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KR20240126857A - 폴리리보뉴클레오티드를 정제하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

폴리리보뉴클레오티드를 정제하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20240126857A
KR20240126857A KR1020247016439A KR20247016439A KR20240126857A KR 20240126857 A KR20240126857 A KR 20240126857A KR 1020247016439 A KR1020247016439 A KR 1020247016439A KR 20247016439 A KR20247016439 A KR 20247016439A KR 20240126857 A KR20240126857 A KR 20240126857A
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KR
South Korea
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polyribonucleotide
target region
polyribonucleotides
oligonucleotide
circular
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Pending
Application number
KR1020247016439A
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English (en)
Inventor
바딤 더드킨
기영 백
Original Assignee
플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 폴리리보뉴클레오티드를 분리하고/거나 정제하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 폴리리보뉴클레오티드는 폴리리보뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물로부터 분리되고, 치료제로서 사용하기 위해 이용가능할 수 있다.

Description

폴리리보뉴클레오티드를 정제하기 위한 조성물 및 방법
폴리리보뉴클레오티드는 다양한 치료 및 조작 적용에 유용하다. 따라서, 폴리리보뉴클레오티드를 분리하고 정제하기 위한 새로운 조성물 및 방법은 유용하다.
한 양태에서, 본 발명은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 방법을 특색으로 한다. 이 방법에서, 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플이 제공된다. 샘플 내의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 하위세트는 표적 영역을 갖는다. 방법은 샘플을 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 샘플 내의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 선형 폴리리보뉴클레오티드 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 방법을 특색으로 한다. 이 방법에서, 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플이 제공된다. 샘플 내의 복수개의 선형 폴리리보뉴클레오티드의 하위세트는 표적 영역을 갖는다. 방법은 샘플을 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 샘플 내의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드는 폴리A 서열(즉, 폴리A 꼬리)을 결여한다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 위치하지 않는다. 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 그의 하위세트는 표적 영역을 결여할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 것을 포함하고, 여기서 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 하위세트는 표적 영역을 갖는다. 표적 영역은 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 위치하지 않는다(즉, 표적 영역은 폴리리보뉴클레오티드 상에서 내부에 위치한다). 방법은 샘플을 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 샘플 내의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 영역을 갖는 복수개의 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 것을 포함한다. 방법은 샘플을 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도로 선형 폴리리보뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하고, 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도와는 상이한 제2 결합 친화도로 원형 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하고, 샘플 내의 복수개의 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리한다. 일부 실시 형태에서, 제1 결합 친화도는 제2 결합 친화도보다 작고, 올리고뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드에 우선적으로 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 영역을 갖는 제2 형태의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 것을 포함한다. 방법은 샘플을 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도로 제1 형태의 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하고, 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도와는 상이한 제2 결합 친화도로 제2 형태의 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하고, 샘플 내의 제2 형태의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드를 분리한다. 일부 실시 형태에서, 제1 결합 친화도는 제2 결합 친화도보다 작고, 올리고뉴클레오티드는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드에 우선적으로 결합한다.
본원에 기재된 양태 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 분리는 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 위치하지 않는다. 예를 들어, 표적 영역은 폴리리보뉴클레오티드 상에서 내부에 위치할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 폴리리보뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하지 않는다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 폴리리보뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 위치하고, 표적 영역은 폴리A 서열을 함유하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 폴리리보뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하고, 폴리A 서열을 함유하지 않는다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 폴리A 서열을 함유하지 않는다.
상기 양태 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 입자에 컨쥬게이트된다. 입자는 예를 들어, 자기 입자 또는 비드일 수 있다. 비드는 예를 들어, 가교된 아가로스, 예를 들어, SEPHAROSE® 비드일 수 있다.
상기 양태 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 제1 포획제에 컨쥬게이트된다.
일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 화학적 링커에 의해 제1 포획제 또는 입자에 컨쥬게이트된다. 화학적 링커는 예를 들어, 트리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 화학적 링커는 올리고뉴클레오티드의 3' 단부 또는 5' 단부에 컨쥬게이트된다.
일부 실시 형태에서, 제1 포획제는 항원(예를 들어, 비오틴)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 샘플을 제1 포획제에 결합하는 제2 포획제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 제2 포획제는 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, 스트렙타비딘)을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제2 포획제는 입자에 컨쥬게이트된다. 입자는 예를 들어, 자기 입자 또는 비드일 수 있다. 비드는 예를 들어, 가교된 아가로스, 예를 들어, SEPHAROSE® 비드일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제2 포획제는 화학적 링커로 입자에 컨쥬게이트된다. 화학적 링커는 예를 들어, 트리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 인트론 또는 그의 부분(예를 들어, 절반-인트론)을 포함한다. 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 인트론 또는 그의 부분은 촉매 인트론(예를 들어, 그룹 I 촉매 인트론 또는 그룹 II 촉매 인트론) 또는 그의 부분이다. 일부 실시 형태에서, 인트론 또는 그의 부분은 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 인트론 또는 그의 부분은 20 내지 500개, 20 내지 400개, 20 내지 300개, 20 내지 200개, 20 내지 100개, 50 내지 500개, 50 내지 400개, 50 내지 300개, 50 내지 200개, 100 내지 500개, 100 내지 400개, 100 내지 300개, 또는 100 내지 200개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 표적 영역은 절반-인트론(예를 들어, 촉매 인트론의 5' 또는 3' 부분)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 5' 절반-인트론(예를 들어, 촉매 인트론의 5' 부분에 상응하는 5' 절반-인트론)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 3' 절반-인트론(예를 들어, 촉매 인트론의 3' 부분에 상응하는 3' 절반-인트론)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 그룹 I 촉매 인트론의 5' 절반을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 그룹 I 촉매 인트론의 5' 절반은 시아노박테리아 아나바에나(Anabaena) 프리-tRNA-Leu 유전자, 테트라히메나(Tetrahymena) 프리-rRNA, T4 파지 td 유전자, 또는 그의 변이체의 5' 부분으로부터의 것이다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 그룹 I 촉매 인트론의 3' 절반을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 그룹 I 촉매 인트론의 3' 절반은 시아노박테리아 아나바에나 프리-tRNA-Leu 유전자, 테트라히메나 프리-rRNA, T4 파지 td 유전자, 또는 그의 변이체로부터의 3' 부분으로부터 선택된다.
표적 영역은 인트론 또는 그의 부분에 대해 5' 또는 3'에 위치할 수 있거나, 인트론 또는 그의 부분에 대해 5' 또는 3'에 위치한 영역의 부분을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 방법은 비-스플라이싱된 또는 부분적으로 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드로부터 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 실시 형태에서, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 실시 형태에서, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드는 인트론 또는 그의 부분을 결여한다(예를 들어, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드는 촉매 인트론, 예컨대 그룹 I 촉매 인트론, 또는 그의 부분을 결여한다).
일부 실시 형태에서, 방법은 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드의 양을 샘플에 비해 적어도 10%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 그 초과) 풍부화한다.
일부 실시 형태에서, 인트론 또는 그의 부분을 갖는 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드이다.
일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 5개의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 5~100개, 5~95개, 10~90개, 10~80개, 12~60개, 15~50개, 15~40개, 15~30개, 18~30개, 20~25개, 또는 20~22개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 23개의 뉴클레오티드의 길이이다.
일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 약 45 ℃ 내지 약 75 ℃, 예를 들어, 약 46 ℃, 47 ℃, 48 ℃, 49 ℃, 50 ℃, 51 ℃, 52 ℃, 53 ℃, 54 ℃, 55 ℃, 56 ℃, 57 ℃, 58 ℃, 59 ℃, 60 ℃, 61 ℃, 62 ℃, 63 ℃, 64 ℃, 65 ℃, 66 ℃, 67 ℃, 68 ℃, 69 ℃, 70 ℃, 71 ℃, 72 ℃, 73 ℃, 74 ℃, 또는 75 ℃의 용융 온도(Tm)를 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 45 ℃ 내지 약 65 ℃의 Tm을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 방법은 (예를 들어, 접촉 단계 후에 및/또는 분리 단계 후에) 표적 영역을 갖는 포획된 폴리리보뉴클레오티드를 1회 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5회, 또는 그 초과) 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 제1 및/또는 제2 포획제를 1회 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5회, 또는 그 초과) 세척하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 제1 용리 단계를 수행하여 표적 영역을 갖는 포획된 폴리리보뉴클레오티드를 방출시키는 단계를 추가로 포함한다. 제1 용리 단계는 예를 들어, 제1 완충제를 첨가하고/거나 샘플을 예를 들어, 적어도 50 ℃, 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃, 70 ℃, 75 ℃, 80 ℃, 또는 그 초과까지 가열하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 방법은 제2 용리 단계를 수행하는 것을 추가로 포함한다. 제2 용리 단계는 제2 완충제를 첨가하고/거나 샘플을 예를 들어, 적어도 50 ℃, 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃, 70 ℃, 75 ℃, 80 ℃, 또는 그 초과까지 가열하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제2 완충제는 변성제, 예를 들어, 포름아미드 또는 우레아를 포함한다. 제2 완충제는 예를 들어, 약 40% 내지 약 60% 포름아미드(예를 들어, 약 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 60% 포름아미드)를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 방법은 샘플을 적어도 10분(예를 들어, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120분, 또는 그 초과) 동안 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 제1 포획제에 컨쥬게이트됨)와 인큐베이션하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 올리고뉴클레오티드에 결합되지 않은 샘플의 부분을 수집하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 포획제(예를 들어, 제1 및/또는 제2 포획제)에 의해 결합되지 않은 샘플의 부분을 수집하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 복수개의 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함하고, 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드는 별개의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 제1 포획제에 컨쥬게이트된다.
일부 실시 형태에서, 방법은 다수의 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 3' 절반 인트론 및 5' 절반 인트론에 혼성화하는 단일 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 3' 절반-인트론에 혼성화하는 제1 올리고뉴클레오티드 및 5' 절반-인트론에 혼성화하는 제2 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 각각 3' 절반-인트론 및/또는 5' 절반-인트론 상의 별개의 영역에 혼성화하는 복수개의 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 영역의 동등한 길이 부분과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 상보성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 방법은 올리고뉴클레오티드를 폴리리보뉴클레오티드에 대해 10:1 내지 1:10(예를 들어, 10:1, 5:1, 2:1, 1:2, 1:5, 또는 1:10)의 몰비로 제공하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 실시 형태 중 임의의 것의 방법에 의해 생성된 폴리리보뉴클레오티드의 집단을 특색으로 한다. 집단은 예를 들어, 표적 영역을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 조성물 내의 총 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 1%(예를 들어, 적어도 5%, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 그 초과)(mol/mol)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 집단은 50% 미만(예를 들어, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만)(mol/mol)의 선형 폴리리보뉴클레오티드를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 조성물을 특색으로 한다. 혼합물의 제1 하위세트는 표적 영역을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고, 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 제2 하위세트는 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 제1 하위세트는 조성물 내의 총 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 1%(예를 들어, 적어도 5%, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 그 초과)(mol/mol)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 및 표적 영역에 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 특색으로 하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 제1 포획제(예를 들어, 항원, 예컨대 비오틴)에 컨쥬게이트된다. 조성물은 예를 들어, 표적 영역을 결여한 폴리리보뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 표적 영역을 결여한 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드일 수 있다. 조성물은 제1 포획제에 결합되도록 구성된 제2 포획제(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대 스트렙타비딘)를 추가로 포함할 수 있다. 제2 포획제는 입자에 컨쥬게이트될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된다.
본원에 기재된 바와 같은 조성물 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드는 인트론 또는 그의 부분을 포함한다. 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분을 포함할 수 있다. 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분에 대해 5' 또는 3'에 위치할 수 있다.
상기 양태 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드는 변형될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 및 희석제, 담체, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 특색으로 한다.
정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어가 하기에 정의된다. 본원에 정의된 용어는 본 발명과 관련된 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 단수 형태 용어는 단수 실체를 지칭하는 것으로 의도될 뿐만 아니라 그의 구체적인 예가 예시를 위해 사용될 수 있는 일반적 부류를 포함한다. "또는"이라는 용어는 단지 대안을 지칭하는 것으로 명백하게 표시되거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용되지만, 본 발명은 단지 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지한다. 본원에서의 용어는 구체적인 실시 형태를 기재하기 위해 사용되지만, 그들의 용법은 청구범위에 개요된 것을 제외하고는, 제한적인 것으로 취해지지 않아야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 값의 범위로 제공된 임의의 값은 상계 및 하계 둘 모두, 및 상계 및 하계 내에 함유된 임의의 값을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약"이라는 용어는 나열된 값의 ± 10% 이내인 값을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "담체"라는 용어는 부분적으로 또는 완전히 캡슐화제를 통해, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 공유 변형에 의해 세포 내로의 조성물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 수송 또는 전달을 용이하게 하는 화합물, 조성물, 시약, 또는 분자, 또는 이들의 조합이다. 담체의 비제한적인 예는 탄수화물 담체(예를 들어, 무수물-변형 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질), 나노입자(예를 들어, 캡슐화하거나 공유적으로 연결된 나노입자는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 결합함), 리포좀, 푸소좀, 생체외 분화된 망상적혈구, 엑소좀, 단백질 담체(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 공유적으로 연결된 단백질), 또는 양이온성 담체(예를 들어, 양이온성 지질중합체 또는 형질감염 시약)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "원형 폴리리보뉴클레오티드", "원형 RNA", 및 "circRNA"라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되며, 유리 단부를 갖지 않는(즉, 유리 3' 또는 5' 단부를 갖지 않는) 구조를 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자, 예를 들어 공유 또는 비-공유 결합을 통해 원형 또는 단부 없는 구조를 형성하는 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 공유적으로 폐쇄된 폴리리보뉴클레오티드일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환", "장애", 및 "상태"라는 용어는 각각 준최적 건강의 상태, 예를 들어, 전형적으로 의학 전문가에 의해 진단되거나 치료되는 또는 진단되거나 치료될 상태를 지칭한다.
"이종"은 천연 발생(천연) 맥락 이외의 맥락에서 발생하는 것을 의미한다. "이종" 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열이 그 서열의 천연 게놈에서 발견되는 것 이외의 방식으로 사용되고 있음을 나타낸다. 예를 들어, "이종 프로모터"는 그 프로모터에 의해 천연적으로 전사되는 것이 아닌 서열의 전사를 유도하는 데 사용되며; 따라서, "이종 프로모터" 서열은 종종 재조합 핵산 기법에 의해 발현 구축물에 포함된다. "이종"이라는 용어는 또한 주어진 서열이 또 다른 서열에 대해 비-천연 발생 관계에 놓인 것을 지칭하기 위해 사용되며; 예를 들어, 이종 코딩 또는 비-코딩 뉴클레오티드 서열은 통상적으로 게놈 형질전환 기법에 의해 게놈 내로 삽입되어 유전적으로 변형된 또는 재조합 게놈을 발생시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "절반-인트론"이라는 용어는 인트론의 부분을 지칭하며, 여기서 제1 절반-인트론 및 제2 절반-인트론은 함께 인트론, 예컨대 촉매 인트론을 형성한다. 절반-인트론은, 5' 절반-인트론 및 3' 절반-인트론이 함께 기능적 인트론, 예컨대 촉매적 자기-스플라이싱이 가능한 기능적 인트론을 형성하도록, 인트론의 5' 부분(예를 들어, 촉매 인트론의 5' 부분) 또는 인트론의 3' 부분(예를 들어, 촉매 인트론의 3' 부분)일 수 있다. 절반-인트론이라는 용어는 2개의 부분으로 분할된 인트론을 지칭하는 것으로 의미된다. 절반-인트론이라는 용어는 2개의 부분 또는 절반이 동등한 길이의 것임을 언급하거나, 암시하거나, 시사하는 것으로 의미되지 않는다. 절반-인트론이라는 용어는 스플리트-인트론이라는 용어와 동의어적으로 사용되며, "인트론 단편"이라는 용어 대신 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "불순물"이라는 용어는 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 예를 들어, 제약 조성물에 존재하는 바람직하지 않은 물질이다. 일부 실시 형태에서, 불순물은 공정-관련 불순물이다. 일부 실시 형태에서, 불순물은 최종 조성물 내의 원하는 생성물 이외의, 예를 들어, 활성 약물 성분, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드 이외의 생성물-관련 물질이다. 본원에 사용된 바와 같이, "공정-관련 불순물"이라는 용어는 본원에 기재된 선형 폴리리보뉴클레오티드 이외의 최종 조성물, 조제물, 또는 생성물에서 바람직하지 않은 조성물, 조제물, 또는 생성물의 제조에서 사용되거나, 존재하거나, 생성되는 물질이다. 일부 실시 형태에서, 공정-관련 불순물은 폴리리보뉴클레오티드의 합성 또는 원형화에 사용되는 효소이다. 본원에 사용된 바와 같이, "생성물-관련 물질"이라는 용어는 조성물, 조제물, 또는 생성물의 합성 동안 생성된 물질 또는 부산물, 또는 그의 임의의 중간체이다. 일부 실시 형태에서, 생성물-관련 물질은 데옥시리보뉴클레오티드 단편이다. 일부 실시 형태에서, 생성물-관련 물질은 데옥시리보뉴클레오티드 단량체이다. 일부 실시 형태에서, 생성물-관련 물질은 하기 중 하나 이상이다: 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드의 유도체 또는 단편, 예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4개의 리보핵산, 모노리보핵산, 디리보핵산, 또는 트리리보핵산의 단편.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체의 "적합성을 증가시키는 것" 또는 "적합성을 촉진시키는 것"은 하기 원하는 효과 중 임의의 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 본원에 기재된 펩티드 또는 폴리펩티드의 투여의 결과로서, 대상체 유기체에 의해 수행되는 생리학의, 또는 임의의 활성의 임의의 바람직한 변경을 지칭한다: (1) 생물적 또는 비생물적 스트레스의 증가된 내성; (2) 증가된 수율 또는 바이오매스; (3) 변형된 개화 시간; (4) 해충 또는 병원체에 대한 증가된 저항성, (4) 제초제에 대한 증가된 저항성; (5) 대상체 유기체(예를 들어, 농업적으로 중요한 곤충)의 집단을 증가시키는 것; (6) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에)의 번식률을 증가시키는 것; (7) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에)의 이동성을 증가시키는 것; (8) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에)의 체중을 증가시키는 것; (9) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에)의 대사율 또는 활성을 증가시키는 것; (10) 수분(예를 들어, 수분되는 식물의 수)을 증가시키는 것; (11) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에) 부산물(예를 들어, 꿀벌로부터의 꿀 또는 누에로부터의 명주)의 생산을 증가시키는 것; (12) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충)의 영양분 함량(예를 들어, 단백질, 지방산, 또는 아미노산)을 증가시키는 것; (13) 살충제(예를 들어, 네오니코티노이드(예를 들어, 이미다클로프리드) 또는 유기인 살곤충제(예를 들어, 포스포로티오에이트, 예를 들어, 페니트로티온))에 대한 대상체 유기체의 저항성을 증가시키는 것; 또는 (14) 대상체 유기체, 예컨대 인간 또는 비-인간 동물의 건강을 증가시키거나 질환을 감소시키는 것. 숙주 적합성의 증가는 조정제가 투여되지 않은 대상체 유기체와 비교하여 결정될 수 있다. 반대로, 대상체의 "적합성을 감소시키는 것"은 하기 의도된 효과 중 임의의 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 본원에 기재된 펩티드 또는 폴리펩티드의 투여의 결과로서, 대상체 유기체에 의해 수행되는 생리학의, 또는 임의의 활성의 임의의 바람직하지 않은 변경을 지칭한다: (1) 생물적 또는 비생물적 스트레스의 감소된 내성; (2) 감소된 수율 또는 바이오매스; (3) 변형된 개화 시간; (4) 해충 또는 병원체에 대한 감소된 저항성, (4) 제초제에 대한 감소된 저항성; (5) 대상체 유기체(예를 들어, 농업적으로 중요한 곤충)의 집단을 감소시키는 것; (6) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에)의 번식률을 감소시키는 것; (7) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에)의 이동성을 감소시키는 것; (8) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에)의 체중을 감소시키는 것; (9) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에)의 대사율 또는 활성을 감소시키는 것; (10) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에)에 의한 수분(예를 들어, 주어진 양의 시간에 수분되는 식물의 수)을 감소시키는 것; (11) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충, 예를 들어, 벌 또는 누에) 부산물(예를 들어, 꿀벌로부터의 꿀 또는 누에로부터의 명주)의 생산을 감소시키는 것; (12) 대상체 유기체(예를 들어, 곤충)의 영양분 함량(예를 들어, 단백질, 지방산, 또는 아미노산)을 감소시키는 것; (13) 살충제(예를 들어, 네오니코티노이드(예를 들어, 이미다클로프리드) 또는 유기인 살곤충제(예를 들어, 포스포로티오에이트, 예를 들어, 페니트로티온))에 대한 대상체 유기체의 저항성을 감소시키는 것; 또는 (14) 대상체 유기체, 예컨대 인간 또는 비-인간 동물의 건강을 감소시키거나 질환을 감소시키는 것. 숙주 적합성의 감소는 조정제가 투여되지 않은 대상체 유기체와 비교하여 결정될 수 있다. 대상체의 생리학, 표현형, 또는 활성의 특정 변화, 예를 들어, 식물에서 개화 시간의 변형은 맥락에 따라(예를 들어, 기후 또는 다른 환경 조건의 변화에 적응하기 위해), 대상체의 적합성을 증가시키거나 대상체의 적합성을 감소시키는 것으로 간주될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 개화 시간의 지연(예를 들어, 주어진 달력 표시 일자에서 집단 개화에 있어서 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% 더 적은 식물)은 더 늦거나 더 시원한 봄 시간에 대한 유익한 적응일 수 있고, 따라서 식물의 적합성을 증가시키는 것으로 간주될 수 있으며; 반대로, 더 이른 또는 더 따뜻한 봄 시간의 맥락에서 개화 시간의 동일한 지연은 식물의 적합성을 감소시키는 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "선형 폴리리보뉴클레오티드", "선형 RNA", 및 "선형 폴리리보뉴클레오티드 분자"라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되며, 5' 및 3' 단부를 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미한다. 5' 및 3' 단부 중 하나 또는 둘 모두는 유리 단부이거나 또 다른 모이어티에 연결될 수 있다. 선형 폴리리보뉴클레오티드는 원형화를 겪지 않은(예를 들어, 원형화되기 전인) 폴리리보뉴클레오티드일 수 있고, 예를 들어, 스플린트 라이게이션, 또는 화학적, 효소적, 리보자임- 또는 스플라이싱-촉매 원형화 방법을 통해 원형화를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "변형된 올리고뉴클레오티드"라는 용어는 당, 핵염기, 또는 뉴클레오티드간 연결에 대한 적어도 하나의 변형을 갖는 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "변형된 리보뉴클레오티드"라는 용어는 당, 핵염기, 또는 뉴클레오시드간 연결에 대한 적어도 하나의 변형을 갖는 뉴클레오시드를 함유하는 리보뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "네이키드 전달"이라는 용어는 담체의 보조 없이 및 세포에의 전달을 보조하는 모이어티에 대한 공유 변형 없이 세포에 전달하기 위한 제형이다. 네이키드 전달 제형은 임의의 형질감염 시약, 양이온성 담체, 탄수화물 담체, 나노입자 담체, 또는 단백질 담체가 없다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 네이키드 전달 제형은 공유 변형이 없고 담체가 없는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제형이다.
본원에 사용된 바와 같이, "니킹된 RNA" 또는 "니킹된 선형 폴리리보뉴클레오티드" 또는 "니킹된 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자"라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되며, 원형 RNA의 니킹 또는 분해로부터 초래되는 5' 및 3' 단부를 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미한다. "니킹된 원형 RNA"는 니킹된 원형 RNA를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "임의적으로 치환된 X"라는 용어는 "X, 여기서 X는 임의적으로 치환됨"(예를 들어, "알킬, 여기서 상기 알킬은 임의적으로 치환됨")과 등가인 것으로 의도된다. "X"(예를 들어, 알킬)라는 특색 자체는 임의적임을 의미하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, "임의적으로 치환된"이라는 용어는 0개, 1개, 또는 그 초과의 치환기(예를 들어, 0~25개, 0~20개, 0~10개, 또는 0~5개의 치환기)를 갖는 것을 지칭한다. 예를 들어, C1 알킬 기, 즉, 메틸은 옥소로 치환되어 포르밀 기를 형성하고, -OH 또는 -NH2로 추가로 치환되어 카르복실 기 또는 아미도 기를 형성할 수 있다.
"제약 조성물"이라는 용어는 또한 제약 조성물 내에 포함되는 원형 또는 선형 폴리리보뉴클레오티드가 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용될 수 있음을 개시하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 하나 이상의 핵산 서브유닛, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 분자를 의미하며, "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드"와 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 아데노신(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 우라실(U), 또는 그의 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 및 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 포스페이트(PO3) 기를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 핵염기, 5탄당(리보스 또는 데옥시리보스 중 어느 하나), 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 리보뉴클레오티드는 당이 리보스인 뉴클레오티드이다. 폴리리보뉴클레오티드, 리보핵산, 또는 RNA는 포스포디에스테르 결합에 의해 중합된 다수의 리보뉴클레오티드를 포함하는 거대 분자를 지칭할 수 있다. 데옥시리보뉴클레오티드는 당이 데옥시리보스인 뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 "폴리리보뉴클레오티드 카고"라는 용어는 적어도 하나의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 임의의 서열을 포함한다. 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 하나 또는 다수의 발현(또는 코딩) 서열을 포함하고, 여기서 각각의 발현(또는 코딩) 서열은 폴리펩티드를 코딩한다. 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 하나 또는 다수의 비코딩 서열, 예컨대 조절 또는 촉매 기능을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 발현 및 비코딩 서열의 조합을 포함한다. 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 본원에 기재된 하나 이상의 폴리리보뉴클레오티드 서열, 예컨대 하나 또는 다수의 조절 요소, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소, 또는 스페이서 서열을 포함한다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용된 바와 같이, "폴리A" 및 "폴리A 서열"이라는 용어는 적어도 5개의 뉴클레오티드의 길이이고 아데노신 잔기로 이루어진 핵산 분자의 비번역된 인접한 영역을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 폴리A 서열은 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 또는 적어도 50개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 폴리A 서열은 오픈 리딩 프레임(예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임)에 대해 3'에(예를 들어, 그의 하류에) 위치하고, 폴리A 서열은 폴리A가 번역되지 않도록 종결 요소(예를 들어, 정지 코돈)에 대해 3'이다. 일부 실시 형태에서, 폴리A 서열은 종결 요소 및 3' 비번역된 영역에 대해 3'에 위치한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산의 요소는, 이들이 전사되어 선형 폴리리보뉴클레오티드를 형성할 수 있고, 이는 이어서 본원에서 제공된 방법을 사용하여 원형 폴리리보뉴클레오티드로 원형화될 수 있도록 벡터에서 위치되는 경우, "작동가능하게 연결되거나(operably connected)", "작동가능하게 연결된다(operably linked)".
폴리데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보핵산, 및 DNA는 포스포디에스테르 결합을 통해 중합된 다수의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 거대분자를 의미한다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 모노포스페이트 또는 뉴클레오시드 폴리포스페이트일 수 있다. 뉴클레오티드는 검출가능한 태그, 예컨대 발광 태그 또는 마커(예를 들어, 형광단)를 포함하는, 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 우리딘 트리포스페이트(dUTP) 및 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP) dNTP로부터 선택될 수 있는 데옥시리보뉴클레오시드 폴리포스페이트, 예컨대, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP)를 의미한다. 뉴클레오티드는 성장하는 핵산 가닥 내로 혼입될 수 있는 임의의 서브유닛을 포함할 수 있다. 이러한 서브유닛은 A, C, G, T, 또는 U, 또는 하나 이상의 상보적 A, C, G, T 또는 U에 대해 특이적이거나, 퓨린(즉, A 또는 G, 또는 그의 변이체) 또는 피리미딘(즉, C, T 또는 U, 또는 그의 변이체)에 대해 상보적인 임의의 다른 서브유닛일 수 있다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 그의 유도체 또는 변이체이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 약간의 예를 들자면, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 소핵 RNA(snRNA), 메신저 RNA(mRNA), 전구체 mRNA(프리-mRNA), 안티센스 RNA(asRNA)이고, 뉴클레오티드 서열 및 그의 임의의 구조적 실시 형태 둘 다, 예컨대 단일-가닥, 이중-가닥, 삼중-가닥, 나선, 헤어핀 등을 포괄한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드 분자는 원형이다. 폴리뉴클레오티드는 다양한 길이를 가질 수 있다. 핵산 분자는 적어도 약 10개의 염기, 20개의 염기, 30개의 염기, 40개의 염기, 50개의 염기, 100개의 염기, 200개의 염기, 300개의 염기, 400개의 염기, 500개의 염기, 1 킬로베이스(kb), 2 kb, 3, kb, 4 kb, 5 kb, 10 kb, 50 kb, 또는 그 초과의 길이를 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 조직으로부터 단리될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 실시 형태는 단리된 및 정제된 DNA/RNA 분자, 합성 DNA/RNA 분자, 및 합성 DNA/RNA 유사체를 포함한다.
폴리뉴클레오티드의 실시 형태, 예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드는 비표준 뉴클레오티드(들), 비-천연 뉴클레오티드(들), 뉴클레오티드 유사체(들) 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드 변이체를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 예는 디아미노 퓨린, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-D46-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 2,6-디아미노퓨린 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 경우에, 뉴클레오티드는 트리포스페이트 모이어티에 대한 변형을 포함하는 그들의 포스페이트 모이어티의 변형을 포함한다. 이러한 변형의 비제한적인 예는 더 큰 길이의 포스페이트 쇄(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 포스페이트 모이어티를 갖는 포스페이트 쇄) 및 티올 모이어티를 갖는 변형(예를 들어, 알파-티오트리포스페이트 및 베타-티오트리포스페이트)을 포함한다. 실시 형태에서, 핵산 분자는 염기 모이어티(예를 들어, 전형적으로 상보적 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성하는 데 이용가능한 하나 이상의 원자에서 또는 전형적으로 상보적 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 없는 하나 이상의 원자에서), 당 모이어티 또는 포스페이트 백본에서 변형된다. 실시 형태에서, 핵산 분자는 아민-변형된 기, 예컨대 아민 반응성 모이어티, 예컨대 N-히드록시 숙신이미드 에스테르(NHS)의 공유 부착을 허용하는 아미노 알릴 1-dUTP(aa-dUTP) 및 아미노헥실 아크릴아미드-dCTP(aha-dCTP)를 함유한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 표준 DNA 염기 쌍 또는 RNA 염기 쌍에 대한 대안은 mm3당 비트 단위의 더 높은 밀도, 더 높은 안전성(천연 독소의 우연한 또는 목적성 합성에 대해 저항성), 광-프로그램된 폴리머라제에서의 더 용이한 식별, 또는 더 낮은 2차 구조를 제공할 수 있다. 데 노보 또는 증폭 합성을 위한 천연 및 돌연변이체 폴리머라제와 혼화성인 이러한 대안적인 염기 쌍은 문헌[Betz K, Malyshev DA, Lavergne T, Welte W, Diederichs K, Dwyer TJ, Ordoukhanian P, Romesberg FE, Marx A. Nat. Chem. Biol. 2012; 8:612-4]에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"는 대부분 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기(천연 또는 비천연)의 중합체를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 유전자 생성물, 천연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 상기의 동족체, 오르토로그, 파라로그, 단편 및 다른 등가물, 변이체, 및 유사체를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 단일 분자 또는 다중-분자 복합체, 예컨대 이량체, 삼량체, 또는 사량체일 수 있다. 이들은 또한 단일 쇄 또는 다중쇄 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 인슐린을 포함할 수 있고, 회합되거나 연결될 수 있다. 가장 통상적으로 디술피드 연결은 다중쇄 폴리펩티드에서 발견된다. 폴리펩티드라는 용어는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에도 적용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "식물-변형 폴리펩티드"라는 용어는 식물의 유전적 특성(예를 들어, 유전자 발현을 증가시키거나, 유전자 발현을 감소시키거나, 다른 방식으로는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오티드 서열을 변경시킴), 후성유전학적 특성, 또는 생화학적 또는 생리학적 특성을 식물의 생리학 또는 표현형의 변화, 예를 들어, 식물 적합성의 증가 또는 감소를 발생시키는 방식으로 변경시킬 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "정제하다", "정제하는 것", 및 "정제"라는 용어는 다른 물질 중에서도, 원형 RNA 및 선형 RNA의 혼합물을 함유하는 샘플로부터 불순물(예를 들어, 공정-관련 불순물(예를 들어, 효소), 공정-관련 물질(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 단편, 데옥시리보뉴클레오티드 단량체)) 또는 부산물(예를 들어, 선형 RNA)을 제거하여, 원래 혼합물과 비교하여 감소된 수준의 불순물(예를 들어, 공정-관련 불순물(예를 들어, 효소), 공정-관련 물질(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 단편, 데옥시리보뉴클레오티드 단량체)) 또는 부산물(예를 들어, 선형 RNA)을 갖는 원형 RNA의 풍부화된 집단을 함유하거나, 출발 혼합물에 비해 선형 RNA 또는 물질이 40 질량% 이상(예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% 또는 그 초과) 감소된 조성물을 생성하는 하나 이상의 단계 또는 공정을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "순수한" 또는 "순도"라는 용어는 분석물(예를 들어, 원형 RNA)이 단리되었고 다른 성분이 없는 정도를 지칭한다. 핵산(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드)의 맥락에서, 단리된 핵산(예를 들어, 원형 RNA)의 순도는 임의의 오염물, 불순물, 또는 부산물(예를 들어, 선형 RNA 및 다른 물질)이 없는 핵산의 집단에 관하여 표현될 수 있다. 예를 들어, 원형 RNA의 집단의 순도는 예를 들어, 순수한 원형 RNA를 기준물로서 사용하여 결정될 수 있는, 단리된 물질의 총 질량을 기준으로 얼마나 많은 집단이 원형 RNA인지를 나타낸다. 본 발명에서 발견된 순도의 수준은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95% 초과, 또는 99% 초과(w/w)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 오염물 또는 불순물 또는 부산물의 수준은 약 20%, 15%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%(w/w) 이하이다. 순도는 겔 전기영동, 분광광도법(예를 들어, 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)에 의한 NanoDrop), 또는 핵산의 집단의 순도를 측정하는 데 적합한 다른 기법을 사용하여 특정 분석물(예를 들어, 원형 RNA) 또는 특정 불순물 또는 부산물(예를 들어, 선형 RNA)의 수준을 검출하고, (예를 들어, 당업계에 알려진 검정에 의해 결정된 바와 같은) 총 핵산 함량에 비한 분석물의 백분율(w/w)을 계산함으로써 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "하나 이상의 불순물 또는 부산물이 실질적으로 없는"이라는 어구는 하나 이상의 불순물 또는 부산물(예를 들어, 본원에 개시된 하나 이상의 불순물 또는 부산물)이 없거나, 하나 이상의 불순물 또는 부산물의 최소량을 함유하는 샘플, 예컨대 원형 RNA의 풍부화된 집단을 함유하는 샘플의 특성을 지칭한다. 하나 이상의 불순물 또는 부산물의 최소량은 20%(w/w) 이하(예를 들어, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%(w/w) 이하, 또는 그 미만)일 수 있다. 또 다른 예에서, 샘플 또는 원형 RNA의 풍부화된 집단은, 하나 이상의 불순물 또는 부산물이 15%(w/w) 미만(예를 들어, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%(w/w) 이하, 또는 그 미만)인 양으로 존재하는 경우, 하나 이상의 불순물 또는 부산물이 실질적으로 없다. 또 다른 예에서, 샘플 또는 원형 RNA의 풍부화된 집단은, 하나 이상의 불순물 또는 부산물이 10%(w/w) 미만(예를 들어, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%(w/w) 이하, 또는 그 미만)인 양으로 존재하는 경우, 하나 이상의 불순물 또는 부산물이 실질적으로 없다. 또 다른 예에서, 샘플 또는 원형 RNA의 풍부화된 집단은, 하나 이상의 불순물 또는 부산물이 5%(w/w) 미만(예를 들어, 4%, 3%, 2%, 1%(w/w) 이하 또는 그 미만)인 양으로 존재하는 경우, 하나 이상의 불순물 또는 부산물이 실질적으로 없다. 추가의 또 다른 예에서, 샘플 또는 원형 RNA의 풍부화된 집단은, 하나 이상의 불순물 또는 부산물이 1% 미만(0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%(w/w) 이하, 또는 그 미만)인 양으로 존재하는 경우, 하나 이상의 불순물 또는 부산물이 실질적으로 없다.
본원에 사용된 바와 같이, "조절 요소"는 원형 또는 선형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 발현을 변형시키는 모이어티, 예컨대 핵산 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, "스페이서"는 2개의 인접한 폴리뉴클레오티드 영역 사이의 거리 또는 유연성을 제공하는 (예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의) 임의의 인접한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "서열 동일성"이라는 용어는 전역 또는 국부 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 펩티드 또는 2개의 뉴클레오티드 서열의 정렬에 의해 결정된다. 서열은 이들이 최적으로 정렬된 경우(예를 들어, 디폴트 파라미터를 사용하는 GAP 또는 BESTFIT와 같은 프로그램에 의해 정렬되는 경우) 서열 동일성의 적어도 특정 최소 백분율을 공유하는 경우, "실질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 유사한" 것으로 지칭된다. GAP는 2개의 서열을 그들의 전체 길이에 걸쳐 정렬하여, 매치의 수를 최대화하고, 갭의 수를 최소화하는 Needleman 및 Wunsch 전역 정렬 알고리즘을 사용한다. 일반적으로, GAP 디폴트 파라미터가 사용되며, 갭 생성 페널티 = 50(뉴클레오티드) / 8(단백질) 및 갭 연장 페널티 = 3(뉴클레오티드) / 2(단백질)이다. 뉴클레오티드에 대해, 사용되는 디폴트 점수화 매트릭스는 nwsgapdna이고, 단백질에 대해, 디폴트 점수화 매트릭스는 Blosum62이다(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-19). 서열 정렬 및 백분율 서열 동일성에 대한 점수는 예를 들어, 컴퓨터 프로그램, 예컨대 미국 92121-3752 캘리포니아주 샌 디에고 스크랜톤 로드 9685에 소재하는 악셀리스 인크.(Accelrys Inc.)로부터 이용가능한 GCG Wisconsin Package, 버전 10.3, 또는 EmbossWin 버전 2.10.0(프로그램 "needle"을 사용하여)을 사용하여 결정된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 퍼센트 동일성은 예를 들어, FASTA, BLAST 등과 같은 알고리즘을 사용하여, 데이터베이스에 대해 검색함으로써 결정된다. 서열 동일성은 서열의 전체 길이에 걸친 서열 동일성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, RNA에 관하여 "구조화된"은 동일한 RNA 분자에서 그 자신 또는 다른 서열을 갖는 구조(예를 들어, 헤어핀 루프)를 형성하도록 RNAFold 소프트웨어 또는 유사한 예측 도구에 의해 예측되는 RNA 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상체"라는 용어는 유기체, 예컨대 동물, 식물, 또는 미생물을 지칭한다. 실시 형태에서, 대상체는 척추 동물(예를 들어, 포유동물, 조류, 어류, 파충류, 또는 양서류)이다. 실시 형태에서, 대상체는 인간이다. 실시 형태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 실시 형태에서, 대상체는 비-인간 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 유인원), 유제류(예를 들어, 소, 버팔로, 비손, 양, 염소, 돼지, 낙타, 라마, 알파카, 사슴, 말, 당나귀), 육식동물(예를 들어, 개, 고양이), 설치류(예를 들어, 래트, 마우스), 또는 토끼목(예를 들어, 토끼)이다. 실시 형태에서, 대상체는 조류, 예컨대 조류 분류군 순계목(예를 들어, 닭, 칠면조, 꿩, 메추라기), 기러기목(예를 들어, 오리, 거위), 고관목(예를 들어, 타조, 에뮤), 비둘기목(예를 들어, 피존, 도브), 또는 앵무새목(예를 들어, 앵무새)의 구성원이다. 실시 형태에서, 대상체는 무척추동물, 예컨대 절지동물(예를 들어, 곤충류, 거미류, 갑각류), 선충, 환형동물, 연충, 또는 연체동물이다. 실시 형태에서, 대상체는 무척추동물 농업적 해충 또는 무척추동물 또는 척추동물 숙주 상에 기생하는 무척추동물이다. 실시 형태에서, 대상체는 식물, 예컨대 피자 식물(쌍자엽 또는 단자엽일 수 있음) 또는 나자 식물(예를 들어, 침엽수, 소철류, 마황문, 은행나무), 양치식물, 쇠뜨기, 석송, 또는 선태식물이다. 실시 형태에서, 대상체는 진핵 조류(단세포 또는 다세포)이다. 실시 형태에서, 대상체는 농업적으로 또는 원예적으로 중요한 식물, 예컨대 줄뿌림 작물 식물, 과실-생산 식물 및 나무, 채소, 나무, 및 관상용 꽃, 관목, 나무, 지표식물, 및 잔디풀을 포함하는 관상용 식물이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하다" 및 "치료하는 것"이라는 용어는 대상체에서의 질환 또는 장애(예를 들어, 감염성 질환, 암, 독성, 또는 알레르기 반응)의 예방적 또는 치료적 치료를 지칭한다. 치료의 효과는 치료적 치료의 부재 하에서의 질환 또는 장애의 상태 또는 상태와 비교하여, 질환, 또는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 징후를 반전시키는 것, 경감시키는 것, 그의 중증도를 감소시키는 것, 치유하는 것, 그의 진행을 억제하는 것, 그의 재발의 가능성을 감소시키는 것, 질환 또는 장애의 상태를 안정화시키는 것(즉, 악화시키지 않는 것), 또는 질환 또는 장애의 확산을 방지하는 것을 포함할 수 있다. 실시 형태는 무척추동물 해충 또는 미생물(예를 들어, 박테리아, 진균, 난균류, 또는 바이러스) 병원체에 의해 유발되거나 그와 관련된 질환 또는 유해 상태를 제어하기 위해 식물을 치료하는 것을 포함한다. 실시 형태는 해충 또는 병원체 압력을 내성화시키는 식물의 선천적 방어 또는 면역 능력을 증가시키기 위해 식물을 치료하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "종결 요소"는 원형 또는 선형 폴리리보뉴클레오티드에서 발현 서열의 번역을 종결시키는 모이어티, 예컨대 핵산 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, "번역 효율"은 리보뉴클레오티드 전사체로부터의 단백질 또는 펩티드 생성의 속도 또는 양이다. 일부 실시 형태에서, 번역 효율은 예를 들어, 주어진 기간에, 예를 들어, 주어진 번역 시스템, 예를 들어, 토끼 망상적혈구 용해물과 같은 무세포 번역 시스템에서, 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 전사체의 주어진 양당 생성된 단백질 또는 펩티드의 양으로서 표현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "번역 개시 서열"은 원형 또는 선형 폴리리보뉴클레오티드에서 발현 서열의 번역을 개시시키는 핵산 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 폴리펩티드"는 대상체에게 투여되거나 대상체에서 발현되는 경우 일부 치료적 이익을 제공하는 폴리펩티드를 지칭한다. 실시 형태에서, 치료 폴리펩티드는 대상체에의 치료 펩티드의 투여에 의해 또는 치료 폴리펩티드의 대상체에서의 발현에 의해 대상체에서 질환, 장애, 또는 상태를 치료하거나 예방하는 데 사용된다. 대안적인 실시 형태에서, 치료 폴리펩티드는 세포에서 발현되고, 세포는 대상체에게 투여되어 치료 이익을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 외래 DNA 단편이 클로닝 또는 발현 목적을 위해 삽입될 수 있거나 삽입된 합성된(예를 들어, PCR을 사용하여), 또는 바이러스, 플라스미드, 또는 고등 유기체의 세포로부터 취해진 DNA의 조각을 의미한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 유기체에서 안정하게 유지될 수 있다. 벡터는 예를 들어, 복제 기점, 선택가능한 마커 또는 리포터 유전자, 예컨대 항생제 저항성 또는 GFP, 또는 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있다. 상기 용어는 선형 DNA 단편(예를 들어, PCR 생성물, 선형화된 플라스미드 단편), 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드, 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 등을 포함한다. 한 실시 형태에서, 본원에서 제공된 벡터는 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원에서 제공된 벡터는 MCS를 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "수율"이라는 용어는 출발 물질(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드, 예컨대, 예를 들어, 원형 및 선형 폴리리보뉴클레오티드의 혼합된 집단) 내의 분석물의 양과 비교하여 정제 단계 또는 공정 후에 수득된 분석물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 집단)의 상대적 양(w/w)을 지칭한다. 수율은 백분율로서 표현될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 출발 물질 내의 분석물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드) 및 정제 단계 후에 수득된 분석물의 양은 검정(예를 들어, 겔 전기영동 또는 분광광도법)을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 방법은 출발 물질, 예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드의 혼합된 집단에 존재하는 양에 비해 약 20%(w/w) 또는 그 초과의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 풍부화된 집단의 수율을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법은 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%(w/w) 또는 그 초과의 정제된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수율을 생성하는 데 사용될 수 있다.
도 1은 본원에 기재된 바와 같은 방법을 보여주는 개략도이다. 좌측에는 선형 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물이 있으며, 그의 일부는 표적 영역을 함유한다. 제1 포획제에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드는 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물에 첨가되고, 표적 영역을 함유하는 폴리리보뉴클레오티드에 혼성화한다. 입자에 컨쥬게이트된 제2 포획제는 제1 포획제에 결합하고, 그에 의해 표적 영역을 결여한 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 함유하는 폴리리보뉴클레오티드를 분리한다.
도 2는 원형 RNA가 자기-스플라이싱에 의해 생성된 시험관내 전사(IVT) 혼합물 내의 선형 부산물을 보여주는 겔이다. 겔은 원하는 원형 RNA 생성물, 비스플라이싱된 선형 RNA, 부분적으로 스플라이싱된 선형 RNA, 니킹된 원형 RNA, 및 스플라이싱된 인트론을 보여준다.
도 3은 자기-스플라이싱에 의해 생성된 원형 RNA로부터 선형 RNA 부산물을 제거하는 방법의 설계를 보여주는 개략도이다.
도 4는 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA의 풍부화를 보여주는 겔이다. 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. 오픈 리딩 프레임(ORF)은 모델 단백질: 가우시아 루시페라제(Gluc)이다.
도 5는 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA의 풍부화를 보여주는 겔이다. 구축물을 5'에서 3'로 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. ORF는 반딧불이 루시페라제(Fluc)이다.
도 6은 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA의 풍부화를 보여주는 겔이다.
도 7은 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA의 풍부화를 위한 2가지 상이한 접근법을 보여주는 겔이다. 한 방법은 RNA-올리고 혼합물을 튜브에서 스트렙타비딘-SEPHAROSE® 비드와 인큐베이션하는 것(회분식 방법)이고, 다른 것은 비드를 칼럼에서 사전패킹하고, 중력에 의해 RNA-올리고머 혼합물을 통해 통과시키는 것(칼럼 방법)이다.
도 8은 연이은 선형 RNA 풀 다운(pull down)에 의한 원형 RNA의 추가의 풍부화를 보여주는 겔이다.
도 9의 A 및 9의 B는 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA 풍부화에 대한 결합 완충제 내의 염 농도의 효과를 보여주는 겔이다. 도 9의 A는 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계된 구축물을 보여준다. ORF는 hEPO이다. 도 9의 B는 도 9의 A와 유사한 구축물을 보여주지만, ORF는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(스파이크)이다.
도 10은 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA를 풍부화하기 위한 선형 RNA 풀 다운 방법에 의해 정제된 원형 RNA로부터의 증진된 발현을 보여주는 겔이다. 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. ORF는 모델 단백질: 가우시아 루시페라제(Gluc)이다.
도 11은 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA를 풍부화하기 위한 선형 RNA 풀 다운 방법에 의해 정제된 원형 RNA로부터의 증진된 발현을 보여주는 겔이다. 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. ORF는 hEPO이다.
도 12는 본원에 기재된 선형 풀-다운 방법에 사용된 3' 절반-인트론(#1 내지 #4)에 대한 및 5' 절반-인트론(#5 및 #6)에 대한 예시적인 올리고머 설계를 보여주는 개략도이다.
도 13의 A 및 13의 B는 감소된 수의 올리고머를 사용하여 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 선형 RNA 풀 다운에 의한 원형 RNA 풍부화에 대한 효과를 보여주는 겔이다.
도 14의 A 및 14의 B는 2개의 올리고(즉, 3' 절반-인트론에 대한 올리고머 및 5' 절반-인트론에 대한 올리고머)의 조합을 사용하여 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 선형 RNA 풀 다운에 의한 원형 RNA 풍부화에 대한 효과를 보여주는 겔이다.
도 15는 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA를 풍부화하기 위한 선형 RNA 풀 다운 방법에 의해 정제된 원형 RNA로부터의 발현을 보여주는 막대 그래프이다.
도 16은 3' 절반-인트론 및 5' 절반-인트론 둘 모두를 표적화하는 예시적인 단일 올리고머를 보여주는 개략도이다.
도 17의 A 및 17의 B는 3' 절반-인트론 및 5' 절반-인트론 둘 모두를 표적화하는 단일 올리고머를 사용하여 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 선형 RNA 풀 다운에 의한 원형 RNA 풍부화에 대한 효과를 보여주는 겔이다.
본 발명은 리보뉴클레오티드를 프로세싱하기 위한, 예를 들어, 정제하기 위한 조성물 및 방법을 기재한다. 폴리리보뉴클레오티드, 예컨대 선형 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 다양한 조작 또는 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 폴리리보뉴클레오티드가 특정 생물학적 반응을 통해 생성되는 경우, 다양한 불순물, 부산물, 또는 불완전한 생성물이 존재할 수 있다. 본 발명은 원하는 폴리리보뉴클레오티드 조성물, 양, 및/또는 순도를 갖는 조성물, 또는 원하는 폴리리보뉴클레오티드 조성물, 양, 및/또는 순도를 갖는 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 함유하는 집단을 생성하기 위해 샘플로부터 이들 불순물, 부산물, 또는 불완전한 생성물을 감소시키거나 제거하는 데 유용한 방법을 특색으로 한다.
특정 실시 형태에서, 방법은 스플라이싱 반응을 겪은 폴리리보뉴클레오티드를 정제하는 데 유용하다. 이러한 실시 형태에서, 방법은 비-스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드로부터 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드를, 또는 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드로부터 비-스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 방법은 선형 폴리리보뉴클레오티드로부터 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 스플라이싱되었음)를, 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 데 사용될 수 있다. 원하는 폴리리보뉴클레오티드를 함유하는 이러한 정제된 조성물은 다양한 하류 적용에, 예컨대 폴리뉴클레오티드 카고(예를 들어, 유전자 또는 단백질을 코딩함)를 표적 세포에 전달하는 데 유용할 수 있다. 조성물 및 방법은 하기에 보다 상세하게 기재된다.
방법
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 포함한다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 것을 포함한다. 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 하위세트는 표적 영역을 갖는다. 방법은 샘플을 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 샘플 내의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 추가로 포함한다(도 1).
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 선형 폴리리보뉴클레오티드 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함한다. 이 방법에서, 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플이 제공된다. 샘플 내의 복수개의 선형 폴리리보뉴클레오티드의 하위세트는 표적 영역을 갖는다. 방법은 샘플을 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 샘플 내의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드는 폴리A 서열(예를 들어, 폴리A 꼬리)을 결여한다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 위치하지 않는다. 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 그의 하위세트는 표적 영역을 결여할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함한다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 것을 포함하고, 여기서 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 하위세트는 표적 영역을 갖는다. 표적 영역은 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 위치하지 않는다(예를 들어, 표적 영역은 폴리리보뉴클레오티드 상에서 내부적으로 위치한다). 방법은 샘플을 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 샘플 내의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 표적 영역에 대한 차등적 결합 친화도에 의해 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 포함한다. 차등적 결합은 표적 결합 영역이 결합을 위한 표적 부위에의 접근을 조정하는 차등적 2차 구조적 요소 내에 존재하는 경우 달성될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 제1 친화도로 제1 구조적 형태의 폴리리보뉴클레오티드의 표적 영역에, 및 예를 들어, 제1 친화도와는 상이한 제2 친화도로 제2 구조적 형태의 폴리리보뉴클레오티드의 표적 영역에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 차등적 결합 또는 2차 구조적 요소는 표적 영역이 선형 대 원형 폴리리보뉴클레오티드 내에, 또는 2개 이상의 별개의 구조적 형태로 존재하는 폴리리보뉴클레오티드에 존재하는 경우 일어날 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도로 선형 폴리리보뉴클레오티드의 표적 영역에, 및 제2 결합 친화도로 원형 폴리리보뉴클레오티드의 표적 영역에 결합할 수 있다. 제1 결합 친화도는 제2 결합 친화도보다 더 클 수 있다. 대안적으로, 제1 결합 친화도는 제2 결합 친화도보다 더 작을 수 있다. 더 낮은 결합 친화도는 올리고뉴클레오티드가 예를 들어, 더 큰 결합 친화도를 갖는 형태의 표적에 비해, 표적에 우선적으로 결합하는 것을 허용한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 표적 영역을 갖는 제2 형태의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 포함한다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 것을 포함한다. 방법은 샘플을 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도로 제1 형태의 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하고, 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도와는 상이한 제2 결합 친화도로 제2 형태의 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하며, 샘플 내의 제2 형태의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드를 분리한다. 일부 실시 형태에서, 제1 결합 친화도는 제2 결합 친화도보다 더 작고, 올리고뉴클레오티드는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드에 우선적으로 결합한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 (예를 들어, 포획제로 또는 포획제 없이) 폴리리보뉴클레오티드를 입자에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 표적 영역을 갖는 복수개의 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함한다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 것을 포함한다. 방법은 샘플을 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도로 선형 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하고, 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도와는 상이한 제2 결합 친화도로 원형 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하며, 샘플 내의 복수개의 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 (예를 들어, 포획제로 또는 포획제 없이) 폴리리보뉴클레오티드를 입자에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 제1 포획제에 컨쥬게이트된다. 일부 실시 형태에서, 방법은 제1 포획제에 결합하는 제2 포획제를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 제2 포획제는 입자에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 포획제는 입자에 컨쥬게이트된다.
일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 입자에 컨쥬게이트된다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함한다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플 및 제1 포획제에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다. 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 하위세트는 표적 영역을 갖고, 올리고뉴클레오티드는 표적 영역에 혼성화한다. 방법은 샘플을 제1 포획제에 결합하는 제2 포획제와 접촉시키고, 샘플 내의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 제2 형태의 표적 영역을 갖는 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함한다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플 및 제1 포획제에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도로 제1 형태의 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하고, 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도와는 상이한 제2 결합 친화도로 제2 형태의 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화한다. 방법은 샘플을 제1 포획제에 결합하는 제2 포획제와 접촉시키고, 샘플 내의 제2 형태의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 결합 친화도는 제2 결합 친화도보다 더 작고, 올리고뉴클레오티드는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드에 우선적으로 결합한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 표적 영역을 포함하는 복수개의 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함한다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플 및 제1 포획제에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도로 선형 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하고, 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도와는 상이한 제2 결합 친화도로 원형 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화한다. 방법은 샘플을 제1 포획제에 결합하는 제2 포획제와 접촉시키고, 샘플 내의 복수개의 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 예를 들어, 제1 또는 제2 포획제 없이 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 입자에 직접적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 방법은 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플 및 입자에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다. 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 하위세트는 표적 영역을 갖고, 올리고뉴클레오티드는 표적 영역에 혼성화한다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 위치하지 않는다. 예를 들어, 표적 영역은 폴리리보뉴클레오티드 상에서 내부적으로 위치할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 폴리리보뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하지 않는다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 폴리리보뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 위치하고, 표적 영역은 폴리A 서열을 함유하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 폴리리보뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하고, 폴리A 서열을 함유하지 않는다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 폴리A 서열(예를 들어, 폴리A 꼬리)을 함유하지 않는다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 분리는 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 것을 포함한다. 방법은 예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 제1 포획제, 제2 포획제, 입자, 또는 이들의 조합을 고정화하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자는 자기 입자이다. 방법은 자기 입자에 힘, 예컨대 자기적 힘을 인가하는 것을 포함할 수 있다. 입자 또는 비드는 예를 들어, 가교된 아가로스, 예를 들어, SEPHAROSE® 비드일 수 있다. 방법은 비드 또는 입자에 힘, 예컨대 기계적, 광학적, 원심분리적, 또는 음향적 힘을 인가하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드는 인트론 또는 그의 부분(예를 들어, 절반-인트론)을 포함한다. 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 인트론 또는 그의 부분은 촉매 인트론(예를 들어, 그룹 I 촉매 인트론 또는 그룹 II 촉매 인트론) 또는 그의 부분이다. 일부 실시 형태에서, 인트론 또는 그의 부분은 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 인트론 또는 그의 부분은 20 내지 500개, 20 내지 400개, 20 내지 300개, 20 내지 200개, 20 내지 100개, 50 내지 500개, 50 내지 400개, 50 내지 300개, 50 내지 200개, 100 내지 500개, 100 내지 400개, 100 내지 300개, 또는 100 내지 200개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 표적 영역은 절반-인트론(예를 들어, 촉매 인트론의 5' 또는 3' 부분)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 5' 절반-인트론(예를 들어, 촉매 인트론의 5' 부분에 상응하는 5' 절반-인트론)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 3' 절반-인트론(예를 들어, 촉매 인트론의 3' 부분에 상응하는 3' 절반-인트론)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 그룹 I 촉매 인트론의 5' 절반을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 그룹 I 촉매 인트론의 5' 절반은 시아노박테리아 아나바에나 프리-tRNA-Leu 유전자, 테트라히메나 프리-rRNA, T4 파지 td 유전자, 또는 그의 변이체의 5' 부분으로부터의 것이다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 그룹 I 촉매 인트론의 3' 절반을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 그룹 I 촉매 인트론의 3' 절반은 시아노박테리아 아나바에나 프리-tRNA-Leu 유전자, 테트라히메나 프리-rRNA, T4 파지 td 유전자, 또는 그의 변이체의 3' 부분으로부터 선택된다.
본원에 기재된 바와 같이, 방법은 예를 들어, 비-스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드로부터 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 비-스플라이싱된 또는 부분적으로 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드로부터 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 실시 형태에서, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 실시 형태에서, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 생성 동안 스플라이싱(예를 들어, 자기-스플라이싱) 사건 후에 인트론 또는 그의 부분을 결여한다. 일부 실시 형태에서, 인트론 또는 그의 부분을 갖는 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드이다.
일부 실시 형태에서, 방법은 표적 영역 및/또는 포획제(예를 들어, 제1 및/또는 제2 포획제)를 갖는 포획된 폴리리보뉴클레오티드를 1회 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5회, 또는 그 초과) 세척하는 것을 추가로 포함한다. 세척은 접촉 단계 후에 및/또는 분리 단계 후에 일어날 수 있다.
일부 실시 형태에서, 방법은 제1 용리 단계를 수행하여 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역 및/또는 포획제(예를 들어, 제1 및/또는 제2 포획제)를 포함하는 포획된 폴리리보뉴클레오티드를 방출시키는 것을 추가로 포함한다. 제1 용리 단계는 제1 완충제를 첨가하고/거나 샘플을 예를 들어, 적어도 50 ℃, 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃, 70 ℃, 75 ℃, 80 ℃, 또는 그 초과까지 가열하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 방법은 제2 용리 단계를 수행하는 것을 추가로 포함한다. 제2 용리 단계는 제2 완충제를 첨가하고/거나 샘플을 예를 들어, 적어도 50 ℃, 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃, 70 ℃, 75 ℃, 80 ℃, 또는 그 초과까지 가열하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제2 완충제는 변성제, 예를 들어, 포름아미드 또는 우레아를 포함한다. 제2 완충제는 예를 들어, 약 40% 내지 약 60% 포름아미드(예를 들어, 약 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 60% 포름아미드)를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 방법은 샘플을 적어도 10분(예를 들어, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120분, 또는 그 초과) 동안 올리고뉴클레오티드 및/또는 포획제(예를 들어, 제1 및/또는 제2 포획제)와 인큐베이션하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 포획제(예를 들어, 제1 및/또는 제2 포획제) 및/또는 올리고뉴클레오티드에 의해 결합되지 않은 샘플의 부분을 수집하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 복수개의 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함하고, 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드는 별개의 표적 영역에 혼성화한다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 제1 포획제 또는 입자, 예를 들어, 자기 입자 또는 비드에 컨쥬게이트될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 방법은 다수의 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 3' 절반 인트론 및 5' 절반 인트론에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 3' 절반-인트론에 혼성화하는 제1 올리고뉴클레오티드 및 5' 절반-인트론에 혼성화하는 제2 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 각각 3' 절반-인트론 및/또는 5' 절반-인트론 상의 별개의 영역에 혼성화하는 복수개의 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 올리고뉴클레오티드를 폴리리보뉴클레오티드에 대해 10:1 내지 1:10(예를 들어, 10:1, 5:1, 2:1, 1:2, 1:5, 또는 1:10)의 몰비로 제공하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 입자, 예를 들어, 비드, 예를 들어, 자기 비드의 샘플을 제공하는 것을 포함한다. 입자는 용기, 예를 들어, 미세원심분리 튜브에 존재하거나, 칼럼에 패킹될 수 있다. 입자는 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이트될 수 있다. 방법은 (예를 들어, 제1 포획제에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드와) 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물을 입자를 함유하는 칼럼 상으로 유동시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 의해 결합된 폴리리보뉴클레오티드는 칼럼에 결합할 것이다. 일부 실시 형태에서, 입자는 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이트된 제1 포획제에 결합하도록 구성된 제2 포획제에 컨쥬게이트된다. 다른 실시 형태에서, 입자는 예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 컨쥬게이트된다.
일부 실시 형태에서, 예를 들어, 자기 입자를 사용하는 경우, 방법은 자기 입자를 예를 들어, 용기(예를 들어, 미세원심분리 튜브)에서 영구 자석을 제공함으로써 펠릿화하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 샘플 내의 원하는 폴리리보뉴클레오티드의 양을 풍부화한다. 예를 들어, 방법은 정제 전의 샘플에 비해 원하는(예를 들어, 스플라이싱된) 폴리리보뉴클레오티드의 양을 적어도 10%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 그 초과) 풍부화할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 정제 방법은 50%(mol/mol) 미만(예를 들어, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%(mol/mol) 미만)의 선형 폴리리보뉴클레오티드를 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 발생시킨다.
올리고뉴클레오티드
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 폴리리보뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하도록 구성된다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 영역의 동등한 길이 부분과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 상보성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 폴리리보뉴클레오티드의 표적 영역에 대해 많아야 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 미스매치를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 영역에 대한 미스매치를 갖지 않는다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 변형된 포스페이트, 당, 또는 염기를 가짐)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 영역에 혼성화하도록 구성된 부분 및 표적 영역(예를 들어, 말단 영역)에 혼성화하지 않는 부분을 함유한다.
올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 적어도 5개의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드)의 길이일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 5~100개, 5~95개, 10~90개, 10~80개, 12~60개, 15~50개, 15~40개, 15~30개, 18~30개, 20~25개, 또는 20~22개의 뉴클레오티드의 길이이다.
올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 30~70%, 예를 들어, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 또는 70%의 GC 함량을 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 약 45 ℃ 내지 약 75 ℃, 예를 들어, 약 46 ℃, 47 ℃, 48 ℃, 49 ℃, 50 ℃, 51 ℃, 52 ℃, 53 ℃, 54 ℃, 55 ℃, 56 ℃, 57 ℃, 58 ℃, 59 ℃, 60 ℃, 61 ℃, 62 ℃, 63 ℃, 64 ℃, 65 ℃, 66 ℃, 67 ℃, 68 ℃, 69 ℃, 70 ℃, 71 ℃, 72 ℃, 73 ℃, 74 ℃, 또는 75 ℃의 용융 온도(Tm)를 가질 수 있다.
포획제
본원에 기재된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 및/또는 입자는 포획제에 컨쥬게이트될 수 있다. 포획제는 표적 분자에 결합하도록, 예를 들어, 이를 포획하도록 구성된다. 포획제 또는 포획제의 세트, 예를 들어, 제1 및/또는 제2 포획제는 임의의 친화성 쌍, 예컨대 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 항원을 포함할 수 있다. 유사하게, 친화성 쌍은 수용체 또는 그의 단편 및 그의 동종체 리간드를 포함할 수 있다. 제1 포획제 및 제2 포획제는 공유 또는 비공유(예를 들어, 이온성 또는 반 데르 발스 힘) 상호작용을 허용하는 충분한 결합 에너지로 상호작용하도록 구성된 임의의 2개의 분자일 수 있다.
본원에 기재된 조성물 또는 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 제1 포획제에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 포획제는 항원을 포함한다. 항원은 예를 들어, 비오틴일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 포획제 또는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 포획제에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드)는 제2 포획제에 의해 결합되거나 결합되도록 구성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제2 포획제는 예를 들어, 항원에 결합하도록 구성된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 제2 포획제는 예를 들어, 스트렙타비딘일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 제1 포획제에 컨쥬게이트되지 않거나 이를 포함하지 않고, 제2 포획제는 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 결합한다.
일부 실시 형태에서, 제1 포획제는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 실시 형태에서, 제2 포획제는 항원이다.
입자
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 및/또는 포획제는 입자, 예를 들어, 자기 입자 또는 비드에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 및/또는 포획제는 복수개의 입자에 컨쥬게이트된다. 일부 실시 형태에서, 입자는 복수개의 포획제 및/또는 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이트된다.
자기 입자는 자기적 힘에 반응성인 적어도 하나의 성분을 포함한다. 자기 입자는 전체적으로 자성일 수 있거나, 비-자성인 성분을 함유할 수 있다. 자기 입자는 자기 비드, 예를 들어, 실질적으로 구형 자기 비드일 수 있다. 자기 입자는 전체적으로 자성일 수 있거나, 하나 이상의 표적 분자에 결합하기 위한 하나 이상의 추가적인 물질, 예컨대, 예를 들어, 하나 이상의 관능기 및/또는 변형에 의해 둘러싸인 하나 이상의 자기 코어를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 자기 입자는 자기 성분, 및 하나 이상의 실란올 기로 변형된 표면을 함유할 수 있다. 이 유형의 자기 입자는 표적 핵산 분자에 결합하는 데 사용될 수 있다.
입자, 예를 들어, 자기 입자 또는 비드는 다공성, 비-다공성, 중공, 고체, 반-고체, 반-유체성, 유체성, 및/또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 입자, 예를 들어, 비드는 용해 가능하거나 분해 가능할 수 있다. 일부 경우에, 입자, 예를 들어, 비드는 분해 가능하지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비드는 가교된 아가로스, 예를 들어, SEPHAROSE®로 구성된다.
입자, 예를 들어, 자기 입자 또는 비드는 천연 및/또는 합성 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 입자, 예를 들어, 비드는 천연 중합체, 합성 중합체 또는 천연 및 합성 중합체 둘 모두를 포함할 수 있다. 천연 중합체의 예는 단백질 및 당, 예컨대 데옥시리보핵산, 고무, 셀룰로스, 전분(예를 들어, 아밀로스, 아밀로펙틴), 단백질, 효소, 다당류, 실크, 폴리히드록시알카노에이트, 키토산, 덱스트란, 콜라겐, 카라기난, 이스파굴라, 아카시아, 아가, 젤라틴, 셸락, 스테르쿨리아 검, 크산탄 검, 옥수수 당 검, 구아 검, 검 카라야, 아가로스, 알긴산, 알기네이트, 또는 이들의 천연 중합체를 포함한다. 합성 중합체의 예는 아크릴, 나일론, 실리콘, 스판덱스, 점성 레이온, 폴리카르복실산, 폴리비닐 아세테이트, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리우레탄, 폴리락트산, 실리카, 폴리스티렌, 폴리아크릴로니트릴, 폴리부탄디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리(클로로트리플루오로에틸렌), 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리에틸렌, 폴리이소부틸렌, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(옥시메틸렌), 폴리포름알데히드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리(테트라플루오로에틸렌), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐 클로라이드), 폴리(비닐리덴 디클로라이드), 폴리(비닐리덴 디플루오라이드), 폴리(비닐 플루오라이드) 및/또는 이들의 조합(예를 들어, 공중합체)을 포함한다. 비드는 또한 지질, 미셀, 세라믹, 유리-세라믹, 물질 복합체, 금속, 기타 무기 물질 등을 포함하는 중합체 이외의 물질로부터 형성될 수 있다.
가교는 사용되는 특정 가교제에 따라 영구적이거나 가역적일 수 있다. 가역적 가교는 중합체가 적절한 조건 하에서 선형화하거나 해리하는 것을 허용할 수 있다. 일부 경우에, 가역적 가교는 또한 비드의 표면에 결합된 물질의 가역적 부착을 허용할 수 있다.
입자, 예를 들어, 비드 또는 자기 입자는 균일한 크기 또는 이질적 크기의 것일 수 있다. 일부 경우에, 입자, 예를 들어, 비드의 직경은 적어도 약 1 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 250 μm, 500 μm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 또는 그 초과일 수 있다. 일부 경우에, 입자, 예를 들어, 비드는 약 1 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 250 μm, 500 μm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm 미만 또는 그 미만의 직경을 가질 수 있다. 일부 경우에, 입자, 예를 들어, 비드는 약 40~75 μm, 30~75 μm, 20~75 μm, 40~85 μm, 40~95 μm, 20~100 μm, 10~100 μm, 1~100 μm, 20~250 μm, 또는 20~500 μm, 500 μm~1 mm, 1 mm~2 mm, 1~5 mm, 또는 1~10 mm의 범위의 직경을 가질 수 있다.
입자는 임의의 적합한 형상의 것일 수 있다. 입자, 예를 들어, 자기 입자 또는 비드 형상의 예는 구형, 비-구형, 계란형, 직사각형, 비정형, 원형, 원통형, 및 이들의 변형을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
링커
일부 실시 형태에서, 링커는 본원에 기재된 조성물 또는 방법에 사용되는 2개 이상의 성분을 컨쥬게이트하는 데 사용된다. 예를 들어, 링커는 올리고뉴클레오티드를 포획제에, 포획제를 입자(예를 들어, 비드)에, 올리고뉴클레오티드를 입자(예를 들어, 비드)에 컨쥬게이트하는 데, 또는 이들의 임의의 조합 또는 변형에 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 화학적 링커로 제1 포획제에 컨쥬게이트된다. 화학적 링커는 올리고뉴클레오티드의 3' 단부 또는 5' 단부에 컨쥬게이트될 수 있다. 대안적으로, 화학적 링커는 올리고뉴클레오티드의 내부 영역에 컨쥬게이트될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제2 포획제는 입자에 컨쥬게이트된다. 입자는 예를 들어, 자기 입자 또는 비드일 수 있다. 비드는 예를 들어, 가교된 아가로스, 예를 들어, SEPHAROSE® 비드일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드는 입자(예를 들어, 비드, 예를 들어, 자기 비드 또는 가교된 아가로스, 예를 들어, SEPHAROSE® 비드)에 직접적으로 컨쥬게이트된다.
화학적 링커는 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와 포획제(예를 들어, 제1 포획제) 및/또는 포획제(예를 들어, 제2 포획제)와 입자 사이에 공간, 강성, 및/또는 유연성을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 결합, 예를 들어, 공유 결합, 예를 들어, 아미드 결합, 디술피드 결합, C-O 결합, C-N 결합, N-N 결합, C-S 결합, 또는 화학적 반응, 예를 들어, 화학적 컨쥬게이션으로부터 생성된 임의의 종류의 결합일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 250개 이하의 원자(예를 들어, 1~2개, 1~4개, 1~6개, 1~8개, 1~10개, 1~12개, 1~14개, 1~16개, 1~18개, 1~20개, 1~25개, 1~30개, 1~35개, 1~40개, 1~45개, 1~50개, 1~55개, 1~60개, 1~65개, 1~70개, 1~75개, 1~80개, 1~85개, 1~90개, 1~95개, 1~100개, 1~110개, 1~120개, 1~130개, 1~140개, 1~150개, 1~160개, 1~170개, 1~180개, 1~190개, 1~200개, 1~210개, 1~220개, 1~230개, 1~240개, 또는 1~250개의 원자(들); 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 원자(들))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 250개 이하의 비-수소 원자(예를 들어, 1~2개, 1~4개, 1~6개, 1~8개, 1~10개, 1~12개, 1~14개, 1~16개, 1~18개, 1~20개, 1~25개, 1~30개, 1~35개, 1~40개, 1~45개, 1~50개, 1~55개, 1~60개, 1~65개, 1~70개, 1~75개, 1~80개, 1~85개, 1~90개, 1~95개, 1~100개, 1~110개, 1~120개, 1~130개, 1~140개, 1~150개, 1~160개, 1~170개, 1~180개, 1~190개, 1~200개, 1~210개, 1~220개, 1~230개, 1~240개, 또는 1~250개의 비-수소 원자(들); 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 비-수소 원자(들))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커의 백본은 250개 이하의 원자(예를 들어, 1~2개, 1~4개, 1~6개, 1~8개, 1~10개, 1~12개, 1~14개, 1~16개, 1~18개, 1~20개, 1~25개, 1~30개, 1~35개, 1~40개, 1~45개, 1~50개, 1~55개, 1~60개, 1~65개, 1~70개, 1~75개, 1~80개, 1~85개, 1~90개, 1~95개, 1~100개, 1~110개, 1~120개, 1~130개, 1~140개, 1~150개, 1~160개, 1~170개, 1~180개, 1~190개, 1~200개, 1~210개, 1~220개, 1~230개, 1~240개, 또는 1~250개의 원자(들); 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 원자(들))를 포함한다. 링커의 "백본"은 컨쥬게이트의 한 부분에서 컨쥬게이트의 또 다른 부분까지의 가장 짧은 경로를 함께 형성하는 링커 내의 원자를 지칭한다. 링커의 백본 내의 원자는 컨쥬게이트의 한 부분을 컨쥬게이트의 또 다른 부분에 연결시키는 데 직접적으로 관여한다. 예를 들어, 링커의 백본 내의 탄소에 부착된 수소 원자는 컨쥬게이트의 한 부분을 컨쥬게이트의 또 다른 부분에 연결시키는 데 직접적으로 관여하는 것으로 간주되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 링커는 예를 들어, 합성 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체)로부터 유래된 합성 기를 포함할 수 있다. 화학적 링커는 예를 들어, 트리에틸렌 글리콜(TEG)을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 아미노산 서열(예를 들어, 1~25 아미노산, 1~10 아미노산, 1~9 아미노산, 1~8 아미노산, 1~7 아미노산, 1~6 아미노산, 1~5 아미노산, 1~4 아미노산, 1~3 아미노산, 1~2 아미노산, 또는 1 아미노산 서열)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 하나 이상의 임의적으로 치환된 C1-C20 알킬렌, 임의적으로 치환된 C1-C20 헤테로알킬렌(예를 들어, PEG 단위), 임의적으로 치환된 C2-C20 알케닐렌(예를 들어, C2 알케닐렌), 임의적으로 치환된 C2-C20 헤테로알케닐렌, 임의적으로 치환된 C2-C20 알키닐렌, 임의적으로 치환된 C2-C20 헤테로알키닐렌, 임의적으로 치환된 C3-C20 시클로알킬렌(예를 들어, 시클로프로필렌, 시클로부틸렌), 임의적으로 치환된 C2-C20 헤테로시클로알킬렌, 임의적으로 치환된 C4-C20 시클로알케닐렌, 임의적으로 치환된 C4-C20 헤테로시클로알케닐렌, 임의적으로 치환된 C8-C20 시클로알키닐렌, 임의적으로 치환된 C8-C20 헤테로시클로알키닐렌, 임의적으로 치환된 C5-C15 아릴렌(예를 들어, C6 아릴렌), 임의적으로 치환된 C3-C15 헤테로아릴렌(예를 들어, 이미다졸, 피리딘), O, S, NRi(Ri는 H, 임의적으로 치환된 C1-C20 알킬, 임의적으로 치환된 C1-C20 헤테로알킬, 임의적으로 치환된 C2-C20 알케닐, 임의적으로 치환된 C2-C20 헤테로알케닐, 임의적으로 치환된 C2-C20 알키닐, 임의적으로 치환된 C2-C20 헤테로알키닐, 임의적으로 치환된 C3-C20 시클로알킬, 임의적으로 치환된 C2-C20 헤테로시클로알킬, 임의적으로 치환된 C4-C20 시클로알케닐, 임의적으로 치환된 C4-C20 헤테로시클로알케닐, 임의적으로 치환된 C8-C20 시클로알키닐, 임의적으로 치환된 C8-C20 헤테로시클로알키닐, 임의적으로 치환된 C5-C15 아릴, 또는 임의적으로 치환된 C3-C15 헤테로아릴임), P, 카르보닐, 티오카르보닐, 술포닐, 포스페이트, 포스포릴, 또는 이미노를 포함할 수 있다.
링커를 사용한 컨쥬게이트 내의 2개 이상의 성분의 공유 컨쥬게이션은 잘 알려진 유기 화학적 합성 기법 및 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 성분 상의 상보적 관능기는 서로와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다. 상보적 반응성 관능기의 예는 예를 들어, 말레이미드 및 시스테인, 아민 및 활성화된 카르복실산, 티올 및 말레이미드, 활성화된 술폰산 및 아민, 이소시아네이트 및 아민, 아지드 및 알킨, 및 알켄 및 테트라진을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 폴리펩티드에의 부위-특이적 컨쥬게이션은 당업계에 알려진 기법을 사용하여 달성될 수 있다.
조성물
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된 폴리리보뉴클레오티드의 집단을 포함하는 조성물을 특색으로 한다. 집단은 예를 들어, 표적 영역을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 조성물 내의 총 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 1%(예를 들어, 적어도 5%, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 그 초과)(mol/mol)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 집단은 조성물 내에 50% 미만(예를 들어, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만)(mol/mol) 선형 폴리리보뉴클레오티드를 갖는다.
다른 실시 형태에서, 집단은 예를 들어, 표적 영역을 갖는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드, 및 표적 영역을 갖는 제2 형태의 폴리리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드는 조성물 내의 총 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 1%, 예를 들어, 적어도 5%, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 또는 적어도 40%(예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 그 초과)(mol/mol)를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 일부 실시 형태에서, 본 발명은 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 조성물을 특색으로 한다. 혼합물의 제1 하위세트는 표적 영역을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고, 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 제2 하위세트는 표적 영역을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 제1 하위세트는 조성물 내의 총 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 1%, 예를 들어, 적어도 5%, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 또는 적어도 40%(예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 그 초과)(mol/mol)를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 일부 실시 형태에서, 본 발명은 표적 영역을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 및 표적 영역에 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 특색으로 하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 제1 포획제(예를 들어, 항원, 예컨대 비오틴)에 컨쥬게이트된다. 조성물은 예를 들어, 표적 영역을 결여한 폴리리보뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 표적 영역을 결여한 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드일 수 있다. 조성물은 제1 포획제에 결합하도록 구성된 제2 포획제(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대 스트렙타비딘)를 추가로 포함할 수 있다. 제2 포획제는 예를 들어, 링커를 통해 입자에 컨쥬게이트될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 조성물 중 임의의 것의 일부 실시 형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드는 인트론 또는 그의 부분을 포함한다. 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분을 포함할 수 있다. 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분에 대해 5' 또는 3'에 위치할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 폴리리보뉴클레오티드일 수 있다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 질량 기준으로 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w), 99%(w/w), 또는 100%(w/w) 순수하다. 순도는 당업자에게 알려진 다수의 분석 기법, 예컨대 질량 분광법, UV-가시성, 형광, 광 산란, 굴절 지수에 기반한 검출 기법을 사용한, 또는 검출을 위한 은 또는 염료 염색 또는 방사성 분해를 사용하는 분리전 또는 분리후 유도체화 방법론과 함께 또는 없이, 분리 기술, 예컨대 크로마토그래피(칼럼을 사용하여, 페이퍼를 사용하여, 겔을 사용하여, HPLC를 사용하여, UHPLC를 사용하여 등, 또는 IC에 의해, SEC에 의해, 역상에 의해, 음이온 교환에 의해, 혼합 방식에 의해 등) 또는 전기영동(UREA PAGE, 칩-기반, 폴리아크릴아미드 겔, RNA, 모세관, c-IEF 등)의 사용(그러나 이에 한정되는 것은 아님) 중 어느 하나에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 순도는 질량 분광법에 의해, 현미경검사에 의해, 원형 2색성(CD) 분광학에 의해, UV 또는 UV-vis 분광광도법에 의해, 형광분석법(예를 들어, Qubit)에 의해, RN아제 H 분석에 의해, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해, 또는 검출을 위한 은 또는 염료 염색 또는 방사성 분해를 이용하는 방법에 의해 분리 기술을 사용하지 않고 결정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 순도는 생물학적 테스트 방법론(예를 들어, 세포-기반 또는 수용체-기반 테스트)에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 조제물 내의 리보뉴클레오티드의 총 질량의 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w), 99%(w/w) 또는 100%(w/w)는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자에 함유된다. 퍼센트는 당업자에게 알려진 다수의 분석 기법, 예컨대 질량 분광법, UV-가시성, 형광, 광 산란, 굴절 지수에 기반한 검출 기법을 사용한, 또는 검출을 위한 은 또는 염료 염색 또는 방사성 분해를 사용하는 분리전 또는 분리후 유도체화 방법론과 함께 또는 없이, 분리 기술, 예컨대 크로마토그래피(칼럼을 사용하여, 페이퍼를 사용하여, 겔을 사용하여, HPLC를 사용하여, UHPLC를 사용하여 등, 또는 IC에 의해, SEC에 의해, 역상에 의해, 음이온 교환에 의해, 혼합 방식에 의해 등) 또는 전기영동(UREA PAGE, 칩-기반, 폴리아크릴아미드 겔, RNA, 모세관, c-IEF 등)의 사용(그러나 이에 한정되는 것은 아님) 중 어느 하나에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 순도는 질량 분광법에 의해, 현미경검사에 의해, 원형 2색성(CD) 분광학에 의해, UV 또는 UV-vis 분광광도법에 의해, 형광분석법(예를 들어, Qubit)에 의해, RN아제 H 분석에 의해, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해, 또는 검출을 위한 은 또는 염료 염색 또는 방사성 분해를 이용하는 방법에 의해 분리 기술을 사용하지 않고 결정될 수 있다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 적어도 0.1 ng/mL, 0.5 ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 50 ng/mL, 0.1 μg/mL, 0.5 μg/mL,1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 30 μg/mL, 40 μg/mL, 50 μg/mL, 60 μg/mL, 70 μg/mL, 80 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 500 μg/mL, 1000 μg/mL, 5000 μg/mL, 10,000 μg/mL, 100,000 μg/mL, 200 mg/mL, 300 mg/mL, 400 mg/mL, 500 mg/mL, 600 mg/mL, 650 mg/mL, 700 mg/mL, 또는 750 mg/mL의 원형 폴리리보뉴클레오티드 농도를 갖는다. 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 모노뉴클레오티드가 실질적으로 없거나, 1 pg/ml, 10 pg/ml, 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500 ng/ml, 1000 μg/mL, 5000 μg/mL, 10,000 μg/mL, 또는 100,000 μg/mL 이하의 모노뉴클레오티드 함량을 갖는다. 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 검출 한계 내지 최대 1 pg/ml, 10 pg/ml, 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500 ng/ml, 1000 μg/mL, 5000 μg/mL, 10,000 μg/mL, 또는 100,000 μg/mL의 모노뉴클레오티드 함량을 갖는다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 질량 기준으로 총 뉴클레오티드의 0.1%(w/w), 0.2%(w/w), 0.3%(w/w), 0.4%(w/w), 0.5%(w/w), 0.6%(w/w), 0.7%(w/w), 0.8%(w/w), 0.9%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 3%(w/w), 4%(w/w), 5%(w/w), 6%(w/w), 7%(w/w), 8%(w/w), 9%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 또는 그들 사이의 임의의 백분율 이하의 모노뉴클레오티드 함량을 갖고, 여기서 총 뉴클레오티드 함량은 데옥시리보뉴클레오티드 분자 및 리보뉴클레오티드 분자의 총 질량이다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 6 0ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500ng/ml, 600 ng/ml, 1 μg/ ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 g/ml, 300 μg/ml, 400 μg/ml, 500 μg/ml, 600 μg/ml, 700 μg/ml, 800 μg/ml, 900 μg/ml, 1 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2mg/ml, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 mg/mL, 300 mg/mL, 400 mg/mL, 500 mg/mL, 600 mg/mL, 650 mg/mL, 700 mg/mL, 또는 750 mg/mL 이하의 선형 RNA 함량, 예를 들어, 선형 RNA 대응물 또는 RNA 단편을 갖는다. 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 검출 한계 내지 최대 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 6 0ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500ng/ml, 600 ng/ml, 1 μg/ ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 g/ml, 300 μg/ml, 400 μg/ml, 500 μg/ml, 600 μg/ml, 700 μg/ml, 800 μg/ml, 900 μg/ml, 1 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400 mg/ml, 500 mg/ml, 600 mg/ml, 650 mg/ml, 700 mg/ml, 또는 750 mg/ml의 선형 RNA 함량, 예를 들어, 선형 RNA 대응물 또는 RNA 단편을 갖는다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 10%(w/w), 9.9%(w/w), 9.8%(w/w), 9.7%(w/w), 9.6%(w/w), 9.5%(w/w), 9.4%(w/w), 9.3%(w/w), 9.2%(w/w), 9.1%(w/w), 9%(w/w), 8%(w/w), 7%(w/w), 6%(w/w), 5%(w/w), 4%(w/w), 3%(w/w), 2%(w/w), 1%(w/w), 0.5%(w/w), 또는 0.1%(w/w), 또는 그들 사이의 백분율 이하의 니킹된 RNA 함량을 갖는다. 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 0만큼 낮은 니킹된 RNA 함량을 갖거나, 니킹된 RNA가 실질적으로 없다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 30%(w/w), 25%(w/w), 20%(w/w), 15%(w/w), 10%(w/w), 9%(w/w), 8%(w/w), 7%(w/w), 6%(w/w), 5%(w/w), 4%(w/w), 3%(w/w), 2%(w/w), 1%(w/w), 0.5%(w/w), 또는 0.1%(w/w), 또는 그들 사이의 백분율 이하의 조합된 선형 RNA 및 니킹된 RNA 함량을 갖는다. 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 0만큼 낮은 조합된 니킹된 RNA 및 선형 RNA 함량을 갖거나, 니킹된 및 선형 RNA가 실질적으로 없다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 분석 방법론, 예컨대 HPLC를 포함하는 분리 방법을 사용한 또는 사용하지 않는 질량 분광법, UV 분광학 또는 형광 검출기, 광 산란 기법, 표면 플라스몬 공명(SPR), 분리전 또는 분리후 유도체화 방법론 중 어느 하나를 사용한 또는 사용하지 않는 HPLC, 칩 또는 겔 기반 전기영동에 의해, 은 또는 염료 염색 또는 방사성 분해를 사용하는 검출 방법, 또는 현미경 검사, 시각적 방법 또는 분광광도계를 이용하는 방법의 검출 한계 이하의 선형 RNA 함량, 예를 들어, 선형 RNA 대응물 또는 RNA 단편을 갖는다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 예를 들어, 실시예 2에서의 방법에 의해 측정된 바와 같이, 0.1%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 3%(w/w), 4%(w/w), 5%(w/w), 6%(w/w), 7%(w/w), 8%(w/w), 9%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 35%(w/w), 40%(w/w), 45%(w/w), 50%(w/w) 이하의 선형 RNA를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 대응물 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 선형 대응물(예를 들어, 원형화되기 전의 버전)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 비-대응물 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 비-대응물을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 대응물 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 비-대응물 또는 그의 단편의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 대응물 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 비-대응물의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 단편은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이, 또는 그들 사이의 임의의 뉴클레오티드 수인 단편이다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 예를 들어, 분광광도계에 의해 측정된 바와 같이, 약 1.6 내지 약 2.3의 A260/A280 흡광도 비를 갖는다. 일부 실시 형태에서, A260/A280 흡광도 비는 약 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 또는 그들 사이의 임의의 수이다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성에서 중간체)는 예를 들어, 분광광도계에 의해 측정된 바와 같이, 약 1.8 초과의 A260/A280 흡광도 비를 갖는다. 일부 실시 형태에서, A260/A280 흡광도 비는 약 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 그 초과이다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 불순물 또는 부산물이 실질적으로 없다. 다양한 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 내의 적어도 하나의 불순물 또는 부산물의 수준은 불순물 또는 부산물을 제거하기 위한 정제 또는 처리 전의 조성물의 그것과 비교하여 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도 70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 적어도 90%(w/w), 또는 적어도 95%(w/w) 감소된다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 공정-관련 불순물 또는 부산물의 수준은 불순물 또는 부산물을 제거하기 위한 정제 또는 처리 전의 조성물의 그것과 비교하여 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도 70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 적어도 90%(w/w), 또는 적어도 95%(w/w) 감소된다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 생성물-관련 물질의 수준은 불순물 또는 부산물을 제거하기 위한 정제 또는 처리 전의 조성물의 그것과 비교하여 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도 70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 적어도 90%(w/w), 또는 적어도 95%(w/w) 감소된다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 추가로 공정-관련 불순물 또는 부산물이 실질적으로 없다. 일부 실시 형태에서, 공정-관련 불순물 또는 부산물은 단백질(예를 들어, 세포 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질), 데옥시리보핵산(예를 들어, 세포 데옥시리보핵산, 예컨대 숙주 세포 데옥시리보핵산), 모노데옥시리보뉴클레오티드 또는 디데옥시리보뉴클레오티드 분자, 효소(예를 들어, 뉴클레아제, 예컨대 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제, 또는 리가제), 시약 성분, 겔 성분, 또는 크로마토그래피 물질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 불순물 또는 부산물은 완충제 시약, 리가제, 뉴클레아제, RN아제 억제제, RN아제 R, 데옥시리보뉴클레오티드 분자, 아크릴아미드 겔 데브리스, 및 모노데옥시리보뉴클레오티드 분자로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 제약 조제물은 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 밀리그램(mg)당 단백질 오염, 불순물, 또는 부산물의 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 또는 500 ng 미만의 단백질(예를 들어, 세포 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질) 오염, 불순물, 또는 부산물을 포함한다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 DNA 함량, 예를 들어, 주형 DNA 또는 세포 DNA(예를 들어, 숙주 세포 DNA)가 실질적으로 없거나, 0만큼 낮은 DNA 함량을 갖거나, 1 pg/ml, 10 pg/ml, 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500 ng/ml, 1000 μg/mL, 5000 μg/mL, 10,000 μg/mL, 또는 100,000 μg/mL 이하의 DNA 함량을 갖는다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 DNA 함량이 실질적으로 없거나, 0만큼 낮은 DNA 함량을 갖거나, 질량 기준으로 총 뉴클레오티드의 0.001%(w/w), 0.01%(w/w), 0.1%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 3%(w/w), 4%(w/w), 5%(w/w), 6%(w/w), 7%(w/w), 8%(w/w), 9%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 35%(w/w), 40%(w/w), 45%(w/w), 50%(w/w) 이하의 DNA 함량을 갖고, 여기서 총 뉴클레오티드 분자는 데옥시리보뉴클레오티드 함량 및 리보뉴클레오티드 분자의 총 질량이다. 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 정량적 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)에 의해 뉴클레오시드를 소화하는 효소에 의한 총 DNA 소화 후에 측정된 바와 같이, DNA 함량이 실질적으로 없거나, 0만큼 낮은 DNA 함량을 갖거나, 질량 기준으로 총 뉴클레오티드의 0.001%(w/w), 0.01%(w/w), 0.1%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 3%(w/w), 4%(w/w), 5%(w/w), 6%(w/w), 7%(w/w), 8%(w/w), 9%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 35%(w/w), 40%(w/w), 45%(w/w), 50%(w/w) 이하의 DNA 함량을 갖고, 여기서 DNA의 함량은 LC-MS에 의해 측정된 바와 같이 각각의 염기(즉, A, C, G, T)의 표준 곡선으로부터 역계산된다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 또는 500 ng/ml 이하의 단백질(예를 들어, 세포 단백질(CP), 예를 들어, 효소, 생성-관련 단백질, 예를 들어, 담체 단백질) 오염, 불순물, 또는 부산물을 갖는다. 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성에서 중간체)는 검출 한계 내지 최대 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 또는 500 ng/ml의 단백질(예를 들어, 생성-관련 단백질, 예컨대 세포 단백질(CP), 예를 들어, 효소) 오염, 불순물, 또는 부산물을 갖는다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 밀리그램(mg)당 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 또는 500 ng 미만의 단백질(예를 들어, 생성-관련 단백질, 예컨대 세포 단백질(CP), 예를 들어, 효소) 오염, 불순물, 또는 부산물을 갖는다. 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성에서 중간체)는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 밀리그램(mg)당 검출 수준 내지 최대 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 또는 500 ng의 단백질(예를 들어, 생성-관련 단백질, 예컨대 세포 단백질(CP), 예를 들어, 효소) 오염, 불순물, 또는 부산물을 갖는다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 예를 들어, 리물루스(Limulus) 아메바세포 용해물(LAL) 테스트에 의해 측정된 바와 같이, 낮은 수준의 내독소를 갖거나, 내독소가 실질적으로 부재한다. 일부 실시 형태에서, 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성에서 중간체는 리물루스 아메바세포 용해물 테스트에 의해 측정된 바와 같이 20 EU/kg(중량), 10 EU/kg, 5 EU/kg, 1 EU/kg 미만의 내독소를 포함하거나, 내독소를 결여한다. 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조성물은 낮은 수준의 뉴클레아제 또는 리가제를 갖거나, 이들이 부재한다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 약 50%(w/w), 45%(w/w), 40%(w/w), 35%(w/w), 30%(w/w), 25%(w/w), 20%(w/w), 19%(w/w), 18%(w/w), 17%(w/w), 16%(w/w), 15%(w/w), 14%(w/w), 13%(w/w), 12%(w/w), 11%(w/w), 10%(w/w), 9%(w/w), 8%(w/w), 7%(w/w), 6%(w/w), 5%(w/w), 4%(w/w), 3%(w/w), 2%(w/w), 1%(w/w) 이하의 적어도 하나의 효소, 예를 들어, 폴리머라제, 예를 들어, RNA 폴리머라제를 포함한다.
실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제약 조제물 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물의 생성에서 중간체)은 멸균성이거나 미생물이 실질적으로 없으며, 예를 들어, 조성물 또는 조제물은 무균 조건 하에서 테스트된 바와 같이 100개 미만의 생존 미생물의 성장을 지지하고/거나, 조성물 또는 조제물은 USP <71>의 표준을 충족시키고/거나, 조성물 또는 조제물은 USP <85>의 표준을 충족시킨다. 일부 실시 형태에서, 제약 조제물은 멸균 전에 100 CFU/100 ml, 50 CFU/100 ml, 40 CFU/100 ml, 30 CFU/100 ml, 200 CFU/100 ml, 10 CFU/100 ml, 또는 10 CFU/100 ml 미만의 생물부담을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조제물은 불순물 또는 부산물을 제거하기 위한 당업계에 알려진 기법, 예컨대 칼럼 크로마토그래피 또는 pH, 바이알 불활성화를 사용하여 추가로 정제될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 분리 및/또는 정제 방법에 사용되고 본원에 기재된 조성물에 존재하는 폴리리보뉴클레오티드를 특색으로 한다. 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드, 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드로부터(예를 들어, 선형 폴리리보뉴클레오티드의 혼화성 단부를 스플라이싱함으로써) 생성된다. 일부 실시 형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 주형(예를 들어, 벡터, 선형화 벡터, 또는 cDNA)으로부터 전사된다. 따라서, 본 발명은 폴리리보뉴클레오티드의 생성에 유용한 선형 데옥시리보뉴클레오티드, 원형 데옥시리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드, 및 원형 폴리리보뉴클레오티드 및 그의 조성물을 특색으로 한다.
선형 폴리리보뉴클레오티드
본 발명은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 특색으로 한다: 3' 절반-인트론; 3' 스플라이스 부위; 3' 엑손; 폴리리보뉴클레오티드 카고; 5' 엑손; 5' 스플라이스 부위; 및 5' 절반-인트론. 일부 실시 형태에서, 3' 절반-인트론은 촉매 그룹 I 인트론, 예를 들어, 시아노박테리아 아나바에나 프리-tRNA-Leu 유전자, 테트라히메나 프리-rRNA, T4 파지 td 유전자, 또는 그의 변이체로부터의 촉매 그룹 I 인트론의 3' 부분에 상응한다. 일부 실시 형태에서, 5' 절반-인트론은 촉매 그룹 I 인트론, 예를 들어, 시아노박테리아 아나바에나 프리-tRNA-Leu 유전자, 테트라히메나 프리-rRNA, T4 파지 td 유전자, 또는 그의 변이체로부터의 촉매 그룹 I 인트론의 5' 부분에 상응한다.
선형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 상기 기재된 요소 중 임의의 것의 외부에 또는 사이에 추가적인 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 요소 중 임의의 것은 본원에 기재된 바와 같은 스페이서 서열에 의해 분리될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 표적 영역은 본원에 기재된 바와 같은 선형 폴리리보뉴클레오티드의 임의의 영역에 존재할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분 내에 존재한다.
특정 실시 형태에서, 본원에서 제공된 데옥시리보뉴클레오티드(예를 들어, 벡터, 선형화 벡터, 또는 cDNA)를 주형(예를 들어, 선형 폴리리보뉴클레오티드를 코딩하는 영역의 상류에 위치한 RNA 폴리머라제 프로모터를 갖는 본원에서 제공된 벡터, 선형화 벡터, 또는 cDNA)으로서 사용하여 무세포 시스템에서의 전사(예를 들어, 시험관내 전사)를 수행함으로써 선형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하는 방법이 본원에서 제공된다.
데옥시리보뉴클레오티드 주형은 전사되어 본원에 기재된 성분을 함유하는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 발현시, 선형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 후속 사용을 위해, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하기 위해 스플라이싱될 수 있는 스플라이싱-혼화성 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드는 50 내지 20,000개, 예를 들어, 300 내지 20,000개(예를 들어, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 또는 20,000개)의 리보뉴클레오티드의 길이이다. 선형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 적어도 500개, 적어도 1,000개, 적어도 2,000개, 적어도 3,000개, 적어도 4,000개, 또는 적어도 5,000개의 리보뉴클레오티드의 길이일 수 있다.
원형 폴리리보뉴클레오티드
일부 실시 형태에서, 본 발명은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 특색으로 한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5' 엑손 및 3' 엑손을 연결시키는 스플라이스 연접부를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 표적 영역은 본원에 기재된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 임의의 영역에 존재할 수 있다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 스플라이싱 후에 인트론을 결여할 수 있다.
원형 폴리뉴클레오티드는 폴리리보뉴클레오티드 카고를 추가로 포함할 수 있다. 폴리리보뉴클레오티드 카고는 발현 서열, 비-코딩 서열, 또는 발현 서열 및 비-코딩 서열의 조합을 포함할 수 있다. 폴리리보뉴클레오티드 카고는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 서열을 포함할 수 있다. 폴리리보뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 서열에 작동가능하게 연결된 IRES를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 IRES과 5' 엑손 단편 또는 3' 엑손 단편 사이에 스페이서 영역을 추가로 포함한다. 스페이서 영역은 예를 들어, 적어도 5개(예를 들어, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개)의 리보뉴클레오티드의 길이 리보뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 스페이서 영역은 예를 들어, 5 내지 500개(예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개)의 리보뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 영역은 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 영역은 폴리A-C, 폴리A-G, 폴리A-U, 또는 다른 이종 또는 무작위 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 약 20개의 뉴클레오티드, 적어도 약 30개의 뉴클레오티드, 적어도 약 40개의 뉴클레오티드, 적어도 약 50개의 뉴클레오티드, 적어도 약 75개의 뉴클레오티드, 적어도 약 100개의 뉴클레오티드, 적어도 약 200개의 뉴클레오티드, 적어도 약 300개의 뉴클레오티드, 적어도 약 400개의 뉴클레오티드, 적어도 약 500개의 뉴클레오티드, 적어도 약 1,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 2,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 5,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 6,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 7,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 8,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 9,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 10,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 12,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 14,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 15,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 16,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 17,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 18,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 19,000개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 20,000개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 리보솜에 대한 결합 부위를 수용하는 데 충분한 크기의 것일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 크기는 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 데 충분한 길이이고, 따라서, 적어도 20,000개의 뉴클레오티드, 적어도 15,000개의 뉴클레오티드, 적어도 10,000개의 뉴클레오티드, 적어도 7,500개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 5,000개의 뉴클레오티드, 적어도 4,000개의 뉴클레오티드, 적어도 3,000개의 뉴클레오티드, 적어도 2,000개의 뉴클레오티드, 적어도 1,000개의 뉴클레오티드, 적어도 500개의 뉴클레오티드, 적어도 1400개의 뉴클레오티드, 적어도 300개의 뉴클레오티드, 적어도 200개의 뉴클레오티드, 적어도 100개의 뉴클레오티드의 길이가 생성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 기재된 하나 이상의 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 요소는 스페이서 서열에 의해 서로로부터 분리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 요소는 1개의 리보뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 약 5개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드, 약 20개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드, 약 40개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드, 약 60개의 뉴클레오티드, 약 80개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드, 약 150개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드, 약 250개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드, 약 400개의 뉴클레오티드, 약 500개의 뉴클레오티드, 약 600개의 뉴클레오티드, 약 700개의 뉴클레오티드, 약 800개의 뉴클레오티드, 약 900개의 뉴클레오티드, 약 1000개의 뉴클레오티드, 최대 약 1 kb, 적어도 약 1000개의 뉴클레오티드, 또는 그들 사이의 임의의 양의 뉴클레오티드에 의해 서로로부터 분리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 요소는 서로와 인접하며, 예를 들어, 스페이서 요소를 결여한다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 반복적 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 기재된 하나 이상의 변형을 포함한다. 한 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 뉴클레오시드 변형을 함유한다. 한 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 뉴클레오시드의 최대 100%가 변형된다. 한 실시 형태에서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 변형은 우리딘 변형 또는 아데노신 변형이다.
그의 원형화의 결과로서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 그것을 선형 폴리리보뉴클레오티드로부터 구별하는 특정 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 많은 또는 더 적은 접근 가능한 표적 영역을 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드와 비교하여 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 덜 감수성일 수 있다. 따라서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는, 특히 엑소뉴클레아제의 존재 하에서 인큐베이션되는 경우, 선형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 안정할 수 있다. 선형 폴리리보뉴클레오티드와 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 증가된 안정성은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 폴리펩티드를 생성하기 위한 세포 형질전환 시약으로서 더 유용하게 만들고, 선형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 용이하게 및 더 오랫동안 저장될 수 있다. 엑소뉴클레아제로 처리된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성은 RNA 분해가 발생하였는지 여부를 결정하는 당업계의 표준 방법을 사용하여(예를 들어, 겔 전기영동에 의해) 테스트될 수 있다. 더욱이, 선형 폴리리보뉴클레오티드와는 달리, 원형 폴리리보뉴클레오티드는, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 포스파타제, 예컨대 송아지 장 포스파타제와 인큐베이션되는 경우, 탈인산화에 덜 감수성일 수 있다.
폴리리보뉴클레오티드 카고
본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드 카고는 적어도 하나의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 임의의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 발현 서열, 비-코딩 서열, 또는 발현 서열 및 비-코딩 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 서열에 작동가능하게 연결된 IRES를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 대상체에 대한 생물학적 효과를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 서열을 포함한다.
폴리리보뉴클레오티드 카고는 예를 들어, 적어도 약 40개의 뉴클레오티드, 적어도 약 50개의 뉴클레오티드, 적어도 약 75개의 뉴클레오티드, 적어도 약 100개의 뉴클레오티드, 적어도 약 200개의 뉴클레오티드, 적어도 약 300개의 뉴클레오티드, 적어도 약 400개의 뉴클레오티드, 적어도 약 500개의 뉴클레오티드, 적어도 약 1,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 2,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 5,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 6,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 7,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 8,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 9,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 10,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 12,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 14,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 15,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 16,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 17,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 18,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 19,000개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 20,000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 1~20,000개의 뉴클레오티드, 1~10,000개의 뉴클레오티드, 1~5,000개의 뉴클레오티드, 100~20,000 뉴클레오티드, 100~10,000개의 뉴클레오티드, 100~5,000개의 뉴클레오티드, 500~20,000개의 뉴클레오티드, 500~10,000개의 뉴클레오티드, 500~5,000개의 뉴클레오티드, 1,000~20,000개의 뉴클레오티드, 1,000~10,000개의 뉴클레오티드, 또는 1,000~5,000개의 뉴클레오티드를 포함한다.
실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 하나 또는 다수의 발현(또는 코딩) 서열을 포함하고, 여기서 각각의 발현(또는 코딩) 서열은 폴리펩티드를 코딩한다. 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 하나 또는 다수의 비코딩 서열을 포함한다. 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 전적으로 비-코딩 서열(들)로 이루어진다. 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 발현(또는 코딩) 및 비코딩 서열의 조합을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 바와 같이 제조된 폴리리보뉴클레오티드는 요법 또는 농업에서 이펙터로서 사용된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법(예를 들어, 본원에 기재된 무세포 방법)에 의해 제조된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에게 투여될 수 있다(예를 들어, 제약, 수의학, 또는 농업 조성물로). 또 다른 예에서, 본원에 기재된 방법(예를 들어, 본원에 기재된 무세포 방법)에 의해 제조된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포에 전달될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 제WO2019/118919호에 개시된 바와 같은 임의의 특색, 또는 특색의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 오픈 리딩 프레임은 IRES에 작동가능하게 연결된다. 오픈 리딩 프레임은 RNA 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 오픈 리딩 프레임은 폴리펩티드를 코딩하고, 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 선형 폴리리보뉴클레오티드와 비교하여, 폴리펩티드의 증가된 발현(예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 초과만큼)을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드, 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 증가된 순도는 예를 들어, 원형 및 선형 폴리리보뉴클레오티드의 집단과 비교하여 폴리펩티드의 증가된 발현(예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 초과만큼)을 발생시킨다.
폴리펩티드 발현 서열
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 폴리리보뉴클레오티드 카고)는 하나 이상의 발현(또는 코딩) 서열을 포함하고, 여기서 각각의 발현 서열은 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 발현(또는 코딩) 서열을 포함한다.
각각의 코딩된 폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 실시 형태에서, 폴리펩티드는 약 5개 내지 약 40,000개의 아미노산, 약 15개 내지 약 35,000개의 아미노산, 약 20개 내지 약 30,000개의 아미노산, 약 25개 내지 약 25,000개의 아미노산, 약 50개 내지 약 20,000개의 아미노산, 약 100개 내지 약 15,000개의 아미노산, 약 200개 내지 약 10,000개의 아미노산, 약 500개 내지 약 5,000개의 아미노산, 약 1,000개 내지 약 2,500개의 아미노산, 또는 그들 사이의 임의의 범위의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 약 40,000개 미만의 아미노산, 약 35,000개 미만의 아미노산, 약 30,000개 미만의 아미노산, 약 25,000개 미만의 아미노산, 약 20,000개 미만의 아미노산, 약 15,000개 미만의 아미노산, 약 10,000개 미만의 아미노산, 약 9,000개 미만의 아미노산, 약 8,000개 미만의 아미노산, 약 7,000개 미만의 아미노산, 약 6,000개 미만의 아미노산, 약 5,000개 미만의 아미노산, 약 4,000개 미만의 아미노산, 약 3,000개 미만의 아미노산, 약 2,500개 미만의 아미노산, 약 2,000개 미만의 아미노산, 약 1,500개 미만의 아미노산, 약 1,000개 미만의 아미노산, 약 900개 미만의 아미노산, 약 800개 미만의 아미노산, 약 700개 미만의 아미노산, 약 600개 미만의 아미노산, 약 500개 미만의 아미노산, 약 400개 미만의 아미노산, 약 300개 미만의 아미노산의 길이를 갖거나, 그 미만이 유용할 수 있다.
본원에 포함된 폴리펩티드는 천연 발생 폴리펩티드 또는 비-천연 발생 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 기능적 단편 또는 변이체(예를 들어, 효소의 효소적으로 활성인 단편 또는 변이체)이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 천연 발생 폴리펩티드의 서열과, 예를 들어, 특정된 영역에 걸쳐 또는 전체 서열에 걸쳐, 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 본원에 기재된 폴리펩티드 중 임의의 것의 기능적으로 활성인 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 관심 단백질과 적어도 50%(예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 그 초과) 동일성을 가질 수 있다.
폴리펩티드의 일부 예는 형광 태그 또는 마커, 항원, 치료 폴리펩티드, 또는 농업적 적용을 위한 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
치료 폴리펩티드는 호르몬, 신경전달물질, 성장 인자, 효소(예를 들어, 옥시도리덕타제, 대사 효소, 미토콘드리아 효소, 옥시게나제, 데히드로게나제, ATP-독립적 효소, 리소좀 효소, 데사추라제), 사이토카인, 항원 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항원 결합 항체 또는 항체-유사 단편, 예컨대 단일 쇄 항체, 나노바디 또는 다른 Ig 중쇄 또는 경쇄 함유 폴리펩티드), Fc 융합 단백질, 항응고물, 혈액 인자, 골 형태형성 단백질, 인터페론, 인터루킨, 및 혈전용해제일 수 있다.
농업적 적용을 위한 폴리펩티드는 박테리오신, 리신, 항미생물 폴리펩티드, 항진균 폴리펩티드, 소절 C-풍부 펩티드, 균세포 조절 펩티드, 펩티드 독소, 살충 폴리펩티드(예를 들어, 살곤충 폴리펩티드 또는 살선충 폴리펩티드), 항원 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항원 결합 항체 또는 항체-유사 단편, 예컨대 단일 쇄 항체, 나노바디 또는 다른 Ig 중쇄 또는 경쇄 함유 폴리펩티드), 효소(예를 들어, 뉴클레아제, 아밀라제, 셀룰라제, 펩티다제, 리파제, 키티나제), 펩티드 페로몬, 및 전사 인자일 수 있다.
일부 경우에, 폴리리보뉴클레오티드는 비-인간 단백질을 발현한다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 항체, 예를 들어, 항체 단편, 또는 그의 부분을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 발현되는 항체는 임의의 이소타입, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM의 것일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 부분, 예컨대 경쇄, 중쇄, Fc 단편, CDR(상보성 결정 영역), Fv 단편, 또는 Fab 단편, 그의 추가의 부분을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 하나 이상의 부분을 발현한다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 초과의 발현 서열을 포함할 수 있으며, 그의 각각은 항체의 부분을 발현하고, 그의 합은 항체를 구성할 수 있다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 중쇄를 코딩하는 하나의 발현 서열, 및 항체의 경쇄를 코딩하는 또 다른 발현 서열을 포함한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 세포 또는 무세포 환경에서 발현되는 경우, 경쇄 및 중쇄는 적절한 변형, 폴딩, 또는 다른 번역후 변형에 적용되어 기능적 항체를 형성할 수 있다.
실시 형태에서, 폴리펩티드는 다수의 폴리펩티드, 예를 들어, 하나의 폴리펩티드 서열의 다수의 카피, 또는 다수의 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 실시 형태에서, 다수의 폴리펩티드는 링커 아미노산 또는 스페이서 아미노산에 의해 연결된다.
실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드 카고는 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 많은 신호 펩티드 서열이 기재되었으며, 예를 들어, Tat(트윈-아르기닌 전위) 신호 서열은 전형적으로 지질 이중층에 걸쳐 이러한 Tat 신호 펩티드를 함유하는 폴딩된 단백질을 전위시키는 역할을 하는 컨센서스 SRRxFLK "트윈-아르기닌" 모티프를 함유하는 N-말단 펩티드 서열이다. 또한, 예를 들어, www[dot]signalpeptide[dot]de에서 공개적으로 이용가능한 신호 펩티드 데이터베이스를 참조한다. 신호 펩티드는 또한 단백질을 특이적 소기관에 지정하는 데 유용하며; 예를 들어, proline.bic.nus.edu.sg/spdb에서 공개적으로 이용가능한 Spdb 신호 펩티드 데이터베이스에 개시된 실험적으로 결정되고 컴퓨터로 예측되는 신호 펩티드를 참조한다.
실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드 카고는 세포-관통 펩티드(CPP)를 코딩하는 서열을 포함한다. 수백 개의 CPP 서열이 기재되었으며; 예를 들어, crdd.osdd.net/raghava/cppsite/에서 공개적으로 이용가능한 세포-관통 펩티드의 데이터베이스, CPPsite를 참조한다. 통상적으로 사용되는 CPP 서열의 예는 CGI 펩티드의 C-말단에 융합될 수 있는 폴리-아르기닌 서열, 예를 들어, 옥토아르기닌 또는 노노아르기닌이다.
실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드 카고는 자기-어셈블리 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하며; 예를 들어, 문헌[Miki et al. (2021) Nature Communications, 21:3412, DOI: 10.1038/s41467-021-23794-6]을 참조한다.
일부 실시 형태에서, 발현 서열은 폴리-A 서열을 포함한다(예를 들어, 발현 서열의 3' 단부에). 일부 실시 형태에서, 폴리-A 서열의 길이는 10개 초과의 뉴클레오티드의 길이이다. 한 실시 형태에서, 폴리-A 서열은 15개 초과의 뉴클레오티드의 길이(예를 들어, 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,500, 및 3,000개의 뉴클레오티드 또는 그 초과)이다. 일부 실시 형태에서, 폴리-A 서열은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019/118919A1호의 [0202]~[0204]에서의 폴리-A 서열의 설명에 따라 설계된다. 일부 실시 형태에서, 발현 서열은 폴리-A 서열을 결여한다(예를 들어, 발현 서열의 3' 단부에).
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리A를 포함하거나, 폴리A를 결여하거나, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 조정하도록 변형된 폴리A를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 폴리A를 결여하거나 변형된 폴리A를 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 기능적 특징, 예를 들어, 면역원성(예를 들어, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 수준), 반감기, 및/또는 발현 효율을 개선시킨다.
치료 폴리펩티드
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 폴리리보뉴클레오티드 카고)는 치료 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 발현 서열을 포함한다. 치료 폴리펩티드는 대상체에게 투여되거나 대상체에서 발현되는 경우 일부 치료 이익을 제공하는 폴리펩티드이다. 치료 폴리펩티드의 대상체에의 투여 또는 대상체에서의 발현은 질환, 장애, 또는 상태 또는 그의 증상을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 치료 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 치료 단백질을 코딩하는 발현 서열을 포함한다. 단백질은 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 치료 단백질은 이를 필요로 하는 대상체에서 돌연변이된, 과소-발현된, 또는 부재하는 단백질을 보상할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 치료 단백질은 이를 필요로 하는 대상체에서 세포, 조직, 또는 바이러스를 표적화하거나, 이와 상호작용하거나, 이에 결합할 수 있다.
치료 폴리펩티드는 세포로부터 분비되거나, 세포의 세포질, 핵, 또는 막 구획에 국재화될 수 있는 폴리펩티드일 수 있다.
치료 폴리펩티드는 호르몬, 신경전달물질, 성장 인자, 효소(예를 들어, 옥시도리덕타제, 대사 효소, 미토콘드리아 효소, 옥시게나제, 데히드로게나제, ATP-독립적 효소, 리소좀 효소, 데사추라제), 사이토카인, 전사 인자, 항원 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항원 결합 항체 또는 항체-유사 단편, 예컨대 단일 쇄 항체, 나노바디 또는 다른 Ig 중쇄 또는 경쇄 함유 폴리펩티드), Fc 융합 단백질, 항응고물, 혈액 인자, 골 형태형성 단백질, 인터페론, 인터루킨, 혈전용해제, 항원(예를 들어, 종양, 바이러스, 또는 박테리아 항원), 뉴클레아제(예를 들어, 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas 단백질, 예를 들어, Cas9), 막 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR), 막관통 수용체, G-단백질-커플링된 수용체(GPCR), 수용체 티로신 키나제(RTK), 항원 수용체, 이온 채널, 또는 막 수송체), 분비된 단백질, 유전자 편집 단백질(예를 들어, CRISPR-Cas, TALEN, 또는 아연 핑거), 또는 진 라이팅 단백질(예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2020/047124호 참조)일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 치료 폴리펩티드는 항체, 예를 들어, 전장 항체, 항체 단편, 또는 그의 부분이다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)에 의해 발현되는 항체는 임의의 이소타입, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM의 것일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 부분, 예컨대 경쇄, 중쇄, Fc 단편, CDR(상보성 결정 영역), Fv 단편, 또는 Fab 단편, 그의 추가의 부분을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 하나 이상의 부분을 발현한다. 예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드는 하나 초과의 발현 서열을 포함할 수 있으며, 그의 각각은 항체의 부분을 발현하고, 그의 합은 항체를 구성할 수 있다. 일부 경우에, 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 중쇄를 코딩하는 하나의 발현 서열, 및 항체의 경쇄를 코딩하는 또 다른 발현 서열을 포함한다. 폴리리보뉴클레오티드가 세포에서 발현되는 경우, 경쇄 및 중쇄는 적절한 변형, 폴딩, 또는 다른 번역후 변형에 적용되어 기능적 항체를 형성할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 바와 같이 제조된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 요법 또는 농업에서 이펙터로서 사용된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에게 투여될 수 있다(예를 들어, 제약, 수의학, 또는 농업 조성물로). 실시 형태에서, 대상체는 척추 동물(예를 들어, 포유동물, 조류, 어류, 파충류, 또는 양서류)이다. 실시 형태에서, 대상체는 인간이다. 실시 형태에서, 방법 대상체는 비-인간 포유동물이다. 실시 형태에서, 대상체는 비-인간 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 유인원), 유제류(예를 들어, 소, 버팔로, 양, 염소, 돼지, 낙타, 라마, 알파카, 사슴, 말, 당나귀), 육식동물(예를 들어, 개, 고양이), 설치류(예를 들어, 래트, 마우스), 또는 토끼목(예를 들어, 토끼)이다. 실시 형태에서, 대상체는 조류, 예컨대 조류 분류군 순계목(예를 들어, 닭, 칠면조, 꿩, 메추라기), 기러기목(예를 들어, 오리, 거위), 고관목(예를 들어, 타조, 에뮤), 비둘기목(예를 들어, 피존, 도브), 또는 앵무새목(예를 들어, 앵무새)의 구성원이다. 실시 형태에서, 대상체는 무척추동물, 예컨대 절지동물(예를 들어, 곤충류, 거미류, 갑각류), 선충, 환형동물, 연충, 또는 연체동물이다. 실시 형태에서, 대상체는 무척추동물 농업적 해충 또는 무척추동물 또는 척추동물 숙주 상에 기생하는 무척추동물이다. 실시 형태에서, 대상체는 식물, 예컨대 피자 식물(쌍자엽 또는 단자엽일 수 있음) 또는 나자 식물(예를 들어, 침엽수, 소철류, 마황문, 은행나무), 양치식물, 쇠뜨기, 석송, 또는 선태식물이다. 실시 형태에서, 대상체는 진핵 조류(단세포 또는 다세포)이다. 실시 형태에서, 대상체는 농업적으로 또는 원예적으로 중요한 식물, 예컨대 줄뿌림 작물 식물, 과실-생산 식물 및 나무, 채소, 나무, 및 관상용 꽃, 관목, 나무, 지표식물, 및 잔디풀을 포함하는 관상용 식물이다.
식물-변형 폴리펩티드
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드의 폴리리보뉴클레오티드 카고)는 식물-변형 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 발현 서열을 포함한다. 식물-변형 폴리펩티드는 식물의 생리학 또는 표현형의 변화, 예를 들어, 식물의 적합성의 증가 또는 감소를 발생시키는 방식으로 식물의 유전적 특성(예를 들어, 유전자 발현을 증가시키거나, 유전자 발현을 감소시키거나, 다른 방식으로는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오티드 서열을 변경시킴), 후성유전학적 특성, 또는 생리학적 또는 생화학적 특성을 변경시킬 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상이한 식물-변형 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 식물-변형 폴리펩티드의 다수의 카피를 코딩한다. 식물-변형 폴리펩티드는 다양한 식물의 생리학 또는 표현형을 변화시키거나, 그의 적합성을 증가시키거나 감소시킬 수 있거나, 하나 이상의 특정 식물(예를 들어, 식물의 특정 종 또는 속)에서 이러한 변화(들)를 실행하는 것일 수 있다.
본원에 사용될 수 있는 폴리펩티드의 예는 효소(예를 들어, 대사 리콤비나제, 헬리카제, 인테그라제, RN아제, DN아제, 또는 유비퀴틴화 단백질), 기공-형성 단백질, 신호전달 리간드, 세포 관통 펩티드, 전사 인자, 수용체, 항체, 나노바디, 유전자 편집 단백질(예를 들어, CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제, TALEN, 또는 아연 핑거), 리보단백질, 단백질 압타머, 또는 샤페론을 포함할 수 있다.
농업적 폴리펩티드
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드의 폴리리보뉴클레오티드 카고)는 농업적 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 발현 서열을 포함한다. 농업적 폴리펩티드는 농업적 용도에 적합한 폴리펩티드이다. 실시 형태에서, 농업적 폴리펩티드는 식물 또는 종자에(예를 들어, 엽상 분무, 살포, 주사, 또는 종자 코팅에 의해) 또는 식물의 환경에(예를 들어, 토양 관주 또는 과립상 토양 시용에 의해) 시용되어, 식물의 생리학, 표현형, 또는 적합성의 변경을 발생시킨다. 농업적 폴리펩티드의 실시 형태는 식물 또는 비-인간 동물 숙주 내에 또는 그 상에 살고 있는 하나 이상의 미생물의 수준, 활성, 또는 대사를 변경시키는 폴리펩티드를 포함하며, 변경은 숙주의 적합성의 증가를 발생시킨다. 일부 실시 형태에서, 농업적 폴리펩티드는 식물 폴리펩티드이다. 일부 실시 형태에서, 농업적 폴리펩티드는 곤충 폴리펩티드이다. 일부 실시 형태에서, 농업적 폴리펩티드는 비-인간 척추 동물, 무척추 동물, 미생물, 또는 식물 세포와 접촉하는 경우 생물학적 효과를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 농업적 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 농업적 폴리펩티드의 다수의 카피를 코딩한다.
농업적 적용에 유용한 폴리펩티드의 실시 형태는 예를 들어, 박테리오신, 리신, 항미생물 펩티드, 소절 C-풍부 펩티드, 및 균세포 조절 펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 곤충, 예컨대 꿀벌 및 누에의 적합성을 증가시키기 위해 표적 미생물의 수준, 활성, 또는 대사를 변경시키는 데 사용될 수 있다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 실시 형태는 펩티드 독소, 예컨대 당업계에 공지된 바와 같이, 곤충병원성 박테리아(예를 들어, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 포토랍두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens), 세라티아 엔토모필라(Serratia entomophila), 또는 크세노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophila))에 의해 자연적으로 생성되는 것들을 포함한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 실시 형태는 농업적으로 중요한 해충 또는 병원체를 방제하기 위한 폴리펩티드(소형 펩티드, 예컨대 시클로디펩티드 또는 디케토피페라진 포함), 예를 들어, 식물에서의 질환을 방제하기 위한 항미생물 폴리펩티드 또는 항진균 폴리펩티드, 또는 무척추동물 해충, 예컨대 곤충 또는 선충을 방제하기 위한 살충 폴리펩티드(예를 들어, 살곤충 폴리펩티드 또는 살선충 폴리펩티드)를 포함한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 실시 형태는 항체, 나노바디, 및 그의 단편, 예를 들어, 무손상 항체 또는 나노바디의 특이적 결합 활성의 적어도 일부(예를 들어, 적어도 10%)를 보유하는 항체 또는 나노바디 단편을 포함한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 실시 형태는 전사 인자, 예를 들어, 식물 전사 인자를 포함하며; 예를 들어, agris-knowledgebase[dot]org/AtTFDB/에서 공개적으로 이용가능한, 모델 식물 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 확인된 전사 인자 패밀리를 열거하는 "AtTFDB" 데이터베이스를 참조한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 실시 형태는 뉴클레아제, 예를 들어, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 또는 Cas12a)를 포함한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 실시 형태는 세포-관통 펩티드, 효소(예를 들어, 아밀라제, 셀룰라제, 펩티다제, 리파제, 키티나제), 펩티드 페로몬(예를 들어, 효모 교미 페로몬, 무척추동물 생식 및 유충 신호전달 페로몬, 예를 들어, 문헌[Altstein (2004) Peptides, 25:1373-76] 참조)을 추가로 포함한다.
내부 리보솜 진입 부위(IRES)
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드의 폴리리보뉴클레오티드 카고)는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, IRES는 하나 이상의 발현 서열에 작동가능하게 연결된다(예를 들어, 각각의 IRES는 하나 이상의 발현 서열에 작동가능하게 연결된다). 실시 형태에서, IRES는 이종 프로모터와 코딩 서열의 5' 단부 사이에 위치한다.
폴리리보뉴클레오티드에 포함시키는 데 적합한 IRES 요소는 진핵 리보솜을 결착할 수 있는 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, IRES 요소는 적어도 약 5 nt, 적어도 약 8 nt, 적어도 약 9 nt, 적어도 약 10 nt, 적어도 약 15 nt, 적어도 약 20 nt, 적어도 약 25 nt, 적어도 약 30 nt, 적어도 약 40 nt, 적어도 약 50 nt, 적어도 약 100 nt, 적어도 약 200 nt, 적어도 약 250 nt, 적어도 약 350 nt, 또는 적어도 약 500 nt이다.
일부 실시 형태에서, IRES 요소는 바이러스, 포유동물, 및 드로소필라(Drosophila)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 유기체의 DNA로부터 유래된다. 이러한 바이러스 DNA는 뇌심근염 바이러스(EMCV) cDNA 및 폴리오바이러스 cDNA와의 피코르나바이러스 상보적 DNA(cDNA)로부터 유래될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 한 실시 형태에서, IRES 요소가 유래되는 드로소필라 DNA는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)로부터의 안테나페디아(Antennapedia) 유전자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시 형태에서, 존재하는 경우, IRES 서열은 타우라 증후군 바이러스, 트리아토마(Triatoma) 바이러스, 타일러 뇌척수염 바이러스, 원숭이 바이러스 40, 솔레놉시스 인빅타(Solenopsis invicta) 바이러스 1, 로팔로시품 파디(Rhopalosiphum padi) 바이러스, 망상내피증 바이러스, 인간 폴리오바이러스 1, 플라우티아 스톨(Plautia stall) 장 바이러스, 카슈미르 벌 바이러스, 인간 리노바이러스 2, 호말로디스카 코아굴라타(Homalodisca coagulata) 바이러스- 1, 인간 면역결핍 바이러스 유형 1, 호말로디스카 코아굴라타 바이러스- 1, 히메토비(Himetobi) P 바이러스, C형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, GB형 간염 바이러스, 구제역 바이러스, 인간 엔테로바이러스 71, 말 비염 바이러스, 엑트로피스 오블리쿠아(Ectropis obliqua) 피코르나-유사 바이러스, 뇌심근염 바이러스(EMCV), 드로소필라 C 바이러스, 크루시퍼 토바모(Crucifer tobamo) 바이러스, 귀뚜라미 마비 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스 1, 블랙 퀸 세포(Black Queen Cell) 바이러스, 진딧물 치사성 마비 바이러스, 조류 뇌척수염 바이러스, 급성 벌 마비 바이러스, 히비스쿠스 황백화 윤문병 바이러스, 고전적 돼지열 바이러스, 인간 FGF2, 인간 SFTPA1, 인간 AML1/RUNX1, 드로소필라 안테나페디아, 인간 AQP4, 인간 AT1R, 인간 BAG-l, 인간 BCL2, 인간 BiP, 인간 c-IAPl , 인간 c-myc, 인간 eIF4G, 마우스 NDST4L, 인간 LEF1, 마우스 HIF1 알파, 인간 n.myc, 마우스 Gtx, 인간 p27kipl, 인간 PDGF2/c-sis, 인간 p53, 인간 Pim-l, 마우스 Rbm3, 드로소필라 레아퍼(Drosophila reaper), 카나인 스캠퍼(Canine Scamper), 드로소필라 Ubx, 인간 UNR, 마우스 UtrA, 인간 VEGF-A, 인간 XIAP, 살리바이러스, 코사바이러스, 파레코바이러스, 드로소필라 헤어리스, 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) TFIID, 에스. 세레비지아에 YAP1, 인간 c-src, 인간 FGF-l, 원숭이 피코마바이러스, 순무 주름 바이러스, eIF4G에 대한 압타머, 콕사키바이러스 B3(CVB3) 또는 콕사키바이러스 A(CVB1/2)의 IRES 서열이다. 추가의 또 다른 실시 형태에서, IRES는 콕사키바이러스 B3(CVB3)의 IRES 서열이다. 추가의 실시 형태에서, IRES는 뇌심근염 바이러스의 IRES 서열이다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과)의 발현 서열에 플랭킹된 적어도 하나의 IRES를 포함한다. 일부 실시 형태에서, IRES는 적어도 하나(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과)의 발현 서열의 양측에 플랭킹된다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 각각의 발현 서열의 한 측 또는 양측 상에 하나 이상의 IRES 서열을 포함하여, 생성된 펩티드 및 또는 폴리펩티드의 분리를 초래한다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 IRES를 포함한다. 예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드 카고는 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Chen et al. Mol. Cell 81:1-19, 2021]에 기재된 바와 같이, 원형 RNA IRES를 포함할 수 있다.
조절 요소
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드의 폴리리보뉴클레오티드 카고)는 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 조절 요소, 예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 발현을 변형시키는 서열을 포함한다.
조절 요소는 발현 생성물을 코딩하는 발현 서열에 인접하여 위치한 서열을 포함할 수 있다. 조절 요소는 인접한 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 조절 요소는 조절 요소가 존재하지 않는 경우 발현된 생성물의 양과 비교하여 발현된 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 또한, 하나의 조절 요소는 탠덤으로 부착된 다수의 발현 서열에 대해 발현된 생성물의 양 또는 수를 증가시킬 수 있다. 따라서, 하나의 조절 요소는 하나 이상의 발현 서열의 발현을 증진시킬 수 있다. 다수의 조절 요소는 당업자에게 널리 알려져 있다.
일부 실시 형태에서, 조절 요소는 번역 조정제이다. 번역 조정제는 폴리리보뉴클레오티드에서 발현 서열의 번역을 조정할 수 있다. 번역 조정제는 번역 증진제 또는 억제제일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 발현 서열에 인접한 적어도 하나의 번역 조정제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 각각의 발현 서열에 인접한 번역 조정제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 번역 조정제는 각각의 발현 서열의 한 측 또는 양측에 존재하여, 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드 및 또는 폴리펩티드의 분리를 초래한다.
일부 실시 형태에서, 조절 요소는 마이크로RNA(miRNA) 또는 miRNA 결합 부위이다.
조절 요소의 추가의 예는 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019/118919호의 단락 [0154]~[0161]에 기재되어 있다.
번역 개시 서열
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드의 폴리리보뉴클레오티드 카고)는 적어도 하나의 번역 개시 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 작동가능하게 연결된 번역 개시 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하고, 번역 개시 서열, 예를 들어, 시작 코돈을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 번역 개시 서열은 코작(Kozak) 또는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 인접한 번역 개시 서열, 예를 들어, 코작 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 번역 개시 서열은 비-코딩 시작 코돈이다. 일부 실시 형태에서, 번역 개시 서열, 예를 들어, 코작 서열은 각각의 발현 서열의 한 측 또는 양측에 존재하여, 발현 생성물의 분리를 초래한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 인접한 적어도 하나의 번역 개시 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 번역 개시 서열은 폴리리보뉴클레오티드에 대한 형태적 유연성을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 번역 개시 서열은 폴리리보뉴클레오티드의 실질적으로 단일 가닥 영역 내에 있다. 번역 개시 서열의 추가의 예는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제2019/118919호의 단락 [0163]~[0165]에 기재되어 있다.
폴리리보뉴클레오티드는 1개 초과의 시작 코돈, 예컨대 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개 또는 60개 초과의 시작 코돈(그러나 이에 한정되는 것은 아님)을 포함할 수 있다. 번역은 제1 시작 코돈 상에서 개시될 수 있거나, 제1 시작 코돈의 하류에서 개시될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 제1 시작 코돈이 아닌 코돈, 예를 들어, AUG에서 개시될 수 있다. 폴리리보뉴클레오티드의 번역은 대안적인 번역 개시 서열, 예컨대 ACG, AGG, AAG, CTG/CUG, GTG/GUG, ATA/AUA, ATT/AUU, TTG/UUG(그러나 이에 한정되는 것은 아님)에서 개시될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 번역은 선택적 조건, 예를 들어, 스트레스 유도 조건 하에서 대안적인 번역 개시 서열에서 시작한다. 비제한적인 예로서, 폴리리보뉴클레오티드의 번역은 대안적인 번역 개시 서열, 예컨대 ACG에서 시작할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 폴리리보뉴클레오티드 번역은 대안적인 번역 개시 서열, CTG/CUG에서 시작할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 폴리리보뉴클레오티드 번역은 대안적인 번역 개시 서열, GTG/GUG에서 시작할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 폴리리보뉴클레오티드는 반복부-관련 비-AUG(RAN) 서열, 예컨대 반복적 RNA의 짧은 스트레치를 포함하는 대안적인 번역 개시 서열, 예를 들어, CGG, GGGGCC(서열 번호 1), CAG, CTG에서 번역을 시작할 수 있다.
종결 요소
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드의 폴리리보뉴클레오티드 카고)는 최소 하나의 종결 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 작동가능하게 연결된 종결 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 종결 요소를 결여한다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하고, 각각의 발현 서열은 종결 요소를 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하고, 발현 서열은, 폴리리보뉴클레오티드가 연속적으로 번역되도록, 종결 요소를 결여한다. 종결 요소의 배제는 발현 생성물의 롤링 서클 번역 또는 연속적 발현을 발생시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하고, 각각의 발현 서열은 종결 요소를 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하고, 발현 서열은, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 연속적으로 번역되도록, 종결 요소를 결여한다. 종결 요소의 배제는 리보솜 멈춤 또는 탈락의 결여로 인해, 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드의 롤링 서클 번역 또는 연속적 발현을 발생시킬 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 롤링 서클 번역은 각각의 발현 서열을 통해 연속적 발현 생성물을 발현한다. 일부 다른 실시 형태에서, 발현 서열의 종결 요소는 스태거 요소의 일부일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 하나 이상의 발현 서열은 종결 요소를 포함한다. 그러나, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 뒤이은(예를 들어, 제2, 제3, 제4, 제5 등의) 발현 서열의 롤링 서클 번역 또는 발현이 수행된다. 이러한 경우에, 발현 생성물은 리보솜이 종결 요소, 예를 들어, 정지 코돈에 직면할 때 리보솜을 탈락시킬 수 있고, 번역을 종결시킨다. 일부 실시 형태에서, 번역은 리보솜, 예를 들어, 리보솜의 적어도 하나의 서브유닛이 원형 폴리리보뉴클레오티드와 접촉하여 남아 있는 동안 종결된다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열의 단부에 종결 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 발현 서열은 잇달아 2개 이상의 종결 요소를 포함한다. 이러한 실시 형태에서, 번역은 종결되고, 롤링 서클 번역은 종결된다. 일부 실시 형태에서, 리보솜은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 완전히 탈착된다. 일부 이러한 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 뒤이은(예를 들어, 제2, 제3, 제4, 제5 등의) 발현 서열의 생성은 번역의 개시 전에 리보솜이 원형 폴리리보뉴클레오티드와 재결착하는 것을 요구할 수 있다. 일반적으로, 종결 요소는 번역의 종결을 신호화하는 프레임내 뉴클레오티드 삼중자, 예를 들어, UAA, UGA, UAG를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 하나 이상의 종결 요소는 프레임-이동된 종결 요소, 예컨대 번역을 종결시킬 수 있는 오프-프레임 또는 -1 및 + 1 이동된 리딩 프레임(예를 들어, 히든 스톱)(그러나 이에 한정되는 것은 아님)이다. 프레임-이동된 종결 요소는 발현 서열의 제2 및 제3 리딩 프레임에서 보이는 뉴클레오티드 삼중자, TAA, TAG, 및 TGA를 포함한다. 프레임-이동된 종결 요소는 종종 세포에 유해한 mRNA의 오해독을 방지하는 데 있어서 중요할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 종결 요소는 정지 코돈이다.
종결 요소의 추가의 예는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제2019/118919호의 단락 [0169]~[0170]에 기재되어 있다.
비번역된 영역
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 비번역된 영역(UTR)을 포함한다. 유전자를 포함하는 게놈 영역의 UTR은 전사되지만 번역되지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, UTR은 본원에 기재된 발현 서열의 번역 개시 서열의 상류에 포함될 수 있다. 일부 실시 형태에서, UTR은 본원에 기재된 발현 서열의 하류에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 제1 발현 서열에 대한 하나의 UTR은 제2 발현 서열에 대한 또 다른 UTR과 동일하거나, 그와 연속적이거나 그와 중첩한다.
예시적인 비번역된 영역은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019/118919호의 단락 [0197]~[201]에 기재되어 있다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 포함한다. 예시적인 폴리-A 서열은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019/118919호의 단락 [0202]~[0205]에 기재되어 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 결여한다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 그 내에 내포된 아데노신 및 우리딘의 하나 이상의 스트레치를 갖는 UTR을 포함한다. 이들 AU 풍부 특징은 발현 생성물의 턴오버 속도를 증가시킬 수 있다.
UTR AU 풍부 요소(ARE)의 도입, 제거, 또는 변형은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성, 또는 면역원성(예를 들어, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 수준)을 조정하는 데 유용할 수 있다. 특정 원형 폴리리보뉴클레오티드를 조작하는 경우, ARE의 하나 이상의 카피는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 도입될 수 있고, ARE의 카피는 발현 생성물의 번역 및/또는 생성을 조정할 수 있다. 마찬가지로, ARE는 확인되고 제거되거나 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 조작되어 세포내 안정성을 조정하고, 따라서 생성된 단백질의 번역 및 생성에 영향을 미칠 수 있다.
임의의 유전자로부터의 임의의 UTR은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 각각의 플랭킹 영역 내로 혼입될 수 있음을 이해해야 한다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5'-UTR을 결여하고, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터의 단백질 발현에 위해 적격이다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 3'-UTR을 결여하고, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터의 단백질 발현에 위해 적격이다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 결여하고, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터의 단백질 발현을 위해 적격이다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 종결 요소를 결여하고, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터의 단백질 발현을 위해 적격이다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위를 결여하고, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터의 단백질 발현을 위해 적격이다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 캡을 결여하고, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터의 단백질 발현을 위해 적격이다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5'-UTR, 3'-UTR, 및 IRES를 결여하고, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터의 단백질 발현을 위해 적격이다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하기 서열 중 하나 이상을 포함한다: 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 서열, 하나 이상의 복제 단백질을 코딩하는 서열, 외인성 유전자를 코딩하는 서열, 치료제를 코딩하는 서열, 조절 요소(예를 들어, 번역 조정제, 예를 들어, 번역 증진제 또는 억제제), 번역 개시 서열, 내인성 유전자를 표적화하는 하나 이상의 조절 핵산(예를 들어, siRNA, lncRNA, shRNA), 및 치료 mRNA 또는 단백질을 코딩하는 서열.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5'-UTR을 결여한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 3'-UTR을 결여한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 결여한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 종결 요소를 결여한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위를 결여한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에 의한 분해 감수성을 결여한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 분해 감수성을 결여한다는 사실은 원형 폴리리보뉴클레오티드가 엑소뉴클레아제에 의해 분해되지 않거나, 엑소뉴클레아제의 존재 하에서 단지 제한된 정도로, 예를 들어, 엑소뉴클레아제의 부재 하에서와 대등하거나 유사한 정도로 분해됨을 의미할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에 의해 분해되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에 노출되는 경우 감소된 분해를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 캡-결합 단백질에의 결합을 결여한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5' 캡을 결여한다.
스태거 요소
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 인접한 적어도 하나의 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 각각의 발현 서열에 인접한 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스태거 요소는 각각의 발현 서열의 한 측 또는 양측에 존재하여, 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드(들) 및 또는 폴리펩티드(들)의 분리를 초래한다. 일부 실시 형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열의 부분이다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하고, 하나 이상의 발현 서열 각각은 원형 폴리리보뉴클레오티드 상의 스태거 요소에 의해 뒤이은 발현 서열로부터 분리된다. 일부 실시 형태에서, 스태거 요소는 (a) 단일 발현 서열의 번역의 2개의 라운드로부터의 또는 (b) 2개 이상의 발현 서열의 번역의 하나 이상의 라운드로부터의 단일 폴리펩티드의 생성을 방지한다. 일부 실시 형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열로부터 별개의 서열이다. 일부 실시 형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열의 발현 서열의 부분을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 스태거 요소를 포함한다. 롤링 서클 번역을 유지하면서, 연속적 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드의 생성을 회피하기 위해, 스태거 요소는 번역 동안 리보솜 휴지를 유도하기 위해 포함될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열 중 적어도 하나의 3' 단부에 있다. 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 롤링 서클 번역 동안 리보솜을 멈추도록 구성될 수 있다. 스태거 요소는 2A-유사, 또는 CHYSEL(서열 번호 2)(시스-작용 히드롤라제 요소) 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 스태거 요소는 X1X2X3EX5NPGP인 C-말단 컨센서스 서열을 갖는 서열을 코딩하고, 여기서 X1은 부재하거나 G 또는 H이고, X2는 부재하거나 D 또는 G이고, X3은 D 또는 V 또는 I 또는 S 또는 M이고, X5는 임의의 아미노산이다(서열번호 83). 일부 실시 형태에서, 이 서열은 강한 알파-나선 경향을 갖는 아미노산의 비-보존된 서열, 이어서 컨센서스 서열 -D(V/I)EXNPGP(여기서 x= 임의의 아미노산임)(서열 번호 4)를 포함한다. 스태거 요소의 일부 비제한적인 예는 GDVESNPGP(서열 번호 5), GDIEENPGP(서열 번호 6), VEPNPGP(서열 번호 7), IETNPGP(서열 번호 8), GDIESNPGP(서열 번호 9), GDVELNPGP(서열 번호 10), GDIETNPGP(서열 번호 11), GDVENPGP(서열 번호 12), GDVEENPGP(서열 번호 13), GDVEQNPGP(서열 번호 14), IESNPGP(서열 번호 15), GDIELNPGP(서열 번호 16), HDIETNPGP(서열 번호 17), HDVETNPGP(서열 번호 18), HDVEMNPGP(서열 번호 19), GDMESNPGP(서열 번호 20), GDVETNPGP(서열 번호 21) GDIEQNPGP(서열 번호 22), 및 DSEFNPGP(서열 번호 23)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 스태거 요소는 예컨대 본원에 기재된 컨센서스 서열의 G와 P 사이에서 발현 생성물을 절단한다. 한 비제한적인 예로서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 생성물을 절단하는 적어도 하나의 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 발현 서열에 인접한 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 각각의 발현 서열 뒤에 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 각각의 발현 서열의 한 측 또는 양측에 존재하는 스태거 요소를 포함하여, 각각의 발현 서열로부터의 개별적인 펩티드 및 또는 폴리펩티드의 번역을 초래한다.
일부 실시 형태에서, 스태거 요소는 번역 동안 리보솜 휴지를 유도하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 또는 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 비천연 뉴클레오티드는 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노 및 잠금 핵산(LNA), 뿐만 아니라 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산(TNA)을 포함할 수 있다. 이들과 같은 예는 분자의 백본에 대한 변화에 의해 천연 발생 DNA 또는 RNA로부터 구별된다. 변형은 번역 동안 리보솜 휴지를 유도할 수 있는 당, 핵염기, 뉴클레오시드간 연결(예를 들어, 연결 포스페이트에 대한 / 포스포디에스테르 연결에 대한 / 포스포디에스테르 백본에 대한), 및 이들의 임의의 조합에 대한 임의의 변형을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 예시적인 변형의 일부는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
일부 실시 형태에서, 스태거 요소는 다른 형태로 원형 폴리리보뉴클레오티드에 존재한다. 예를 들어, 일부 예시적인 원형 폴리리보뉴클레오티드에서, 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 종결 요소, 및 제1 발현 서열에 뒤이은 발현의 제1 번역 개시 서열로부터 종결 요소를 분리하는 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함한다. 일부 예에서, 제1 발현 서열의 제1 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열에 뒤이은 발현의 제1 번역 개시 서열의 상류에(그에 대해 5'에) 있다. 일부 경우에, 제1 발현 서열 및 제1 발현 서열에 뒤이은 발현 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 2개의 별개의 발현 서열이다. 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 서열 사이의 거리는 제1 발현 서열 및 그의 뒤이은 발현 서열의 연속적 번역을 가능하게 할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제1 스태거 요소는 종결 요소를 포함하고, 제1 발현 서열의 발현 생성물을 그의 뒤이은 발현 서열의 발현 생성물로부터 분리하고, 그에 의해 별개의 발현 생성물을 생성한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 뒤이은 서열의 제1 번역 개시 서열의 상류에 제1 스태거 요소를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속적으로 번역되는 반면, 제2 발현 서열에 뒤이은 발현 서열의 제2 번역 개시 서열의 상류에 있는 제2 발현 서열의 스태거 요소를 포함하는 상응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속적으로 번역되지 않는다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 단지 하나의 발현 서열이 존재하며, 제1 발현 서열 및 그의 뒤이은 발현 서열은 동일한 발현 서열이다. 일부 예시적인 원형 폴리리보뉴클레오티드에서, 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 제1 종결 요소, 및 종결 요소를 하류 번역 개시 서열로부터 분리하는 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함한다. 일부 이러한 예에서, 제1 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 제1 번역 개시 서열의 상류에(그에 대해 5'에) 있다. 일부 경우에, 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 서열 사이의 거리는 제1 발현 서열 및 임의의 뒤이은 발현 서열의 연속적 번역을 가능하게 한다.
일부 실시 형태에서, 제1 스태거 요소는 제1 발현 서열의 하나의 라운드 발현 생성물을 제1 발현 서열의 다음 라운드 발현 생성물로부터 분리하고, 그에 의해 별개의 발현 생성물을 생성한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 제1 번역 개시 서열의 상류에 제1 스태거 요소를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속적으로 번역되는 반면, 상응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제2 발현 서열의 제2 번역 개시 서열의 상류에 스태거 요소를 포함하는 상응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속적으로 번역되지 않는다. 일부 경우에, 제2 스태거 요소와 제2 번역 개시 서열 사이의 거리는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리보다 상응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드에서 적어도 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 또는 10x 더 크다. 일부 경우에, 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리는 적어도 2 nt, 3 nt, 4 nt, 5 nt, 6 nt, 7 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt, 25 nt, 30 nt, 35 nt, 40 nt, 45 nt, 50 nt, 55 nt, 60 nt, 65 nt, 70 nt, 75 nt, 또는 그 초과이다. 일부 실시 형태에서, 제2 스태거 요소와 제2 번역 개시 사이의 거리는 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리보다 적어도 2 nt, 3 nt, 4 nt, 5 nt, 6 nt, 7 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt, 25 nt, 30 nt, 35 nt, 40 nt, 45 nt, 50 nt, 55 nt, 60 nt, 65 nt, 70 nt, 75 nt, 또는 그 초과이다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 초과의 발현 서열을 포함한다.
스태거 요소의 예는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019/118919호의 단락 [0172]~[0175]에 기재되어 있다.
비-코딩 서열
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드의 폴리리보뉴클레오티드 카고)는 하나 이상의 비-코딩 서열, 예를 들어, 폴리펩티드의 발현을 코딩하지 않는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 비-코딩 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 폴리펩티드 발현 서열을 코딩하지 않는다.
비코딩 서열은 천연 또는 합성 서열일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비코딩 서열은 세포 거동, 예컨대, 예를 들어, 림프구 거동을 변경시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비코딩 서열은 세포 RNA 서열에 대해 안티센스이다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 전형적으로 약 5~500 염기 쌍(bp)(특이적 RNA 구조에 따라(예를 들어, miRNA 5~30 bp, IncRNA 200~500 bp)의 RNA 또는 RNA-유사 구조인 조절 핵산을 포함하고, 세포 내의 발현된 표적 유전자 내의 코딩 서열과 동일한(상보적) 또는 거의 동일한(실질적으로 상보적) 핵염기 서열을 가질 수 있다. 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 더 작은 miRNA 중간체 또는 성숙 miRNA로 프로세싱될 수 있는, 약 50 내지 약 1000 bp일 수 있는, 더 작은 RNA, 예를 들어, miRNA 전구체로 프로세싱될 수 있는 RNA 전구체를 코딩하는 조절 핵산을 포함한다.
긴 비-코딩 RNA(IncRNA)는 100개 초과의 뉴클레오티드의 비-단백질 코딩 전사체로서 정의된다. 많은 IncRNA는 조직 특이적인 것으로서 특성화된다. 인근의 단백질-코딩 유전자에 대해 반대 방향에서 전사되는 분기성 IncRNA는 상당한 비율(예를 들어, 포유동물 게놈 내의 총 IncRNA의 약 20%)을 포함하고, 가능하게는 인근의 유전자의 전사를 조절한다. 한 실시 형태에서, 본원에서 제공된 폴리리보뉴클레오티드는 IncRNA의 센스 가닥을 포함한다. 한 실시 형태에서, 본원에서 제공된 폴리리보뉴클레오티드는 IncRNA의 안티센스 가닥을 포함한다.
실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, mRNA)의 전부에 대해 또는 적어도 하나의 단편에 대해 실질적으로 상보적, 또는 완전히 상보적인 조절 핵산을 코딩한다. 실시 형태에서, 조절 핵산은 인트론과 엑손 사이의 경계에, 엑손 사이에, 또는 엑손에 인접한 서열을 보완하여, 전사를 위한 특이적 유전자의 새롭게 생성된 핵 RNA 전사체의 mRNA로의 성숙을 방지한다. 특이적 유전자에 대해 상보적인 조절 핵산은 그 유전자에 대한 mRNA와 혼성화되고 그의 번역을 방지할 수 있다. 안티센스 조절 핵산은 DNA, RNA, 또는 그의 유도체 또는 혼성체일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조절 핵산은 내인성 유전자 또는 외인성 유전자의 발현의 조절에 참여하는 단백질에 결합할 수 있는 단백질-결합 부위를 포함한다.
실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드의 길이는 관심 전사체에 혼성화하는 조절 핵산을 코딩하고, 여기서 조절 RNA는 약 5개 내지 30개의 뉴클레오티드, 약 10개 내지 30개의 뉴클레오티드, 또는 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 30개 초과의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 실시 형태에서, 표적화된 전사체와의 조절 RNA의 서열 동일성의 정도는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%이다.
실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 표적 유전자의 약 5개 내지 약 25개의 인접한 뉴클레오티드와 동일한 마이크로RNA(miRNA) 분자를 코딩하거나, 그 miRNA에 대한 전구체를 코딩한다. 일부 실시 형태에서, miRNA 서열은 mRNA가 특이적 표적 mRNA를 인식하고 그에 결합하게 하는 것을 갖는다. 실시 형태에서, miRNA 서열은 디뉴클레오티드 AA로 시작되고, 약 30~70%(약 30~60%, 약 40~60%, 또는 약 45%~55%)의 GC-함량을 포함하고, 예를 들어 표준 BLAST 검색에 의해 결정된 바와 같이, 그것이 도입될 대상체(예를 들어, 포유동물)의 게놈 내의 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열과 높은 백분율 동일성을 갖지 않는다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 miRNA(또는 miRNA 전구체), 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 초과의 miRNA 또는 miRNA 전구체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 표적 서열과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 100% 뉴클레오티드 서열 상보성을 갖는 miRNA(또는 그의 전구체)를 코딩하는 서열을 포함한다.
siRNA 및 shRNA는 내인성 마이크로RNA(miRNA) 유전자의 프로세싱 경로에서의 중간체를 닮았다. 일부 실시 형태에서, siRNA는 miRNA로서 기능할 수 있고, 그 역도 마찬가지이다. 마이크로RNA는, siRNA와 같이, 표적 유전자를 하향조절하기 위해 RISC를 사용하지만, siRNA와는 달리, 대부분의 동물 miRNA는 mRNA를 절단하지 않는다. 대신, miRNA는 번역 억제 또는 폴리A 제거 및 mRNA 분해를 통해 단백질 산출량을 감소시킨다. 알려진 miRNA 결합 부위는 mRNA 3' UTR 내에 있으며; miRNA는 miRNA의 5' 단부로부터의 뉴클레오티드 2~8과 거의 완벽한 상보성을 갖는 부위를 표적화하는 것으로 보인다. 이 영역은 시드 영역으로 알려져 있다. 성숙 siRNA 및 miRNA는 상호교환 가능하기 때문에, 외인성 siRNA는 siRNA와 시드 상보성을 갖는 mRNA를 하향조절한다.
알려진 miRNA 서열의 목록은 검색 조직, 예컨대 다른 것들 중에서도, 웰컴 트러스트 생어 협회(Wellcome Trust Sanger Institute), 펜 생물정보학 센터(Penn Center for Bioinformatics), 메모리얼 슬로안 케터링 암 센터(Memorial Sloan Kettering Cancer Center), 및 유럽 분자 생물학 실험실(European Molecule Biology Laboratory)에 의해 유지되는 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 알려진 효과적인 siRNA 서열 및 동종체 결합 부위는 또한 관련 문헌에 잘 나타나 있다. RNAi 분자는 당업계에 알려진 기술에 의해 용이하게 설계되고 생성된다. 또한, 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 발견할 기회를 증가시키는 컴퓨터 도구가 존재한다.
단백질-결합 서열
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질, 예를 들어, 리보솜이 RNA 서열 내의 내부 부위에 결합하는 것을 가능하게 하는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 단백질 결합 부위, 예를 들어, 리보솜 결합 부위를 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 조작함으로써, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 숙주의 면역계에 의한 검출을 회피하거나 감소된 검출을 가질 수 있고, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 숙주의 면역계의 성분으로부터 마스킹함으로써, 조정된 분해, 또는 조정된 번역을 가질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어 면역 반응, 예를 들어, CTL(세포독성 T 림프구) 반응을 회피하기 위해, 적어도 하나의 면역단백질 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고 원형 폴리리보뉴클레오티드를 외인성으로서 마스킹하는 것을 보조하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시 형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고 원형 폴리리보뉴클레오티드를 외인성 또는 외래로서 은폐시키는 것을 보조하는 뉴클레오티드 서열이다.
선형 RNA에 대한 리보솜 결착의 전통적인 메카니즘은 RNA의 캡핑된 5' 단부에 대한 리보솜 결합을 수반한다. 5' 단부로부터, 리보솜은 개시 코돈으로 이동하고, 그 때 제1 펩티드 결합이 형성된다. 본 발명에 따르면, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역의 내부 개시(즉, 캡-독립적)는 유리 단부 또는 캡핑된 단부를 요구하지 않는다. 오히려, 리보솜은 비-캡핑된 내부 부위에 결합하고, 그에 의해 리보솜은 개시 코돈에서 폴리펩티드 신장을 시작한다. 일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 리보솜 결합 부위, 예를 들어, 개시 코돈을 포함하는 하나 이상의 RNA 서열을 포함한다.
천연 5'UTR은 번역 개시를 위해 역할을 하는 특색을 보유한다. 이들은 리보솜이 많은 유전자의 번역을 개시시키는 과정에 관여하는 것으로 통상적으로 알려져 있는 코작 서열과 같은 특징을 갖는다. 코작 서열은 컨센서스 CCR(A/G)CCAUGG(서열 번호 24)를 갖고, 여기서 R은 시작 코돈(AUG)의 3개의 염기 상류에 있는 퓨린(아데닌 또는 구아닌)이고, 여기에 또 다른 'G'가 이어진다. 5 'UTR은 또한 신장 인자 결합에 관여하는 2차 구조를 형성하는 것으로 알려졌다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질에 결합하는 단백질 결합 서열을 코딩한다. 일부 실시 형태에서, 단백질 결합 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 특이적 표적에 표적화하거나 국재화한다. 일부 실시 형태에서, 단백질 결합 서열은 단백질의 아르기닌-풍부 영역에 특이적으로 결합한다.
일부 실시 형태에서, 단백질 결합 부위는 단백질, 예컨대 ACIN1, AGO, APOBEC3F, APOBEC3G, ATXN2, AUH, BCCIP, CAPRIN1, CELF2, CPSF1, CPSF2, CPSF6, CPSF7, CSTF2, CSTF2T, CTCF, DDX21, DDX3, DDX3X, DDX42, DGCR8, EIF3A, EIF4A3, EIF4G2, ELAVL1, ELAVL3, FAM120A, FBL, FIP1L1, FKBP4, FMR1, FUS, FXR1, FXR2, GNL3, GTF2F1, HNRNPA1, HNRNPA2B1, HNRNPC, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPM, HNRNPU, HNRNPUL1, IGF2BP1, IGF2BP2, IGF2BP3, ILF3, KHDRBS1, LARP7, LIN28A, LIN28B, m6A, MBNL2, METTL3, MOV10, MSI1, MSI2, NONO, NONO-, NOP58, NPM1, NUDT21, PCBP2, POLR2A, PRPF8, PTBP1, RBFOX2, RBM10, RBM22, RBM27, RBM47, RNPS1, SAFB2, SBDS, SF3A3, SF3B4, SIRT7, SLBP, SLTM, SMNDC1, SND1, SRRM4, SRSF1, SRSF3, SRSF7, SRSF9, TAF15, TARDBP, TIA1, TNRC6A, TOP3B, TRA2A, TRA2B, U2AF1, U2AF2, UNK, UPF1, WDR33, XRN2, YBX1, YTHDC1, YTHDF1, YTHDF2, YWHAG, ZC3H7B, PDK1, AKT1, 및 RNA에 결합하는 임의의 다른 단백질에 대한 결합 부위를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
스페이서 서열
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 스페이서 서열을 포함한다. 스페이서는 2개의 인접한 폴리뉴클레오티드 영역 사이에 거리 또는 유연성을 제공하는 (예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의) 임의의 인접한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 스페이서는 본원에 기재된 핵산 요소 중 임의의 것 사이에 존재할 수 있다. 스페이서는 또한 본원에 기재된 핵산 요소 내에 존재할 수 있다.
스페이서는 예를 들어, 적어도 5개(예를 들어, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개)의 리보뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 스페이서 영역은 적어도 5개(예를 들어, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개)의 리보뉴클레오티드의 길이이다. 각각의 스페이서 영역은 예를 들어, 5 내지 500개(예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개)의 리보뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 제1 스페이서 영역, 제2 스페이서 영역, 또는 제1 스페이서 영역 및 제2 스페이서 영역은 폴리A 서열을 포함할 수 있다. 제1 스페이서 영역, 제2 스페이서 영역, 또는 제1 스페이서 영역 및 제2 스페이서 영역은 폴리A-C 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 스페이서 영역, 제2 스페이서 영역, 또는 제1 스페이서 영역 및 제2 스페이서 영역은 폴리A-G 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 스페이서 영역, 제2 스페이서 영역, 또는 제1 스페이서 영역 및 제2 스페이서 영역은 폴리A-T 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 스페이서 영역, 제2 스페이서 영역, 또는 제1 스페이서 영역 및 제2 스페이서 영역은 무작위 서열을 포함한다.
스페이서는 또한 본원에 기재된 핵산 영역 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 카고 영역은 하나 또는 다수의 스페이서를 포함할 수 있다. 스페이서는 폴리뉴클레오티드 카고 내에서 영역을 분리할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 스페이서 서열은 예를 들어, 적어도 10개의 뉴클레오티드의 길이, 적어도 15개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 적어도 30개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 서열은 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 또는 30개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 서열은 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 또는 30개 이하의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 서열은 20 내지 50개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시 형태에서, 스페이서 서열은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드의 길이이다.
스페이서 서열은 폴리A 서열, 폴리A-C 서열, 폴리C 서열, 또는 폴리-U 서열일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 스페이서 서열은 폴리A-T, 폴리A-C, 폴리A-G, 또는 무작위 서열일 수 있다.
스페이서 서열은 IRES를 인접한 구조적 요소로부터 분리하여 IRES 또는 인접한 요소의 구조 및 기능을 유지하는 데 사용될 수 있다. 스페이서는 IRES에 따라 특이적으로 조작될 수 있다. 일부 실시 형태에서, RNA 폴딩 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 RNAFold는 스페이서를 포함하는 벡터의 다양한 요소의 설계를 가이드하는 데 이용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 5' 스페이서 서열(예를 들어, 5' 어닐링 영역과 폴리리보뉴클레오티드 카고 사이에)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 적어도 10개의 뉴클레오티드의 길이이다. 또 다른 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 적어도 15개의 뉴클레오티드의 길이이다. 추가의 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 적어도 30개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 또는 30개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 또는 30개 이하의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 20 내지 50개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드의 길이이다. 한 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 폴리A 서열이다. 또 다른 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 폴리A-C 서열이다. 일부 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 폴리A-G 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 폴리A-T 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 무작위 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 3' 스페이서 서열(예를 들어, 3' 어닐링 영역과 폴리리보뉴클레오티드 카고 사이에)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 3' 스페이서 서열은 적어도 10개의 뉴클레오티드의 길이이다. 또 다른 실시 형태에서, 3' 스페이서 서열은 적어도 15개의 뉴클레오티드의 길이이다. 추가의 실시 형태에서, 3' 스페이서 서열은 적어도 30개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 3' 스페이서 서열은 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 또는 30개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 3' 스페이서 서열은 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 또는 30개 이하의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 3' 스페이서 서열은 20 내지 50개의 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 실시 형태에서, 3' 스페이서 서열은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드의 길이이다. 한 실시 형태에서, 3' 스페이서 서열은 폴리A 서열이다. 또 다른 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 폴리A-C 서열이다. 일부 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 폴리A-G 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 폴리A-T 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 5' 스페이서 서열은 무작위 서열을 포함한다.
한 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 5' 스페이서 서열을 포함하지만, 3' 스페이서 서열은 포함하지 않는다. 또 다른 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 3' 스페이서 서열을 포함하지만, 5' 스페이서 서열은 포함하지 않는다. 또 다른 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 5' 스페이서 서열도 3' 스페이서 서열도 포함하지 않는다. 또 다른 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 IRES 서열을 포함하지 않는다. 추가의 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 IRES 서열, 5' 스페이서 서열 또는 3' 스페이서 서열을 포함하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 스페이서 서열은 적어도 3개의 리보뉴클레오티드, 적어도 4개의 리보뉴클레오티드, 적어도 5개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 8개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 10개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 12개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 15개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 20개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 25개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 30개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 40개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 50개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 60개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 70개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 80개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 90개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 100개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 120개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 150개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 200개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 250개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 300개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 400개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 500개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 600개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 700개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 800개의 리보뉴클레오티드, 적어도 약 900개의 리보뉴클레오티드, 또는 적어도 약 100개의 리보뉴클레오티드를 포함한다.
생물반응기
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 정제하는 임의의 방법은 생물반응기에서 수행될 수 있다. 생물반응기는 유기체 또는 이러한 유기체로부터 유래된 생화학적으로 활성인 물질을 수반하는 화학적 또는 생물학적 공정이 수행되는 임의의 용기를 지칭한다. 생물반응기는 본원에 기재된 원형 RNA를 정제하거나 생성하기 위한 무세포 방법과 혼화성일 수 있다. 생물반응기를 위한 용기는 단일 사용(일회용), 오토클레이브 가능할, 또는 멸균 가능할 수 있는 배양 플라스크, 디쉬, 또는 백을 포함할 수 있다. 생물반응기는 유리로 제조될 수 있거나, 이는 중합체-기반일 수 있거나, 이는 다른 물질로 제조될 수 있다.
생물반응기의 예는 제한 없이, 교반 탱크(예를 들어, 잘 혼합된) 생물반응기 및 관상(예를 들어, 플러그 유동) 생물반응기, 에어리프트 생물반응기, 막 교반 탱크, 스핀 필터 교반 탱크, 진동혼합기, 유동층 반응기, 및 막 생물반응기를 포함한다. 생물반응기를 작동하는 방식은 회분식 또는 연속식 공정일 수 있다. 생물반응기는 시약 및 생성물 스트림이 연속적으로 공급되고 있고 시스템으로부터 빼내어지는 경우 연속적이다. 회분식 생물반응기는 연속적 재순환 유동을 가질 수 있지만, 시약 또는 생성물 수확물의 연속적 공급은 갖지 않을 수 있다.
본 발명의 일부 방법은 폴리리보뉴클레오티드의 대규모 생성에 관한 것이다. 대규모 생성 방법을 위해, 방법은 1 리터(L) 내지 50 L, 또는 그 초과(예를 들어, 5 L, 10 L, 15 L, 20 L, 25 L, 30 L, 35 L, 40 L, 45 L, 50 L, 또는 그 초과)의 부피에서 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 방법은 5 L 내지 10 L, 5 L 내지 15 L, 5 L 내지 20 L, 5 L 내지 25 L, 5 L 내지 30 L, 5 L 내지 35 L, 5 L 내지 40 L, 5 L 내지 45 L, 10 L 내지 15 L, 10 L 내지 20 L, 10 L 내지 25 L, 20 L 내지 30 L, 10 L 내지 35 L, 10 L 내지 40 L, 10 L 내지 45 L, 10 L 내지 50 L, 15 L 내지 20 L, 15 L 내지 25 L, 15 L 내지 30 L, 15 L 내지 35 L, 15 L 내지 40 L, 15 L 내지 45 L, 또는 15 내지 50 L의 부피에서 수행될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 생물반응기는 적어도 1 g의 RNA를 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 생물반응기는 1~200 g의 RNA(예를 들어, 1~10 g, 1~20 g, 1~50 g, 10~50 g, 10~100 g, 50~100 g, 50~200 g의 RNA)를 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 생성되는 양은 리터당(예를 들어, 리터당 1~200 g), 회분 또는 반응당(예를 들어, 회분 또는 반응당 1~200 g), 또는 단위 시간당(예를 들어, 시간당 또는 일당 1~200 g) 측정된다.
일부 실시 형태에서, 생성 용량을 증가시키기 위해 하나 초과의 생물반응기가 일련으로 이용될 수 있다(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 생물반응기가 일련으로 사용될 수 있다).
사용 방법
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 바와 같이 제조된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 요법 또는 농업에서 이펙터로서 사용된다.
예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에게 투여될 수 있다(예를 들어, 제약, 수의학, 또는 농업 조성물로). 일부 실시 형태에서, 대상체는 척추 동물(예를 들어, 포유동물, 조류, 어류, 파충류, 또는 양서류)이다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 실시 형태에서, 대상체는 비-인간 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 유인원), 유제류(예를 들어, 소, 버팔로, 양, 염소, 돼지, 낙타, 라마, 알파카, 사슴, 말, 당나귀), 육식동물(예를 들어, 개, 고양이), 설치류(예를 들어, 래트, 마우스), 또는 토끼목(예를 들어, 토끼)이다. 실시 형태에서, 대상체는 조류, 예컨대 조류 분류군 순계목(예를 들어, 닭, 칠면조, 꿩, 메추라기), 기러기목(예를 들어, 오리, 거위), 고관목(예를 들어, 타조, 에뮤), 비둘기목(예를 들어, 피존, 도브), 또는 앵무새목(예를 들어, 앵무새)의 구성원이다. 실시 형태에서, 대상체는 무척추동물, 예컨대 절지동물(예를 들어, 곤충류, 거미류, 갑각류), 선충, 환형동물, 연충, 또는 연체동물이다. 실시 형태에서, 대상체는 무척추동물 농업적 해충 또는 무척추동물 또는 척추동물 숙주 상에 기생하는 무척추동물이다. 실시 형태에서, 대상체는 식물, 예컨대 피자 식물(쌍자엽 또는 단자엽일 수 있음) 또는 나자 식물(예를 들어, 침엽수, 소철류, 마황문, 은행나무), 양치식물, 쇠뜨기, 석송, 또는 선태식물이다. 실시 형태에서, 대상체는 진핵 조류(단세포 또는 다세포)이다. 실시 형태에서, 대상체는 농업적으로 또는 원예적으로 중요한 식물, 예컨대 줄뿌림 작물 식물, 과실-생산 식물 및 나무, 채소, 나무, 및 관상용 꽃, 관목, 나무, 지표식물, 및 잔디풀을 포함하는 관상용 식물이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 조성물 또는 제형을 대상체에게 제공함으로써 대상체를 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 조성물 또는 제형은 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 DNA 분자 또는 RNA 분자)이거나 이를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 진핵 대상체에게 제공된다. 일부 실시 형태에서, 조성물 또는 제형은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 진핵 또는 원핵 세포이거나 이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 조성물 또는 제형을 대상체에게 제공함으로써 이를 필요로 하는 대상체에서 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 조성물 또는 제형은 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 DNA 분자 또는 폴리리보뉴클레오티드)이거나 이를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 진핵 대상체에게 제공된다. 일부 실시 형태에서, 조성물 또는 제형은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 진핵 또는 원핵 세포이거나 이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 진핵 또는 원핵 세포를 대상체에게 제공함으로써 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 대상체에게 제공하는 방법을 제공한다.
제형
본 발명의 일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 조성물, 예를 들어, 세포, 식물, 무척추 동물, 비-인간 척추 동물, 또는 인간 대상체에의 전달을 위한 조성물, 예를 들어, 농업, 수의학, 또는 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 제약 조성물로 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 폴리리보뉴클레오티드 및 희석제, 담체, 보조제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드 및 담체 또는 임의의 담체가 없는 희석제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 담체가 없는 희석제를 갖는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 대상체에의 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 네이키드 전달을 위해 사용된다.
제약 조성물은 임의적으로 하나 이상의 추가적인 활성 물질, 예를 들어, 치료적으로 및/또는 예방적으로 활성 물질을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 임의적으로 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 예컨대 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 승인되고 불활성 성분 데이터베이스에 열거된 불활성 성분 중 어느 하나)에 대한 비히클 또는 매질로서 역할을 하는 불활성 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 멸균성 및/또는 피로겐-무함유일 수 있다. 제형 및/또는 제약 작용제의 제조에 있어서 일반적 고려사항은 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005](본원에 참조로 포함됨)에서 발견될 수 있다. 불활성 물질의 비-제한적 예는 용매, 수성 용매, 비-수성 용매, 분산 매질, 희석제, 분산제, 현탁 조제, 표면 활성제, 등장성제, 증점제, 유화제, 보존제, 중합체, 펩티드, 단백질, 세포, 히알루로니다제, 분산제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 완충제(예를 들어, 포스페이트 완충 염수(PBS)), 윤활제, 오일, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본원에 제공된 제약 조성물의 설명은 원칙적으로 인간에의 투여에 적합한 제약 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 임의의 다른 동물에의, 예를 들어, 비-인간 동물, 예를 들어, 비-인간 포유동물에의 투여에 적합함을 당업자는 이해할 것이다. 인간에의 투여에 적합한 제약 조성물을 변형하여 조성물을 다양한 동물에의 투여에 적합하게 만드는 것은 잘 이해되어 있으며, 통상의 기술을 갖는 수의학 약리학자는 존재하는 경우, 단지 통상적인 실험으로 이러한 변형을 설계하고/거나 수행할 수 있다. 제약 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 상업적으로 관련된 포유동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 및/또는 래트를 포함하는 포유동물; 및/또는 상업적으로 관련된 조류, 예컨대 가금류, 닭, 오리, 거위, 및/또는 칠면조를 포함하는 조류를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제형은 약리학의 분야에서 알려진 또는 이후에 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합시키고, 이어서, 필요할 경우 및/또는 바람직할 경우, 생성물을 분할하고/거나, 형상화하고/거나, 패키징하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조제물에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500 ng/ml, 600 ng/ml, 1 μg/ ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 g/ml, 300 μg/ml, 400 μg/ml, 500 μg/ml, 600 μg/ml, 700 μg/ml, 800 μg/ml, 900 μg/ml, 1 mg/ml, 1.5 mg/ml, 또는 2 mg/ml 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 존재이다.
일부 실시 형태에서, 조제물에 존재하는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 제약 조제물 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w), 99%(w/w), 99.1%(w/w), 99.2%(w/w), 99.3%(w/w), 99.4%(w/w), 99.5%(w/w), 99.6%(w/w), 99.7%(w/w), 99.8%(w/w), 99.9%(w/w), 또는 100%(w/w) 분자이다.
일부 실시 형태에서, 조제물에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 제약 조제물 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 0.5%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 5%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자이다.
일부 실시 형태에서, 조제물 내에 존재하는 니킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자에 대한 참조 기준은 제약 조제물 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 0.5%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 5%(w/w), 10%(w/w), 또는 15%(w/w) 이하의 니킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자이다.
일부 실시 형태에서, 조제물 내에 존재하는 조합된 니킹된 및 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 제약 조제물 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 0.5%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 5%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w) 이하의 조합된 니킹된 및 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자이다. 일부 실시 형태에서, 제약 조제물은 최종 원형 폴리리보뉴클레오티드 약물 생성물의 중간체 제약 조제물이다. 일부 실시 형태에서, 제약 조제물은 약물 물질 또는 활성 제약 성분(API)이다. 일부 실시 형태에서, 제약 조제물은 대상체에의 투여를 위한 약물 생성물이다.
일부 실시 형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조제물은 DNA, 단백질 오염, 불순물, 또는 부산물(예를 들어, 세포 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질 또는 단백질 공정 불순물), 내독소, 모노뉴클레오티드 분자, 및/또는 공정-관련 불순물을 실질적으로 제거하기 위해 (선형 RNA의 환원 전에, 동안 또는 후에) 추가로 프로세싱된다.
염
일부 경우에, 본원에서 제공된 조성물 또는 제약 조성물은 하나 이상의 염을 포함한다. 긴장성을 제어하기 위해, 생리학적 염, 예컨대 나트륨 염은 본원에서 제공된 조성물에 포함될 수 있다. 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산이나트륨, 및/또는 염화마그네슘 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염으로 제제화된다. 하나 이상의 제약상 허용되는 염은 무기 이온, 예컨대, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 이온 등의 것들을 포함할 수 있다. 이러한 염은 무기 또는 유기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 질산, 황산, 메탄 술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 푸마르산, 숙신산, 락트산, 만델산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 또는 말레산과의 염을 포함할 수 있다. 폴리리보뉴클레오티드는 선형 또는 원형 형태 중 어느 하나로 존재할 수 있다.
완충제/pH
본원에서 제공된 조성물 또는 제약 조성물은 하나 이상의 완충제, 예컨대 트리스 완충제; 보레이트 완충제; 숙시네이트 완충제; 히스티딘 완충제(예를 들어, 수산화알루미늄 보조제를 가짐); 또는 시트레이트 완충제를 포함할 수 있다. 완충제는, 일부 경우에, 5~20 mM 범위로 포함된다.
본원에서 제공된 조성물 또는 제약 조성물은 약 5.0 내지 약 8.5, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 7.5, 또는 약 7.0 내지 약 7.8의 pH를 가질 수 있다. 조성물 또는 제약 조성물은 약 7의 pH를 가질 수 있다. 폴리리보뉴클레오티드는 선형 또는 원형 형태 중 어느 하나로 존재할 수 있다.
세정제/계면활성제
본원에서 제공된 조성물 또는 제약 조성물은 의도되는 투여 경로에 따라, 하나 이상의 세정제 및/또는 계면활성제, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(통상적으로 "Tween"으로 지칭됨), 예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; DOWFAX™ 상표명 하에 판매되는 에틸렌 옥시드(EO), 프로필렌 옥시드(PO), 및/또는 부틸렌 옥시드(BO)의 공중합체, 예컨대 선형 EO/PO 블록 공중합체; 반복하는 에톡시(옥시-l,2-에탄디일) 기의 수에 있어서 달라질 수 있는 옥톡시놀, 예를 들어, 옥톡시놀-9(트리톤 X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올); (옥틸 페녹시)폴리에톡시에탄올(IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린(레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예컨대 Tergitol™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르(Brij 계면활성제로 알려짐), 예컨대 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 및 소르비탄 에스테르(통상적으로 "SPAN"으로 알려짐), 예컨대 소르비탄 트리올레에이트(Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트, 옥톡시놀(예컨대 옥톡시놀-9(트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드("CTAB"), 또는 나트륨 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 하나 이상의 세정제 및/또는 계면활성제는 단지 흔적량으로 존재할 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 1 mg/ml 미만의 각각의 옥톡시놀-10 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 비-이온성 계면활성제는 본원에서 사용될 수 있다. 계면활성제는 그들의 "HLB"(친수성/친지질성 균형)에 의해 분류될 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제는 적어도 10, 적어도 15, 및/또는 적어도 16의 HLB를 갖는다. 폴리리보뉴클레오티드는 선형 또는 원형 형태 중 어느 하나로 존재할 수 있다.
희석제
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 폴리리보뉴클레오티드 및 희석제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 선형 폴리리보뉴클레오티드 및 희석제를 포함한다.
희석제는 비-담체 부형제일 수 있다. 비-담체 부형제는 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 예컨대 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 비히클 또는 매질로서 역할을 한다. 비-담체 부형제는 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 예컨대 선형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 비히클 또는 매질로서 역할을 한다. 비-담체 부형제의 비제한적인 예는 용매, 수성 용매, 비-수성 용매, 분산 매질, 희석제, 분산액, 현탁 조제, 표면 활성제, 등장성제, 증점제, 유화제, 보존제, 중합체, 펩티드, 단백질, 세포, 히알루로니다제, 분산제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 완충제(예를 들어, 포스페이트 완충 염수(PBS)), 윤활제, 오일, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 비-담체 부형제는 세포-관통 효과를 나타내지 않는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인되고 불활성 성분 데이터베이스에 열거된 불활성 성분 중 어느 하나일 수 있다. 비-담체 부형제는 비-인간 동물에의 투여에 적합한, 예를 들어, 수의학 용도에 적합한 임의의 불활성 성분일 수 있다. 조성물을 다양한 동물에의 투여에 적합하게 만들기 위한 인간에의 투여에 적합한 조성물의 변형은 널리 이해되어 있으며, 통상의 기술을 갖는 수의학 약리학자는 존재하는 경우, 단지 통상적인 실험으로 이러한 변형을 설계하고/거나 수행할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 예컨대 희석제를 포함하는 네이키드 전달 제형으로서 전달될 수 있다. 네이키드 전달 제형은 담체의 보조 없이 및 폴리리보뉴클레오티드, 캡핑된 폴리리보뉴클레오티드, 또는 이들의 복합체의 변형 또는 부분적 또는 완전한 캡슐화 없이 폴리리보뉴클레오티드를 세포에 전달한다.
네이키드 전달 제형은 담체가 없는 제형이고, 여기서 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)는 세포에의 전달을 보조하는 모이어티에 결합하는 공유 변형이 없거나, 폴리리보뉴클레오티드의 부분적 또는 완전한 캡슐화가 없다. 일부 실시 형태에서, 세포에의 전달을 보조하는 모이어티에 결합하는 공유 변형이 없는 폴리리보뉴클레오티드는 단백질, 소분자, 입자, 중합체, 또는 생체중합체에 공유적으로 결합되지 않는 폴리리보뉴클레오티드이다. 세포에의 전달을 보조하는 모이어티에 결합하는 공유 변형이 없는 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 기를 함유하지 않는다. 예를 들어, 세포에의 전달을 보조하는 모이어티에 결합하는 공유 변형이 없는 폴리리보뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트 에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르를 함유하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 네이키드 전달 제형은 형질감염 시약, 양이온성 담체, 탄수화물 담체, 나노입자 담체, 또는 단백질 담체 중 임의의 것 또는 전부가 없다. 일부 실시 형태에서, 네이키드 전달 제형은 프토글리코겐 옥테닐 숙시네이트, 피토글리코겐 베타-덱스트린, 무수물-변형된 피토글리코겐 베타-덱스트린, 리포펙타민, 폴리에틸렌이민, 폴리(트리메틸렌이민), 폴리(테트라 에틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-b-시클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(리신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화 젤라틴, 덴드리머, 키토산, l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), l-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N-(-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤 히드로클로라이드(DC-콜레스테롤 HC1), 디헵타데실아미도글리실 스페르미딘(DOGS), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), 인간 혈청 알부민(HSA), 저-밀도 지단백질(LDL), 고-밀도 지단백질(HDL), 또는 글로불린이 없다.
특정 실시 형태에서, 네이키드 전달 제형은 비-담체 부형제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비-담체 부형제는 세포-관통 효과를 나타내지 않는 불활성 성분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비-담체 부형제는 완충제, 예를 들어 PBS를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비-담체 부형제는 용매, 비-수성 용매, 희석제, 현탁 조제, 표면 활성제, 등장성제, 증점제, 유화제, 보존제, 중합체, 펩티드, 단백질, 세포, 히알루로니다제, 분산제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 완충제, 윤활제, 또는 오일이다.
일부 실시 형태에서, 네이키드 전달 제형은 희석제를 포함한다. 희석제는 액체 희석제 또는 고체 희석제일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 희석제는 RNA 가용화제, 완충제, 또는 등장성제이다. RNA 가용화제의 예는 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 포름아미드, 및 2-프로판올을 포함한다. 완충제의 예는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES), 비스-트리스, 2-[(2-아미노-2-옥소에틸)-(카르복시메틸)아미노]아세트산(ADA), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산(ACES), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES), 2-[[1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄술폰산(TES), 3-(N-모르폴리노)프로판 술폰산(MOPS), 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 트리스, 트리신, Gly-Gly, 비신, 또는 포스페이트를 포함한다. 등장성제의 예는 글리세린, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트레할로스, 또는 수크로스를 포함한다.
담체
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 원형 폴리리보뉴클레오티드 및 담체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 선형 폴리리보뉴클레오티드 및 담체를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 조성물은 소낭 또는 다른 막-기반 담체에 본원에 기재된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조성물은 소낭 또는 다른 막-기반 담체에 본원에 기재된 바와 같은 선형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 조성물은 세포, 소낭 또는 다른 막-기반 담체에 또는 이를 통해 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 조성물은 세포, 소낭 또는 다른 막-기반 담체에 또는 이를 통해 선형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시 형태에서, 조성물은 리포좀 또는 다른 유사한 소낭에 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시 형태에서, 조성물은 리포좀 또는 다른 유사한 소낭에 선형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싼 단층 또는 다층 지질 이중층 및 상대적으로 비투과성인 외부 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구형 소낭 구조이다. 리포좀은 음이온성, 중성 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 생체적합성, 무독성이며, 친수성 및 친지성 약물 분자 둘 모두를 전달하고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 이들의 카고를 보호하고, 이들의 로드(load)를 생물학적 막 및 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러 수송할 수 있다(예를 들어, 검토를 위해, 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011 doi:10.1155/2011/469679] 참조).
소낭은 몇몇 상이한 유형의 지질로 제조될 수 있지만; 인지질이 약물 담체로서 리포좀을 생성하기 위해 가장 통상적으로 사용된다. 다층 소낭 지질의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 다층 소낭 지질 제조에 관한 교시가 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 제6,693,086호 참조). 지질막이 수용액과 혼합되는 경우 소낭 형성은 자발적일 수 있지만, 이는 또한 균질화기, 초음파분쇄기, 또는 압출 장치를 사용함으로써 진탕 형태로 힘을 가하여 촉진될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011 doi:10.1155/2011/469679] 참조). 압출된 지질은 압출된 지질 제조에 관한 교시가 본원에 참조로 포함되는, 문헌[Templeton et al., Nature Biotechnol., 15:647-52, 1997]에 기재된 바와 같이, 감소하는 크기의 필터를 통해 압출함으로써 제조될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 폴리리보뉴클레오티드 및 지질 나노입자, 예를 들어 본원에 기재된 지질 나노입자를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 선형 폴리리보뉴클레오티드 및 지질 나노입자를 포함한다. 지질 나노입자는 본원에 기재된 바와 같은 폴리리보뉴클레오티드 분자에 대한 생체혼화성 및 생체분해성 전달 시스템을 제공하는 담체의 또 다른 예이다. 지질 나노입자는 본원에 기재된 바와 같은 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자에 대한 생체혼화성 및 생체분해성 전달 시스템을 제공하는 담체의 또 다른 예이다. 나노구조화된 지질 담체(NLC)는 고체 지질 나노입자(SLN)의 특징을 보유하고, 약물 안정성 및 로딩 용량을 개선시키고, 약물 누출을 방지하는 변형된 SLN이다. 중합체 나노입자(PNP)는 약물 전달의 중요한 성분이다. 이들 나노입자는 특이적 표적에 약물 전달을 효과적으로 지정하고 약물 안정성 및 제어된 약물 방출을 개선시킬 수 있다. 리포좀 및 중합체를 조합한 담체의 새로운 유형인 지질-중합체 나노입자(PLN)는 또한 이용될 수 있다. 이들 나노입자는 PNP 및 리포좀의 보완적 이점을 갖는다. PLN은 코어-쉘 구조로 구성되며; 중합체 코어는 안정한 구조를 제공하고, 인지질 쉘은 우수한 생체적합성을 제공한다. 따라서, 2가지 성분은 약물 캡슐화 효율을 증가시키고, 표면 변형을 용이하게 하고, 수용성 약물의 누출을 방지한다. 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Li et al. 2017, Nanomaterials 7, 122; doi:10.3390/nano7060122]을 참조한다.
담체의 추가적인 비제한적인 예는 탄수화물 담체(예를 들어, 무수물-변형된 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질), 단백질 담체(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드에 공유적으로 연결된 단백질 또는 선형 폴리리보뉴클레오티드에 공유적으로 연결된 단백질), 또는 양이온성 담체(예를 들어, 양이온성 지질중합체 또는 형질감염 시약)를 포함한다. 탄수화물 담체의 비제한적인 예는 프토글리코겐 옥테닐 숙시네이트, 피토글리코겐 베타-덱스트린, 및 무수물-변형된 피토글리코겐 베타-덱스트린을 포함한다. 양이온성 담체의 비제한적인 예는 리포펙타민, 폴리에틸렌이민, 폴리(트리메틸렌이민), 폴리(테트라 에틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-b-시클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(리신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화 젤라틴, 덴드리머, 키토산, l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), l-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N-(-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤 히드로클로라이드(DC-콜레스테롤 HC1), 디헵타데실아미도글리실 스페르미딘(DOGS), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 및 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC)를 포함한다. 단백질 담체의 비제한적인 예는 인간 혈청 알부민(HSA), 저-밀도 지단백질(LDL), 고-밀도 지단백질(HDL), 또는 글로불린을 포함한다.
엑소좀은 또한 본원에 기재된 조성물 또는 조제물에 대한 약물 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 엑소좀은 본원에 기재된 선형 폴리리보뉴클레오티드 조성물 또는 조제물에 대한 약물 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 검토를 위해, 문헌[Ha et al. July 2016. Acta Pharmaceutica Sinica B. Volume 6, Issue 4, Pages 287-96; doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001]을 참조한다.
생체외 분화된 적혈구는 또한 본원에 기재된 조성물 또는 조제물에 대한 담체로서 사용될 수 있다. 생체외 분화된 적혈구는 또한 본원에 기재된 선형 폴리리보뉴클레오티드 조성물 또는 조제물에 대한 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 공개 제WO2015/073587호; 제WO2017/123646호; 제WO2017/123644호; 제WO2018/102740호; 제WO2016/183482호; 제WO2015/153102호; 제WO2018/151829호; 제WO2018/009838호; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]; 미국 특허 제9,644,180호; 문헌[Huang et al. 2017. Nature Communications 8: 423]; [Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]을 참조한다.
예를 들어, 국제 특허 공개 제WO2018/208728호에 기재된 바와 같은 푸소좀 조성물은 또한 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 전달하는 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제WO2018/208728호에 기재된 바와 같은 푸소좀 조성물은 또한 본원에 기재된 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 전달하는 담체로서 사용될 수 있다.
비로좀 및 바이러스-유사 입자(VLP)는 또한 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 표적화된 세포에 전달하는 담체로서 사용될 수 있다. 비로좀 및 바이러스-유사 입자(VLP)는 또한 본원에 기재된 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 표적화된 세포에 전달하는 담체로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 국제 특허 공개 제WO2011/097480호, 제WO2013/070324호, 제WO2017/004526호, 또는 제WO2020/041784호에 기재된 바와 같은 식물 나노베지클 및 식물 메신저 팩(PMP)은 또한 본원에 기재된 조성물 또는 조제물을 전달하는 담체로서 사용될 수 있다. 식물 나노베지클 및 식물 메신저 팩(PMP)은 또한 본원에 기재된 선형 폴리리보뉴클레오티드 조성물 또는 조제물을 전달하는 담체로서 사용될 수 있다.
마이크로버블은 또한 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 전달하는 담체로서 사용될 수 있다. 마이크로버블은 또한 본원에 기재된 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 전달하는 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제US7115583호; 문헌[Beeri, R. et al., Circulation. 2002 Oct 1;106(14):1756-1759]; [Bez, M. et al., Nat Protoc. 2019 Apr; 14(4): 1015-1026]; [Hernot, S. et al., Adv Drug Deliv Rev. 2008 Jun 30; 60(10): 1153-1166]; [Rychak, J.J. et al., Adv Drug Deliv Rev. 2014 Jun; 72: 82-93]을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 마이크로버블은 알부민-코팅된 퍼플루오로카본 마이크로버블이다.
본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 담체는 복수개의 입자를 포함할 수 있다. 입자는 30 내지 700 나노미터(예를 들어, 30 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 100 내지 500, 50 내지 500, 또는 200 내지 700 나노미터)의 중위 물품 크기를 가질 수 있다. 입자의 크기는 세포 내로의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 페이로드의 침착에 유리하도록 최적화될 수 있다. 특정 세포 유형 내로의 폴리리보뉴클레오티드의 침착은 상이한 입자 크기에 유리할 수 있다. 예를 들어, 입자 크기는 항원 제시 세포 내로의 폴리리보뉴클레오티드의 침착을 위해 최적화될 수 있다. 입자 크기는 수지상 세포 내로의 폴리리보뉴클레오티드의 침착을 위해 최적화될 수 있다. 추가적으로, 입자 크기는 배수 림프절 세포 내로의 폴리리보뉴클레오티드의 침착을 위해 최적화될 수 있다.
지질 나노입자
본 발명에 의해 제공된 조성물, 방법, 및 전달 시스템은 특정 실시 형태에서, 지질 나노입자(LNP)를 포함하는 본원에 기재된 임의의 적합한 담체 또는 전달 양상을 이용할 수 있다. 지질 나노입자는 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 이온성 지질, 예컨대 비-양이온성 지질(예를 들어, 중성 또는 음이온성 또는 양쪽이온성 지질); 하나 이상의 컨쥬게이트된 지질(예컨대 PEG-컨쥬게이트된 지질 또는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO2019217941호의 표 5에 기재된 중합체에 컨쥬게이트된 지질); 하나 이상의 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)을 포함한다.
나노입자 제형(예를 들어, 지질 나노입자)에서 사용될 수 있는 지질은 예를 들어, 참조로 포함되는 제WO2019217941호의 표 4에 기재된 것들을 포함하며-예를 들어, 지질-함유 나노입자는 제WO2019217941호의 표 4의 지질 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 지질 나노입자는 추가적인 요소, 예컨대 중합체, 예컨대 참조로 포함되는 제WO2019217941호의 표 5에 기재된 중합체를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 컨쥬게이트된 지질은 존재하는 경우, PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대 l-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), PEG화 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대 4-0-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-l-0-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카르보닐-메톡시폴리 에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, 및 제WO2019051289호(참조로 포함됨)의 표 2에 기재된 것들, 및 상기의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 지질 나노입자 내로 혼입될 수 있는 스테롤은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체 중 하나 이상, 예컨대 참조로 포함되는 제W02009/127060호 또는 제US2010/0130588호의 것들을 포함한다. 추가적인 예시적인 스테롤은 본원에 참조로 포함되는 문헌[Eygeris et al. (2020), dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386]에 기재된 것들을 포함하는 피토스테롤을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질, 비-양이온성 지질, 입자의 응집을 억제하는 컨쥬게이트된 지질, 및 스테롤을 포함한다. 이들 성분의 양은 독립적으로, 그리고 원하는 특성을 달성하도록 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 지질 나노입자는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 90 mol%의 양(다른 실시 형태에서, 이는 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20~70%(mol), 30~60%(mol) 또는 40~50%(mol); 약 50 mol% 내지 약 90 mol%일 수 있음)의 이온화 가능한 지질, 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 30 mol%의 양의 비-양이온성 지질, 총 지질의 약 0.5 mol% 내지 약 20 mol%의 양의 컨쥬게이트된 지질, 및 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 50 mol%의 양의 스테롤을 포함한다. 총 지질 대 핵산의 비는 원하는 대로 달라질 수 있다. 예를 들어, 총 지질 대 핵산(질량 또는 중량) 비는 약 10: 1 내지 약 30: 1일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 지질 대 핵산 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다. 지질 및 핵산의 양은 원하는 N/P 비, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 나노입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL의 범위일 수 있다.
본원에 기재된 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 핵산(예를 들어, RNA(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드))의 전달을 위한 지질 나노입자를 형성하기 위해 (예를 들어, 다른 지질 성분과 조합하여) 사용될 수 있는 지질 화합물의 일부 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
[화학식 i]
일부 실시 형태에서, 화학식 i을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 ii]
일부 실시 형태에서, 화학식 ii를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 iii]
일부 실시 형태에서, 화학식 iii을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 iv]
[화학식 v]
일부 실시 형태에서, 화학식 v를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 vi]
일부 실시 형태에서, 화학식 vi을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 vii]
[화학식 viii]
일부 실시 형태에서, 화학식 viii을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 ix]
일부 실시 형태에서, 화학식 ix를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 x]
또는 이의 염
상기 식에서,
X1은 O, NR1 또는 직접적인 결합이고, X2는 C2-5 알킬렌이고, X3은 C(=0) 또는 직접적인 결합이고, R1은 H 또는 Me이고, R3은 C1-3알킬이고, R2는 C1-3 알킬이거나, R2는 이것이 부착된 질소 원자 및 X2의 1~3개의 탄소 원자와 함께, 4-, 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, X1은 NR1이고, R1 및 R2는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성하고, Y1은 C2-12 알킬렌이고, Y2는
로부터 선택되며,
n은 0 내지 3이고, R4는 C1-15 알킬이고, Z1은 C1-6 알킬렌 또는 직접적인 결합이고,
Z2는 이거나, 부재하되, 단, Z1이 직접적인 결합이면, Z2는 부재하고;
R5는 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이며, R6은 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이며, W는 메틸렌 또는 직접적인 결합이며, R7은 H 또는 Me이되, 단, R3 및 R2가 C2 알킬이고, X1이 O이고, X2가 선형 C3 알킬렌이고, X3이 C(=0)이고, Y1이 선형 Ce 알킬렌이고, (Y2 )n-R4가
이고,
R4가 선형 C5 알킬이고, Z1이 C2 알킬렌이고, Z2가 부재하고, W가 메틸렌이고, R7이 H이면, R5 및 R6은 Cx 알콕시가 아니다.
일부 실시 형태에서, 화학식 xii를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 xi]
일부 실시 형태에서, 화학식 xi을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 xii]
(여기서, R은 임)
[화학식 xiii]
[화학식 xiv]
일부 실시 형태에서, LNP는 화학식 xiii의 화합물 및 화학식 xiv의 화합물을 포함한다.
[화학식 xv]
일부 실시 형태에서, 화학식 xv를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 xvi]
일부 실시 형태에서, 화학식 xvi을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다.
[화학식 xvii]
[화학식 xviii(a)]
(여기서, X는 임)
[화학식 xviii(b)]
[화학식 xix]
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 핵산(예를 들어, RNA(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드))의 전달을 위해 지질 나노입자를 형성하기 위해 사용되는 지질 화합물은 하기 반응 중 하나에 의해 제조된다:
[화학식 xx(a)]
[화학식 xx(b)]
일부 실시 형태에서, 화학식 xxi을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서, 화학식 xxi의 LNP는 제WO2021113777호에 기재된 LNP(예를 들어, 화학식 1의 지질, 예컨대 제WO2021113777호의 표 1의 지질)이다.
[화학식 xxi]
상기 식에서,
각각의 n은 독립적으로 2~15의 정수이며; L1 및 L3은 각각 독립적으로 -OC(O)-* 또는 -C(O)O-*이며, "*"는 R1 또는 R3에 대한 부착점을 나타내며;
R1 및 R3은 각각 독립적으로 옥소, 할로, 히드록시, 시아노, 알킬, 알케닐, 알데히드, 헤테로시클릴알킬, 히드록시알킬, 디히드록시 알킬, 히드록시알킬아미노알킬, 아미노 알킬, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노 알킬, (헤테로시클릴)(알킬)아미노알킬, 헤테로시클릴, 헤테로아릴, 알킬 헤테로아릴, 알키닐, 알콕시, 아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬카르보닐아미노, 아미노카르보닐 알킬아미노, (아미노카르보닐알킬)(알킬)아미노, 알케닐카르보닐아미노, 히드록시카르보닐, 알킬옥시 카르보닐, 아미노카르보닐, 아미노알킬아미노카르보닐, 알킬아미노알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노알킬아미노카르보닐, 헤테로시클릴알킬아미노카르보닐, (알킬아미노알킬)(알킬)아미노카르보닐, 알킬아미노알킬카르보닐, 디알킬아미노알킬카르보닐, 헤테로시클릴카르보닐, 알케닐 카르보닐, 알키닐 카르보닐, 알킬 술폭시드, 알킬술폭시드알킬, 알킬 술포닐, 및 알킬 술폰 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 임의적으로 치환되는 선형 또는 분지형 C9-C20 알킬 또는 C9-C20 알케닐이며;
R2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 실시 형태에서, 화학식 xxii를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서, 화학식 xxii의 LNP는 제WO2021113777호에 기재된 LNP(예를 들어, 화학식 2의 지질, 예컨대 제WO2021113777호의 표 2의 지질)이다.
[화학식 xxii]
상기 식에서,
각각의 n은 독립적으로 1~15의 정수이며;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
R3은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 실시 형태에서, 화학식 xxiii을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 조성물을 세포에 전달하는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서, 화학식 xxiii의 LNP는 제WO2021113777호에 기재된 LNP(예를 들어, 화학식 3의 지질, 예컨대 제WO2021113777호의 표 3의 지질)이다.
[화학식 xxiii]
상기 식에서,
X는 -O-, -S-, 또는 -OC(O)-*로부터 선택되며, *는 R1에 대한 부착점을 나타내며;
R1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
R2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 핵산(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 또는 단백질)은 이온화 가능한 지질을 포함하는 LNP에 제공된다. 일부 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제US9,867,888호(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 1에 기재된 바와 같은, 헵타데칸-9-일 8-((2-히드록시에틸)(6-옥소-6-(운데실옥시)헥실)아미노)옥타노에이트(SM-102)이다. 일부 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2015/095340호(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 13에서 합성되는 바와 같은, 9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트(LP01)이다. 일부 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제US2012/0027803호(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 7, 8 또는 9에서 합성되는 바와 같은, 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L319)이다. 일부 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2010/053572호(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 14 및 16에서 합성되는 바와 같은, 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실) 아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)이다. 일부 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질은 이미다졸 콜레스테롤 에스테르(ICE) 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카히드로-lH-시클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트, 예를 들어, 제WO2020/106946호(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)로부터의 구조 I이다.
일부 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질은 양이온성 지질, 이온화 가능한 양이온성 지질, 예를 들어, pH에 따라 양으로 하전된 또는 중성 형태로 존재할 수 있는 양이온성 지질, 또는 용이하게 양성자화될 수 있는 아민-함유 지질일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 지질은 예를 들어, 생리학적 조건 하에서 양으로 하전될 수 있는 지질이다. 예시적인 양이온성 지질은 양전하를 보유하는 하나 이상의 아민 기(들)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 지질 입자는 중성 지질, 이온화 가능한 아민-함유 지질, 생체분해성 알킨 지질, 스테로이드, 고도불포화된 지질을 포함하는 인지질, 구조적 지질(예를 들어, 스테롤), PEG, 콜레스테롤, 및 중합체 컨쥬게이트된 지질 중 하나 이상을 갖는 제형에서 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 지질은 이온화 가능한 양이온성 지질일 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 예시적인 양이온성 지질은 6.0을 초과하는 유효 pKa를 가질 수 있다. 실시 형태에서, 지질 나노입자는 제1 양이온성 지질과는 상이한(예를 들어, 제1 유효 pKa보다 더 큰) 유효 pKa를 갖는 제2 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 지질 나노입자는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 또는 이와 회합된, 40 내지 60 mol 퍼센트의 양이온성 지질, 중성 지질, 스테로이드, 중합체 컨쥬게이트된 지질, 및 치료제, 예를 들어, 본원에 기재된 핵산(예를 들어, RNA(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드))을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 양이온성 지질과 동시-제형화된다. 핵산은 LNP, 예를 들어, 양이온성 지질을 포함하는 LNP의 표면에 흡착될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 LNP, 예를 들어, 양이온성 지질을 포함하는 LNP에 캡슐화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지질 나노입자는 예를 들어, 표적화제로 코팅된 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 실시 형태에서, LNP 제형은 생체분해성이다. 일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 지질, 예를 들어, 화학식 i, ii, ii, vii 및/또는 ix를 포함하는 지질 나노입자는 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 100%의 RNA 분자를 캡슐화한다.
지질 나노입자 제형에서 사용될 수 있는 예시적인 이온화 가능한 지질은 제한 없이, 본원에 참조로 포함되는 제WO2019051289호의 표 1에 열거된 것들을 포함한다. 추가적인 예시적인 지질은 제한 없이, 하기 화학식 중 하나 이상을 포함한다: 제US2016/0311759호의 X; 제US20150376115호 또는 제US2016/0376224호의 I; 제US20160151284호의 I, II 또는 III; 제US20170210967호의 I, IA, II 또는 IIA; 제US20150140070호의 I-c; 제US2013/0178541호의 A; 제US2013/0303587호 또는 제US2013/0123338호의 I; 제US2015/0141678호의 I; 제US2015/0239926호의 II, III, IV 또는 V; 제US2017/0119904호의 I; 제WO2017/117528호의 I 또는 II; 제US2012/0149894호의 A; 제US2015/0057373호의 A; 제WO2013/116126호의 A; 제US2013/0090372호의 A; 제US2013/0274523호의 A; 제US2013/0274504호의 A; 제US2013/0053572호의 A; 제W02013/016058호의 A; 제W02012/162210호의 A; 제US2008/042973호의 I; 제US2012/01287670호의 I, II, III 또는 IV; 제US2014/0200257호의 I 또는 II; 제US2015/0203446호의 I, II 또는 III; 제US2015/0005363호의 I 또는 III; 제US2014/0308304호의 I, IA, IB, IC, ID, II, IIA, IIB, IIC, IID 또는 III~XXIV; 제US2013/0338210호의; 제W02009/132131호의 I, II, III 또는 IV; 제US2012/01011478호의 A; 제US2012/0027796호의 I 또는 XXXV; 제US2012/0058144호의 XIV 또는 XVII; 제US2013/0323269호의; 제US2011/0117125호의 I; 제US2011/0256175호의 I, II 또는 III; 제US2012/0202871호의 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII; 제US2011/0076335호의 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, X, XII, XIII, XIV, XV 또는 XVI; 제US2006/008378호의 I 또는 II; 제US2013/0123338호의 I; 제US2015/0064242호의 I 또는 X-A-Y-Z; 제US2013/0022649호의 XVI, XVII 또는 XVIII; 제US2013/0116307호의 I, II 또는 III; 제US2013/0116307호의 I, II 또는 III; 제US2010/0062967호의 I 또는 II; 제US2013/0189351호의 I~X; 제US2014/0039032호의 I; 제US2018/0028664호의 V; 제US2016/0317458호의 I; 제US2013/0195920호의 I; 제US10,221,127호의 5, 6 또는 10; 제WO2018/081480호의 III-3; 제WO2020/081938호의 I-5 또는 I-8; 제US9,867,888호의 18 또는 25; 제US2019/0136231호의 A; 제WO2020/219876호의 II; 제US2012/0027803호의 1; 제US2019/0240349호의 OF-02; 제US10,086,013호의 23; 문헌[Miao et al (2020)]의 cKK-E12/A6; 제WO2010/053572호의 C12-200; 문헌[Dahlman et al (2017)]의 7C1; 문헌[Whitehead et al]의 304-O13 또는 503-O13; 제US9,708,628호의 TS-P4C2; 제WO2020/106946호의 I; 제WO2020/106946호의 I; 및 제WO2021/113777호의 (1), (2), (3), 또는 (4). 예시적인 지질은 제WO2021/113777호의 표 1~16 중 어느 하나의 지질을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2019051289A9호(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 9에 기재된 바와 같은 MC3 (6Z,9Z,28Z,3 lZ)-헵타트리아콘타-6,9,28,3 l-테트라엔-l9-일-4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다. 일부 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2019051289A9호(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 10에 기재된 바와 같은 지질 ATX-002이다. 일부 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2019051289A9호(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 11에 기재된 바와 같은 (l3Z,l6Z)-A,A-디메틸-3-노닐도코사-l3,l6-디엔-l-아민(화합물 32)이다. 일부 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2019051289A9호(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 12에 기재된 바와 같은 화합물 6 또는 화합물 22이다.
예시적인 비-양이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일 포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일 포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대 16-O-모노메틸 PE), 디메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 난(egg) 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일 포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, Lys 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 난 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카르디오리핀, 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, Lys 포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 디아실 포스파티딜콜린 및 디아실 포스파티딜에탄올아민 인지질도 또한 사용될 수 있는 것이 이해된다. 이들 지질 내의 아실 기는 바람직하게는 C10-C24 탄소 쇄를 갖는 지방산, 예를 들어, 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일, 또는 올레오일로부터 유래된 아실 기이다. 추가적인 예시적인 지질은, 특정 실시 형태에서, 제한 없이, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Kim et al. (2020) dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386]에 기재된 것들을 포함한다. 이러한 지질은 일부 실시 형태에서, mRNA(예를 들어, DGTS)로의 간 형질감염을 개선시키는 것으로 관찰된 식물 지질을 포함한다.
지질 나노입자에 사용하는 데 적합한 비-양이온성 지질의 다른 예는 제한 없이, 인을 함유하지 않는 지질, 예컨대, 예를 들어, 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실 아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤 리신 올레에이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴계 중합체, 트리에탄올아민-라우릴 술페이트, 알킬-아릴 술페이트 폴리에틸옥실화 지방산 아미드, 디옥타데실 디메틸 암모늄 브로마이드, 세라미드, 스핑고미엘린 등을 포함한다. 다른 비-양이온성 지질은 제WO2017/099823호 또는 미국 특허 공개 제US2018/0028664호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 비-양이온성 지질은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제US2018/0028664호의 화학식 I, II 또는 IV의 화합물 또는 올레산이다. 비-양이온성 지질은 예를 들어, 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0~30%(mol)를 구성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비-양이온성 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5~20%(mol) 또는 10~15%(mol)이다. 실시 형태에서, 이온화 가능한 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1의 범위(예를 들어, 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1 또는 8:1)이다.
일부 실시 형태에서, 지질 나노입자는 임의의 인지질을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 막 온전성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 성분을 추가로 포함할 수 있다. 지질 나노입자에 사용될 수 있는 한 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 및 그의 유도체이다. 콜레스테롤 유도체의 비제한적인 예는 5a-콜레스탄올, 53-코프로스탄올, 콜레스테릴-(2'-히드록시)-에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-히드록시)-부틸 에테르, 및 6-케토콜레스탄올과 같은 극성 유사체; 5a-콜레스탄, 콜레스테논, 5a-콜레스타논, 5p-콜레스타논, 및 콜레스테릴 데카노에이트와 같은 비극성 유사체; 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 콜레스테롤 유도체는 극성 유사체, 예를 들어, 콜레스테릴-(4'-히드록시)-부틸 에테르이다. 예시적인 콜레스테롤 유도체는 PCT 공개 제W02009/127060호 및 미국 특허 공개 제US2010/0130588호에 기재되어 있으며, 이의 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 막 온전성을 제공하는 성분, 예컨대 스테롤은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0~50%(mol)(예를 들어, 0~10%, 10~20%, 20~30%, 30~40% 또는 40~50%)를 구성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이러한 성분은 지질 나노입자의 총 지질 함량의 20%~50%(mol) 30~40%(mol)이다.
일부 실시 형태에서, 지질 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 컨쥬게이트된 지질 분자를 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 나노입자의 응집을 억제하고/거나 입체 안정화를 제공하기 위해 사용된다. 예시적인 컨쥬게이트된 지질은 PEG-지질 컨쥬게이트, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 컨쥬게이트, 폴리아미드-지질 컨쥬게이트(예컨대, ATTA-지질 컨쥬게이트), 양이온성 중합체-지질(CPL) 컨쥬게이트, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 컨쥬게이트된 지질 분자는 PEG-지질 컨쥬게이트, 예를 들어, (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-컨쥬게이트된 지질이다.
예시적인 PEG-지질 컨쥬게이트는 PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), PEG화 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸) 부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가적인 예시적인 PEG-지질 컨쥬게이트는 예를 들어 제US5,885,6l3호, 제US6,287,59l호, 제US2003/0077829호, 제US2003/0077829호, 제US2005/0175682호, 제US2008/0020058호, 제US2011/0117125호, 제US2010/0130588호, 제US2016/0376224호, 제US2017/0119904호, 제US2018/0028664호, 및 제WO2017/099823호에 기재되어 있으며, 이들 모두의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시 형태에서, PEG-지질은 그의 내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 제US2018/0028664호의 화학식 III, III-a-I, III-a-2, III-b-1, III-b-2 또는 V의 화합물이다. 일부 실시 형태에서, PEG-지질은 둘 모두의 내용의 전체가 본원에 참조로 포함되는 제US20150376115호 또는 제US2016/0376224호의 화학식 II이다. 일부 실시 형태에서, PEG-DAA 컨쥬게이트는 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필, 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복스아미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜) 에테르) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]일 수 있다. 일부 실시 형태에서, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]을 포함한다. 일부 실시 형태에서, PEG-지질은 하기로부터 선택되는 구조를 포함한다:
일부 실시 형태에서, PEG 이외의 분자와 컨쥬게이트된 지질이 또한 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 컨쥬게이트, 폴리아미드-지질 컨쥬게이트(예컨대, ATTA-지질 컨쥬게이트), 및 양이온성 중합체-지질(GPL) 컨쥬게이트가 PEG-지질 대신에 또는 이에 더하여 사용될 수 있다.
예시적인 컨쥬게이트된 지질, 즉, PEG-지질, (POZ)-지질 컨쥬게이트, ATTA-지질 컨쥬게이트 및 양이온성 중합체-지질은, 모든 내용의 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO2019051289A9호의 표 2에 열거된 PCT 및 LIS 특허 출원에 기재되어 있다.
일부 실시 형태에서, PEG 또는 컨쥬게이트된 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0~20%(mol)를 구성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, PEG 또는 컨쥬게이트된 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0.5~10% 또는 2~5%(mol)이다. 이온화 가능한 지질, 비-양이온성-지질, 스테롤 및 PEG/컨쥬게이트된 지질의 몰비는 필요에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 지질 입자는 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 30~70%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 0~60%의 콜레스테롤, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 0~30%의 비-양이온성-지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 1~10%의 컨쥬게이트된 지질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 30~40%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 40~50%의 콜레스테롤, 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 10~20%의 비-양이온성-지질을 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 조성물은 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 50~75%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 20~40%의 콜레스테롤, 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 5 내지 10%의 비-양이온성-지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 1~10%의 컨쥬게이트된 지질이다. 조성물은 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 60~70%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 25~35%의 콜레스테롤, 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 5~10%의 비-양이온성-지질을 함유할 수 있다. 조성물은 또한, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 최대 90%의 이온화 가능한 지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2 내지 15%의 비-양이온성 지질을 함유할 수 있다. 제형은 또한, 예를 들어, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 8~30%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 5~30%의 비-양이온성 지질, 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 0~20%의 콜레스테롤; 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 4~25%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 4~25%의 비-양이온성 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2 내지 25%의 콜레스테롤, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 10 내지 35%의 컨쥬게이트 지질, 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 5%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2~30%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2~30%의 비-양이온성 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 1 내지 15%의 콜레스테롤, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2 내지 35%의 컨쥬게이트 지질, 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 1~20%의 콜레스테롤; 또는 심지어 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 최대 90%의 이온화 가능한 지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2~10%의 비-양이온성 지질, 또는 심지어 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 100%의 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자 제형일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지질 입자 제형은 50:10:38.5:1.5의 몰비의 이온화 가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 지질 입자 제형은 60:38.5:1.5의 몰비의 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질, 비-양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 PEG화 지질을 포함하며, 지질의 몰비는 이온화 가능한 지질의 경우 20 내지 70 몰%의 범위(목표는 40 내지 60 몰%임)이고, 비-양이온성 지질의 몰%는 0 내지 30몰%의 범위(목표는 0 내지 15몰%임)이고, 스테롤의 몰%는 20 내지 70 몰%의 범위(목표는 30 내지 50 몰%임)이고, PEG화 지질의 몰%는 1 내지 6 몰%의 범위(목표는 2 내지 5 몰%임)이다.
일부 실시 형태에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질 / 비-양이온성-지질 / 스테롤 / 컨쥬게이트된 지질을 50:10:38.5:1.5의 몰비로 포함한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 추가적인 화합물이 또한 포함될 수 있다. 이들 화합물은 개별적으로 투여될 수 있거나, 추가적인 화합물은 본 발명의 지질 나노입자에 포함될 수 있다. 다시 말하면, 지질 나노입자는 핵산에 더하여 다른 화합물 또는 적어도 제1 핵산과는 상이한 제2 핵산을 함유할 수 있다. 제한 없이, 다른 추가적인 화합물은 소형 또는 대형 유기 또는 무기 분자, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 단백질, 펩티드 유사체 및 그의 유도체, 펩티드 모방체, 핵산, 핵산 유사체 및 유도체, 생물학적 물질로 제조된 추출물, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시 형태에서, LNP는 생체분해성 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, LNP는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필(9Z,l2Z)-옥타데카-9,l2-디에노에이트)로도 지칭되는 (9Z,l2Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,l2-디에노에이트 또는 또 다른 이온화 가능한 지질을 포함한다. 예를 들어, 제WO2019/067992호, 제WO/2017/173054호, 제WO2015/095340호, 및 제WO2014/136086호, 및 그 안에 제공되는 참고문헌의 지질을 참조한다. 일부 실시 형태에서, LNP 지질의 맥락에서 양이온성 및 이온화 가능한이라는 용어는 상호교환 가능하며, 예를 들어, 이온화 가능한 지질은 pH에 따라 양이온성이다.
일부 실시 형태에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 수십 nm 내지 수백 nm일 수 있으며, 예를 들어, 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정된다. 일부 실시 형태에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 40 nm 내지 약 150 nm, 예컨대 약 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm일 수 있다. 일부 실시 형태에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 90 nm, 약 50 nm 내지 약 80 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm, 약 50 nm 내지 약 60 nm, 약 60 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 90 nm, 약 60 nm 내지 약 80 nm, 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 70 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 90 nm 내지 약 100 nm일 수 있다. 일부 실시 형태에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 70 nm 내지 약 100 nm일 수 있다. 특정 실시 형태에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 80 nm일 수 있다. 일부 실시 형태에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 100 nm일 수 있다. 일부 실시 형태에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 1 mm 내지 약 500 mm, 약 5 mm 내지 약 200 mm, 약 10 mm 내지 약 100 mm, 약 20 mm 내지 약 80 mm, 약 25 mm 내지 약 60 mm, 약 30 mm 내지 약 55 mm, 약 35 mm 내지 약 50 mm 또는 약 38 mm 내지 약 42 mm의 범위이다.
LNP는 일부 예에서, 상대적으로 균질할 수 있다. 다분산 지수는 LNP의 균질성, 예를 들어, 지질 나노입자의 입자 크기 분포를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 작은(예를 들어, 0.3 미만) 다분산 지수는 일반적으로 좁은 입자 크기 분포를 나타낸다. LNP는 약 0 내지 약 0.25, 예컨대 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 또는 0.25의 다분산 지수를 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, LNP의 다분산 지수는 약 0.10 내지 약 0.20일 수 있다.
LNP의 제타 전위는 조성물의 계면 동전위를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제타 전위는 LNP의 표면 전하를 설명할 수 있다. 더 고도로 하전된 종은 신체의 세포, 조직, 및 다른 요소와 바람직하지 않게 상호작용할 수 있기 때문에, 상대적으로 낮은 양전하 또는 음전하를 갖는 지질 나노입자가 일반적으로 바람직하다. 일부 실시 형태에서, LNP의 제타 전위는 약 -10 mV 내지 약 +20 mV, 약 -10 mV 내지 약 +15 mV, 약 -10 mV 내지 약 +10 mV, 약 -10 mV 내지 약 +5 mV, 약 -10 mV 내지 약 0 mV, 약 -10 mV 내지 약 -5 mV, 약 -5 mV 내지 약 +20 mV, 약 -5 mV 내지 약 +15 mV, 약 -5 mV 내지 약 +10 mV, 약 -5 mV 내지 약 +5 mV, 약 -5 mV 내지 약 0 mV, 약 0 mV 내지 약 +20 mV, 약 0 mV 내지 약 +15 mV, 약 0 mV 내지 약 +10 mV, 약 0 mV 내지 약 +5 mV, 약 +5 mV 내지 약 +20 mV, 약 +5 mV 내지 약 +15 mV, 또는 약 +5 mV 내지 약 +10 mV일 수 있다.
단백질 및/또는 핵산의 캡슐화의 효율은 제공되는 초기의 양에 비해, 제조 후에 LNP와 회합되거나 또는 캡슐화된 단백질 및/또는 핵산의 양을 설명한다. 캡슐화 효율은 높은(예를 들어, 100%에 가까운) 것이 바람직하다. 캡슐화 효율은 예를 들어, 지질 나노입자를 하나 이상의 유기 용매 또는 세정제로 분해(breaking up)하기 전과 후에 상기 지질 나노입자를 함유하는 용액에서 단백질 또는 핵산의 양을 비교함으로써 측정될 수 있다. 음이온 교환 수지를 사용하여, 용액 중 유리 단백질 또는 핵산(예를 들어, RNA)의 양을 측정할 수 있다. 형광은 용액 중 유리 단백질 및/또는 핵산(예를 들어, RNA)의 양을 측정하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 지질 나노입자의 경우, 단백질 및/또는 핵산의 캡슐화 효율은 적어도 50%, 예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 캡슐화 효율은 적어도 80%일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 캡슐화 효율은 적어도 90%일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 캡슐화 효율은 적어도 95%일 수 있다.
LNP는 임의적으로 하나 이상의 코팅을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, LNP는 코팅을 갖는 캡슐, 필름 또는 정제로 제형화될 수 있다. 본원에 기재된 조성물을 포함하는 캡슐, 필름 또는 정제는 임의의 유용한 크기, 인장 강도, 경도 또는 밀도를 가질 수 있다.
LNP의 추가적인 예시적인 지질, 제형, 방법 및 특성화는 각각의 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO2020/061457호 및 제WO2021/113777호에 교시되어 있다. LNP의 추가의 예시적인 지질, 제형, 방법 및 특성화는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Hou et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater (2021). doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0]에 교시되어 있다(예를 들어, 문헌[Hou et al.]의 도 2의 예시적인 지질 및 지질 유도체 참조).
일부 실시 형태에서, 시험관내 또는 생체외 세포 리포펙션은 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)® 메신저맥스(MessengerMax)(써모 피셔(Thermo Fisher)) 또는 TransIT-mRNA 형질감염 시약(미루스 바이오(Mirus Bio))을 사용하여 수행된다. 특정 실시 형태에서, LNP는 GenVoy_ILM 이온화 가능한 지질 믹스(프리시젼 나노시스템즈(Precision NanoSystems))를 사용하여 제형화된다. 특정 실시 형태에서, LNP는 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA) 또는 디리놀레일메틸-4-디메틸아미노부티레이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)를 사용하여 제형화되며, 이의 제형 및 생체내 이용은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Jayaraman et al. Angew Chem Int Ed Engl 51(34):8529-8533 (2012)]에 교시되어 있다.
CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어, Cas9-gRNA RNP, gRNA, Cas9 mRNA의 전달을 위해 최적화된 LNP 제형은 둘 모두가 참조로 포함되는 제WO2019067992호 및 제WO2019067910호에 기재되어 있으며, 본원에 기재된 원형 폴리리보뉴클레오티드 및 선형 폴리리보뉴클레오티드의 전달에 유용하다.
핵산(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드)의 전달에 유용한 추가적인 구체적인 LNP 제형은 둘 모두가 참조로 포함되는 제US8158601호 및 제US8168775호에 기재되어 있으며, 이는 명칭 ONPATTRO 하에 판매되는 파티시란(patisiran)에서 사용되는 제형을 포함한다.
실시 형태에서, 본원에 기재된 단백질 또는 폴리펩티드의 적어도 부분(예를 들어, 항원성 부분)을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드)는 LNP에서 제제화되고, 여기서 (a) LNP는 양이온성 지질, 중성 지질, 콜레스테롤, 및 PEG 지질을 포함하고, (b) LNP는 80 nm 내지 160 nm의 평균 입자 크기를 갖고, (c) 폴리리보뉴클레오티드. 실시 형태에서, LNP에서 제제화된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드)는 백신이다.
폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) LNP의 예시적인 투여는 약 0.1, 0.25, 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 또는 100 mg/kg(RNA)을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 선형 폴리리보뉴클레오티드) 항원성 조성물의 용량은 30~200 mcg, 예를 들어, 30 mcg, 50 mcg, 75 mcg, 100 mcg, 150 mcg, 또는 200 mcg이다.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하고, 제조하고, 평가하는 방법의 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명을 순수하게 예시하는 것으로 의도되고, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 원형 RNA의 풍부화를 위한 선형 RNA 풀 다운 방법
본 실시예는 자기-스플라이싱에 의해 생성된 원형 RNA로부터 선형 RNA 부산물을 제거하기 위한 방법의 설계를 기재한다.
원형 RNA가 자기-스플라이싱에 의해 생성되는 경우 시험관내 전사(IVT) 혼합물에는 몇몇 주요한 선형 불순물 또는 부산물이 존재할 수 있다: 비스플라이싱된 선형 RNA, 부분적으로 스플라이싱된 선형 RNA, 니킹된 원형 RNA, 및 스플라이싱된 인트론(도 2).
올리고머는 인트론 영역에 대한 상보적 서열을 갖도록 설계된다. 인트론 영역은 원형 RNA 생성물에 존재하지 않지만, 선형 RNA 또는 스플라이싱된 형태의 일부로서 선형 부산물에만 존재하는 서열이다(도 2 및 3). 올리고머는 스트렙타비딘 단백질에 높은 친화도로 결합할 수 있는 TEG 링커에 의해 연결된 비오틴을 갖도록 설계된다. 올리고머가 인트론 서열을 함유하는 선형 부산물에 결합하면, 부산물은 스트렙타비딘-비드에 의해 포획될 수 있고, 원형 RNA는 비결합된 분획에서 풍부화될 수 있다.
실시예 2: 선형 RNA 풀 다운은 선형 부산물을 특이적으로 포획하고, 원형 RNA를 풍부화한다
본 실시예는 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA의 풍부화를 입증한다.
본 실시예에서, 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. ORF는 가우시아 루시페라제(Gluc, 도 4에 대해) 또는 반딧불이 루시페라제(Fluc, 도 5에 대해) 중 어느 하나였다. 선형 RNA의 길이는 Gluc ORF를 갖는 대략 1.4 Kb 및 Fluc ORF를 갖는 대략 2.6 Kb였다.
인트론 서열을 함유하는 선형 부산물을 제거하기 위한 선형 RNA 풀 다운(LP)을 위해, 인트론 영역에 대해 6개의 상이한 올리고머, 즉, 3' 절반-인트론에 대해 4개의 올리고머, 및 5' 절반-인트론에 대해 2개의 올리고머를 설계하였다. 각각의 올리고머는 23개의 뉴클레오티드였으며, TEG에 의해 연결된 비오틴을 가졌다.
선형 RNA를 7.5 mM의 NTP의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 주형 DNA를 20분 동안 DN아제로 처리함으로써 제거하였다. 합성된 선형 RNA를 RNA 클린 업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), T2050)로 정제하였다. 자기-스플라이싱은 전사 동안 일어났으며; 추가의 또는 추가적인 반응은 요구되지 않았다.
자기-스플라이싱된 RNA(200 pmol)를 총 500 μl 중 1X 결합 완충제(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 0.5 mM EDTA)의 존재 하에서 동일한 양의 각각의 올리고머(200 pmol의 각각의 올리고머, 총 1.2 nmol의 올리고머)와 혼합하였다(최종 RNA 농도는 400 nM이었다). LP 효율에 대한 RNA:올리고머 비의 효과를 테스트하기 위해, 2배(800 nM) 및 5배 더 많은 올리고머(2 μm)를 사용하였다. 음성 대조군으로서, 올리고머가 없는 RNA를 사용하였다. RNA-올리고머 혼합물을 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 100 μl의 스트렙타비딘-SEPHAROSE®(시그마(Sigma))와 혼합하였다. 혼합물을 RT에서 1시간 동안 로터 믹스 상에서 인큐베이션하고, 스트렙타비딘-SEPHAROSE® 비드를 원심분리에 의해 스핀 다운시킴으로써 비결합된 분획을 수집하였다. 비드를 1X 결합 완충제로 3회 세척하였다. 수지를 1X 결합 완충제의 존재 하에서 75 ℃에서 10분 동안 가열함으로써 비드에 결합된 RNA를 용리하였다(도 4 및 5에서 '용리됨'). 비드를 95% 포름아미드의 존재 하에서 95 ℃에서 5분 동안 가열함으로써 비드에 여전히 결합된 RNA를 용리하였다(도 4 및 5에서 '수지'). 비결합된 및 용리된 RNA의 농도를 Qubit에 의해 측정하고, 200 ng의 RNA를 우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(우레아 PAGE)에 의해 분리하고, 겔 염색을 사용하여 염색하고, 화상화 시스템을 사용하여 가시화하였다.
1.4 Kb RNA(도 4) 및 2.6 Kb RNA(도 5) 둘 모두에서, 투입물과 비교하여 비결합된 분획에서 원형 RNA의 유의한 풍부화가 있었다(1.4 Kb RNA에서 대략 90% 풍부화(도 4) 및 2.6K RNA에서 50% 풍부화(도 5)). 수지에 결합된 대다수의 RNA는 인트론 영역을 함유하는 선형 RNA였으며(선형 RNA, 도 4 및 5), 이는 올리고머가 인트론-함유 RNA를 특이적으로 포획하였음을 나타낸다. 올리고머 농도의 증가는 1.4 Kb RNA 및 2.6 Kb RNA 둘 모두에서 원형 RNA 풍부화 수율에 영향을 미치지 않았다.
실시예 3: 단일 올리고머는 선형 RNA 부산물을 포획하고 원형 RNA를 풍부화할 수 있다
본 실시예는 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA의 풍부화를 입증한다. 본 실시예에서, 선형 RNA는 자기-스플라이싱 동안 스플라이싱된 3' 절반-인트론의 5' 단부에 연장된 영역을 포함하였다.
본 실시예에서, 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. 구축물은 5' 단부에 연장된 서열의 36개의 뉴클레오티드를 포함하였다.
연장된 서열을 함유하는 선형 부산물을 풀 다운하기 위해, 연장된 영역에 대한 올리고머를 설계하였다. 올리고머는 36개의 뉴클레오티드였으며, TEG에 의해 연결된 비오틴을 가졌다.
선형 RNA를 7.5 mM의 NTP의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 주형 DNA를 20분 동안 DN아제로 처리함으로써 제거하였다. 합성된 선형 RNA를 RNA 클린 업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하였다. 자기-스플라이싱은 전사 동안 일어났으며; 추가의/추가적인 반응은 요구되지 않았다.
자기-스플라이싱된 RNA(200 pmol)를 1X 결합 완충제(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 0.5 mM EDTA)의 존재 하에서 400 pmol의 올리고와 혼합하였다(최종 RNA 농도는 400 nM이고, 올리고머 농도는 800 nM이었다). 선형 RNA 풀 다운 효율에 대한 RNA:올리고머 비의 효과를 테스트하기 위해, 2.5배(1 μm) 또는 5배 더 많은(2 μm) 올리고머를 사용하였다. 음성 대조군으로서 올리고머가 없는 RNA를 사용하였다. RNA-올리고머 혼합물을 RT에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 100 μl의 스트렙타비딘-SEPHAROSE®(시그마)와 혼합하였다. 혼합물을 RT에서 1시간 동안 로터 믹스 상에서 인큐베이션하고, SEPHAROSE® 비드를 원심분리에 의해 스핀 다운시킴으로써 비결합된 분획을 수집하였다. 비드를 1X 결합 완충제로 3회 세척하였다. 수지를 1X 결합 완충제의 존재 하에서 75 ℃에서 10분 동안 가열함으로써 수지에 결합된 RNA를 용리하였다(도 6에서 '용리됨'). 수지를 95% 포름아미드의 존재 하에서 95 ℃에서 5분 동안 가열함으로써 비드에 여전히 결합된 RNA를 용리하였다(도 6에서 '수지'). 비결합된 및 용리된 RNA의 농도를 Qubit에 의해 측정하고, 200 ng의 RNA를 우레아 PAGE에 의해 분리하고, 겔 염색으로 염색하고, 화상화 시스템을 사용함으로써 가시화하였다.
투입물과 비교하여 비결합된 분획에서 원형 RNA의 유의한 풍부화가 있었다(800 nM 올리고에서 50% 풍부화(도 6)). 수지에 결합된 대다수의 RNA는 연장된 영역을 함유한 선형 RNA였으며, 이는 올리고머가 연장된 영역을 갖는 선형 RNA를 특이적으로 포획하였음을 나타낸다(선형 RNA, 도 6). 올리고머 농도의 증가는 800 nM 올리고머의 경우 50%에서 4 μm 올리고머에 대해 96%까지 원형 RNA 풍부화 수율에 유의하게 영향을 미쳤다.
실시예 4: 회분식-정제 및 칼럼-패킹 방법의 비교
본 실시예는 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA의 풍부화에 대한 2가지 상이한 접근법을 입증한다. 한 방법은 RNA-올리고 혼합물을 튜브에서 스트렙타비딘-SEPHAROSE® 비드와 인큐베이션하는 것이었고(회분식 방법), 다른 것은 비드를 칼럼에서 사전패킹하고, 중력에 의해 RNA-올리고머 혼합물을 통해 통과시키는 것이었다(칼럼 방법).
본 실시예에서, 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다.
인트론 서열을 함유하는 선형 부산물을 풀 다운하기 위해, 인트론 영역에 대해 6개의 상이한 올리고머, 즉, 3' 절반-인트론에 대해 4개의 올리고머, 및 5' 절반-인트론에 대해 2개의 올리고머를 설계하였다. 각각의 올리고머는 23개의 뉴클레오티드였으며, TEG에 의해 연결된 비오틴을 가졌다.
선형 RNA를 7.5 mM의 NTP의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 주형 DNA를 20분 동안 DN아제로 처리함으로써 제거하였다. 합성된 선형 RNA를 RNA 클린 업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하였다. 자기-스플라이싱은 전사 동안 일어났으며; 추가의/추가적인 반응은 요구되지 않았다.
자기-스플라이싱된 RNA(1 nmol)를 총 2.5 ml 중 1X 결합 완충제(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 0.5 mM EDTA)의 존재 하에서 2 nmol의 각각의 올리고와 혼합하였다(최종 RNA 농도는 400 nM이고, 올리고머 농도는 각각의 올리고머당 800 nM이었다). RNA-올리고머 혼합물을 75 ℃에서 3분 동안의 가열하면서 또는 가열하지 않고 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 올리고머가 없는 RNA 혼합물을 음성 대조군으로서 사용하였다. 회분식 정제 방법을 위해, 500 μl의 스트렙타비딘-SEPHAROSE® 비드를 혼합물에 첨가하였다. 이어서 혼합물을 RT에서 1시간 동안 로터 믹스 상에서 인큐베이션하고, SEPHAROSE® 비드를 원심분리에 의해 스핀 다운시킴으로써 비결합된 분획을 수집하였다. 칼럼 정제를 위해, 500 μl의 비드를 비어 있는 칼럼에서 사전-패킹하고, RNA-올리고머 혼합물을 패킹된 수지 상에 놓았다. RNA-올리고머 혼합물을 중력에 의해 수지를 통해 통과시키고, 유통액을 수집하였다. 비결합된 또는 유통액의 RNA의 농도를 Qubit에 의해 측정하고, 200 ng의 RNA를 우레아-PAGE에 의해 분리하고, 겔 염색을 사용하여 염색하고, 화상화 시스템을 사용하여 가시화하였다.
투입물과 비교하여 회분식 정제와 칼럼 정제 방법 사이에 원형 RNA의 풍부화에서 유의한 차이는 발견되지 않았다(예를 들어, 각각 레인 3 및 4 대 레인 6 및 7 참조)(도 7). RNA-올리고머의 가열 및 냉각은 원형 RNA 풍부화를 증가시키지 않았다. 이 데이터는 선형 RNA 풀-다운 방법(LP) 방법이 SEPHAROSE® 비드의 칼럼 패킹을 통해 규모 확대될 수 있음을 나타낸다.
실시예 5: 연이은 선형 RNA 풀 다운은 원형화 효율이 낮은 경우 원형 RNA를 추가로 풍부화할 수 있다
본 실시예는 연이은 선형 RNA 풀 다운에 의한 원형 RNA의 풍부화를 입증한다.
본 실시예에서, 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다.
인트론 서열을 함유하는 선형 부산물을 풀 다운하기 위해, 인트론 영역에 대해 6개의 상이한 올리고머, 즉, 3' 절반-인트론에 대해 4개, 및 5' 절반-인트론에 대해 2개를 설계하였다. 각각의 올리고머는 23개의 뉴클레오티드였으며, TEG에 의해 연결된 비오틴을 가졌다.
선형 RNA를 7.5 mM의 NTP의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 주형 DNA를 20분 동안 DN아제로 처리함으로써 제거하였다. 합성된 선형 RNA를 RNA 클린 업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하였다. 자기-스플라이싱은 전사 동안 일어났으며; 추가의/추가적인 반응은 요구되지 않았다.
자기-스플라이싱된 RNA(1 nmol)를 총 2.5 ml 중 1X 결합 완충제(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 0.5 mM EDTA)의 존재 하에서 2 nmol의 각각의 올리고와 혼합하였다(최종 RNA 농도는 400 nM이고, 올리고머 농도는 각각의 올리고머당 800 nM이었다). RNA-올리고머 혼합물을 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 칼럼 정제를 위해, 500 μl의 비드를 비어 있는 칼럼에서 사전-패킹하고, RNA-올리고머 혼합물을 패킹된 수지 상에 정치하였다. RNA-올리고머 혼합물을 중력에 의해 수지를 통해 통과시키고, 유통액을 수집하였다. 수집된 유통액을 추가적인 올리고머와 혼합하고(최종 800 nM), 이어서 새롭게 사전-패킹된 수지를 통해 통과시켰다. 유통액을 수집하고, 제1 및 제2 라운드의 유통액의 농도를 Qubit에 의해 측정하였다. 200 ng의 RNA를 우레아-PAGE에 의해 분리하고, 겔 염색을 사용하여 염색하고, 화상화 시스템을 사용하여 가시화하였다.
제1 라운드의 선형 RNA 풀 다운에서, 130%의 원형 RNA 풍부화가 있었다(도 8, 제1 LP; 23% 내지 54%의 원형 RNA 순도). 제2 라운드의 풀 다운으로는, 추가적인 풍부화가 있었으며, 이어서 마지막으로 200% 초과의 풍부화가 달성되었다(도 8, 제2 LP; 23% 내지 72%의 원형 RNA 순도).
실시예 6: 상이한 염 농도를 갖는 선형 RNA 풀 다운의 최적화
본 실시예는 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA 풍부화에 대한 결합 완충제 중의 염 농도의 효과를 입증한다.
본 실시예에서, 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. ORF는 hEPO(hEPO, 도 9의 A에 대해) 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(스파이크, 도 9의 B에 대해) 중 어느 하나였다. 선형 RNA의 길이는 hEPO ORF를 갖는 대략 1.2 Kb 및 SARS-CoV-2 스파이크 ORF를 갖는 대략 4.5 Kb였다(RNA의 크기가 4.5 Kb였더라도 6% 우레아 PAGE 상의 2 Kb 래더로 실행함).
인트론 서열을 함유하는 선형 부산물을 풀 다운하기 위해, 인트론 영역에 대해 6개의 상이한 올리고머, 즉, 3' 절반-인트론에 대해 4개, 및 5' 절반-인트론에 대해 2개를 설계하였다. 각각의 올리고머는 23개의 뉴클레오티드였으며, TEG에 의해 연결된 비오틴을 가졌다.
선형 RNA를 7.5 mM의 NTP의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 주형 DNA를 20분 동안 DN아제로 처리함으로써 제거하였다. 합성된 선형 RNA를 RNA 클린 업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하였다. 자기-스플라이싱은 전사 동안 일어났으며; 추가의/추가적인 반응은 요구되지 않았다.
자기-스플라이싱된 RNA(1 nmol)를 총 2.5 ml 중 1X 결합 완충제(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 0.5 mM EDTA)의 존재 하에서 2 nmol의 각각의 올리고와 혼합하였다(최종 RNA 농도는 400 nM이고, 올리고머 농도는 각각의 올리고머당 800 nM이었다). 원형 RNA 풍부화에 대한 염 농도의 효과를 테스트하기 위해, 500 mM, 1000 mM 및 2000 mM NaCl 농도를 또한 테스트하였다. RNA-올리고머 혼합물을 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 칼럼 정제를 위해, 500 μl의 비드를 비어 있는 칼럼에서 사전-패킹하고, RNA-올리고머 혼합물을 패킹된 수지 상에 정치하였다. RNA-올리고머 혼합물을 중력에 의해 수지를 통해 통과시키고, 유통액을 수집하였다. 유통액을 수집하고, 유통액 중의 RNA의 농도를 Qubit에 의해 측정하였다. 200 ng의 RNA를 우레아-PAGE에 의해 분리하고, 겔 염색으로 염색하고, 화상화 시스템을 사용하여 가시화하였다.
1.2 Kb RNA의 경우, 상이한 염 농도에서 원형 RNA 풍부화에 대한 유의한 차이는 없었다(도 9의 A). 그러나, 4.5 Kb RNA의 원형 RNA 풍부화는 염 농도가 증가되었을 때 증가되었다(도 9의 B). 150 mM NaCl에서는 60% 풍부화가 있었지만(투입물로부터 20%의 원형 RNA 순도 내지 32%의 원형 RNA 순도), 2000 mM NaCl에서는 90% 풍부화가 있었다(투입물로부터 20%의 원형 RNA 순도 내지 38%의 원형 RNA 순도). 이 데이터는 더 높은 염이 선형 RNA 풀 다운(LP)에서 긴 RNA의 원형 RNA 풍부화를 개선시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 7: 선형 RNA 풀 다운-매개 원형 RNA 풍부화는 하류 공정 정제 후에 원형 RNA 발현을 증진시킨다
본 실시예는 선형 RNA 풀 다운 방법에 의해 정제된 원형 RNA로부터의 증진된 발현을 입증한다.
본 실시예에서, 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. ORF는 가우시아 루시페라제(Gluc, 도 10에 대해) 또는 hEPO(도 11에 대해) 중 어느 하나였다.
인트론 서열을 함유하는 선형 부산물을 풀 다운하기 위해, 인트론 영역에 대해 6개의 상이한 올리고머, 즉, 3' 절반-인트론에 대해 4개의 올리고머, 및 5' 절반-인트론에 대해 2개의 올리고머를 설계하였다. 각각의 올리고머는 23개의 뉴클레오티드였으며, TEG에 의해 연결된 비오틴을 가졌다.
선형 RNA를 7.5 mM의 NTP의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 주형 DNA를 20분 동안 DN아제로 처리함으로써 제거하였다. 합성된 선형 RNA를 RNA 클린 업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하였다. 자기-스플라이싱은 전사 동안 일어났으며; 추가의/추가적인 반응은 요구되지 않았다.
자기-스플라이싱된 RNA(1 nmol)를 총 2.5 ml 중 1X 결합 완충제(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 0.5 mM EDTA)의 존재 하에서 2 nmol의 각각의 올리고와 혼합하였다(최종 RNA 농도는 400 nM이고, 올리고머 농도는 각각의 올리고머당 800 nM이었다). RNA-올리고머 혼합물을 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 칼럼 정제를 위해, 500 μl의 비드를 비어 있는 칼럼에서 사전-패킹하고, RNA-올리고머 혼합물을 패킹된 수지 상에 정치하였다. RNA-올리고머 혼합물을 중력에 의해 수지를 통해 통과시키고, 유통액을 수집하였다. 수집된 유통액을 Amicon ultra 원심분리 필터(100K 컷 오프)에 의해 물로 완충제 교환하였다.
풍부화된 원형 RNA를 상이한 하류 공정으로 정제하였다. 풍부화가 없는 시험관내 전사된 RNA를 대조를 위해 병행하여 정제하였다.
Gluc를 코딩한 원형 RNA에 대해, 4가지 상이한 정제 방법을 테스트하였다. 첫 번째 방법은 칼럼 정제였고, 풍부화된 원형 RNA를 칼럼-정제하였다(모나크(Monarch)). 두 번째 방법은 겔-정제였다. Gluc를 코딩하는 풍부화된 원형 RNA를 우레아-PAGE에 의해 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA)에서 용리하고, 에탄올 침전시키고, RN아제-무함유수에 재현탁시켰다. 세 번째 방법은 역상 크로마토그래피(RP)였다. Gluc를 코딩하는 원형 RNA를 역상 크로마토그래피에 의해 정제하고, 분획을 Amicon Ultra 원심분리 필터(100K 컷 오프)에서 시트르산나트륨, 이어서 물로 완충제 교환하였다. 네 번째 방법은 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)였다. Gluc를 코딩하는 원형 RNA를 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 의해 정제하고, 분획을 Amicon Ultra 원심분리 필터(100K 컷 오프)에서 물로 완충제 교환하였다. 시험관내 전사된 RNA를 비교를 위해 RP 및 AEX 정제에 적용하였다.
hEPO를 코딩한 원형 RNA에 대해, 4가지 상이한 정제 방법을 테스트하였다. 첫 번째 방법은 정제가 없는 것이었고, 완충제 교환된 원형 RNA만을 사용하였다(BE). 두 번째 방법은 겔-정제였다. hEPO를 코딩하는 풍부화된 원형 RNA를 우레아-PAGE에 의해 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA)에서 용리하고, 에탄올 침전시키고, RN아제-무함유수에 재현탁시켰다. 세 번째 방법은 역상 크로마토그래피(RP)였다. hEPO를 코딩하는 원형 RNA를 역상 크로마토그래피에 의해 정제하고, 분획을 Amicon Ultra 원심분리 필터(100K 컷 오프)에서 시트르산나트륨, 이어서 물로 완충제 교환하였다. 네 번째 방법은 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)였다. hEPO를 코딩하는 원형 RNA를 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 의해 정제하고, 분획을 Amicon Ultra 원심분리 필터(100K 컷 오프)에서 물로 완충제 교환하였다. 시험관내 전사된 RNA를 비교를 위해 겔-정제, RP 및 AEX 정제에 적용하였다.
풍부화된(LP) 또는 비-풍부화된(IVT) 원형 RNA로부터의 Gluc의 발현을 비교하기 위해, 0.1 pmol의 정제된 원형 RNA를 리포펙타민® 메신저맥스 형질감염 시약(인비트로젠(Invitrogen))을 사용하여 HeLa 세포(96 웰 플레이트에서 세포당 10,000개의 세포)에서 형질감염시켰다. 세포 배양 배지를 6시간, 24시간 또는 48시간에서 수거하였다. Gluc 활성을 측정하기 위해, 10 μl의 수거된 세포 배지를 흰색 96 웰 플레이트에 옮기고, 생물발광 리포터 검정 시스템을 제조업체의 지시서(피어스 가우시아 루시페라제 플래쉬 검정 키트, 16158, 써모 사이언티픽)에 따라 사용하였다. 플레이트를 광도계 기기(프로메가(Promega))에서 판독하였다.
풍부화된(LP) 또는 비-풍부화된(IVT) 원형 RNA로부터의 hEPO의 발현을 비교하기 위해, 0.25 pmol의 정제된 원형 RNA를 리포펙타민® 메신저맥스 형질감염 시약(인비트로젠)을 사용하여 HeLa 세포(96 웰 플레이트에서 웰당 10,000개의 세포)에서 형질감염시켰다. 세포 배양 배지를 24시간 또는 48시간에서 수거하였다. 분비된 hEPO 단백질의 양을 hEPO ELISA 키트(인비트로젠)에 의해 제조업체의 지시서에 따라 측정하였다.
Gluc RNA 및 hEPO RNA 둘 모두에서, 선형 RNA 풀 다운(LP)을 통해 정제된 원형 RNA는 원형 RNA가 동일한 방법을 사용하여 정제된 경우 풍부화가 없는 것보다 더 우수한 발현을 보여주었다(예를 들어, LP-RP는 IVT-RP보다 Gluc의 경우 4배 초과 더 높은 발현 및 hEPO의 경우 2배 초과 더 높은 발현을 보여주었다). 이 데이터는 본원에 기재된 방법을 사용한 원형 RNA 풍부화가 발현을 증진시킴을 나타낸다.
실시예 8: 감소된 수의 올리고머로의 선형 RNA 풀 다운은 원형 RNA를 풍부화한다
본 실시예는 더 작은 수의 올리고머와의 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA의 풍부화를 입증한다.
본 실시예에서, 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. 본 실시예에 대해, ORF는 hEPO이고, hEPO ORF를 갖는 선형 RNA의 길이는 대략 1.4 Kb이다.
인트론 서열을 함유하는 선형 부산물을 제거하기 위한 선형 풀 다운을 위해, 인트론 영역에 대해 6개의 상이한 올리고머, 즉, 3' 절반-인트론에 대해 4개의 올리고머(#1 내지 #4), 및 5' 절반-인트론에 대해 2개의 올리고머(#5 및 #6)를 설계하였다(도 12). 각각의 올리고머는 23개의 뉴클레오티드였으며, TEG에 의해 연결된 비오틴을 가졌다. 본 실시예에서, 감소된 수의 올리고머로의 풀-다운 효율을 조사하였다.
첫 번째 연구에서, 3' 절반-인트론에 대한 올리고머를 테스트하였다(#1 내지 #4). 선형 RNA를 7.5 mM의 NTP의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 주형 DNA를 20분 동안 DN아제로 처리함으로써 제거하였다. 합성된 선형 RNA를 RNA 클린 업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하였다. 자기-스플라이싱은 전사 동안 일어났으며; 추가의 또는 추가적인 반응은 요구되지 않았다.
자기-스플라이싱된 RNA(200 pmol)를 총 500 μl 중 1X 결합 완충제(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 0.5 mM EDTA)의 존재 하에서 2가지 상이한 농도(2.4 μM 또는 4.8 μM)에서 3' 절반-인트론에 대한 각각의 올리고머(#1 내지 #4)와 혼합하였다(최종 RNA 농도는 400 nM이었다). 음성 대조군으로서, 올리고머가 없는 RNA를 사용하였다. 양성 대조군으로서, 모든 6개의 올리고머(#1 내지 #6)의 혼합물을 사용하였다. RNA-올리고머 혼합물을 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 칼럼 정제를 위해, 500 μl의 수지를 비어 있는 칼럼에서 사전-패킹하고, RNA-올리고머 혼합물을 패킹된 수지 상에 정치하였다. RNA-올리고머 혼합물을 중력에 의해 수지를 통해 통과시키고, 유통액을 수집하였다. 유통액의 RNA의 농도를 Qubit에 의해 측정하고, 200 ng의 RNA를 우레아 PAGE에 의해 분리하고, 겔 염색 용액을 사용하여 염색하고, 화상화 시스템을 사용하여 가시화하였다.
#1 및 #2 올리고머는 풀 다운을 위해 모든 6개의 올리고머를 사용하고(도 13의 A, 6% 겔), 3' 절반-인트론을 제거한(도 13의 B, 10% 겔) 양성 대조군과 비교하여 2.4 μM 및 4.8 μM 농도 둘 모두에서 유사한 풍부화 효율을 보여주었다.
두 번째 연구에서, 3' 절반-인트론(#1 및 #2) 및 5' 절반-인트론(#5 및 #6) 둘 모두에 대한 올리고의 조합을 테스트하였다. 선형 RNA를 7.5 mM의 NTP의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 주형 DNA를 20분 동안 DN아제로 처리함으로써 제거하였다. 합성된 선형 RNA를 RNA 클린 업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하였다. 자기-스플라이싱은 전사 동안 일어났으며; 추가의 또는 추가적인 반응은 요구되지 않았다.
자기-스플라이싱된 RNA(200 pmol)를 총 500 μl 중 1X 결합 완충제(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 0.5 mM EDTA)의 존재 하에서 #5 또는 #6 올리고와 조합으로 #1 올리고머, 또는 #5 또는 #6 올리고와 조합으로 #2 올리고머와 혼합하였다(최종 RNA 농도는 400 nM이었다)(최종 올리고머 농도는 각각 2.4 μM이다). 음성 대조군으로서, 올리고머가 없는 RNA를 사용하였다. 추가의 대조군으로서, #1 올리고 단독 또는 #5 올리고머 단독을 사용하였다. 양성 대조군으로서, 모든 6개의 올리고머(#1 내지 #6)의 혼합물을 사용하였다. RNA-올리고머 혼합물을 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 칼럼 정제를 위해, 500 μl의 수지를 비어 있는 칼럼에서 사전-패킹하고, RNA-올리고머 혼합물을 패킹된 수지 상에 정치하였다. RNA-올리고머 혼합물을 중력에 의해 수지를 통해 통과시키고, 유통액을 수집하였다. 유통액의 RNA의 농도를 Qubit에 의해 측정하고, 200 ng의 RNA를 우레아 PAGE에 의해 분리하고, 겔 염색을 사용하여 염색하고, 화상화 시스템을 사용하여 가시화하였다.
3' 절반-인트론 또는 5' 절반-인트론에 대한 2개의 올리고의 조합은 3' 절반-인트론에 대한 단일 올리고머를 사용한 것과 유사한 원형 RNA 풍부화 효율(도 14의 A, 6% 겔) 및 그보다 더 우수한 인트론 제거를 보여주었다(도 14의 B, 10% 겔). #1 및 #5 올리고 조합은 풀 다운을 위해 모든 6개의 올리고머를 사용한 양성 대조군과 비교하여 유사한 원형 RNA 풍부화 효율(도 14의 A) 및 인트론 제거 효율(도 14의 B)을 보여주었다. 이들 데이터는 2개의 올리고머의 사용이 6개의 올리고머를 사용한 것과 등가의 원형 RNA 풍부화 및 인트론 제거 효율을 가짐을 입증한다.
실시예 9: 감소된 수의 올리고머를 사용한 선형 RNA 풀 다운 매개 원형 RNA 풍부화는 원형 RNA 발현을 발생시킨다
본 실시예는 2개의 올리고머를 사용한 선형 RNA 풀 다운 방법에 의해 정제된 원형 RNA로부터의 발현을 입증한다.
본 실시예에서, 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), hEPO ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. 선형 RNA를 7.5 mM의 NTP의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 주형 DNA를 20분 동안 DN아제로 처리함으로써 제거하였다. 합성된 선형 RNA를 RNA 클린 업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하였다. 자기-스플라이싱은 전사 동안 일어났으며; 추가적인 반응은 요구되지 않았다.
인트론 서열을 함유하는 선형 부산물을 제거하기 위한 선형 풀 다운을 위해, 인트론 영역에 대해 6개의 상이한 올리고머(#1 내지 #6)를 실시예 8에 기재된 바와 같이 설계하였다.
자기-스플라이싱된 RNA(200 pmol)를 총 500 μl 중 1X 결합 완충제(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 0.5 mM EDTA)의 존재 하에서 #1 올리고머 및 #5 또는 #6 올리고머, 또는 #2 올리고머 및 #5 또는 #6 올리고머와 혼합하였다(최종 RNA 농도는 400 nM이었다)(최종 올리고머 농도는 각각 2.4 μM이다). 음성 대조군으로서, 올리고머가 없는 RNA를 사용하였다. 또 다른 대조군으로서, #1 올리고머 단독 또는 #5 올리고머 단독을 사용하였다. 양성 대조군을 위해, 모든 6개의 올리고머(#1 내지 #6)의 혼합물을 사용하였다. RNA-올리고머 혼합물을 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 칼럼 정제를 위해, 500 μl의 수지를 비어 있는 칼럼에서 사전-패킹하고, RNA-올리고머 혼합물을 패킹된 수지 상에 정치하였다. RNA-올리고머 혼합물을 중력에 의해 수지를 통해 통과시키고, 유통액을 수집하였다. 수집된 유통액을 Amicon ultra 원심분리 필터(100K 컷 오프)에 의해 물로 완충제 교환하였다.
상이한 올리고머로의 풍부화된(LP) 원형 RNA로부터의 hEPO의 발현을 비교하기 위해, 0.25 pmol의 정제된 원형 RNA를 리포펙타민® 메신저맥스 형질감염 시약(인비트로젠)을 사용하여 HeLa 세포(96 웰 플레이트에서 웰당 10,000개의 세포)에서 형질감염시켰다. 세포 배양 배지를 24시간에서 수거하였다. 분비된 hEPO 단백질의 양을 hEPO ELISA 키트(인비트로젠)를 사용하여 제조업체의 지시서에 따라 측정하였다.
2개의 올리고머를 사용한 선형 풀 다운(LP)을 통해 정제된 원형 RNA는 모든 6개의 올리고머(#1 내지 #6)를 사용한 LP를 통해 정제된 원형 RNA와 대등한 발현을 보여주었다(도 15). 특히, 데이터는 2개의 올리고머의 조합(즉, 3' 절반-인트론에 대한 올리고머 및 5' 절반-인트론에 대한 올리고머)을 사용한 LP를 통해 정제된 원형 RNA로부터 원형 RNA 발현이 수득되고, 모든 6개의 올리고머를 사용한 LP를 통해 정제된 원형 RNA로부터 관찰된 발현에 있어서 대등함을 보여준다.
실시예 10: 3' 절반-인트론 및 5' 절반-인트론 둘 모두를 표적화하는 단일 올리고머로의 선형 RNA 풀 다운
본 실시예는 3' 절반-인트론 및 5' 절반-인트론 둘 모두를 표적화하는 단일 올리고머와의 올리고-스트렙타비딘 상호작용을 통해 선형 부산물을 포획함에 의한 원형 RNA의 풍부화를 입증한다.
본 실시예에서, 구축물을 촉매 인트론의 3' 절반, 엑손 단편 2(E2), ORF를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 카고, 엑손 단편 1(E1), 및 촉매 인트론의 5' 절반을 포함하도록 설계하였다. ORF는 hEPO이고, 선형 RNA의 길이는 대략 1.4 Kb였다.
본 실시예에서, 2개의 올리고머를 설계하였다: 올리고 5-Bio_1A5는 #1 올리고(실시예 8에 기재된 바와 같은 3' 절반-인트론에 대한 올리고머), 이어서 #5 올리고(실시예 8에 기재된 바와 같은 5' 절반-인트론에 대한 올리고머)로 이루어지고; 올리고 5-Bio_5A1은 #5 올리고, 이어서 #1 올리고로 이루어진다. 5-Bio_1A5 및 5-Bio_5A1 올리고머 둘 모두는 상이한 올리고머 서열 사이에 아데노신 링커의 8개의 뉴클레오티드 및 TEG에 의해 올리고머에 연결된 5' 단부 비오틴을 갖는다. 5-Bio_1A5 및 5-Bio_5A1 올리고머의 개략도는 도 16에 제공된다.
선형 RNA를 7.5 mM의 NTP의 존재 하에서 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 주형 DNA를 20분 동안 DN아제로 처리함으로써 제거하였다. 합성된 선형 RNA를 RNA 클린 업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하였다. 자기-스플라이싱은 전사 동안 일어났으며; 추가적인 반응은 요구되지 않았다.
자기-스플라이싱된 RNA(200 pmol)를 500 μl 총 부피 중 1X 결합 완충제(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, 0.5 mM EDTA)의 존재 하에서 3' 절반-인트론 및 5' 절반-인트론(2.4 μM 농도) 둘 모두를 표적화하는 올리고머 5-Bio_1A5 또는 5-Bio_5A1과 혼합하였다(최종 RNA 농도는 400 nM이었다). 음성 대조군으로서, 올리고머가 없는 RNA를 사용하였다. 양성 대조군을 위해, 모든 6개의 올리고머(#1 내지 #6)의 혼합물을 사용하였다. RNA-올리고머 혼합물을 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 칼럼 정제를 위해, 500 μl의 수지를 비어 있는 칼럼에서 사전-패킹하고, RNA-올리고머 혼합물을 패킹된 수지 상에 정치하였다. RNA-올리고머 혼합물을 중력에 의해 수지를 통해 통과시키고, 유통액을 수집하였다. 유통액의 RNA의 농도를 Qubit에 의해 측정하고, 200 ng의 RNA를 우레아 PAGE에 의해 분리하고, 겔 염색을 사용하여 염색하고, 화상화 시스템을 사용하여 가시화하였다.
5-Bio_1A5 또는 5-Bio_5A1을 사용한 선형 풀-다운 방법을 통해 정제된 원형 RNA는 선형 RNA(도 17의 A) 및 인트론 RNA(도 17의 B)를 효율적으로 제거하였다. 원형 RNA 풍부화 효율(도 17의 A) 및 인트론 제거 효율(도 17의 B)은 풀 다운을 위해 모든 6개의 올리고머를 사용한 양성 대조군과 유사하였다. 이들 데이터는 3' 절반-인트론 및 5' 절반-인트론 둘 모두를 표적화하도록 설계된 단일 올리고머가, 6개의 올리고머를 갖는 LP를 사용한 것과 필적하는 원형 RNA 풍부화 및 인트론 제거 효율로, 원형 RNA를 풍부화하기 위한 선형 풀 다운에 사용될 수 있음을 입증한다.
다른 실시 형태
본 발명을 그의 구체적인 실시 형태에 관하여 설명하였지만, 추가의 변형이 가능하고, 본 출원은, 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고 본 발명이 속하는 기술 분야 내의 알려지거나 통상적인 실시 내에 해당하며 상기 제시된 본질적인 특색에 적용될 수 있는 본 발명으로부터 벗어난 것들을 포함하는 본 발명의 임의의 변동, 용도, 또는 적응을 커버하는 것으로 의도되며, 청구범위의 범주에 따른다는 것이 이해될 것이다. 다른 실시 형태는 청구범위 내에 있다.
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Claims (62)

  1. 선형 폴리리보뉴클레오티드 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 포함하는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, 여기서 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 하위세트는 표적 영역을 포함하는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    (b) 샘플을 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 샘플 내의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 포함하는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 표적 영역을 결여하는, 방법.
  3. 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, 여기서 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 하위세트는 표적 영역을 포함하고, 표적 영역은 표적 영역을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 위치하지 않는 것인 단계;
    (b) 샘플을 표적 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 샘플 내의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계.
  4. 표적 영역을 포함하는 복수개의 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 포함하는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 샘플을 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 여기서 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도로 선형 폴리리보뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하고, 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도와는 상이한 제2 결합 친화도로 원형 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하는 것인 단계; 및
    (c) 샘플 내의 복수개의 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 포함하는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 제1 결합 친화도는 제2 결합 친화도보다 작고, 올리고뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드에 우선적으로 결합하는, 방법.
  6. 표적 영역을 포함하는 제2 형태의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 표적 영역을 포함하는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 복수개의 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 샘플을 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 여기서 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도로 제1 형태의 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하고, 올리고뉴클레오티드는 제1 결합 친화도와는 상이한 제2 결합 친화도로 제2 형태의 폴리뉴클레오티드의 표적 영역에 혼성화하는 것인 단계; 및
    (c) 샘플 내의 제2 형태의 복수개의 폴리리보뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 표적 영역을 포함하는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 단계.
  7. 제6항에 있어서, 제1 결합 친화도는 제2 결합 친화도보다 작고, 올리고뉴클레오티드는 제1 형태의 폴리리보뉴클레오티드에 우선적으로 결합하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 영역은 폴리A 서열을 결여하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 입자에 컨쥬게이트되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 제1 포획제에 컨쥬게이트되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 화학적 링커로 제1 포획제에 컨쥬게이트되는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 화학적 링커는 트리에틸렌 글리콜을 포함하는, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 화학적 링커는 올리고뉴클레오티드의 3' 단부 또는 5' 단부에 컨쥬게이트되는, 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 포획제는 항원을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 항원은 비오틴인 방법.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 포획제에 결합하는 제2 포획제를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제2 포획제는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 스트렙타비딘인, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 포획제는 입자에 컨쥬게이트되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 입자는 자기 입자 또는 비드인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 영역을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드는 인트론 또는 그의 부분을 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분을 포함하는, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분에 대해 5' 또는 3'에 위치하는, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 비-스플라이싱된 또는 부분적으로 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드로부터 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드를 분리하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드인, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드인, 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드는 인트론 또는 그의 부분을 결여하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 스플라이싱된 폴리리보뉴클레오티드의 양을 샘플에 비해 적어도 50% 풍부화하는, 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 또는 그의 부분을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드는 선형 폴리리보뉴클레오티드인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 영역을 포함하는 포획된 폴리리보뉴클레오티드를 1회 이상 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 후에, 제1 용리 단계를 수행하여 표적 영역을 포함하는 포획된 폴리리보뉴클레오티드를 방출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 제1 용리 단계는 제1 완충제를 첨가하고/거나 샘플을 가열하는 것을 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 제1 용리 단계는 샘플을 적어도 50 ℃까지 가열하는 것을 포함하는, 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용리 단계 후에, 제2 용리 단계를 수행하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 제2 용리 단계는 제2 완충제를 첨가하고/거나 샘플을 가열하는 것을 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 제2 용리 단계는 샘플을 적어도 50 ℃까지 가열하는 것을 포함하는, 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 제2 완충제는 변성제를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 변성제는 포름아미드 또는 우레아를 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 샘플을 적어도 10분 동안 올리고뉴클레오티드와 인큐베이션하는 것을 포함하는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 올리고뉴클레오티드에 의해 결합되지 않은 샘플의 부분을 수집하는 것을 포함하는, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 복수개의 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함하고, 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드는 별개의 표적 영역에 혼성화하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 제1 포획제에 컨쥬게이트되는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적 영역의 동등한 길이 부분과 적어도 80% 상보성을 갖는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적 영역의 동등한 길이 부분과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 상보성을 갖는, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 올리고뉴클레오티드를 표적 영역을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드에 대해 10:1 내지 1:10의 몰비로 제공하는 것을 포함하는, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 폴리리보뉴클레오티드의 집단.
  48. 제47항에 있어서, 집단은 표적 영역을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 조성물 내의 총 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 40%(mol/mol)를 포함하는, 폴리리보뉴클레오티드의 집단.
  49. 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 조성물로서, 여기서 혼합물의 제1 하위세트는 표적 영역을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고, 복수개의 폴리리보뉴클레오티드의 제2 하위세트는 표적 영역을 포함하는 선형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고, 제1 하위세트는 조성물 내의 총 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 40%(mol/mol)를 포함하는, 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 집단은 50%(mol/mol) 미만의 선형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  51. 표적 영역을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 및 표적 영역에 혼성화하도록 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서, 여기서 올리고뉴클레오티드는 제1 포획제에 컨쥬게이트되는, 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 표적 영역을 결여한 폴리리보뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 표적 영역을 결여한 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드인, 조성물.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 포획제에 결합하도록 구성된 제2 포획제를 추가로 포함하는, 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 제2 포획제는 입자에 컨쥬게이트되는, 조성물.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 포획제는 비오틴인, 조성물.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 포획제는 스트렙타비딘인, 조성물.
  58. 제49항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된, 조성물.
  59. 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 선형 폴리리보뉴클레오티드는 인트론 또는 그의 부분을 포함하는, 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분을 포함하는, 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 표적 영역은 인트론 또는 그의 부분에 대해 5' 또는 3'에 위치하는, 조성물.
  62. 제49항 내지 제61항 중 어느 한 항의 조성물 및 희석제, 담체, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
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