KR900007936B1

KR900007936B1 - 오레오베이시디움속의 신규 미생물 및 그 취득방법과 이 균주를 사용한 에리쓰리톨의 제조방법

Info

Publication number: KR900007936B1
Application number: KR1019870009963A
Authority: KR
Inventors: 다까시 사사끼; 다께후미 가스미; 나오야 쿠보; 게이찌 가이누마; 가쯔오 왁꼬오; 히로아끼 이시즈까; 가꾸 가와구찌; 쯔네로오 오다
Original assignee: 노오린 스이산쇼오 쇼꾸힝 소오고오 켕큐우쇼; 다무라 신하지로오; 닛껜 가가꾸 가부시끼가이샤; 이시노 요시후사
Priority date: 1986-09-09
Filing date: 1987-09-09
Publication date: 1990-10-23
Also published as: DE3784611T2; US4939091A; CA1301684C; EP0262463A3; DE3784611D1; AU600749B2; EP0262463B1; AU7776887A; EP0262463A2; DK168490B1; DK467987D0; DK467987A; KR880010116A; US5036011A

Abstract

내용 없음.

Description

오레오베이시디움속의 신규 미생물 및 그 취득방법과 이 균주를 사용한 에리쓰리톨의 제조방법

본 발명은 신규 미생물 및 그 취득방법과 이 신규미생물을 사용한 발효에 의해서 에리쓰리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 오레오베이시디움(Aureobasidium)속의 SN-124A와 이것의 인공적 변이균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42와 SN-τ96 및 이 같은 미생물의 취득방법과 상기의 미생물을 사용하여 발효당을 에리쓰리톨로 변화시켜서 에리쓰리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다. 미생물을 사용하는 발효에 의하여 에리쓰리톨을 제조하는 방법은 공지의 사실이다.

이러한 에리쓰리톨의 생산능력을 지닌 미생물로서는 예를들면, 데바리오마이세스(Debaryomyces)속(미국 특허번호 2,986,495), 피키아(Pichia)속(미국 특허번호 2,986,495), 칸디다(Candida)속(안토니반 류벤후크(Antonie van Leeuwenhoek)37 (1971)107-118 등등), 오레오베이시디움(Aureobasidium)속(일본 특허공개번호 6l-31091)등이 알려져 있다.

그러나 이러한 미생물들은 실용상 무시될 수 없는 중대한 결점이 있기 때문에 여지껏 공업적으로 이용되지 못하고 있다. 더 정확하게는 미국 특허번호 2,986,495호는 피키아속과 데바리오마이세스속의 미생물들을 사용하여 단당류로부터 에리쓰리톨(erythritol), 글리세롤(glycerol), 아라비톨(arabitol)을 제조하는 방법을 개시하고 있다.

그러나 이 방법에 의하면, 에리쓰리톨은 부산물로서 단지 소량밖에 얻을 수 없을 뿐만 아니라 분리하여 모으는데 상당한 어려움이 따른다. 미국 특허번호 3,756,917호는 칸디다속의 미생물들을 사용하여 탄화수소류로부터 에리쓰리톨을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 이 방법은 기질의 농도가 기껏해야 20%이하이므로 대단히 비경제적이며, 생산성이 낮다.

또 다른 결점은 원료로 탄화수소를 사용하므로서, 제품중에 잔류할 가능성이 있기 때문에 식품에는 사용할 수 없다는 것이다. 안토니 반 류벤후크, 37, 107-118(1971)과 어플라이드 마이크로바이올러지(Applied-Microbiology), 12, [3]240-246(1964)에서는 모닐리엘라(토룰라)(Moniliella(Torula))속 미생물들을 사용하여 글루코오스로부터 에리쓰리톨을 제조하는 방법을 서술하고 있다. 이 방법은 글루코오스의 에리쓰리톨에 대한 변환비가 높고, 배지의 기질 농도를 비교적 높은 수준까지 증가시킬 수 있는 특징이있으나, 배양시에 거품의 발생이 현저하기 때문에 거품의 제거를 위해서 다량의 잰테인검(xanthane gum)을 사용하여야만 하는 결점이 있다. 일본 특허공개번호 61-31091호는 오레오베이시디움(Aureobasidium)속의 미생물들을 사용하여 단당류로부터 에리쓰리톨을 제조하는 방법을 설명하고 있다.

이 방법은 비교적 높은 기질 농도를 갖는 배지를 사용하여 에리쓰리톨을 제조하는 것을 가능하게 하였으므로 그 자체로 값진것이 었다. 그러나 이 방법은 미생물들의 균체증식량에 비하면 에리쓰리톨의 수율이 만족스럽지 못할 뿐만 아니라 최적 pH·온도등의 범위가 좁아서 이러한 요소들이 최적범위로부터 조금만 이탈되어도 에리쓰리톨의 수율이 현저히 저하된다는 결점때문에 항상 만족스러운 것은 못되었다.

상기와 같은 문제점들을 고려하여 실용성이 높은 에리쓰리톨 생성능력을 보유하고 있는 미생물을 얻기 위하여 많은 미생물에 대한 에리쓰리톨 생성능력을 스크린닝(screening)한 결과, 일본 오끼나와현의 한 전분공장내의 토양으로부터 분리해낸 오레오베이시디움(Aureobasidium)속에 속하는 신규의 미생물이 높은 에리쓰리톨 생성능력을 가지고 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 기본적인 목적은 높은 에리쓰리톨 생성능력을 갖는 실용성이 높은 새로운 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 기질 농도가 높은 배지에서도 높은 에리스리톨 생성능력을 유지할 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 균체가 고도의 친수성을 나타내어 배양시에 거품의 생성이 없는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 바와같은 유용한 미생물을 취득하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 바와같은 미생물을 사용하여 효율적으로 에리쓰리톨을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 다음의 상세한 설명으로부터 분명해진다. 본 발명에 의하면 본 발명의 상술한 목적은 야생균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주와 이 균주를 인공적으로 변이시켜서 얻어진 변이균주 SN-G42와 SN-Y 96에 의하여 달성된다. 또한 본 발명의 상술한 목적은 발효당을 포함하고 있는 배지에 상기의 균주를 접종시키고, 배양액안에 에리쓰리톨을 축적시키도록 호기적으로 배양한 다음 에리쓰리톨을 수거하는 것으로 달성된다.

본 발명의 미생물인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주는 통상적인 방법(어플라이드 마이크로 바이올러지 (Applied Microbiology)12[1]87 (1964), 카나디안 저널 마이크로 바이올러지(Can. J. Microbiol)2, 72(1956))에 따라 일본의 오끼나와현의 한 전분 공장내의 토양으로 부터 순수 분리되어 졌다.

이것의 영양세포는 단세포, 난형이며, 다극출아에 의해서 증식하고, 자낭포자를 형성하지 않으며, 균사체는 진공균사를 형성하고, 그 선단 및 측면 전체에 출아형태의 분생자를 다수 가진다. 이 균주는 YM 한천 배지에서는 흰색의 집락이 3일내에 검은색의 집락으로 변할 정도로 급속히 생육하며, 액체 배지에서는 피막을 형성하며, 또한 발효당을 주생성물인 에리쓰리톨과 소량의 글리세롤로 변환시킬 수 있다.

본 발명의 미생물인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42와 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-τ96 균주는 모균주인 상기의 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주를 자외선 조사 및 변이유발제를 처리하여 얻어졌으며, 소망한다면 r선을 조사할 수도 있다.

이와같은 변이균주의 취득방법을 지금부터 설명한다.

SN-124A 균주를 글루코오스 농도가 22.0%의 액체 배지중에서 호기적으로 배양하여 얻은 배양물에 소정의 시간동안 자외선을 조사한다. 그후 배양물을 글루코오스 농도 22.0%의 한천 배지에 도포하여 배양시키고, 생육한 균주를 선발한다.

이렇게 선발된 균주를 글루코오스 농도 33.5%의 액체 배지중에서 호기적으로 배양하여 균체를 분리시키고, 그 다음에는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)이 1my/ml의 농도로 포함된 완충용액을 처리한다. 다음에 이 처리물(균체)를 글루코오스 농도 40%의 한천 배지에 도포하여 배양시키고, 생육한 균주를 선발하는데 이 균주가 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN -G42 균주이다.

그 다음에 이렇게 선발된 균주를 글루코오스 농도가 40%인 액체 배지중에서 호기적으로 배양하고, 그 배양물을 소정량의 코발트 감마선으로 조사한다. 그후, 처리된 균체들을 글루코오스 농도가 45%인 한천 배지에 도포하여 배양시켜서 생육된 균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-τ96 균주를 선발한다. 이렇게 준비된 변이균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42와 SN-τ96은 그들의 모균주인 야생주 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A보다 에리쓰리톨로의 변환율이 더 높으며, 그 농도의 당에 대한 내성에 있어서 우수하고, 친수성인 균체로 증식하기 때문에 에리쓰리톨의 공업적 생산에 더욱 바람직하다.

본 발명에 사용된 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주는 미생물학적으로 다음과 같은 특성들을 가지고 있다.

I. 배지상의 생육상태

1) 현미경적 소견

영양세포의 크기(^*1) : 4-7×4-15μ

영양세포의 형태(^*1) : 균사 또는 효모같은 단세포, 난형.

영양세포의 증식(^*1) : 균사 또는 효모같은 세포의 다극출아.

균사체(^*2) : 전면출아 형태로 다수의 분생자가 그 선단과 측면에 발생하는 진성균사를 형성하는 균사체.

(주)^*1 : YM 한천 배지에서 27℃로 5일간 배양하였다.

^*2 : 포테이토 글루코오스 한천 배지로 슬라이드 배양하였다.

2) 한천 사면 배지(^*3)

생육 : 양호

광택 : 없음

색조 : 시간의 경과에 따라 백색의 집락이 흑색의 집락으로 변하였다.

(주)^*3 : YM 한천 배지

3) 액체 배양(^*4)

표면 생육 : 두꺼운 피막을 형성

탁도 : 투명

침전 : 현저

(주)^*4 : 액체 배지

II. 자낭 포자의 형성

포테이토 글루코오스 한천 배지 : 형성되지 않음.

콘-밀 배지 : 형성되지 않음

YM 한천 배지 : 〃

캐럿 추출물 배지 : 〃

V₈배지 : 〃

III. 생리학적 성질

산소요구성 : 호기적

생육온도 : 약 40℃ 까지

최적생육온도 : 35-37℃

생육 pH : 2.5-9.5

최적 생육 pH : 4-7

KNO₃동화성(^*5) : 있음

(NH₄)₂SO₄동화성(^*5) : 있음

요소의 분해 : 있음

젤라틴의 액화 : 없음

카로티노이드의 생성 : 없음

유기산의 생성 : 있음

알부틴(Albutin) : 없음

전분상 물질의 생성 : 없음

비타민의 요구성(^*5) : 있음

글루코오스 농도(^*6) : 50% 생육 ++

60% 생육 --

(주)^*5 : 워커햄(wickerham)의 합성배지를 사용하여 로더(J. Lodder) 등이 제안했던 방법으로 판정하였다.

^*6 : 한천 배지

^*7 : 액체 배지

IV. 당의 발효성(^*5)

글루코오스 ++

락토오스 --

갈락토오스 --

멜리바이오스 --

수크로오스 ++

라피노오스 --

말토오스 +

셀로바이오스 --

트레할로오스 --

이눌린 --

V. 당·유기산등의 동화성

글루코오스 ++

D-자일로오스 ±

갈락토오스 --

에리쓰리톨 +

D-아라비노오스 --

L-아라비노오스 --

D-라이보오스 +

수크로오스 +

L-람노오스 --

말토오스 +

에타놀 --

셀로바이오스 +

살리신 --

L-솔보오스 --

리비톨 --

갈락티톨 --

글리세롤 +

트레할로오스 --

락토오스 --

멜리바이오스 --

D-만니톨 +

라피노오스 --

멜레자이토오스 --

α-메틸-D-글루코시드 --

이눌린 ±

이노시톨 --

가용성 전분 --

DL-젖산 --

호박산 ±

구연산 +

상기와 같은 미생물학적 성질을 갖는 본 균주의 분류학적 위치를 '더 제너라 오브 펀지 스포룰레이팅 인퓨어 컬춰'(J. A. Von Arx : 1974)을 참조하여 검토한 결과 본 균주는 YM 한천 배지에서 흰색의 집락이 시간이 경과하여 배양의 훈반부 시기가되면 검은색으로 변하는 집락을 형성하며, 영양세포에 있어서는 균사를 형성하고, 후막포자를 생성하지 않으며, 다수의 블래스트(blast)포자를 생성하는 등의 특징이 있다. 따라서본 발명의 균주는 오레오베이시디움(Aureobasidium)속에 속하는 신규의 미생물로 판단되어 졌으며, 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주로 명명하였다. 한편, 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42와 SN-τ96 균주의 미생물학적 성질은 이들의 모균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주(야생균주)와 매우 흡사한 성질을 나타내고 있다.

달리 표현한다면, 변이 균주들은 한천 배지에서 배양할때 표면에 주름이 있는 집락을 형성하며, 요소의 분해능이 없이며, 질산염의 동화성이 모균주보다 조금 떨어지는 것을 제외하고는 그들의 모균주와 미생물학적 특성이 꼭 같은 변이 균주이며, 이 변이 균주들은 표 1에 나타낸 바와같이 당과 유기산등의 동화에 있어서 보균주와 다소 다르다.

당·유기산 등의 동화성

[표 1]

앞서의 설명으로부터 명백한 바와같이 변이균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42와 SN-τ96은 그들의 모균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A(야생균주)와 미생물학적 성질이 매우 흡사한 성질을 나타내고 있다. 실시예에서 나타나지만, 이들 변이균주들은 당농도에 대한 높은 내성과 균체가 친수성이므로 배양중에 거품이 실질적으로 발생하지 않는다는 점에서 그들의 모균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주와는 다르다.

특히 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주(야생균주)는 배지중의 글루코오스 농도가 33.5%까지는 약 37.0-41.5%라는 에리쓰리톨로의 만족스러운 변환비를 나타낸다. 그러나 글루코오스의 농도가 39.5%를 초과하면 에리쓰리톨로의 변환비가 급격히 저하된다. 글루코오스의 농도 45%에서는 변환비는 약 16%로 저하된다.

한편 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42와 SN-τ96 균주는 배지중의 글루코오스의 농도가 40%를 초과하더라도 에리쓰리톨로의 변환비가 실질적으로 저하되지 않는다. 글루코오스의 농도가 45%일때에도 만족스러운 변환비가 유지된다. 특히 SN-τ96 균주는 배지중의 글루코오스의 농도가 60%를 초과할때에도 40%가 넘는 변환비를 유지하며, 배지중의 글루코오스의 농도가 75%일때 조차도 32%나 되는 변환비를 가진다. 더우기 SN-τ96과 SN-G42 균주는 균체가 친수성이기 때문에 거품이 배양중에 실질적으로 발생하지 않는것이 특징이다.

본 발명에 따른 균주들은 '퍼멘테이션 리서취 인스티튜선 오브 에이전시 오브 인더스트리얼 사이엔스 앤드 테크놀러지'(Fermentation Research Institution of Agency of Industrial Seience and Technology)에 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주는 FERM P-8745(FERM BP-1429)로, 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42는 FERM P-8940(FERM BP-1430)으로, 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-τ96은 FERM P-9400(FERM BP-1431)로서 기탁되어져 있다. 또한 본 발명에 따른 균주들은 1988년 1월 16일자로 "한국 종균협회"에 오레오베이시디움속 SN-124A 균주는 KFCC-10508로, 오레오베이시디움속 SN-G42균주는 KFCC-10506으로, 오레오베이시디움속 SN-τ96균주는 KFCC-10507로서 기탁되어져 있다.

다음에 본 발명에 따른 미생물을 사용한 에리쓰리톨의 제조방법을 설명한다. 다음의 설명중에서 특별한 지적이 없는 한, %는 W/V%이다. 본 균주의 배양은 본 균주가 동화시킬 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 포함하고 있는 액체배지를 사용하여 호기적 조건하에서 이루어진다.

액체 배지의 탄소원으로서는 글루코오스, 프락토오스, 수크로오스와 같은 당류가 사용된다. 당농도의 상한은 사용 균주에 따라 다르므로 일반적으로 결정할 수는 없다. 그러나 SN-124A 균주를 사용할 때에는 당농도는 10-40%가 바람직하며, 더욱 바람직한 것은 20-30%이다.

SN-G42 균주를 사용할 때에는 당농도는 10-55%정도이고, 바람직한 것은 20-50%이다. SN-Y 96균주를 사용할 때에는 당농도가 10-95%, 바람직하게는 20-70%의 농도가 사용된다. 질소원으로서는 예를들면 효모추출물, 맥아추출물, 카사민산(casaminoacid), 옥수수 침지액, 암모니움 설페이트, 요소등과 같은 미생물이 이용할 수 있는 질소화합물을 사용한다. 이러한 질소화합물들은 효모추출물의 경우에는 0.5-3.0%의 양으로 사용하는 겻이 바람직하며, 옥수수 침지액의 경우에는 1.5-10%의 양이 바림직하다.

무기염류로서는, 페로스설페이트 소디움클로라이드, 다이포타슘 하이드로젠 포스페이트, 칼슘하이드록사이드, 징크설페이트등의 염이 사용되어지며, 0.1%이하의 양으로 사용하는 것이 바람직하다. 단 이러한 탄소원, 질소원, 무기염류외에 미생물의 생육에 필요한 각종의 유기물, 무기물 또는 통상적으로 사용되어지는 거품제거등이 사용될 수도 있다.

배양은 본 미생물의 균체를 상기와 같은 조성을 갖는 액체 배지에 직접 접종하거나, 별도로 사전배양한 종균배양액을 접종하는 것으로, 행하여 진다. 이러한 종균배양액은 40.0%의 글루코오스와 1.6%의 효모추출물을 포함하고 있는 PH 4-7의 액체 배지에 통상적인 방법으로 사면 배양한 것을 한 루프떠서 접종하고, 다음에는 이것을 34-37℃로 2-4일동안 배양하여 준비된다.

배양은 본 미생물이 생육할 수 있는 온도 범위인 30-38℃ 바람직하게는 35-37℃에서 행하여 진다. 배지는 PH 4-9로 바람직하게는 4-7로 맞춘다. 배양기간은 사용된 배지의 종류와 탄소원으로서 제공된 당의 농도에 따라 다르지만, 보통 4-15일이다.

배양 형태는 뱃취(batch)법이나 연속(continuous)법으로 행한다. 배양을 끝내는 시기는 배지중의 영양원이 최대한으로 이용되고, 배양액중에 생산된 에리쓰리톨의 양이 최대에 달할때가 바람직하다. 따라서 배양은 GLC(gas liquid chromatography) 와 HPLC(high performance liquid chromatography)의 같은 공지의 수단을 사용하여 배양액중의 에리쓰리톨의 양을 측정하면서 행하는 것이 바람직하다. 배양액중에 축적된 에리쓰리톨은 배양이 완료된후, 통상적인 방법에 따라 분리할 수 있다.

즉 해당분야에 있어서 통상적으로 사용되는 수단 예를 들면 여과, 원심분리, 이온교환 또는 흡착크로마토그라피, 용매추출, 증류, 결정화 등의 조작을 필요에 따라 적절히 조합하여 분리한다. 일예를 들면, 여과나 원심분리하여 배양액으로부터 균체를 제거하고, 활성탄으로 처리하여 색소물질을 제거한다. 그 다음, 이온교환 수지를 사용하여 탈이온화하고, 농축시켜서 시럽으로 만든후, 결정화시켜서 에리쓰리톨을 최종적으로 분리해 낸다.

본 발명에 관계된 오레오베이시디움(Aureobasidium)속에 속하는 신규의 미생물 SN-124A 균주와 변이균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42와 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r 96은 당으로부터 에리쓰리톨로의 변환비가 높기 때문에 공업적인 이용에 적합하다. 특히 변이균주 SN-G 42와 SN-r 96은 당농도에 대한 내성이 상당히 크고, 내열성이 우수하며, 배양시에 실질적으로 거품의 발생이 없다는 점 때문에 공업적으로 사용하기에 매우 적합하다. 다음의 실시예들을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1

(a) 종균 배양액의 제조

오리오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A균주 KFCC-10508, (FERM BP-1429)의 균체를 20.0%(W/W)의 글루코오스, 0.5%의 효모 추출물과 1.5%의 한천을 포함하고 있는 사면배지에 접종하고, 35℃에서 3일동안 정치배양 하였다.

그 다음 상기와 같이 배양한 균체를 20%(W/W)의 글루코오스와 2.0%의 옥수수 침지액(오지 콘 스타치(주)제 : oji Corn Starch Co., Ltd.)이 포함된 100ml의 액체배지(PH 5.5)가 들어있는 500ml 용량의 얼렌메이어 플라스크에 1백금이 이식하고, 35℃에서 3일동안 배양하여 배양물을 얻었다.

(b) 본 배양

20%(W/W)의 글루코오스와 2.0%의 옥수수 침지액이 포함된 5kg의 배지를 PH 6.0으로 맞추고, 0.1%의 솔비탄 지방산에스테르(Sorbitan fatty acid ester)와 0.03%의 실리콘계 거품제거제를 7l용량의 발효조에 첨가하고, 120℃로 20분간 멸균하였다. 냉각시킨후, 배지의 PH를 5.5로 맞추고, 상기의 단계(a)에서 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주 KFCC-10508, (FERM P-8745, FERM BP-1429)의 종균배양액 200ml을 이것에 가했다. 이 배지를 35℃에서 1l/min로 에어레이션(aeration)하면서 400rpm으로 7일동안 배양하였다.

그 결과 467g의 에이쓰리톨과 미량의 글리세롤이 이 배양액중에 축적되었다. 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고, 활성탄으로 탈색시킨후 이온교환수지(IRA-410 : IRA-120 B=2 : 1)로 탈염시키고, 농축시켜서 5℃로 보존하여 결정들을 얻었다. 이 결정들을 용해시키고 같은 방법으로 재결정 시켰다. 이렇게 하여 얻어진 다면체의 백색결정들은 상쾌한 단맛을 가지며, 그 융점은 121℃였다. NMR, 선광도, HPLC, GLC등으로 측정한 결과 이 백색 결정들은 에리쓰리톨(메조-에리쓰리톨)로 동정되어 졌다.

실시예 2

30%(W/W)의 글루코오스와 3.2%의 옥수수 침지액이 포함된 50g의 배지(PH 6.0으로 조절)를 500ml의 엘렌메이어 플라스크에 넣고, 멸균한 다음 냉각시켰다. 그후 이 배지의 PH를 6.0으로 맞추었다. 이것에 실시예 1에서 사용한 것과 같은 종균배양액 2ml을 접종하고, 35℃에서 180rpm으로 10일동안 진탕배양 하였다. 그 결과 5.9g의 에리쓰리톨과 1.4g의 글리세롤이 배지중에 축적되었다.

실시예 3

20%(W/W)의 수크로스와 0.5%의 효모추출물이 포함된 50g의 배지를 500ml의 엘렌메이어 플라스크에 넣고, 120℃로 15분간 멸균하였다. 냉각시킨후, 배지를 PH 6.0으로 맞추고, 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주 KFCC-10508, (FERM BP-1429)를 접종하여 35℃에서 180r.p.m.으로 7일간 회전진탕 배양시켰다. 그 결과 4.2g의 에리쓰리톨이 배양액중에 축적되었으나, 글리세롤은 축적되지 않았다.

실시예 4

0.5%의 효모추출물과 10에서 30%(W/W)의 글루코오스가 포함된 50g의 배지를 500ml의 엘렌메이어 플라스크에 넣고 120℃로 15분간 멸균하였다. 냉각시킨후, 배지를 PH 5.5로 맞추고, 20%의 글루코오스와 0.5%의 효모추출물이 포함된 배지에 종균 배양액(오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주를 배양하여 얻은 액) 2ml을 접종하여 35℃, 180rpm으로 4-11일간 배양하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.

[표 1]

* 소비된 글루코오스에 대한 것임

실시예 5

8개의 500ml 용량의 엘렌메이어 플라스크에 20%(W/W)의 글루코오스와 0.5%의 효모추출물이 포함된 50g의 배지를 각각 넣고 멸균하였다. 냉각시킨후, 1N 염산 또는 1N NaOH로 배지를 2.9-10.1의 범위로 조절하였다. 이렇게 하여 얻어진 각각의 배지에 종균(오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주, KFCC-10508, FERM BP-1429)을 접종하여 35℃, 180rpm으로 7일간 회전 진탕배양 하였다. 그 결과 에리쓰리톨이 표 2에 나타낸 바와 같은 수율로 얻어졌다.

[표 2]

* 소비된 글루코오스에 대한 것임

실시예 6

변이균주의 작성

오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주, KFCC-10508, (FERM BP-1429)를 0.5%의 효모추출물과 22%의 글루코오스가 포함된 배지에서 2일간 사전배양 하였다.

사전배양물을 100배로 희석하고, 15-W의 자외선 램프(도시바 살균램프 GL 15)로 30cm의 거리에서 40분간 자외선을 조사하였다. 희석한후, 자외선을 조사한 배양물을 한천배지(1.0%의 효모추출물, 33.5%의 글루코오스와 1.5%의 한천)에 도포하고, 생육하는 균주를 선발하였다. 이렇게 하여 선발된 균주를 같은 방법으로 자외선을 조사하고, 생육하는 균주를 선발하였다. 그 다음, 선발된 균주를 1mg/ml 농도의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 30분간 처리하고, 같은 방법으로 생육하는 균주를 선발하여 변이균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42균주, KFCC-10506, (FERM P-8940, FERM BP-1430)를 얻었다.

실시예 7

(a) 종균 배양액의 제조

오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42균주, KFCC-10506, (FERM BP-1430)의 균체를 35.5%의 글루코오스, 1.0%의 효모 추출물과 1.5%의 한천을 포함하는 사면배지에 도포하고, 35℃로 2-3일간 정지배양하였다. 그 다음 상기와 같이 배양한 균체를 20%의 글루코오스와 1.6%의 옥수수 침지액(오지 콘스타치(주)제, Oji Corn Starch Co., Ltd.)이 포함된 150ml의 액체배지(PH 4.0)가 들어있는 500ml용량의 엘렌메이어 플라스크에 1백금이 이식하고, 35℃로 3일간 배양하였다. 이 배양액중의 9ml을 상기와 같은 액체배지 150ml이 들어있는 500ml용량의 엘렌메이어 플라스크에 접종하고, 35℃로 3일간 회전 진탕배양 시켰다.

(b) 본 배양

20.0%의 글루코오스와 1.6%의 옥수수 침지액이 포함된 15'의 배지를 30'용량의 발효조에 넣고, 300ppm으로 거품 제거제(실리콘 KS-66 신에쯔 카가꾸(주), Shinetsu Kagaku, Co., Ltd.)를 가하고, 120℃로 20분간 증기로 멸균하였다. 냉각시킨 배지를 가성소다로 PH 4.0으로 맞추었다. 그후, 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42의 6%종균 배양액을 배지에 가하고, 0.25VVm으로 에어레이션(Aeration)하면서 35℃ 230rpm으로 배양하였다.

배양종료후 배양액을 분석한 결과, 글리세롤은 완전히 소모되었고, 에리쓰리톨과 글리세린의 수율은 각기 49.3%와 2.2%였다.

다음에는 이 배양액의 일부를 원심분리하여 균체를 제거하고, 활성탄과 이온교환수지(IRA-410 : IR-120 B=2 : 1)를 사용하여 탈색과 탈염을 행하였다. 이렇게 하여 얻어진 용액을 당 농도가 50%이상이 되도록 농축시키고, 서서히 냉각시켜 결정들을 얻은 다음, 물에 용해시키고, 같은 방법으로 재결정 시켰다. 이렇게 하여 얻어진 다면체의 백색결정들은 상쾌한 단맛을 가지며, 융점은 121℃였다.

HPLC와 GLC 그리고 선광도의 측정과 NMR의 스펙트럼을 관찰한 결과, 상기의 결정들은 에리쓰리톨(메조-에리쓰리톨)로 동정되어 졌다.

실시예 8

20.0%의 글루코오스와 1.6%의 옥수수 침지액을 포함하는 15l의 배지를 30l의 용량의 발효조에 넣고 300ppm의 거품제거제를 가한다음 120℃로 20분간 증기멸균 시켰다. 냉각시킨후, 가성소다를 사용하여 PH 4.0으로 맞추었다. 그 다음에 상기의 배지와 동일한 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라서 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42균주, KFCC-10506, (FERM BP-1430)의 6%종균 배양액을 이 배지에 가하였다. 그후 0.50VVm으로 에어레이션하면서 35℃, 230rpm으로 7일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과 글루코오스는 모두 소모되어 졌으며, 에리쓰리톨과 글리세린의 수율은 각기 49.2%와 12%였다.

실시예 9

20.0%의 글루코오스와 1.6%의 옥수수 침지액이 포함된 15l의 배지를 용량 30l의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제를 가한후, 120℃로 20분간 증기멸균을 하였다. 냉각시킨후 배지의 PH를 가성소다를 사용하여 4.0으로 맞추었다. 상기의 배지와 동일한 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라서 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42균주, KFCC-10506, (FERM BP-1430)의 6%종균 배양액을 이 배지에 가하였다. 그후, 0.75VVm으로 에어레이션 하면서 35℃, 230rpm으로 7일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 글루코오스는 모두 소모되어 졌으며, 에리쓰리톨과 글리세롤의 수율은 각기 46.5%와 2.7%였다.

실시예 10

20.0%의 글루코오스와 1.6%의 옥수수 침지액이 포함된 15l의 배지를 30l용량의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제를 가한후, 120℃로 20분간 증기로 멸균하였다. 냉각시킨후, 배지를 가성소다를 사용하여 PH 4.0으로 맞추었다.

상기의 배지와 동일한 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라서 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42균주, KFCC-10506, (FERM BP-1430)의 종균배양액 900ml을 이 배지에 가하였다. 그후 1.00VVm으로 에어레이션 하면서 35℃, 230rpm으로 7일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 글루코오스는 모두 소모되어졌으며, 에리쓰리톨과 글리세롤의 수율은 각기 41.8%와 1.4%였다.

실시예 11

33.5%의 글루코오스와 4.47%의 옥수수 침지액이 포함된 5l의 배양액을 용량 7l의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제를 가한후 120℃에서 20분간 증기로 멸균하였다. 냉각시킨 후, 배지를 가성소다를 사용하여 PH 4.2로 맞추었다.

상기의 배지와 같은 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42의 종균배양액 300ml을 이 배지에 가하였다.

그후, 0.25VVm으로 에어레이션하면서 35℃, 500rpm으로 5일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 글루코오스는 모두 소모되어졌으며, 에리쓰리톨과 글리세롤의 수율은 각기 39.7%와 7.9%였다.

실시예 12

39.5%의 글루코오스와 4.0%의 옥수수 침지액이 포함된 5l의 배지를 용량 7l의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제를 가한후, 120℃로 20분간 증기 멸균하였다.

냉각시킨후, 배지를 가성소다를 사용하여 PH 4.2로 맞추었다. 상기의 배지와 같은 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42균주(KFCC-10506, FERM BP-1430)의 종균배양액 300ml을 이 배지에 가하였다. 그후에 0.25VVm으로 에어레이션하면서 35℃, 500rpm으로 6일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 글루코오스는 모두 소모되어졌으며, 에리쓰리톨과 글리세롤의 수율은 각기 38.6%와 9.5%였다.

실시예 13

39.5%의 글루코오스와 5.3%의 옥수수 침지액이 포함된 5l의 배지를 용량 7l의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제를 가한후, 120℃로 20분간 증기 멸균하였다. 냉각시킨후 배지를 가성소다를 사용하여 PH4.2로 맞추었다.

상기의 배지와 같은 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42균주(KFCC-10506, FERM BP-1430)의 종균배양액 300ml을 이 배지에 가하였다. 그후에 0.25VVm으로 에어레이션하면서 35℃, 500rpm으로 5일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 글루코오스는 모두 소모되어졌으며, 에리쓰리톨과 글리세롤의 수율은 각기 37.5%와 7.5%였다.

실시예 14

39.5%의 글루코오스와 6.6%의 옥수수 침지액이 포함된 5l의 배지를 용량 7l의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제를 가한후 120℃로 20분간 증기 멸균하였다. 냉각시킨후 배지를 가성소다를 사용하여 PH 4.2로 맞추었다. 상기의 배지와 같은 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42균주(KFCC-10506, FERM BP-1430)의 종균배양액 300ml을 이 배지에 가하였다. 그후에 0.25VVm으로 에어레이션하면서 35℃, 500rpm으로 4일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 글루코오스는 모두 소모되어졌으며, 에리쓰리톨과 글리세롤의 수율은 각기 37.1%와 48%였다.

실시예 15

45.0%의 글루코오스와 6.0%의 옥수수 침지액이 포함된 15l이 배지를 용량 30l의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제를 가한후, 120℃로 20분간 증기 멸균하였다. 냉각시킨후, 배지를 가성소다를 사용하여 PH 4.0으로 맞추었다. 상기의 배지와 같은 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42균주(KFCC-10506, FERM BP-1430)의 6%종균 배양액을 이 배지에 가하였다. 그후에 0.33VVm으로 에어레이션하면서 35℃, 230rpm으로 8일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 글루코오스는 모두 소모되어졌으며, 에리쓰리톨과 글리세롤의 수율은 각기 37.3%와 4.5%였다.

실시예 16

33.5%의 수크로오스와 4.5%의 옥수수 침지액이 포함된 5l의 배지를 용량 7l의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제를 가한후, 120℃로 20분간 증기 멸균하였다. 냉각시킨후, 배지를 가성소다를 사용하여 PH4.1로 맞추었다. 상기의 배지와 같은 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G 42균주(KFCC-10506, FERM BP-1430)의 종균배양액 300ml을 이 배지에 가하였다. 그후에 0.25VVm으로 에어레이션하면서 35℃, 500rpm으로 6일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 수크로오스는 모두 소모되어졌으며, 에리쓰리톨과 글리세롤의 수율은 각기 41.9%와 7.4%였다.

실시예 17

39.5%의 수크로오스와 5.3%의 옥수수 침지액이 포함된 5l의 배지를 용량 7l의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제를 가한후 120℃로 20분간 증기 멸균하였다. 냉각시킨후, 배지를 가성소다를 사용하여 PH4.1로 맞추었다.

상기의 배지와 같은 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42균주(KFCC-10506, FERM BP-1430)의 종균배양액 300ml을 이 배지에 가하였다. 그후에 0.25vvm으로 에어레이션하면서 35℃, 500rpm으로 6일간 배양하였다.

배양종료후에 배양액을 분석한 결과 수크로오스는 모두 소모되어 졌으며, 에리쓰리톨과 글리세롤의 수율은 각기 42.4%와 5.8%였다.

실시예 18

45.0%의 수크로오스와 6.0%의 옥수수 침지액이 포함된 5l의 배지를 용량 7l의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제를 가한후, 120℃로 20분간 증기 멸균하였다. 냉각시킨후, 배지를 가성소다를 사용하여 pH 4.1로 맞추었다.

상기의 배지와 같은 배지를 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42균주(KFOC-10506, FERM BP-1430)의 종균배양액 300ml을 이 배지에 가하였다. 그후에 0.25vvm으로 에어레이션하면서 35℃, 500rpm으로 6일간 배양하였다.

배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 수크로오스는 모두 소모되어졌으며, 에리쓰리톨과 글리세롤의 수율은 각기 41.7%와 3.8%였다.

실시예 19

변이 균주의 작성

22.0%의 글루코오스와 0.5%의 효모추출물이 포함된 5ml의 액체 배지에 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주(KFCC-10508, FERM BP-1429)를 접종하여 30℃로 2일간 회전 진탕배양하여 배양물을 얻었다.

이렇게 배양한 배양물을 22.0%의 글루코오스 용액으로 100배 희석하고, 페트리 디쉬속에서 교반하면서 15W의 자외선 램프(도시바 살균 램프 GL-15)로 30cm의 거리에서 40분간 자외선을 조사하였다. 페트리 디쉬속에서 이렇게 좌외선을 조사 처리한 용액을 22.0%의 글루코오스, 0.5%의 효모추출물과 1.5%의 한천이 포함된 한천배지상에 도포하고, 30℃에서 4일간 배양하여 생육하는 균주를 선발하였다.

그 다음, 이렇게 선발된 균주를 22.0%의 글루코오스와 0.5%의 효모추출물을 포함하고 있는 액체 배지에 접종하고, 30℃로 2일간 회전 진탕배양시켜 배양물을 얻었다. 그 다음, 이 배양물을 앞에서와 같은 방법으로 희석하고, 앞에서 언급한 바와같은 조사하에서 20분간 자외선을 재 조사하였다.

이렇게 재 조사 처리한 용액을 33.5%의 글루코오스, 1.0%의 효모 추출물과 1.5%의 한천이 포함된 한천 배지상에 도포하고, 30℃로 4일간 정치 배양하여 생육하는 균주를 선발하였다. 그후, 이렇게 선발된 균주를 33.5%의 글루코오스와 1.0%의 효모추출물이 포함된 액체배지에 접종하고, 30℃로 2일간 회전 진탕 배양시켜 배양물을 얻었다.

다음에는, 배양물을 원심분리하여 균체를 분리하고, 2M의 글루코오스가 포함된 0.2M의 초산완충용액(pH 5.0)으로 2차례 씻어 냈다. 그후, 균체의 농도가 1×10⁷마리/ml이 되도록 완충용액에 현탁시키고, 1mg/ml 농도의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitoro-N-nitrosoguanidine)으로 30℃에서 30분간 처리하였다.

처리종료후, 균체를 통상적인 방법에 따라 분리하고, 완충용액으로 씻어냈다. 그후, 40.0%의 글루코오스, 1.0%의 효모추출물과 1.5%의 한천이 포함된 한천 배지상에 도포하고, 30℃로 5일간 정치 배양시켜 생육하는 균주를 선발하였다. 이렇게 선발된 균주를 1.5%의 효모추출물과 40.0%의 글루코오스가 포함된 액체 배지에 접종하고, 30℃로 2일간 진탕배양하여 배양물을 얻었다. 이렇게 얻어진 배양물을 1×10⁷마리/ml로 희석하고, 3ml의 희석한 배양물을 유리제 시험관에 넣은후, 18cm의 거리로 부터 200KRad의 감마선(60Co)을 조사하였다. 조사종료후, 45.0%의 글루코오스 1.6%의 효모추출물과 1.5%의 한천이 포함된 한천배지상에 도포하고, 30℃로 5일간 정치배양하고 생육하는 균주를 선발하였다.

이렇게 하여 선발된 변이균주가 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM P-9400, FERM BP-1431)이다.

실시예 20

(a) 종균 배양액의 제조

오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)를 40.0%의 글루코오스, 1.6%의 효모추출물과 1.5%의 한천이 포함된 사면 배지상에 도포하고, 35℃로 5일간 정치배양하였다.

그 다음, 상기와 같이 사면 배양된 균체를 40%의 글루코오스와 1.6%의 효모추출물이 포함된 100ml의 액체 배지가 들어있는 500ml 용량의 엘렌메이어 플라스크에 1백금이 이식하고, 35℃로 3일간 배양하였다. 이 배양액중의 9ml을 상기와 같은 액체 배지 150ml이 들어있는 500ml의 코니칼 플라스크에 접종하고, 35℃로 3일간 회전 진탕 배양시켜 배양물을 얻었다.

(b) 본 배양

40.0%의 글루코오스와 6.8%의 옥수수 침지액(별도로 멸균된)이 포함된 15l의 액체 배지를 30l 용량의 발효조에 넣고, 300ppm의 거품제거제(아데카놀 LG-109, 아사히 덴끼 K. K. 제, Adecanol LG-109, Asahi Denka K. K.)를 가하고, NaOH를 사용하여 pH 4.2로 맞추었다.

상기의 (a)단계에서 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)의 종균배양액 900ml을 배지에 가하였다. 0.1vvm으로 에어레이션하면서 35℃, 400rpm으로 4일간 배양하였다. 배양종료후에 HPLC로 배양액을 분석한 결과 글루코오스는 완전히 소모되었고, 에리쓰리톨과 글리세롤의 함량은 각각 18.9%(수율 : 47.3%)와 3.5%(수율 : 8.8%)였다.

다음에는, 이 배양액의 600ml를 원신분리하여 균체를 제거하고, 활성탄과 이온교환수지(IRA-140 : IR-120=2 : 1)를 사용하여 탈색과 탈염을 행하였다. 이렇게 하여 얻어진 용액을 당 농도가 50%이상이 되도록 농축시키고, 서서히 냉각 침전시켜서 결정물을 분리하였다.

그후, 이 결정들을 물에 용해시키고, 같은 방법으로 재결정시켜서 융점이 121.0℃이고, 상쾌한 단맛을 갖는 다면체의 백색 결정들을 얻었다. 이 백색 결정들은 액체 크로마토그라피, 가스크로마토그라피와 비선광도의 측정, 핵자기 공명(NMK)의 스펙트럼으로부터 에리쓰리톨(메조-에리쓰리톨)로 동정되어 졌다.

실시예 21

50.0%의 글루코오스와 6.8%의 옥수수 침지액(별도로 멸균된)이 포함원 15l의 액체 배지를 30l 용량의 발효조에 넣고, 300의 거품제거제를 가하고, NaOH를 사용하여 pH 4.2로 맞추었다.

실시예 20(a)의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주(KPCC-10507, FERM BP-1431)의 종균배양액 900ml을 배지에 가하였다. 1.5vvm으로 에어레이션하면서 35℃, 400rpm으로 6일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 글루코오스는 완전히 소모되었고, 에리쓰리톨과 글리세롤의 함량은 각각 23.3%(수율 : 46.5%)와 4.5%(수율 : 9.0%)였다.

실시예 22

60.2%의 글루코오스와 2.0%의 효모추출물(별도로 멸균된)이 포함된 2l의 액체배지를 3l 용량의 발효조에 넣고, 200ppm의 거품제거제를 가하였다. 실시예 20(a)의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96(KFCC-10507, FERM BP-1431)의 종균배양액 80ml을 배지에 가하였다.

2.5vvm으로 에어레이션하면서 35℃, 1000rpm으로 7일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과 글루코오스는 완전히 소모되었고, 에리쓰리톨과 글리세롤의 함량은 각각 28.8%(수율 : 47.7%)와 6.8%(수율 : 11.3%)였다.

실시예 23

75.5%의 글루코오스와 2.0%의 효모추출액(별도로 멸균된)이 포함된 2l의 액체 배지를 3l용량의 발효조에 넣고, 200ppm의 거품제거제를 가하였다.

실시예 20(a)의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)의 종균배양액 80ml을 배지에 가하였다. 2 .0vvm으로 에어레이션하면서, 35℃, 1000rpm으로 11일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 글루코오스는 완전히 소모되었고, 에리쓰리톨과 글리세롤의 함량은 각각 24.5%(수율 : 32.4%)와 11.0%(수율 : 14.3%)였다.

실시예 24

50.0%의 수크로오스와 6.8%의 옥수수 침지액(별도로 멸균된)이 포함된 5l의 액체 배지를 7l 용량의 발효조에 넣고, 3000ppm의 거품제거제를 가하고, NaOH를 사용하여 pH 4.2로 맞추었다. 실시예 20(a)의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)의 종균 배양액 300ml을 배지에 가하였다. 1.0vvm으로 에어레이션하면서 35℃, 800rpm으로 5일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 수크로오스는 완전히 소모되었고, 에리쓰리톨과 글리세롤의 함량은 각각 23.6%(변환비 : 47.25%)와 5.0%(변환비 : 10.0%)였다.

실시예 25

61.0%의 수크로오스와 2.0%의 옥수수 침지액(별도로 멸균된)이 포함된 2l의 액체배지를 3l용량의 발한조에 넣고, 200ppm의 거품 제거제를 가하였다.

실시예 20(a)의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)의 종균배양액 80ml을 배지에 가하였다. 2.5vvm으로 에어레이션 하면서 35℃, 100rpm으로 6일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과, 수크로오스는 완전히 소모되었고, 에리쓰리톨과 글리세롤의 함량은 각각 24.6%(수율 : 40.3%)와 7.8%(수율 : 12.8%)였다.

실시예 26

93.9%의 수크로오스와 2.0%의 효모추출액(별도로 멸균된)이 포함된 2l의 액체 배지를 3l용량의 발효조에 넣고, 200ppm의 거품제거제를 가하였다.

실시예 20(a)의 방법에 따라 제조한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)의 종균배양액 80ml을 배지에 가하였다. 2.0vvm으로 에러에이션하면서 35℃, 1000rpm으로 15일간 배양하였다. 배양종료후에 배양액을 분석한 결과 수크로오스는 완전히 소모되었고, 에리쓰리톨과 글리세롤의 함량은 각각 21.6%(수율 : 23.0%)와 4.9%(수율 : 5.3%)였다.

실시예 27

본 실시예는 야생균주인 본 발명의 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주와 이것의 변이균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42균주와 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주의 내당성에 대한 비교결과를 보여주고 있다.

방법

2.0%의 효모추출물(디프코(주)제, Difco, Co., Ltd.)과 소정량(22.0-83.3%)의 글루코오스를 포함하는 각각의 100ml의 액체 배지들을 용량 500ml의 코니칼 플라스크에 넣고, 통상적인 방법에 따라 멸균하였다. 그후, 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A, SN-G42와 SN-r96균주를 사면 배양하고, 이 균체를 각각의 배지에 접종하여 35℃에서 1-5일간 배양하여 종균배양액으로 하였다. 그 다음 소정량(22.0-83.3%)의 글루코오스와 20%의 효모추출물을 포함하는 2l의 액체 배지를 3l 용량의 발효조에 넣었다. 이것에 상기의 대응하는 기질 농도를 갖는 종균 배양액 80ml를 각각의 배지에 가하였다.

각 배지중의 글루코오스가 완전히 소모될때까지(2-14일) 2.0vvm으로 에어레이션 하면서 35℃, 1000rpm으로 배양하였다.

배양이 종료된 후, 각 배양액중에 포함된 에리쓰리톨의 양을 HPLC로 측정하였다.

결과

소모된 글루코오스당 에리스톨의 수율은 다음의 표와 같다.

실시예 28

본 실시예는 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주와 이것의 변이균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42균주와 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주의 발포성, 응집성, 친수성에 대한 비교 결과를 보여주고 있다.

방법

1.0%의 효모추출물과 33.5%의 글루코오스를 포함하는 5ml의 액체 배지를 시험관에 넣고, 120℃로 15분간 증기멸균 하였다. 냉각시킨후, 배지를 pH 5.5로 맞추고, 사면 배양한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주와 SN-G42균주와의 균체를 접종한 다음 30℃에서 4일간 회전 진탕배양하였다.

배양종료후, 균체의 응집된 상태와 거품의 발생(발포성 및 응집성)을 관찰하기 위하여 배양액을 15분간 정치하였다.

그 다음 계속하여 배양액과 같은 양의 벤젠을 배양액을 격렬히 교반하면서 가하고, 약 30분간 정치시켜 균체의 벤젠층으로의 이행상태(친수성)를 관찰하였다.

같은 방법으로 효모추출물 1.6%와 글루코오스 40.0%를 포함하는 액체 배지를 사용하여 로에오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-r96균주에 대하여도 관찰하였다.

결과

모균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A 균주를 액체배지중에서 호기적으로 배양했을때, 거품이 현저하게 발생하였다.

이 거품은 왕복진탕을 멈춘후에도 상당한 시간동안 남아있었다. 배양액중의 균체들은 교반을 정지하였을때 급속히 응집하여 침전되었다. 그러나, 변이 균주인 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-G42와 SN-r96 균주를 상기와 같은 조건하에서 배양하였을때에는 거품은 전혀 관찰되지 않았다.

또한 왕복 진탕을 멈춘후에도 균체의 응집은 일어나지 않았다. 더우기 적량의 벤젠을 모균주와 변이 균주들의 배양액에 각각 가하여 벤젠과 물의 2층계로 하였을때 모균주의 균체들은 벤젠층으로 이행되었으며, 수용액층에는 잔류된 균체가 없었으나, 변이 균주들의 균체들은 모두 수용액층에 남아 있었으며, 벤젠층으로의 이행은 없었다.

Claims

동화할 수 있는 탄소원 및 동화할 수 있는 질소원을 함유하는 액체 배지중에서 호기적으로 배양할 때에, 배양액중에 에리쓰리톨을 생성축적하는 성질을 가지며, 당류의 발효에 의한 에리쓰리톨의 제조에 유용한 오레오베이시디움(Aureobasidium)속 SN-124A균주(KFCC-10508, FERM BP-1429) 및, 이것의 인공변이 균주인 오레오베이시디움속 SN-G42균주(KFCC-10506, FERM BP-1430) 및 오레오베이시디움속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)의 생물학적으로 순수한 배양균주인 오레오베이시디움속의 신규미생물.
동화할 수 있는 탄소원을 40%이상 함유하며, 동시에 동화할 수 있는 질소원을 함유하는 액체 배지중에서 호기적으로 배양할 때에, 발효에 따른 거품의 생성을 실질적으로 수반하지 않고, 배양액중에 에리쓰리톨을 생성축적하는 성질을 갖으며, 균체가 친수성이고, 당류의 발효에 의한 에리쓰리톨의 제조에 유용한 오레오베이시디움속 SN-124A균주(KFCC-10508, FERM BP-1429)의 인공변이 균주의 생물학적으로 순수한 배양균주인 오레오베이시디움속의 신규미생물.
제2항에 있어서, 오레오베이시디움속 SN-124A 균주의 인공변이 균주가 생물학적으로 순수한 배양균주인 오레오베이시디움속 SN-G42균주(KFCC-10506, FERM BP-1430)인 오레오베이시디움속의 신규미생물.
제2항에 있어서, 오레오베이시디움속 SN-124A균주의 인공변이 균주가 생물학적으로 순수한 배양균주인 오레오베이시디움속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)인 오레오베이시디움속의 신규미생물.
높은 내당성을 가지며, 균체가 친수성이고, 배양시에 거품을 실질적으로 발생하지 않는 오레오베이시디움속 SN-124A균주의 인공변이 균주인 오레오베이시디움속 SN-G42 및 오레오베이시디움속 SN-r96균주의 취득방법이, (1) 오레오베이시디움속 SN-124A균주(KFCC-10508, FERM BP-1429)의 배양균주에 자외선을 조사한 다음, 글루코오스의 농도가 비교적 낮은 한천 배지상에서 정치 배양하여 생육하는 균주를 선발하고, (2) 이렇게 선발된 균주에 다시 자외선을 조사한 다음, 상기의 농도보다 높은 글루코오스의 농도를 갖는 한천 배지상에서 정치배양하여 생육하는 균주를 선발하고, (3) 이렇게 선발된 균주를 변이 유발제로 처리한 다음, 상기의 농도보다 더높은 글루코오스의 농도를 갖는 한천 배지상에서 정치배양하여 생육하는 균주인 오레오베이시디움속 SN-G42 균주(KFCC-10506, FERM BP-1430)를 선발하고, (4) 원한다면, 이렇게 선발된 균주에 60Co의 감마선을 조사한 다음, 더욱더 높은 글루코오스의 농도를 한천 배지상에서 정치배양하여 생육하는 균주인 오레오베이시디움속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)을 선발하는 것인 오레오베이시디움속의 신규미생물의 취득방법.
제5항에 있어서, 변이유발제가 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘인 오레오베이시디움속의 신규미생물의 취득방법.
동화할 수 있는 탄소원 및 질소원을 함유하는 pH 4-9의 액체 배지에 오레오베이시디움속 SN-124A균주(KFCC-10508, FERM BP-1429)및, 이것의 인공변이균주인 오레오베이시디움속 SN-G42균주(KFCC-10506, FERM BP-1430) 및 오레오베이시디움속 SN-r96균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)로부터 선발된 균주를 접종하고, 30-38℃로 소정기간동안 호기적으로 배양하여 배지중에 에리쓰리톨을 생성축적시키고, 이것을 분리정제하는 것을 포함하는 당류의 발효에 의한 에리쓰리톨의 제조방법.
동화할 수 있는 탄소원을 30%이상 함유하며, 동시에 동화할 수 있는 질소원을 함유하고 있는 pH4-9의 액체 배지에 오레오베이시디움속 SN-124A균주(KFCC-10508, FERM BP-1429)의 인공변이 균주를 접종하고, 30-38℃로 소정기간동안 호기적으로 배양하여 배지중에 에리쓰리톨을 생성 축적시키고, 이것을 분리정제하는 것을 포함하는 당류의 발효에 의한 에리쓰리톨의 제조방법.
제8항에 있어서, 오레오베이시디움속 SN-124A 균주의 인공변이 균주가 오레오베이시디움속 SN-G42 균주(KFCC-10506, FERM BP-1430)인 당류의 발효에 의한 에리쓰리톨의 제조방법.
제8항에 있어서, 오레오베이시디움속 SN-124A 균주의 인공변이가 균주가 오레오베이시디움속 SN-r96 균주(KFCC-10507, FERM BP-1431)인 당류의 발효에 의한 에리쓰리톨의 제조방법.