KR20230136711A - 항-lag-3 항체 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-LAG-3 항체, 및 LAG-3 활성을 조절함으로써 이익을 얻는 질병 및 질환, 예를 들어, 암을 치료하는데 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-LAG-3 항체 및 조성물{ANTI-LAG-3 ANTIBODIES AND COMPOSITIONS}

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 2017년 10월 5일에 작성된 서열 목록의 전자 사본의 명칭은 022675_WO057_SL.txt이고, 크기는 64,693 바이트이다.

발명의 배경

CD223으로도 공지된 LAG-3(림프구-활성화 유전자 3)는 면역 체크포인트 수용체로서 기능하는 면역글로불린 슈퍼패밀리 단백질이다. 성숙 단백질은 4개의 세포외 Ig-유사 도메인을 갖는 503개-아미노산 타입 I 막통과 단백질이다. 이것은 활성화된 T 세포, T 조절성(Treg) 세포, 자연 살해 세포, B 세포 및 플라스마사이토이드(plasmacytoid) 수지상 세포를 포함하는 다양한 유형의 세포에서 발현된다. LAG-3의 서열 데이터, 엑손/인트론 구성, 및 염색체 국소화에 대한 정보는 이것이 CD4와 밀접한 관련이 있음을 나타낸다. CD4와 유사하게, LAG-3는 MHC 클래스 II 분자에 결합하지만, CD4와 비교하여 더 높은 친화도로 그리고 별개의 위치에서 결합한다.

LAG-3는 CTLA-4 및 PD-1과 유사한 방식으로 T 세포 증식, 활성화 및 항상성을 조절하는 것으로 여겨지는 보조-억제 수용체이다. 리간드가 세포외 도메인에 결합하면, LAG-3는 세포질 도메인을 통한 후속 신호전달을 통해 그 효과를 발휘한다. LAG-3에 대해 가장 잘 특성화된 리간드는 MHC 클래스 II(MHCII)이지만, LSECtin을 포함하는 다른 LAG-3 리간드가 기재되어 있다.

LAG-3는 전통적인 ITIM 또는 ITSM 모티프를 갖지 않지만, T-세포 활성에 대한 그 억제 효과를 확립하는데 필수적이라고 여겨지는 보존된 KIEELE 모티프(SEQ ID NO: 73)를 갖는다. LAG-3가 T-세포 활성에 영향을 미치는 정확한 메커니즘은 잘 이해되어 있지 않다. LAG-3는 활성화된 T-세포가 세포 주기의 성장 단계로 들어가는 것을 차단함으로써 T 세포 확장을 억제하여, S-단계에 세포의 축적을 발생시킨다. LAG-3는 또한 조절성 T-세포의 억제 활성을 강화시키고 수지상 세포 기능을 조절하는데 역할을 한다고 여겨진다. 암 세포는 이펙터 T-세포에서 LAG-3와 결합하여 이들의 활성을 억제하고 종양 면역 이탈을 유도하는 MHCII의 발현을 상향조절하는 능력을 갖는다.

면역 조절제로서의 LAG-3의 결정적인 역할에 비추어, 암 및 면역 시스템의 특정 장애를 치료하기 위해 LAG-3를 표적화하는 새롭고 개선된 면역 요법에 대한 필요성이 존재한다.

발명의 개요

본 발명은 LAG-3를 표적화하는 신규한 재조합 항체 뿐만 아니라 이들 항체 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물, 및 환자의 면역을 강화시키고 피부, 폐, 장, 결장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장과 같은 조직에서 발생한 암의 치료를 위한 항체 및 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 항체 치료를 포함하는 상기 암에 대한 현재 이용 가능한 치료와 비교하여, 본 발명의 항체는 단독으로 또는 다른 암 치료제, 예를 들어, 다른 면역 체크포인트 단백질을 표적화하는 항체와 함께 우수한 임상 반응을 제공할 수 있는 것으로 고려된다.

한 구체예에서, 본 발명은 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하고, 여기서 항-LAG-3 항체는 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011로서 본원에서 지칭된 임의의 항체 또는 이의 변이체이고, 상기 변이체는 부모 항체의 항원-결합 특이성을 잃지 않으며, 예를 들어, 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011에 비해 상이한 아이소형 또는 아이소형 아부류일 수 있고/거나 특정 최소 아미노산 변화를 함유할 수 있다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 인간 LAG-3와의 결합에 대해 중쇄(H) CDR1-3 및 경쇄(L) CDR1-3이 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3과 동일하거나 이로부터 유래되는 항체와 경쟁한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 중쇄(H) CDR1-3 및 경쇄(L) CDR1-3이 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3과 동일하거나 이로부터 유래되는 항체와 동일한 인간 LAG-3의 에피토프에 결합한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 H-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR3를 포함한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 H-CDR1-3 아미노산 서열을 각각 포함하는 H-CDR1-3를 포함한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 L-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR3를 포함한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 L-CDR1-3 서열을 각각 포함하는 L-CDR1-3를 포함한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 H-CDR3 및 L-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 인간 LAG-3와의 결합에 대해 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011과 경쟁한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011과 동일한 인간 LAG-3의 에피토프에 결합한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 37, 43, 46, 50, 55, 58, 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역(H-CDR) 3를 포함한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 35-37; 41-43; 35, 42, 및 46; 48-50; 53-55; 56-58; 또는 62-64의 아미노산 서열을 각각 포함하는 H-CDR1-3를 포함한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 서열에 있어 SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23 또는 27의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH를 갖는다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23 또는 27을 포함하는 VH를 갖는다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23 또는 27의 VH 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 30의 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC)를 갖는다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 40, 52, 61, 또는 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역(L-CDR) 3을 포함한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 38-40; 44, 45, 및 40; 44, 47, 및 40; 51, 47, 및 52; 59-61; 또는 65-67의 아미노산 서열을 각각 포함하는 L-CDR1-3를 포함한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 서열에 있어 SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24 또는 28의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VL을 갖는다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24 또는 28을 포함하는 VL을 갖는다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24 또는 28의 VL 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 32 또는 34의 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 37 및 40; 43 및 40; 46 및 40; 50 및 52; 55 및 40; 58 및 61; 또는 64 및 67의 H-CDR3 및 L-CDR3 아미노산 서열을 각각 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 하기의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다:

a) 각각 SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 및 40;

b) 각각 SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 및 40;

c) 각각 SEQ ID NO: 35, 42, 46, 44, 47, 및 40;

d) 각각 SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 47, 및 52;

e) 각각 SEQ ID NO: 53, 54, 55, 44, 45, 및 40;

f) 각각 SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60, 및 61; 또는

g) 각각 SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 및 67.

특정 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분은:

a) 서열에 있어 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH, 및 서열에 있어 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VL을 갖거나;

b) 서열에 있어 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH, 및 서열에 있어 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VL을 갖거나;

c) 서열에 있어 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH, 및 서열에 있어 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VL을 갖거나;

d) 서열에 있어 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH, 및 서열에 있어 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VL을 갖거나;

e) 서열에 있어 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH, 및 서열에 있어 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VL을 갖거나;

f) 서열에 있어 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH, 및 서열에 있어 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VL을 갖거나;

g) 서열에 있어 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH, 및 서열에 있어 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VL을 갖는다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분은:

a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL을 갖거나;

b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL을 갖거나;

c) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL을 갖거나;

d) SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL을 갖거나;

e) SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH 및 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL을 갖거나;

f) SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH 및 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL을 갖거나;

g) SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH 및 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL을 갖는다.

특정 구체예에서, 항-LAG-3 항체는:

a) SEQ ID NO: 4 및 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LC; 및 SEQ ID NO: 3 및 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HC를 갖거나;

b) SEQ ID NO: 8 및 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LC; 및 SEQ ID NO: 7 및 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HC를 갖거나;

c) SEQ ID NO: 12 및 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LC; 및 SEQ ID NO: 11 및 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HC를 갖거나;

d) SEQ ID NO: 16 및 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LC; 및 SEQ ID NO: 15 및 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HC를 갖거나;

e) SEQ ID NO: 20 및 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LC; 및 SEQ ID NO: 19 및 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HC를 갖거나;

f) SEQ ID NO: 24 및 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LC; 및 SEQ ID NO: 23 및 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HC를 갖거나;

g) SEQ ID NO: 28 및 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LC; 및 SEQ ID NO: 27 및 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HC를 갖는다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 하기 특징 중 적어도 하나를 갖는다:

a) 20 μg/mL의 농도에서, A375 세포 상의 인간 MHC 클래스 II에 대한 인간 LAG-3의 결합을 유세포분석 경쟁 검정에 의해 측정시 음성 대조군 항체와 비교하여 85% 넘게 감소시키고;

b) 20 μg/mL의 농도에서, A375 세포 상의 인간 MHC 클래스 II에 대한 인간 LAG-3의 결합을 유세포분석 경쟁 검정에 의해 측정시 음성 대조군 항체와 비교하여 35% 내지 85% 감소시키고;

c) Jurkat 세포 상에 발현된 인간 LAG-3 및 Raji 세포 상에 발현된 인간 MHC 클래스 II 사이의 결합을 차단하고;

d) 유세포분석에 의해 측정시 0.1 nM 이하의 EC₅₀으로 인간 LAG-3에 결합하고;

e) 유세포분석에 의해 측정시 0.3 nM 이하의 EC₅₀으로 시노몰구스 LAG-3에 결합하고;

f) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 3.0 x 10^-8 이하의 K_D로 인간 LAG-3에 결합하고;

g) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 1.5 x 10^-7 이하의 K_D로 시노몰구스 LAG-3에 결합하고;

h) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 3.5 x 10^-8 이하의 K_D로 마우스 LAG-3에 결합하고;

i) 스태필로코쿠스 엔테로톡신 B(SEB)로 처리된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 IL-2 생산을 자극하고;

j) 인간 T 세포에서 LAG-3의 세포 수준을 감소시키고;

k) 인간 T 세포의 배양물에서 LAG-3의 가용성 수준을 감소시키고;

l) 생체내에서 종양 성장 퇴행(regression)을 유도하고;

m) 생체내에서 종양 성장을 지연시키고;

n) 항체 25F7-Lag3.5와 동일한 인간 LAG-3의 에피토프에 결합하지 않는다.

그러한 항체의 예는 비제한적으로 항체 15646(적어도 특징 b, c, d, e, i, 및 n을 지님), 항체 15532(적어도 특징 a, c, d, e, f, g, i, j, k, m, 및 n을 지님), 항체 15723(적어도 특징 b, c, d, e, i, 및 n을 지님), 항체 15595(적어도 특징 a, c, d, e, i, 및 n을 지님), 항체 15431(적어도 특징 a, c, d, e, f, g, i, 및 n을 지님), 항체 15572(적어도 특징 b, c, d, e, f, g, i, 및 n을 지님), 및 항체 15011(적어도 특징 a, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, 및 n을 지님)을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-TIM-3 항체 또는 항원-결합 부분은 상기 특징 중 적어도 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개를 갖는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-TIM-3 항체 또는 항원-결합 부분은 적어도 특징 b, c, d, e, i, 및 n; 적어도 특징 a, c, d, e, f, g, i, j, k, m, 및 n; 적어도 특징 a, c, d, e, i, 및 n; 적어도 특징 a, c, d, e, f, g, i, 및 n; 적어도 특징 b, c, d, e, f, g, i, 및 n; 또는 적어도 특징 a, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, 및 n을 갖는다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 인간 LAG-3와의 결합에 대해 항체 15011, 15572, 및/또는 15431과 경쟁한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 하기를 갖는 인간 LAG-3의 에피토프에 결합한다:

a) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 H85, P86, A87, P89, S91, W92, 및 G93;

b) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 A40, Q41, P43, P46, P49, D52, T62, Q64, H65, Q66, P67, D68, G93, P94, P96, R98, Y99, T100, V101, P106, G107, R119, E124, R129, G130, D131, S133, R137, P138, D143, R148, 및 R163;

c) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 A40, Q41, P43, P46, P49, D52, T62, Q64, H65, Q66, P67, D68, P96, Y99, T100, V101, P106, G107, R119, E124, R129, G130, D131, S133, R137, P138, D143, R148, 및 R163; 또는

d) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 G107, L109, R110, 및 S111.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 98-105를 갖는 에피토프에 결합한다. 그러한 항체의 예는 비제한적으로 항체 15532, 15431, 15572, 및 15011을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 하기를 갖는 에피토프에 결합한다:

a) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 78-105 및 123-131;

b) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 23-30, 40-66, 88-105, 123-137, 및 148-152; 또는

c) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 23-30, 40-66, 98-105, 118-137, 및 148-161.

일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 아이소형 IgG, 예를 들어, 아이소형 IgG 아부류 IgG₁ 또는 IgG₂를 갖는다. 특정 구체예에서, 항체는 F_c 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정 구체예에서, 항체는 IMGT^® 넘버링 체계에 따라 넘버링된 중쇄 아미노산 위치 228, 234 및 235 중 하나 이상에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 위치 234 및 235의 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘 모두는 Leu에서 Ala로 돌연변이될 수 있고/거나 위치 228의 아미노산 잔기는 Ser에서 Pro로 돌연변이될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 적어도 하나(예를 들어, 하나)의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분 및 약학적으로 허용되는 부형제를, 선택적으로 항암 항체 치료제와 같은 추가적인 치료제와 함께 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 항-LAG-3 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 둘 모두를 포함하는 분리된 핵산 분자를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하고, 상기 벡터는 발현 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항-LAG-3 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 둘 모두를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 방법으로서, 본원에 기재된 항-LAG-3 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포를 상기 항체 또는 부분의 발현에 적합한 조건 하에 배양시키고, 생성된 항체 또는 부분을 분리시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항-LAG-3 항체의 항원-결합 부분 및 또 다른 별개 항체, 예를 들어, 다른 항-LAG-3 항체(예를 들어, 본원에 기재됨) 또는 다른 면역 체크포인트 단백질, 암 항원, 또는 그 활성이 암과 같은 질병 상태를 매개하는 또 다른 세포 표면 분자와 같은 상이한 단백질을 표적화하는 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 다중-특이적(예를 들어, 이중특이적) 결합 분자를 제공한다.

본 발명은 또한 환자에게 본원에 기재된 바와 같은 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 약학적 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, LAG-3-관련 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 달리 언급되지 않는 한, 환자는 본원에서 인간 환자를 지칭한다.

본 발명은 또한 환자에게 본원에 기재된 바와 같은 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 약학적 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 면역을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 환자에게 본원에 기재된 바와 같은 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 약학적 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 구체예에서, 암은 피부, 폐, 장, 결장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장으로부터 선택되는 조직에서 유래한다. 특정 구체예에서, 암은 섬유육종, 비소세포폐암, 흑색종, 아교모세포종, 신경아교육종, 또는 결장직장암이다.

상기 방법 중 임의의 방법은, 예를 들어, 화학요법제, 항신생물제, 항혈관형성제, 티로신 키나제 억제제, LAG-3 경로 억제제, 또는 방사선 요법의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 레티노산, 페닐부티레이트, 올-트랜스-레티노산, 및/또는 활성 형태 비타민 D의 투여를 추가로 포함한다.

본 발명은 LAG-3-관련 장애를 갖는 환자를 치료하고/거나, 환자의 암을 치료하고/거나, 면역의 향상을 필요로 하는 환자의 면역을 향상시키기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 바와 같은 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분을 포함하는 항체 조성물의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 LAG-3-관련 장애를 갖는 환자를 치료하고/거나, 환자의 암을 치료하고/거나, 면역의 향상을 필요로 하는 환자의 면역을 향상시키기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항-LAG 3 항체 또는 항원-결합 부분을 추가로 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분을 포함하는 제조 물품을 추가로 제공하고, 상기 제조 물품은 LAG-3-관련 장애를 갖는 환자를 치료하고/거나, 환자의 암을 치료하고/거나, 면역의 향상을 필요로 하는 환자의 면역을 향상시키기에 적합하다.

도면의 간단한 설명
도 1a-1c는 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 항체에 대한 대표적인 유세포분석 도트 플롯을 나타낸다. 도 1a: 인간 LAG-3-트랜스펙션된 세포에 특이적으로 결합하는 항체 클론. 도 1b: CHO-S 세포에 비특이적으로 결합하는 항체 클론. 도 1c: 스크리닝에 사용된 세포 집단 중 어느 것에도 결합하지 않는 항체 클론.
도 2는 항-LAG-3 모노클로날 항체로 처리한 후 SEB-자극된 PBMC로부터의 IL-2 생산 수준을 나타낸다.
도 3는 항-LAG-3 모노클로날 항체로 처리한 후 SEB-자극된 PBMC로부터의 IL-2 생산 수준을 나타낸다. 각각의 도트는 단일 PBMC 공여자로부터의 IL-2 분비의 수준을 나타낸다.
도 4는 항-LAG-3 모노클로날 항체로 처리한 후 LAG-3-MHC 클래스 II 차단 검정에서의 발광 수준을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다.
도 5는 항-LAG-3 모노클로날 항체로 처리한 후 LAG-3 트랜스펙션된 T 세포주로부터의 용해물 및 상청액 중의 LAG-3 수준을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다. 별표는 15532 및 참조 항체 유사체 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(*: p<0.05, ***: p<0.001, ****: p<0.0001).
도 6은 2개의 동계 뮤린 종양 모델에서 항체 15011의 생체내 효능을 입증한다.
도 7은 반-인간화된 이종이식 종양 모델에서 항체 15532의 생체내 효능을 입증하고, 이 때 NOG 마우스의 면역 시스템은 인간 PBMC로 재구성되었고 마우스는 인간 흑색종 A375 세포로 이식되었다.
도 8은 13개의 항-LAG-3 항체의 패널의 결합 경쟁 분석에 의해 확인된 에피토프 그룹(에피토프 빈)의 개요를 나타낸다. 검정색 선으로 연결된 항체는 두 방향 모두에서의 교차 차단 활성을 나타낸다(리간드 및 분석물). 점선으로 연결된 항체는 단방향 차단을 나타내고, 항체는 분석물로 시험될 때만 차단된다. 항체는 경쟁 패턴에 따라 다른 항-LAG-3 항체로 분류된다.
도 9는 리간드 항체의 에피토프 다양성의 클러스터 분석을 나타낸다. x-축 값이 0 보다 큰 분지 점을 갖는 항체는 패널 내 다른 항체의 LAG-3 결합에 대한 경쟁에 기반하여 구별되는 에피토프를 갖는다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 암 환자와 같은 인간 환자에서 면역 시스템을 향상시키는데 사용될 수 있는 새로운 항-인간 LAG-3 항체를 제공한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 "LAG-3"는 인간 LAG-3를 지칭한다. 인간 LAG-3 폴리펩티드 서열은 UniProt 수탁 번호 P18627(LAG3_HUMAN)(SEQ ID NO: 68) 하에 입수 가능하다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"(Ab) 또는 "면역글로불린"(Ig)은 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄(H)(약 50 내지 70 kDa) 및 2개의 경쇄(L)(약 25 kDa)를 포함하는 테트라머를 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 도메인 및 VL 도메인은 "프레임워크 영역"(FR)으로 지칭되는 더욱 보존적인 영역에 배치된, "상보성 결정 영역"(CDR)으로 지칭되는 과가변성(hypervariability)의 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단에서 카르복실-말단으로 배열된 3개의 CDR(본원에서 H-CDR은 중쇄로부터의 CDR을 명시하며; 본원에서 L-CDR은 경쇄로부터의 CDR을 명시함) 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 또는 경쇄에서의 아미노산 번호의 정렬은 IMGT^® 정의[Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003)]; 또는 카바트의 정의[Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); or Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]에 따를 수 있다.

용어 "재조합 항체"는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 세포 또는 세포주로부터 발현되는 항체를 지칭하며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열(들)은 자연적으로 세포와 관련이 없다.

용어 "분리된 단백질," "분리된 폴리펩티드" 또는 "분리된 항체"는 이의 유래 기원 또는 공급원에 의해 (1) 이의 천연 상태에서 수반되는 자연적으로 결합된 성분들과 결합되지 않고/거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 존재하지 않고/거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되고/거나, (4) 자연에서 발생하지 않는 단백질, 폴리펩티드 또는 항체를 지칭한다. 이에 따라, 화학적으로 합성되거나 이것이 자연적으로 유래하는 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성된 폴리펩티드는 이의 자연적으로 결합된 성분으로부터 "분리"될 것이다. 단백질은 또한 당해 분야에 널리 공지된 단백질 정제 기술을 이용하여, 분리에 의해 자연적으로 결합된 성분들이 실질적으로 존재하지 않게 제공될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "생식계열(germline)"은 생식 세포를 통해 부모에서 자식으로 진행됨에 따른 항체 유전자 및 유전자 세그먼트의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 지칭한다. 생식계열 서열은 성숙 B 세포에서 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 구별되며, 이는 B 세포 성숙화의 과정 동안 재조합 및 과돌연변이 사건에 의해 변경되었다. 특정 생식계열 서열을 "활용"하는 항체는 그 생식계열 뉴클레오티드 서열, 또는 이것이 임의의 다른 생식계열 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열보다 더욱 밀접하게 특정하는 아미노산 서열과 정렬되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 갖는다.

용어 "친화도"는 항원과 항체 간의 인력의 척도를 지칭한다. 항원에 대한 항체의 고유 친화도는 통상적으로 특정 항체-항원 상호작용의 결합 친화도 평형 상수(K_D)로서 표현된다. 항체는 K_D가 ≤ 1 mM, 바람직하게, ≤ 100 nM일 때, 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. K_D 결합 친화도 상수는, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(BIAcore™) 또는 바이오-레이어 간섭굴절측정법(Bio-Layer Interferometry)에 의해, 예를 들어, IBIS Technologies로부터의 IBIS MX96 SPR 시스템 또는 ForteBio로부터의 Octet™ 시스템을 이용하여 측정될 수 있다.

용어 "k_off"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. k_off 해리 속도 상수는, 예를 들어, IBIS MX96 시스템을 사용하여, 예를 들어, SPR(표면 플라스몬 공명)에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체 또는 관련된 분자, 예를 들어, 이중특이적 결합 분자에 특이적으로 결합하는 항원의 부분(결정인자)을 지칭한다. 에피토프성 결정 인자는 일반적으로 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑, 예를 들어, 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄로 이루어지고, 일반적으로 특정 3차원 구조 특징 뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 "선형"이거나 "입체구조(conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질(예를 들어, 항원)과 상호작용하는 분자(예를 들어, 항체) 간의 모든 상호작용 지점은 단백질의 일차 아미노산 서열을 따라 선형으로 일어난다. 입체구조 에피토프에서, 상호작용 지점은 일차 아미노산 서열에서 서로 분리되어 있는 단백질 상의 아미노산 잔기를 가로질러 일어난다. 항원 상의 요망되는 에피토프가 결정되면, 당해 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 그 에피토프에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 선형 에피토프에 대한 항체는, 예를 들어, 동물을 선형 에피토프의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드로 면역시킴에 의해 생성될 수 있다. 입체구조 에피토프에 대한 항체는, 예를 들어, 동물을 입체구조 에피토프의 관련 아미노산 잔기를 함유하는 미니-도메인으로 면역시킴에 의해 생성될 수 있다. 특정 에피토프에 대한 항체는 또한, 예를 들어, 동물을 관심 표적 분자(예를 들어, LAG-3) 또는 이의 관련 부분으로 면역시킨 다음, 에피토프에 대한 결합을 스크리닝함으로써 생성될 수 있다.

경쟁 검정, 에피토프 비닝(epitope binning), 및 알라닌 스캐닝을 비제한적으로 포함하는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 항체가 본 발명의 항-LAG-3 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 결합에 대해 이러한 항체와 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체가 포화 조건 하에 LAG-3에 결합하게 한 다음, LAG-3에 결합하는 시험 항체의 능력을 측정한다. 시험 항체가 참조 항-LAG-3 항체와 동시에 LAG-3에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 참조 항-LAG-3 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 동시에 LAG-3에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프, 또는 본 발명의 항-LAG-3 항체에 의해 결합된 에피토프에 매우 근접한 에피토프에 결합한다. 이 실험은, 예를 들어, ELISA, RIA, BIACORE™, SPR, 바이오-레이어 간섭굴절측정법 또는 유세포분석을 이용하여 수행될 수 있다. 항-LAG-3 항체가 또 다른 항-LAG-3 항체와 교차-경쟁하는지를 시험하기 위해, 상기 기재된 경쟁 방법을 두 방향으로 이용할 수 있고, 즉, 공지된 항체가 시험 항체를 차단하는지 및 그 반대인지를 결정할 수 있다. 그러한 교차-경쟁 실험은, 예를 들어, IBIS MX96 SPR 기계 또는 Octet™ 시스템을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 결합에 대해 이러한 항체와 경쟁하는 항체는 바람직하게는, 예를 들어, 실시예 6에 기재된 유세포분석 경쟁 검정을 사용하여 결정시, MHCII 차단 활성을 갖는다. 본 발명의 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 결합에 대해 이러한 항체와 경쟁하는 항체는 결합을 적어도, 예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%, 또는 바람직하게는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다.

용어 "키메라 항체"는 가장 넓은 의미에서 한 항체로부터의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 영역을 함유하는 항체, 전형적으로 부분적으로는 인간 기원이고 부분적으로는 비-인간 기원, 즉, 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스, 래트 또는 다른 설치류, 또는 닭과 같은 조류에서 부분적으로 유래된 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 인간 항-항체 반응, 예를 들어, 뮤린 항체의 경우 인간 항-마우스 항체 반응의 위험을 감소시키기 위해 비-인간 항체보다 바람직하다. 전형적인 키메라 항체의 예는 가변 도메인 서열이 뮤린인 한편 불변 영역 서열은 인간인 항체이다. 키메라 항체의 경우, 비-인간 부분은 항체를 인간화하기 위해 추가 변경을 거칠 수 있다. 본원에 기재된 키메라 항체는, 예를 들어, 닭 가변 도메인 서열 및 인간 불변 영역 서열을 가질 수 있다.

용어 "인간화"는 항체가 전체적으로 또는 부분적으로 비-인간 기원인 경우(예를 들어, 관심 항원으로 마우스 또는 닭을 각각 면역화하여 얻은 뮤린 또는 닭 항체, 또는 그러한 뮤린 또는 닭 항체에 기반한 키메라 항체), 인간의 면역 반응을 피하거나 최소화하기 위해, 특히 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역 및 불변 영역의 특정 아미노산을 대체할 수 있다는 사실을 지칭한다. 특정 항체의 면역원성 및 그에 따른 인간 항-항체 반응을 정확하게 예측하는 것이 가능하지는 않지만, 비-인간 항체는 인간 항체보다 인간에서 더 면역원성인 경향이 있다. 외래(예를 들어, 설치류 또는 조류) 불변 영역이 인간 기원의 서열로 대체된 키메라 항체는 일반적으로 완전한 외래 기원의 항체보다 덜 면역원성인 것으로 나타났고, 치료용 항체의 경향은 인간화 또는 완전한 인간 항체로 향한다. 따라서 키메라 항체 또는 비-인간 기원의 다른 항체는 인간 항-항체 반응의 위험을 감소시키기 위해 인간화될 수 있다.

키메라 항체의 경우, 인간화는 전형적으로 가변 도메인 서열의 프레임워크 영역의 변형을 포함한다. 상보성 결정 영역(CDR)의 일부인 아미노산 잔기는 인간화와 관련하여 가장 자주 변경되는 것은 아니지만, 특정 경우에 개별 CDR 아미노산 잔기를 변경하여, 예를 들어, 당화 부위, 탈아미드화 부위, 아스파르테이트 이성질체화 부위 또는 요망되지 않는 시스테인 또는 메티오닌 잔기를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. N-결합된 당화는 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr의 아스파라긴 잔기에 올리고사카라이드 사슬을 부착시킴으로써 발생하며, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-당화 부위의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기를 상이한 잔기로, 바람직하게는 보존적 치환에 의해 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 요인에 따라 발생할 수 있다. 아스파라긴 잔기는 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때 탈아미드화에 특히 민감하고, Asn-Ala와 같은 다른 디펩티드 서열에 존재할 때 어느 정도 민감하다. 그러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly가 CDR 서열에 존재하는 경우, 이에 따라 통상적으로 보존적 치환에 의해 그 부위를 제거하여 내포된 잔기 중 하나를 제거하는 것이 바람직할 수 있다.

항체 서열의 인간화를 위한 수많은 방법이 당해 분야에 공지되어 있다; 예를 들어, Almagro & Fransson, Front Biosci. 13:1619-1633 (2008)에 의한 검토 참조. 일반적으로 사용되는 방법 중 하나는 CDR 그라프팅이고, 예를 들어, 뮤린-유래된 키메라 항체의 경우에, 뮤린 가변 도메인 유전자에 대한 인간 생식계열 유전자 대응부의 식별 및 뮤린 CDR 서열의 이의 프레임워크로의 그라프팅을 포함한다. 항체와 표적 항원의 상호작용의 특이성은 주로 중쇄 및 경쇄의 6개 CDR에 위치한 아미노산 잔기에 존재한다. 따라서 CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에서 훨씬 더 가변적이다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체, 또는 보다 일반적으로 주어진 아미노산 서열을 갖는 임의의 특정 항체를, 예를 들어, 다른 항체의 프레임워크 서열에 그라프팅된 특정 항체로부터 CDR 서열을 발현시키는 발현 벡터를 작제함으로써, 발현시키는 것이 가능하다. 결과적으로, 비-인간 항체를 "인간화"할 수 있고 원래 항체의 결합 특이성 및 친화도를 여전히 실질적으로 유지할 수 있다. CDR 그라프팅은 카바트 CDR 정의에 기반할 수 있지만, 보다 최근의 간행물(Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210-225(2007))은 IMGT^® 정의(the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org)가 인간화의 결과를 개선시킬 수 있다고 제안하였다(문헌[Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003) 참조).

일부 경우에, CDR 그라프팅은 CDR이 수득되는 부모 항체와 비교하여 CDR-그라프팅된 항체의 결합 특이성 및 친화도, 및 이에 따라 생물학적 활성을 감소시킬 수 있다. 부모 항체의 결합 특이성 및 친화도를 재확립하기 위해, 전형적으로 프레임워크 영역에서, CDR-그라프팅된 항체의 선택된 위치에 역 돌연변이(때로 "프레임 워크 복구"로서 언급됨)가 도입될 수 있다. 가능한 역 돌연변이를 위한 위치는 문헌 및 항체 데이터베이스에서 이용 가능한 정보를 사용하여 확인될 수 있다. 역 돌연변이의 후보인 아미노산 잔기는 전형적으로 항체 분자의 표면에 위치한 아미노산 잔기인 반면, 묻혀 있거나 표면 노출 정도가 낮은 잔기는 일반적으로 변동이 없을 것이다. CDR 그라프팅 및 역 돌연변이에 대한 대안적인 인간화 기술이 재고중이며, 여기서 비-인간 기원의 비-표면 노출된 잔기는 유지되는 반면, 표면 잔기는 인간 잔기로 변경된다.

특정 경우에, 표적 에피토프에 대한 결합 친화도를 개선시키기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변경시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이것은 "친화도 성숙"으로 알려져 있고, 예를 들어, 항체의 인간화가 감소된 결합 특이성 또는 친화도를 발생시키고 역 돌연변이 단독에 의해 결합 특이성 또는 친화도를 충분히 개선할 수 없는 상황에서, 인간화와 관련하여 선택적으로 수행될 수 있다. 다양한 친화도 성숙 방법, 예를 들어, 문헌[Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)]에 의해 기술된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이발생 방법 및 문헌[Wu et al. Proc Natl Acad Sci USA 95:6037-6042 (1998)]의 단계별 시험관내 친화도 성숙화 방법이 당해 분야에 공지되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 부분"(또는 단순하게 "항체 부분")은 항원(예를 들어, 인간 LAG-3, 또는 이의 부분)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 부분 또는 단편을 지칭한다. 전장 항체의 특정 단편은 항체의 항원-결합 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편: V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성된 일가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편: 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 이가 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) V_H 도메인으로 구성된 dAb 단편; 및 (vi) 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 V_L 및 V_H는 별개의 유전자에 의해 인코딩되지만, 이들은 일가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로서 공지됨)를 형성시키기 위해 이들을 V_L 및 V_H 도메인이 페어링된 단일 단백질 사슬로서 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용하여, 결합될 수 있다. 또한, 본 발명 내에 V_H 및/또는 V_L을 포함하는 항원-결합 분자가 있다. V_H의 경우에, 분자는 또한 CH1, 힌지, CH2, 또는 CH3 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 그러한 단일쇄 항체는 또한 항체의 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 다른 형태의 단일쇄 항체, 예를 들어, 디아바디(diabody)가 또한 포함된다. 디아바디는 V_H 및 V_L 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만, 너무 짧아서 동일한 사슬 상의 2개의 도메인을 페어링할 수 없는 링커를 이용하여, 도메인이 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어링되게 하고, 2개의 항원-결합 부위를 생성시키는 이가의 이중특이적 항체이다.

항체 부분, 예를 들어, Fab 및 F(ab')₂ 단편은 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상적인 기술을 이용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 또한, 항체, 항체 부분 및 면역접합 분자는, 예를 들어, 본원에 기술된 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득될 수 있다.

항-LAG-3 항체의 부류(아이소형) 및 아부류는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 항체의 부류 및 아부류는 항체의 특정 부류 및 아부류에 대해 특이적인 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 그러한 항체는 상업적으로 입수 가능하다. 부류 및 아부류는 ELISA, 웨스턴 블롯(Western Blot) 뿐만 아니라 다른 기술들에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 부류 및 아부류는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역 전부 또는 이의 일부를 서열화하고, 이의 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 부류 및 아부류의 공지된 아미노산 서열과 비교하고, 항체의 부류 및 아부류를 결정함으로써 결정될 수 있다.

달리 언급되지 않는 한, 본 개시내용에서 언급되는 모든 항체 아미노산 잔기 번호는 IMGT® 넘버링 체계 하에 있는 것들이다.

항-LAG-3 항체

본 발명은 LAG-3에 대한 항체 및 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 항체는 인간 이디오타입을 지닌 항체를 생성할 수 있는 트랜스제닉 래트로부터 생성된 인간 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 닭 CDR 서열 및 인간 프레임워크 영역을 포함하는 닭-유래된 키메라 항체이고, 여기서 프레임워크 영역은 인간화를 거쳤다.

본 발명의 신규한 항-LAG-3 항체의 한 가지 이점은 증가된 IL-2 생산에 의해 측정된 바와 같이 이들이 T-세포의 활성을 향상시킬 수 있다는 것이다; 예를 들어, 실시예 7 참조. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으며, 본 발명의 항-LAG-3 항체는 LAG-3와 이의 추정상 리간드, 예를 들어, MHCII 및 LSECtin의 상호작용을 차단할 수 있다고 여겨진다. 항체는, 예를 들어, 실시예 6에서 입증된 바와 같이, 리간드 결합 영역의 차단을 통해, 또는 실시예 9에 제시된 결과 배후의 가능한 작용 메커니즘으로 고려되는 LAG-3 내재화의 유도를 통해, 이를 직접적으로 달성할 수 있다. 본 발명의 항-LAG-3 항체의 또 다른 잠재적인 이점은 "LALA" 돌연변이(L234A/L235A)를 갖는 항체에서의 낮은 수준의 이차 이펙터 기능이고, 이는 인간 FcgR(Fc 감마 수용체)에 대한 상당한 항체 결합 및 이에 따른 이펙터 T-세포의 고갈을 방해한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 서열에 있어 SEQ ID NO: 37, 43, 46, 50, 55, 58, 및 64 중 어느 하나와 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 37, 43, 46, 50, 55, 58, 및 64 중 어느 하나와 적어도 92% 동일하고, 예를 들어, 적어도 95%, 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 CDR3(H-CDR3)를 갖는다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 서열에 있어 SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23 또는 27 중 어느 하나와 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23 또는 27 중 어느 하나와 적어도 92% 동일하고, 예를 들어, 적어도 95%, 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 도메인(VH)을 갖는다.

또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 서열에 있어 SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23 또는 27 중 어느 하나와 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23 또는 27 중 어느 하나와 적어도 92% 동일하고, 예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 도메인(VH); 및 서열에 있어 SEQ ID NO: 30과 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 30과 적어도 92% 동일하고, 예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 갖는다.

또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23 또는 27 중 어느 하나의 VH 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 30의 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC)를 갖는다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 서열에 있어 SEQ ID NO: 40, 52, 61, 및 67 중 어느 하나와 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 40, 52, 61, 및 67 중 어느 하나와 적어도 92% 동일하고, 예를 들어, 적어도 95%, 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 CDR3(L-CDR3)를 갖는다.

또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 서열에 있어 SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24 또는 28 중 어느 하나의 VL 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24 또는 28 중 어느 하나와 적어도 92% 동일하고, 예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 도메인(VL)을 갖는다.

또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 서열에 있어 SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 중 어느 하나의 VL 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 중 어느 하나와 적어도 92% 동일하고, 예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 도메인(VL); 및 서열에 있어 SEQ ID NO: 34와 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 34와 적어도 92% 동일하고, 예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 서열에 있어 SEQ ID NO: 28의 VL 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 28과 적어도 92% 동일하고, 예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 도메인(VL); 및 서열에 있어 SEQ ID NO: 32와 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, SEQ ID NO: 32와 적어도 92% 동일하고, 예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 또는 24, 및 SEQ ID NO: 34 중 어느 하나를 포함하는 경쇄를 갖는다.

또 다른 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 SEQ ID NO: 28 및 SEQ ID NO: 32를 포함하는 경쇄를 갖는다.

특정 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 상기 기재된 중쇄 중 어느 하나 및 상기 기재된 경쇄 중 어느 하나를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 하기의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다:

a) 각각 SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 및 40;

b) 각각 SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 및 40;

c) 각각 SEQ ID NO: 35, 42, 46, 44, 47, 및 40;

d) 각각 SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 47, 및 52;

e) 각각 SEQ ID NO: 53, 54, 55, 44, 45, 및 40;

f) 각각 SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60, 및 61; 또는

g) 각각 SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 및 67.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 하기의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 H-CDR3 및 L-CDR3를 포함한다:

a) 각각 SEQ ID NO: 37 및 40;

b) 각각 SEQ ID NO: 43 및 40;

c) 각각 SEQ ID NO: 46 및 40;

d) 각각 SEQ ID NO: 50 및 52;

e) 각각 SEQ ID NO: 55 및 40;

f) 각각 SEQ ID NO: 58 및 61; 또는

g) 각각 SEQ ID NO: 64 및 67.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 하기의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 및 VL을 포함한다:

a) 각각 SEQ ID NO: 3 및 4;

b) 각각 SEQ ID NO: 7 및 8;

c) 각각 SEQ ID NO: 11 및 12;

d) 각각 SEQ ID NO: 15 및 16;

e) 각각 SEQ ID NO: 19 및 20;

f) 각각 SEQ ID NO: 23 및 24; 또는

g) 각각 SEQ ID NO: 27 및 28.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 하기의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL을 포함한다:

a) 각각 SEQ ID NO: 3 및 4;

b) 각각 SEQ ID NO: 7 및 8;

c) 각각 SEQ ID NO: 11 및 12;

d) 각각 SEQ ID NO: 15 및 16;

e) 각각 SEQ ID NO: 19 및 20;

f) 각각 SEQ ID NO: 23 및 24; 또는

g) 각각 SEQ ID NO: 27 및 28.

일부 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 하기를 포함한다:

a) SEQ ID NO: 3 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 4 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC;

b) SEQ ID NO: 7 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 8 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC;

c) SEQ ID NO: 11 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 12 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC;

d) SEQ ID NO: 15 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 16 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC;

e) SEQ ID NO: 19 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 20 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC;

f) SEQ ID NO: 23 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 24 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC; 또는

g) SEQ ID NO: 27 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 28 및 32의 아미노산 서열을 갖는 LC.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 아미노산 서열에 있어 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 VH 및 VL과 각각 적어도 90% 동일한 VH 및 VL을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011의 각각 VH 및 VL인 VH 및 VL을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체는 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011, 또는 상기 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체이다.

본 발명은 또한 하기를 갖는 인간 LAG-3의 에피토프에 결합하는 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다:

a) SEQ ID NO: 68(예를 들어, 항체 15532)의 H85, P86, A87, P89, S91, W92, 및 G93로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 모두의 아미노산 잔기;

b) SEQ ID NO: 68(예를 들어, 항체 15431)의 A40, Q41, P43, P46, P49, D52, T62, Q64, H65, Q66, P67, D68, G93, P94, P96, R98, Y99, T100, V101, P106, G107, R119, E124, R129, G130, D131, S133, R137, P138, D143, R148, 및 R163로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 또는 32개 모두의 아미노산 잔기;

c) SEQ ID NO: 68(예를 들어, 항체 15572)의 A40, Q41, P43, P46, P49, D52, T62, Q64, H65, Q66, P67, D68, P96, Y99, T100, V101, P106, G107, R119, E124, R129, G130, D131, S133, R137, P138, D143, R148, 및 R163로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개 모두의 아미노산 잔기; 또는

d) SEQ ID NO: 68(예를 들어, 항체 15011)의 G107, L109, R110, 및 S111로부터 선택되는 1, 2, 3, 또는 4개 모두의 아미노산 잔기.

본 발명은 또한 잔기 98-105를 갖는 인간 LAG-3의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 하기를 갖는 인간 LAG-3의 에피토프에 결합한다:

a) SEQ ID NO: 68의 잔기 78-105 및 123-131로부터 선택되는 2 또는 3개의 아미노산 세그먼트(예를 들어, 항체 15532);

b) SEQ ID NO: 68의 잔기 23-30, 40-66, 88-105, 123-137, 및 148-152로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 세그먼트(예를 들어, 항체 15431);

c) SEQ ID NO: 68의 잔기 23-30, 40-66, 98-105, 118-137, 및 148-161로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 세그먼트(예를 들어, 항체 15572); 또는

d) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 98-105(예를 들어, 항체 15011).

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 68의 잔기 23-30 및 40-66을 갖는 인간 LAG-3의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 일부 구체예에서, 에피토프는 SEQ ID NO: 68의 잔기 88-105, 123-137, 및/또는 148-152를 추가로 갖는다. 일부 구체예에서, 에피토프는 SEQ ID NO: 68의 잔기 98-105, 118-137, 및 148-161을 추가로 갖는다.

본 발명은 또한 15532, 15646, 15723, 15595, 15431, 15572, 및 15011로 구성된 군으로부터 선택되는 항체와 결합에 대해 경쟁 또는 교차-경쟁하거나, 이와 동일한 에피토프에 결합하는 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 25F7-Lag3.5와 동일한 인간 LAG-3의 에피토프에 결합하지 않는다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 IGHV4-34, IGHV1-24, IGHV6-1, IGHV4-39, 및 IGHV3-23으로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 중쇄 생식계열 유전자를 이용한다. 특정 구체예에서, 중쇄 생식계열 유전자는 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 부분의 상응하는 중쇄 서열과 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. 특정 구체예에서, 상기 중쇄 생식계열 유전자의 프레임워크 영역 서열은 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 부분의 상응하는 중쇄 프레임워크 영역 서열과 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 IGKV3-11, IGKV1-12, IGKV1-5, 및 IGLV3-19로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 경쇄 생식계열 유전자를 이용한다. 특정 구체예에서, 경쇄 생식계열 유전자는 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 부분의 상응하는 경쇄 서열과 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. 특정 구체예에서, 상기 경쇄 생식계열 유전자의 프레임워크 영역 서열은 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 부분의 상응하는 경쇄 프레임워크 영역 서열과 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 상기 인간 중쇄 생식계열 유전자 및 인간 경쇄 생식계열 유전자의 임의의 조합(예를 들어, IGHV4-34 및 IGKV3-11, IGHV1-24 및 IGKV1-12, IGHV6-1 및 IGKV3-11, IGHV4-39 및 IGKV1-5, 또는 IGHV3-23 및 IGLV3-19)을 이용한다. 일부 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 생식계열 유전자는 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 부분의 상응하는 중쇄 및 경쇄 서열과 각각 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. 특정 구체예에서, 상기 중쇄 및 경쇄 생식계열 유전자의 프레임워크 영역 서열은 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 부분의 상응하는 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역 서열과 각각 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은, 예를 들어, 0.2 nM 이하, 0.15 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.09 nM 이하, 0.08 nM 이하, 0.07 nM 이하, 0.06 nM 이하, 0.05 nM 이하, 또는 0.04 nM 이하의 EC50으로 인간 LAG-3에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은, 예를 들어, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.09 nM 이하, 0.08 nM 이하, 0.07 nM 이하, 0.06 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.04 nM 이하, 또는 0.03 nM 이하의 EC50으로 시노몰구스 LAG-3에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은, 예를 들어, 0.1 nM 이하의 EC50으로 인간 LAG-3에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은, 예를 들어, 0.3 nM 이하의 EC50으로 시노몰구스 LAG-3에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은, 예를 들어, 0.1 nM 이하의 EC50으로 인간 LAG-3에 결합하고, 예를 들어, 0.3 nM 이하의 EC50으로 시노몰구스 LAG-3에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기술된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 MHC 클래스 II(MHCII) 또는 LSECtin과 같은 리간드가 LAG-3에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 예를 들어, 20 μg/mL에서, 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 MHCII에 대한 LAG-3의 결합을 음성 대조군 항체의 존재 하에서의 결합과 비교하여 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 단백질은 MHCII에 대한 LAG-3의 결합을 음성 대조군과 비교하여 85% 넘게 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 단백질은 MHCII에 대한 LAG-3의 결합을 음성 대조군과 비교하여 약 35% 내지 85%만큼 감소시킬 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 LAG-3와 MHC 클래스 II, 예를 들어, Jurkat 세포에서 발현된 인간 LAG-3와 Raji 세포에서 발현된 인간 MHC 클래스 II의 결합을 차단할 수 있다(예를 들어, 0.1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 30 μg/mL, 40 μg/mL, 또는 50 μg/mL의 농도에서).

일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 5.0 x 10^-8 이하, 4.0 x 10^-8 이하, 3.0 x 10^-8 이하, 2.0 x 10^-8 이하, 1.0 x 10^-8 이하, 9.0 x 10^-9 이하, 8.0 x 10^-9 이하, 7.0 x 10^-9 이하, 6.0 x 10^-9 이하, 5.0 x 10^-9 이하, 4.0 x 10^-9 이하, 3.0 x 10^-9 이하, 2.0 x 10^-9 이하, 또는 1.0 x 10^-9 이하의 K_D로 인간 LAG-3에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 1.5 x 10^-7 이하, 1.0 x 10^-7 이하, 9.0 x 10^-8 이하, 8.0 x 10^-8 이하, 7.0 x 10^-8 이하, 6.0 x 10^-8 이하, 5.0 x 10^-8 이하, 4.0 x 10^-8 이하, 3.0 x 10^-8 이하, 2.0 x 10^-8 이하, 또는 1.0 x 10^-8 이하의 K_D로 시노몰구스 LAG-3에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 5.0 x 10^-8 이하, 4.5 x 10^-8 이하, 4.0 x 10^-8 이하, 3.5 x 10^-8 이하, 또는 3.0 x 10^-8 이하의 K_D로 마우스 LAG-3에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은, 예를 들어, SEB-자극된 PBMC로부터 IL-2 생산을 자극할 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은, 예를 들어, 인간 T 세포주(예를 들어, LAG-3를 과발현시키는 인간 T 세포주)에서 LAG-3의 세포 및/또는 가용성 수준을 감소시킬 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 생체내에서 종양 성장 퇴행을 유도하고/거나 종양 성장을 지연시킬 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 항체 25F7-Lag3.5와 상이한 인간 LAG-3의 에피토프에 결합할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 투여는 T 세포를 활성화하여, 강화된 항-종양 활성을 발생시킬 수 있다.

본원에 기재된 방법에 의해 수득된 항-LAG-3 항체의 부류는 또 다른 부류 또는 아부류로 변경되거나 전환될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, VL 또는 VH를 인코딩하는 핵산 분자는 CL 또는 CH를 각각 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않도록 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 분리된다. VL 또는 VH를 인코딩하는 핵산 분자는 이후에 상이한 부류의 면역글로불린 분자로부터의 CL 또는 CH를 각각 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 결합된다. 이는 상술된 바와 같이, CL 또는 CH 사슬을 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 본래 IgM이었던 항-LAG-3 항체는 IgG로 부류가 전환될 수 있다. 또한, 부류 전환(class switching)은 하나의 IgG 아부류를 다른 IgG 아부류로, 예를 들어, IgG₁을 IgG₂로 전환시키기 위해 사용될 수 있다. κ 경쇄 불변 영역은, 예를 들어, λ 경쇄 불변 영역으로 변경될 수 있다. 요망되는 Ig 아이소형을 갖는 본 발명의 항체를 생산하기 위한 바람직한 방법은 항-LAG-3 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자 및 항-LAG-3 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자를 분리시키는 단계, 중쇄의 가변 도메인을 수득하는 단계, 중쇄의 가변 도메인을 요망되는 아이소형의 중쇄의 불변 영역과 라이게이션시키는 단계, 경쇄 및 라이게이션된 중쇄를 세포에서 발현시키는 단계, 및 요망되는 아이소형을 갖는 항-LAG-3 항체를 수집하는 단계를 포함한다.

본 발명의 항-LAG-3 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자일 수 있으나, 전형적으로 IgG 아이소형, 예를 들어, IgG 아부류 IgG₁, IgG₂a 또는 IgG₂b, IgG₃ 또는 IgG₄이다. 한 구체예에서, 항체는 IgG₁이다. 다른 구체예에서, 항체는 IgG₂이다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 LAG-3 에피토프에 결합하는 본 발명의 IgG₁ 항체는 암 치료 또는 면역자극 효과를 달성하기 위해 LAG-3 기능을 조절(예를 들어, 억제)하는데 양호한 활성을 제공한다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 Fc 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 다수의 상이한 Fc 돌연변이가 공지되어 있고, 이러한 돌연변이는 변경된 이펙터 기능을 제공한다. 예를 들어, 많은 경우에, 예를 들어, 리간드/수용체 상호작용이 요망되지 않거나 항체-약물 컨쥬게이트의 경우에, 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직할 것이다.

한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 이펙터 기능을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 Fc 영역에 포함한다. 이펙터 기능을 감소시키기 위해 돌연변이되는 것이 바람직할 수 있는 Fc 영역 아미노산 위치는 위치 228, 233, 234 및 235 중 하나 이상을 포함하고, 이 때 아미노산 위치는 IMGT^® 넘버링 체계에 따라 넘버링된다.

한 구체예에서, 위치 234 및 235의 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘 모두는, 예를 들어, Leu에서 Ala로 돌연변이될 수 있다(L234A/L235A). 이러한 돌연변이는 IgG₁ 항체의 Fc 영역의 이펙터 기능을 감소시킨다. 추가로 또는 대안적으로, 위치 228의 아미노산 잔기는, 예를 들어, Pro으로 돌연변이될 수 있다. 일부 구체예에서, 위치 233의 아미노산 잔기는, 예를 들어, Pro으로 돌연변이될 수 있고/거나, 위치 234의 아미노산 잔기는, 예를 들어, Val으로 돌연변이될 수 있고/거나, 위치 235의 아미노산 잔기는, 예를 들어, Ala으로 돌연변이될 수 있다. 아미노산 위치는 IMGT^® 넘버링 체계에 따라 넘버링된다.

일부 구체예에서, 항체가 IgG₄ 아부류인 경우, 이것은 돌연변이 S228P를 포함할 수 있고, 즉, 위치 228에 프롤린을 가질 수 있으며, 이 때 아미노산 위치는 IMGT^® 넘버링 체계에 따라 넘버링된다. 이 돌연변이는 요망되지 않는 Fab 아암(arm) 교환을 감소시키는 것으로 알려져 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된, 보다 큰 면역접합 분자의 일부일 수 있다. 그러한 면역접합 분자의 예는 테트라머 scFv 분자를 제조하기 위해 스트렙타비딘 코어 영역의 사용[Kipriyanov et al., Human antibody and Hybridomas 6:93-101 (1995)] 및 이가 및 바이오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위해 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용[[Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)]을 포함한다. 다른 예는 항체로부터의 하나 이상의 CDR이 관심 항원에 특이적으로 결합하는 면역접합체(immunoadhesin)를 제조하기 위해 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 도입되는 경우를 포함한다. 그러한 구체예에서, CDR(들)은 보다 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 도입될 수 있거나, 다른 폴리펩티드 사슬에 공유 결합될 수 있거나, 비공유적으로 도입될 수 있다.

다른 구체예에서, 또 다른 폴리펩티드에 결합된 본 발명의 항-LAG-3 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 면역접합체가 제조될 수 있다. 특정 구체예에서, 단지 항-LAG-3 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 결합된다. 특정 구체예에서, 항-LAG-3 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드에 결합되며, 항-LAG-3 항체의 VL 도메인은 항원-결합 부위를 형성시키기 위해 VH 도메인 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있는 방식으로 제1 폴리펩티드와 회합하는 제2 폴리펩티드에 결합된다. 다른 바람직한 구체예에서, VH 도메인은 VH 도메인 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다(예를 들어, 단일쇄 항체). VH-링커-VL 항체는 이후에 관심 폴리펩티드에 결합된다. 또한, 2개(또는 그 초과)의 단일쇄 항체가 서로 결합된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이는 단일 폴리펩티드 사슬 상에 이가 또는 다가 항체를 형성시키고자 하는 경우에, 또는 이중특이적 항체를 생성시키고자 하는 경우에 유용하다.

단일쇄 항체(scFv)를 형성시키기 위해, VH- 및 VL-인코딩 DNA 단편은 VH 서열 및 VL 서열이 가요성 링커(flexible linker)에 의해 연결된 VL 도메인 및 VH 도메인을 지닌 인접한 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있도록, 가요성 링커를 인코딩하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3(SEQ ID NO: 74)을 인코딩하는 다른 단편에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 문헌[Bird et al., Science 242:423 426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883 (1988); and McCafferty et al., Nature 348:552 554 (1990)] 참조. 단일쇄 항체는 단지 단일 VH 및 VL이 사용되는 경우에 일가; 2개의 VH 및 VL이 사용되는 경우에 이가; 또는 2개 초과의 VH 및 VL이 사용되는 경우에 다가일 수 있다. 예를 들어, 인간 LAG-3 및 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다.

다른 구체예에서, 다른 변형된 항체는 항-LAG-3 항체-인코딩 핵산 분자를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, "카파 바디(kappa body)"(Ill et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)), "미니바디(minibody)"(Martin et al., EMBO J. 13:5303-9 (1994)), "디아바디"(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)), 또는 "자누신(Janusin)"(Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) and Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992))은 본 명세서의 교시에 따라 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분은 다른 분자(예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질)로 유도체화되거나 여기에 결합될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 이의 부분은, LAG-3 결합이 유도체화 또는 표지화에 의해 악영향을 받지 않도록 유도체화된다. 이에 따라, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 본원에 기술된 완전한 형태 및 변형된 형태의 인간 항-LAG-3 항체 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 하나 이상의 다른 분자 실체, 예를 들어, 다른 항체(예를 들어, 이중특이적 항체 또는 디아바디), 검출제, 약학적 제제, 및/또는 다른 분자(예를 들어, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와 항체 또는 항체 부분의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 (화학적 커플링, 유전학적 융합, 비공유 회합 또는 다른 방법에 의해) 기능적으로 결합될 수 있다.

유도체화된 항체의 한 유형은 2개 이상의 항체(예를 들어, 이중특이적 항체를 생성시키기 위해 동일하거나 상이한 유형)를 가교시킴으로써 생산된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르)에 의해 분리된 2개의 별개의 반응성 기를 갖는 헤테로이작용성이거나 호모이작용성(예를 들어, 디석신이미딜 수베레이트)인 것을 포함한다. 그러한 링커는, 예를 들어, Pierce Chemical Company(Rockford, Il.)로부터 입수 가능하다.

항-LAG-3 항체는 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 탄수화물 기와 같은 화학적 기로 유도체화될 수 있다. 이러한 기들은 항체의 생물학적 특징을 개선시키기 위해, 예를 들어, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 유용할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 또한 표지될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "표지(label)" 또는 "표지된(labeled)"은 항체에 다른 분자의 도입을 지칭한다. 한 구체예에서, 표지는 검출 가능한 마커, 예를 들어, 방사선표지된 아미노산의 도입 또는 마킹된 아비딘(예를 들어, 광학적 방법 또는 비색법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 함유한 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 모이어티의 폴리펩티드에 대한 부착이다. 다른 구체예에서, 표지 또는 마커는 치료제, 예를 들어, 약물 컨쥬게이트 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 사용될 수 있다. 폴리펩티드용 표지의 예는 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소 표지(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼린 포스파타제), 화학발광 마커, 바이오티닐 기, 2차 리포터(secondary reporter)에 의해 인지되는 사전결정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 자성 제제(magnetic agent), 예를 들어, 가돌리늄 킬레이트, 독소, 예를 들어, 백일해 독소, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암(spacer arm)에 의해 부착된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 중성 형태(쯔비터 이온 형태를 포함함) 또는 양으로 또는 음으로-하전된 종으로서 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 약학적으로 허용되는 염을 형성하기 위해 반대이온과 복합체화될 수 있다.

용어 "약학적으로 허용되는 염"은 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 반대이온을 포함하는 복합체를 지칭하며, 여기서 반대이온은 약학적으로 허용되는 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된다.

이중특이적 결합 분자

추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-LAG-3 항체의 결합 특이성(예를 들어, 항원-결합 부분 포함), 및 또 다른 항-LAG-3 항체(예를 들어, 본원에 기재된 또 다른 항-LAG-3 항체) 또는 상이한 단백질, 예를 들어, 또 다른 면역 체크포인트 단백질, 암 항원, 또는 그 활성이 암과 같은 질병 상태를 매개하는 또 다른 세포 표면 분자를 표적화하는 항체의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 결합 분자를 제공한다. 그러한 이중특이적 결합 분자는 당해 분야에 공지되어 있고, 상이한 유형의 이중특이적 결합 분자의 예는 본원에서 달리 제공된다.

핵산 분자 및 벡터

본 발명은 또한 본원에 기술된 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자 및 서열을 제공한다. 일부 구체예에서, 상이한 핵산 분자는 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 인코딩한다. 다른 구체예에서, 동일한 핵산 분자는 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 인코딩한다.

뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 달리 기술하지 않는 한 이의 보체(complement)를 포함한다. 이에 따라, 특정 서열을 갖는 핵산에 대한 언급은 이의 상보적 서열을 갖는 이의 상보적 가닥을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 지칭되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 적어도 10개의 염기인 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 즉, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 의미한다. 상기 용어는 단일- 및 이중-가닥 형태를 포함한다.

본 발명은 또한 본원에 인용된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 17, 18, 21, 22, 25 및 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27 및 28로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 핵산 서열의 맥락에서 용어 "퍼센트 서열 동일성"은 최대 일치(correspondence)를 위해 정렬될 때 2개의 서열에서 동일한 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 대개 적어도 약 18개의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로, 적어도 약 24개의 뉴클레오티드, 통상적으로, 적어도 약 28개의 뉴클레오티드, 더욱 통상적으로, 적어도 약 32개의 뉴클레오티드, 및 바람직하게, 적어도 약 36개, 48개 이상의 뉴클레오티드의 스트레치(stretch) 이상일 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 당해 분야에 공지된 여러 상이한 알고리즘이 존재한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 FASTA, Gap 또는 Bestfit를 이용하여 비교될 수 있으며, 이는 Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG)(Madison, Wisconsin)의 프로그램이다. 예를 들어, 프로그램 FASTA2 및 FASTA3을 포함하는 FASTA는 조회 서열과 검색 서열 간의 최상의 중첩 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다(예를 들어, 문헌[Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998)] 참조; 본원에서 참조로서 포함됨]. 달리 명시하지 않는 한, 특정 프로그램 또는 알고리즘에 대한 기본 파라미터들이 사용된다. 예를 들어, 핵산 서열들 간의 퍼센트 서열 동일성은 이의 기본 파라미터(6의 단어 크기 및 스코어링 매트릭스를 위한 NOPAM 인자)를 갖는 FASTA를 이용하거나 GCG Version 6.1에 제공된 바와 같은 이의 기본 파라미터를 갖는 Gap을 이용하여 결정될 수 있으며, 이들은 본원에 참고로 포함된다.

한 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 17, 18, 21, 22, 25 및 26로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 특정 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 및 2, SEQ ID NO: 5 및 6, SEQ ID NO: 9 및 10, SEQ ID NO: 13 및 14, SEQ ID NO: 17 및 18, SEQ ID NO: 21 및 22, 또는 SEQ ID NO: 25 및 26의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 상기 구체예에서, 핵산 분자는 분리될 수 있다.

추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 사슬 중 하나를 발현시키기에 적합한 벡터를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 여기에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 구체예에서, 벡터는 플라스미드, 즉, 추가적인 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 DNA의 원형의 이중 가닥 조각이다. 일부 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가적인 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 구체예에서, 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시에 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이에 의해, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이것이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순하게, "발현 벡터")로서 지칭된다.

본 발명은 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 경쇄, 또는 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편, 및 이의 프로브를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자는 그러한 항체 또는 부분을 생산하는 임의의 공급원으로부터 분리될 수 있다. 다양한 구체예에서, 핵산 분자는 인간 LAG-3 항원으로 면역된 동물로부터 분리된 항-LAG-3 항체를 발현시키는 B 세포로부터, 또는 그러한 B 세포로부터 생산된 무한증식 세포로부터 분리된다. 항체를 인코딩하는 핵산을 분리시키는 방법은 당해 분야에서 널리 공지되어 있다. mRNA는 항체 유전자의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 cDNA 클로닝에서 사용하기 위한 cDNA를 생산하기 위해 분리되고 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 분리되기보다는 합성될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 임의의 공급원으로부터의 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임으로 결합된 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분으로부터의 VH 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 핵산 분자는 임의의 공급원으로부터의 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임으로 결합된 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분으로부터의 VL 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 추가 양태에서, 중쇄(VH) 및/또는 경쇄(VL)의 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는 전장 항체 유전자로 "전환"될 수 있다. 한 구체예에서, VH 도메인 또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는, VH 세그먼트가 벡터 내에서 CH 세그먼트(들)에 작동 가능하게 결합되고/거나 VL 세그먼트가 벡터 내에서 CL 세그먼트에 작동 가능하게 결합되도록, 각각 중쇄 불변(CH) 또는 경쇄 불변(CL) 영역을 이미 인코딩하는 발현 벡터로의 삽입에 의해 전장 항체 유전자로 전환된다. 다른 구체예에서, VH 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 CH 및/또는 CL 영역을 인코딩하는 핵산 분자에 VH 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자를 연결시킴으로써, 예를 들어, 라이게이션시킴으로써 전장 항체 유전자로 전환된다. 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자는 이후에 이들이 도입된 세포로부터 발현될 수 있고, 항-LAG-3 항체가 분리될 수 있다.

핵산 분자는 대량의 항-LAG-3 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 핵산 분자는 또한 본원에 기술된 바와 같은 키메라 항체, 이중특이적 항체, 단일쇄 항체, 면역접합체, 디아바디, 돌연변이된 항체 및 항체 유도체를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 특이적 항체 서열을 위한 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용된다. 예를 들어, 핵산은 그 중에서도 항-LAG-3 항체의 가변 도메인을 인코딩하는 추가적인 핵산 분자를 분리시키기 위해 사용될 수 있는 DNA의 영역을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로서 또는 진단 방법에서의 프로브로서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 관심 항체의 중쇄 및 경쇄의 고도의 가변 도메인으로부터 기인한 것이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 CDR들 중 하나 이상의 전부 또는 일부를 인코딩한다.

다른 구체예에서, 핵산 분자 및 벡터는 돌연변이된 항-LAG-3 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 항체의 결합 성질을 변경시키기 위해, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 항-LAG-3 항체의 K_D를 증가시키거나 감소시키기 위해, k_off를 증가시키거나 감소시키기 위해, 또는 항체의 결합 특이성을 변경시키기 위해 CDR들 중 하나 이상에서 만들어질 수 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 본 발명의 모노클로날 항체에서의 생식계열과 비교하여 변경되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 만들어진다. 돌연변이는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역, 또는 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 돌연변이는 가변 도메인에서 만들어진다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 생식계열과 비교하여 변경되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 만들어진다.

다른 구체예에서, 프레임워크 영역(들)은 생성된 프레임워크 영역(들)이 상응하는 생식계열 유전자의 아미노산 서열을 갖도록 돌연변이된다. 돌연변이는 항-LAG-3 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 00/09560호 참조. 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이는 또한 항체의 면역원성을 변경시키기 위해 및/또는 다른 분자에 대한 공유 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하기 위해 만들어질 수 있다. 본 발명에 따르면, 단일 항체는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역들 중 임의의 하나 이상 또는 불변 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 전사 및 번역 조절 서열과 같은 필수적인 발현 조절 서열에 유전자가 작동 가능하게 결합되도록 발현 벡터에, 상기 기술된 바와 같이 얻어진 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA를 삽입함으로써 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 식물 바이러스, 예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래된 에피솜 등을 포함한다. 항체 코딩 서열은 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 코딩 서열의 전사 및 번역을 조절하는 이의 의도된 기능을 제공하도록 벡터에 라이게이션될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 양립 가능하도록 선택될 수 있다. 항체 경쇄 코딩 서열 및 항체 중쇄 코딩 서열은 별도의 벡터에 삽입될 수 있고, 동일하거나 상이한 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 결합될 수 있다. 한 구체예에서, 둘 모두의 코딩 서열은 동일한 발현 벡터에 삽입되고 동일한 발현 조절 서열(예를 들어, 공통 프로모터), 별도의 동일한 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터), 또는 상이한 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 결합될 수 있다. 항체 코딩 서열은 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 블런트 단부 라이게이션(blunt end ligation))에 의해 발현 벡터에 삽입될 수 있다.

편리한 벡터는, 상술된 바와 같이, 임의의 VH 또는 VL 서열이 용이하게 삽입되고 발현되도록 공학처리된 적절한 제한 부위를 갖는, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 인코딩하는 벡터이다. 그러한 벡터의 HC- 및 LC-인코딩 유전자는 관련 mRNA를 안정화시킴으로써 전체 항체 단백질 수율을 향상시킬 인트론 서열을 함유할 수 있다. 인트론 서열은 스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터 부위의 측면에 있으며, RNA 스플라이싱이 발생할 곳을 결정한다. 인트론 서열의 위치는 항체 사슬의 가변 또는 불변 영역에 있거나, 다중 인트론이 사용되는 경우 가변 및 불변 영역 둘 모두에 있을 수 있다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 다운스트림의 고유 염색체 부위에서 일어날 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 인코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 면역글로불린 사슬의 아미노 말단에 인-프레임으로 결합되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 사슬 유전자에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 지닐 수 있다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 변형되는 숙주 세포의 선택, 요망되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예를 들어, 레트로바이러스 LTR, 시토메갈로바이러스(CMV)(예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40(SV40)(예를 들어, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter; AdMLP))로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서, 폴리오마(polyoma) 및 강한 포유동물 프로모터, 예를 들어, 고유 면역글로불린 및 액틴 프로모터를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 이의 서열의 추가 설명을 위하여, 예를 들어, 미국특허 제5,168,062호, 제4,510,245호 및 제4,968,615호가 참조된다. 프로모터 및 벡터의 설명을 포함하는 식물에서 항체를 발현시키는 방법 뿐만 아니라 식물의 형질전환이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국특허 6,517,529호 참조. 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예를 들어, 효모 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 방법이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예를 들어, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 선택 가능한 마커 유전자를 지닐 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예를 들어, 미국특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 통상적으로, 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에 약물, 예를 들어, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 예를 들어, 선택 가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 갖는 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위한), neo 유전자(G418 선택을 위한), 및 글루타메이트 합성효소 유전자를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "발현 조절 서열"은 라이게이션되는 코딩 서열의 발현 및 처리를 달성하는데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 처리 신호, 예를 들어, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 요망될 때, 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 그러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하며, 원핵생물에서, 그러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하며; 진핵생물에서, 일반적으로 그러한 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 발현 및 처리를 위해 필수적으로 존재하는 모든 성분들을 최소한으로 포함하도록 의도되고, 또한 존재하는 것이 유리한 추가적인 성분, 예를 들어, 리더 서열(leader sequence) 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.

숙주 세포 및 항체 및 항체 조성물을 생산하는 방법

본 발명의 추가적인 양태는 본 발명의 항체 조성물 및 항체 및 이의 항원-결합 부분을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태의 한 구체예는 항체를 발현시킬 수 있는 재조합 숙주 세포를 제공하고, 항체의 발현에 적합한 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양시키고, 생성된 항체를 분리시키는 것을 포함하는, 본원에서 정의된 바와 같은 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 그러한 재조합 숙주 세포에서 상기 발현에 의해 생산된 항체는 본원에서 "재조합 항체"로서 지칭된다. 본 발명은 또한 그러한 숙주 세포의 자손 세포, 및 이에 의해 생산된 항체를 제공한다.

본원에서 사용되는 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 본 발명은, 예를 들어, 상기 기술된 본 발명에 따른 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 둘 모두를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포 뿐만 아니라, 그러한 세포의 자손을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향 중 어느 하나로 인해 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 그러한 자손은 실제로, 부모 세포와 일치하지 않지만, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.

항-LAG-3 항체를 인코딩하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유동물, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 트랜스펙션(transfection)을 위해 사용될 수 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의한 것일 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에 도입하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 덱스트란-매개 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개 트랜스펙션, 원형질 융합, 전기천공, 리포솜 중에 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 핵에 DNA의 직접 미세주입을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호, 및 제4,959,455호 참조. 식물 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 아그로박테리윰-매개 형질전환, 유전자총법 형질전환, 직접 주입, 전기천공 및 바이러스 형질전환을 포함한다. 박테리아 및 효모 세포를 형질전환시키는 방법이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

발현을 위한 숙주로서 입수 가능한 포유동물 세포주는 당해 분야에서 널리 공지되어 있고, 미국 표준 균주 배양 수집소(American Type Culture Collection; ATCC)로부터 입수 가능한 다수의 무한증식 세포주를 포함한다. 이들은 다른 것들 중에서, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, 293 Freestyle 세포(Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 그린 몽키 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포, 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지를 결정함에 의해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주에는 곤충 세포주, 예를 들어, Sf9 또는 Sf21 세포가 있다. 항체 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 항체는 숙주 세포를, 숙주 세포에서 항체의 발현을 가능하게 하거나 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지에 항체의 분비를 가능하게 하는데 충분한 시간 동안 배양시킴으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 식물 숙주 세포는 예를 들어, 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 좀개구리밥(duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등을 포함한다. 박테리아 숙주 세포는 이.콜라이(E.coli) 및 스트렙토마이세스 종을 포함한다. 효모 숙주 세포는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.

또한, 생산 세포주로부터의 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 발현은 다수의 공지된 기술을 이용하여 향상될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 특정 조건 하에 발현을 향상시키기 위한 일반적인 접근법이다. GS 시스템은 EP 특허 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 및 0 338 841와 관련하여 전부 또는 일부 논의되어 있다.

상이한 세포주에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현된 항체는 서로 상이한 당화 패턴을 가질 가능성이 있다. 그러나, 본원에 제공된 핵산 분자에 의해 인코딩되거나 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 당화 상태와 무관하게, 그리고, 보다 일반적으로, 번역후 변형(들)의 존재 또는 부재와는 무관하게, 본 발명의 일부이다.

약학적 조성물

본 발명의 다른 양태는 활성 성분으로서(또는 단독 활성 성분으로서) 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 결합 분자, 또는 항체 조성물을 포함하는 약학적 조성물이다. 약학적 조성물은 본원에 기재된 임의의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 결합 분자, 또는 항체 조성물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 LAG-3-관련 장애 및/또는 암의 개선, 예방 및/또는 치료를 위해 의도된다. 본원에서 사용되는 LAG-3-관련 또는 -매개 장애는 LAG-3 활성의 조절에 의해 그 진행이 개선되거나 느려지는 장애, 질병 또는 질환을 지칭한다. 일부 구체예에서, 조성물은 면역 시스템의 활성화를 위해 의도된다. 특정 구체예에서, 조성물은 피부, 폐, 장, 결장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장과 같은 조직에서 기원한 암의 개선, 예방, 및/또는 치료를 위해 의도된다. 특정 구체예에서, 암은 섬유육종, 폐 암종, 또는 흑색종이다. 특정 구체예에서, 암은 아교모세포종, 신경아교육종, 또는 결장직장암이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 건선의 치료를 위해 의도된다.

일반적으로, 본 발명의 항체, 항원-결합 부분, 및 이중특이적 결합 분자는, 예를 들어, 하기 기술된 바와 같이, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제(들)와 회합하여 제형으로서 투여하기에 적합하다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항-LAG-3 항체, 결합 부분, 또는 이중특이적 결합 분자, 예를 들어, 1 또는 2개의 항-LAG-3 항체, 결합 부분, 또는 이중특이적 결합 분자를 포함할 것이다. 한 구체예에서, 조성물은 본 발명의 단일 항-LAG-3 항체 또는 이의 결합 부분을 포함한다.

다른 구체예에서, 약학적 조성물은 적어도 하나의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 예를 들어, 하나의 항-LAG-3 항체 또는 부분, 및 하나 이상의 관련 세포 표면 수용체, 예를 들어, 하나 이상의 암-관련 수용체를 표적화하는 하나 이상의 추가적인 항체를 포함할 수 있다.

용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 임의의 성분을 기술하기 위해 본원에서 사용된다. 부형제(들)의 선택은 특정 투여 모드, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 투여 형태의 특성과 같은 인자에 상당히 크게 좌우될 것이다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 부형제"는 생리학적으로 양립 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용되는 부형제의 일부 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이들의 조합물이 있다. 많은 경우에, 조성물에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 또는 소듐 클로라이드를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용되는 물질의 추가적인 예로는 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 에멀젼화제, 보존제 또는 완충액이 있으며, 이는 항체의 저장 수명 또는 효능을 향상시킨다.

본 발명의 약학적 조성물 및 이의 제조 방법은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 그러한 조성물 및 이의 제조 방법은 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)]에서 확인될 수 있다. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP(우수 제조관리 기준(good manufacturing practices)) 조건 하에 제조된다.

본 발명의 약학적 조성물은 벌크로, 단일 단위 용량으로서, 또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 "단위 용량"은 사전 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에 투여되는 활성 성분의 투여량과 같거나, 그러한 투여량의 편리한 분획, 예를 들어, 이를 테면, 그러한 투여량의 1/2 또는 1/3이다.

당해 분야에서 허용되는 펩티드, 단백질 또는 항체를 투여하기 위한 임의의 방법은 본 발명의 항체 및 항원-결합 부분에 대해 적합하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상적으로 비경구 투여를 위해 적합하다. 본원에서 사용되는 약학적 조성물의 "비경구 투여"는 대상체의 조직의 물리적 브리칭(physical breaching) 및 조직에 브리치(breach)를 통한 약학적 조성물의 투여에 의해 특징되는 임의의 투여 경로를 포함하며, 이에 따라, 일반적으로 혈류에, 근육에 또는 내부 장기에 직접 투여를 발생시킨다. 이에 따라, 비경구 투여는 조성물의 주사에 의해, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용에 의해, 조직-침투 비-외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약학적 조성물의 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 심실내, 요도내, 두개내, 종양내, 및 활막내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기술을 비제한적으로 포함하는 것으로 고려된다. 국소 관류법이 또한 고려된다. 특정 구체예는 정맥내 및 피하 경로를 포함한다.

비경구 투여를 위해 적합한 약학적 조성물의 제형은 통상적으로 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 멸균수 또는 멸균 등장성 염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 그러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적절한 형태로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 주사용 제형은 보존제를 함유하는 앰풀 또는 다중-용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 비제한저긍로 포함하는 하나 이상의 추가적인 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 한 구체예에서, 활성 성분은 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공되고, 이는 재구성된 조성물을 비경구 투여하기 전에 적절한 비히클(예를 들어, 발열원이 없는 멸균수)로 재구성된다. 비경구 제형은 또한 부형제, 예를 들어, 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게, 3 내지 9의 pH까지)를 함유할 수 있는 수용액을 포함하지만, 일부 적용을 위하여, 이들은 더욱 적합하게 멸균 비-수용액으로서 또는 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균, 무발열원 수와 함께 사용되는 건조된 형태로서 제형화될 수 있다. 예시적인 비경구 투여 형태는 멸균 수용액, 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 수용액 중의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 그러한 투여 형태는 요망되는 경우에, 적합하게 완충될 수 있다. 유용할 수 있는 다른 비경구적으로-투여 가능한 제형은 미정질 형태 또는 리포솜 제조물에 활성 성분을 포함하는 것들을 포함한다. 비경구 투여를 위한 제형은 즉방출 및/또는 변형된 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 변형된 방출 제형은 지연된-, 지속된-, 펄스화된-, 조절된-, 표적화된 및 프로그램된 방출을 포함한다.

예를 들어, 한 양태에서, 멸균 주사 가능한 용액은 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이의 조합과 함께, 적절한 용매 중에 요구되는 양의 항-LAG-3 항체, 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 결합 분자, 또는 항체 조성물을 혼입한 다음, 필요한 경우에, 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이의 이전의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써, 및/또는 변형된-방출 코팅제(예를 들어, 서방출 코팅제)를 사용함으로써 초래될 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 통상적으로 건조 분말 흡입기로부터의 건조 분말 형태로(단독으로, 혼합물로서, 또는 혼합된 성분 입자로서, 예를 들어, 적합한 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 입자로서), 적합한 추진제의 사용 유무와 함께, 가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기(바람직하게는 미세한 미스트를 형성시키기 위한 전기유체역학을 이용한 분무기) 또는 네불라이저로부터의 에어로졸 스프레이로서, 또는 점비액으로서, 비강내 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.

가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기, 또는 네불라이저는 일반적으로, 예를 들어, 활성물의 방출물을 분산, 가용화 또는 팽창시키기 위한 적합한 제제, 용매로서 추진제(들)를 포함하는 본 발명의 항체의 용액 또는 현탁액을 함유한다.

건조 분말 또는 현탁액 제형에서 사용하기 전에, 약물 제품은 일반적으로 흡입에 의한 전달을 위해 적합한 크기(통상적으로, 5 마이크론 미만)로 미세화된다. 이는 임의의 적절한 분쇄 방법, 예를 들어, 나선형 제트 밀링, 유체층 제트 밀링, 나노입자를 형성시키기 위한 초임계 유체 가공, 고압 균질화 또는 스프레이 건조에 의해 달성될 수 있다.

흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐, 블리스터(blister), 및 카트리지는 본 발명의 화합물, 적합한 분말 베이스 및 성능 개질제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.

미세한 미스트를 형성시키기 위해 전기유체역학을 이용하는 분무기에서 사용하기 위한 적합한 용액 제형은 1회 구동(actuation) 당 적합한 용량의 본 발명의 항체를 함유할 수 있으며, 구동 부피는 예를 들어, 1 μl 내지 100 μl로 다양할 수 있다.

흡입/비강내 투여를 위한 제형은 즉방출 및/또는 변형된 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 변형된 방출 제형은 지연된-, 지속된-, 펄스화된-, 조절된-, 표적화된 및 프로그램된 방출을 포함한다.

건조 분말 흡입제 및 에어로졸의 경우에, 투여 유닛은 계량된 양을 전달하는 밸브에 의해 결정된다. 본 발명에 따른 유닛은 통상적으로 계량된 용량 또는 "퍼프(puff)"의 본 발명의 항체를 투여하도록 배치된다. 전체 일일 용량은 통상적으로 단일 용량으로, 또는 보다 일반적으로 분할된 용량으로서 종일 투여될 것이다.

본 발명의 항체 및 항체 부분은 또한 경구 경로 투여를 위해 제형화될 수 있다. 경구 투여는, 화합물이 위장관으로 진입하도록, 연하(swallowing)를 수반할 수 있고/거나, 협측, 설측 또는 설하 투여는 화합물이 입으로부터 혈류로 직접적으로 진입하게 한다.

경구 투여를 위해 적합한 제형은 고체, 반-고체, 및 액체 시스템, 예를 들어, 정제; 다중- 또는 나노-미립자, 액체 또는 분말을 함유한 연질 또는 경질 캡슐; 로젠지(액체 충전을 포함함); 츄(chew); 겔; 속분산 투여 형태; 필름; 오불(ovule); 스프레이; 및 협측/점막접착 패치를 포함한다.

액체 제형은 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 그러한 제형은 (예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스로부터 제조된) 연질 또는 경질 캡슐 중의 충전제로서 사용될 수 있고, 통상적으로, 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸셀룰로스, 또는 적합한 오일, 및 하나 이상의 에멀젼화제 및/또는 현탁제를 포함한다. 액체 제형은 또한, 예를 들어, 사세(sachet)로부터 고체의 재구성에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 항체 및 조성물의 치료 용도

한 양태에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항-LAG-3 조성물, 및 이중특이적 결합 분자는 면역 시스템의 향상 또는 활성화가 필요한 인간에서 면역 시스템을 향상시키거나 활성화시키기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 환자는 면역-억제된 환자이다. 예를 들어, 의사는 본 발명의 항-LAG-3 항체를 단독으로 또는 다른 치료제와 함께(순차적으로 또는 동시에) 투여함으로써 환자 고유의 면역 시스템의 항암 활성을 부스팅할 수 있다. LAG-3 항체는 면역 세포에서 LAG-3의 활성을 조절하여, 항암 면역을 강화시킨다.

특정 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 암, 예를 들어, 피부, 폐, 장, 결장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장과 같은 조직에서 기원한 암 및 LAG-3 활성에 좌우되고/되거나 환자가 LAG-3 리간드(예를 들어, MHCII, LSECtin, 또는 둘 모두)를 발현하거나 과발현하는 임의의 암 또는 다른 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체, 항원-결합 부분, 이중특이적 결합 분자 및/또는 항체 조성물에 의해 치료되는 암은, 예를 들어, 흑색종(예를 들어, 진행 또는 전이성 흑색종), 비소세포폐암, 두경부 편평 세포 암, 신세포 암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 교모세포종, 신경아교종, 편평 세포 폐암, 소세포폐암, 간세포 암종, 방광암, 상부요로암, 식도암, 위식도 접합부 암, 위암, 간암, 결장암, 결장직장 암종, 다발성 골수종, 육종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 비인두암, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 소형 림프성 림프종, 난소암, 위장암, 원발성 복막암, 자궁관암, 요로상피암, HTLV-관련 T-세포 백혈병/림프종, 전립선암, 비뇨생식암, 수막종, 부신겉질암, 신경아교육종, 섬유육종, 신장암, 유방암, 췌장암, 자궁내막암, 피부 기저 세포암, 충수암, 담관암, 침샘암, 진행 메르켈 세포 암, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포 림프종, 중피종, 및 고형 종양을 포함할 수 있다. 암은, 예를 들어, 초기, 중기, 후기, 또는 전이성 단계에 있을 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체, 항원-결합 부분, 조성물, 및/또는 이중특이적 결합 분자에 의해 치료되는 암은, 예를 들어, 혈액 악성종양, 아교모세포종(예를 들어, 재발성 아교모세포종), 신경아교육종, 비소세포폐암(예를 들어, 진행성 비소세포폐암), 결장직장암, 및 고형 종양을 포함할 수 있다.

한 양태에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 건선, 전신홍반루푸스, MLS(경화증), 크론병, 당뇨병, 및/또는 궤양대장염과 같은 면역-매개 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물 또는 이중특이적 결합 분자는, 예를 들어, 병원체가 숙주 면역 반응을 억제하는 바이러스 및/또는 기생충 감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 병원체는, 예를 들어, HIV, 간염(A, B 또는 C), 인간 유두종 바이러스(HPV), 림프구 맥락수막염 바이러스(LCMV), 아데노바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코르노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, 인간 T-세포 림프구 친화성 바이러스(HTLV), 뎅기 바이러스, 물렁종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, 존 커닝햄(JC) 바이러스, 아르보바이러스 뇌염 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인플루엔자, 헤르페스, 편모충, 말라리아, 리슈만편모충, 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 또는 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)일 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 면역약화되거나 면역약화의 위험이 있는(예를 들어, 화학요법 또는 방사선 요법으로 인해) 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 항원-특이적 T 세포의 생체외 활성화 및 확대를 위해 사용될 수 있다.

"치료하다," "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 이의 수반되는 증상들 중 적어도 하나를 완화시키거나 제거하는 방법을 지칭한다. 본원에서 사용되는 질병, 장애 또는 질환을 "완화시키는" 것은 질병, 장애 또는 질환의 증상의 중증도 및/또는 발생 횟수를 감소시키는 것을 의미한다. 또한, 본원에서 "치료"에 대한 언급은 치유, 완화 및 예방 치료에 대한 언급을 포함한다.

"치료적 유효량"은 치료되는 장애의 증상들 중 하나 이상을 어느 정도까지 완화시킬 투여되는 치료제의 양을 지칭한다. 항암 치료제의 치료적 유효량은, 예를 들어, 종양 수축, 생존 증가, 암 세포의 제거, 질병 진행 감소, 전이의 역전, 또는 건강관리 전문가가 원하는 다른 임상적 종말점을 발생시킬 수 있다.

본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 약물 또는 항체(또는 이의 임의의 조합으로서)와 함께 투여될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 약학적 조성물, 방법 및 용도는 또한, 하기에 상세히 기술되는 바와 같이, 다른 활성제와의 조합(동시-투여)의 구체예를 포함한다.

하나 이상의 다른 치료제와 함께 본 발명의 항-LAG-3 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 및 이중특이적 결합 분자를 지칭하는 본원에서 사용되는 용어 "동시-투여", "동시-투여된" 및 "~와 조합하여"는 하기 기술된 것을 의미하는 것으로 의도되고, 이를 지칭하며 이를 포함한다:

a) 성분들이 환자에게 실질적으로 동시에 상기 성분들을 방출시키는 단일 투여 형태로 함께 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체/항원-결합 부분/항체 조성물/이중특이적 결합 분자 및 치료제(들)의 조합물의 동시 투여,

b) 성분들이 환자에 의해 실질적으로 동시에 취해지는 별도의 투여 형태로 서로 분리하여 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체/항원-결합 부분/항체 조성물/이중특이적 결합 분자 및 치료제(들)의 조합물의 실질적인 동시 투여, 여기서 상기 성분들은 상기 환자에게 실질적으로 동시에 방출됨,

c) 성분들이 환자에 의해 각 투여 간에 상당한 시간 간격을 갖는 연속적 시간에 취해지는 별도의 투여 형태로 서로 분리하여 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체/항원-결합 부분/항체 조성물/이중특이적 결합 분자 및 치료제(들)의 조합물의 순차적인 투여, 여기서 상기 성분들은 상기 환자에게 실질적으로 상이한 시간에 방출됨; 및

d) 성분이 조절된 방식으로 상기 성분들을 방출하는 단일 투여 형태로 함께 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체/항원-결합 부분/항체 조성물/이중특이적 결합 분자 및 치료제(들)의 조합물의 순차적인 투여, 이 때 이들은 상기 환자에게 동일한 시간 및/또는 상이한 시간에 동시에, 순차적으로, 및/또는 중첩하여 방출되며, 여기서 각 부분은 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있음.

본 발명의 항-LAG-3 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 추가의 치료적 처치 없이, 즉, 단독 요법(단일요법)으로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항-LAG-3 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자로의 치료는 적어도 하나의 추가적인 치료적 처치(조합 요법), 예를 들어, 다른 면역자극제, 항암제, 항바이러스제, 또는 백신(예를 들어, 종양 백신)을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 암의 치료를 위한 다른 약제/약물과 동시-투여되거나 함께 제형화될 수 있다. 추가적인 치료학적 치료는, 예를 들어, 화학요법제, 항신생물제, 또는 항혈관형성제, 상이한 항암 항체, 및/또는 방사선 요법을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자를 암세포의 말기 분화를 유도하는 것으로 알려진 제제와 조합함으로써, 효과가 추가로 개선될 수 있다. 그러한 화합물은, 예를 들어, 레티노산, 트랜스-레티노산, 시스-레티노산, 페닐부티레이트, 신경 성장 인자, 디메틸 설폭사이드, 활성 형태 비타민 D3, 퍼옥시좀 증식체-활성화된 수용체 감마, 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트, 헥사메틸렌-비스-아세트아미드, 형질전환 성장 인자-베타, 부티르산, 환형 AMP 및 베스나리논으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 화합물은 레티노산, 페닐부티레이트, 모든-트랜스-레티노산, 및 활성 형태 비타민 D로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자 및 적어도 하나의 다른 제제(예를 들어, 화학요법제, 항신생물제, 또는 항혈관형성제)를 포함하는 약학적 물품은 암 요법에서 동시적, 분리된 또는 연속적인 투여를 위한 조합 치료로서 사용될 수 있다. 다른 제제는 고려되는 특정 암의 치료를 위해 적합한 임의의 제제, 예를 들어, 알킬화제, 예를 들어, 백금 유도체, 예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴 및/또는 옥살리플라틴; 식물 알코이드, 예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 및/또는 이리노테칸; 항종양 항생제, 예를 들어, 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 닥티노마이신, 블레오마이신, 악티노마이신, 루테오마이신, 및/또는 미토마이신; 토포아이소머라제 억제제, 예를 들어, 토포테칸; 및/또는 항대사산물, 예를 들어, 플루오로우라실 및/또는 다른 플루오로피리미딘으로 구성된 군으로부터 선택된 제제일 수 있다. 일부 구체예에서, 다른 제제는 다카르바진(dacarbazine) 또는 겜시타빈(gemcitabine)이다.

본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 또한 백신, 사이토카인, 효소 억제제, 면역자극 화합물, 및 T 세포 요법과 같은 다른 항암 요법과 함께 사용될 수 있다. 백신의 경우, 이것은, 예를 들어, 치료되는 암과 관련된 하나 이상의 항원을 함유하는 단백질, 펩티드 또는 DNA 백신, 또는 항원과 함께 수지상 세포를 포함하는 백신일 수 있다. 적합한 사이토카인은, 예를 들어, IL-2, IFN-감마 및 GM-CSF를 포함한다. 항암 활성을 갖는 효소 억제제 유형의 예는 인돌아민-2,3-디옥시게나제(IDO) 억제제, 예를 들어 1-메틸-D-트립토판(1-D-MT)이다. 입양 T 세포 요법은 종양을 인지하고 공격하기 위해 환자 자신의 T 세포를 확장하거나 공학처리하는 것을 포함하는 다양한 면역요법 기술을 지칭한다.

본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 티로신 키나제 억제제와 관련하여 보조 요법에 사용될 수 있는 것으로 또한 고려된다. 이들은 수용체의 세포내 티로신 키나제 도메인과 상호작용하고 세포내 Mg-ATP 결합 부위에 대해 경쟁함으로써 리간드-유도 수용체 인산화를 억제하는 주로 퀴나졸린-유래된 합성 저분자량 분자이다.

일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 A2AR, BTLA, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, CD27, CD28, CD40, CD47, CD55, CD73, CD122, CD137, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, CTLA-3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1 및/또는 CEACAM-5), GAL9, GITR, HVEM, LY108, LAIR1, ICOS, IDO, KIR, LAIR1, PD-1/PD-L1/PD-L2, OX40, TIGIT, TIM-3, TGFR-beta, VISTA, LILRB2, CMTM6 및/또는 2B4의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 비제한적으로 포함하여, 면역 시스템 활성화를 매개하는 또 다른 약제/약물과 함께 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 제제는 상기 분자 중 하나에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-21), EGFR 억제제, VEGF 억제제 등과 함께 사용될 수 있는 것으로 또한 고려된다.

특정 양태에서, 본 발명의 항체 및 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 LAG-3 또는 이의 리간드 중 하나 이상을 표적화할 수 있는 LAG-3 경로의 또 다른 억제제와 함께 투여될 수 있다. 그러한 억제제의 예는 다른 항-LAG-3 항체, 항-MHCII 항체, 항-갈렉틴-3 항체, 및 항-LSECtin 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 항체, 또는 항체 조성물은 BMS-986016, GSK2831781, REGN3767, BAP050 또는 BAP050-chi, 또는 LAG525와 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 및 이중특이적 결합 분자는 본원에 설명된 바와 같은 치료 방법에서 사용될 수 있고/거나, 본원에 설명된 바와 같은 치료에 사용하기 위한 것일 수 있고/거나, 본원에 설명된 바와 같은 치료를 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 및 이중특이적 결합 분자를 포함하는 키트 및 제조 물품을 제공한다.

투여 용량 및 경로

본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는 해당 조건의 치료를 위한 유효량으로 투여될 것이고, 즉, 요망되는 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 시간의 기간 동안 투여될 것이다. 치료적 유효량은 치료될 특정 질환, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 항체가 독립 치료로서 또는 하나 이상의 추가적인 항암 치료제와 함께 투여되는 지의 여부와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.

투여 요법은 최적의 요망되는 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할된 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태의 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료되는 환자/대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하는데, 각 단위는 요구되는 약학적 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 일반적으로 (a) 화학요법제의 독특한 특징 및 달성될 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위해 그러한 활성 화합물을 배합하는 분야에서의 고유의 한계에 의해 지시되고 이에 직접적으로 따른다.

이에 따라, 당업자는 본원에 제공된 설명을 기초로 하여, 용량 및 투여 요법이 치료 분야에서 널리 공지된 방법에 따라 조절된다는 것을 인식할 것이다. 즉, 최대 내약 용량이 용이하게 규명될 수 있으며, 환자에 대한 검출 가능한 치료 이익을 제공하는 유효량이 또한, 환자에 대한 검출 가능한 치료 이익을 제공하기 위해 각 제제를 투여하기 위한 일시적 요건일 수 있으므로, 결정될 수 있다. 이에 따라, 특정 용량 및 투여 요법이 본원에 예시되어 있지만, 이러한 예는 본 발명을 실행함에 있어서 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 요법을 어떠한 방식으로도 한정하지 않는다.

투여량 값이 개선될 질환의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있고, 단일 용량 또는 다중 용량을 포함할 수 있다는 것이 주목되어야 한다. 임의의 특정 대상체에 대하여, 특정 투여 요법이 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단 및 개개 필요에 따라 시간에 따라 조절될 것이며, 본원에 기술된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이고 구현된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하지 않도록 의도된다는 것이 추가로 이해된다. 또한, 본 발명의 조성물로의 투여 요법은 질병의 유형, 연령, 체중, 성별, 환자의 의학적 상태, 질환의 중중도, 투여 경로, 및 사용되는 특정 항체를 포함하는 다양한 인자를 기초로 할 수 있다. 이에 따라, 투여 요법은 광범위하게 달라질 수 있지만, 관례대로 표준 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 약동력학 또는 약물역학적 파라미터를 기초로 하여 조절될 수 있으며, 이는 임상 효과, 예를 들어, 독성 효과 및/또는 실험실 수치를 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 환자내 용량-상승을 포함한다. 적절한 투여량 및 요법을 결정하는 것은 관련 분야에서 널리 공지되어 있고, 본원에 기술된 교시를 제공한 후에 당업자에 의해 포함될 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 항체, 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자의 적합한 용량은 0.1-100 mg/kg, 예를 들어, 약 0.5-50 mg/kg, 예를 들어, 약 1-20 mg/kg의 범위일 것으로 고려된다. 항체, 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자는, 예를 들어, 적어도 0.25 mg/kg, 예를 들어, 적어도 0.5 mg/kg, 예를 들어, 적어도 1 mg/kg, 예를 들어, 적어도 1.5 mg/kg, 예를 들어, 적어도 2 mg/kg, 예를 들어, 적어도 3 mg/kg, 예를 들어, 적어도 4 mg/kg, 예를 들어, 적어도 5 mg/kg; 및 예를 들어, 최대 50 mg/kg, 예를 들어, 최대 30 mg/kg, 예를 들어, 최대 20 mg/kg, 예를 들어, 최대 15 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 투여는 대개 적합한 간격으로, 예를 들어, 주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 4주마다 1회, 그리고 필요한 경우에 투여량을 임의적으로 증가시키거나 감소시킬 수 있는 주치의에 의해 적절한 것으로 여겨지는 동안 반복될 것이다.

종양 요법을 위한 유효량은 환자에서 질병 진행을 안정화시키고/거나 증상을 개선시키는 이의 능력, 및 바람직하게는 질병 진행을 역전시키는 능력에 의해, 예를 들어, 종양 크기가 감소하는 것에 의해 측정될 수 있다. 암을 억제하기 위한 본 발명의 항체, 항원-결합 부분, 항체 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자의 능력은, 예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같은 시험관내 검정 뿐만 아니라, 인간 종양에서의 효능을 예측하는 적합한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 적합한 투여 요법은 각 특정 상황, 예를 들어, 단일 볼루스로서 또는 연속 주입으로서, 및 각 경우의 경험에 의해 지시되는 바와 같은 투여량의 가능한 조절로 투여되는 상황에서 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 선택될 것이다.

진단 용도 및 조성물

본 발명의 항체는 또한 진단 과정(예를 들어, 시험관내, 생체외)에서 유용하다. 예를 들어, 항체는 환자로부터의 샘플(예를 들어, 조직 샘플, 또는 체액 샘플, 예를 들어, 염증 삼출물, 혈액, 혈청, 장액, 타액, 또는 소변)에서 LAG-3의 수준을 검출하고/거나 측정하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 검출 및 측정 방법은 면역학적 방법, 예를 들어, 유세포분석, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 화학적발광 검정, 방사면역검정, 및 면역조직학을 포함한다. 본 발명은 본원에 기술된 항체를 포함하는 키트(예를 들어, 진단 키트)를 추가로 포함한다.

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학용어 및 기술용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기술되어 있으며, 본 발명의 실시 또는 시험에서 본원에 기술된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 물질들이 또한 사용될 수 있다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 발명의 명세서가 우선할 것이다.

일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화의 기술 및 이와 관련하여 사용된 명명법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용된다. 효소적 반응 및 정제 기술은 당해 분야에서 통상적으로 달성되거나 본원에 기술된 바와 같이, 제조업체의 사양에 따라 수행된다.

또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서 및 구체예 전반에 걸쳐, 단어 "가지다" 및 "포함하다", 또는 변형예, 예를 들어, "갖다", "갖는", "포함" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 그룹을 배제하지 않는 것을 내포하는 것으로 이해될 것이다.

본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 전문이 참조로서 포함된다. 다수의 문헌들이 본원에 인용되어 있지만, 이러한 인용은 임의의 이러한 문서들이 당해 분야의 공통의 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것은 아니다.

본 발명이 보다 잘 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 기술된다. 이러한 실시예는 단지 예시를 목적으로 하는 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어선 안된다.

실시예

실시예 1: 항-LAG-3 항체 레퍼토리의 생성 및 스크리닝

2개의 항-LAG-3 항체 레퍼토리는 LAG-3 세포외 도메인(ECD) 또는 LAG-3 ECD Fc 융합 단백질에 의한 면역화에 의해 생성되었다. 하나의 항체 라이브러리는 Symplex™ 항체 발견 기술을 사용하여 면역된 OmniRat® 래트로부터의 단일-세포 분류된 B 세포로부터 준비되었다(Osborn et al., J Immunol. 190(4): 1481-90 (2013); Meijer et al., J Mol Biol. 358(3): 764-72 (2006). 이 항체 레퍼토리로부터의 발현 작제물은 IgG₁ 항체의 Fc 영역의 이펙터 기능을 감소시키는 것으로 알려진 2개의 돌연변이(L234A/L235A)를 보유한 IgG₁ 포맷의 완전한 인간 면역글로불린을 인코딩하였다(Hezareh et al., J Virol. 75(24):12161-8 (2001). 제2 항체 레퍼토리는 면역된 야생형 닭(갈루스 갈루스(Gallus gallus))의 림프 기관으로부터 유래된 단일-세포 분류된 B 세포를 사용하여 작제되었다.

둘 모두의 항-LAG-3 레퍼토리로부터 클로닝된 항체를 384-웰 포맷으로 293fectin™ 트랜스펙션 시약(Invitrogen, Cat. No. 12347-019)을 사용하여 HEK293 세포에서 개별적으로 트랜스펙션 및 발현시키고, 항체-함유 상청액을 트랜스펙션 6일 후에 수집하였다.

세포-기반 항체 스크리닝을 위해, FreeStyle™ MAX 시약(Invitrogen, Cat. No. 16447-100)을 사용하여 CHO-S 세포를 384-웰 포맷으로 트랜스펙션시켜 GPI-고정된 인간 LAG-3을 발현시키고, 무관한 GPI-고정된 대조군 단백질로 트랜스펙션된 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 멀티플렉스 스크리닝 설정을 허용하기 위해, 대조군 세포를 카르복시플루오레신 석신이미딜 에스테르(CFSE)를 사용하여 표지하고, 비-표지된 LAG-3 트랜스펙션된 세포와 1:1의 비 및 mL 당 1x10⁶개 세포의 밀도로 혼합하였다. 384-웰 플레이트에서, 40 μL의 이러한 세포 믹스를 10 μL의 항체-함유 상청액과 혼합하고, 세포-결합된 항체를 염소 항-인간 IgG(H+L) AF647 이차 항체(Molecular Probes, Cat. No. A21445)의 첨가에 의해 나타내었다. 병행하여, 항체를 유사한 설정에서 시노몰구스 LAG-3와의 결합에 대해 스크리닝하였다. 샘플을 고 처리량 유세포분석(iQue® Screener, Intellicyt)을 사용하여 수득하였고 데이터를 CFSE 대 인간 IgG 결합(AF647)을 플롯팅함에 의해 ForeCyt® 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. LAG-3-특이적 1차 적중(hits)은 인간 및 시노몰구스 LAG-3-트랜스펙션된 세포(CSFE 음성) 둘 모두에는 결합하지만 대조군 세포(CFSE 양성)에는 결합하지 않는 항체 클론으로서 확인되었고, 적중 수확 및 후속 서열 분석을 위해 플레이트 번호 및 플레이트 좌표를 수집하였다.

6개의 기능성 OmniRat®-유래된 항-LAG-3 항체(15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 및 15572)) 및 1개의 기능성 닭-유래된 항-LAG-3 항체(15011; 실시예 2 참조)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 DNA 및 단백질 서열은 하기 서열 목록 섹션에 제공된다. 가변 및 불변 영역 DNA 및 단백질 서열의 SEQ ID 번호의 개요는 표 8 및 표 9에 제공된다. CDR에 대한 SEQ ID 번호는 표 9에 있다. 본원의 CDR 서열은 CDR1 및 CDR2에 대한 IMGT^® 정의에 따라 결정되었다. 중쇄 및 경쇄 CDR3의 경우, 본원의 정의는 IMGT-CDR3의 업스트림에 한 여분의 아미노산 잔기(Cys) 및 다운스트림에 한 여분의 아미노산 잔기(H-CDR3의 경우 Trp, L-CDR3의 경우 Phe)를 포함한다. 6개의 OmniRat®-유래된 항체의 생식계열 유전자 사용은 표 10에 제시되어 있다.

실시예 2: 닭-유래된 항-LAG-3 항체의 인간화

닭-유래된 항-LAG-3 항체의 프레임워크 영역의 인간화는 부모 닭 항체의 특이성 및 친화도를 실질적으로 유지하면서, 인간에 투여될 때 최소 면역원성을 갖는 항체 분자를 생산하기 위해 수행되었다.

닭-유래된 항체의 인간화는 문헌[Jones et al., Nature 321(6069):522-5 (1986)]에 원래 기재되어 있는 방법인 "CDR 그라프팅" 접근법을 사용하여 수행되었다. 먼저, 가장 가까운 인간 생식계열 유전자를 찾기 위해 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 영역을 인간 IgG 데이터베이스에 대해 블라스팅(blast)하였다. 이것은 IGHV3-23*01(M99660) 및 인간 IGLV3-19*01(X56178) 유전자가 각각 닭 VH 및 VL 유전자와 가장 가깝다는 것을 확인하였다. 유사하게, J-유전자 영역 인간화를 위해 선택된 인간 아미노산 서열은 VH 및 VL에 대해 각각 IGHJ1*01(J00256) 및 IGLJ6*01(M18338)로부터 유래되었다. 이후 항체 VH 및 VL 유전자를 닭 면역글로불린 생식계열 유전자에 대해 정렬시켜 항체 기능 및/또는 구조에서 역할을 할 수 있는 프레임워크 영역에서의 체세포 돌연변이를 확인하였다. 마지막으로, 항체 구조, 안정성 및 기능에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 특정 아미노산 위치, 소위 "베르니에(Vernier) 잔기"(Nishibori et al., Mol Immunol. 43(6):634-42 (2006))는 상응하는 생식계열로부터의 인간 또는 닭 잔기를 포함하는 대안적인 인간화 항체 변이체를 생성하기 위해 고려되었다.

닭 CDR 및 인간 프레임워크 영역의 어셈블리를 인 실리코에서 수행하고 인간화된 VH 및 VL을 인코딩하는 합성 유전자를 Genscript Inc.로부터 주문하였다. VH 및 VL 유전자를 인간 항체 경쇄 및 중쇄의 불변 영역을 보유하는 발현 벡터(플라스미드)에서 클로닝하였다. 구체적으로, VL은 인간 람다 불변 IGLC1*01(J00252)에 결합하였다. 람다 사슬의 업스트림에서 신호 펩티드의 정확한 절단을 증가시키기 위해, 람다 유전자 IGLV3.19의 제2 아미노산(Ser)을 다른 인간 생식계열, 예를 들어, IGLV3.25에 존재하는 또 다른 아미노산(Tyr)으로 대체하였다.

이 실시예에 기재된 바와 같이 생성된 항체 클론에 대한 대표적인 유세포분석 도트 플롯을 도 1a-c에 나타내었다: (a) 인간 LAG-3-트랜스펙션된 세포에 특이적으로 결합하는 항체 클론, (b) CHO-S 세포에 비-특이적으로 결합하는 항체 클론, 및 (c) 스크리닝에 사용된 임의의 세포 집단과 결합하지 않는 항체 클론.

실시예 3: 항-LAG-3 참조 항체 유사체의 클로닝

25F7-Lag3.5 및 BAP050의 항체 유사체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 아미노산 서열은 미국 특허 출원 공보 2014/0093511 A1호(서열 SEQ ID NO: 12 및 14) 및 PCT 특허 출원 공보 WO 2015/138920 A1호(SEQ ID NO: 6 및 16)로부터 각각 수득되었다. 단백질 서열을 인간 코돈 사용에 의해 DNA 서열로 역 번역시켰다. 이후 상응하는 DNA 서열을 합성하고 인간 IgG₄ 중쇄 또는 카파 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 클로닝시켜, 전장 항체를 발현시켰다. Fab 아암 교환을 방지하기 위해, 위치 228의 세린 잔기를 프롤린으로 치환하였다(Angal et al., Mol. Immunol. 30:105-108 (1993)). CHO 세포를 표준 단백질 발현 시스템을 사용하여 생성된 발현 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 상응하는 항체 상청액을 표준 단백질 A 정제 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.

실시예 4: SEB+PBMC 검정에서 LAG-3 특이적 mAb 패널의 스크리닝

스태필로코쿠스 엔테로톡신 B(SEB)로 처리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 IL-2 분비를 자극하는 LAG-3 특이적 mAb 대형 패널의 능력을 단일 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 평가하였다. SEB는 T 세포 수용체(TCR)의 MHC 클래스 II 분자 및 특정 Vβ 영역에 결합하여 T-세포의 비-특이적 자극을 유도하는 슈퍼-항원이다. 이것은 폴리클로날 T 세포 활성화/증식 및 IL-2를 포함하는 사이토카인의 방출을 초래한다. 건강한 공여자로부터의 백혈구연층으로부터 분리된 인간 PBMC를 384 웰 플레이트에 시딩하고 10 ng/mL의 SEB 및 10 μg/mL의 항체로 처리하거나 처리하지 않고 방치하였다. 37℃의 가습된 인큐베이터에서 48시간 후, 상청액을 제거하고 IL-2 ELISA 키트(Life Technologies)를 사용하여 IL-2 수준을 분석하였다.

항-LAG-3 mAb 레퍼토리 또는 25F7-Lag3.5 유사체로 처리한 후 IL-2 분비의 증가가 도 2에서 보여진다. 상이한 항-LAG-3 mAb로 처리한 후 IL-2 수준은 강하게 변화하였음이 분명하며, 이는 레퍼토리 내의 일부 항체는 이 검정에서 기능이 없었지만, 다른 항체는 25F7-Lag3.5 유사체와 유사한 수준으로 IL-2 분비를 유도하였음을 보여준다.

실시예 5: 세포-발현된 인간 또는 시노몰구스 LAG-3에 결합하는 항체

항체의 결합에 대한 EC50 값을 유세포분석에 의해 측정하기 위해, FreeStyle™ MAX 시약(Invitrogen, Cat. No. 16447-100)을 사용하여 CHO-S 세포를 일시적으로 트랜스펙션시켜 인간 또는 시노몰구스 LAG-3를 발현시켰다. 항체를 염색 완충액(PBS; 2% FBS; NaN₃)에서 10 내지 0.05 μg/mL로 3배 희석하여 적정하고 인간 또는 시노몰구스 LAG-3-트랜스펙션된 세포와 혼합하여 인큐베이션하였다. 염색 완충액에서 2회 세척한 후, 염소 항-인간 IgG(H+L) AF647 이차 항체(Molecular Probes, Cat. No. A21445)의 첨가에 의해 세포-결합된 항체를 나타내었다. 샘플을 고 처리량 유세포분석(iQue® Screener, Intellicyt)을 사용하여 수득하였고 데이터를 항체 농도 대 AF647에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 플롯팅함에 의해 ForeCyt® 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. ForeCyt®의 "용량 반응 그래프" 기능을 사용하여 EC50 값을 계산하였다.

적정에 의해 측정된 항체 결합 특성의 요약은 하기 표 1에 있고, 여기서 huLAG-3 및 cyLAG-3는 각각 인간 및 시노몰구스 LAG-3-트랜스펙션된 세포이다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 항체 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 및 15572는 인간 및 시노몰구스 LAG-3 둘 모두에 결합한다.

표 1. 항체 특성 개관

실시예 6: MHCII 차단 활성에 대한 항-LAG-3 항체의 유세포분석

본 실시예는 표면-MHCII-양성 A375 세포 및 형광색소-표지된 가용성 LAG-3를 사용하여 유세포분석 경쟁 검정을 수행함으로써 항-LAG-3 항체가 주조직적합성 복합체 II(MHCII) 차단 활성에 대해 시험된 방법을 예시한다.

MHCII 차단 활성은 인간 흑색종 세포주 A375(ATCC^® CRL-1619™)를 사용하여 세포-기반 검정에서 조사되었다. R-PE-표지된 인간 LAG-3-Fc 키메라 단백질은 A375 상의 표면-발현된 MHCII에 특이적으로 결합하여, 유세포분석에 의한 이러한 상호작용의 정량을 가능하게 한다. 시판되는 재조합 인간 LAG-3-Fc 키메라 단백질(R&D Systems, USA)을 Lightning-Link^® R-피코에리트린 컨쥬게이션 키트(Innova Biosciences, UK)를 사용하여 R-PE에 컨쥬게이션시켰다. A375 세포를 효소-비함유 세포 분리 완충액(Gibco™)을 사용하여 수확하고, 세척하고, 찬 염색 완충액(PBS, 2% FBS, NaN₃)에 재현탁시켰다. 시험할 항-LAG-3 항체를 96-웰 포맷으로 플레이팅하고 50 μL 염색 완충액 중 20 μg/mL로 조정하였다. 1 μL의 LAG-3-Fc-PE(약 0.17 μg LAG-3-Fc에 상응함)를 웰 당 첨가하고, 혼합하고, 플레이트를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 LAG-3-항체 복합체가 형성되게 하였다. 인큐베이션 동안, 1x10⁵개 A375세포(100 μL 염색 완충액 중)를 96-웰 포맷으로 플레이팅하고, 원심분리에 의해 침전시키고, 세포 펠릿을 미리-인큐베이션된 LAG-3/항체 혼합물에 재현탁시켰다. 세포를 4℃에서 추가로 20분 동안 인큐베이션하고, 200 μL의 찬 염색 완충액에서 1회 세척하고, 획득을 위해 100 μL 염색 완충액에 재현탁하였다.

시험된 7개의 항-LAG-3 항체(20 μg/mL) 중 4개인 15532, 15595, 15431 및 15011은 음성 대조군 항체의 존재 하에서의 결합과 비교하여 MHCII에 대한 LAG-3 결합(MFI)을 약 90%만큼 감소시켰고, 따라서, 상호작용의 효과적인 차단제로 고려된다. 나머지 3개의 항체 15646, 15723 및 15572는 LAG-3-MHCII-결합에 대해 단지 제한적인 효과만을 가졌고 불충분한 차단제로 고려될 수 있다. 참조 항체 25F7-Lag3.5 유사체는 중간 차단 활성을 나타내었다. 결과는 표 2에 요약되어 있다.

표 2. 항-LAG-3 항체의 존재 하에 A375 세포 상의 MHCII에 대한 LAG-3 결합의 차단.

실시예 7: SEB+PBMC 검정에서 항-LAG-3 모노클로날 항체의 효능

스태필로코쿠스 엔테로톡신 B(SEB)로 처리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 IL-2 분비를 자극하는 7개의 항-LAG-3 mAb의 능력을 평가하였다. 본 실시예는 여러 PBMC 공여자에서 7개의 항-LAG-3 mAb의 효능을 기술한다. 또한, 다른 서열 클러스터로부터의 4개의 항-LAG-3 mAb의 효능을 기술한다. 서열 클러스터 번호는 항체 번호 다음에 괄호로 표시하며 이는 실시예 13에서 추가로 기술된다. 항-LAG-3 항체를 실시예 4에 기술된 바와 같이 SEB+PBMC 검정에서 10 또는 12.5 μg/ml로 시험하였다.

항-LAG-3 mAb 15431, 15532, 15572, 15595, 15646, 15723, 및 15011 또는 25F7-Lag3.5 유사체로 처리한 후 IL-2 분비의 증가는 도 3에 도시된다. 각각의 도트는 단일 PBMC 공여자로부터의 IL-2 분비의 수준을 나타낸다. 항-LAG-3 mAb로 처리한 후 IL-2 수준은 상이한 PBMC 공여자 간에 다양하지만, 7개 모두의 항-LAG-3 mAb는 IL-2 생산을 유사한 수준으로 자극하는 것이 명백하다. 이것은 IL-2 생산을 증가시키지 않는 항-LAG-3 mAb 15445, 15429 및 15491과 대조적이다.

실시예 8: 세포-기반 LAG-3-MHC 클래스 II 차단 검정에서 항-LAG-3 모노클로날 항체의 효과

7개의 항-LAG-3 mAb를 추가로 특성화하기 위해, LAG-3-MHC 클래스 II 상호작용을 차단하는 능력을 세포 기반 검정으로 시험하였다.

NFAT-RE-제어 루시페라제 유전자를 보유하고 변형된 TCR 및 LAG-3를 발현시키는 Jurkat 세포(Promega)를 MHC 클래스 II-발현 Raji 세포주, 50 ng/mL의 스태필로코쿠스 엔테로톡신 D(SED) 및 도 4에 지시된 바와 같이 상이한 농도의 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션하였다. 37℃의 가습된 인큐베이터에서 6시간 후, 루시페라제 기질(Promega)을 첨가하고 발광을 측정하였다. 발광은 TCR 신호전달에 의해 제어되고 LAG-3 신호전달에 의해 억제되는 루시페라제 발현의 척도이다. 따라서, 적은 LAG-3 신호전달은, 예를 들어, LAG-3-MHCII 상호작용을 차단함으로써, 증가된 발광을 유도할 것이다.

항-LAG-3 mAb 15431, 15532, 15572, 15595, 15646, 15723, 및 15011 또는 25F7-Lag3.5 유사체로 처리한 후 발광의 증가는 도 4에 도시된다. 시험된 모든 항-LAG-3 항체는 발광을 유사한 수준으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

실시예 9: LAG-3의 세포 수준에 대한 항-LAG-3 모노클로날 항체의 효과

선택된 항-LAG-3 항체를 추가로 특성화하기 위해, LAG-3 수준을 하향-조절하는 능력을 LAG-3을 과발현하는 T-세포주에서 시험하였다.

변형된 TCR 및 LAG-3를 발현하는 Jurkat 세포(Promega)를 도 5에 나타낸 바와 같이 25 mg/mL의 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션하였다. 37℃의 가습된 인큐베이터에서 24시간 후, 상청액을 수집하고 세포-용해시켰다. 세포에서 LAG-3의 수준을 항-LAG-3 검출 항체(Novus Biologicals) 및 간단한 웨스턴 기술(Sally Sue, Proteinsimple)로 평가하였다. 상청액 중 LAG-3의 수준을 항-LAG-3 ELISA(R&D Systems)를 사용하여 평가하였다. 결합 경쟁 연구는 시험된 항-LAG-3 항체가 가용성 LAG-3와의 결합에 대해 ELISA 검출 항체와 경쟁하지 않음을 확인시켜 주었다. 통계 분석은 다중 비교를 위해 수정된 일원 ANOVA 후 Bonferroni 수정된 post-hoc t-테스트를 사용하여 수행되었다.

항-LAG-3 mAb 15431, 15532, 15011, 25F7-Lag3.5 유사체 또는 BAP050 유사체로 처리한 후 세포 및 가용성 LAG-3의 수준은 도 5에 도시된다. 15532, 15011, 25F7-Lag3.5 유사체 및 BAP050 유사체는 세포 뿐만 아니라 가용성 LAG-3 수준도 감소시켰다. 15532는 세포 LAG-3 수준을 25F7-Lag3.5 유사체보다 낮은 수준으로 통계적으로 유의하게 감소시켰고, 가용성 LAG-3 수준을 25F7-Lag3.5 유사체 및 BAP050 유사체보다 낮은 수준으로 통계적으로 유의하게 감소시켰다. 15431은 세포 또는 가용성 LAG-3 수준을 저하시키지 않았다.

실시예 10: 2개의 동계 뮤린 종양 모델에서 항체 15011의 생체내 효능

본 실시예는 2개의 동계 뮤린 종양 모델에서 항체 15011의 생체내 효능을 입증한다.

방법

6-8주령 암컷 A/J(Sa1N) 또는 BALB/cAnNRj(ASB-XIV) 마우스의 옆구리에 2x10⁵개 Sa1N(섬유육종) 및 5x10⁶개 ASB-XIV(폐 암종) 세포를 피하 접종하였다. 종양을 2차원에서 캘리퍼스로 매주 3회 측정하였고 종양 부피를 mm³으로 하기 식에 따라 계산하였다: (폭)² x 길이 x 0.5. 접종 후 5-7일에, 평균 종양 크기 30-50 mm³에서, 마우스를 10마리 동물의 두 그룹으로 무작위화하고 치료를 시작하였다. 마우스를 비히클 완충액 또는 모노클로날 항체 15011의 복강내 주입에 의해 매주 3회 총 6회 처리로 치료한 다음 관찰 기간을 가졌다. 항체 치료제는 10 mg/kg으로 투여되었다. Bonferroni의 다중 비교 테스트와 함께 이원 ANOVA를 적용하여 치료 그룹 간의 각 시점에 종양 부피를 비교하였다. GraphPad Prism 버전 5.0(GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

결과

상기 결과는 시험된 동계 종양 모델에서 항체 15011의 현저한 종양 억제 효과를 나타내었다(*P<0.001)(도 6). 15011은 Sa1N 종양이 이식된 마우스의 50%에서 종양 성장 퇴행을 유도하고 ASB-XIV 동계 종양 모델에서 종양 성장 지연을 초래하였다.

실시예 11: 인간 PBMC로 재구성되고 인간 흑색종 A375 세포가 이식된 NOG 마우스에서 항체 15532의 생체내 효능

본 실시예는 반-인간화된 이종이식 종양 모델에서 항체 15532의 생체내 효능을 입증하고, 이 때 NOG 마우스의 면역 시스템은 인간 PBMC로 재구성되었고 마우스에 인간 흑색종 A375 세포가 이식되었다.

방법

연구 0일에, NOG 마우스에 2-4.5 x 10⁶개 A375 흑색종 세포를 피하 주입하고 연구 2일에 9 또는 12 x 10⁶개 PBMC를 복강내 투여하였다. 한 공여자로부터의 PBMC를 각 실험에 사용하였다. PBMC 접종 당일에 치료를 개시하였고, 마우스를 비히클 완충액 또는 모노클로날 항체 15532(10 mg/kg)의 복강내 주입에 의해 매주 3회 총 6회 또는 9회 처리로 치료한 다음 관찰 기간을 가졌다. 종양을 2차원에서 캘리퍼스로 매주 3회 측정하였고 종양 부피를 mm³으로 하기 식에 따라 계산하였다: (폭)² x 길이 x 0.5. Bonferroni의 다중 비교 테스트와 함께 이원 ANOVA를 적용하여 치료 그룹 간의 각 시점에 종양 부피를 비교하였다. GraphPad Prism 버전 5.0(GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

결과

도 7은 항-LAG-3 치료에 반응한 2개의 상이한 인간 PBMC 공여자를 사용한 2개의 실험으로부터의 결과를 보여준다. 15532에 의한 치료는 비히클 처리된 그룹과 비교하여 현저한 종양 성장 지연을 초래하였다[P<0.05(공여자 1) 및 P<0.001(공여자 2)].

실시예 12: 인간, 시노몰구스 및 마우스 LAG-3에 대한 항-LAG-3 모노클로날 항체 친화도의 측정

본 실시예는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된 인간, 시노몰구스 및 마우스 LAG-3 세포외 도메인에 대한 항-LAG-3 항체의 결합을 입증한다. 인간 LAG-3의 단백질 서열은 UniProt 수탁 번호 P18627(SEQ ID NO: 68) 하에 입수 가능하다. 시노몰구스 LAG-3의 단백질 서열은 NCBI 수탁 번호 XP_005570011.1(SEQ ID NO: 69) 하에 입수 가능하다. 마우스 LAG-3의 단백질 서열은 UniProt 수탁 번호 Q61790 (SEQ ID NO: 72) 하에 입수 가능하다.

재료 및 방법

IBIS MX96 SPR 기계(IBIS Technologies, The Netherlands)와 결합된 연속 흐름 미세스포터(CFM)(Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, US)를 사용하여 동력학 결합 분석을 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 수행하였다.

Genovis(Sweden)에 의해 제공된 키트를 사용하여, IgG₁ 항체를 GingisKHAN 효소로 분해함으로써 항-LAG-3 Fab 항체를 생성하였다.

인간 및 시노몰구스 LAG-3의 세포외 도메인을 코딩하는 LAG-3 cDNA를 합성하고 각각을 CMV 프로모터 및 인간 IgG₁ Fc 서열(AA P101-K330)을 함유하는 벡터로 클로닝시켜, 클로닝된 LAG-3 ECD에 IgG₁ Fc의 C-말단 융합을 발생시켰다. 표준 PCR 및 공학처리 기술에 의해 LAG-3 Fc 융합 작제물을 생성하고 ExpiCHO™ 발현 시스템을 사용하여 단백질을 2 ml 배양액에서 일시적으로 발현시켰다. 인간 LAG-3 Fc 융합 작제물을 9일 후에 수확하고 상청액을 SPR에 의해 LAG-3 Fab 항체에 대한 결합 친화도에 대해 시험하였다. 항원을 표준 절차를 사용하여 정제하고, 연속 흐름 미세스포터(CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, US)를 이용하여 G-a-hu-IgG Fc SensEye®(Ssens BV, The Netherlands)에 15분 동안 포집하였다. 스폿팅 후, SensEye®를 IBIS MX96 바이오센서에 배치하고 남아있는 포집 부위를 차단하였다. 소위 동력학 적정 시리즈(Karlsson R. 2006)를 적용시켜 동력학 분석을 수행하였고, 여기서 본 발명의 항체의 단합체 Fab 단편은 각 Fab 주입 후에 표면 재생 단계를 적용하지 않고 1 nM에서 1000 nM로 증가하는 농도로 주입되었다. Fab 회합을 15분 동안 수행하고, 항원 해리를 15분 동안 수행하였다. 기록된 결합 반응은 온-레이트(on-rate)(kon 또는 ka), 오프-레이트(off-rate)(koff 또는 kd) 및 친화도(K_D) 상수를 계산하기 위해 Scrubber 2 소프트웨어에 의해 단순 Langmuir 1:1 결합 모델에 핏팅되었다.

결과

친화도 측정의 결과는 평가된 항체 15532, 15431, 15572, 15011 및 참조 항체 유사체 25F7-Lag3.5가 상이한 친화도로 인간 및 시노몰구스 LAG-3에 결합한다는 것을 입증한다. 15011은 마우스 LAG-3 교차-반응성을 갖는 유일한 항체이다. 상세한 결합 동력학은 하기 표 3에 표로 제시되어 있다.

표 3. SPR에 의해 측정시 인간, 시노몰구스 및 마우스 LAG-3 ECD에 대한 항-LAG-3 Fab 단편의 결합 동력학.

실시예 13: 항-LAG-3 항체의 에피토프 비닝

본 실시예는 샌드위치 검정에서 페어링된 경쟁 패턴에 기반하여 항-LAG-3 항체가 에피토프 빈으로 그룹화되는 방법을 예시한다. 상이한 에피토프 빈에 속하는 항체는 LAG-3 ECD 상의 상이한 에피토프를 인지한다.

재료 및 방법

IBIS MX96 SPR 기계(IBIS Technologies, The Netherlands)와 결합된 연속 흐름 미세스포터(CFM)(Wasatch Microfluidics, US)를 사용하여 페어링된 항체 경쟁에 대한 조사를 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 수행하였다. 표면 플라스몬 공명 영상 분석을 염소-항-인간-IgG Fc SensEye® SPR 센서(Ssens BV, The Netherlands) 상에서 수행하였다. 참조 항체 25F7-Lag3.5를 포함하는 총 13개의 항-LAG-3 항체를 0.05% Tween 20(PBS-T)를 함유하는 PBS 완충액(pH 7.0)에서 7.5 μg/mL로 희석하였다. 항체를 연속 흐름 미세스포터를 사용하여 15분 동안 스폿팅함에 의해 항-Fc 센서 표면에 포집하였다. 스폿팅 후, SensEye®를 IBIS MX96 바이오센서에 배치하고, 30 μg/ml의 비-특이적 인간 IgG₁의 주입에 의해 나머지 항-Fc 부위를 차단하였다. 포집된 항체를 FixIt 키트(Ssens BV, The Netherlands)를 사용하여 표면에 컨쥬게이션시켰다. 센서 준비 후, 고정된 항체(리간드)를 사용하여 센서 위에 주입된 용액 중의 1가 LAG-3 항원(50 nM, Acro Biosystems, China)을 포집하였다. 다음으로, PBS-T 완충액에서 15 μg/mL로 희석된 LAG-3 항체의 패널을 센서 위에 하나씩 분석물로서 주입하고, 샌드위치 검정에서 포집된 LAG-3에 대한 결합을 시험하여 항체 경쟁 패턴을 확립하였다. 각각의 항체 주입 후, 센서 표면을 100 mM H₃PO₄ 완충액(pH 3.0)으로 재생하였다.

결과

13개의 항-LAG-3 항체의 경쟁 패턴이 도 8에 제시되어 있다. 항체는 이들의 ID 번호에 따라 명명되고 클러스터 그룹을 괄호 안에 표시된다. 동일한 클러스터 그룹의 mAb는 동일한 에피토프 빈에 결합할 것으로 예상되는데, 이는 클러스터 구성원으로부터의 단백질 서열이 매우 관련이 있고 단지 소수의 위치에서만 상이하기 때문이다.

모든 항체는 성공적으로 에피토프 비닝되었다; 그러나, 항체 15595(52), 15613(33) 및 15431(38)은 리간드로서 사용되는 경우에 작동하지 않았고, 분석물로서만 시험될 수 있었다. 항체 15646(15) 및 15011(94)은 리간드로서만 시험되었다.

경쟁 분석은 LAG-3 항체의 패널이 6개의 주요 에피토프 빈을 포괄한다는 것을 나타내었다(도 8). 항체 15011(94)은 패널로부터 임의의 다른 항체에 의해 교차 차단되지 않은 독특한 에피토프에 결합하였고, 결과적으로 이 항체는 에피토프 빈 1에 할당되었다. 에피토프 빈 2는 그룹으로부터의 다른 mAb 중 일부와 교차 경쟁하는 7개의 항체를 함유하고, 이러한 항체는 하위 빈으로 추가로 더 나뉜다. mAb 15584(54)는 리간드 또는 분석물로서 시험될 때 15532(17) 및 15595(52) 둘 모두를 교차 차단함으로써 특성화되었지만, 분석물로서 시험됐을 때 참조 mAb 25F7-Lag3.5에 의해 차단되지 않았다. mAb 15613(33)은 분석물로서만 시험되었고 15723(39), 15532(17) 및 15646(15)에 의해 차단되지만, 25F7-Lag3.5에 의해서는 차단되지 않는 것으로 나타났다. 결과적으로, 15532(17)는 25F7-Lag3.5와 중첩되는 에피토프에 결합하지만, 15532(17)의 에피토프는 15584(84) 및 15613(33)과의 경쟁의 차이로 인해 25F7-Lag3.5의 에피토프와 상이하고, 이러한 항체는 결과적으로 상이한 하위 빈에 할당되었다. 마찬가지로, 에피토프 빈 2의 다른 mAb는 빈 2의 다른 항체와의 경쟁 패턴에 기반하여 하위 빈에 할당되었다(도 8).

mAb 15572(91)는 단지 mAb 15584(54)와 교차 경쟁하는 것으로 밝혀졌고 별도의 빈 3에 할당되었다. 마찬가지로, mAb 15431(83)은 별도의 빈 4에 할당되었는데, 그 이유는 이 항체가 단지 mAb 15723(39)와 교차 경쟁하였기 때문이다. 마지막으로, 비기능 활성을 갖는 항체를 함유하는 2개의 분리된 에피토프 빈이 확인되었다. 에피토프 빈 5는 교차 차단 항체 15445(70) 및 15491(84)를 함유하였고 에피토프 빈 6은 패널로부터의 임의의 항체를 교차 차단하지 않는 mAb 15429(72)를 함유하였다. 빈 5 항체는 또한 이들을 분석물로서 시험했을 때 항체 25F7-Lag3.5, 빈 2로부터의 15532(17) 및 15723(39)을 차단하였다(도 8). 리간드 항체에 대한 경쟁 패턴의 요약은 도 9에 표시되고, 여기서 mAb의 에피토프 관련성은 Euclidean 거리를 사용한 클러스터링에 기반하여 제시된다. 클러스터 다이어그램에서, 0 보다 큰 x-축 값에서 분지 점을 갖는 항체는 시험된 LAG-3 패널의 다른 항체와 비교하여 상이한 에피토프를 갖는다는 것이 관찰될 수 있다. mAb 15595(52), 15613(33) 및 15431(38)는 클러스터 분석에 포함되지 않았는데, 그 이유는 이들이 리간드로서 작용하지 않았기 때문이다.

실시예 14: LAG-3 돌연변이유발에 의한 LAG-3 항체의 에피토프 맵핑

항체 에피토프는 일반적으로 선형 에피토프(연속 에피토프로도 명명됨) 또는 입체구조 에피토프(불연속 에피토프로도 명명됨)로서 특성화될 수 있다. 선형 에피토프는 단일 연속 아미노산 서열에 기반하여 정의되지만, 입체구조 에피토프는 여러 더 작은 불연속 선형 서열 또는 단일 접촉 잔기로 구성될 수 있다. 항체와 항원 사이의 분자간 단백질 계면에서 클러스터링되는 접촉 잔기의 집합체는 또한 핫 스팟(hot spot)으로서 명명된다(Moreira et al., Proteins 68(4):803-12 (2007)). 대부분의 B-세포 에피토프는 본질적으로 불연속인 것으로 현재 널리 알려져 있고(Sivalingam and Shepherd, Mol Immunol. 51(3-4):304-92012 (2012), Kringelum et al., Mol Immunol. 53(1-2):24-34 (2013)) 평균 에피토프는 15-22개 아미노산 잔기에 걸쳐 있는데, 이 중 2-5개 아미노산이 결합의 대부분에 기여한다(Sivalingam and Shepherd, supra).

108개의 상이한 LAG-3 돌연변이체에 대해 결합 친화도의 순위를 매김으로써, 이 실시예는 항-LAG-3 항체 15532, 15431, 15572, 및 15011의 결합 에피토프가 어떻게 참조 항체 25F7-Lag3.5 유사체에 의해 인지되는 에피토프와 구별되는 선형 에피토프 및 핫 스팟으로 나뉠 수 있는지를 예시한다.

방법

인간 LAG-3 수용체(CD223)는 427개 아미노산(잔기 23-450)의 세포외 도메인(ECD)에 이어 막통과 도메인(잔기 451-471) 및 세포질 도메인(잔기 472-525)을 포함하는 525개 아미노산(AA) 막통과 단백질이다. LAG-3 ECD는 4개의 면역글로불린 도메인(D1-D4)을 함유하며, 여기서 제1 도메인인 IgV-타입 도메인은 리간드 결합(MHCII 결합)에 관여하고 나머지 3개의 도메인은 IgC2 타입 도메인이다. 처음 2개의 N-말단 도메인(D1-D2)만으로 리간드 결합에 충분하고, D2는 정확한 수용체 제시에 필요하다는 것이 밝혀졌다(Huard et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:5744-5749 (1997), Andrews et al., Immunol Rev. 276(1):80-96 (2017)). 도메인 1은 다른 IgV-도메인에서는 발견되지 않고 리간드 결합에 필수적인 것으로 밝혀진 30개 아미노산(여분의 루프)의 추가적인 고유 스트레치를 함유한다. 아미노산(AA) 99, 110, 125, 131 및 137은 또한 리간드 결합(성숙 단백질의 Y77, R88, R103, D109, R115)에 중요하다는 것이 확인되었다(Huard et al, supra; Andrews et al., supra). LAG-3에 대힌 공개된 구조는 없다. 그러나, LAG-3 및 CD4 사이의 서열 및 진화 상동성이 확인되었고, 따라서, CD4의 상동성 모델링에 기반한 LAG-3에 대한 구조 정보에 대한 접근이 가능하다(Huard et al., supra; Andrews et al., supra).

인간 LAG-3 및 오르톨로그(orthologues)의 단백질 서열을 UniProt 또는 NCBI:인간(P18627; SEQ ID NO: 68), 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis), XP_005570011.1; SEQ ID NO: 69), 래트(라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), Q5BK54; SEQ ID NO: 70) 및 개(카니스 루푸스 파밀리아리스(Canis Lupus Familiaris), F1P7Z3; SEQ ID NO: 71)로부터 다운로드하였다. 상이한 LAG-3 세포외 도메인 아미노산 서열의 서열 동일성을 하기 표 4에 나타내었다.

표 4. 다른 종으로부터의 LAG-3의 세포외 도메인에서 인간 LAG-3에 대한 아미노산 차이 및 서열 동일성의 목록.

천연 인간 LAG-3 구조와 관련하여 선형 에피토프를 맵핑하기 위해, 35개의 키메라 단백질을 설계하였고(여기서 인간 LAG-3 ECD 서열 중 10개의 아미노산은 5개 아미노산만큼 중첩된 세그먼트에서 래트 서열로 순차적으로 교환되었다), 이는 특히 관심 영역의 개 및 시노몰구스 버전으로 보충되었다(예를 들어, 중요 AA 삽입 서열 및 루프 스트레치). 서열 교환은 아미노산 23-170에 걸쳐 있는 인간 LAG-3의 도메인 1에서 수행되었다. CD4 결정 구조(1WIO, 1WIQ) 및 아미노산 서열 정렬에 기반하여 작제된 상동성 모델로부터, 표면 노출된 아미노산을 확인하고 인간 LAG-3 도메인 1 상에 80개의 개별 치환을 설계하였다. 도입된 점 돌연변이는 주로 알라닌 치환이었다. 표면 노출된 잔기가 알라닌일 때, 이 위치는 세린으로 바뀌었다.

인간 LAG-3 세포외 도메인(AA 1-266)의 도메인 1및 2를 코딩하는 LAG-3 cDNA를 유전자 합성하고 CMV 프로모터 및 인간 IgG₁ Fc 서열(AA P101-K330)을 함유하는 벡터로 클로닝하여, LAG 도메인 1-2 Fc 융합 단백질을 발현시켰다. 표준 PCR 및 공학처리 기술에 의해 돌연변이된 인간 LAG-3 Fc 융합 작제물을 생성하고, ExpiCHO™ 발현 시스템을 이용하여 단백질을 2 ml 배양액에서 일시적으로 발현시켰다. 인간 LAG-3 Fc 융합 작제물을 수확하고, 정제하고, 항-LAG-3 mAb에 대한 결합 친화도에 대해 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 시험하였다. LAG-3 융합 단백질을 연속 흐름 미세스포터(CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, US)를 이용하여 G-a-hu-IgG Fc SensEye®(Ssens BV, The Netherlands)에 15분 동안 고정시켰다. 스폿팅 후, SensEye®를 IBIS MX96 바이오센서에 배치하고 포집된 단백질을 결합 친화도에 대해 평가하였다. 소위 동력학 적정 시리즈(Karlsson R. 2006)를 적용시켜 동력학 분석을 수행하였고, 여기서 본 발명의 항체의 단합체 Fab 단편은 각 Fab 주입 후에 표면 재생 단계를 적용하지 않고 0.4 nM에서 300 nM로 증가하는 농도로 주입되었다. Fab 회합을 15분 동안 수행하고, 항원 해리를 15분 동안 수행하였다. 기록된 결합 반응은 온-레이트(kon 또는 ka), 오프-레이트(koff 또는 kd) 및 친화도(KD) 상수를 계산하기 위해 Scrubber 2 소프트웨어에 의해 단순 Langmuir 1:1 결합 모델에 핏팅되었다.

결과

항-LAG-3 항체 15532, 15431, 15572, 15011 및 찹조 항체 25F7-Lag3.5 유사체의 Fab 단편의 결합 친화도를 LAG-3 돌연변이체 작제물에 대한 변경된 결합과 관련하여 평가하였다. 돌연변이된 LAG-3 작제물에 대한 Fab 단편의 결합 친화도를 KD 돌연변이체/KD 야생형(표준화된 결합 친화도) 사이의 비로 표시하였다. 하기 표 5 및 6은 각각 모든 시험된 키메라 단백질 및 알라닌 스캐닝 실험에 대한 표준화된 결합 친화도를 나타낸다. 돌연변이된 LAG-3 작제물에 대해 유의하게 감소된 결합 친화도를 검출하기 위한 기준으로서 적어도 5배 친화도 감소의 컷-오프(cut-off)가 사용되었다. 일부 경우에, 특정 항체에 대한 어떤 결합도 검출될 수 없었다. 이러한 작제물은 결합하지 않음(N.B.)으로서 작성된다.

상기 분석은 항-LAG-3항체 15532, 15431, 15572, 15011의 결합 에피토프가 참조 항체 25F7-Lag3.5 유사체의 결합 에피토프와 별개임을 보여주었다. 15532의 결합 에피토프는 위치 78-87, 84-92, 88-97에 삽입된 AA를 갖는 키메라 단백질로부터 명백하다 - 도메인 1 여분의 루프 내에 있는 LAG-3의 집합적 아미노산 스트레치. 그러나, 25F7-Lag3.5와 달리, 15532의 선형 에피토프는 AA 95-100, AA 98-105 및 AA123-131를 포함하여, 이 스트레치를 넘어 연장된다. 흥미롭게도, 리간드 상호작용을 위한 주요 아미노산은 99-131로부터의 세그먼트에서 확인되었다(Y99, R125 & D131; Huard et al, supra). 25F7-Lag3.5 유사체는 리간드 결합에 중요한 영역에서 돌연변이에 대한 어떤 민감성도 나타내지 않았다. 알라닌 치환에 의해 측정시 15532 접촉 잔기는 H85, P86, A87, P89, S91, W92 및 G93으로 확인된 반면 25F7-Lag3.5 유사체는 P86 및 S91에 대해 민감성을 나타내지 않았는데, 이는 AA 85-93 영역 내에서 분화된 접촉 잔기를 예시한다. 15532는 시노몰구스 AA 역돌연변이(P84H; H85R; S90Y)를 갖는 키메라 작제물 #28에 결합할 수 있었지만, 25F7-Lag3.5 유사체는 그렇지 않았고, 이는 다시 AA 84-90 영역 내에서 분화된 미세한 에피토프를 반영하였다.

2개의 항체 15431 및 15572 둘 모두는 세그먼트 AA 23-30 및 40-66의 선형 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 추가로 알라닌 스캐닝은 둘 모두의 항체가 위치 A40, Q41, P43, P46, P49, D52, T62, Q64, H65, Q66, P67 및 D68에서 동일한 접촉 잔기를 공유한다는 것을 나타내었다. 15431은 키메라 작제물 88-97, 95-100 및 98-105(세그먼트 AA 88-105)에 추가로 민감하였다. AA 영역 98-105는 15532, 15431, 15572 및 15011 사이의 독특한 공유된 에피토프인 것으로 입증되었다. 25F7-Lag3.5 유사체는 이 에피토프에 결합하지 않았다. 알라닌 스캐닝은 15431 및 15572가 접촉 잔기 P96, Y99, T100, V101, P106 및 G107을 공유한 반면, 15431은 위치 G93, P94, 및 R98에서 고유한 접촉을 가졌음을 나타내었다. 항체 15431은 또한 세그먼트 AA 123-131, 128-137 및 148-154에서 선형 에피토프를 가졌다. 흥미롭게도, 위치 125, 131 및 137은 리간드 결합에 중요하다는 것이 이전에 밝혀졌다(Huard et al, supra). 이들 세그먼트(AA 123-131, 128-137 및 148-154)는 또한 세그먼트 AA 118-137 및 148-161에서 선형 에피토프를 인지한 15572에 중요하였다. 알라닌 스캐닝은 15431 및 15572 둘 모두가 위치 R119, E124, R129, G130, D131, S133, R137, P138, D143, R148 및 R163에서 접촉 잔기를 공유한 반면, 25F7-Lag3.5 유사체는 이러한 에피토프 영역 또는 아미노산 위치 중 어느 것에도 민감성을 나타내지 않았음을 추가로 보여주었다.

항체 15011은 AA98-105의 범위의 돌연변이를 갖는 키메라 작제물에 의해 한정된 선형 에피토프를 함유하였고, 알라닌 스캐닝은 위치 G107, L109, R110 및 S111에서 접촉 잔기를 포함하기 위해 독특한 에피토프를 추가로 연장시켰다. 흥미롭게도, R110은 리간드 결합에 중요하다는 것이 밝혀졌다(Huard et al, supra). 아미노산 서열은 인간, 시노몰구스, 마우스 및 래트 오르톨로그 간의 이러한 영역(AA 98-113)에서 잘 보존되며, 이는 마우스 및 시노몰구스 원숭이 LAG-3에 대한 이 항체의 교차-반응성을 설명한다(실시예 12). 수집된 에피토프 맵핑 결과의 요약을 하기 표 7에 나타내었다.

요약하면, 본 발명자들은 단일 아미노산 분해능으로, 108개 LAG-3 돌연변이체의 패널에 대한 결합을 분석함으로써, 4개의 항체 15532, 15431, 15572 및 15011이 LAG-3의 도메인 1에서 독특하지만 부분적으로 중첩되는 에피토프를 인지한다는 것을 밝혀내었다. 상기 발견은 실시예 13의 에피토프 비닝 분석과 일치하며, 15532가 25F7-Lag3.5 유사체와 교차-경쟁하지만, 다른 LAG-3 항체와 차별화된 경쟁 패턴 및 이에 따라 상이한 에피토프를 갖는다는 것을 보여준다(표 7). 15431, 15572 및 15011은 15532 또는 25F7-Lag3.5와 결합에 대해 경쟁하지 않았고 별개의 에피토프 빈 2 항체와 독특한 경쟁 패턴을 가졌다. 할당된 에피토프 빈(실시예 13)은 각 항체가 독특한 차별화된 에피토프를 나타내었음을 밝힌 에피토프 맵핑과 잘 일치하였다(표 7). 키메라 작제물 #28을 포함하는 에피토프 데이터는 또한 15532가 시노몰구스 LAG-3에 대해 유의한 결합을 나타내고 25F7-Lag3.5는 그렇지 않은 결합 친화도 분석(실시예 12)을 잘 확증하였다 - 차별화된 접촉 잔기로 인한 항체의 상이한 특성을 반영함.

표 6. 점 돌연변이 스캐닝된 인간 LAG-3에 결합하는 항-LAG-3 항체의 Fab 단편에 대한 결합 친화도 분석의 요약. 표준화된 결합은 K_D 돌연변이체/K_D 야생형으로 표현되었다.

표 7. 시험된 항-LAG-3 항체에 대해 확인된 결합 에피토프의 요약

표 8. VH, VL, HC 및 LC DNA 및 단백질 서열에 대한 SEQ ID NO

서열 목록

VH 및 VL DNA 및 단백질 서열

SEQ ID NO: 1 (15646 VH DNA 서열)

SEQ ID NO: 2 (15646 VL DNA 서열)

SEQ ID NO: 3 (15646 VH 단백질 서열)

SEQ ID NO: 4 (15646 VL 단백질 서열)

SEQ ID NO: 5 (15532 VH DNA 서열)

SEQ ID NO: 6 (15532 VL DNA 서열)

SEQ ID NO: 7 (15532 VH 단백질 서열)

SEQ ID NO: 8 (15532 VL 단백질 서열)

SEQ ID NO: 9 (15723 VH DNA 서열)

SEQ ID NO: 10 (15723 VL DNA 서열)

SEQ ID NO: 11 (15723 VH 단백질 서열)

SEQ ID NO: 12 (15723 VL 단백질 서열)

SEQ ID NO: 13 (15595 VH DNA 서열)

SEQ ID NO: 14 (15595 VL DNA 서열)

SEQ ID NO: 15 (15595 VH 단백질 서열)

SEQ ID NO: 16 (15595 VL 단백질 서열)

SEQ ID NO: 17 (15431 VH DNA 서열)

SEQ ID NO: 18 (15431 VL DNA 서열)

SEQ ID NO: 19 (15431 VH 단백질 서열)

SEQ ID NO: 20 (15431 VL 단백질 서열)

SEQ ID NO: 21 (15572 VH DNA 서열)

SEQ ID NO: 22 (15572 VL DNA 서열)

SEQ ID NO: 23 (15572 VH 단백질 서열)

SEQ ID NO: 24 (15572 VL 단백질 서열)

SEQ ID NO: 25 (15011 VH DNA 서열)

SEQ ID NO: 26 (15011 VL DNA 서열)

SEQ ID NO: 27 (15011 VH 단백질 서열)

SEQ ID NO: 28 (15011 VL 단백질 서열)

불변 영역 DNA 및 단백질 서열

SEQ ID NO: 29 (IgHC 불변 영역 DNA 서열)

SEQ ID NO: 30 (IgHC 불변 영역 단백질 서열)

SEQ ID NO: 31 (IgLC 불변 영역 DNA 서열)

SEQ ID NO: 32 (IgLC 불변 영역 단백질 서열)

SEQ ID NO: 33 (IgKC 불변 영역 DNA 서열)

SEQ ID NO: 34 (IgKC 불변 영역 단백질 서열)

SEQ ID NO: 35 (15646/15723 H-CDR1)

SEQ ID NO: 36 (15646 H-CDR2)

SEQ ID NO: 37 (15646 H-CDR3)

SEQ ID NO: 38 (15646 L-CDR1)

SEQ ID NO: 39 (15646 L-CDR2)

SEQ ID NO: 40 (15646/15532/15723/15431 L-CDR3)

SEQ ID NO: 41 (15532 H-CDR1)

SEQ ID NO: 42 (15532/15723 H-CDR2)

SEQ ID NO: 43 (15532 H-CDR3)

SEQ ID NO: 44 (15532/15723/15431 L-CDR1)

SEQ ID NO: 45 (15532/15431 L-CDR2)

SEQ ID NO: 46 (15723 H-CDR3)

SEQ ID NO: 47 (15723/15595 L-CDR2)

SEQ ID NO: 48 (15595 H-CDR1)

SEQ ID NO: 49 (15595 H-CDR2)

SEQ ID NO: 50 (15595 H-CDR3)

SEQ ID NO: 51 (15595 L-CDR1)

SEQ ID NO: 52 (15595 L-CDR3)

SEQ ID NO: 53 (15431 H-CDR1)

SEQ ID NO: 54 (15431 H-CDR2)

SEQ ID NO: 55 (15431 H-CDR3)

SEQ ID NO: 56 (15572 H-CDR1)

SEQ ID NO: 57 (15572 H-CDR2)

SEQ ID NO: 58 (15572 H-CDR3)

SEQ ID NO: 59 (15572 L-CDR1)

SEQ ID NO: 60 (15572 L-CDR2)

SEQ ID NO: 61 (15572 L-CDR3)

SEQ ID NO: 62 (15011 H-CDR1)

SEQ ID NO: 63 (15011 H-CDR2)

SEQ ID NO: 64 (15011 H-CDR3)

SEQ ID NO: 65 (15011 L-CDR1)

SEQ ID NO: 66 (15011 L-CDR2)

SEQ ID NO: 67 (15011 L-CDR3)

SEQ ID NO: 68 (인간 LAG-3)

SEQ ID NO: 69 (시노몰구스 LAG-3)

SEQ ID NO: 70 (래트 LAG-3)

SEQ ID NO: 71 (개 LAG-3)

SEQ ID NO: 72 (마우스 LAG-3)

SEQUENCE LISTING <110> SYMPHOGEN A/S <120> ANTI-LAG-3 ANTIBODIES AND COMPOSITIONS <130> 022675.WO057 <140> <141> <150> 62/407,678 <151> 2016-10-13 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 caggtgcagc tgcagcagtg gggtgccggt ctgctgaagc cttctgaaac tctgtctctg 60 acttgtgccg tctatggtgg atcattcagc ggctactatt ggtcctggat caggcagccc 120 cctggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaaccacc ggggctctac caactacaat 180 ccctctctga agagcagggt gaccatctcc gtggacacat ctaagaatca gttcagcctg 240 aagctgagct ccgtgaccgc cgctgataca gccgtgtact attgcacaag gggggaggaa 300 tgggagtcac tgttctttga ttactggggg caggggacac tggtcacagt ctcgagt 357 <210> 2 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 gaaatcgtcc tgacccagtc ccccgccacc ctgagcctga gccccggaga aagagccacc 60 ctgtcctgcc 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 20 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 21 cagctgcagc tgcaggaaag cggccccggc ctggtgaagc cctctgagac cctgtccctg 60 acatgcaccg tgagcggcga ttccatcagc tcttccagct attactgggg ctggatccgg 120 cagccccccg gcaagggcct ggagtggatc ggcagcatct tctactccgg caatacatat 180 tataatcctt ctctgaagag cagggtgaca atcagcgtgg atacctccaa 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Gly Arg Gln 115 120 125 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln 195 200 205 Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly 225 230 235 240 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala 260 265 270 Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val 275 280 285 Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu 305 310 315 320 Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His 325 330 335 Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr 340 345 350 Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 360 365 Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser 370 375 380 Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 385 390 395 400 Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln 405 410 415 Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser 420 425 430 Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly 435 440 445 His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu 450 455 460 Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro 465 470 475 480 Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln 485 490 495 Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro 500 505 510 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu 515 520 525 <210> 69 <211> 533 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> MOD_RES <222> (74)..(74) <223> Any amino acid <400> 69 Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp 1 5 10 15 Val Ala Pro Val Lys Pro Pro Gln Pro Gly Ala Glu Ile Ser Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln 50 55 60 His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Xaa Ala Pro Gly His Pro Pro 65 70 75 80 Val Pro Gly His Arg Pro Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 Gly Glu Tyr Arg Ala Thr Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Leu Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Thr Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Ser Arg Gly Gln 195 200 205 Gly Arg Val Pro Val Gln Gly Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 Phe Leu Phe Leu Pro His Val Gly Pro Met Asp Ser Gly Leu Trp Gly 225 230 235 240 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Ala Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala 260 265 270 Gly Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val 275 280 285 Gly Thr Gln Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Ala Pro Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Pro Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu 305 310 315 320 Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Ile Cys His Ile Arg 325 330 335 Leu Gln Gly Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr 340 345 350 Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 360 365 Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gln Glu His Phe Val Trp Ser Pro 370 375 380 Leu Asn Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 385 390 395 400 Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu His Gln 405 410 415 Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser 420 425 430 Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Arg Ala Gly 435 440 445 His Leu Pro Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Phe Leu Leu Leu Leu 450 455 460 Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro 465 470 475 480 Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln 485 490 495 Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro 500 505 510 Glu Leu Glu Arg Glu Leu Gly Pro Glu Pro Glu Pro Gly Pro Glu Pro 515 520 525 Glu Pro Glu Gln Leu 530 <210> 70 <211> 525 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 70 Met Arg Gln Asp Leu Phe Leu Asp Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Trp 1 5 10 15 Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Ser Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Glu Phe 35 40 45 Pro His Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Trp Val Thr Trp Gln 50 55 60 His Arg Pro Asp Ser Asp Gln Pro Ala Ser Ile Pro Ala Leu Asp Leu 65 70 75 80 Leu Gln Gly Met Pro Ser Thr Arg Arg His Pro Pro His Arg Tyr Thr 85 90 95 Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu 100 105 110 Leu Ser His Val Gln Leu Glu Lys Arg Gly Pro Gln Arg Gly Asp Phe 115 120 125 Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Thr Arg Lys Asp Ala Gly Glu Tyr His 130 135 140 Ala Phe Val Arg Leu Pro Asp Arg Asp Phe Ser Cys Ser Leu Arg Leu 145 150 155 160 Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Pro Gly Thr Leu Lys 165 170 175 Pro Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg 180 185 190 Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Ser Arg Val Pro Val His 195 200 205 Asn Ser Pro Arg His Tyr Leu Ala Glu Ser Phe Leu Leu Leu Pro Gln 210 215 220 Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg 225 230 235 240 Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Gln Gly Leu 245 250 255 Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val 260 265 270 Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Val Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu 275 280 285 Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Thr 290 295 300 Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu Gln Leu Glu Asn Val Gly Arg Ala 305 310 315 320 Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Arg Gln Leu 325 330 335 Ser Ala Ala Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe 340 345 350 Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gln Lys Leu Leu Cys Glu Val Val Pro Ala 355 360 365 Ser Gly Glu Gly Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Ser Asp Leu Ser Arg 370 375 380 Ser Ser Leu Gly Pro Val Leu Glu Leu Gln Glu Ala Lys Leu Leu Ala 385 390 395 400 Glu Gln Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Lys Leu Leu Gly Ala 405 410 415 Thr Val Tyr Thr Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala Trp Ser Ala Lys Arg 420 425 430 Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Phe Leu Ser Leu Ile Leu 435 440 445 Gly Ala Leu Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His 450 455 460 Leu Trp Arg Arg Gln Leu Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu His 465 470 475 480 Gly Ile Arg Pro Pro Pro Val Gln Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Arg 485 490 495 Glu Pro Glu Thr Glu Met Glu Pro Glu Thr Glu Pro Asp Pro Glu Pro 500 505 510 Gln Pro Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Ser Arg Gln Leu 515 520 525 <210> 71 <211> 476 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 71 Met Trp Glu Val Gln Phe Leu Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Trp 1 5 10 15 Val Ala Pro Val Ala Ala Pro Gly Ser Gly Thr Glu Val Gln Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Asp Val Ser Leu Leu Arg Asn Ala Gly Val Thr Trp Tyr 50 55 60 His Leu Pro Glu Ser Gly Pro Ala Ala Pro Ala Leu Ser Leu Arg Pro 65 70 75 80 Ala Ala Pro Ser Ala Arg Gly Pro Gly Pro Arg Ser Tyr Val Val Leu 85 90 95 Met Arg Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Leu Val Pro Thr Val Asn 100 105 110 Ala Leu Ala Leu Asn Ser Pro Gly Pro Thr Arg Phe Ser Leu Ala Leu 115 120 125 Gln Thr Val Ile Ser Leu Pro His Ser Trp Leu Phe Pro Gly Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Pro Gly Gln Pro Leu Ala Ser Cys Trp Pro Ser Pro His Val 145 150 155 160 Gly Val Gly Cys Val Cys Glu His Pro Pro Phe Ile His Leu Thr Leu 165 170 175 Leu Pro Ala Arg Gln Ser Pro Leu Leu Phe Leu Leu Pro Ser Leu Gln 180 185 190 Pro Gln Cys Ser Ala Ser Leu Tyr Leu Ser Leu Ser Ala Ser Thr Leu 195 200 205 Ala Ser Ser Phe Pro Gly Leu Glu Pro Ser Gly Pro Leu Thr Val Tyr 210 215 220 Thr Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Gly 225 230 235 240 Val Gly Thr Gln Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly 245 250 255 Gly Pro Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Asp Gly Asn Phe Thr Leu Gln 260 265 270 Leu Glu Val Val Asn Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile 275 280 285 His Leu Gln Gly Gln Gln Leu Ser Thr Thr Val Thr Leu Ala Val Ile 290 295 300 Thr Val Thr Pro Lys Ser Ser Gly Leu Pro Gly Asn Leu Arg Lys Leu 305 310 315 320 Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser 325 330 335 Pro Leu Asp Lys Gln Ser Trp Arg Gly Ser Pro Gly Pro Cys Leu Glu 340 345 350 Met Gln Glu Thr Arg Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys His Val Tyr 355 360 365 Gln Ala Glu Arg Leu Leu Gly Thr Ala Val Tyr Leu Ile Asp Pro Ala 370 375 380 Gly Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Gln Gly Val Leu Lys Thr 385 390 395 400 Gly His Leu Ser Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ile Leu Phe Leu Leu Leu 405 410 415 Leu Met Thr Gly Ala Phe Gly Phe Gln Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg 420 425 430 Pro Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Leu Gly Thr His Pro Pro Gln Ala 435 440 445 Gln Ser Lys Ile Gly Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Leu Glu Leu Glu 450 455 460 Pro Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu 465 470 475 <210> 72 <211> 521 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 72 Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp 1 5 10 15 Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser 35 40 45 Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln 50 55 60 His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu 65 70 75 80 His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr 85 90 95 Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu 100 105 110 His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe 115 120 125 Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His 130 135 140 Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu 145 150 155 160 Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys 165 170 175 Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg 180 185 190 Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr 195 200 205 Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln 210 215 220 Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg 225 230 235 240 Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu 245 250 255 Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val 260 265 270 Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu 275 280 285 Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala 290 295 300 Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala 305 310 315 320 Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu 325 330 335 Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe 340 345 350 Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala 355 360 365 Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg 370 375 380 Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala 385 390 395 400 Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala 405 410 415 Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg 420 425 430 Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Val Leu Val Leu Ile Leu 435 440 445 Gly Ala Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Phe Gly Phe His 450 455 460 Trp Trp Arg Lys Gln Leu Leu Leu Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu His 465 470 475 480 Gly Ile Gln Pro Phe Pro Ala Gln Arg Lys Ile Glu Glu Leu Glu Arg 485 490 495 Glu Leu Glu Thr Glu Met Gly Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro 500 505 510 Gln Leu Glu Pro Glu Pro Arg Gln Leu 515 520 <210> 73 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: LAG-3 motif" <400> 73 Lys Ile Glu Glu Leu Glu 1 5 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 74 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (40)

1. 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체가 항체 15532, 15646, 15723, 15595, 15431, 15572 또는 15011과 동일한 인간 LAG-3의 에피토프에 결합하는, 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
2. 제1항에 있어서, 항-LAG-3 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분:
   a) 중쇄 상보성-결정 영역(H-CDR) 3이 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   b) H-CDR 1-3이 각각 SEQ ID NO: 41-43의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   c) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   d) VH가 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   e) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 7 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   f) 경쇄 상보성 결정 영역 1-3(L-CDR1-3)이 각각 SEQ ID NO: 44, 45 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   g) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   h) VL이 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   i) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 8 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   j) H-CDR3이 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하고 L-CDR3이 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   k) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   l) VH가 서열에 있어 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   m) VH가 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
   n) HC가 SEQ ID NO: 7 및 30의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 8 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
3. 제1항에 있어서, 항-LAG-3 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분:
   a) H-CDR3이 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   b) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 35-37의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   c) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   d) VH가 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   e) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 3 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   f) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 38-40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   g) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   h) VL이 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   i) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 4 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   j) H-CDR3이 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하고 L-CDR3이 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   k) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 35-40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   l) VH가 서열에 있어 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   m) VH가 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
   n) HC가 SEQ ID NO: 3 및 30의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 4 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
4. 제1항에 있어서, 항-LAG-3 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분:
   a) H-CDR3이 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   b) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 35, 42 및 46의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   c) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   d) VH가 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   e) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 11 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   f) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 44, 47 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   g) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   h) VL이 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   i) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 12 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   j) H-CDR3이 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하고 L-CDR3이 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   k) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 35, 42, 46, 44, 47 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   l) VH가 서열에 있어 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   m) VH가 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
   n) HC가 SEQ ID NO: 11 및 30의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 12 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
5. 제1항에 있어서, 항-LAG-3 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분:
   a) H-CDR3이 SEQ ID NO: 50의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   b) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 48-50의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   c) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   d) VH가 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   e) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 15 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   f) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 51, 47 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   g) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   h) VL이 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   i) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 16 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   j) H-CDR3이 SEQ ID NO: 50의 아미노산 서열을 포함하고 L-CDR3이 SEQ ID NO: 52의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   k) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 47 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   l) VH가 서열에 있어 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   m) VH가 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
   n) HC가 SEQ ID NO: 15 및 30의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 16 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
6. 제1항에 있어서, 항-LAG-3 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분:
   a) H-CDR3이 SEQ ID NO: 55의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   b) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 53-55의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   c) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   d) VH가 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   e) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 19 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   f) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 44, 45 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   g) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   h) VL이 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   i) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 20 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   j) H-CDR3이 SEQ ID NO: 55의 아미노산 서열을 포함하고 L-CDR3이 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   k) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 53, 54, 55, 44, 45 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   l) VH가 서열에 있어 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   m) VH가 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
   n) HC가 SEQ ID NO: 19 및 30의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 20 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
7. 제1항에 있어서, 항-LAG-3 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분:
   a) H-CDR3이 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   b) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 56-58의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   c) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   d) VH가 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   e) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 23 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   f) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 59-61의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   g) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   h) VL이 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   i) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 24 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   j) H-CDR3이 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 포함하고 L-CDR3이 SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   k) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 56-61의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   l) VH가 서열에 있어 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   m) VH가 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
   n) HC가 SEQ ID NO: 23 및 30의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 24 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
8. 제1항에 있어서, 항-LAG-3 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분:
   a) H-CDR3이 SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   b) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 62-64의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   c) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   d) VH가 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   e) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 27 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   f) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 65-67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   g) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   h) VL이 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   i) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 28 및 32의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   j) H-CDR3이 SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열을 포함하고 L-CDR3이 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   k) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 62-67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
   l) VH가 서열에 있어 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
   m) VH가 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
   n) HC가 SEQ ID NO: 27 및 30의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 28 및 32의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
9. 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체가 하기의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함하는, 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
   a) 각각 SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 및 40;
   b) 각각 SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 및 40;
   c) 각각 SEQ ID NO: 35, 42, 46, 44, 47, 및 40;
   d) 각각 SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 47, 및 52;
   e) 각각 SEQ ID NO: 53, 54, 55, 44, 45, 및 40;
   f) 각각 SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60, 및 61; 또는
   g) 각각 SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66, 및 67.
10. 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체가 하기의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
    a) 각각 SEQ ID NO: 7 및 8;
    b) 각각 SEQ ID NO: 3 및 4;
    c) 각각 SEQ ID NO: 11 및 12;
    d) 각각 SEQ ID NO: 15 및 16;
    e) 각각 SEQ ID NO: 19 및 20;
    f) 각각 SEQ ID NO: 23 및 24; 또는
    g) 각각 SEQ ID NO: 27 및 28.
11. 하기를 포함하는 항-LAG-3 항체:
    a) SEQ ID NO: 7 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 8 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC;
    b) SEQ ID NO: 3 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 4 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC;
    c) SEQ ID NO: 11 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 12 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC;
    d) SEQ ID NO: 15 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 16 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC;
    e) SEQ ID NO: 19 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 20 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC;
    f) SEQ ID NO: 23 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 24 및 34의 아미노산 서열을 갖는 LC; 또는
    g) SEQ ID NO: 27 및 30의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 SEQ ID NO: 28 및 32의 아미노산 서열을 갖는 LC.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 부분이 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 성질을 갖는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) 20 μg/mL의 농도에서, A375 세포 상의 인간 MHC 클래스 II에 대한 인간 LAG-3의 결합을 유세포분석 경쟁 검정에 의해 측정시 음성 대조군 항체와 비교하여 85% 넘게 감소시키고;
    b) 20 μg/mL의 농도에서, A375 세포 상의 인간 MHC 클래스 II에 대한 인간 LAG-3의 결합을 유세포분석 경쟁 검정에 의해 측정시 음성 대조군 항체와 비교하여 35% 내지 85% 감소시키고;
    c) Jurkat 세포 상에 발현된 인간 LAG-3 및 Raji 세포 상에 발현된 인간 MHC 클래스 II 사이의 결합을 차단하고;
    d) 유세포분석에 의해 측정시 0.1 nM 이하의 EC₅₀으로 인간 LAG-3에 결합하고;
    e) 유세포분석에 의해 측정시 0.3 nM 이하의 EC₅₀으로 시노몰구스 LAG-3에 결합하고;
    f) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 3.0 x 10^-8 이하의 K_D로 인간 LAG-3에 결합하고;
    g) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 1.5 x 10^-7 이하의 K_D로 시노몰구스 LAG-3에 결합하고;
    h) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 3.5 x 10^-8 이하의 K_D로 마우스 LAG-3에 결합하고;
    i) 스태필로코쿠스 엔테로톡신 B(SEB)로 처리된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 IL-2 생산을 자극하고;
    j) 인간 T 세포에서 LAG-3의 세포 수준을 감소시키고;
    k) 인간 T 세포의 배양물에서 LAG-3의 가용성 수준을 감소시키고;
    l) 생체내에서 종양 성장 회귀를 유도하고;
    m) 생체내에서 종양 성장을 지연시키고;
    n) 항체 25F7-Lag3.5와 동일한 인간 LAG-3의 에피토프에 결합하지 않는다.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 LAG-3와의 결합에 대해 항체 15011과 경쟁하는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분.
14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 LAG-3와의 결합에 대해 항체 15572와 경쟁하는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분.
15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 LAG-3와의 결합에 대해 항체 15431과 경쟁하는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분.
16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 부분이 하기를 갖는 인간 LAG-3의 에피토프에 결합하는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 H85, P86, A87, P89, S91, W92, 및 G93;
    b) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 A40, Q41, P43, P46, P49, D52, T62, Q64, H65, Q66, P67, D68, G93, P94, P96, R98, Y99, T100, V101, P106, G107, R119, E124, R129, G130, D131, S133, R137, P138, D143, R148, 및 R163;
    c) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 A40, Q41, P43, P46, P49, D52, T62, Q64, H65, Q66, P67, D68, P96, Y99, T100, V101, P106, G107, R119, E124, R129, G130, D131, S133, R137, P138, D143, R148, 및 R163; 또는
    d) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 G107, L109, R110, 및 S111.
17. 제1항 또는 제12항에 있어서, 항체 또는 부분이 SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 98-105를 갖는 에피토프에 결합하는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분.
18. 제17항에 있어서, 상기 항체 또는 부분이 하기를 갖는 에피토프에 결합하는 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 78-105 및 123-131;
    b) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 23-30, 40-66, 88-105, 123-137, 및 148-152; 또는
    c) SEQ ID NO: 68의 아미노산 잔기 23-30, 40-66, 98-105, 118-137, 및 148-161.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 아이소형 IgG인 항-LAG-3 항체.
20. 제19항에 있어서, 항체가 아이소형 IgG 아부류 IgG₁인 항-LAG-3 항체.
21. 제20항에 있어서, 항체가 F_C 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 항-LAG-3 항체.
22. 제21항에 있어서, 항체가 IMGT^® 넘버링 체계에 따라 넘버링된 중쇄 아미노산 위치 228, 234 및 235 중 하나 이상에 돌연변이를 포함하는 항-LAG-3 항체.
23. 제22항에 있어서, 위치 234 및 235의 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘 모두가 Leu에서 Ala로 돌연변이되고/거나, 위치 228의 아미노산 잔기가 Ser에서 Pro로 돌연변이되는 항-LAG-3 항체.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
25. 제24항에 있어서, 하나의 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 약학적 조성물.
26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항-LAG-3 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 둘 모두를 포함하는 분리된 핵산 분자.
27. 제26항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 벡터가 발현 조절 서열을 추가로 포함하는, 벡터.
28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항-LAG-3 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포.
29. 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 방법으로서, 제28항에 따른 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포를 상기 항체 또는 부분의 발현에 적합한 조건 하에 배양시키고, 생성된 항체 또는 부분을 분리시키는 것을 포함하는, 방법.
30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 두 별개의 항-LAG-3 항체의 항원-결합 부분들을 포함하는 이중특이적 결합 분자.
31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분, 제24항 또는 제25항에 따른 약학적 조성물, 또는 제30항에 따른 이중특이적 결합 분자를 LAG-3-관련 장애를 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법.
32. 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 부분, 제24항 또는 제25항에 따른 약학적 조성물, 또는 제30항에 따른 이중특이적 결합 분자를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
33. 제32항에 있어서, 암이 피부, 폐, 장, 결장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁, 및 췌장으로 구성된 군으로부터 선택되는 조직에서 유래하는 방법.
34. 제32항에 있어서, 암이 섬유육종, 비소세포폐암, 흑색종, 아교모세포종, 신경아교육종, 또는 결장직장암인 방법.
35. 면역을 향상시킬 필요가 있는 환자에서 면역을 향상시키는 방법으로서, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분, 제24항 또는 제25항에 따른 약학적 조성물, 또는 제30항에 따른 이중특이적 결합 분자를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 면역자극제, 백신, 화학요법제, 항신생물제, 항혈관형성제, 티로신 키나제 억제제, LAG-3 경로 억제제, 또는 방사선 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
37. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 레티노산, 페닐부티레이트, 올-트랜스-레티노산 및 활성 형태 비타민 D로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
38. 하기를 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항-LAG-3 항체 또는 항원-결합 부분의 용도:
    a) LAG-3-관련 장애를 갖는 환자의 치료;
    b) 환자의 암 치료; 또는
    c) 면역을 향상시킬 필요한 있는 환자에서 면역 향상.
39. 하기에 사용하기 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) LAG-3-관련 장애를 갖는 환자의 치료;
    b) 환자의 암 치료; 또는
    c) 면역을 향상시킬 필요한 있는 환자에서 면역 향상.
40. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 부분을 포함하는 제조 물품으로서, 상기 제조 물품이 하기에 적합한, 제조 물품:
    a) LAG-3-관련 장애를 갖는 환자의 치료;
    b) 환자의 암 치료; 또는
    c) 면역을 향상시킬 필요한 있는 환자에서 면역 향상.