KR20230081015A

KR20230081015A - 신규한 히알루론산 생산 균주 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법

Info

Publication number: KR20230081015A
Application number: KR1020210168676A
Authority: KR
Inventors: 윤정준; 전종민
Original assignee: 한국생산기술연구원
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2023-06-07
Anticipated expiration: 2041-11-30
Also published as: KR102797288B1

Abstract

본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid; HA)을 생산하는 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus) 균주 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 신규 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주는 모균주인 S. zooepidemicus KCCM 40305 균주에 비해 균주의 성장 속도가 빠르고 성장률이 우수하며, 히알루론산 생산량이 모균주 대비 에서 현저히 우수한 바, 많은 기업에서 요구하는 고순도의 히알루론산을 생산하고 용혈성이 제거된 균주를 제공함으로써 기존의 공정 대비 저비용으로 고농도의 히알루론산 대량 생산 기술에 적용할 수 있어 히알루론산을 이용한 제품 및 관련 산업 활성화에 기여할 수 있다.

Description

신규한 히알루론산 생산 균주 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법{Method for producing Polyhydroxyalkanoate from mixed alkanes}

본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid; HA)을 생산하는 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus) 균주 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법에 관한 것이다.

히알루론산(hyaluronic acid; HA)은 화장품의 성분, 노화 방지 및 입술 주사용 피부 필러, 점조수술법, 관절염 관절의 윤활 물질 등으로 사용할 수 있는 고분자 화합물 소재로써 의약품, 화장품, 의료기기, 건강기능식품, 기능성 소재 등 여러 분야의 제품 생산에 활용되고 있으며 이와 관계된 산업군이 광범위하다.

생물 공정에 기반한 히알루론산 생산에는 대표적으로 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.) 균주가 이용되고 있으나, 상기 균주는 적혈구를 파괴하는 용혈성을 가지고 있어 산업화가 어려운 문제점이 있었다. 이에, 스트렙토코커스 속 균주를 히알루론산 대량 생산 공정에 이용하기 위해서는 상기한 용혈성 특성을 제거하는 것이 필수적이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus) 균주에서 용혈성이 제거되고 히알루론산 생산능이 증가한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. 한국공개특허 제10-2020-0048312호

본 발명의 하나의 목적은 히알루론산 히알루론산(hyaluronic acid; HA) 생산능을 갖는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스-JJY01(Streptococcus zooepidemicus-JJY01) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 히알루론산 생산능을 갖는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스-JJY01 균주를 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는, 히알루론산 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 히알루론산 생산능을 갖는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스-JJY01 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 히알루론산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 히알루론산 생산능을 갖는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스-JJY01(Streptococcus zooepidemicus-JJY01) 균주를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 2021년 10월 8일자로 한국미생물보존센터에 수탁번호 KFCC11903P로 기탁된 균주일 수 있다.

본 발명에서 용어, "스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus)"는 Lancefield 그룹 C 스트렙토코커스로서 여러 동물과 인간을 감염시키는 점막 공생 및 기회주의 병원체로서, 발효 부산물로 히알루론산 및 젖산을 생산하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 신규 균주는 수탁번호 KCCM 40305로 기탁된 S. zooepidemicus 균주를 EMS(Ethyl-methane-sulfonate) 처리하여 수득한 변이주로, 모균주인 S. zooepidemicus KCCM 40305에 비해 성장이 우수하면서 용혈성이 없고 히알루론산 생산능이 증가한 것에 의의가 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 균주는 Blood agar법을 이용하여 용혈성이 없는 것을 확인하였고(도 1), 배양 중 균주 성장 수준을 OD600 nm에서 흡광도를 측정하여 확인한 결과 배양 24시간 후 본 발명의 균주와 모균주는 각각 1.78과 0.05, 배양 72시간 후 본 발명의 균주와 모균주는 각각 3.01와 1.34로 본 발명의 균주가 균주 성장이 우수함을 확인하였으며(도 2), 동일한 배지 조건에서 본 발명의 균주가 모균주 대비 히알루론산 생산량이 우수함을 확인하였다(표 1).

본 발명의 다른 양태는 본 발명의 균주를 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는, 히알루론산 생산 방법을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KFCC11903P로 기탁된 균주일 수 있다.

본 발명에서, 용어 "배양"은 본 발명의 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "배지"는 본 발명의 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 발명의 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 펩톤, 트립톤, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 균주의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 배지는 (NH₄)₂SO₄ 0.01 내지 0.10 %, 글루코스 10 내지 150 g/L, 효모추출물 1 내지 10 g/L, 펩톤 0 내지 30 g/L를 첨가한 M9 배지일 수 있고, 구체적으로 (NH₄)₂SO₄ 0.02 내지 0.07 %, 글루코스 80 내지 120 g/L, 효모추출물 2 내지 7 g/L, 펩톤 13 내지 17 g/L를 첨가한 M9 배지일 수 있다. 상기 M9 배지의 구체적인 조성은 공지의 데이터베이스(http://cshprotocols.cshlp.org/)를 통해 확인할 수 있으며, 일예로 100 mL 당 M9 salts(5X) 20 ml, 20% 글루코스 2 ml, 1M MgSO₄ 200 uL, 1M CaCl₂ 10 uL 및 H₂O 78 mL을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 배양은 전술한 배지에서 배양하거나, 혹은 배양 시작 시점으로부터 24 내지 72시간 뒤 배양액에 i) 탄소 및 효모추출물; 또는 ii) 아미노산을 추가로 첨가(feeding)한 후 더 배양하는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 i) 탄소 및 효모추출물은 탄소 1 내지 200 g/L 및 효모추출물 1 내지 10 g/L로 첨가되는 것일 수 있고, 구체적으로 탄소 80 내지 120 g/L 및 효모추출물 2 내지 7 g/L로 첨가되는 것일 수 있다.

상기 ii) 아미노산은 트립톤일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 트립톤은 1 내지 30 g/L로 첨가되는 것일 수 있고, 구체적으로 13 내지 17 g/L로 첨가되는 것일 수 있다.

본 발명의 배양에서 배양 온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 배양에 의하여 생산된 히알루론산은 배지 중으로 분비될 수 있다.

본 발명의 히알루론산 생산 방법은, 본 발명의 균주를 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 본 발명의 균주로부터 생산되는 히알루론산 생산량은 배양 시작 시점으로부터 72시간 이후 기준으로 4 g/L 이상, 5 g/L 이상, 6 g/L 이상, 7 g/L 이상, 8 g/L 이상, 9 g/L 이상, 10 g/L 이상, 11 g/L 이상일 수 있으며, 특히 14 g/L 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 균주는 배양시 탄소 및 효모추출물 추가 feeding에 따라 히알루론산 생산량이 증가하였다(도 3).

또한, 아미노산으로 트립톤을 추가 feeding시에 히알루론산 생산량은 11 g/L로 feeding 전 3 g/L에 비해 현저히 증가한 것을 확인하였으며(도 4), 트립톤 60 g/L를 추가 feeding하고 72시간 동안 배양한 결과 히알루론산 생산량이 13 g/L 이상으로 나타났고, 트립톤 120 g/L을 추가 feeding하고 72시간 동안 배양한 경우 가장 높은 히알루론산 생산량(14.6 g/L)을 나타냄을 확인하였다(도 5).

즉, 본 발명의 배양은 배양 중에 아미노산을 추가 feeding할 수 있으며, 예컨대, 아미노산으로서 트립톤을 추가 feeding 하는 경우 트립톤을 60 g/L 이상의 농도로 첨가하고 72시간 이상 배양시 히알루론산 생산량이 13 g/L 이상임을 알 수 있다.

본 발명의 히알루론산 생산 방법은, 상기 배양된 배지 또는 균주로부터 히알루론산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 회수는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 히알루론산을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 히알루론산을 회수할 수 있다.

또한, 본 발명의 히알루론산 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 활성탄을 이용한 세척 공정으로 히알루론산을 정제할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 본 발명의 히알루론산 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 하나의 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 히알루론산 생산용 조성물을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

상기 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 포함하며, 추가로 상기 균주의 히알루론산 생산을 증대시킬 수 있을 구성을 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명의 신규 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus)-JJY01 균주는 모균주인 S. zooepidemicus KCCM 40305 균주에 비해 균주의 성장 속도가 빠르고 성장률이 우수하며, 히알루론산 생산량이 모균주 대비 에서 현저히 우수한 바, 많은 기업에서 요구하는 고순도의 히알루론산을 생산하고 용혈성이 제거된 균주를 제공함으로써 기존의 공정 대비 저비용으로 고농도의 히알루론산 대량 생산 기술에 적용할 수 있어 히알루론산을 이용한 제품 및 관련 산업 활성화에 기여할 수 있다.

도 1은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus) KCCM 40305 균주에 EMS(Ethyl-methane-sulfonate) 처리 전후 용혈성을 확인한 결과이다.
도 2는 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주와 S. zooepidemicus KCCM 40305의 균주 성장을 비교한 결과이다.
도 3은 탄소 및 효모추출물 추가 feeding에 따른 히알루론산 생산량을 나타낸 도이다.
도 4는 트립톤 추가 feeding에 따른 히알루론산 생산량을 나타낸 도이다.
도 5는 배지 내 트립톤 농도 및 배양 시간에 따른 히알루론산 생산량을 나타낸 결과이다.
도 6은 생산된 히알루론산을 정제한 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 균주에 EMS(Ethyl-methane-sulfonate) 처리

히알루론산(hyaluronic acid; HA) 생산 균주인 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus) KCCM 40305는 동결 스톡을 TBS(Tryptic soy broth) 고체 배지에 도말하고 단일 콜로니를 채취한 후 5ml TSB 액체 배지에 1%(V/V) 접종하여 전배양하였다. S. zooepidemicus KCCM 40305의 용혈성을 제거하고 랜덤 돌연변이를 주기 위해, 전배양된 균주를 TSB 배지 10ml에 1%(v/v) 접종하고 24시간 동안 배양한 후 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. 수집된 세포를 10ml의 PBS(Phos히알루론산te-buffered saline)로 세척한 후 10ml의 0.2% EMS(Ethyl-methane-sulfonate) 용액을 처리하고 1시간 동안 배양하였다.

EMS 처리된 균주를 Blood agar에 도말하여 37℃의 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 용혈성이 제거된 콜로니를 확인하여, 최종적으로 용혈성이 없는 콜로니를 선별하였다(도 1).

상기 선별된 콜로니로부터 분리한 균주를 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 로 명명하였다.

실시예 2. Streptococcus zooepidemicus -JJY01 균주와 S. zooepidemicus KCCM 40305의 성장 및 히알루론산 생산 비교

상기 실시예 1에서 분리된 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주 및 대조군으로 S. zooepidemicus KCCM 40305 균주를 이용하여 균주 성장 및 히알루론산 생산능을 비교하였다. 배양에 사용된 배지는 M9 배지(100 mL 당 M9 salts(5X) 20 ml, 20% 글루코스 2 ml, 1M MgSO₄ 200 uL, 1M CaCl₂ 10 uL 및 H₂O 78 mL)에 탄소원으로 글루코스 30~50 g/L, 아미노산으로 5 g/L의 효모 추출물과 0~15g/L의 펩톤, 0~15g/L의 트립톤이 첨가된 것을 사용하였다. 배지 5 ml에 1%의 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주 및 대조군으로 S. zooepidemicus KCCM 40305 균주를 각각 접종한 후 72시간 동안 34℃의 배양기에서 배양하여 히알루론산을 생산하였다.

생산된 배양액 내 히알루론산을 분석하기 위해 carbazole assay를 수행하였다. 먼저 정제된 히알루론산을 이용하여 표준 곡선을 그린 후 배양액 내의 히알루론산 생산량을 측정하기 위해 균주가 포함된 배양액을 3500 rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상등액의 8배(v/v)의 에탄올을 첨가하여 30분 동안 원심분리로 히알루론산을 침전시켰다. 상기 방법을 2회 반복 수행하여 배양액 내의 당과 불순물을 제거하였다. carbazole 비색 반응을 위해, 침전된 히알루론산 0.5 ml에 0.025 M sodium tetraborate·10H₂O가 용해된 H₂SO₄ 시약 2.5 ml을 첨가한 후 99℃에서 10분간 가열하고, 이에 0.125% carbazole 시약 0.1 ml을 첨가하여 15분간 가열 후 반응을 종결하였다. 반응을 마친 시료를 UV-vis spectrophotometer를 이용하여 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 표준 곡선에 의해 생산된 히알루론산 농도를 측정하였다.

배양 후 24 시간 후 OD600 nm에서 흡광도를 측정한 결과, EMS 처리한 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주(40305 mutant)와 모균주인 S. zooepidemicus KCCM 40305 균주는 각각 1.78과 0.05로 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주의 성장이 더 우세하였다. 또한 배양이 끝난 뒤인 72 시간 후의 흡광도 측정 결과 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주(40305 mutant)와 모균주는 각각 3.01와 1.34로 최종 성장도 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주가 더 높았다(도 2).

또한, 동일한 배지 조건에서 모균주와 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주(40305 mutant)의 히알루론산 생산량을 확인한 결과 모균주의 히알루론산 생산량은 평균 2.04 g/L이고, Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주의 히알루론산 생산량은 평균 2.88 g/L이었다(표 1). 특히, Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주는 글루코스 30~50 g/L, 5 g/L의 효모 추출물과 15 g/L의 트립톤이 첨가된 배지에서 히알루론산 생산량이 7.05 g/L로 가장 우수한 것을 확인하였다.

	N	Carbon (g/L)		base media M9+NH₄(0.05%)			total volume 5 ml		히알루론산 생산량 (g/L)	Carbon 소모량 (g/L)	전환율 (히알루론산 g/ 글루코스 g)
		Carbon (g/L)		Amino acid (g/L)			O.D.
		글루코스	녹말	효모추출물	펩톤	트립톤	initial	final (72h)
S. zooepidemicus KCCM 30405 (Control)	1	50	o	5	15	0	0.5	1.27	2.86	34.46	0.08
	2	50	o	5	0	15	0.5	3.68	5.52	34.60	0.16
	3	50	x	5	15	0	0	0.06	0.20	0.00	0.00
	4	50	x	5	0	15	0	0.13	0.20	0.00	0.00
	5	30	o	5	15	0	0.53	0.97	2.17	21.63	0.10
	6	30	o	5	0	15	0.49	1.39	2.40	21.38	0.11
	7	30	x	5	15	0	0	3.13	2.77	20.75	0.13
	8	30	x	5	0	15	0	0.38	0.20	21.00	0.01
S. Zooepidemicus-JJY01 (Mutant)	9	50	o	5	15	0	0.5	3.86	1.46	34.27	0.04
	10	50	o	5	0	15	0.5	4.06	1.47	34.44	0.04
	11	50	x	5	15	0	0	0.65	0.20	34.27	0.01
	12	50	x	5	0	15	0	3.72	7.05	34.82	0.20
	13	30	o	5	15	0	0.5	4.37	4.48	20.98	0.21
	14	30	o	5	0	15	0.5	4.87	3.38	20.97	0.16
	15	30	x	5	15	0	0	4.07	3.08	21.19	0.15
	16	30	x	5	0	15	0	3.72	1.93	20.75	0.09

실시예 3. 히알루론산 생산 공정 최적화(7L scale)

Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주를 이용한 히알루론산 생산시 배지 조성 및 배양 조건은 최적화하기 위해 다음의 배지 조성 및 배양 조건으로 배양하고, 시간당 히알루론산 생산량, 시간별 균주 성장, feeding 에 따른 히알루론산 생산량 변화를 확인하였다:

#1: (NH₄)₂SO₄ 0.05 %, 글루코스 100g/L, 효모추출물 5g/L, 펩톤 15g/L를 첨가한 M9 배지에서 34℃, 72 시간 동안 배양.

#2: (NH₄)₂SO₄ 0.05 %, 글루코스 100g/L, 효모추출물 5g/L, 펩톤 15g/L를 첨가한 M9 배지에서 34℃, 72 시간 동안 배양한 후, 배양액에 탄소 100g/L 및 효모추출물 5g/L을 추가로 feeding하고 24h 동안 배양.

#3: (NH₄)₂SO₄ 0.05 %, 글루코스 100g/L, 효모추출물 5g/L, 펩톤 15g/L를 첨가한 M9 배지에서 34℃, 36 시간 동안 배양한 후, 배양액에 15g/L 트립톤을 추가로 feeding하고 40h 이상 배양.

그 결과, #1과 같이 탄소 및 효모추출물 추가 feeding에 따라 히알루론산 생산량이 증가하였으며(도 3), #3과 같이 트립톤 추가 feeding시에 히알루론산 생산량은 11 g/L로 feeding 전 3 g/L에 비해 현저히 증가한 것을 확인하였다(도 4).

또한, 트립톤 추가 feeding시 히알루론산 생산량이 증가하는 것을 확인함에 따라, 배지 내 트립톤 농도(15, 30, 60, 120 g/L) 및 배양 시간(24, 72 시간)에 따른 히알루론산 생산량을 확인한 결과, 트립톤 60 g/L를 추가 feeding하고 72시간 동안 배양한 결과 히알루론산 생산량이 13 g/L 이상으로 나타났고, 트립톤 120 g/L 첨가시에 가장 높은 히알루론산 생산량(14.6 g/L)을 나타냄을 확인하였다(도 5).

상기 실시예의 결과로 생산된 히알루론산을 정제한 결과는 도 6에 도시하였다.

본 발명에 따른 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주는 한국미생물보존센터에 2021년 10월 8일자로 수탁번호 KFCC11903P로 기탁되었다.

상기 실시예의 결과에 따라, 신규 균주인 Streptococcus zooepidemicus-JJY01 균주는 모균주인 S. zooepidemicus KCCM 40305 균주에 비해 균주의 성장 속도가 빠르고 성장률이 우수하며, 히알루론산 생산량이 모균주 대비 에서 현저히 우수한 바, 많은 기업에서 요구하는 고순도의 히알루론산을 생산하고 용혈성이 제거된 균주를 제공함으로써 기존의 공정 대비 저비용으로 고농도의 히알루론산 대량 생산 기술에 적용할 수 있어 히알루론산을 이용한 제품 및 관련 산업 활성화에 기여할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11903P

20211008

Claims

히알루론산 생산능을 갖는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스-JJY01(Streptococcus zooepidemicus-JJY01) 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KFCC11903P로 기탁된 것인, 균주.
히알루론산 생산능을 갖는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스-JJY01 균주를 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는, 히알루론산 생산 방법.
제3항에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KFCC11903P로 기탁된 것인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 배양은 (NH₄)₂SO₄ 0.01 내지 0.10 %, 글루코스 10 내지 150 g/L, 효모추출물 1 내지 10 g/L, 펩톤 0 내지 30 g/L를 첨가한 M9 배지에서 배양하는 것인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 배양은 배양 시작 시점으로부터 24 내지 72시간 뒤 배양액에 i) 탄소 1 내지 200 g/L 및 효모추출물 1 내지 10 g/L; 또는 ii) 1 내지 30 g/L 아미노산을 추가로 첨가한 후 더 배양하는 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 ii)의 아미노산은 트립톤인 것인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 균주의 배양 온도는 20 내지 40℃이고, 배양 시간은 10 내지 120 시간인 것인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 균주로부터 생산되는 히알루론산 생산량은 11 g/L 이상인 것인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 히알루론산 생산량은 배양 시작 시점으로부터 72시간 이후의 생산량인 것인, 방법.
히알루론산 생산능을 갖는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스-JJY01 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 히알루론산 생산용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KFCC11903P로 기탁된 것인, 조성물.