KR20250078982A

KR20250078982A - 글리신-포르메이트 생합성 경로를 통한 대사 선택

Info

Publication number: KR20250078982A
Application number: KR1020257013843A
Authority: KR
Inventors: 사무엘 피터스; 제임스 라벨레테; 데이비드 라자프스키; 제이슨 에이 구스틴; 트리싸 보르그슐테
Original assignee: 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2023-09-29
Publication date: 2025-06-04
Also published as: EP4594507A1; CN120283058A; WO2024073692A1

Abstract

본 개시내용은 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 2 (SHMT2) 발현의 감소 또는 제거를 포함하는 단리된 포유동물 세포를 제공한다. 이같은 세포를 제조하는 방법 및 재조합 단백질의 생산을 위해 이같은 세포를 사용하는 방법이 추가로 제공된다.

Description

글리신-포르메이트 생합성 경로를 통한 대사 선택

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2022년 9월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 63/377,874를 우선권 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

분야

본 개시내용은 생물학적 생산 시스템에서 사용하기 위한 포유동물 세포주에 관한 것이며, 여기서 포유동물 세포주는 글리신 영양요구성 세포주를 생성시키기 위해 글리신-포르메이트 생합성 경로의 구성요소의 발현이 감소 또는 제거되도록 조작된다.

바이오제작을 위한 고생산성 클론 세포주의 개발은 전형적으로 하나 이상의 널리 공지된 선택 방법, 예컨대 글루타민 신테타제 (글루타민 선택을 위한 GS), 디히드로폴레이트 수용체 (하이포크산틴 및 티미딘 선택을 위한 DHFR), 항생제 선택 (푸로마이신, 히그로마이신, 블라스티시딘 등), 또는 P5C 신테타제 (P5CS-프롤린 선택)를 활용한다. GS 시스템이 업계 표준이 되었지만, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 및 기타 다중쇄 효소/단백질 또는 발현을 위해 이펙터 단백질을 필요로 하는 단백질/효소와 같은 분자의 생산을 용이하게 하기 위해 하나를 초과하는 벡터가 세포주 내로 도입될 수 있도록 다중 선택 방법을 허용하는 세포주가 요구된다.

본 개시내용의 다양한 측면 중 하나는 생물학적 생산 시스템에서 사용하기 위한 포유동물 세포주를 제공하는 것이며, 여기서 포유동물 세포주는 내인성 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 2 (SHMT2) 유전자의 발현이 감소 또는 제거되도록 조작된다. 내인성으로 발현된 기능성 SHMT2 단백질의 부재 하에, 세포는 생존하고/거나 성장하기 위해 아미노산 글리신의 외인성 공급원 및/또는 단일 탄소 공급원, 예를 들어 포르메이트를 필요로 한다. 표적화 엔도뉴클레아제-매개 게놈 변형, 예를 들어, CRISPR 리보핵단백질 (RNP) 복합체 또는 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 염색체 SHMT2 서열이 불활성화될 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 측면에서, 내인성 SHMT2 유전자의 발현이 감소 또는 제거되고 내인성 글루타민 신테타제 (GS) 유전자의 발현이 감소 또는 제거되도록 조작된 포유동물 세포주가 제공된다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 발현된 생물치료 단백질의 생산성이 강화된 세포주를 선택하기 위한 프로세스를 포괄한다. 본 개시내용의 다른 측면에서, 다중 선택 시스템을 활용함으로써 더욱 편리하게 이펙터 단백질의 발현을 필요로 하는 이중특이적 항체 또는 생물치료 단백질의 발현을 위한 바이오생산 시스템이 제공된다. 이 프로세스는 임의의 포유동물 세포주에서 적어도 하나의 재조합 단백질을 발현하는 것을 포함한다.

본 개시내용의 다른 측면 및 변형 내용이 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.

도 1 세린 히드록실메틸트랜스퍼라제 2 (Shmt2)가 미토콘드리아에서 세린을 글리신으로 전환시킨다.
도 2 CHO에서의 Shmt2 cDNA 서열. gRNA 표적 부위는 밑줄 표시되고, NGG PAM은 볼드체이다.
도 3. A) Shmt2 KO 클론의 유전자형이 NGS로 확인되었다. 삽입 또는 결실 및 그의 각각의 빈도는 볼드체이다. B) CRISPR-Cas9 표적화에 의해 생성된 KO 대립유전자. 위쪽의 모든 염기 쌍 변형이 코딩 서열에서 조기 정지 코돈을 생산한다.
도 4 mAb 중쇄, 경쇄, 및 Shmt2 또는 GS 코딩 서열을 함유하는 2개의 유사한 벡터의 사용을 통해 글루타민-기반 선택 시스템을 사용한 GFP 양성 세포의 선택 및 글리신-포르메이트 기반 선택 시스템을 사용한 CFP 양성 세포의 선택, 뿐만 아니라 분비된 재조합 단백질의 개발을 허용하도록 벡터가 디자인되었다.
도 5 Shmt2 KO 클론 1B4, 5D5, 및 8F9는 글리신 없이 생존할 수 없는 한편, 모 세포주 GS-/- Shmt2+/+는 글리신의 존재 또는 부재 하에 생존한다.
도 6 GS+GFP 발현 카세트를 함유하는 플라스미드로 형질감염된 GS 및 Shmt2 유전자가 유전적으로 파괴된 CHO 세포가 글루타민 결핍 배지에서 선택되었고, GFP를 발현하지만, CFP는 발현하지 않는다 (좌측). Shmt2+CFP 발현 카세트를 함유하는 플라스미드로 형질감염된 GS 및 Shmt2 유전자가 유전적으로 파괴된 CHO 세포가 글리신 결핍 배지에서 선택되었고, CFP를 발현하지만, GFP는 발현하지 않는다 (중간). Shmt2+CFP 및 GS+GFP로 공동-형질감염된 GS 및 Shmt2 유전자가 유전적으로 파괴된 CHO 세포가 글리신 및 글루타민 둘 다가 결핍된 배지에서 선택되었고, GFP 및 CFP 둘 다를 높은 수준으로 발현한다 (우측).
도 7 ddPCR을 통한 GS-/- Shmt2+/+ 세포주에서의 내인성 Shmt2의 카피 수.
도 8 각각 GS, Shmt2, 또는 GS 및 Shmt2 (이중) 선택을 사용한, GFP, CFP, 또는 GFP 및 CFP를 발현하는 풀의 생육성 및 성장.
도 9 배지 내의 포름산나트륨 보충이 Shmt2 KO 클론의 성장률을 용량 의존적 방식으로 증가시킨다. 200 uM 포름산나트륨의 보충은 SHMT2^+/+ 세포와 유사한 성장률에 이른다.
도 10 Shmt2 KO 세포가 포름산나트륨의 존재 하에서도 글리신 없이 생존할 수 없다.
도 11 이중 발현 벌크 풀이 페드 뱃치 검정법에서 가장 높은 생육성 및 가장 높은 생육가능 세포 밀도를 나타내었다.
도 12 모든 벌크 풀이 mAb 생산을 나타내었고, 이중 발현 풀 (GS-SO57 + Shmt2-SO57)이 가장 높은 단백질 생산을 나타내었다 (좌측 패널). GS-SO57 및 Shmt2-SO57은 더 낮은 수준의 단백질 생산을 나타내었다 (우측 패널).

본 개시내용은 내인성 SHMT2 유전자의 발현이 감소 또는 제거되도록 조작된 포유동물 세포주를 제공한다. 내인성 GS 유전자의 발현이 감소 또는 제거되고 내인성 SHMT2 유전자의 발현이 감소 또는 제거되도록 조작된 포유동물 세포주가 추가로 제공된다. 상기 조작된 세포주의 생산 방법, 뿐만 아니라 상기 조작된 세포주를 선택하고 사용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.

(I) 조작된 세포주

본 개시내용의 한 측면은 내인성 SHMT2 유전자의 발현이 감소 또는 제거되도록 조작된 포유동물 세포주를 포괄한다. 대안적으로, 포유동물 세포주는 내인성 SHMT2 유전자 및 내인성 GS 유전자 둘 다의 발현이 감소 또는 제거되도록 조작된다.

SHMT2의 발현이 감소 또는 제거되었거나 SHMT2 및 GS의 발현이 감소된 본원에 개시된 세포주는 SHMT2 또는 GS 단백질을 코딩하는 염색체 서열을 변형하도록 유전자 조작된다. 표적화된 엔도뉴클레아제-매개 게놈 편집 기술을 사용하여 염색체 서열이 변형될 수 있고, 이는 하기의 섹션 (III)에서 상술된다. 예를 들어, 염색체 서열이 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 그의 조합을 포함하도록 변형될 수 있어, 판독틀이 이동되고 단백질 생성물이 생산되지 않거나 또는 비-기능성 단백질이 생산된다 (즉, 염색체 서열이 불활성화된다). SHMT2 또는 GS를 코딩하는 염색체 서열의 하나의 대립유전자의 불활성화는 단백질의 발현 감소 (즉, 녹-다운)를 초래한다. SHMT2 또는 GS를 코딩하는 염색체 서열의 둘 다의 대립유전자의 불활성화는 단백질이 발현되지 않는 것 (즉, 녹-아웃)을 초래한다.

일부 실시양태에서, SHMT2의 발현 수준이 적어도 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 약 99% 초과만큼 감소될 수 있다. 다른 실시양태에서, SHMT2의 발현 수준이 관련 분야에서 표준인 기술 (예를 들어, 웨스턴 이뮤노블롯팅 검정법, ELISA 효소 검정법, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 등)을 사용하여 검출가능하지 않은 수준으로 감소될 수 있다.

일반적으로, 본원에 개시된 조작된 세포주의 세포 생육성, 생육가능 세포 밀도, 역가, 성장률, 증식 반응, 세포 형태학, 아폽토시스 및 자가포식 수준, 및/또는 일반적인 세포 건강은 글리신, 포르메이트, 단일 탄소 공급원 및/또는 외인성 SHMT2 코딩 서열이 보충되었을 때 그의 비-조작된 모 세포의 것들과 유사하다.

(a) 세포 유형

본원에 개시된 조작된 세포주는 포유동물 세포주이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포주는 인간 세포주로부터 유래될 수 있다. 적절한 인간 세포주의 비제한적인 예는 인간 배아 신장 세포 (HEK293, HEK293T); 인간 결합 조직 세포 (HT-1080); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 인간 배아 망막 세포 (PER.C6); 인간 신장 세포 (HKB-11); 인간 간 세포 (Huh-7); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 인간 U2-OS 골육종 세포, 인간 A549 폐 세포, 인간 A-431 표피 세포, CACO-2 인간 결장직장 선암종 세포, 인간 만능성 줄기 세포, 저캇(Jurkat) 인간 T 림프구 세포, 또는 인간 K562 골수 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 세포주는 비-인간 세포주로부터 유래될 수 있다. 적절한 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포; 마우스 골수종 NS0 세포; 마우스 골수종 Sp2/0 세포; 마우스 유선 C127 세포; 마우스 배아 섬유모세포 3T3 세포 (NIH3T3); 마우스 B 림프종 A20 세포; 마우스 흑색종 B16 세포; 마우스 근모세포 C2C12 세포; 마우스 배아 중간엽 C3H-10T1/2 세포; 마우스 암종 CT26 세포, 마우스 전립선 DuCuP 세포; 마우스 유방 EMT6 세포; 마우스 간암종 Hepa1c1c7 세포; 마우스 골수종 J5582 세포; 마우스 상피 MTD-1A 세포; 마우스 심근 MyEnd 세포; 마우스 신장 RenCa 세포; 마우스 췌장 RIN-5F 세포; 마우스 흑색종 X64 세포; 마우스 림프종 YAC-1 세포; 래트 교모세포종 9L 세포; 래트 B 림프종 RBL 세포; 래트 신경모세포종 B35 세포; 래트 간암종 세포 (HTC); 버팔로 래트 간 BRL 3A 세포; 개 신장 세포 (MDCK); 개 유선 (CMT) 세포; 래트 골육종 D17 세포; 래트 단핵구/대식세포 DH82 세포; 원숭이 신장 SV-40 형질전환 섬유모세포 (COS7) 세포; 원숭이 신장 CVI-76 세포; 또는 아프리카 녹색 원숭이 신장 (VERO, VERO-76) 세포를 또한 포함한다. 포유동물 세포주의 광범위한 목록을 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection) 카탈로그 (ATCC, 버지니아주 머내서스)에서 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 세포주는 마우스 세포주 이외의 것이다. 특정 실시양태에서, 조작된 세포주는 CHO 세포주이다. 적절한 CHO 세포주는 CHO-K1, CHO-K1SV, CHO GS-/-, CHO S, DG44, DuxB11, 및 그의 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

다양한 실시양태에서, 모 세포주는 글루타민 신타제 (GS), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT), 아스파라긴 신테타제 (ASNS), 포스포세린 포스파타제 (PSPH) 또는 그의 조합이 결핍될 수 있다. 예를 들어, GS, DHFR, HPRT, ASNS 및/또는 PSPH를 코딩하는 염색체 서열이 불활성화될 수 있다. 구체적 실시양태에서, GS, DHFR, HPRT, ASNS 및/또는 PSPH를 코딩하는 염색체 서열 모두가 모 세포주에서 불활성화된다.

(b) 재조합 단백질을 코딩하는 임의적인 핵산

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조작된 세포주는 재조합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 재조합 단백질은 이종성이고, 이는 단백질이 세포에 대해 천연이지 않다는 것을 의미한다. 재조합 단백질은, 비제한적으로, 항체, 항체의 단편, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간화 모노클로날 항체, 키메라 항체, IgG 분자, IgG 중쇄, IgG 경쇄, IgA 분자, IgD 분자, IgE 분자, IgM 분자, 백신, 성장 인자, 시토카인, 인터페론, 인터루킨, 호르몬, 응고 인자, 혈액 구성요소, 효소, 치료 단백질, 건강기능 단백질, 상기 중 임의의 것의 기능성 단편 또는 기능성 변이체, 또는 상기 단백질 및/또는 그의 기능성 단편 또는 변이체 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질로부터 선택된 치료 단백질일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 재조합 단백질은 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체, 또는 발현을 위해 이펙터 단백질을 필요로 하는 단백질이다.

일부 실시양태에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산이 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 2 (SHMT2), 포스포세린 포스파타제 (PSPH), 아스파라긴 신테타제 (ASNS), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 및/또는 글루타민 신타제 (GS)를 코딩하는 서열에 연결될 수 있어, SHMT2, PSPH, ASNS, HPRT, DHFR, 및/또는 GS가 선택성 마커로 사용될 수 있다. 재조합 단백질을 코딩하는 핵산은 적어도 하나의 항생제 저항성 유전자를 코딩하는 서열 및/또는 마커 단백질 예컨대 형광 단백질을 코딩하는 서열에 연결될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산은 발현 구축물의 일부분일 수 있다. 발현 구축물 또는 벡터는 추가적인 발현 제어 서열 (예를 들어, 인핸서 서열, 코작(Kozak) 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선택성 마커 서열, 복제 기점 등을 포함할 수 있다. 추가적인 정보를 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003] 또는 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001]에서 확인할 수 있다.

일부 실시양태에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산은 염색체외적으로 위치할 수 있다. 즉, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산이 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체, 또는 또 다른 염색체외 구축물로부터 일시적으로 발현될 수 있다. 다른 실시양태에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산은 세포의 게놈 내로 염색체적으로 통합될 수 있다. 통합은 무작위일 수 있거나 또는 표적화될 수 있다. 따라서, 재조합 단백질이 안정적으로 발현될 수 있다. 이러한 실시양태의 일부 변형에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 적합한 이종성 발현 제어 서열 (즉, 프로모터)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 변형에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 내인성 발현 제어 서열의 제어 하에 놓일 수 있다. 상동 재조합, 표적화 엔도뉴클레아제-매개 게놈 편집, 바이러스 벡터, 트랜스포존, 재조합효소 매개 카세트 교환 시스템, 플라스미드, 및 기타 널리 공지된 수단을 사용하여 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 세포주의 게놈 내로 통합될 수 있다. 추가적인 지침을 상기 문헌 [Ausubel et al. 2003] 및 상기 문헌 [Sambrook & Russell, 2001]에서 확인할 수 있다.

(II) 키트

본 개시내용의 추가 측면은 재조합 단백질의 생산을 위한 키트를 제공하며, 여기서 키트는 상기의 섹션 (I)에서 상술된 조작된 세포주 중 임의의 것을 포함한다. 키트는 세포 성장 배지, 형질감염 시약, 플라스미드 벡터, 선택 배지, 재조합 단백질 정제 수단, 완충제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 키트는 세포주를 성장시키고 이를 사용하여 재조합 단백질을 생산하기 위한 설명서를 일반적으로 포함한다. 키트에 포함된 설명서는 포장재에 부착될 수 있거나 포장 삽입물로서 포함될 수 있다. 설명서는 전형적으로 기재되거나 인쇄된 물질이지만, 이에 제한되지는 않는다. 이같은 설명서를 저장할 수 있고 이를 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 개시내용에 의해 구상된다. 이같은 매체는 전자 저장 매체 (예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예를 들어, CD ROM) 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "설명서"는 설명서를 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.

(III) 조작된 세포주의 제조 방법

본 개시내용의 또 다른 측면은 상기의 섹션 (I)에서 기술된, SHMT2 및/또는 GS의 발현이 감소 또는 제거된 세포주를 제조하거나 조작하기 위한 방법을 제공한다. SHMT2 및/또는 GS를 코딩하는 염색체 서열이 다양한 기술을 사용하여 녹-다운 또는 녹-아웃될 수 있다. 일반적으로, 조작된 세포주는 표적화 엔도뉴클레아제-매개 게놈 변형 프로세스를 사용하여 제조된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 조작된 세포주가 부위-특이적 재조합 시스템, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 제조될 수도 있다는 것을 이해한다.

일반적으로, 조작된 세포주는 모 관심 세포주 내로 적어도 하나의 표적화 엔도뉴클레아제 또는 상기 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 도입하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되며, 여기서 표적화 엔도뉴클레아제는 SHMT2 및/또는 GS를 코딩하는 염색체 서열에 표적화된다. 표적화 엔도뉴클레아제는 특이적인 염색체 서열을 인식하여 이에 결합하고, 이중-가닥 파손을 도입한다. 일부 실시양태에서, 비-상동성 단부-연결 (NHEJ) 복구 프로세스에 의해 이중-가닥 파손이 복구된다. NHEJ는 오류 경향이 있기 때문에, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 및/또는 치환이 발생할 수 있고, 이에 의해 염색체 서열의 판독틀이 파괴되어 단백질 생성물이 생산되지 않거나, 또는, 예를 들어, 단백질의 효소적으로 활성인 부위의 파괴를 통해, 비-기능성 단백질이 생산된다. 다른 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 표적화된 염색체 서열의 일부분과의 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 공동-도입하는 것에 의해 상동 재조합 반응을 통해 염색체 서열을 변경시키는데 사용될 수도 있다. 이같은 상황에서, 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중-가닥 파손은 (예를 들어, 외인성 서열의 통합에 의해) 염색체 서열이 변화 또는 변경되는 것을 초래하는 방식으로 염색체 서열이 폴리뉴클레오티드로 교환되도록 상동성-지시 복구 프로세스에 의해 복구된다.

(a) 표적화 엔도뉴클레아제

다양한 표적화 엔도뉴클레아제가 SHMT2 및/또는 GS를 코딩하는 염색체 서열을 변형시키는데 사용될 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제는 천연-발생 단백질 또는 조작된 단백질일 수 있다. 적절한 표적화 엔도뉴클레아제는, 비제한적으로, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), CRISPR 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE) 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 키메라 뉴클레아제, 부위-특이적 엔도뉴클레아제 및 인공 표적화 DNA 이중 가닥 파손 유도제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

(i) 아연 핑거 뉴클레아제

구체적 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)일 수 있다. ZFN은 특이적인 표적화된 서열에 결합하고, 표적화된 절단 부위 내로 이중-가닥 파손을 도입한다. 전형적으로, ZFN은 DNA 결합 도메인 (즉, 아연 핑거) 및 절단 도메인 (즉, 뉴클레아제)을 포함하고, 이들 각각이 하기에서 기술된다.

DNA 결합 도메인 . DNA 결합 도메인 또는 아연 핑거은 임의의 선택된 핵산 서열을 인식하고 이에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141]; [Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340]; [Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660]; [Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637]; [Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; [Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860]; [Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708]; 및 [Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814]을 참조한다. 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 천연-발생 아연 핑거 단백질에 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 디자인 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 합리적 디자인은, 예를 들어, 이벌식, 삼벌식 및/또는 사벌식 뉴클레오티드 서열 및 개별적인 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 이벌식, 삼벌식 또는 사벌식 뉴클레오티드 서열은 특정한 삼벌식 또는 사벌식 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 회합된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261을 참조하고, 이들의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예로서, 미국 특허 6,453,242에 기술된 알고리즘이 미리 선택된 서열을 표적화하도록 아연 핑거 결합 도메인을 디자인하는데 사용될 수 있다. 대안적 방법, 예컨대 비-축퇴성 인식 코드 표를 사용하는 합리적 디자인 또한 특이적 서열을 표적화하도록 아연 핑거 결합 도메인을 디자인하는데 사용될 수 있다 (Sera et al. (2002) Biochemistry 41:7074-7081). DNA 서열 내의 잠재적인 표적 부위를 확인할 뿐만 아니라 아연 핑거 결합 도메인을 디자인하기 위한 공개적으로 이용가능한 웹-기반 도구가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, DNA 서열 내의 잠재적인 표적 부위를 확인하기 위한 도구를 zincfingertools.org에서 확인할 수 있다. zifit.partners.org/ZiFiT에서 아연 핑거 결합 도메인을 디자인하기 위한 도구를 확인할 수 있다. (문헌 [Mandell et al. (2006) Nuc. Acid Res. 34:W516-W523]; [Sander et al. (2007) Nuc. Acid Res. 35:W599-W605]을 또한 참조한다.)

아연 핑거 결합 도메인은 길이가 약 3개의 뉴클레오티드 내지 약 21개의 뉴클레오티드의 범위인 DNA 서열을 인식하고 이에 결합하도록 디자인될 수 있다. 한 실시양태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 길이가 약 9개 내지 약 18개의 뉴클레오티드의 범위인 DNA 서열을 인식하고 이에 결합하도록 디자인될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 아연 핑거 뉴클레아제의 아연 핑거 결합 도메인은 적어도 3개의 아연 핑거 인식 영역 또는 아연 핑거를 포함하며, 여기서 각각의 아연 핑거는 3개의 뉴클레오티드에 결합한다. 한 실시양태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 4개의 아연 핑거 인식 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 5개의 아연 핑거 인식 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 6개의 아연 핑거 인식 영역을 포함한다. 아연 핑거 결합 도메인은 임의의 적절한 표적 DNA 서열에 결합하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,607,882; 6,534,261 및 6,453,242를 참조하고, 이들의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

아연 핑거 인식 영역을 선택하는 예시적인 방법은 파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하고, 이는 미국 특허 번호 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 기술되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가적으로, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 강화가, 예를 들어, WO 02/077227에 기술되어 있으며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

아연 핑거 결합 도메인 및 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 디자인 및 구축 방법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,888,121에 상세하게 기술되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함된다. 아연 핑거 인식 영역 및/또는 다중-핑거 아연 핑거 단백질이 아미노산 5개 이상의 길이의 링커를 예를 들어 포함하는 적절한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 아미노산 6개 이상의 길이의 링커 서열의 비제한적인 예에 대해 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조하며, 이의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 기술된 아연 핑거 결합 도메인은 단백질의 개별적인 아연 핑거들 사이의 적절한 링커의 조합을 포함할 수 있다.

절단 도메인. 아연 핑거 뉴클레아제는 절단 도메인을 또한 포함한다. 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인 부분은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 엔도뉴클레아제의 비제한적인 예는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀향 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [New England Biolabs Catalog] 또는 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단할 수 있는 추가적인 효소가 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제). 문헌 [Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993]을 또한 참조한다. 이러한 효소들 (또는 그의 기능성 단편) 중 하나 이상이 절단 도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.

절단 도메인은 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는 상기 기술된 바와 같은 효소 또는 그의 일부분으로부터 유래될 수도 있다. 각각의 뉴클레아제가 활성 효소 이량체의 단량체를 포함하기 때문에, 절단을 위해 2개의 아연 핑거 뉴클레아제가 필요할 수 있다. 대안적으로, 단일 아연 핑거 뉴클레아제가 둘 다의 단량체를 포함하여 활성 효소 이량체를 생성할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "활성 효소 이량체"는 핵산 분자를 절단할 수 있는 효소 이량체이다. 2개의 절단 단량체가 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 단량체가 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있다.

2개의 절단 단량체가 활성 효소 이량체를 형성하는데 사용되는 경우, 2개의 아연 핑거에 대한 인식 부위는 바람직하게는 2개의 아연 핑거가 그들 각각의 인식 부위에 결합하는 것이 절단 단량체를, 예를 들어, 이량체화에 의해, 절단 단량체가 활성 효소 이량체를 형성하는 것을 허용하는 서로에 대한 공간적인 배향에 놓도록 배치된다. 결과적으로, 인식 부위의 인접한 가장자리들이 약 5개 내지 약 18개의 뉴클레오티드만큼 분리될 수 있다. 예를 들어, 인접한 가장자리들은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 뉴클레오티드만큼 분리될 수 있다. 그러나, 2개의 인식 부위 사이에 임의의 정수 개수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 개재될 수 있다는 것이 이해될 것이다 (예를 들어, 약 2개 내지 약 50개의 뉴클레오티드 쌍 또는 이를 초과하는 개수). 아연 핑거 뉴클레아제의 인식 부위의 인접한 가장자리들, 예를 들어, 본원에서 상세하게 기술된 것들은 6개의 뉴클레오티드만큼 분리될 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 인식 부위들 사이에 놓인다.

제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 다수의 종에 존재하고, (인식 부위에서) 서열-특이적으로 DNA에 결합할 수 있으며, 결합 부위에서 또는 결합 부위 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예를 들어, IIS형)는 인식 부위에서 떨어진 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, IIS형 효소 FokI은 하나의 가닥 상의 그의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오티드 및 다른 가닥 상의 그의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오티드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라, 문헌 [Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279]; [Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768]; [Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887]; [Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31978-31982]를 참조한다. 따라서, 아연 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 IIS형 제한 효소로부터의 절단 도메인 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함할 수 있고, 이들은 조작될 수 있거나 또는 조작되지 않을 수 있다. 예시적인 IIS형 제한 효소가, 예를 들어, 국제 공개 WO 07/014,275에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가적인 제한 효소 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하고, 이들 또한 본 개시내용에 의해 구상된다. 예를 들어, 문헌 [Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조한다.

절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 IIS형 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정한 효소는 이량체로서 활성이다 (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10, 570-10, 575). 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 아연 핑거 뉴클레아제에서 사용된 FokI 효소의 일부분이 절단 단량체로서 간주된다. 따라서, FokI 절단 도메인을 사용한 표적화된 이중-가닥 절단을 위해, 각각 FokI 절단 단량체를 포함하는 2개의 아연 핑거 뉴클레아제가 활성 효소 이량체를 재구성하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 절단 단량체를 함유하는 단일 폴리펩티드 분자 또한 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 절단 도메인은 동종이량체화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 단량체를 포함한다. 비제한적인 예로서, FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538의 아미노산 잔기가 모두 FokI 절단 절반-도메인의 이량체화에 영향을 미치기 위한 표적이다. 의무적인 이종이량체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 단량체는 제1 절단 단량체는 FokI의 아미노산 잔기 위치 490 및 538에 돌연변이를 포함하고 제2 절단 단량체는 아미노산 잔기 위치 486 및 499에 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.

따라서, 조작된 절단 단량체의 한 실시양태에서, 아미노산 위치 490의 돌연변이는 Glu (E)를 Lys (K)로 교체하고; 아미노산 잔기 538의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체하고; 아미노산 잔기 486의 돌연변이는 Gln (Q)을 Glu (E)로 교체하며; 위치 499의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체한다. 구체적으로, 하나의 절단 단량체에서 위치 490을 E에서 K로, 538을 I에서 K로 돌연변이시켜 "E490K:I538K"로 지정된 조작된 절단 단량체를 생산하고, 또 다른 절단 단량체에서 위치 486을 Q에서 E로, 499를 I에서 K로 돌연변이시켜 "Q486E:I499K"로 지정된 조작된 절단 단량체를 생산함으로써 조작된 절단 단량체가 제조될 수 있다. 상기 기술된 조작된 절단 단량체는 비정상적인 절단이 최소화되거나 폐지된 의무적인 이종이량체 돌연변이체이다. 적절한 방법을 사용하여, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 7,888,121에 기술된 바와 같은 야생형 절단 단량체 (FokI)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해, 조작된 절단 단량체가 제조될 수 있다.

추가적인 도메인. 일부 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 핵 국소화 서열 (NLS)을 추가로 포함한다. NLS는 염색체 내의 표적 서열에 이중 가닥 파손을 도입하기 위해 아연 핑거 뉴클레아제 단백질을 핵 내로 표적화하는 것을 용이하게 하는 아미노산 서열이다. 핵 국소화 신호는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105]을 참조한다). 핵 국소화 신호의 비제한적인 예는 PKKKRKV (서열식별번호: 1), PKKKRRV (서열식별번호: 2), KRPAATKKAGQAKKKK (서열식별번호: 3), YGRKKRRQRRR (서열식별번호: 4), RKKRRQRRR (서열식별번호: 5), PAAKRVKLD (서열식별번호: 6), RQRRNELKRSP (서열식별번호: 7), VSRKRPRP (서열식별번호: 8), PPKKARED (서열식별번호: 9), PQPKKKPL (서열식별번호: 10), SALIKKKKKMAP (서열식별번호: 11), PKQKKRK (서열식별번호: 12), RKLKKKIKKL (서열식별번호: 13), REKKKFLKRR (서열식별번호: 14), KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (서열식별번호: 15), RKCLQAGMNLEARKTKK (서열식별번호: 16), NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (서열식별번호: 17), 및 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (서열식별번호: 18)를 포함한다. NLS는 아연 핑거 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.

추가적인 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 세포-침투 도메인을 또한 포함할 수 있다. 적절한 세포-침투 도메인의 예는, 비제한적으로, GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (서열식별번호: 19), PLSSIFSRIGDPPKKKRKV (서열식별번호: 20), GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV (서열식별번호: 21), GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (서열식별번호: 22), KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (서열식별번호: 23), YARAAARQARA (서열식별번호: 24), THRLPRRRRRR (서열식별번호: 25), GGRRARRRRRR (서열식별번호: 26), RRQRRTSKLMKR (서열식별번호: 27), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열식별번호: 28), KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열식별번호: 29), 및 RQIKIWFQNRRMKWKK (서열식별번호: 30)를 포함한다. 세포-침투 도메인은 아연 핑거 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 마커 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 마커 도메인의 비제한적인 예는 형광 단백질, 정제 태그, 및 에피토프 태그를 포함한다. 한 실시양태에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적절한 형광 단백질의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질 (예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, 단량체성 Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (예를 들어 YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (예를 들어 EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 청록색 형광 단백질 (예를 들어 ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 주황색 형광 단백질 (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, 단량체성 Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적절한 형광 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 적절한 태그는 폴리(His) 태그, FLAG (또는 DDK) 태그, 할로(Halo) 태그, AcV5 태그, AU1 태그, AU5 태그, 비오틴 카르복실 담체 단백질 (BCCP), 칼모듈린 결합 단백질 (CBP), 키틴 결합 도메인 (CBD), E 태그, E2 태그, ECS 태그, eXact 태그, Glu-Glu 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), HA 태그, HSV 태그, KT3 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP), MAP 태그, Myc 태그, NE 태그, NusA 태그, PDZ 태그, S 태그, S1 태그, SBP 태그, 소프태그(Softag) 1 태그, 소프태그 3 태그, 스팟(Spot) 태그, 스트렙(Strep) 태그, SUMO 태그, T7 태그, 탠덤 친화성 정제 (TAP) 태그, 티오레독신 (TRX), V5 태그, VSV-G 태그, 및 Xa 태그를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 마커 도메인은 아연 핑거 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.

적어도 하나의 핵 국소화 신호, 적어도 하나의 세포-침투 도메인, 및/또는 적어도 하나의 마커 도메인은 하나 이상의 화학 결합 (예를 들어, 공유 결합)을 통해 아연 핑거 뉴클레아제에 직접적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 핵 국소화 신호, 적어도 하나의 세포-침투 도메인, 및/또는 적어도 하나의 마커 도메인은 하나 이상의 링커를 통해 아연 핑거 뉴클레아제에 간접적으로 연결될 수 있다. 적절한 링커는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드, 핵산, 유기 링커 분자 (예를 들어, 말레이미드 유도체, N-에톡시벤질이미다졸, 비페닐-3,4',5-트리카르복실산, p-아미노벤질옥시카르보닐 등), 디술피드 링커, 및 중합체 링커 (예를 들어, PEG)를 포함한다. 링커는 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아랄킬, 아랄케닐, 아랄키닐 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 스페이싱 기를 포함할 수 있다. 링커는 중성일 수 있거나, 또는 양전하 또는 음전하를 보유할 수 있다. 추가적으로, 링커를 또 다른 화학 기에 연결하는 링커의 공유 결합이 pH, 온도, 염 농도, 빛, 촉매 또는 효소를 포함하는 특정 조건 하에 파손되거나 절단될 수 있도록 링커가 절단성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커일 수 있다. 펩티드 링커는 가요성 아미노산 링커 또는 강직성 아미노산 링커일 수 있다. 적절한 링커의 추가적인 예가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 링커를 디자인하는 프로그램이 쉽게 이용가능하다 (Crasto et al., Protein Eng., 2000, 13(5):309-312).

(ii) CRISPR 리보핵단백질 (RNP)

다른 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복물(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat) (CRISPR) 뉴클레아제일 수 있다. CRISPR 뉴클레아제는 박테리아 또는 고세균 CRISPR/CRISPR-연관 (Cas) 시스템으로부터 유래된 RNA-가이드 뉴클레아제이다. CRISPR RNP 시스템은 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함한다.

뉴클레아제. CRISPR 뉴클레아제는 I형 (즉, IA, IB, IC, ID, IE, 또는 IF), II형 (즉, IIA, IIB, 또는 IIC), III형 (즉, IIIA 또는 IIIB), V형, 또는 VI형 CRISPR 시스템으로부터 유래될 수 있고, 이들은 다양한 박테리아 및 고세균에 존재한다. 예를 들어, CRISPR 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종 (예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 에스. 써모필루스(S. thermophilus), 에스. 파스테우리아누스(S. pasteurianus)), 캄필로박테르(Campylobacter) 종 (예를 들어, 캄필로박테르 제주니(Campylobacter jejuni)), 프란시셀라(Francisella) 종 (예를 들어, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida)), 아카리오클로리스(Acaryochloris) 종, 아세토할로비움(Acetohalobium) 종, 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus) 종, 아시디티오바실루스(Acidithiobacillus) 종, 알리시클로바실루스(Alicyclobacillus) 종, 알로크로마티움(Allochromatium) 종, 암모니펙스(Ammonifex) 종, 아나바에나(Anabaena) 종, 아르트로스피라(Arthrospira) 종, 바실루스(Bacillus) 종, 부르크홀데리알레스(Burkholderiales) 종, 칼디셀룰로시럽토르(Caldicelulosiruptor) 종, 칸디다투스(Candidatus) 종, 클로스트리디움(Clostridium) 종, 크로코스파에라(Crocosphaera) 종, 시아노테세(Cyanothece) 종, 엑시구오박테리움(Exiguobacterium) 종, 피네골디아(Finegoldia) 종, 크테도노박테르(Ktedonobacter) 종, 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 종, 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 린그비아(Lyngbya) 종, 마리노박테르(Marinobacter) 종, 메타노할로비움(Methanohalobium) 종, 마이크로실라(Microscilla) 종, 마이크로콜레우스(Microcoleus) 종, 마이크로시스티스(Microcystis) 종, 나트라나에로비우스(Natranaerobius) 종, 나이세리아(Neisseria) 종, 니트로소코쿠스(Nitrosococcus) 종, 노카르디옵시스(Nocardiopsis) 종, 노둘라리아(Nodularia) 종, 노스톡(Nostoc) 종, 오실라토리아(Oscillatoria) 종, 폴라로모나스(Polaromonas) 종, 펠로토마쿨룸(Pelotomaculum) 종, 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas) 종, 페트로토가(Petrotoga) 종, 프레보텔라(Prevotella) 종, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종, 스트렙토미세스(Streptomyces) 종, 스트렙토스포랑기움(Streptosporangium) 종, 시네코코쿠스(Synechococcus) 종, 테르모시포(Thermosipho) 종, 또는 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia) 종으로부터의 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, CRISPR 뉴클레아제는 고세균 CRISPR 시스템, CRISPR/CasX 시스템, 또는 CRISPR/CasY 시스템으로부터 유래될 수 있다 (Burstein et al., Nature, 2017, 542(7640):237-241).

일부 실시양태에서, CRISPR 뉴클레아제는 II형 CRISPR 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, II형 CRISPR 뉴클레아제는 Cas9 단백질일 수 있다. 적절한 Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 (SpCas9), 프란시셀라 노비시다 Cas9 (FnCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (SaCas9), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(Streptococcus thermophilus) Cas9 (StCas9), 스트렙토코쿠스 파스테우리아누스(Streptococcus pasteurianus) (SpaCas9), 캄필로박테르 제주니 Cas9 (CjCas9), 나이세리아 메닌기티스(Neisseria meningitis) Cas9 (NmCas9), 또는 나이세리아 시네레아(Neisseria cinerea) Cas9 (NcCas9)를 포함한다. 다른 실시양태에서, CRISPR 뉴클레아제는 V형 CRISPR 뉴클레아제, 예컨대 Cpf1 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 적절한 Cpf1 뉴클레아제는 프란시셀라 노비시다 Cpf1 (FnCpf1), 아시다미노코쿠스 종 Cpf1 (AsCpf1), 또는 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006 Cpf1 (LbCpf1)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CRISPR 뉴클레아제는 VI형 CRISPR 뉴클레아제, 예를 들어, 렙토트리키아 와데이(Leptotrichia wadei) Cas13a (LwaCas13a) 또는 렙토트리키아 샤히이(Leptotrichia shahii) Cas13a (LshCas13a)로부터 유래될 수 있다.

CRISPR 뉴클레아제는 야생형 CRISPR 뉴클레아제, 변형된 CRISPR 뉴클레아제, 또는 야생형 또는 변형된 CRISPR 뉴클레아제의 단편일 수 있다. CRISPR 뉴클레아제는 핵산 결합 친화력 및/또는 특이성을 증가시키고/거나, 효소 활성을 변경시키고/거나, 단백질의 또 다른 성질을 변화시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 뉴클레아제의 뉴클레아제 (즉, DNase, RNase) 도메인이 변형, 결실 또는 불활성화될 수 있다. 뉴클레아제의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하도록 CRISPR 뉴클레아제가 말단절단될 수 있다.

CRISPR 뉴클레아제는 2개의 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 가이드 RNA 상보성 가닥을 절단하는 HNH 도메인, 및 비-상보성 가닥을 절단하는 RuvC 도메인을 포함하고; Cpf1 뉴클레아제는 RuvC 도메인 및 NUC 도메인을 포함하며; Cas13a 뉴클레아제는 2개의 HNEPN 도메인을 포함한다. 뉴클레아제 도메인 둘 다가 기능성일 때, CRISPR 뉴클레아제가 이중-가닥 파손을 도입한다. 하나 이상의 돌연변이 및/또는 결실에 의해 뉴클레아제 도메인 중 하나가 불활성화될 수 있고, 이에 의해 이중-가닥 서열의 한 가닥에서 단일-가닥 파손을 도입하는 변이체가 생성된다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제의 RuvC 도메인에서의 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, D10A, D8A, E762A, 및/또는 D986A)로 가이드 RNA 상보성 가닥을 니킹하는 HNH 니카제가 초래되고; Cas9 뉴클레아제의 HNH 도메인에서의 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, H840A, H559A, N854A, N856A, 및/또는 N863A)로 가이드 RNA 비-상보성 가닥을 니킹하는 RuvC 니카제가 초래된다. 비슷한 돌연변이가 Cpf1 및 Cas13a 뉴클레아제를 니카제로 전환시킬 수 있다. (한 쌍의 오프셋 가이드 RNA를 통해) 염색체 서열의 반대편 가닥들에 표적화된 2개의 CRISPR 니카제를 조합하여 사용하여, 염색체 서열에서 이중-가닥 파손을 생성시킬 수 있다. 이중 CRISPR 니카제 RNP는 표적 특이성을 증가시키고 표적을 벗어나는 효과를 감소시킬 수 있다.

추가적인 도메인. CRISPR 뉴클레아제는 적어도 하나의 핵 국소화 서열 (NLS)을 추가로 포함할 수 있다. NLS는 염색체 내의 표적 서열에 이중 가닥 파손을 도입하기 위해 아연 핑거 뉴클레아제 단백질을 핵 내로 표적화하는 것을 용이하게 하는 아미노산 서열이다. 핵 국소화 신호는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105]을 참조한다). 핵 국소화 신호의 비제한적인 예는 PKKKRKV (서열식별번호: 1), PKKKRRV (서열식별번호: 2), KRPAATKKAGQAKKKK (서열식별번호: 3), YGRKKRRQRRR (서열식별번호: 4), RKKRRQRRR (서열식별번호: 5), PAAKRVKLD (서열식별번호: 6), RQRRNELKRSP (서열식별번호: 7), VSRKRPRP (서열식별번호: 8), PPKKARED (서열식별번호: 9), PQPKKKPL (서열식별번호: 10), SALIKKKKKMAP (서열식별번호: 11), PKQKKRK (서열식별번호: 12), RKLKKKIKKL (서열식별번호: 13), REKKKFLKRR (서열식별번호: 14), KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (서열식별번호: 15), RKCLQAGMNLEARKTKK (서열식별번호: 16), NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (서열식별번호: 17), 및 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (서열식별번호: 18)를 포함한다. NLS는 CRISPR 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.

추가적인 실시양태에서, CRISPR 뉴클레아제는 적어도 하나의 세포-침투 도메인을 또한 포함할 수 있다. 적절한 세포-침투 도메인의 예는, 비제한적으로, GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (서열식별번호: 19), PLSSIFSRIGDPPKKKRKV (서열식별번호: 20), GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV (서열식별번호: 21), GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (서열식별번호: 22), KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (서열식별번호: 23), YARAAARQARA (서열식별번호: 24), THRLPRRRRRR (서열식별번호: 25), GGRRARRRRRR (서열식별번호: 26), RRQRRTSKLMKR (서열식별번호: 27), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열식별번호: 28), KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열식별번호: 29), 및 RQIKIWFQNRRMKWKK (서열식별번호: 30)를 포함한다. 세포-침투 도메인은 CRISPR 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, CRISPR 뉴클레아제는 적어도 하나의 마커 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 마커 도메인의 비제한적인 예는 형광 단백질, 정제 태그, 및 에피토프 태그를 포함한다. 한 실시양태에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적절한 형광 단백질의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질 (예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, 단량체성 Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (예를 들어 YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (예를 들어EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 청록색 형광 단백질 (예를 들어 ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 주황색 형광 단백질 (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, 단량체성 Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적절한 형광 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 적절한 태그는 폴리(His) 태그, FLAG (또는 DDK) 태그, 할로 태그, AcV5 태그, AU1 태그, AU5 태그, 비오틴 카르복실 담체 단백질 (BCCP), 칼모듈린 결합 단백질 (CBP), 키틴 결합 도메인 (CBD), E 태그, E2 태그, ECS 태그, eXact 태그, Glu-Glu 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), HA 태그, HSV 태그, KT3 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP), MAP 태그, Myc 태그, NE 태그, NusA 태그, PDZ 태그, S 태그, S1 태그, SBP 태그, 소프태그 1 태그, 소프태그 3 태그, 스팟 태그, 스트렙 태그, SUMO 태그, T7 태그, 탠덤 친화성 정제 (TAP) 태그, 티오레독신 (TRX), V5 태그, VSV-G 태그, 및 Xa 태그를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 마커 도메인은 CRISPR 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.

적어도 하나의 핵 국소화 신호, 적어도 하나의 세포-침투 도메인, 및/또는 적어도 하나의 마커 도메인은 하나 이상의 화학 결합 (예를 들어, 공유 결합)을 통해 CRISPR 뉴클레아제에 직접적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 핵 국소화 신호, 적어도 하나의 세포-침투 도메인, 및/또는 적어도 하나의 마커 도메인은 하나 이상의 링커를 통해 CRISPR 뉴클레아제에 간접적으로 연결될 수 있다. 적절한 링커는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드, 핵산, 유기 링커 분자 (예를 들어, 말레이미드 유도체, N-에톡시벤질이미다졸, 비페닐-3,4',5-트리카르복실산, p-아미노벤질옥시카르보닐 등), 디술피드 링커, 및 중합체 링커 (예를 들어, PEG)를 포함한다. 링커는 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아랄킬, 아랄케닐, 아랄키닐 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 스페이싱 기를 포함할 수 있다. 링커는 중성일 수 있거나, 또는 양전하 또는 음전하를 보유할 수 있다. 추가적으로, 링커를 또 다른 화학 기에 연결하는 링커의 공유 결합이 pH, 온도, 염 농도, 빛, 촉매 또는 효소를 포함하는 특정 조건 하에 파손되거나 절단될 수 있도록 링커가 절단성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커일 수 있다. 펩티드 링커는 가요성 아미노산 링커 또는 강직성 아미노산 링커일 수 있다. 적절한 링커의 추가적인 예가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 링커를 디자인하는 프로그램이 관련 기술분야에서 쉽게 이용가능하다.

가이드 RNA . 가이드 RNA에 의해 CRISPR 뉴클레아제가 그의 표적 부위로 가이드된다. 가이드 RNA는 표적 부위와 혼성화되고, CRISPR 뉴클레아제와 상호작용하여 CRISPR 뉴클레아제를 염색체 서열 내의 표적 부위로 지시한다. 표적 부위는 서열이 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM: protospacer adjacent motif)에 의해 경계지어지는 것을 제외하고는 서열 제한이 없다. 상이한 박테리아 종으로부터의 CRISPR 단백질이 상이한 PAM 서열을 인식한다. 예를 들어, PAM 서열은 5'-NGG (SpCas9, FnCAs9), 5'-NGRRT (SaCas9), 5'-NNAGAAW (StCas9), 5'-NNNNGATT (NmCas9), 5-NNNNRYAC (CjCas9), 및 5'-TTTV (Cpf1)를 포함하며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드로 정의되고, R은 G 또는 A로 정의되고, W는 A 또는 T로 정의되고, Y는 C 또는 T로 정의되며, V는 A, C, 또는 G로 정의된다. Cas9 PAM은 표적 부위의 3'에 위치하고, cpf1 PAM은 표적 부위의 5'에 위치한다.

가이드 RNA는 3개의 영역을 포함한다: 표적 부위에서의 서열에 상보적인 5' 단부의 제1 영역, 줄기 루프 구조를 형성하는 제2의 내부 영역, 및 본질적으로 단일-가닥으로 유지되는 제3의 3' 영역. 각각의 가이드 RNA가 CRISPR 뉴클레아제를 특이적인 표적 부위로 가이드하도록 각각의 가이드 RNA의 제1 영역은 상이하다. 각각의 가이드 RNA의 제2 및 제3 영역 (스캐폴드 영역으로도 칭해짐)은 모든 가이드 RNA에서 동일할 수 있다.

가이드 RNA의 제1 영역이 표적 부위에서의 서열과 염기 쌍을 이룰 수 있도록 가이드 RNA의 제1 영역은 표적 부위에서의 서열 (즉, 프로토스페이서 서열)에 상보적이다. 가이드 RNA의 제1 영역 (즉, crRNA)과 표적 서열 사이의 상보성은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과일 수 있다. 일반적으로,가이드 RNA의 제1 영역의 서열과 표적 부위에서의 서열 사이에는 미스매치가 없다 (즉, 상보성이 완전하다). 다양한 실시양태에서, 가이드 RNA의 제1 영역은 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 25개 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 제1 영역과 염색체 서열 내의 표적 부위 사이에서 염기 쌍을 이룬 영역은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25개, 또는 25개 초과의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 예시적 실시양태에서, 가이드 RNA의 제1 영역은 약 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오티드의 길이이다.

가이드 RNA는 2차 구조를 형성하는 제2 영역을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 구조는 줄기 (또는 헤어핀) 및 루프를 포함한다. 루프 및 줄기의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 루프는 길이가 약 3개 내지 약 10개의 뉴클레오티드의 범위일 수 있고, 줄기는 길이가 약 6개 내지 약 20개의 염기쌍의 범위일 수 있다. 줄기는 하나 이상의 뉴클레오티드 1 내지 약 10개의 돌출부를 포함할 수 있다. 따라서, 제2 영역의 전체 길이는 약 16개 내지 약 60개의 뉴클레오티드의 길이의 범위일 수 있다. 예시적 실시양태에서, 루프는 약 4개의 뉴클레오티드의 길이이고, 줄기는 약 12개의 염기쌍을 포함한다.

가이드 RNA는 본질적으로 단일-가닥으로 유지되는 3' 단부의 제3 영역을 또한 포함한다. 따라서, 제3 영역은 관심 세포 내의 어떠한 염색체 서열에 대해서도 상보성을 갖지 않고, 가이드 RNA의 나머지에 대해서 상보성을 갖지 않는다. 제3 영역의 길이는 다양할 수 있다. 일반적으로, 제3 영역은 약 4개를 초과하는 뉴클레오티드의 길이이다. 예를 들어, 제3 영역의 길이는 약 5개 내지 약 60개의 뉴클레오티드의 길이의 범위일 수 있다.

가이드 RNA의 제2 및 제3 영역 (또는 스캐폴드)의 통합 길이는 약 30개 내지 약 120개의 뉴클레오티드의 길이의 범위일 수 있다. 한 측면에서, 가이드 RNA의 제2 및 제3 영역의 통합 길이는 약 70개 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 길이의 범위이다.

일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 3개 영역 모두를 포함하는 하나의 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 가이드 RNA는 2개의 별개의 분자를 포함할 수 있다. 제1 RNA 분자는 가이드 RNA의 제1 (5') 영역 및 가이드 RNA의 제2 영역의 "줄기"의 절반을 포함할 수 있다. 제2 RNA 분자는 가이드 RNA의 제2 영역의 "줄기"의 다른 절반 및 가이드 RNA의 제3 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태에서, 제1 및 제2 RNA 분자는 서로 상보적인 뉴클레오티드의 서열을 각각 함유한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 제1 및 제2 RNA 분자는 다른 서열과 염기쌍을 이루어 기능성 가이드 RNA를 형성하는 서열 (약 6개 내지 약 20개의 뉴클레오티드)을 각각 포함한다.

(iii) 기타 표적화 엔도뉴클레아제

추가 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제일 수 있다. 메가뉴클레아제는 긴 인식 서열을 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제이고, 즉, 인식 서열이 일반적으로 약 12개의 염기쌍 내지 약 40개의 염기쌍의 범위이다. 이러한 요건의 결과로서, 인식 서열은 일반적으로 임의의 소정의 게놈에서 1회만 발생한다. 메가뉴클레아제 중에서, LAGLIDADG로 명명된 귀향 엔도뉴클레아제의 패밀리가 게놈 및 게놈 조작의 연구를 위한 귀중한 도구가 되었다 (예를 들어, 문헌 [Arnould et al., 2011, Protein Eng Des Sel, 24(1-2):27-31]을 참조한다). 다른 적절한 메가뉴클레아제는 I-CreI 및 I-Dmol을 포함한다. 메가뉴클레아제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 그의 인식 서열을 변형시킴으로서 특이적인 염색체 서열에 대해 표적화될 수 있다.

추가적인 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE) 뉴클레아제일 수 있다. TALE는 새로운 DNA 표적에 결합하도록 쉽게 조작될 수 있는 식물 병원체 크산토모나스(Xanthomonas)로부터의 전사 인자이다. TALE 또는 그의 말단절단 버전이 엔도뉴클레아제 예컨대 FokI의 촉매 도메인에 연결되어 TALE 뉴클레아제 또는 TALEN으로 칭해지는 표적화 엔도뉴클레아제가 생성될 수 있다 (문헌 [Sanjana et al., 2012, Nat Protoc, 7(1):171-192] 및 [Arnould et al., 2011, Protein Engineering, Design & Selection 24(1-2):27-31]).

대안적 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 키메라 뉴클레아제일 수 있다. 키메라 뉴클레아제의 비제한적인 예는 ZF-메가뉴클레아제, TAL-메가뉴클레아제, Cas9-FokI 융합물, ZF-Cas9 융합물, TAL-Cas9 융합물 등을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이같은 키메라 뉴클레아제 융합물을 생성시키기 위한 수단에 익숙하다.

또 다른 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 부위-특이적 엔도뉴클레아제일 수 있다. 특히, 부위-특이적 엔도뉴클레아제는 그의 인식 서열이 게놈에서 희귀하게 발생하는 "희귀-절단제" 엔도뉴클레아제일 수 있다. 대안적으로, 부위-특이적 엔도뉴클레아제는 관심 부위를 절단하도록 조작될 수 있다 (Friedhoff et al., 2007, Methods Mol Biol 352:1110123). 일반적으로, 부위-특이적 엔도뉴클레아제의 인식 서열은 게놈에서 1회만 발생한다. 대안적인 추가 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 인공 표적화 DNA 이중 가닥 파손 유도제일 수 있다.

(b) 세포로의 표적화 엔도뉴클레아제 전달

방법은 표적화 엔도뉴클레아제를 관심 대상인 모 세포주 내로 도입하는 것을 포함한다. 표적화 엔도뉴클레아제는 정제된 단리된 단백질로서 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산으로서 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 코딩 핵산이 mRNA인 실시양태에서, mRNA는 5' 캡핑되고/거나 3' 폴리아데닐화될 수 있다. 코딩 핵산이 DNA인 실시양태에서, DNA는 선형 또는 원형일 수 있다. 핵산은 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 일부분일 수 있으며, 여기서 코딩 DNA는 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적합한 벡터, 프로모터, 기타 제어 요소, 및 벡터를 관심 세포 내로 도입하는 수단에 익숙하다. 표적화 엔도뉴클레아제가 CRISPR 뉴클레아제인 실시양태에서, CRISPR 뉴클레아제 시스템은 gRNA-단백질 복합체로서 세포 내로 도입될 수 있다.

다양한 수단에 의해 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들)가 세포 내로 도입될 수 있다. 적절한 전달 수단은 미세주입, 전기천공, 초음파천공, 생물포격, 인산칼슘-매개 형질감염, 양이온성 형질감염, 리포솜 형질감염, 덴드리머 형질감염, 열 충격 형질감염, 뉴클레오펙션 형질감염, 마그네토펙션, 리포펙션, 임페일펙션, 광학적 형질감염, 핵산의 독점 작용제-강화 흡수, 및 리포솜, 면역리포솜, 비로솜 또는 인공 비리온을 통한 전달을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들)는 뉴클레오펙션을 통해 세포 내로 도입된다.

임의적인 도너 폴리뉴클레오티드. 표적화된 게놈 변형 또는 조작을 위한 방법은 표적 염색체 서열에 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 변화가 있는 서열을 포함하는 적어도 하나의 도너 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중-가닥 파손이 상동성-지시 복구 프로세스에 의해 복구될 수 있고, 도너 폴리뉴클레오티드의 서열이 염색체 서열 내로 삽입되거나 염색체 서열과 교환됨으로써 염색체 서열을 변형시킬 수 있도록, 도너 폴리뉴클레오티드는 염색체 서열 내의 표적화된 부위에 있거나 그 근처에 있는 서열에 대한 실질적인 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 도너 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 한 측면 상의 서열에 대한 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1 서열, 및 표적 부위의 다른 측면 상의 서열에 대한 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2 서열을 포함할 수 있다. 도너 폴리뉴클레오티드는 표적화된 염색체 서열 내로의 통합을 위한 도너 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 도너 서열은 외인성 서열의 통합이 판독틀을 파괴하고 표적화된 염색체 서열을 불활성화시키도록 외인성 서열 (예를 들어, 마커 서열)일 수 있다.

염색체 서열 내의 표적 부위에 있거나 그 근처에 있는 서열에 대한 실질적인 서열 동일성을 갖는 도너 폴리뉴클레오티드 내의 제1 및 제2 서열의 길이는 다양할 수 있고, 다양할 것이다. 일반적으로, 도너 폴리뉴클레오티드 내의 제1 및 제2 서열 각각은 적어도 약 10개의 뉴클레오티드의 길이이다. 다양한 실시양태에서, 염색체 서열과의 실질적인 서열 동일성이 있는 도너 폴리뉴클레오티드 서열은 약 15개의 뉴클레오티드, 약 20개의 뉴클레오티드, 약 25개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드, 약 40개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 100개를 초과하는 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.

"실질적 서열 동일성"이라는 구절은 폴리뉴클레오티드 내의 서열이 관심 염색체 서열과 적어도 약 75%의 서열 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 내의 서열은 관심 염색체 서열과 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.

도너 폴리뉴클레오티드의 길이는 다양할 수 있고, 다양할 것이다. 예를 들어, 도너 폴리뉴클레오티드는 약 20개의 뉴클레오티드의 길이 내지 약 200,000개의 뉴클레오티드의 길이의 범위일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 약 20개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 길이, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 1000개의 뉴클레오티드의 길이, 약 1000개의 뉴클레오티드 내지 약 10,000개의 뉴클레오티드의 길이, 약 10,000개의 뉴클레오티드 내지 약 100,000개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 약 100,000개의 뉴클레오티드 내지 약 200,000개의 뉴클레오티드의 길이의 범위일 수 있다.

전형적으로, 도너 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. DNA는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. DNA는 선형 또는 원형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 약 200개 미만의 뉴클레오티드를 포함하는 단일-가닥의 선형 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시양태에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부분일 수 있다. 적절한 벡터는 DNA 플라스미드, 바이러스 벡터, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 및 효모 인공 염색체 (YAC)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 전달 비히클 예컨대 리포솜 또는 폴록사머와 복합체를 이룬 핵산 또는 PCR 단편일 수 있다.

도너 폴리뉴클레오티드(들)는 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들)와 동시에 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 도너 폴리뉴클레오티드(들) 및 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들)는 순차적으로 세포 내로 도입될 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 대 도너 폴리뉴클레오티드(들)의 비는 다양할 수 있고, 다양할 것이다. 일반적으로, 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 대 도너 폴리뉴클레오티드(들)의 비는 약 1:10 내지 약 10:1의 범위이다. 다양한 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 대 폴리뉴클레오티드(들)의 비는 약 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1일 수 있다. 한 실시양태에서, 비는 약 1:1이다.

(c) 세포 배양

방법은 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중-가닥 파손이 (i) 염색체 서열이 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되도록 하는 비-상동성 단부-연결 복구 프로세스, 또는, 임의적으로, (ii) 염색체 서열이 폴리뉴클레오티드의 서열로 교환되어 염색체 서열이 변형되도록 하는 상동성-지시 복구 프로세스에 의해 복구될 수 있도록 세포를 적합한 조건 하에 유지시키는 것을 추가로 포함한다. 표적화 엔도뉴클레아제(들)를 코딩하는 핵산(들)이 세포 내로 도입되는 실시양태에서, 방법은 세포가 표적화 엔도뉴클레아제(들)를 발현하도록 세포를 적합한 조건 하에 유지시키는 것을 포함한다.

일반적으로, 세포는 세포 성장 및/또는 유지에 적합한 조건 하에 유지된다. 적절한 세포 배양 조건이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Santiago et al. (2008) PNAS 105:5809-5814]; [Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055-3060]; [Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651]; 및 [Lombardo et al (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306]에 기술되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포 배양 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 세포 유형에 따라 다양할 수 있고 다양할 것임을 인지한다. 특정 세포 유형에 대한 최상의 기술을 결정하기 위해, 모든 경우에, 일상적인 최적화가 사용될 수 있다.

프로세스의 이러한 단계 동안, 표적화 엔도뉴클레아제(들)는 염색체 서열 내의 표적화된 절단 부위(들)를 인식하고, 결합하고, 이중-가닥 파손(들)을 생성시키며, 이중-가닥 파손(들)의 복구 동안, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및/또는 치환이 표적화된 염색체 서열 내로 도입된다. 구체적 실시양태에서, 표적화된 염색체 서열이 불활성화된다.

관심 염색체 서열이 변형되었음이 확인되면, 단일 세포 클론을 단리하여 유전자형을 결정할 수 있다 (DNA 시퀀싱 및/또는 단백질 분석을 통해). 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 세포에 1회 이상의 추가적인 라운드의 표적화된 게놈 변형이 진행되어 추가적인 염색체 서열을 변형시킬 수 있고, 이에 의해 이중 녹-아웃, 삼중 녹-아웃 등이 생성된다.

(IV) 재조합 단백질 생산

본 개시내용의 또 다른 측면은 생물학적 생산 시스템에서 재조합 단백질을 생산하는 방법을 포괄한다. 적절한 재조합 단백질이 섹션 (I)(c)에 기술되어 있다. 방법은 관심 재조합 단백질을 상기의 섹션 (I)에서 기술된 조작된 세포주 중 임의의 것에서 발현하는 단계 및 발현된 재조합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 재조합 단백질의 생산 또는 제작 수단이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Biopharmaceutical Production Technology", Subramanian (ed), 2012, Wiley-VCH; ISBN: 978-3-527-33029-4] 참조).

정화, 예를 들어, 여과 단계, 및 1회 이상의 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 단백질 A (또는 G) 크로마토그래피, 이온 교환 (즉, 양이온 및/또는 음이온) 크로마토그래피를 포함하는 프로세스를 통해 재조합 단백질이 정제될 수 있다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 하기의 참고문헌은 기술자에게 본 발명에서 사용된 용어 중 다수의 일반적인 정의를 제공한다: [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)]; [The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)]; [The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 [Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에서 사용된 바와 같이, 하기의 용어는 달리 상술되지 않는 한 이에 부여된 의미를 갖는다.

본 개시내용 또는 그의 바람직한 실시양태(들)의 요소를 소개할 때, 단수형은 하나 이상의 요소가 있다는 것을 의미하도록 의도된다. 용어 "포함하는", 수반함하는" 및 "갖는"은 포괄적인 것으로, 그리고 열거된 요소 이외의 추가적인 요소가 있을 수 있다는 것을 의미하도록 의도된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "내인성 서열"은 세포에 대해 천연인 염색체 서열을 지칭한다.

용어 "외인성 서열"은 세포에 대해 천연이 아닌 염색체 서열, 또는 상이한 염색체 위치로 이동된 염색체 서열을 지칭한다.

"조작된" 또는 "유전자 변형된" 세포는 게놈이 변형되거나 조작된 세포를 지칭하고, 즉, 세포는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환을 함유하도록 조작된 적어도 하나의 염색체 서열을 함유한다.

용어 "게놈 변형" 및 "게놈 편집"은 특이적인 내인성 염색체 서열이 변화되어 염색체 서열이 변형되는 프로세스를 지칭한다. 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 변형된 염색체 서열은 생성물이 만들어지지 않도록 불활성화된다. 대안적으로, 염색체 서열은 변경된 생성물이 만들어지도록 변형될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 "유전자"는 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 영역 (엑손 및 인트론 포함), 뿐만 아니라 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 지칭하고, 이같은 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하는지 여부는 상관 없다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 부위, 및 유전자좌 제어 영역을 포함하지만, 필수적으로 이에 제한되지는 않는다.

용어 "이종성"은 관심 세포 또는 종에 대해 천연이지 않은 실체를 지칭한다.

용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 원형 형상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 이러한 용어들은 중합체의 길이와 관련하여 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체, 뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티에서 변형된 뉴클레오티드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정한 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 형성 특이성을 갖는다; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드는 포스포디에스테르, 포스포티오에이트, 포스포르아미디트, 포스포로디아미데이트 결합, 또는 그의 조합에 의해 연결될 수 있다.

용어 "뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 (즉, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘, 및 유리딘) 또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 천연 발생 뉴클레오티드 (예를 들어, 이노신) 또는 비-천연 발생 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드의 당 또는 염기 모이어티 상의 변형의 비제한적인 예는 아세틸 기, 아미노 기, 카르복실 기, 카르복시메틸 기, 히드록실 기, 메틸 기, 포스포릴 기 및 티올 기의 부가 (또는 제거), 뿐만 아니라 염기의 탄소 및 질소 원자가 다른 원자로 치환되는 것 (예를 들어, 7-데아자 퓨린)을 포함한다. 뉴클레오티드 유사체는 디데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA), 및 모르폴리노를 또한 포함한다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하도록 상호교환가능하게 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 변형 또는 편집될 염색체 서열의 일부분을 정의하는 핵산 서열로서, 결합을 위한 충분한 조건이 존재하는 조건 하에, 표적화 엔도뉴클레아제가 이를 인식하고 결합하도록 조작되는 핵산 서열을 지칭한다.

용어 "상류" 및 "하류"는 고정된 위치에 대해 상대적인 핵산 서열의 위치를 지칭한다. 상류는 위치에 대해 5' (즉, 가닥의 5' 단부의 근처)인 영역을 지칭하고, 하류는 위치에 대해 3' (즉, 가닥의 3' 단부의 근처)인 영역을 지칭한다.

핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이같은 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고/거나 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 결정하고, 이러한 서열을 제2의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열 또한 이러한 방식으로 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 상응성을 각각 지칭한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)이 그들의 퍼센트 동일성을 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 서열이든 또는 아미노산 서열이든 2개의 서열의 퍼센트 동일성은 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 매치의 개수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 문헌 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소적 상동성 알고리즘에 의해 핵산 서열에 대한 대략적인 정렬이 제공된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA]에 의해 개발되고 문헌 [Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 정규화된 채점 행렬을 사용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적인 실행이 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group) (위스콘신주 매디슨)에 의해 "베스트핏(BestFit)" 유틸리티 어플리케이션에서 제공된다. 서열 사이의 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 기타 적절한 프로그램이 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 또 다른 정렬 프로그램은 BLAST이고, 이는 디폴트 파라미터와 함께 사용된다. 예를 들어, 하기 디폴트 파라미터를 사용하여 BLASTN 및 BLASTP가 사용될 수 있다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=양쪽 가닥; 절단값=60; 기대값=10; 행렬=BLOSUM62; 설명=50개의 서열; 분류 방식=높은 점수; 데이터베이스=비-중복, 진뱅크(GenBank)+EMBL+DDBJ+PDB+진뱅크 CDS 번역+스위스 단백질+Sp업데이트+PIR. 이러한 프로그램의 상세사항을 진뱅크 웹사이트에서 확인할 수 있다. 본원에 기술된 서열과 관련하여, 원하는 서열 동일성 정도의 범위는 약 80% 내지 100% 및 그 사이의 임의의 정수 값이다. 전형적으로, 서열 사이의 퍼센트 동일성은 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더욱 바람직하게는 85-90%, 더욱 더 바람직하게는 92%, 더더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.

발명의 범주를 벗어나지 않으면서 상기 기술된 세포 및 방법에서 다양한 변화가 이루어질 수 있기 때문에, 상기 설명 및 하기에서 제공된 실시예에 함유된 모든 내용은 제한적인 의미가 아니라 예시적인 것으로 해석되어야 하는 것으로 의도된다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 특정 측면들을 예시한다.

실시예 1: 글리신-포르메이트 매개 선택 시스템의 디자인

글리신-포르메이트 매개 대사 선택 시스템을 개발하기 위해, 비-필수 아미노산 글리신 (Gly)에 대해 영양요구성인 CHO 세포주가 먼저 개발되었다. 글리신-포르메이트 합성 경로와 연관된 모든 유전자를 확인하기 위한 종합적인 검색이 리액톰(Reactome) 및 KEGG 데이터베이스에 대해 수행되었다. 내인성 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 2 유전자 (SHMT2)가 Gly 합성을 담당하는 유일한 비-중복 유전자로서 확인되었다 (도 1). Gly 영양요구성 CHO 세포주를 생성시키기 위해, 밀리포어시그마(MilliporeSigma)로부터의 글루타민 (Gln) 영양요구성 CHOZN^® GS^-/- 세포주 (CHOZN^®)가 활용되었다. 내인성 SHMT2 코딩 서열 (도 2)이 CHOZN^® 세포주의 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)을 통해 해명되었고, 디지털 액적 PCR (ddPCR) 분석에 의해 결정된 바와 같이, 이는 CHOZN^® 게놈에 2개의 카피로 존재하는 것으로 밝혀졌다 (도 7). SHMT2 유전자를 파괴하도록 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시약이 디자인되었다. 도 2에서 CRISPR/Cas9 표적 서열은 밑줄 표시된다. 37℃에서 5% CO2로 진탕 조건 하에 CHOZN^® 세포를 6 mM L-글루타민 (밀리포어시그마 G7513)이 보충된 EX-CELL^®　CD CHO 융합 배지 (밀리포어시그마 14365C) (융합 + Gln)에서 배양하였다. 형질감염 3일 전에 세포를 0.3e6개로 분주하였다. 50 pmol의 Cas9 (시그마(Sigma) CAS9PROT-250UG)를 150 pmol의 sgRNA (시그마)와 혼합함으로써 15분 동안 실온에서 Cas9 RNP를 복합체화시켰다. 프로그램 DT-133 및 SF 뉴클레오펙터 용액으로 론자(Lonza)의 4DX 뉴클레오펙터 시스템을 사용하여 4e5개의 세포에 총 200 pmol의 복합체화 RNP를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 6 mM L-글루타민 (밀리포어시그마 G7513)이 보충된 2 mL의 미리 가온된 EX-CELL^®　CD CHO 융합 배지 (밀리포어시그마 14365C)를 함유하는 6웰 배양 플라스크로 옮겼다. 세포를 정적 환경에서 37℃/5% CO2에서 인큐베이션하였다. 형질감염 48시간 후, 20%의 풀 (400 uL)을 게놈 DNA 추출 (gDNA)을 위해 수확하고, 퀵익스트랙트(QuickExtract) (루시젠(Lucigen) QE09050)를 사용하여 gDNA를 추출하였다. 일루미나(illumina) Miseq를 사용하여 차세대 시퀀싱 (NGS)을 위해 2.5 uL의 gDNA를 증폭시켰다. NGS에서 >90%의 풀이 편집되었음이 확인되었다.

Cas9 변형된 풀로부터의 단일 세포 클론을 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)를 통해 96웰 배양 플레이트 내로 단리하였다. 단일 세포 클론을 NGS를 통해 평가하여, SHMT2의 양쪽 카피의 성공적인 유전자 파괴를 함유하는 클론을 확인하였다 (도 3).

독립형 시스템으로서 및 이중 대사 선택 시스템의 한 부분으로서 양쪽 모두의 글리신-포르메이트 매개 선택 메커니즘의 효능을 실연하기 위해, 다수의 분자를 발현하는 안정적인 선택된 세포 집단이 생성되었다. 이러한 시스템의 검증에서 사용된 분자는 청록색 형광 단백질 (CFP), 대셔(Dasher) 녹색 형광 단백질 (GFP), 및 인간 IgG1을 포함한다. CHOZN^® GS^-/- SHMT2^-/- 세포를 융합 + Gln + Gly + 포르메이트 (For) 배지에서 배양하였다. 본 연구에서 사용된 발현 벡터는 실험 디자인에 지시된 바와 같이 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 2 (SHMT2) 또는 글루타민 신테타제 (GS) 선택 마커를 함유한다. 뮤린 SHMT2 (단백질: 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 2; 유전자: SHMT2; 유니프롯KB(UniProtKB) ID: Q9CZN7) 또는 뮤린 GS (단백질: 글루타민 신테타제 {글루타메이트-암모니아 리가제}; 유전자: Glul; 유니프롯KB ID: P15105)의 발현이 5' SV40 프로모터에 의해 구동되었고, 유전자의 3' 단부에 SV40 폴리아데닐화 서열이 있었다 (도 4).

37℃에서 5% CO2로 진탕 조건 하에 CHOZN^® GS^-/- SHMT2^-/- 세포를 융합 +Gln +Gly +For에서 배양하였다. 세포를 형질감염 3일 전에 0.3e6개로 분주하였다. 조건 당 1.0e6개의 세포를 프로그램 DT-133 및 SF 뉴클레오펙터 용액으로 론자의 4DX 뉴클레오펙터 시스템을 사용하여 1 ug의 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 6 mM L-글루타민 (밀리포어시그마 G7513) 및 200 uM의 포름산나트륨 (시그마 456020-25G)이 보충된 3 mL의 미리 가온된 EX-CELL^®　CD CHO 융합 배지 (밀리포어시그마 14365C)를 함유하는 6웰 배양 플라스크 내로 옮겼다. 세포를 정적 환경에서 37℃/5% CO2에서 인큐베이션하였다. 형질감염 3일 후, 각각의 샘플을 T-25로 확장시키고, 2 ml의 배지를 첨가하였다. 제7일에, 세포가 ~90% 생육성에 도달하였고, 이를 15 mL 코니컬로 옮기고, 1000 rpm (~300 × g)에서 5분 동안 스피닝하였다. 상청액을 흡인한 후, 세포를 5 mL의 PBS로 세정하고, 다시 5분 동안 스피닝하였다. 상청액을 흡인하고, 세포를 10-15 ml의 이의 상응하는 선택 배지에 재현탁시키고, T-75 플라스크로 옮겼다. 융합 -Gln을 사용하여 글루타민-기반 선택을 수행하였고, 융합 -Gly -For를 사용하여 글리신 포르메이트-기반 선택을 수행하였으며, Gln, Gly 및 For가 없는 융합을 사용하여 글루타민/글리신 포르메이트 이중 선택을 수행하였다. 다양한 선택 배양물의 세포 생육성 및 생육가능 세포 밀도를 경시적으로 모니터링하였다.

EX-CELL^®　어드밴스드(Advanced) CHO 페드-뱃치 배지 (밀리포어시그마 14366C) 및 EX-CELL^®　어드밴스드 CHO 피드 (밀리포어시그마 24367C)의 Gly 결핍 맞춤 제형이 개발되었다 (각각 어드밴스드 -Gly 및 피드 -Gly). 셀벤토(Cellvento)^® 4 피드 (밀리포어시그마 1.03796.0005)가 미변형으로 사용되었다. IgG1 발현 벡터로 형질감염된 안정적인 선택된 배양물을 펠릿화하고, 선택 배지를 흡인한 후, 페드-뱃치 조건에서의 생산성 분석을 위해 3e5개의 생육가능 세포/mL를 어드밴스드- Gly에 재현탁시켰다. 각각의 배양물에 대한 생육가능 세포 밀도 및 생육성을 시딩 후 제3일에 시작하여 격일로 수집하였다. 시딩 후 제3일에 시작하여, 1.5 mL의 어드밴스드 피드 -Gly 및 4 피드의 50/50 블렌드를 각각의 배양물에 첨가하였다. 제5일에 시작하여 격일로 각각의 배양물로부터 글루코스를 판독하였고, 적합한 글루코스 수준을 유지하기 위해 D-+-글루코스 (밀리포어시그마 G8769)를 첨가하였다. 경시적으로 생산성을 모니터링하였고, 제8일에 시작하여 배양물이 70% 생육성 미만으로 하락할 때까지 격일로 페드 뱃치 역가를 기록하였다. 포르테바이오 옥텟(ForteBio Octet) 상에서 간섭법을 사용하여 역가를 결정한 후, HPLC 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 통해 확인하였다.

실시예 2:

글리신 (Gly)이 없는 기본 EX-CELL^®　CD CHO 융합 배지의 맞춤 제형이 개발되었다 (융합 -Gln -Gly). CHOZN^® GS^-/- SHMT2^-/- 클론을 융합 +Gln +Gly +For, 또는 융합 + Gln -Gly -For에서 적어도 10일 동안 배양하였다. 주 2회로 생육성 및 생육가능 세포 밀도를 측정하였다. 도 5는 글리신 및 포르메이트의 부재 하에 CHOZN^® GS^-/- SHMT2^-/- 세포가 성장할 수 없지만, 글리신이 배지 내로 보충되는 경우, CHOZN^® GS^-/- SHMT2^-/-세포 성장이 구제된다는 것을 가리킨다. 중요하게, SHMT2^-/- 세포 성장 속도가 SHMT2^+/+ 세포주보다 유의하게 더 느리지만, 이는 배지 내로 포름산나트륨을 첨가하는 것을 통해 구제될 수 있다 (도 9). 포르메이트만 첨가하는 것 (융합 -Gly +For)은 세포 생존에 충분하지 않다 (도 10).

실시예 3:

안정적인 선택된 세포 집단이 실시예 1에 기술된 Gly/For-매개 선택 시스템을 사용하여 관심 단백질을 생산할 수 있었음을 실연하기 위해, 세포를 형질감염시키고, 융합 -Gly -For에서 선택적 압력 하에 계대시켰다. SHMT2/CFP 벡터가 CHOZN^® GS^-/- SHMT2^-/- 세포 내로 형질감염되었다. 선택 전반에 걸쳐 세포 성장 및 생육성을 모니터링하였다. SHMT2/CFP 플라스미드로 형질감염되고 융합 +Gln -Gly -For (Gly 선택 배지)에서 성장된 세포가 선택적 압력으로부터 회복되었다. 생존 세포 집단을 FACS로 분석하였고, 평균 형광 강도 (MFI) 및 CFP+ 세포의 백분율을 측정하였다. 융합 +Gln +Gly +For에서 성장된 세포는 융합 +Gln -Gly -For에서 Gly/For-선택에 적용된 세포에 비교하여 매우 작은 백분율의 CFP 양성 세포 및 낮은 MFI를 나타내었다. 결과가 도 6 & 8에서 요약된다.

실시예 4:

안정적인 선택된 세포 집단이 실시예 1에 기술된 Gly For-매개 선택 시스템을 사용하여 관심 단백질을 생산할 수 있었음을 실연하기 위해, 본 발명가들은 IgG 중쇄, IgG 경쇄 및 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 2 (SHMT2) 코딩 서열이 있는 벡터를 개발하였다. 이러한 벡터를 CHOZN^® GS^-/- SHMT2^-/- 세포주 내로 형질감염시켰다. 대조군으로서, DNA가 없는 모의 형질감염이 사용되었다. 집단을 융합 +Gln -Gly -For에서 선택적 압력 하에 계대시켰다. 선택에 사용된 조건은 회복, 확대 및 생산성 검정법 동안에도 적용되었다. 페드-뱃치 생산성 검정법을 어드밴스드 +Gln -Gly -For 배지에 3e5개의 생육가능 세포/mL로 접종하였다. 각각의 배양물에 대한 생육가능 세포 밀도 및 생육성을 시딩 후 제3일에 시작하여 격일로 수집하였다. 시딩 후 제3일에 시작하여, 1.5 mL의 어드밴스드 피드 -Gly -For 및 4 피드 -Gly -For의 50/50 블렌드를 각각의 배양물에 첨가하였다. 제5일에 시작하여 격일로 글루코스를 판독하였고, 적합한 글루코스 수준을 유지하기 위해 D-+-글루코스 (밀리포어시그마 G8769)를 첨가하였다. SHMT2 벡터로만 형질감염된 세포는 ~12.5e6개의 세포/mL의 피크 생육가능 세포 밀도에 도달하였고 (도 11의 좌측 패널의 중간 그래프), 적어도 13일 동안 >70% 생육성을 유지하였다 (도 11의 우측 패널의 중간 그래프). 페드 뱃치로부터의 세포의 역가는 ~200 mg/L의 피크에 도달하였다 (도 12의 좌측 패널의 중간 그래프 및 우측 패널의 우측 그래프).

실시예 5:

안정적인 세포 집단이 글루타민- 및 글리신/포르메이트-없음 조건 하에 2개의 독립적인 세포내 형광 단백질을 생산할 수 있는지를 테스트하기 위해, 본 발명가들은 하나는 GFP 및 GS 코딩 서열을 함유하고 두 번째는 CFP 및 SHMT2 코딩 서열을 함유하는 2개의 벡터를 개발하였다 (도 4). 이러한 2개의 플라스미드를 CHOZN^® GS^-/- SHMT2^-/- 세포 내로 공동-형질감염시켰다 (GFP + CFP). 대조군으로서, 각각의 벡터가 또한 CHOZN^® GS^-/- SHMT2^-/- 세포 내로 독립적으로 형질감염되었다 (각각 GFP 단독 및 CFP 단독). 그 후, 3가지 형질감염 모두로부터의 세포를 GS-선택 조건 (융합 -Gln), SHMT2-선택 조건 (융합 -Gly -For), 뿐만 아니라 이중 대사 선택 조건 (융합 -Gln -Gly -For) 하에 계대시켰다. 선택에 사용된 조건은 회복, 확대 및 모든 다른 검정법 동안에도 적용되었다. 도 8은 GFP 벡터로 형질감염된 세포가 -Gln 조건에서 생존하고 성장할 수 있지만, 배지 내의 Gly/For 보충을 필요로 한다는 것을 가리키는 선택 검정법으로부터의 생육성 데이터를 제시한다. 반면에, CFP 벡터로 형질감염된 세포는 -Gly 조건에서 생존하고 성장할 수 있지만, 배지 내의 Gln 보충을 필요로 한다. 양쪽 모두의 벡터 (GFP + CFP)로 공동-형질감염된 세포는 -Gln -Gly -For 배지에서 생존하고 성장할 수 있다. 도 6 및 8은 -Gln 배지에서 생존하고 성장하는 GFP 벡터로 형질감염된 세포가 GFP에 대해 양성이고, -Gly -포르메이트 배지에서 생존하고 성장하는 CFP 벡터로 형질감염된 세포가 CFP에 대해 양성이며, -Gln -Gly -For 배지에서 생존하고 성장하는 양쪽 모두의 벡터 (GFP + CFP)로 공동-형질감염된 세포가 GFP 및 CFP 둘 다에 대해 양성이라는 것을 가리킨다. 이러한 데이터는 GS + SHMT2 이중 대사 선택 시스템이 임의의 선택제, 예를 들어 항생제를 배지에 첨가하는 것을 필요로 하지 않으면서 세포내 단백질을 코딩하는 독립적인 다중 벡터들이 도입된 세포를 선택할 고유한 기회를 제공한다는 것을 가리킨다.

실시예 6:

안정적인 세포 집단이 글루타민- 및 글리신-없음 조건 하에 분비 단백질을 생산할 수 있는지를 테스트하기 위해, 본 발명가들은 하나는 IgG 중쇄, IgG 경쇄 및 GS 코딩 서열을 함유하고 두 번째는 동일한 IgG 중쇄, IgG 경쇄 및 SHMT2 코딩 서열을 함유하는, IgG1을 발현하는 2개의 벡터를 개발하였다. 이러한 2개의 독립적인 벡터를 CHOZN^® GS^-/- SHMT2^-/- 세포 내로 공동-형질감염시켰다 (GS + SHMT2). 대조군으로서, 각각의 벡터가 또한 CHOZN^® GS^-/-SHMT2^-/- 내로 독립적으로 형질감염되었다 (GS 단독 및 SHMT2 단독). 그 후, 세포를 융합 -Gln (GS 단독 형질감염 세포), 융합 -Gly -For (SHMT2 단독 형질감염 세포) 또는 융합 -Gln -Gly -For (GS + SHMT2 형질감염 세포)에서 선택적 압력 하에 계대시켰다. 선택에 사용된 조건은 회복, 확대 및 생산성 검정법 동안에도 적용되었다. GS 단독 선택 배양물은 14-19일 후에 완전히 회복된 한편, SHMT2 단독 및 GS + SHMT2 이중 선택 배양물은 선택 회복 프로파일이 유사하였고, 완전히 회복되는데 19일을 필요로 하였다. 페드 뱃치 검정법에서, GS 단독 및 SHMT2 단독 클론은 유사한 수준의 IgG를 생산하는 한편, GS + SHMT2 세포는 유의하게 더 많은 IgG를 생산하고, 성장 및 생육성이 가장 높다. 이는 외인성 GS 및/또는 SHMT2 코딩 서열의 발현 시 세포에 의해 생산된 GS 및 SHMT2가 분비 단백질을 발현하는데 충분하다는 것을 시사한다 (도 11의 우측 그래프 및 도 12의 좌측 패널의 우측 그래프). 이것은 추후에 원하는 분비 단백질로부터 항생제를 분리하거나 정제하는 것을 필요로 하는 것으로 인해 또는 항생제를 대규모 바이오리액터에 첨가하는 것의 비용으로 인해 항생제 선택 방법을 사용하여 수행하기 어려울 수 있는, 이중 대사 선택 조건 하에 대규모 생산 바이오리액터를 운영할 잠재력을 제공한다. 또한, 이러한 이중 대사 선택 시스템 (GS + SHMT2)은, 예를 들어 이중특이적 항체 또는 또 다른 대형이고/거나 복합적인 단백질을 발현하는 경우에, 다중 대형 벡터가 세포 내로 도입된 세포를 더욱 효율적으로 선택할 기회를 제공한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

재조합 단백질 생성물을 생산하기 위한 방법으로서, 프로세스가 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 내인성 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 2 (SHMT2)의 발현이 감소 또는 제거되도록 조작된 포유동물 세포주를 제공하는 단계;
(b) 포유동물 세포주 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하며, 여기서 폴리뉴클레오티드가 기능성 SHMT2 유전자 및 재조합 단백질을 코딩하는 것인 단계;
(c) 세포주를 배양하는 단계; 및
(d) 재조합 단백질을 정제하여 재조합 단백질 생성물을 형성하는 단계.
제1항에 있어서, (a)의 포유동물 세포주가 내인성 글루타민 신테타제 (GS), 포스포세린 포스파타제 (PSPH), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), P5C 신타제 (P5CS), 아스파라기나제 (ASPG), 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및/또는 아스파라긴 신테타제 (ASNS)의 발현의 감소 또는 제거를 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 내인성 SHMT2 발현이 포유동물 세포주의 내인성 SHMT2 유전자를 불활성화시킴으로써 감소 또는 제거되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 내인성 SHMT2 유전자가 표적화 엔도뉴클레아제-매개 게놈 변형 기술을 사용하여 불활성화되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 표적화 엔도뉴클레아제가 CRISPR 리보핵단백질 복합체 또는 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제인 방법.
제1항에 있어서, 포유동물 세포주가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포주, NS0 마우스 골수종 세포주, HEK293 세포주, 또는 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 글리신 및/또는 포르메이트의 존재 또는 부재 하에 배양된 CHO 세포주인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 생성물이 항체, 항체 단편, 백신, 성장 인자, 시토카인, 호르몬, 또는 응고 인자로부터 선택되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 항체가 이중특이적 또는 다중특이적 항체인 방법.
생물학적 생산 시스템에서 사용하기 위한 유전자 조작된 포유동물 세포주로서, 여기서 포유동물 세포주가 내인성 SHMT2의 발현이 감소 또는 제거되도록 조작된 것인 포유동물 세포주.
제10항에 있어서, SHMT2 발현이 SHMT2를 코딩하는 염색체 서열의 적어도 하나의 대립유전자의 불활성화를 통해 감소 또는 제거되는 것인 포유동물 세포주.
제11항에 있어서, SHMT2를 코딩하는 염색체 서열의 하나 이상의 대립유전자가 불활성화되는 것인 포유동물 세포주.
제10항에 있어서, 세포주가 내인성 글루타민 신테타제 (GS), 포스포세린 포스파타제 (PSPH), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), P5C 신타제 (P5CS), 아스파라기나제 (ASPG), 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및/또는 아스파라긴 신테타제 (ASNS)의 발현이 감소 또는 제거되도록 조작되는 것인 포유동물 세포주.
제12항에 있어서, 염색체 서열이 표적화 엔도뉴클레아제-매개 게놈 변형 기술을 사용하여 불활성화되는 것인 포유동물 세포주.
제14항에 있어서, 표적화 엔도뉴클레아제가 리보핵단백질 복합체 또는 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제인 포유동물 세포주.
제15항에 있어서, 비-인간 세포주가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포주, NS0 마우스 골수종 세포주, HEK293 세포주, 또는 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주인 포유동물 세포주.
제16항에 있어서, 세포주가 글리신 및/또는 포르메이트의 존재 또는 부재 하에 배양된 CHO 세포주인 포유동물 세포주.
제17항에 있어서, 세포 생육성, 생육가능 세포 밀도, 역가, 성장률, 증식 반응, 세포 형태학, 및/또는 일반적인 세포 건강이 비-조작된 모 포유동물 세포주의 것들과 비슷한 것인 포유동물 세포주.
제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 항체 단편, 백신, 성장 인자, 시토카인, 호르몬, 또는 응고 인자로부터 선택된 재조합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 추가로 포함하는 포유동물 세포주.
제19항에 있어서, 항체가 이중특이적 또는 다중특이적 항체인 포유동물 세포주.
기능성 SHMT2 및 적어도 하나의 관심 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드:
a) 기능성 SHMT2를 코딩하는 핵산 서열;
b) 기능성 GS 및/또는 ASNS를 코딩하는 핵산 서열; 및
c) 효소 중 하나 또는 이들 둘 다의 활성을 약화시키는 ASNS 및/또는 SHMT2 코딩 서열 내의 돌연변이를 코딩하는 핵산 서열
d) 관심 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열.