KR900005339B1 - 리포솜을 이용한 신규의 면역분석방법 - Google Patents

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Description

리포솜을 이용한 신규의 면역분석방법

제1도는 다층 리포솜내의 스테아릴아민 함량변화에 따른(막내글루코스농도 대 막외글루코스농도의 비)-(450mm에서의 흡광도의 역수)^3/2의 그래프를 나타내며[ ●; 스테아릴아민농도 7.3몰%, □; 14몰%, △; 24몰%. ○; 32몰%].

제2도는 면역리포솜에 대한 항혈청의 영향을 나타내며[ ●; 항-BSA토끼혈청, ○; 정상토끼의 혈청].

제3도는 면역리포솜에 대한 보체의 영향을 나타번다.[ ○; 보체, ●; 가열불활성화 보체].

일찌기 시료중의 항원성물질이나 항체 혹은 분석하고자 하는 여러가지 물질의 정성 혹은 정량적 분석의 목적으로 대략선별분석(high volume screening assay)의 필요성이 강조되어 왔다.

따라서 과거에는 가스크로마토그라피, 질량분석기, 액채크로마토그라프 및 여러가지 생물학적 정량법이 사용되었다.

그러나 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고, 비용이 많이 들며 다량의 분석에는 적용하기 힘든 비효율적인 방법들이다.

최근에는 매우 특이하고 민감한 면역반응을 이용한 분석법이 고안되어 생물학적 시료중의 약물, 호르몬, 비타민, 펩타이드, 단백질 및 기타 항원성 거대활자들의 분석에 많이 이용되고 있다.

이중 방사성 면역분석법(radioimmunosasay ; 이하 RIA로 약한다.)은 매우 민갑하여 가장 많이 사용되고 있는 분석방법중의 하나이다. 그러나, 이 분석법의 가장 큰 단점은 항체가 결합된 항원과 결합되지 않은 항원과의 분리작업에 있다.

분리의 목적으로 전해질침전법(electrolye precipitation), 분배법(Partition), 고체상을 이용하는 법(solid phase method), 크로마토그라피, 초원심분리(ultracentrifugation) 등이 이용되나 모두 시간소모가 많고 비용이 많이들며 오차의 가능성이 높다. 이밖에도 이 방법은 다량의 분석에는 적합하지 못하고 특별한 처리가 필요할 뿐더러 취급자가 한정되어 있고 복잡한기계(예 ; scintillation counter)의 설비를 필요로하고, 방사성 동위원소의 짧은 반감기(¹²⁵I,¹³¹I등), 위험성, 고가의 비용등의 단점을 지니고 있다.

또 다른 면역분석법으로는 형광 또는 효소면역분석법(fluorescent or enzymatic immunoassay)이 있는데 이는 RIA법에서 사용한 위험한 방사성물질을 사용하지 않는다는 잇점은 있으나 마찬가지로 원심분리나 크로마토그라피 같은 번거로운 분리조작을 거처야 한다는 점에서 볼편함과 시간소모를 초래한다.

이밖에도 효소표지항원을 고체상(solid phase)얘 흡착 또는 공유결합시킴으로서 분리조작없이도 민감하게 분석정량할 수 있는 방법이 있으나, 이 방법은 긴급한 효소에 항체 혹은 항원을 결합시켜 사용하므로 새로운 분석에는 쉽게 적용할 수 없다.

또한 표면에 항체나 항원을 결합시킨 리포솜에 스핀공명표지물질(spin resonance labels)을 봉입시켜 외부의 항원이나 항체에 감작되었을 경우 면역반응에 의해 리포솜이 용혈됨으로서[kinsky,s.c.(1972).Biochim.Biophys.Acta,265,1-23]방출되는 내부표지물질을 정량하는 스핀 리포솜 면역분석법[ spin liposome immunoassay : U.S.pat, No 3.850.5781]이 개발되었으나 이 역시 전자 스핀 공명분광기(ESR spectroscopy)가 필요하고, 스핀 공명표지물질 대신 형광물질을 사용하는 방법[ U.S.pat.No 4.483,929] 역시 형광분석기의 필요성으로 자가분석적 진단시약으로의 이용은 불가능하다.

최근에는 이러한 불편을 없애기 위해, 역시 표면에는 항원이나 항체를 결합시키고 내부에는 효소를 봉입시킨 리포솜이 개발됨으로서[ British patent Application No.8,103,282,dated Feb.3,1981) 이를 이용한 분석법이 개발되고 있다.[ U.S.pat No 4,480,041,EP.No.134,222A]

이러한 방법은 매우 민감한 효소-기질의 특이반응을 이용하는 것으로 퍼옥시다아제(peroxidase)나 알칼린포스파라아제(alkaline phosphatase)가 해당 기질인 과산화수소나 파라-니트로페닐포스레이트(P-nitrophenyl phosphate)와 반응시 색깔을 발하는 원리를 이용한 것으로, 기존의 방법은 리포솜내 효소 봉입시 효소단백의 소수성부분이 리포솜의 이중막 사이에 걸리게 됨으로서 리포솜의 외부표면에도 효소의 활성부위가 일부노출됨으로서 신호대잡음비(signal to noise ratio)가 너무 낮아, 간편하다는 잇점은 있었으나 감도 높은 분석은 어려웠었다.

본 발명에서는 리포솜표면에 노출된 효소의 활성부위에 특이하게 작용하여 불활성화시키는 브롬화시안(CNBr)처리법을 개발하여 거의 잡음없고 감도 높은 분석법을 개발했다.

또한 리포솜표면에 항체나 항원을 결합시킬 경우 대부분 두개의 관능기를 갖는 결합제(카르보디이미드, 석신아미드, 말레아미드, 아릴이소시아네이트, 4-플루오로-3-니트로페닐아지드, 방향족디설포닐 클로라이드 등)를 이용함으로서 두세번의 반응단계를 거쳐야 하거나, 여러단계의 합성단계를 거친 지질로 리포솜을 제조하는 것과 같은 번거로움이 있었으나, 본 발명에서는 리포솜표면의 특정기를 산화 혹은 환원시킴으로서 알데히드기를 생성시킨 후 한 단계로 바로 항체를 결합시키는 새로운 방법이, 결합체 글루타르알데히드를 사용하는 방법과 함께 개발되었다. 이때 항체는 피들러(Fiddler) 등의 방법에 의해 리포솜표면에 간편하게 결합시킬 수 있다. [ Analyt.Chem.,86,716-724(1978)]

또한 본 발명에서는 양전하를 띤 스테아릴아민을 사용하여 리포솜의 물성을 변하게 하지 않는 수준에서 인지질간의 거리를 최대로 높여 단층 거대 리포솜(2000-3000Å)을 제조함으로서 효소봉입의 극대과를 꾀하였다.

그리고 적당량의 콜레스테롤을 인지질의 이중막 사이에 넣어 리포솜의 안정성을 증가시키고, 리포솜 현탁액을 냉동건조기술을 이용하여 분말상태로 제조함으로서 효소활성의 손실없이 일년이상 보관가능하계 되었다.

이렇게 제조된 면역리포솜을 이용한 면역분석방법은 최근 항원에 대해 매우 특이한 친화력을 갖는 단세포 군 항체(monoclonal antibody) 생산기술[ U.S.pat.No.4,196,265] 발달로 분석의 감도를 배가시킬 수 있게 되어 분석하고자 하는 물질의 정성분석은 물론 10^-4-10^-5M까지 정량분석할 수 있게 되었다.

따라서 본 발명의 리포솜 면역분석방법은 어떠한 위험성이나 분리공정없이 신속, 간편하게 단지 소량의 시료(10μl)를 이용, 단일 조작으로 약물이나 생리활성물질, 독성물질, 항원성물질 등의 존재여부를 검색할 수 있어 자가분석적 진단시약으로의 개발가치가 높다.

본 발명이 진단시약으로 이용될 경우는

1) 내부에는 효소를 봉입하고 이를 브롬화시안으로 처리한 후 표면에는 항체 혹은 항원을 결합시킨 면역리포솜의 현탁액

2) 상기 효소의 기질

3) 보채로 구성된 각기 다른 용기의 시약으로 구성될 수 있다.

여기에 사람의 혈청 등 분석하고자 하는 물질을 넣어 같이 섞으면 10분 내지 20분후에 그 색깔의 발색여부로 진단할 수 있게 된다. 실지로 본 발명의 응용범위는 넓어서, 다음 물질들을 모두 분석할 수 있다.

1) 호르몬 ;

갑성선호르몬 ; 티록신, 삼요오드화티로닌, 부갑상선호르몬, 칼시토닌

스테로이드호르몬 ; 에스트라다이올, 에스트론, 테스토스테론

췌장호르몬 ; 인슐린, 프로인슐린, 글루카곤

뇌하수체호르몬 ; 프로락틴, 티로트로핀, 아드레노코르티 코트로핀호르몬, 옥시토신, 바소프래신

자궁 및 태반호르몬 ; 코리오닉 고나도트로핀, 릴랙신

성장인자 ; 유로가스트론, 신경성장인자

2) 뉴클레오티드류

뉴클레오시드류

3) 약물과 그 유도체 및 대사체 ;

바르비탈산염(barbiturates)

디곡신(digoxin), 디기톡신(digitoxin)

디페닐히단토인(diphenylhydantoin)

메산토인(mesantoin)

아편알칼로이드(opiate)

맥각알칼로이드(ergot alkaloid)

마리화나(marihuana)

코카인(cocaine)

항생제류(antibiotics)

암페타민(amphetamine)

카테콜아민(catecholamine)

프로스타글란딘(prostaglandin)

살충제류(pesticides)

4) 독소 ;

미코톡신(mycotoxin)

아플라톡신(aflatoxin)

파툴린(patulin)

페니실린산(penicillic acid)

5) 거대분자 항원 ;

B형간염표면항원(hepatitis B surface antigen)

조직접합성 표지물(histocompatibilitiy marker)

기생충-유도항원 (parasite-derived antigens)

세균성 항원(bacterial antigen)

알러지 원(alllergen)

본 발명은 이러한 목적 이외에도 면역학 영역에서 인공세포인 리포솜을 이용하여 면역반응을 연구하는데 이용할 수 있으며 효소와 같은 단백질을 리포솜의 지질막내에 넣어 유동모자이크 세포모델을 제조함으로서 세포막의 구조와 기능을 연구하는데 이용할 수 있다.

효소를 봉입시킨 리포솜은 특정 효소 결핍증 환자에게로의 효소투여 매체로 이용함으로서 선천적 혹은 후천적으로 체내에 여러가지 활성효소가 부족한 사람들에게 임상적으로 이용가능하고 항체를 결합시킨 리포솜은 암세포와 같은 체내 특정환부로의 표적화에 응용, 약물의 부작용을 줄이고 지속성 약물방출을 꾀할 수 있는 새로운 약물 전달체계로의 개발에도 이용할 수 있다.

실지로 이 분야에의 이용도는 높아서 리포솜 기초제품의 시장규모는 1987년 6훨 12일 현재 총 212백만달러로 분석되고 있으며 1995년도의 항암제, 항감염제. 안과용약, 기관지 확장제 및 펩타이드들에 대한 리포솜 기초제품의 세계시장성은 1,015백만달러 정도로 추정되고 있다. [제약기술정보 1987년 10월호. p 17-l9]

또한 본 발명의 리포솜은 내부에 DNA,RNA, 바이러스 등을 봉입시킨 후 다른 인공세포 혹은 자연세포와의 세포융합을 통해 유전정보를 갖는 물질을 다른 세포로 전이시킴으로서 생명공학에 이용할 수도 있다.

[실시예 1]

다층 리포솜의 제조

포스파티딜콜린, 콜레스테롤(몰비, 2:1)과 여러가지 농도의(7.3%-32%) 스테아릴아민의 혼합물로 제조하였다. 먼저 이들 원료를 클로로포름에 용해시킨 후 회전식 진공증발기로 용매를 제거하여 시험관 내부에 지질박막을 형성시키고 실온중에서 15-20시간 동안 감압하여 건조시킨 다음 여기에 60mM포도당, 2mMDATA 및 10mM트리스-염산완충액을 함유한 pH 7.5의 수용액을 가한 후 보르텍싱시켜 리포솜 현탁액으로 제조하였다. 이렇게 형성된 리포솜 20μℓ에 고장액 혹은 저장액의 포도당 용액 3mℓ를 넣고 1시간 후에 450nm에서 흡광도를 측정[ LKB모델 Ultrospec 4050 스팩트로포토미터]함으로써 삼투현상을 관찰하였다.

리포솜에 글루코스농도에 대한 리포솜의 글로 코스농도의 비-(450mm에서의 흡광도의 역수)^3/2를 그래프로 나타냈다.(제1도)

(1/A₄₅₀)^3/2=(1/K) [ Vact (Cin/Cout) + Vdead]의 식 [ Yoshikawa, W. et al, Biochim. Biophys.Acta 735, 397(1983)]으로부터 삼투압구배가 막기능이 있는 리포솜용적에 대해 상관성을 나타냄을 알 수 있으므로 제1도로부터 소혈청알부민을 리포솜표면에 부각시키는테 필수적인 스테아릴아민의 양은 15몰% 이하임을 알았다. 그 이상의 농도에서는 스테아릴아민의 양이온전하반발에 의해 막기능을 상실한다고 생각되었다. 단, 식중에서 A₄₅₀은 450nm에서의 흡광도, Cin은 막내글루코스농도, Cout은 막외글루코스농도, Vdead는 삼투압활성이 없는 리포솜 농도, Vact는 삼투압활성이 있는 리포솜농도, K는 상수를 나타낸다.

[실시예 2]

1) 역상증발법에 의한 단층 거대 리포솜의 제조

실시예 1의 다층리포솜과 같은 조성의 지질을 이용하여 역상증발법(reverse-Phase evaporation method : U.S.pat.No.4,235,871)으로 제조하였다.

먼저 다층 리포솜의 경우와 같이 시험관 내부에 지질박막을 형성시킨후 3㎖의 디에틸에테르에 다시 용해시켰다.

여기에 5mg의 알칼린 포스파타아제를 함유한 pH 9.5의 25mM 붕산염완충액 1㎖을 가하고 보르텍싱하여 수층과 유기용액층을 혼화시킨 다음, 실온감압하에서 디에틸에테르를 완전히 제거하고 소량의 붕산완충액을 넣고 부드럽게 보르텍싱시켜 제조하였다. 봉입되지 않은 효소나 이중지질막사이에 낀 효소는 브롬화시안(CNBr) 포화용액으로 3시간 동안 처리하여 불활성화시킨 후 30,000g에서 30분씩 여러차례 원심분리하여 유리된 효소를 제거하였다. 마지막에 얻은 리포솜잔사에 붕산염완충액을 가해 처음 용량으로 하였다.

2) 리포솜내 효소 봉입효율 측정

실시에 2-1)과 같은 방법으로 20μmol의 포스파티딜콜린, 10μmol의 콜레스테롤을 사용하고, 스테아릴아민을 여러가지 농도로 사용하여 단층 거대 리포솜을 제거하고 100,000g로 1시간동안 원심분리하였다. 리포솜내에 봉입되지 않고 상등액중에 용해되어 있는 효소 알칼린 포스파타아제를 로우리등의 방법[ Lowry, O.H., Rosebrough. N.J.,Farr,A.L.,& Randall,R.J(1951).J.Biol.Chem.193,265-275]으로 정량하였다.

봉입된 알칼린 포스파타아제의 양은 총량으로부터 상등액 중의 효소량을 뺀값으로 하였으며 그 결과 표 1과 같았다. 스테아릴아민을 12몰% 이상 사용했을 때 45%정도의 봉입효율을 얻을 수 있었다.

[표 1]

또한 실시예 2-1)과 같은 방법으로 20μmol의 포스파티딜콜린, 2μmol의 스테아릴아민을 사용하고, 콜레스테롤을 여러가지 농도로 사용하여 단층 거대 리포솜을 제조하였다. 스테아릴아민농도를 변화시킨 것과 동일한 방법으로 실시하여 효소봉입효율을 측정하였다. 이 결과를 표 2에 나타내었으며 이로부터 콜레스테롤은 10몰% 이상에서는 콜레스테롤함량과 봉입효율의 상관성을 나타냄을 알 수 있었다.

[표 2]

[실시예 3]

계면활성제에 의한 단층 거대 리포솜 제조

실시예 2와 같은 조성의 지질과 효소를 라우릴설페이트나 소디움데옥시콜레이트와 같은 계면활성제 수용액에 녹이고 반투막에 넣은 다음 pH 9.5 붕산완충액 2ℓ중에서 24시간동안 투석에 의해 계면활성제를 제거함으로서 직경 1000Å정도의 거대 리포솜을 얻었다.

[실시예 4]

글루타르알데허드에 의한 리포솜 표면에의 소혈청알부민의 결합

실시예 2나 실시예 3과 같은 방법으로 제조된 단층 거대 리포솜 1㎖에 각각 25% 글루타르알데히드 10,20,30μℓ씩을 가하고 20℃에서 10분간 반응시켰다. 반응후 남은 과량의 글루타르알데히드는 4℃ 붕산완충액 2ℓ중에서 24시간동안 투석하여 제거하였다.

여기에 소혈청알부민을 0.5 내지 4.0mg까지 표 3과 같은 조성이 되도록 가하고 4℃에서 24시간동안 반응시켜 리포솜표면에 결합시켰다. 대조로는 글루타르알데히드를 사용하지 않은 시료와 소혈청알부민을 사용하지 않은 시료를 사용하였다. 결합되지 않은 소혈청알부민은 원심분리기로 제거하였다. (30,000g,30분). 유리 단백질을 완전히 제거하기 위해 이 공정을 수회 반복하고 리포솜에 결합된 단백질은 실시예 4에서 실시한 로우리등의 방법에 의해 정량하였다. 이를 표 3에 나타내었다. 이 결과로부터 반응혼합물에 단백질농도를 약 2mg/㎖정도로 사용해야 충분한 단백결합도를 얻을 수 있으며 결합제인 글루타르알데히드 농도가 증가할 수록 단백결합도가 증가함을 알 수 있었다. 글루타르알데히드 50μℓ/㎖이상이고 BSA농도 약 4mg/mℓ이상이면 응집이 일어난다.

[표 3]

[실시예 5]

리포솜표면 환원에 의한 소혈청알부민의 결합

지질의 조성을 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 포스파티딜세린(몰비, 10:5:2)로 하여 실시예 2나 3과 같은 방식으로 단층 거대 리포솜을 제조하여 30mM보로움보로하이드라이드(NaBH₄)를 넣고 20℃에서 1시간 동안 반응시킨후 세파로우즈 4B컬럼크로마토그라피를 이용하여 미반응의 물질을 제거하였다. 다음 3mg의 소혈청알부민을 가하고 반응시켜 실시예 4와 마찬가지로 분리 정량하였다.

[실시예 6]

면역반응의 분석

실시예 2,3과 같은 방법으로 제조한 단층 거대 리포솜에 실시예 4,5와 같은 방법으로 소혈청알부민을 결합시킨 면역 리포솜 10μℓ를 0.15M 소디움클로라이드, 0.15mM 칼슘클로라이드, 0.5mM 마그네슘클로라이드가 함유된 50mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5) 500μl에 넣고 여러 가지 농도의 기니픽보체(guinea pig complement)와 소혈청알부민에 대한 토끼의 항혈청을 가하고 25℃에서 30분간 반응시켜 면역반응에 의한 리포솜의 용혈현상을 유발시켰다.

대조군으로서는 56℃에서 30분간 처리하여 활성을 없앤 보체와, 토끼의 정상혈청을 사용하였다.

다음에는 pH 9.5 붕산완충액중에 녹아있는 파라-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl pheiphate)(0.5mg/㎖) 3㎖를 가한뒤 25℃에서 5분간 반응시키고 2M 소디움하이드록사이드 3㎖를 이용해 정색반응을 종결시키고 파장 410mm에서 자외선 분광기로 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 제2도 및 제3도에 도시하였다.

제2도는 리포솜 용혈에 대한 항혈청의 효과를 나타내기 위해 항-BSA 토끼혈청과 정상 토끼혈청을 사용하여 실험한 결과이며, 제3도는 항- BSA토끼혈청에 보체를 가했을 때의 리조솜 용혈현상과, 가열불활성화 보체를 가했을 때의 리포솜 용혈현상을 나타낸 것이다.

Claims (8)

1. 리포솜내에 효소를 봉입한 후 브롬화시안(CNBr)으로 처리하여 리포솜표면에 노출된 효소를 불활성화한 후, 면역기능을 갖도록 그 표면에 항체 혹은 항원을 결합시킨 다음 냉동건조 시켜서 얻어진 면역리포솜.
2. 리포솜내에 효소를 봉입한후 브롬화시안(CNBr)으로 처리하여 리포솜표면에 노출된 효소를 불활성화한 후 면역기능을 갖도록 그 표면에 항체 혹은 항원을 결합시킨 다음 냉동건조시켜서 면역리포솜을 제조하는 방법.
3. 세포성 면역반응에 의해 특이하게 일어나는 세포용혈현상과 효소-기질의 특이적 반응을 이용하여, 혈맥, 헐청, 뇨, 타액 등과 같은 생리액이나 기타 미지시료중의 약물, 항원성물질, 알러지원 등을 신속, 간편하게 분석함에 있어서, 1) 리포솜내에 효소로서 알칼린 포스파타아제 또는 퍼옥시다아제를 봉입시킨 후 브롬화시안으로 처리하고, 항체 혹은 항원을 결합시켜 제조한 면역리포솜 ; 2) 기질인 파라-니트로페닐포스레이트 또는 과산화수소 수용액 ; 및 3) 기니픽보체를 각각 관리 포장하였다가, 분석시에 시료와 혼합하여 사용하는 진단용 시약키트.
4. 제2항에서 면역리포솜을 제조할 때, 스테아릴아민을 사용하여 봉입효율을 증가시키는 방법.
5. 제2항에서 면역리포솜을 제조할 때, 10몰% 이상의 콜레스테롤을 사용하여 리포솜의 봉입효율을 증가시키는 방법.
6. 제2항에서 면역리포솜 제조시, 스테아릴아민과 글루타르알데히드틀 이용하여 항체 흑은 항원을 결합시키는 방법.
7. 제2항에서 면역리포솜 제조시, 포스파티딜세린을 함유한 리포솜표면의 환원에 의해 항체 혹은 항원을 직접 결합시키는 방법.
8. 제7항에서 환원제로 보로하이드라이드를 사용하는 방법.

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