KR900005532B1

KR900005532B1 - 사이클로 덱스트린(cyclodextrin) 생성 효소와 그의 생산 미생물

Info

Publication number: KR900005532B1
Application number: KR1019880009365A
Authority: KR
Inventors: 유주현; 정용운; 권익부; 이윤수
Original assignee: 유주현
Priority date: 1988-07-26
Filing date: 1988-07-26
Publication date: 1990-07-31
Also published as: KR900001844A

Abstract

내용 없음.

Description

사이클로 덱스트린(cyclodextrin) 생성 효소와 그의 생산 미생물

제1도는 전분용액에 본 균주의 효소를 작용시켜 얻어진 반응 생성물을 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 분석한 도면이다.

제2도는 사이클로 덱스트린 생성효소를 생산하는 미생물의 전자 현미경 사진 도해이다.

제3도는 정제된 효소 단백질의 에스디에스 폴리아크릴 아마이드 젤 전기 영동(SDS-Polyacrylamidegel electrophoresis) 사진이다.

제4도는 효소 단백질의 콜리아크릴 아마이드 젤 전기 영동(Polyacrylamide gel electrophoresis)을 행한 후 전분용액에 반응시켜 활성이 있는 위치를 확인한 결과이다.

본 발명은 환상 다당류 사이클로 덱스트린(cyclodextrin)을 생산하는 효소 즉 신규의 사이클로 덱스트린 글라이코실 트랜스 훠 레이스(cyclodextrin glycosyltran sferase)와 그 생산 미생물에 관한 것이다. 사이클로 덱스트린은 1891년 빌리어(Villier)에 의해 처음 발견된 이래 많은 연구를통해 그 구조와 특성이 밝혀져 6-8개의 포도당(glucose)이 알파-1,4(^a-1,4) 결합으로 연결된 환상형 당류로 알려져 있다.

사이클로 덱스트린은 분자내에 특징적인 소수성 공동(cavity)을 가지고 있어 여러분자들과 포접 화합물(inclusion complex)를 형성함으로서 그 분자들이 가지고 있는 물리·화학적 성질을 변화시키는 능력을 가지고 있다.

이러한 사이클로 덱스트린의 독특한 특성을 이용하여 의약, 농약, 화장품, 식품등에 있어서 유효성분의 안정화, 가용화, 유화등에 현재 널리 실용화되고 있다. 또한 사이클로 덱스트린의 포도당 분자가 알파-1,6 결합으로 결합된 분지 사이클로 덱스트린(branched cyclodextrion) 및 각종 사이클로 덱스트린 유도체를 이용한 포접 화합물의 구조 및 기작 연구와 사이클로 덱스트린 자체의 촉매기능에 관해서도 연구 보고가 되고 있다. 이러한 사이클로 덱스트린은 전분에 사이클로 덱스트린 글라이코실 트랜스 훠 레이스를 작용시킴으로서 포도당 분자가 6,7,8로 구성된 알파, 베타, 감마-사이클로 덱스트린(α,β,γ -CD)의 형태로 얻어진다. 이 효소에 대한 연구는 1939년 틸든과 허드슨(Tilden과 Hudson)에 의해 바실러스 마세란스(Bacillus macerans)가 생산하는 효소를 시작으로 연구가 진행되어 왔다. 전분으로부터 알파와 베타와 감마 사이클로 덱스트린의 생성비율은 각 효소의 종류에 따라 서로 다른 것으로 알려져 있고 주 생성 형태가 알파형으로 바실러스 마세란스(Bacillus macerans, Tilden과 Hudson, 1939), 이외에 바실러스 스테아로써 모필러스(B.Stearothermophilus, Shiosks, 1976), 크레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonias, Bender, 1977)등과 베타형으로 바실러스 서큘란스(B.Circylans, Okads 등, 1973), 바실러스 메가테리움(B.megaterium, Kita hata 등, 1974), 호알카리성 바실러스(Aldlophilic Bacillus Sp., Nakamura 등 197 6), 바실러스 오벤시스(B. Ohbensis, Sato 등, 1985)등이 이 효소를 생산하는 미생물로 알려져 있다. 특히 1976년 일본국의 나카무라(Nakamura)등이 분리한 호알카리성바실러스(alkalophillic Bacillus SP. ATCC 21783)에 의해 베타 사이클로 덱스트린의 제조 및 공업적 양산화에 성공을 거두었다.

본 발명에서는 공업적으로 유용한 사이클로 덱스트린 생성 효소를 생상하는 호알카리성 미생물을 토양으로부터 분리하여 Bacillus SP.KFCC 10623호로 동정하고 효소 생산조건 및 효소적 특성을 검토한 결과, 기존 생산 균주의 생리적 성질과 효소 특성에 있어서 몇가지 현저한 특성을 갖고 있었다.

본 발명의 균주 KFCC 10623호 미생물은 1988년 7월 5일 사단법인 한국굴균 협회에 기탁되었으며 특허관계법령에 따라 수탁중을 첨부하며 필요시 분양 가능함은 물론이다.

[효소 활성 실험]

본 발명의 미생물 균주는 토양으로부터 알카리 조건 (pH 10.3)하에서 생육하는 미생물중 전분 분해능을 가지며 전분으로부터 사이클로 덱스트린의 생성 능력이 우수한 균주를 선정하였다. 활성의 확인 방법으로 5% 전분용액에 본 균주의 효소를 50℃에서 20시간 반응시켜 반응 생성물을 HPLC(high performance liquid chromat ography)를 사용하여 분석한 결과는 제1도와 같았다.

본 효소에 의해 생성되는 주 생성 형태는 베타형 사이클로 덱스트린이었으며 약간의 알파 및 감마형의 부수적으로 생성되는 것이 확인된다.

[미생물 균주 동정]

본 발명의 균주는 그람 염색 양성이었으며 제2도 사진도에 나타난 바와같이 형태는 간균(크기0.4-0.5㎛ S2.0-3.0㎛)이며 호기성, 운동성을 가지며 카타리아제 양성(catalase positive)과 코자를 형성하는 특징으로부터 바실러스 속(Bacillus SP.)미생물로 동정되었다. 그밖에 여러 가지 배양 및 생리적 특성을 실험 검토한 결과는 표 1과 같다. 베타 사이클로 덱스트린의 생산균으로 공지된 호알카리성 바실러스(alkalophilic Bacillus SP.ATCC 21783)를 대조균으로 하여 그 특성을 비교하여 본 결과 본 균주는 중성 포도당 영양배지(glucoes-nutrient medium, pH 7.0)에서 전혀 생육하지 않는 반면 대조균의 경우 약간의 생육을 보이며 7% 식염(NaCl)이 함유된 배지에서는 본 균주는 정상적 생육을 보이는 반면 대조균은 전혀 생육하지 않았다. 이때의 배지조성은 포도당(glucose) 1%, 이스트익스트랙트(yeast extract) 0.5%, 폴리펩돈(poly peptone) 0.5%, 인산칼륨(K₂HPO) 0.1%, 황산마그네시움(Mgso₄.7HO)0.02%, 소듐카보네이트(Na₂CO₃)1% (pH 10.3)이었다. 또한 최고 생육 온도에 있어서 대조균은 45℃까지 생육을 보이나 본 균주는 전혀 생육하지 않고 42℃까지 생육을 보인다. 생육 pH는 두 균주 모두 7.5-11.0에서 생육하는 호 알카리성 세균이었다. 가수분해 활성에 있어서 대조균의 경우 카제인을 빠르게 분해하는 반면 본 균주는 매우 서서히 가수분해 하였고 카르복시 메칠 셀룰로오스(CMC)와 젤라틴(gelatin)에 분해 활성이 있으나, 본 균주는 분해하지 못하는 차이를 보여주었다.

이상의 균주 공정 결과 본 발명의 균주는 이미 공지된 대조균과 현저한 생리적 특성의 차이를 보였으며 또한 이제까지 보고된 사이클로 덱스트린을 생산하는 미생물과도 비교시 상이한 특성의 차이를 가지고 있다.

[실험예 1]

본 발명의 균주는 전분, 당류등의 탄소원, 요소, 질산염 , 암모니움염, 단백질, 아미노산과 같은 질소원, 비타민, 핵산, 효모추출물, 펩톤, 말트추출물등과 같은 영양원, 인산염, 황산염, 탄산염과 같은 무기염으로 구성된 배지로부터 신규한 효소를 얻을 수 있다. 최대의 효소 생산을 얻기 위하여 가용성 전분(soluble starch) 1.5%, 콘스팁리쿼(corn steep liquor) 5%, 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.1%, 황산마그네숨(MgSO₄.7HO) 0.02%, 소듐카보네이트(Na₂CO₃)1%, 칼슘카보네이트(CaCO₃) 1%를 증류수에 용해한 조성의 배지(pH 10.3)에서 37℃, 호기적 조건하에서 48-60시간 진탕 배양한 배양액으로부터 2.35u/ml효소 생산을 얻을 수 있었다. 동 효소의 활성을 측정하기 위하여 기질 용액으로서 5mM 알파 사이클로 덱스트린(d-CD)와 25mM 슈크로즈(sucrose)를 완충액(pH 6.0)에 용해하여 기질 용액 0.35ml에 효소액 20ul를 가해서 40℃에서 10분간 반응시킨후 끓는 물에서 10분간 처리하여 효소 반응을 정지시켰다. 생성된 직쇄상의 말토 덱스트린(maltodextrin)을 포도당 단위로 완전 분해시키기 위해서 30ul의 글루코아밀라제(glucoamylase, 9.3u/30ul)를 40℃에서 20분간 처리하고 디니트로 살리실릭산(dinitrosalicylic acid, DNS)용액 1ml를 가해 5분간 끓였다. 여기서 3ml의 증류수를 가해 희석하고 생성된 환원당의 양을 흡광도(O.D 510)을 측정함으로써 정량하였다. 이때 효소 1단위(unit)는 주어진 조건에서 1분간 1마이크로 몰(umole)의 포도당을 생성시키는 효소의 양으로 정의하였다. 이와같은 조건에서 본 균주는 CGTase 이외의 다른 불순 amylase를 생산하지 아니하였다.

[실험예 2]

본 균주가 생산하는 효소의 특성을 확인한 결과 본 효소는 분자량 7500 달톤 정도의 단일 서브유니트(subunit)를 가진 한 종류의 효소임을 에스디에스 폴리아크릴 아마이드 젤 전기 영동(SDS-polyacryamide electrophoresis)으로 확인하였으며 최적 pH는 6.0이었다. 이 실험 결과는 제3도 사진도에 나타내었다. 대조균의 경우 분자량이 85000-88000 달톤의 산성·중성·알카리성의 3종류의 효소가 존재한다고 알려져 있다.

[실험예 3]

본 균주와 대조균의 효소 단백질을 폴리아크릴 아마이드 젤 전기 영동(polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리하여 젤을 3%(W/V) 전분용액에 50℃에서 15분간 반응시킨후 요오드 용액을 가해 발색시켜 활성이 있는 부분의 투명대로 효소 단백질의 위치를 확인하였다. 본 효소 단백질은 아래 부분의 단일한 위치에서 활성을 보인반면, 대조균의 효소 경우, 위의 위치에서 각각 3종류의 활성위치를 확인함으로서 효소 단백질 자체의 성상의 차이를 확인할 수 있었다. 이 실험 결과는 제4도 사진도에 나타내었다. 이는 효소의 정제시나 효소의 고정화등의 효소의 산업적 이용면에서 단일 단백질로 인한 동일한 특성의 효소 단백질을 수율높게 회수 또는 이용할 수 있다는 점에서 유용한 장점으로 기대된다. 이처럼 본 발명의 미생물균극 KFCC 10623호(기탁기관: 사단법인 한국종균 협회, 기탁일자: 1988.7.5)는 주로 베타 사이클로 덱스트린을 생산하는 호알칼리성 바실러스 속(Bacillus SP)의 산업적으로 유용한 발명인 것이다.

[표 1]

Claims

베타형 사이클로 덱스트린을 주로 생산하는 호알칼리성 바실러스 스페시스 KFCC 10623호 미생물.
최적 pH 6.0, 분자량 약 75000 달톤 크기의 단일 서브유니트를 가진 바실루스 스페시스 KFCC 10623호 유래의 사이클로 덱스트린 생성 효소.