KR20230059649A - Micro-nano scale hierarchical pattern based cell culture platform inducing maturation - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 마이크로-나노 스케일의 계층적 패턴을 가지는 배양 플랫폼 및 이를 활용한 세포 배양/성숙법에 관한 것이다.The present invention relates to a culture platform having a micro-nano scale hierarchical pattern and a cell culture/maturation method using the same.
표면의 단단함, 탄성, 구조 등의 특징은 세포의 부착, 생존, 분화, 성숙 등의 규제, 조절에 중요한 역할을 한다. 특히 실제 세포의 환경을 모사하는 마이크로-, 나노- 스케일의 표면구조가 세포에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구가 활발히 진행되어왔다. Characteristics such as surface hardness, elasticity, and structure play an important role in regulating and regulating cell adhesion, survival, differentiation, and maturation. In particular, studies have been actively conducted on how micro- and nano-scale surface structures that simulate real cell environments affect cells.
실제 인체의 대부분 구조는 계층적 구조를 지니고 있는 것으로 알려져 있다. 이에, 단일 스케일에서의 세포의 거동을 관찰하는 것을 뛰어넘어 계층적 구조에서의 세포의 세포역학신호변환(mechanotransduction)을 확인하는 연구에 대한 전세계적인 관심이 지대하다. 계층적 구조는 복잡한 다중 스케일의 체내 조직을 모사할 수 있고, 세포의 점층적/다층적인 세포역학신호변환을 통한 각 구조의 역할을 규명할 수 있다는 점에서 중요성을 가진다. It is known that most structures of the actual human body have a hierarchical structure. Accordingly, there is great worldwide interest in research that goes beyond observing cell behavior on a single scale and confirms cell mechanotransduction in a hierarchical structure. Hierarchical structures are important in that they can simulate complex multi-scale body tissues and identify the role of each structure through gradual/multi-layered cellular dynamics signal transduction of cells.
따라서, 다양한 방향에서의 세포 자극이나 계층적 구조에서의 세포의 세포역학신호변환을 확인할 수 있는 배양 플랫폼을 연구, 개발하는 것이 필요한 실정이다.Therefore, it is necessary to research and develop a culture platform capable of confirming cell dynamics signal conversion of cells in a hierarchical structure or cell stimulation in various directions.
본 발명자들은 세포의 부착 및 성숙 유도를 효과적으로 조절하기 위한 세포 배양 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 마이크로-나노 패턴의 구조적 최적화에 의한 계층적 구조를 확립하고 이에 따른 세포의 부착 및 성숙 유도를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have made intensive research efforts to develop a cell culture method for effectively regulating cell adhesion and maturation induction. As a result, the present invention was completed by establishing a hierarchical structure by structural optimization of micro-nano patterns and identifying cell attachment and maturation induction accordingly.
따라서, 본 발명의 목적은 마이크로 패턴 및 나노 패턴이 계층적으로(hierarchical) 형성된 세포 배양용 기판을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a substrate for cell culture on which micropatterns and nanopatterns are hierarchically formed.
본 발명의 다른 목적은 마이크로 패턴 및 나노 패턴이 계층적으로 형성된 세포 배양용 기판에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cell culture method comprising the step of culturing cells on a cell culture substrate on which micropatterns and nanopatterns are hierarchically formed.
본 발명자들은 세포의 부착 및 성숙 유도를 효과적으로 조절하기 위한 세포 배양 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 마이크로-나노 패턴의 구조적 최적화에 의한 계층적 구조를 확립하고 이에 따른 세포의 부착 및 성숙 유도를 규명하였다.The present inventors have made intensive research efforts to develop a cell culture method for effectively regulating cell adhesion and maturation induction. As a result, a hierarchical structure was established by structural optimization of micro-nano patterns, and cell adhesion and maturation induction were investigated accordingly.
본 발명은 마이크로 패턴 및 나노 패턴이 계층적으로 형성된 세포 배양용 기판 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a cell culture substrate on which micropatterns and nanopatterns are hierarchically formed and a cell culture method using the same.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로 패턴 및 나노 패턴이 계층적으로(hierarchical) 형성된 세포 배양용 기판을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a substrate for cell culture in which micropatterns and nanopatterns are formed hierarchically.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 마이크로 패턴은 규칙 또는 불규칙한 주름(wrinkle) 구조로 형성된 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the micropattern may be formed in a regular or irregular wrinkle structure.
본 발명에서 "주름(wrinkle) 구조"는 마루(볼록)와 골(오목)이 주기적으로 반복되는 형태를 의미한다.In the present invention, "wrinkle structure" means a form in which peaks (convex) and valleys (concave) are periodically repeated.
본 발명의 주름 구조는 열수축 공정에 의해 마이크로 패턴화된 단위 구조(주름)의 집합이 기판 표면 상에 형성되도록 제작될 수 있다.The pleated structure of the present invention can be manufactured so that a set of micro-patterned unit structures (wrinkles) is formed on the substrate surface by a heat shrinking process.
본 발명의 주름 구조는 형성된 주름의 방향에 따라 세포가 배열될 수 있도록 가이던스(guidance) 역할을 하고, 이로 인해 세포의 길이가 길어지는 효과가 발휘될 수 있다.The wrinkle structure of the present invention serves as a guide to arrange the cells according to the direction of the formed wrinkles, and as a result, the length of the cells can be increased.
상기 주름 구조의 파장(wavelength)은 1 μm 내지 100 μm, 5 μm 내지 100 μm, 10 μm 내지 100 μm, 20 μm 내지 100 μm, 30 μm 내지 100 μm, 40 μm 내지 100 μm, 50 μm 내지 100 μm, 60 μm 내지 100 μm, 70 μm 내지 100 μm, 80 μm 내지 100 μm, 90 μm 내지 100 μm, 1 μm 내지 90 μm, 1 μm 내지 80 μm, 1 μm 내지 70 μm, 1 μm 내지 60 μm, 5 μm 내지 60 μm, 10 μm 내지 60 μm, 15μm 내지 60 μm, 20 μm 내지 60 μm, 25 μm 내지 60 μm, 30 μm 내지 60 μm, 35 μm 내지 60 μm, 40 μm 내지 60 μm, 45 μm 내지 60 μm, 50 μm 내지 60 μm, 55 μm 내지 60 μm, 1 μm 내지 55 μm, 1 μm 내지 50 μm, 1 μm 내지 45 μm, 1 μm 내지 40 μm, 1 μm 내지 35 μm, 1 μm 내지 30 μm, 1 μm 내지 25 μm, 1 μm 내지 20 μm, 1 μm 내지 15 μm, 1 μm 내지 10 μm, 1 μm 내지 5 μm, 5 μm 내지 10 μm, 10 μm 내지 15 μm, 15 μm 내지 20 μm, 20 μm 내지 25 μm, 25 μm 내지 30 μm, 30 μm 내지 35 μm, 35 μm 내지 40 μm, 40 μm 내지 45 μm, 45 μm 내지 50 μm, 50 μm 내지 55 μm, 55 μm 내지 60 μm, 60 μm 내지 65 μm, 65 μm 내지 70 μm, 70 μm 내지 75 μm, 75 μm 내지 80 μm, 80 μm 내지 85 μm, 85 μm 내지 90 μm, 90 μm 내지 95 μm, 또는 95 μm 내지 100 μm일 수 있다. 상술한 파장 내에서 발명을 실시하는 경우, 세포 크기, 방향성 및 배열 양상을 마이크로 스케일 내 넓은 범위에서 체계적으로 통제 가능하다.The wavelength of the wrinkle structure is 1 μm to 100 μm, 5 μm to 100 μm, 10 μm to 100 μm, 20 μm to 100 μm, 30 μm to 100 μm, 40 μm to 100 μm, 50 μm to 100 μm , 60 μm to 100 μm, 70 μm to 100 μm, 80 μm to 100 μm, 90 μm to 100 μm, 1 μm to 90 μm, 1 μm to 80 μm, 1 μm to 70 μm, 1 μm to 60 μm, 5 μm to 60 μm, 10 μm to 60 μm, 15 μm to 60 μm, 20 μm to 60 μm, 25 μm to 60 μm, 30 μm to 60 μm, 35 μm to 60 μm, 40 μm to 60 μm, 45 μm to 60 μm, 50 μm to 60 μm, 55 μm to 60 μm, 1 μm to 55 μm, 1 μm to 50 μm, 1 μm to 45 μm, 1 μm to 40 μm, 1 μm to 35 μm, 1 μm to 30 μm, 1 μm to 25 μm, 1 μm to 20 μm, 1 μm to 15 μm, 1 μm to 10 μm, 1 μm to 5 μm, 5 μm to 10 μm, 10 μm to 15 μm, 15 μm to 20 μm, 20 μm to 25 μm, 25 μm to 30 μm, 30 μm to 35 μm, 35 μm to 40 μm, 40 μm to 45 μm, 45 μm to 50 μm, 50 μm to 55 μm, 55 μm to 60 μm, 60 μm to 65 μm μm, 65 μm to 70 μm, 70 μm to 75 μm, 75 μm to 80 μm, 80 μm to 85 μm, 85 μm to 90 μm, 90 μm to 95 μm, or 95 μm to 100 μm. In the case of carrying out the invention within the above-mentioned wavelength, it is possible to systematically control the cell size, orientation and arrangement in a wide range within the micro scale.
본 발명에서 상기 주름 구조는 열수축 시간을 조절함으로써, 상술한 범위에서 다양하게 형성될 수 있다.In the present invention, the wrinkle structure may be formed in various ways within the above range by controlling the heat shrinkage time.
또한, 본 발명에서 상기 주름 구조는 기판 표면에 코팅된 희생층(폴리비닐피롤리돈)의 두께를 조절함으로써, 상술한 범위에서 다양하게 형성될 수 있다.Further, in the present invention, the wrinkle structure may be formed in various ways within the above range by adjusting the thickness of the sacrificial layer (polyvinylpyrrolidone) coated on the surface of the substrate.
상기 희생층의 두께는 폴리비닐피롤리돈의 농도에 의해 조절될 수 있다.The thickness of the sacrificial layer may be controlled by the concentration of polyvinylpyrrolidone.
본 발명에서 상기 주름 구조는 다양한 파장의 단위(주름) 구조가 동시에, 또는 없거나(즉, 단일 파장) 부분적으로 동시에 구현될 수 있다.In the present invention, the wrinkle structure may be partially simultaneously implemented with or without unit (wrinkle) structures of various wavelengths (ie, a single wavelength).
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 나노 패턴은 가로 세로 방향으로 다열(multiseriate) 배열된 복수의 필라(pillar) 구조로 형성된 것일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the nanopattern may be formed of a plurality of pillar structures arranged in a multiserial direction in a horizontal and vertical direction.
본 발명에서 "필라(pillar) 구조"는 돌기 형태를 의미하며, 구체적으로는 원통형, 원뿔형, 원뿔대형, 반구형, 다각 기둥형 등의 형태를 의미한다.In the present invention, "pillar structure" means a protrusion shape, and specifically means a shape such as a cylindrical shape, a cone shape, a truncated cone shape, a hemispherical shape, a polygonal column shape, and the like.
본 발명에서 '원통형'은 밑면이 원인 기둥 형상의 돌기 형상이다.In the present invention, 'cylindrical' is a protrusion in the form of a column with a circular bottom.
본 발명에서 '원뿔대형'은 원뿔을 밑면에 평행한 평면으로 잘랐을 때, 잘린 면으로 나뉜 원뿔의 두 부분 중에서 원뿔의 꼭짓점을 포함하지 않는 아랫부분 및 잘린 면으로 이루어진 돌기 형상이다.In the present invention, 'truncated cone shape' is a projection shape composed of the lower part not including the vertex of the cone and the truncated surface among the two parts of the cone divided by the truncated surface when the cone is cut in a plane parallel to the base.
본 발명에서 '다각기둥형'은 밑면이 다각형인 기둥 모양의 형상으로서 예를 들면, 밑면이 삼각형이면 삼각 기둥형, 밑면이 사각형이면 사각기둥형이다.In the present invention, the 'polygonal column' is a columnar shape with a polygonal base, for example, a triangular prism if the base is a triangle, and a quadrangular prism if the base is a square.
상기 가로 세로 비율은 제작하는 세포 배양 기판 구조에 따라 달라질 수 있으며, 세포별로 동일하게 적용 가능하다.The aspect ratio may vary depending on the cell culture substrate structure to be manufactured, and may be equally applicable for each cell.
본 발명의 필라 구조는 식각(etching), 구체적으로는 건식 식각(dry ething) 공정에 의해 나노 패턴화된 단위 구조(필라)의 집합이 기판 표면 상에 형성되도록 제작될 수 있다.The pillar structure of the present invention may be fabricated so that a set of nano-patterned unit structures (pillars) is formed on a substrate surface by an etching process, specifically, a dry etching process.
본 발명의 필라 구조는 세포 배양용 기판의 표면적을 증가시켜 세포 부착성을 향상시키는 역할을 하고, 이로 인해 세포 성장 또는 분화를 촉진하는 효과가 발휘될 수 있다.The pillar structure of the present invention serves to improve cell adhesion by increasing the surface area of the substrate for cell culture, and thereby promotes cell growth or differentiation.
상기 필라 구조의 직경은 110 nm 내지 500 nm, 150 nm 내지 500 nm, 200 nm 내지 500 nm, 250 nm 내지 500 nm, 300 nm 내지 500 nm, 350 nm 내지 500 nm, 400 nm 내지 500 nm, 450 nm 내지 500 nm, 110 nm 내지 500 nm, 110 nm 내지 450 nm, 110 nm 내지 400 nm, 110 nm 내지 350 nm, 110 nm 내지 300 nm, 110 nm 내지 250 nm, 110 nm 내지 200 nm, 110 nm 내지 150 nm, 150 nm 내지 200 nm, 200 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 350 nm, 350 nm 내지 400 nm, 400 nm 내지 450 nm, 또는 450 nm 내지 500 nm일 수 있다. 상술한 직경 내에서 발명을 실시하는 경우, 세포 내부 국소 접착(focal adhesion) 및 전체 세포 접착 양상을 나노 스케일 내 넓은 범위에서 체계적으로 통제 가능하다.The diameter of the pillar structure is 110 nm to 500 nm, 150 nm to 500 nm, 200 nm to 500 nm, 250 nm to 500 nm, 300 nm to 500 nm, 350 nm to 500 nm, 400 nm to 500 nm, 450 nm to 500 nm, 110 nm to 500 nm, 110 nm to 450 nm, 110 nm to 400 nm, 110 nm to 350 nm, 110 nm to 300 nm, 110 nm to 250 nm, 110 nm to 200 nm, 110 nm to 150 nm, 150 nm to 200 nm, 200 nm to 250 nm, 250 nm to 300 nm, 300 nm to 350 nm, 350 nm to 400 nm, 400 nm to 450 nm, or 450 nm to 500 nm. In the case of carrying out the invention within the above-mentioned diameter, it is possible to systematically control the focal adhesion inside the cell and the entire cell adhesion pattern in a wide range within the nanoscale.
상기 필라 구조의 직경은 금 원형 패턴의 식각 시간을 조절함으로써, 상술한 범위에서 다양하게 형성될 수 있다.The diameter of the pillar structure may be variously formed within the above range by adjusting the etching time of the circular gold pattern.
상기 필라 구조의 높이는 150 nm 내지 900 nm, 200 nm 내지 900 nm, 250 nm 내지 900 nm, 300 nm 내지 900 nm, 350 nm 내지 900 nm, 400 nm 내지 900 nm, 450 nm 내지 900 nm, 500 nm 내지 900 nm, 550 nm 내지 900 nm, 600 nm 내지 900 nm, 650 nm 내지 900 nm, 700 nm 내지 900 nm, 750 nm 내지 900 nm, 800 nm 내지 900 nm, 850 nm 내지 900 nm, 150 nm 내지 750 nm, 200 nm 내지 750 nm, 250 nm 내지 750 nm, 300 nm 내지 750 nm, 350 nm 내지 750 nm, 400 nm 내지 750 nm, 450 nm 내지 750 nm, 500 nm 내지 750 nm, 550 nm 내지 750 nm, 600 nm 내지 750 nm, 650 nm 내지 750 nm, 700 nm 내지 750 nm, 150 nm 내지 850 nm, 150 nm 내지 800 nm, 150 nm 내지 700 nm, 150 nm 내지 650 nm, 150 nm 내지 600 nm, 150 nm 내지 550 nm, 150 nm 내지 500 nm, 150 nm 내지 450 nm, 150 nm 내지 400 nm, 150 nm 내지 350 nm, 150 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 250 nm, 150 nm 내지 200 nm, 200 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 350 nm, 350 nm 내지 400 nm, 400 nm 내지 450 nm, 450 nm 내지 500 nm, 500 nm 내지 550 nm, 550 nm 내지 600 nm, 600 nm 내지 650 nm, 650 nm 내지 700 nm, 700 nm 내지 750 nm, 750 nm 내지 800 nm, 800 nm 내지 850 nm, 또는 850 nm 내지 900 nm일 수 있다. 상술한 높이 내에서 발명을 실시하는 경우, 세포 내부 국소 접착(focal adhesion) 및 전체 세포 접착 양상을 나노 스케일 내 넓은 범위에서 체계적으로 통제 가능하다.The height of the pillar structure is 150 nm to 900 nm, 200 nm to 900 nm, 250 nm to 900 nm, 300 nm to 900 nm, 350 nm to 900 nm, 400 nm to 900 nm, 450 nm to 900 nm, 500 nm to 900 nm, 550 nm to 900 nm, 600 nm to 900 nm, 650 nm to 900 nm, 700 nm to 900 nm, 750 nm to 900 nm, 800 nm to 900 nm, 850 nm to 900 nm, 150 nm to 750 nm , 200 nm to 750 nm, 250 nm to 750 nm, 300 nm to 750 nm, 350 nm to 750 nm, 400 nm to 750 nm, 450 nm to 750 nm, 500 nm to 750 nm, 550 nm to 750 nm, 600 nm to 750 nm, 650 nm to 750 nm, 700 nm to 750 nm, 150 nm to 850 nm, 150 nm to 800 nm, 150 nm to 700 nm, 150 nm to 650 nm, 150 nm to 600 nm, 150 nm to 550 nm, 150 nm to 500 nm, 150 nm to 450 nm, 150 nm to 400 nm, 150 nm to 350 nm, 150 nm to 300 nm, 150 nm to 250 nm, 150 nm to 200 nm, 200 nm to 250 nm , 250 nm to 300 nm, 300 nm to 350 nm, 350 nm to 400 nm, 400 nm to 450 nm, 450 nm to 500 nm, 500 nm to 550 nm, 550 nm to 600 nm, 600 nm to 650 nm, 650 nm to 700 nm, 700 nm to 750 nm, 750 nm to 800 nm, 800 nm to 850 nm, or 850 nm to 900 nm. In the case of carrying out the invention within the height described above, it is possible to systematically control the focal adhesion inside the cell and the entire cell adhesion pattern in a wide range within the nanoscale.
상기 필라 구조의 높이는 필라 식각 시간을 조절함으로써, 상술한 범위에서 다양하게 형성될 수 있다.The height of the pillar structure may be variously formed within the above range by adjusting the pillar etching time.
본 발명에서 상기 필라 구조는 다양한 직경 및 높이의 단위(필라) 구조가 동시에, 또는 없거나(즉, 단일 직경 및 높이) 부분적으로 동시에 구현될 수 있다.In the present invention, the pillar structure may be partially simultaneously implemented with or without unit (pillar) structures of various diameters and heights (ie, a single diameter and height).
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 상기 나노 패턴은 상기 마이크로 패턴 상에 형성된 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 배양용 기판은 마이크로 패턴 상에 나노 패턴이 계층적으로 형성된 것일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the nanopattern may be formed on the micropattern. Therefore, the substrate for cell culture of the present invention may have nanopatterns formed hierarchically on micropatterns.
본 발명의 마이크로 패턴 및 나노 패턴이 계층적으로 형성된 세포 배양용 기판을 이용하여 세포들을 배양함으로써 세포들의 분화, 성장 및/또는 유도를 촉진할 수 있다.Differentiation, growth, and/or induction of cells can be promoted by culturing cells using the cell culture substrate on which the micropatterns and nanopatterns of the present invention are hierarchically formed.
본 발명은 세포가 성장하는 환경의 지형학적 요소를 제어함으로써 세포의 분화, 성장, 유도를 촉진시키는 원리를 이용하고, 특히 마이크로-나노 패턴을 사용하는 경우 표면적이 넓어질 뿐만 아니라 전방위적인 자극에 노출될 수 있기 때문에 세포의 분화, 성장 및 유도를 보다 촉진시킬 수 있다.The present invention uses the principle of promoting differentiation, growth, and induction of cells by controlling the topographical factors of the environment in which cells grow. In particular, when using micro-nano patterns, the surface area is widened and exposed to omnidirectional stimuli. Because it can be, the differentiation, growth and induction of cells can be more promoted.
따라서, 본 발명의 세포 배양용 기판을 사용함으로써 발휘되는 효과는 특정 세포를 선택함으로써 발휘되는 효과는 아니며, 본 발명의 세포 배양용 기판을 사용할 수 있는 세포의 종류는 크게 제한되지 않는다.Therefore, the effect exerted by using the cell culture substrate of the present invention is not the effect exerted by selecting specific cells, and the type of cells that can use the cell culture substrate of the present invention is not significantly limited.
구체적으로, 본 발명의 세포 배양용 기판을 사용할 수 있는 세포의 종류를 예를 들면, 근육세포, 줄기세포, 혈액세포, 면역세포, 골세포, 혈관내피세포, 섬유아세포 및/또는 상피세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Specifically, the cell types that can use the cell culture substrate of the present invention may be, for example, muscle cells, stem cells, blood cells, immune cells, bone cells, vascular endothelial cells, fibroblasts and/or epithelial cells. However, it is not limited thereto.
보다 구체적으로, 상기 근육세포는 예를 들어, 골격근 세포, 심근 세포 및/또는 민무늬근 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.More specifically, the muscle cells may be, for example, skeletal muscle cells, cardiomyocytes and/or smooth muscle cells, but are not limited thereto.
또한, 상기 줄기세포는 예를 들어, 신경 줄기세포(neural stem cell; NSC), 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 조혈 모세포(haematopoietic stem cell; HSC), 조혈 전구세포(haemopoietic precursor cell; HPC), 림프 선조세포(lymphoid progenitor cell) 및/또는 흉선 선조세포(thymic progenitor cell)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In addition, the stem cells include, for example, neural stem cells (NSC), embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC), hematopoietic stem cells (haematopoietic stem cells), cell; HSC), hematopoietic precursor cell (HPC), lymphoid progenitor cell and/or thymic progenitor cell, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 배양용 기판은 폴리(Poly) 계열 플라스틱 및/또는 폴리다이메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS) 재질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본래의 세포, 조직 또는 기관 등에 유의한 염증 반응, 면역원성 또는 세포 독성을 유도하지 않는 기능을 가지는 당업계에 공지된 어떠한 물질도 사용 가능하다.According to another embodiment of the present invention, the substrate for cell culture of the present invention may be a poly (Poly)-based plastic and / or polydimethylsiloxane (PDMS) material, but is not limited thereto, and the original Any material known in the art that has a function that does not induce significant inflammatory response, immunogenicity, or cytotoxicity in cells, tissues, or organs can be used.
상기 폴리 계열 플라스틱은 폴리스티렌(Polystyrene), 폴리에틸렌(Polyethylene) 및/또는 폴리프로필렌(Polypropylene)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The poly-based plastic may be polystyrene, polyethylene, and/or polypropylene, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로 패턴 및 나노 패턴이 계층적으로(hierarchical) 형성된 세포 배양용 기판에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a cell culture method comprising culturing cells on a substrate for cell culture on which micropatterns and nanopatterns are hierarchically formed.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 근육세포의 배양방법은 근육세포를 배양액이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 근육세포를 세포 배양용 기판에 씨딩(seeding)하는 단계; 및 근육세포를 배양하는 단계를 포함한다.According to one embodiment of the present invention, a method for culturing muscle cells that can be used in the present invention includes culturing muscle cells in a medium containing a culture medium; Seeding muscle cells on a substrate for cell culture; and culturing the muscle cells.
상기 배양액은 당업계에서 세포의 배양 및/또는 분화에 사용 가능한 배양액이라면 어떠한 배양액도 포함할 수 있으며, 상기 배양액에 포함되는 성분 또는 인자의 종류 및/또는 농도는 배양되는 세포에 따라 통상의 기술자가 용이하게 조절할 수 있다.The culture medium may include any culture medium as long as it is usable for culturing and/or differentiating cells in the art, and the type and/or concentration of components or factors included in the culture medium may be determined by a person skilled in the art depending on the cells to be cultured. can be easily adjusted.
상기 세포 배양 방법은 상술한 세포 배양용 기판을 사용하므로, 세포 배양용 기판의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.Since the cell culture method uses the above-described cell culture substrate, overlapping details of the cell culture substrate are omitted in consideration of the complexity of the present specification.
본 발명은 마이크로-나노 스케일의 계층적 구조를 가지는 배양 플랫폼을 제공한다. 본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The present invention provides a culture platform having a micro-nano scale hierarchical structure. The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 마이크로/나노 패턴이 계층적으로 형성된 구조를 통해, 예를 들어 종래의 방법에 비해 심근의 성숙화 효율을 매우 효과적으로 향상시켜 심근세포의 기능성을 향상시킬 수 있다.(a) Through a structure in which micro/nano patterns are hierarchically formed, it is possible to improve the functionality of cardiomyocytes by very effectively improving the maturation efficiency of the myocardium compared to, for example, conventional methods.
(b) 마이크로 주름의 파장 및 나노 필라의 직경, 높이 등을 다양하게 조절할 수 있어 생체 내 조직 구조의 모사가 용이하며, 이로써 세포에 물리적인 자극을 제공하여 기능이 향상된 세포를 제조할 수 있다.(b) Since the wavelength of the micro wrinkles and the diameter and height of the nano pillars can be variously controlled, it is easy to simulate the tissue structure in vivo, and thus, cells with improved functions can be manufactured by providing physical stimulation to the cells.
(c) 세포 조직의 모사가 가능하다는 점에서, 범용적인 플랫폼 기술이 되어 세포의 기본 연구 및 약물 스크리닝 등의 질병 연구까지 넓은 범위에 활용될 수 있다.(c) Since it is possible to mimic cell tissue, it becomes a general-purpose platform technology and can be used in a wide range from basic cell research to disease research such as drug screening.
도 1은 본 발명의 배양 플랫폼 제작 과정을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 플랫폼에서, 다양한 범위의 직경을 갖는 나노 필라 구조(a) 및 다양한 범위의 파장을 갖는 마이크로 주름 구조(b)를 확인한 전자 현미경(SEM) 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 플랫폼에서 배양된 심근세포의 크기를 마이크로 주름 구조의 파장(wavelength)에 따라 비교한 도이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 플랫폼에서 배양된 심근세포의 크기를 나노 필라 구조의 높이(height)와 직경(diameter)에 따라 비교한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 플랫폼에서, 직경 500 nm, 높이 150 nm의 나노 필라 구조(a), 파장 42 μm의 마이크로 주름 구조(b) 및 상기 나노 필라 구조와 마이크로 주름 구조의 계층적 구조(c)에서 배양된 심근세포를 확인한 전자 현미경(SEM) 사진이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 플랫폼에서, 직경 500 nm, 높이 150 nm의 나노 필라 구조 및 파장 42 μm의 마이크로 주름 구조의 계층적 구조에서 배양된 심근세포를 확인한 심근 트로포닌 T 면역 염색 사진이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 플랫폼에서, 직경 500 nm, 높이 150 nm의 나노 필라 구조 및 파장 42 μm의 마이크로 주름 구조의 계층적 구조에서 배양된 심근세포의 분율 및 크기를 정량화하여 나타낸 도이다.1 shows the manufacturing process of the culture platform of the present invention.
Figure 2 is an electron microscope (SEM) photograph confirming the nanopillar structure (a) having a diameter of various ranges and the micro wrinkle structure (b) having a range of wavelengths in a culture platform according to an embodiment of the present invention.
Figure 3a is a diagram comparing the size of cardiomyocytes cultured on the culture platform according to an embodiment of the present invention according to the wavelength of the micro-wrinkle structure.
Figure 3b is a diagram comparing the size of cardiomyocytes cultured on the culture platform according to an embodiment of the present invention according to the height and diameter of the nanopillar structure.
Figure 4 is a nano-pillar structure (a) with a diameter of 500 nm and a height of 150 nm, a micro-wrinkled structure (b) with a wavelength of 42 μm, and the nano-pillar structure and the micro-wrinkled structure in a culture platform according to an embodiment of the present invention. It is an electron microscope (SEM) photograph confirming the cultured cardiomyocytes in the hierarchical structure (c).
Figure 5a shows myocardial troponin T immunity cultured in a hierarchical structure of a nanopillar structure with a diameter of 500 nm and a height of 150 nm and a micro-wrinkled structure with a wavelength of 42 μm in a culture platform according to an embodiment of the present invention. This is a dyed photo.
Figure 5b quantifies the fraction and size of cultured cardiomyocytes in a hierarchical structure of a nanopillar structure with a diameter of 500 nm and a height of 150 nm and a micro-wrinkle structure with a wavelength of 42 μm in a culture platform according to an embodiment of the present invention. is the diagram shown.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for explaining the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
제조예. 본 발명의 계층적 구조의 형성manufacturing example. Formation of the hierarchical structure of the present invention
모세관력 리소그라피(Capillary force lithography) 방식을 통해 약 40 nm 두께의 원형 금 패턴을 제작하였다. 이때, 직경은 건식 식각(dry etching) 시간을 조절하여 약 250 nm 부터 500 nm까지 다양하게 제작 가능하다.A circular gold pattern with a thickness of about 40 nm was fabricated through capillary force lithography. At this time, the diameter can be variously manufactured from about 250 nm to 500 nm by adjusting the dry etching time.
제작된 금 패턴을 폴리스티렌(Polystyrene) 기판에 전사 후, 이를 에칭(etching) 마스크로 활용해 건식 식각 과정으로 기둥(필라) 구조를 식각하였다. 이때, 기둥(필라) 높이는 식각 시간을 조절하여 최대 1 μm까지 다양하게 제작하였다. 또한, 기둥 직경은 상기 원형 금 패턴의 직경에 따라 결정된다.After transferring the fabricated gold pattern to a polystyrene substrate, the pillar structure was etched through a dry etching process using it as an etching mask. At this time, the height of the pillar (pillar) was varied up to 1 μm by adjusting the etching time. Also, the column diameter is determined according to the diameter of the circular gold pattern.
끝으로, 나노 패터닝(필라)된 폴리스티렌 기판을 열수축하여 마이크로 주름 구조를 형성하였다. 이때, 주름 파장은 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone, PVP)의 농도(희생층 두께 조절용) 및/또는 열수축 시간(변형도(Strain) 조절용)을 조절하여 다양하게 제작하였다.Finally, the nano-patterned (pillar) polystyrene substrate was heat-shrinked to form a micro-wrinkled structure. At this time, the wrinkle wavelength was variously manufactured by adjusting the concentration of polyvinylpyrrolidone (PVP) (for controlling the thickness of the sacrificial layer) and/or the heat shrinkage time (for controlling the strain).
각 단계에서 제작된 나노 필라 구조 및 마이크로 주름 구조는 Magellan400(FEI company)을 통해 확인하였으며, 결과는 도 2에 나타내었다.The nanopillar structure and microwrinkle structure produced in each step were confirmed through Magellan400 (FEI company), and the results are shown in FIG. 2 .
실시예 1. 심근세포의 배양Example 1. Culture of cardiomyocytes
H9C2 세포(CRL-1446, ATCC)를 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)(Welgene, Korea), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, USA)이 포함된 high-serum DMEM(Gibco, USA) 배양액으로 37 ℃에서 하루 동안 배양한 다음, 상기 제조예의 각 단계에서 제작된 (a) 나노 필라 구조, (b) 마이크로 주름 구조 및 각 구조가 적용된 (c) 계층적 구조 기판 위에 올리고(seeding) 10% 소태아 혈청(Welgene), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco), 100 nM Retinoic acid(Merck, USA)이 포함된 배양액으로 37 ℃에서 7 일 동안 배양하였다.H9C2 cells (CRL-1446, ATCC) were cultured in high-serum DMEM (Gibco, USA) containing 10% fetal bovine serum (Welgene, Korea) and 1% penicillin-streptomycin (Gibco, USA). After incubation at 37 ° C. for one day, 10% (a) nano-pillar structure, (b) micro-wrinkle structure and (c) hierarchical structure substrate prepared in each step of the above preparation were applied (seeding) Fetal bovine serum (Welgene), 1% penicillin-streptomycin (Gibco), and 100 nM Retinoic acid (Merck, USA) were incubated for 7 days at 37 °C in a culture medium.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 패턴 사이즈에 따라 세포의 배양 및 부착 형태가 다르게 관찰되었다.As can be seen in Figure 3, the cell culture and attachment patterns were observed differently depending on the pattern size.
실시예 2. 심근세포의 성숙도 확인Example 2. Confirmation of maturity of cardiomyocytes
상기 실시예 1의 결과를 기초로, 심근세포의 성숙도는 심근 트로포닌 T를 면역 염색하여 확인하였다.Based on the results of Example 1, the degree of maturity of cardiomyocytes was confirmed by immunostaining for myocardial troponin T.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 배양된 H9C2 세포를 4% 파라포름알데하이드(Sigma)로 고정하고, DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)(Welgene) 상에서 0.1% 트리톤 X-100을 이용하여 투과(Permeabilize)시켰다. 세포고정 후, 세포는 4 ℃에서 하루 동안 1% 소 태아 혈청과 DPBS 용액 상에서 트로포닌 T(Thermo) 1차 항체와 함께 배양하였다. 형광 염색에는 안티-마우스 Alexa Flour 488(abcam)을 사용하였다. 핵(nuclei)은 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Siggma)을 사용하여 대조 염색하였다. 염색된 세포는 형광 현미경(Nikon Ti)을 사용하여 시각화하였다.Specifically, the H9C2 cells cultured in Example 1 were fixed with 4% paraformaldehyde (Sigma), and permeabilized using 0.1% Triton X-100 on DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) (Welgene) made it After cell fixation, cells were incubated with Troponin T (Thermo) primary antibody in 1% fetal bovine serum and DPBS solution at 4°C for one day. Anti-mouse Alexa Flour 488 (abcam) was used for fluorescence staining. Nuclei were counterstained using 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Siggma). Stained cells were visualized using a fluorescence microscope (Nikon Ti).
도 4에서 확인할 수 있듯이, 직경 500 nm, 높이 150 nm의 나노 필라 구조, 파장 42 μm의 마이크로 주름 구조 및 이를 반영한 계층적 구조에서 가장 높게 확인되었다.As can be seen in FIG. 4, the nanopillar structure with a diameter of 500 nm and a height of 150 nm, the micro-wrinkled structure with a wavelength of 42 μm, and the hierarchical structure reflecting this were found to be the highest.
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