

(e) 플라스미드 pKC7을 BglII 및 SmaI로 절단하고 세균 알카리성 포스파타제로 처리하고 단펴 14(4.8 kb)를 분리한다.

단편 14

(f) 단편들 10, 12, 13 및 14를 한데 모으고 T4 리가제를 사용하여 연결하여 성숙 TPA cDNA를 포함하는 pTPA cDNA(7.4 kb)를 생성한다.

AmpR = 암피실린 저항성

T = TPA cDNA의 5'위치

P = TPA cDNA의 중간부분

A = TPA cDNA의 3'부분

N = TPA cDNA의 비전사된 3'부분

챠트 6. pTPA-B1의 조립

(a) 플라스미드 pSK4를 Clal 및 SphI로 절단하여 단편 15(4.1 kb)를 생성하고, 이를 분리하고 TAG를 포함하는 ClaI/XbaI 연결자를 통해 핑거 영역을 포함하는 블럭 1에 연결시킨다.

단편 15

(b) 단편 15와 블럭 1을 연결자를 통해 연결시켜서 pTPA-B1(4.25kb)를 생성한다.

pTPA-B1

D = Trp 촉진유전자/작동유전자

E = TrpL 리보소옴 결합 자리

F = 핑거 영역

AmpR = 암피실린 저항성

ATG = 개실 코오돈

챠트 7. pTPA-B1 ,2 의 조립

(a) 플라스미드 pTPA-B1을 EcoRI 및 SphI로 절단하여 단편 16(450 bp) 및 성장 인자 영역을 포함하는 블럭 2(100 bp)를 생성하고 EcoRI 및 SphI를 사용하여 적당한 클론으로부터 분리한다.

단편 16

블럭 2

(b) 단편 16과 블럭 2를 pBR 322의 EcoRI/ClaI소화로부터 유도된 단편 17(4.35 kb)에 연결시켜 pTPA-B1, 2(4.8 kb)를 생성한다.

단편 17

pTPA-B1, 2

P/O = Trp 촉진유전자/작동유전자

RbS = Trp리보소옴 결합 자리

ATG = 개시 코오돈

F = 핑거 영역

G = 성장 인자 영역

AmpR = 암피실린 저항성

Ori = PBR322 의 복제 기점

챠트 8. pTPA-B1, 2(a)의 조립

(a) 플라스미드 pTPA-B1, 2을 XbaI 및 EcoRI로 절단하고 단편 18(4.5 kb)를 생성하고 이를 분리하고 BindIII자리 및 BglII자리를 포함하는 연결자에 연결시켜 pTPA-B1, 2(a)(4.5 kb)를 생성한다.

단편 18

F = 핑거

G = 성장 인자 지역

AmpR = 암피실린 저항성

챠트 9. pTPA-B1, 2, 3 의 조립

플라스미드 pTPA-B1, 2(a)를 ClaI/BamHI 로 절단하고 단편 19(4.0 kb)를 분리하고 크린글 1 및 ClaI자리 상류 및 BamHI자리 하류를 포함하는 블럭 3(270 bp)과 연결하여 pTPA 3(4.3 kb)을 생성한다.

단편 19

pTPA-B1, 2, 3

F = 핑거 영역

G = 성장 인자 영역

K = 크린글 1

AmpR = 암피실린 저항성

챠트 10. pTPA-B1, 2, 3, 4(a)의 조립

(a) 플라스미드 pTPA cDNA(챠트 5)를 ScaI로 절단하고 TPA 유전자의 3'부분을 포함하는 단편 20(6.0 kb)을 겔 분리한다.

단편 20

(b) 플라스미드 pTPA-B1, 2, 3(챠트 9)을 SacI 및 BamHI로 절단하고 단편 21(1100 bp)을 겔 분리한다.

단편 21

(c) 블럭 4를 포함하는 클론으로부터, 크린글 2 지역을 포함하는 BamHI/ScaI 단편 4a(230bp)를 분리한다.

단편 4a

(d) 단편 20, 21 및 4a를 연결하여 pTPA-B1 ,2, 3, 4a를 형성한다.

(e) 플라스미드 pTPA-B1, 2, 3, 4^*를 HindIII과 AatII으로 절단하고 2.2 kb 원형 TPA유전자를 pUC19 로 부클론화하고 유사하게 HindIII 및 AatII으로 소화시켜 pTPA-B1, 2, 3, 4a(4.2 kb)를 생성한다. 플라스미드 pTPA-B1, 2, 3, 4a는 pTPA-B1, 2, 3, 4^*와 부호가 유사하나 더욱 편리한 배열의 제한자리를 갖는다.

AmPR = 암피실린 저항성

F = 핑거영역

G = 성장인자 영역

K = 크린글 1 영역

k = 크린글 2 영역

a = 활성 자리

n = TPA cDNA의 비전사 3′부분

챠트 11. pTPA-B1, 2, 3, 4의 조립

(a) 플라스미드 pTPA-B1, 2, 3, 4a를 EcoRI와 BamHI로 절단한다. 큰 단편(3.7 kb)을 적당한 클론으로부터 얻은 블럭 4(560 bp)에 연결시키고 또한 EcoRI(부분 소화)와 BAmHI로 절단하여 pTPA-B1, 2, 3, 4를 생성한다.

AmpR = 암피실린 저항성

F = 핑거영역

G = 성장인자영역

K = 클린글 1 영역

k = 크린글 2 영역

A = TPA cDNA의 3'부분

N = TPA cDNA의 비전사 3'부분

챠트 12. pFK2K2A의 조립

(a) 플라스미드 PTPA-B1, 2, 3, 4a를 HpaI로 절단하고 단편 22(3.9 kb)를 생성하고 이를 겔로부터 분리한다.

단편 22

(b) 플라스미드 pTPA-B1, 2, 3, 4를 HpaI와 MstI로 절단하고 크린글 2를 포함하는 단편 23(250 bp)을 생성한다.

(c) 단편 22 와 23을 함께 연결시켜 pFK2K2A(4.1 kb)를 생성한다.

Ori = pBR322의 복제 기점

AmpR = 암피실린 저항성

k = 크린글 2 영역

F = 핑거영역

A = 활성 자리

N = 비암호화 3'서열

챠트 13. pTPA Expl의 조립

(a) 플라스미드 pTPA-B1, 2(챠트 7)를 XbaI와 BamHI로 절단하고 단편 24(4.2 kb)를 겔 분리한다.

단편 24

(b) 플라스미드 pFK2K2A(챠트 12)를 XbaI와 BglII으로 절단하여 단편 25(2.0 kb)를 생성하고 이를 겔 분리한다.

단편 25

(c) 단편 24와 25를 연결하여 pTPA ExpL(6.2 kb)를 형성하고 ; BamHI와 BglII은 상보적이나 복원되지는 않는다.

pTPA EspL

trpP/O = 트립토파아지 촉진유전자/작동유전자

RbS = 리보소옴 결합자리

k = 크린글 2

F = 핑거영역

A = 활성자리

N = 비암호화 3'서열

AmpR = 암피실린 저항성

ATG = 개시코오돈

챠트 14. pyRep 3'B의 조립

(a) 플라스미드 pYIP31을 SmaI로 절단하고 세균 알카리성 포스파타제로 처리하여 단편 26을 생성한다.

단편 26

(b) 효모의 2μ 플라스미드를 pPstI와 XbaI로 절단하고 크레뉴 효소로 처리한다. 결과 형성된 단편 27(1.3 kb)을 분리한다.

단편 27

(c) 단편 26 과 27을 연결하여 pyRep 3′B(6.7 kb)을 생성한다.

u = URA3

R = RepIII과 복제 기점의 서열간격

챠트 15. 플라스미드 pGG400 의 조립

(a) 플라스미드 pBR311를 EcoRI와 PbuII로 절단하고 끝을 크레뉴 효소로 채워서 단편 28(2.3kb)을 생성한다.

단편 28

(b) 플라스미드 pMl21을 PvuII으로 절단하고 단편 29(1.7 kb)를 생성한다.

단편 29

(c) 단편 28과 29를 T4를 사용하여 연결하여 pGG400(4.0 kb)를 생성한다.

AmpR = 암피실린 저항성

KmR = 카나마이신 저항성

챠트 16. pADHt의 조립

(a) 플라스미드 pGG400을 XhoI와 PvuII으로 절단하고, 크레뉴 효소로 처리하고 결과형성된 단편 30(3.5 kb)을 분리한다.

단편 30

(b) 플라스미드 pADHBC를 HincII과 BamHI로 절단하고, 끝을 T4리가제로 채우고, 결과 형성된 단편31(0.36 kb)을 분리한다.

단편 31

(c) 단편 30 과 31을 T4리가제를 사용하여 연결하여 pADHt(3.86 kb)를 얻는다.

AmpR = 암피실린 저항성

KmR = 카나마이신 저항성

H = ADHt 3'말단

챠트 17. 플라스미드 pADHt-RepIII의 조립

(a) 플라스미드 pADHt를 BamHI로 제한하고 8-mer SalI 연결자로 채워진 BamHI자리로 연결하여 개조한다.

(b) 플라스미드 pADHt(개조된)을 SphI로 절단하고 끝을 T4 리가제로 채워서 단편 32(3.8 kb)를 생성한다.

(c) 플라스미드 pyRep31B(챠트 16)을 HindIII으로 절단하고 끝을 T4 리가제로 채워서 단편 33(2.4 kb)를 생성한다.

(d) 단편 32 와 33을 T4리가제를 사용하여 연결하여 pADHt-RepII(6.2 kb)을 얻는다.

AmpR = 암피실린 저항성

H = ADHt 3'말단

u = Ura3

R = RepIII 및 복제기점

챠트 18. pα1-ADHt의 조립

(a) 플라스미드 pADHt-RepIII(챠트 15)을 EcoRI와 HindIII으로 절단하고 단편 34(5.3 kb)를 분리한다.

단편 34

(b) 플라스미드 pα1을 EcoRI와 HindIII 으로 제한하여 1.2 kb의 단편을 포함하는 MFα1 유전자를 생성한다.

단편 35

(c) 단편 34 와 35를 T4 리가제를 사용하여 연결하여 pα1-ADHt(6.5 kb)를 얻는다.

AmpR = 암피실린 저항성

H = ADHt 3′말단

u = Ura3

R = RepIII 및 복제기점

MFα1 = MFα1유전자의 신호서열 및 촉진유전자

챠트 19. pα1-FK2K2A의 조립

(a) 플라스미드 pFK2K2A(챠트 12)를 BglII으로 절단하고 단편 36(2.0 kb)을 얻고 이를 겔 분리한다.

단편 36

(b) 플라스믿, pα1-ADHt를 HindIII과 XhoI로 절단하고 ; 끝을 염기 아데노신과 구아노신 존재하에 크레뉴 효소로 부분적으로 채우고, Mung Bean 뉴클리아제로 처리하여 단편 37(5.6 kb)을 생성하고 이를 겔 분리한다.

단편 37

(c) 단편 36과 37을 연결하여 pα1-FK2K2A(7.6 kb)를 형성한다.

MFα1 = MFα1 유전자의 신호 서열 및 촉진유전자

F = 핑거

k = 크린글 지역 2

A = 활성 자리

N = 비전사 3'서열

H = ADHt 3'말단

u = URA3

R = RepIII 및 복제기점

챠트 20. pSVCOW7의 조립

(a) 플라스미드 pSV2dhfr을 BamHI와 EcoRI로 절단하여 단편 38(5.0 kb)를 얻는다.

단편 38

(b) 플라스미드 pλGH2R2를 BamHI와 EcoRI로 절단하여 단편 39(2.1 kb)를 얻는다.

단편 39

(c) 단편 38과 39를 연결하여 pSVCOW7(7.1 kb)를 생성한다.

A = 소성장 호르몬 폴리 A꼬리

G = 게몬 소 성장 호르몬

I = 인트론

dhfr = 디히드로폴레이트 리덕타제

SV40 = SV40 촉진 유전자 및 복제기점

AmpR = 임피실린 저항성

챠트 21. pTPA cDNA, BaMHI의 조립

(a) 플라스미드 pTPA 5′ cDNA(챠트 5, 파트 a)를 Hga로 절단하고 단편 40(517 bp)을 크레뉴로 상기시키고 10-mer BamHI 연결자에 연결시킨다. 단편 40을 NarI로 절단하여 TPA cDNA의 염기 78-518을 갖는 단편 41(440 bp)을 생성한다.

단편 40

(b) 플라스미드 pTPA cDNA(챠트 5)를 NarI와 BglII로 절단하고 TPA cDNA의 3′부분을 포함하는 단편 42(1644 bp)를 겔 분리한다.

단편 42

(c) 플라스미드 pKC7을 BamHI와 BglII으로 절단하고 단편 43(4.3 kb)를 생성하고 이를 겔 분리하고, 단편 41 및 42 와 연결시켜 pTPA cDNA, BamHI(6.5 kb)를 생성한다.

pTPA cDNA, BamHI

L = 리더 서열

T = TPA cDNA의 5'부분

P = TPA cDNA의 비전사 3'부분

A = TPA cDNA의 3'부분

N = TPA cDNA의 비전사 3'부분

챠트 22. pTPA-IE-PA의 조립

(a) 플라스미드 pSVCOW7을 EcoRI와 PvuII으로 절단하여 소성장 호르몬의 폴리아데닐화 서열을 포함하는 단편 44(600 bp)를 생성하고 이를 겔 분리한다.

단편 44

(b) 플라스미드 pSVCOW7(챠트 20)을 EcoRI와 BamHI로 절단하여 단편 45(5.8 kb)를 생성한다.

단편 45

(c) 플라스미드 pTPA cDNA, BamHI(챠트 21)을 BamHI와 BalI으로 절단하여 단편 46(2.0 kb)을 생성한다.

단편 46

(d) 단편 44,45 및 46을 연결하여 pTPA-PA(8.4 kb)를 형성한다.

pTPA-PA

플라스미드 pTPA-PA를 BamHI로 절단하고 CMV게놈을 PstI와 Sau3AI 소화하여 된 CMV-IE 촉진 유전자(760 bp)를 삽입시켜 pTPA-IE-PA를 형성한다.

pTPA-IE-PA

AmpR = 암피실린 저항성

Ori = 복제의 pBR322 기점

SV40/ori = 복제의 시미안 바이러스 기점

Mo/dhfr = 쥐 디히드로폴레이트 리턱타제 표시유전자

CMV/PRom = 사이토메갈로바이러스 촉진유전자

L = TPA 리더 서열

T = TPA cDNA의 5'부분

P = TPA cDNA의 중간지역

A = TPA cDNA의 3'지역

N = TPA cDNA의 비전사 3'부분

a = 폴리아데닐화 표시 서열

챠트 23. pTPA-IE-FK2K2A의 조립

(a) pTPA-IE-PA(챠트 22)를 BamHI와 BglII으로 절단하여 단편 47(120 bp)를 생성하고 이를 겔 분리한다.

단편 47

(b) 플라스미드 pSVCOW7을 EcoRI와 PvuII으로 절단하여 소 성장 호르몬의 폴리아데닐화 서열을 포함하는 단편 48(600 bp)을 생성하고 이를 겔 분리한다.

단편 48

(c) 플라스미드 pFK2K2A(챠트 12)를 BglII과 BalI로 절단하여 단편 49(1.7 kb) 얻고 이를 겔 분리한다.

단편 49

(d) 플라스미드 pSVCOW7(챠트 20)을 EcoRI와 BamHI로 절단하여 단편 50을 얻는다.

단편 50

(e) 단편 47, 48, 49 및 50을 T4 리가제를 사용하여 연결하여 pTPAFK2K2A(8.3 kb)를 생성한다.

pTPAFK2K2A

(f) 플라스미드 pTPAFK2K2A를 BamHI로 절단하고 CMV게놈을 PstI와 Sau3AI로 소화시켜 얻은 CMV-IE 촉진유전자(760 bp)를 삽입시켜 pTPA-IE-FK2K2A를 형성한다.

pTPA-IE-FK2K2A

AmpR = 암피실린 저항성

Ori = 복제의 pBR322 기점

SV40 = 복제의 시미안 바이러스 기점

Mo/dhfr = 쥐 디히드로플레이트 리덕타제 표시유전자

CMV/Prom = 사이토메갈로바이러스 촉진유전자

L = TPA리더 서열

T = TPA cDNA의 5지역

P = TPA cDNA의 중간지역

F = 핑거 영역

K = 크린글 2

A = 활성자리

N = TPA cDNA의 비전사 3'지역

a = 폴리아데닐화 신호 서열

챠트 24. pAc TPA의 조립

(a) 플라스미드 pAc 373(7.1 kb)를 BamHI로 절단하고 mung bean 뉴클리아제로 처리하여 끝을 뭉툭하게 만들고 여기에 BglII 연결자를 첨가한다. 끝을 서로 결합하여 pAc 373, BglII를 생성한다.

pAc 373

pAc 373, BglII

(b) 플라스미드 pTPA cDNA, BamHI(챠트 21)를 BamHI로 절단하고 BglII로 부분적으로 소화시켜서 순전한 TPA cDNA를 포함하는 단편 51(1.95 kb)을 생성한다.

단편 51

(c) 단편 51을 삽입하고 pAc 373, BglII의 BglII자리에 연결시켜 pAc TPA(9.05 kb)를 생성한다.

pAc TPA

L = 리더 서열

T = TPA cDNA의 5'부분

P = TPA cDNA의 중간부분

A = TPA cDNA의 3'부분

N = TPA cDNA의 비전사 3'부분

AmpR = 암피실린 저항성

Poly = 폴리헤드린 단백질 유전자

챠트 25. pAc FK2K2A의 조립

(a) pAc TPA(챠트 24)를 BglII으로 절단하여 단편 52(7.1 kb)를 생성한다.

단편 52

(b) 플라스미드 pFK2K2A(챠트 12)를 BglII으로 절단하여 상사체 cDNA를 단편 53(2.0 kb)으로 겔 분리한다.

단편 53

(c) 단편 52 와 53을 연결하여 pAc FK2K2A(9.15 kb)를 형성한다.

L = 리더서열

F = 핑거 영역

K = 크린글 2 영역

A = 활성 자리 영역

N = TPA cDNA의 비전사 3'부분

AmpR = 암피실린 저항성

Claims (12)

1. 숙주가 DNA를 유지하고 TPA유사 단백질을 발현할 수 있도록 DNA를 함유한 적당한 숙주 세포로부터 TPA-유사 단백질을 발현하는 것으로 구성되는, FGK1K2A의 자연 순서를 가진 TPA와 비교했을 때 FK2A, FK2K2A 또는 FGK2A(여기서 F는 핑거 영역이며, G는 성장 인자 영역이며, K1 및 K2는 크린글 1 및 2 영역이며, A는 활성 부위임)의 순서를 가지며 90,000 달톤 이하의 분자량을 갖는 TPA-유사 단백질을 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 순서가 FK2A인 방법.
3. 제 2 항에 있어서, DNA는 사잉 영역 지역들을 암호화하는 튜클레오티드 서열내에 영역 지역들을 함호화하는 뉴클레오티드 서열에 존재하지 않는 비-자연 엔도뉴클리아제 제한 부위들을 함유하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, DNA는 자연 배열의 뉴클레오티드 염기 187 과 198 사이에 xba 부위를 포함하는 방법.
5. 제 3 항에 있어서, DNA는 자연 배열의 뉴클레오티드 염기 328과 342 사이에 HapI 또는 SphI부위 또는 그 조합을 포함하는 방법.
6. 제 3 항에 있어서, DNA는 자연 배열의 뉴클레오티드 염기 442와 462 사이에 EcoRV, ClaI 또는 SamI 부위 또는 그 조합을 포함하는 방법.
7. 제 3 항에 있어서, DNA는 자연 배열의 뉴클레오티드 염기 709 와 726 사이에 BamHI 또는 HpaI부위 또는 그 조합을 포함하는 방법.
8. 제 3 항에 있어서, DNA는 자연 배열의 뉴크레오티드 염기 973 과 997 사이에 Mst HI, SphI 또는 XmaIII부위 또는 그 조합을 포함하는 방법.
9. 제 3 항에 있어서, 숙주가 효모, 진핵 세포 또는 이쉐리키아종인 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 세포가 차이니스 햄스터 난소 세포인 방법.
11. 제 3 항에 있어서, 숙주가 곤충인 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 곤충이 봄빅스 모리 또는 스포돕테라 푸루기페르다인 방법.