KR20220156912A - 다중특이적 결합 단백질 및 그의 개발 방법 - Google Patents
다중특이적 결합 단백질 및 그의 개발 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220156912A KR20220156912A KR1020227036637A KR20227036637A KR20220156912A KR 20220156912 A KR20220156912 A KR 20220156912A KR 1020227036637 A KR1020227036637 A KR 1020227036637A KR 20227036637 A KR20227036637 A KR 20227036637A KR 20220156912 A KR20220156912 A KR 20220156912A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- amino acid
- numbering
- acid residue
- light chain
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 다중특이적 결합 단백질, 및 다중특이적 결합 단백질의 정제 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 의약 분야, 특히 다중특이적 결합 단백질 분야, 예컨대 질환의 치료에 사용되는 이중특이적 항체 및 삼중특이적 결합 단백질, 및 그의 개발 방법에 관한 것이다.
다중특이적 결합 단백질은 다수의 서로 다른 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. WO2001077342호, WO2007110205호, WO2008024188호, WO2009089004호, WO2012135345호 및 WO2016118742호에 제시되어 있는 것과 같은 다수의 다중특이적 결합 단백질 포맷이 개시되었으며, 다양한 자가면역 질환, 암, 감염성 질환 및 심혈관 질환의 치료용으로 시험되기도 하였다. 다중특이적 결합 단백질이 예를 들면 다수의 항원을 표적화하는 것에 의한 치료상 이익의 강화, 비용 절약 잠재력 및 환자 편의성 향상의 가능성을 제공하기는 하지만, 치료제 후보로서의 그의 개발은 제한되어 왔다.
다중특이적 결합 단백질의 진전을 제한하는 인자는 그러한 분자의 조립, 제조 및 정제에 있어서의 복잡성이다. 예를 들면, 이중특이적 분자의 제조는 서로 다른 항원 결합 도메인의 적정한 조립을 필요로 할 뿐만 아니라, 서로 다른 항원 결합 도메인의 단일 분자로의 조립도 필요로 한다. 종종, 다중특이적 결합 단백질의 재조합 발현 동안, 원치않는 분자 (예컨대 단일특이적 단백질, 단일 사슬 쌍 등)를 포함하는 혼합물이 발현된다. 원하는 다중특이적 결합 단백질은 발현 배지로부터 뿐만 아니라 원치않는 분자의 혼합물로부터도 정제되어야 한다. 원치않는 분자의 형성 및 추가적인 정제 단계의 필요성은 원하는 다중특이적 결합 단백질의 수율 감소 및 전체적인 제조 비용의 증가를 초래한다.
다중특이적 결합 단백질의 개발 및 정제를 강화하려는 시도는 예를 들면 WO20100151792호, WO2013088259호 및 WO2013136186호에 제시되어 있는 바와 같이 개시되었다. 그러나, 이들 개시내용은 다중특이적 결합 단백질의 개발 문제를 처리하는 데에 제한이 있음을 증명하였다. 예를 들면, 일부 경우에서, 이들 개시내용은 이펙터 기능의 손상, 면역원성 우려의 강화, 조립상의 변경, 친화성 변경 및/또는 반감기와 같은 약동학적 특성의 감소 중 1종 이상을 입증한다. 일부 경우에서는, 상기 개시내용의 적용성이 특정 분자 및/또는 포맷으로 제한된다. 따라서, 안정성 및 친화성을 변경하지 않으면서도 다중특이적 결합 단백질의 개발을 강화하며, 허용되지 않는 면역원성을 동반하지 않는, 개선된 다중특이적 결합 단백질 및 그의 개발 방법에 대한 필요가 여전히 존재한다.
이에 따라, 본 개시내용은 개선된 다중특이적 결합 단백질 및 그의 개발 방법을 제공하는 것에 의해 상기 필요성 중 하나 이상을 해소한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질 및 방법의 실시양태는 원하는 다중특이적 결합 단백질의 정제 강화, 분자의 보존 및/또는 조립 강화, 단백질 응집의 감소, 물리적 안정성의 향상을 제공하며, 면역원성 위험성의 증가, 이펙터 기능의 변경 및/또는 약동학적 특성의 변경을 동반하지 않는다. 또한, 본 개시내용의 실시양태는 다중특이적 결합 단백질의 친화성을 보존하며, 정제 반응물에 대한 카파 경쇄의 원치않는 결합을 감소시키거나 차단한다. 또한, 본 개시내용의 실시양태는 전체적인 정제 과정 또는 개발 과정에 시간 및/또는 비용을 부가하지 않는다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 다중특이적 결합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 다중특이적 결합 단백질이 제공되며, 상기 다중특이적 결합 단백질은 제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이며 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신; 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌; 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산; 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산; 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신; 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌; 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신; 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌; 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신; 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신; 또는 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및 제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하며, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다. 일부 그와 같은 실시양태에 있어서, 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하지 않고; 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하지 않고; 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하지 않고; 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하지 않고; 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하지 않고; 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하지 않고; 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하지 않고; 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하지 않고; 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하지 않고; 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하지 않고; 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에 따라, 다중특이적 결합 단백질은 제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및 제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 Fab 영역은 추가로 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 Fab 영역은 추가로 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함한다.
본원에서 제공되는 다중특이적 결합 단백질의 다른 실시양태에 따라, 다중특이적 결합 단백질은 제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및 제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 Fab 영역은 추가로 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함한다.
본원에서 제공되는 다중특이적 결합 단백질의 실시양태에 따라, 다중특이적 결합 단백질은 제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및 제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 Fab 영역은 추가로 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함한다.
본원에서 제공되는 다중특이적 결합 단백질의 실시양태에 따라, 다중특이적 결합 단백질은 제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및 제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다.
본원에서 제공되는 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태에 따라, 다중특이적 결합 단백질은 제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및 제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다.
본원에서 제공되는 다중특이적 결합 단백질의 또 다른 실시양태에 따라, 다중특이적 결합 단백질은 제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및 제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다.
본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태에 따라, 다중특이적 결합 단백질의 제1 항원 결합 도메인은 추가로 제1 중쇄 Fc 영역을 포함한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄 Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태에서, 제2 항원 결합 도메인은 추가로 제2 중쇄 Fc 영역을 포함한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 또 다른 실시양태에서, 상기 제2 중쇄 Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태에서, 제1 중쇄 Fc 영역은 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 포함한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태에 따라, 제2 중쇄 Fc 영역은 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 포함한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 Fc 영역은 모두 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나; 모두 인간 IgG2 불변 영역을 포함하거나; 또는 모두 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 Fc 영역은 모두 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 포함한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태에 따라, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 109의 알라닌을 포함하지 않거나; 아미노산 잔기 110의 아스파르트산을 포함하지 않거나; 아미노산 잔기 143의 리신을 포함하지 않거나; 또는 아미노산 잔기 199의 리신을 포함하지 않는다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 109의 알라닌을 포함하지 않고; 아미노산 잔기 110의 아스파르트산을 포함하지 않고; 아미노산 잔기 143의 리신을 포함하지 않고; 아미노산 잔기 199의 리신을 포함하지 않는다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태에 따라, 제2 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이다. 또한, 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태에 따라, 제2 경쇄 Fab 영역은 람다 경쇄이다.
일부 실시양태에 따라, 다중특이적 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질로 구성된다. 그와 같은 일부 실시양태에 따라, 이중특이적 결합 단백질은 이뮤노글로불린 헤테로맙(heteromab)이다. 더 구체적인 일부 실시양태에서, 상기 이뮤노글로불린 헤테로맙은 IgG 헤테로맙이다. 또 다른 실시양태에 따라, 다중특이적 결합 단백질은 다중특이적 결합 단백질로 구성된다.
또한, 본 개시내용의 실시양태는 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물도 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 실시양태에 따라, 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 정제 방법이 제공된다. 그와 같은 일부 실시양태에 따라, 상기 방법은 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 그와 같은 일부 실시양태에 따라, 상기 도입 단계는 추가로 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 도입 단계는 추가로 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 포함한다.
아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질 정제 방법의 추가적인 실시양태가 제공된다. 일부 실시양태에 따라, 상기 도입 단계는 추가로 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 포함한다.
아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질 정제 방법의 추가적인 실시양태가 제공된다. 일부 실시양태에 따라, 상기 도입 단계는 추가로 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 포함한다.
추가적인 실시양태에 따라, 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 정제 방법이 제공된다.
아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질 정제 방법의 추가적인 실시양태가 제공된다.
아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질 정제 방법의 또 다른 실시양태가 제공된다.
본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질 정제 방법의 일부 실시양태에 따라, 상기 도입 단계는 추가로 제1 중쇄 Fc 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 방법의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄 Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, 도입 단계는 추가로 제2 중쇄 Fc 영역을 제2 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 방법의 또 다른 실시양태에서, 상기 제2 중쇄 Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에 따라, 도입 단계는 추가로 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 제1 중쇄 Fc 영역에 도입하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, 도입 단계는 추가로 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 제2 중쇄 Fc 영역에 도입하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에 따라, 제1 중쇄 Fc 영역 및 제2 중쇄 Fc 영역은 모두 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나; 모두 인간 IgG2 불변 영역을 포함하거나; 또는 모두 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, 도입 단계는 추가로 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 제1 중쇄 Fc 영역 및 제2 중쇄 Fc 영역 모두에 도입하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 109의 알라닌을 포함하지 않거나; 아미노산 잔기 110의 아스파르트산을 포함하지 않거나; 아미노산 잔기 143의 리신을 포함하지 않거나; 또는 아미노산 잔기 199의 리신을 포함하지 않는다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 109의 알라닌을 포함하지 않고; 아미노산 잔기 110의 아스파르트산을 포함하지 않고; 아미노산 잔기 143의 리신을 포함하지 않고; 아미노산 잔기 199의 리신을 포함하지 않는다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이다. 본 개시내용의 방법의 다른 실시양태에서, 제2 경쇄 Fab 영역은 람다 경쇄이다.
본 개시내용의 방법의 다른 실시양태에 따라, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 카파 친화성 리간드를 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 컬럼은 람다 친화성 리간드를 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에 따라, 친화성 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A를 포함한다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 Fab 영역은 제1 경쇄 Fab 영역에 비해 더 큰 친화성으로 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합한다. 본 개시내용의 방법의 또 다른 실시양태에서, 제1 경쇄 Fab 영역은 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하지 않는다.
본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질 정제 방법의 또 다른 실시양태에 따라, 상기 방법은 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계 후 정제된 다중특이적 결합 단백질을 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및 정제된 다중특이적 결합 단백질을 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계 후 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따라, 상기 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼은 카파 친화성 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼은 람다 친화성 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에 따라, 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 Fab 영역은 제1 경쇄 Fab 영역에 비해 더 큰 친화성으로 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 Fab 영역은 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하지 않는다.
또 다른 실시양태에 따라, 본 개시내용은 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 그와 같은 일부 실시양태에서, 상기 방법은 다중특이적 결합 단백질이 발현되도록 하는 조건하에서 본 개시내용의 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포로부터 본 발명의 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법에 따라 본 발명의 다중특이적 결합 단백질이 제조되는 것을 포함한다. 일부 실시양태에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인을 코딩하는 단일 벡터로 구성된다. 다른 실시양태에 따라, 폴리뉴클레오티드 서열은 제1 항원 결합 도메인을 코딩하는 제1 벡터 및 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 벡터로 구성된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 상기 방법은 추가로 회수된 다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하고, 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 컬럼은 카파 친화성 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 컬럼은 람다 친화성 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에 따라, 제1 항원 결합 도메인은 제1 경쇄 Fab 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 경쇄 Fab 영역을 포함하고, 제2 경쇄 Fab 영역은 제1 경쇄 Fab 영역에 비해 더 큰 친화성으로 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 Fab 영역은 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하지 않는다. 또 다른 실시양태에 따라, 본 개시내용의 상기 방법은 추가로 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계 후 정제된 다중특이적 결합 단백질을 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하고, 정제된 다중특이적 결합 단백질을 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계 후 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼은 카파 친화성 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼은 람다 친화성 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에 따라, 제1 항원 결합 도메인은 제1 경쇄 Fab 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 경쇄 Fab 영역을 포함하고, 제2 경쇄 Fab 영역은 제1 경쇄 Fab 영역에 비해 더 큰 친화성으로 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 Fab 영역은 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 치료법에서 사용하기 위한 다중특이적 결합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 이상의 치료에서 사용하기 위한 다중특이적 결합 단백질을 제공한다. 그와 같은 일부 실시양태에서, 의학적 이상은 암, 심혈관 질환, 자가면역 질환 또는 신경변성 질환 중 1종이다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 약제의 제조에서 사용하기 위한 다중특이적 결합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료법을 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 다중특이적 결합 단백질을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 이상의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 다중특이적 결합 단백질을 제공한다. 그와 같은 일부 실시양태에서, 의학적 이상은 암, 심혈관 질환, 자가면역 질환 또는 신경변성 질환 중 1종이다.
본원에서 사용될 때의 "다중특이적 결합 단백질"이라는 용어는 2종 이상의 서로 다른 항원-결합 도메인을 가지는 분자를 지칭한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질은 2종 이상의 상이한 항원 또는 동일 항원의 2종 이상의 상이한 항원결정인자에 결합한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 실시양태에는 이중특이적 항체는 물론, 관련분야에 알려져 있는 바와 같은 삼중특이적 또는 사중특이적 결합 분자는 물론 이분절체(diabody)를 포함한 단일 사슬 다중특이적 결합 분자도 포함된다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질은 크기 및 형상구조가 상이할 수 있으며, 관련 기술분야에 알려져 있는 바와 같은 다수의 포맷으로 구성될 수 있다.
본원에서 언급될 때, "항원 결합 도메인"은 각 항원과 상호작용하여 그에 대한 특이성을 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 다중특이적 결합 단백질의 부분을 지칭한다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 항원 결합 도메인은 경쇄 Fab 영역 및 중쇄 Fab 영역을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 Fab 영역 모두는 프레임워크(framework) 영역으로 지칭되는 더 보존되는 영역과 함께 산재되는 CDR을 포함하는 아미노-말단의 가변 부분을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 Fab 영역 모두는 또한 보존 영역 (예컨대 관련분야에 알려져 있는 바와 같은 경쇄의 CL 및 중쇄 Fab 영역의 CH1)을 포함한다. 관련 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, 경쇄 Fab 영역은 카파 또는 람다로 분류된다.
본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 일부 실시양태는 중쇄 Fab 영역의 카르복시 말단에 연결된 중쇄 Fc 영역을 포함한다 (예컨대 관련분야에 알려져 있는 바와 같은 중쇄를 형성함). 본 개시내용의 중쇄 Fc 영역은 감마로 분류되며, IgG, 및 하위클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 1종으로 중쇄 동형을 규정한다. 중쇄 Fc 영역은 또한 다중특이적 결합 단백질에 대한 (관련분야에 알려져 있는 바와 같은) 이펙터 기능을 할 수 있다.
일부 특정 실시양태에 따라, 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질은 IgG 헤테로맙 분자 또는 그의 단편을 포함한다. 관련 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, IgG 헤테로맙 분자는 원형의(archetypical) Fab 구조 및 IgG 구조를 포함한다 (하나의 Fab "아암(arm)" 또는 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하며, 다른 Fab "아암" 또는 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합함).
관련 기술분야에 인식되어 있는 "EU 번호지정"이라는 용어는 이뮤노글로불린 분자의 아미노산 잔기 번호지정 시스템을 지칭한다. EU 번호지정에 대해서는 예를 들면 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]; [Edelman, G.M, et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)]; 및 http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs에 기술되어 있다. "카바트(Kabat) 번호지정"이라는 용어는 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기에 비해 더 가변적인 (즉 초가변적인) 아미노산 잔기의 번호지정 시스템을 지칭하는 것으로 관련 기술분야에 인식되어 있다 (예를 들면 문헌 [Kabat, et al., Ann. NY Acad . Sci . 190:382-93 (1971)]; [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)] 참조). "노스(North) 번호지정"이라는 용어는 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기에 비해 더 가변적이며 (즉 초가변적이며) 적어도 부분적으로 문헌 [North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)]에 기술되어 있는 바와 같은 많은 수의 결정 구조를 사용한 친화성 전파 클러스터링(affinity propagation clustering)을 기반으로 하는 아미노산 잔기의 번호지정 시스템을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "친화성 크로마토그래피"라는 용어는 생체분자 사이의 특이적인 가역적 상호작용을 기반으로 하여 생화학적 혼합물 (예컨대 다중특이적 결합 단백질과 원치않는 생체분자 종)을 분리하기 위한 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 친화성 크로마토그래피의 예시적인 실시양태에는 단백질 A 친화성 컬럼, 카파 친화성 리간드 크로마토그래프 (예컨대 캡쳐셀렉트(CaptureSelect)™, 카파(Kappa)XL™, 카파셀렉트(KappaSelect)™, 카파XP™) 또는 람다 친화성 리간드 크로마토그래피가 포함된다.
본원에서 언급될 때의 "모체" 또는 "모체" 분자는 예를 들면 아미노산 치환 및 구조적 변경을 통한 본원에서 제시되는 예시적인 실시양태 중 하나의 제조에 사용되는 아미노산 서열에 의해 코딩되는 분자이다. 모체 분자는 예를 들면 뮤린 항체 또는 그의 단편, 또는 파지 디스플레이 또는 예를 들면 트랜스제닉(transgenic) 비-인간 동물을 통하여 유도되는 결합 단백질을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질은 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있으며 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체(들) 및/또는 희석제(들)을 포함하는 제약 조성물에 도입될 수 있다 (예컨대 종사자들에게 일반적으로 알려져 있는 바와 같은 제제화 기술의 개론을 제공하는 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Loyd V., Ed., Pharmaceutical Press, 2012]). 적합한 제약 조성물용 담체에는 다중특이적 결합 단백질과 조합되었을 때 분자의 활성을 유지하며 환자의 면역 시스템과 비-반응성인 임의의 재료가 포함된다.
그것이 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 발현 벡터에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 폴리펩티드(들)의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종유래 신호 펩티드일 수 있다. 발현되는 폴리펩티드 각각은 하나의 벡터 내에서 그것이 작동가능하게 연결되는 상이한 프로모터로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 또는 대안적으로는 다수의 벡터 내에서 그것이 작동가능하게 연결되는 상이한 프로모터로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 발현 벡터는 통상적으로 에피솜(episome), 또는 숙주 염색체 DNA의 통합된 일부 중 어느 하나로서 숙주 생물체 내에서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열에 의해 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 하기 위하여, 선택 마커, 예컨대 테트라사이클린, 네오마이신 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 포함하게 된다.
숙주 세포는 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 1종 이상 폴리펩티드 사슬을 발현하는 1종 이상의 발현 벡터에 의해 안정하게 또는 일시적으로 형질감염, 형질전환, 형질도입 또는 감염되는 세포를 지칭한다. 본 개시내용의 결합 단백질을 생성시키는 숙주 세포주의 생성 및 단리는 관련 기술분야에 알려져 있는 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질의 발현에는 포유동물 세포가 바람직한 숙주 세포이다. 구체적인 포유동물 세포로는 HEK 293, NS0, DG-44 및 CHO가 포함된다. 바람직하게는, 결합 단백질은 숙주 세포가 배양되며 예를 들면 통상적인 기술을 사용하여 결합 단백질이 그로부터 회수되거나 정제될 수 있는 배지로 분비된다. 예를 들면, 상기 배지는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼 및/또는 카파 친화성 리간드 또는 람다 친화성 리간드 크로마토그래피 컬럼에 적용되어 그로부터 용리될 수 있다. 가용성 응집물 및 다량체를 포함한 원치않는 생체분자 종은 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한 통상적인 기술에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 생성물은 예를 들면 -70 ℃로 즉시 냉동될 수 있거나, 냉장되거나, 또는 동결건조될 수 있다. 다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있으며, 그와 같은 방법에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있는 바, 예를 들면 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)] 및 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994)]에 기술되어 있다.
[
실시예
]
예시적인 다중특이적 결합 단백질의 발현 및 정제
cMet에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 BHA10에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 가지는 IgG 헤테로맙 포맷을 포함하는 예시적인 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질이 본질적으로 하기와 같이 발현 및 정제될 수 있다. 간략하게, 각각 인간 G1 동종이형 불변 영역 및 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 pEHG1 및 pEHK 발현 벡터와 같은 발현 벡터에 제1 경쇄 및 중쇄 Fab 영역을 클로닝한다. 두 벡터는 분비를 추진하는 뮤린 카파 리더 서열을 수용하고 있다 (WO2014/150973 A1호; 문헌 [Lewis S.M., et al., 2014 Nat. Biotechnol. 32, 191-8]).
아미노산 잔기 변화는 하기를 포함한 관련 기술분야에 알려져 있는 방법을 통하여 결합 도메인에 도입될 수 있다: 경쇄, 퀵체인지(Quickchange) 위치-지정 돌연변이유발 키트 (스트라타젠(Stratagene) 사, 캘리포니아 라 졸라 소재), (단일 또는 분리된 벡터로) 새로이 합성되는 코돈-최적화 코딩 영역 등. 돌연변이 위치를 결정하는 데에는 EU-번호지정 규약이 사용될 수 있다.
예시적인 본 개시내용의 변형된 카파 경쇄 Fab 영역 및 중쇄 Fc 영역 포맷을 각각 표 1a 및 1b에 제공하였다 (아미노산 변형은 EU 번호지정을 기반으로 번호지정하였음).
표 1a 및 1b의 중쇄 및 경쇄 포맷을 포함하는 다양한 IgG 헤테로맙 조합의 실시양태를 표 2에 제공하였다. 예시적인 IgG 헤테로맙은 cMet에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 BHA10에 결합하는 제2 항원 결합 도메인; 또는 PD-1에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 Tigit에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 포맷의 경향을 기반으로 하여 발현, 조립 및 정제에 대하여 있을 수 있는 영향을 평가하기 위하여, 표 2의 예시적인 IgG 헤테로맙에는 각각 제1 및 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 변형된 중쇄 및 경쇄 포맷 (표 1a 및 1b의 것)의 상이한 조합이 포함된다. 모체 단일클론 항체 및 IgG1 헤테로맙 분자 (예컨대 표 1a 및 1b에 제시되어 있는 바와 같은 변형된 경쇄 또는 중쇄 포맷을 포함하지 않는 분자)도 대조로서 평가한다.
표 2의 예시적인 IgG 헤테로맙을 분비하기 위한 발현 시스템을 사용하여 CHO와 같은 적절한 숙주 세포를 일시적으로 형질감염시킨다. 예시적인 IgG 헤테로맙이 분비되는 정화된 배지 중에서 280 nm에서의 흡광도에 의해 예시적인 IgG 헤테로맙을 검출한다. 표 2에 나타나 있는 바와 같이, 표 1의 변형된 카파 경쇄 Fab 항체 포맷 및 변형된 중쇄 Fc 항체 포맷의 발현 수준은 각 모체 항체와 유사하다. 따라서, 표 1a 및 1b의 포맷에 따른 변형은 발현 수준에 부정적인 영향을 주지 않았으며, 일부 경우에는 발현 역가를 향상시켰다.
카파
XL
컬럼에서의
예시적인 변형된
카파
경쇄
Fab
영역 포맷의
%
플로우 스루 및
%
용리
비교
정화된 배지 중 또는 단백질 A 정제로부터 회수된 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질은 캡쳐셀렉트™ 카파 XL (써모 피셔(Thermo Fisher) 사 Cat.# 494321001) 사전-충진 친화성 컬럼을 사용한 제2 정제 단계에 적용될 수 있다. 간략하게, 단백질 A 정제로부터 회수된 본 개시내용의 다중특이적 결합 단백질을 pH 7.4의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)와 같은 상용성 완충제를 사용하여 평형화된 카파 XL 친화성 컬럼에 적용한다. 다음에, 컬럼을 세척하여 비특이적 결합 성분을 제거한다. 예를 들면 pH 구배 (예컨대 20 mM 트리스(Tris) 완충제 pH 7.0 내지 10 mM 소듐 시트레이트 완충제 pH 3.0)에 의해 결합된 다중특이적 결합 단백질을 용리한다. 예컨대 UV 흡광도 또는 SDS-PAGE에 의해 결합 단백질 분획을 검출한 다음, 혼합수집한다.
본질적으로 본원에서 기술되는 바와 같은 카파 XL 컬럼 정제 후의 본 개시내용의 예시적인 헤테로맙의 % 플로우 스루 (%FT) 및 % 용리를 평가한다. 간략하게, 다양한 항체 포맷 (표 3에 제시되어 있는 바와 같음)을 카파 XL 컬럼에 적용한다. 플로우 스루 재료는 동종이량체 또는 오조립 항체와 같은 불순물을 포함하는 것으로 생각되는 반면, 카파 XL 리간드 결합 재료 (용리 재료)는 올바르게 조립된 이중특이적 항체인 것으로 생각된다.
표 3은 두 경쇄 Fab 영역에 DKK 포맷을 가지는 cMet 모체 mAb가 카파 XL 컬럼에 대한 결합을 무산시킴으로써, 100 %의 항체가 플로우 스루에서 수집되고, 원하는 항체 종과 원치않는 항체 종의 판별을 막는다는 것을 나타낸다. 마찬가지로, cMet 모체 mAb 및 cMet-BAH10 IgG1 헤테로맙의 플로우 스루 %는 각각 2.8 % 및 5.5 %로, 대부분의 항체가 카파 XL 컬럼에 결합되었으며, 그에 따라 원하는 항체 종과 원치않는 항체 종 사이의 판별을 가능하게 하지 않았다. 반면, 표 3의 결과는 cMet 경쇄 Fab 영역에 DKK 포맷을 가지는 cMet-BAH10 IgG1 헤테로맙 만이 29.3 %의 플로우 스루 종 및 70.7 %의 용리된 다중특이적 결합 단백질 종으로 이어진다는 것을 나타냄으로써, 카파 경쇄 Fab 영역의 DKK 포맷이 선택적인 판별을 가능하게 하고, 원치않는 종으로부터의 원하는 다중특이적 결합 단백질 종의 분리를 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
또한, 표 3은 (PD-1-Tigit IgG1 헤테로맙의) PD-1 경쇄 Fab 영역상에서의 DKK 및 ADK 카파 경쇄 Fab 영역 포맷이 각각 80.72 % 및 78.24 %의 용리 종으로 이어진다는 것을 나타냄으로써, 두 포맷이 원치않는 (플로우 스루) 종으로부터 원하는 다중특이적 결합 단백질 용리 종을 선택적으로 판별한다는 것을 표시한다.
종합하면, 상기 결과는 표 1a의 카파 경쇄 Fab 영역 포맷이 IgG 헤테로맙의 오로지 하나의 경쇄 Fab 영역상에서 발현되는 경우 원치않는 종으로부터 원하는 다중특이적 결합 단백질을 효과적으로 판별하며, 그에 따라 원하는 결합 단백질의 효과적인 분리 및 정제를 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
단백질 A 및
카파XL
리간드에 결합하는 정제된 다중특이적 결합 단백질
단백질 A 결합 분석
엘리사(ELISA)를 통하여, 단백질 A 리간드에 대한 예시적인 IgG 헤테로맙에서의 표 1b 중쇄 Fc 영역 포맷의 결합이 평가될 수 있다. 간략하게, 100 ul/웰의 2 ug/mL 염소 항-인간-카파 단백질을 사용하여 96-웰 편평저 엘리사 플레이트를 코팅하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이팅한다. 다음날, 세척 완충제 (0.05 % PBS-트윈(Tween) 20 (PBS-T))를 사용하여 플레이트를 3x 세척하고, 실온 (RT)에서 차단 완충제 (카세인, 200 μL/웰)를 사용하여 1시간 동안 차단한다. 세척 완충제를 사용하여 플레이트를 3x 세척하고, 결합 단백질 (표 4에 나타낸 바와 같은 것)을 10 μg/mL로 개별 웰에 첨가한 후, PBS-T 중에 100 uL/웰의 부피로 1:3 연속 희석한다. RT에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이팅하고, 세척 완충제를 사용하여 3x 세척한다. 0.5 ug/ml의 바이오틴-단백질 A를 100 uL/웰로 첨가하고, RT에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이팅한 후, 3x 세척하고, 100 uL/웰의 스트렙타비딘 표지된 알칼리성 포스파타제 (SA-AP)를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 RT에서 30분 인큐베이팅한다. 다음에, 플레이트를 3x 세척하고, 100 uL/웰의 p-니트로페닐 포스페이트, 디소듐 염 (PNAP) (써모 피셔 사이언티픽 사) 기질을 첨가한다. 반응을 중지시키고, 405 nm로 설정된 비색 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도를 측정한다. 결과를 표 4에 제공하였다.
결과는 중쇄 Fc 영역 RE 포맷이 오로지 cMet-BAH10 IgG1 헤테로맙의 cMet 중쇄 Fc 영역의 일부로서 발현되는 경우 cMet-BAH10 IgG1 헤테로맙과 비교하였을 때 단백질 A에의 결합에 있어서 대략 1.2-배 감소를 나타낸다는 것을 나타낸다. 중쇄 Fc 영역 RE 포맷이 두 중쇄 Fc 영역의 일부로서 발현되는 경우, 모체와 비교하였을 때 단백질 A에의 결합 친화성의 대략 2-배 감소가 존재한다. 이와 같은 데이터는 중쇄 Fc 영역 RE 포맷이 더 높은 pH에서의 원하는 결합 분자의 용리 및 분별 단백질 A 용리를 통한 원치않는 종 또는 오염성 종으로부터의 판별을 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
카파
XL
결합 분석
엘리사를 통하여 카파 XL 리간드에 대한 예시적인 IgG 헤테로맙에서의 표 1a 경쇄 Fab 영역 포맷의 결합이 평가될 수 있다. 간략하게, 100 ul/웰의 2 ug/mL 염소 항-인간-IgG 단백질을 사용하여 96-웰 편평저 엘리사 플레이트를 코팅하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이팅한다. 다음날, 세척 완충제 (0.05 % PBS-트윈 20)를 사용하여 플레이트를 3x 세척하고, 실온 (RT)에서 차단 완충제 (카세인, 200 μL/웰)를 사용하여 1시간 동안 차단한다. 세척 완충제를 사용하여 플레이트를 3x 세척하고, 결합 단백질 (표 5에 나타낸 바와 같은 것)을 10 μg/mL로 첨가한 후, DPBS (둘베코 하이클론(Dulbecco's HyClone)) 중에 100 uL/웰로 1:3 연속 희석한다. RT에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이팅하고, 세척 완충제를 사용하여 3x 세척한 후, 1 ug/ml의 바이오틴-카파XL을 100 uL/웰로 첨가한다. 다음에, RT에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이팅한 후, 3x 세척하고, 100 uL/웰의 SA-AP를 각 웰에 첨가한 후, RT에서 30분 인큐베이팅한다. 다음에, 플레이트를 3x 세척하고, 100 uL/웰의 PNAP 기질을 첨가한다. 반응을 중지시키고, 405 nm로 설정된 비색 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도를 측정한다. 결과를 표 5에 제공하였다.
표 5의 결과는 cMet 경쇄 Fab 영역만의 일부로서 DKK 포맷을 가지는 cMet-BAH10 IgG 헤테로맙 (2.50 nm) 및 cMet 경쇄 Fab 영역만의 일부로서 ADK를 가지는 cMet-BAH10 IgG 헤테로맙 (1.27 nM) 둘 다가 표 1a의 경쇄 Fab 영역 포맷이 없는 cMet-BAH10 IgG1 헤테로맙 (0.57 nM)과 비교하였을 때 더 낮은 카파 XL 리간드에 대한 결합 친화성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 두 LC의 일부로서 발현되는 DKK 포맷을 가지는 cMet 모체 mAb는 카파 XL 리간드에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 DKK 및 ADK 경쇄 Fab 영역 포맷 둘 다가 다중특이적 결합 단백질의 단일 "아암"상에 도입되는 경우, 카파 XL 리간드에 대한 결합 친화성을 감소시킴으로써, 원치않거나 오염성인 종 (예컨대 플로우 스루 중의 것)의 제거를 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 표 1a의 경쇄 Fab 영역 포맷이 결합 단백질의 더 고도 발현 "아암"으로만 포함되도록 설계되는 다중특이적 결합 단백질에서는 이와 같은 이익이 더 강화될 수 있다는 것에 유의한다.
정제된 항체의 순도, 정체성 및
비균질성
분석
표 1의 중쇄 Fc 영역 및/또는 경쇄 Fab 영역 포맷을 포함하는 다중특이적 결합 단백질을 단백질 A (단계 1) 정제 후 이어지는 카파 XL (단계 2) 정제에 적용한다. 플로우 스루 및 용리 재료를 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 모세관 전기영동 (랩 칩(lab chip) NR ceSDS), 고성능 액체 크로마토그래피 (HIC-HPLC) 및 무손상 질량 분광측정법과 같은 표준 기술에 의해 순도, 정체성 및 비균질성에 대하여 분석한다. SEC는 % 고분자량물질 (HMW), % 전면 숄더(Front shoulder), % 주 피크 및 % 저분자량물질 (LMW)에 대하여 샘플을 분석하는 데에 사용된다. 백분율은 총 AUC에 대한 단량체 피크 전에 용리된 피크의 AUC의 비를 사용한 크로마토그래프의 엠파워(Empower) 분석을 통하여 계산된다. NR ceSDS는 정제된 재료 중 총 Ab (%) 및 ½Ab (%) 농도를 정량하는 데에 사용된다. 각 단계에서 평가된 결합 단백질의 포맷을 표 6, 7 및 8에 제공하였다.
표 6에 나타나 있는 바와 같이, 단계 1 (단백질 A 정제)은 대조 (PD-1-TIGIT IgG1 헤테로맙)와 비교하였을 때 표 1a의 카파 경쇄 Fab 영역 포맷이 HMW 종에 대하여 부정적인 영향을 주지 않음으로써, 표 1a의 경쇄 Fab 영역 포맷이 다중특이적 결합 단백질의 조립에 부정적인 영향을 주지 않는다는 것을 나타내고 있음을 보여준다. 또한, 표 1a 경쇄 Fab 영역 포맷의 주 피크는 대조 (PD-1-TIGIT IgG1 헤테로맙)와 유사하였으며, 표 1a의 경쇄 Fab 영역 이중 및 삼중 포맷 사이에서 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다.
표 7에 나타나 있는 바와 같이, 단계 2 (카파 XL 정제) 용리 프로파일은 본원에서 개시된 표 1a의 카파 경쇄 Fab 영역 포맷이 결핍되어 있는 각 결합 단백질에서의 약 83 %와 비교하였을 때, 주 피크의 순도가 표 1a의 모든 카파 경쇄 Fab 영역 포맷에서 95 % 초과로 증가된다는 것을 보여주었다. 상기 결과는 또한 LMW 피크로 나타나는 바와 같은 불순물이 표 1a의 카파 경쇄 Fab 영역 포맷이 결핍되어 있는 각 결합 단백질에서의 7.7 %에 비해 표 1a의 카파 경쇄 Fab 영역 포맷에서 1.0 % 미만으로 감소된다는 것을 보여준다. 유사하게, NR ceSDS 프로파일은 표 1a의 카파 경쇄 Fab 영역 포맷을 포함하는 전체 결합 단백질의 양이 94 %를 초과하였던 반면, 표 1a의 카파 경쇄 Fab 영역 포맷이 결핍되어 있는 결합 단백질은 겨우 80.2 %라는 것을 보여주었다. 또한, 표 1a의 카파 경쇄 Fab 영역 포맷을 포함하는 결합 단백질의 1/2 Ab 프로파일은 4 % 미만이었던 반면, 표 1a의 카파 경쇄 Fab 영역 포맷이 결핍되어 있는 결합 단백질은 17.8 %였다. 표 1a의 다양한 카파 경쇄 Fab 영역 포맷을 포함하는 상이한 결합 단백질 사이에서 용리 프로파일의 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다.
표 8은 원치않는 불순물 (전면 및 LMW %)이 카파 XL 플로우 스루에서 효과적으로 분리 제거되며, 표 1의 포맷을 포함하는 원하는 다중특이적 결합 단백질이 용리에서 보강된다는 것을 나타낸다. 비변형 대조는 플로우 스루 프로파일에서 관찰되지 않음으로써, 모든 비변형 헤테로맙이 카파 XL 컬럼에 결합하였음을 표시하였다.
표 3-8에 제공된 결과는 표 1a의 변형된 카파 경쇄 Fab 영역 포맷이 강력한 정제를 제공함으로써, 원치않는 종 및/또는 불순물로부터 원하는 다중특이적 결합 단백질을 선택적으로 판별하여 그의 분리를 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
예시적인 다중특이적 결합 단백질의 열 안정성 평가
단백질 A 및 카파 XL 정제 후, 시차 주사 열량법 (DSC)에 의해 본원에서 제공되는 예시적인 다중특이적 결합 단백질의 열안정성을 평가한다. 결과 (폴딩해제 온도는 Tm1으로 기록하였음)를 표 9에 제공하였다.
표 9는 중쇄 Fc 영역 RE 포맷 (cMet 모체 항체의 두 아암상)가 열 안정성에 영향을 주지만, 중쇄 Fc 영역 RE 포맷이 예시적 IgG1 헤테로맙의 하나의 아암의 일부로서만 발현되는 경우 효과가 관찰되지 않는다는 것을 나타내었다. 또한, 모든 변형된 카파 경쇄 Fab 포맷은 각 비변형 모체 분자 대비 유사한 열안정성을 나타내었다.
예시적인 다중특이적 결합 단백질의 결합 친화성 분석
엘리사를 통하여, 본원에서 제공되는 예시적인 다중특이적 결합 단백질의 결합 친화성을 평가한다. 간략하게, 20 ul/웰의 1 ug/mL 항-인간-Fc 단백질을 사용하여 384-웰 편평저 엘리사 플레이트를 코팅하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이팅한다. 다음날, 세척 완충제 (0.05 % PBS-트윈 20)를 사용하여 플레이트를 3x 세척하고, 실온 (RT)에서 차단 완충제 (카세인, 60 μL/웰)를 사용하여 1시간 동안 차단한다. 세척 완충제를 사용하여 플레이트를 3x 세척하고, 표 10에 나타낸 바와 같은 결합 단백질을 DPBS (둘베코 하이클론) 중 20 uL/웰의 3반복으로 1 μg/mL로 첨가한다. RT에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이팅하고, 세척 완충제를 사용하여 3x 세척한 후, 20 ul/웰의 적정된 항원을 첨가하고, RT에서 60분 동안 인큐베이팅한다. 플레이트를 3x 세척하고, 20 uL/웰의 NAAP 기질을 첨가한 후, 20분 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 3x 세척하고, 20 uL/웰의 PNPP 기질을 첨가한 후 반응을 중지시키고, 405 nm로 설정된 비색 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도를 측정한다. 결과는 표 10에 제시되었다.
표 10에 제공되어 있는 이러한 결과는 표 1a의 변형된 카파 경쇄 Fab 영역 포맷을 포함하는 예시적인 다중특이적 결합 단백질이 (비변형 모체 다중특이적 결합 단백질과 비교하였을 때) 표적 항원에 대하여 유사하며 일부 경우에는 향상된 결합 친화성을 유지한다는 것을 나타낸다.
인실리코
면역원성 분석
면역 항원결정인자 데이터베이스 분석(Immune Epitope Database Analysis) (IEDB)을 통한 인실리코(in silico) 면역원성 분석에 의해, 예시적인 다중특이적 결합 단백질의 변형된 중쇄 Fc 영역 및 경쇄 Fab 영역 포맷의 면역원성을 분석한다. 항체 서열의 면역원성 (IG) 점수 및 희귀성(rarity) 점수 (인간 Ig 레파토리에 대비한 상응하는 위치에서의 아미노산 사용 빈도)를 계산한다 (더 낮은 점수는 더 낮은 면역원성을 표시함). 결과를 표 11a 및 11b에 제공하였다.
표 11a 및 11b에 제시된 결과는 표 1a 및 1b의 변형된 경쇄 Fab 영역 및 중쇄 Fc 영역 포맷이 각 비변형 모체 분자와 유사한 IG 및 희귀성 점수를 나타낸다는 것을 보여줌으로써, 변형된 포맷이 면역원성 위험성을 부가하지 않는다는 것을 시사한다.
[서열 목록]
서열식별번호: 1 (예시적인 cMet HC, Fab 영역은 밑줄 표시됨)
서열식별번호: 2 (예시적인 cMet LC)
서열식별번호: 3 (예시적인 BAH10 HC, Fab 영역은 밑줄 표시됨)
서열식별번호: 4 (예시적인 BAH10 LC)
서열식별번호: 5 (예시적인 cMet HC, 밑줄 및 이탤릭체 표시된 RE 포맷을 가짐, Fab 영역은 밑줄 표시됨)
서열식별번호: 6 (예시적인 cMet HC, Fab 영역은 밑줄 표시됨)
서열식별번호: 7 (예시적인 cMet LC, 밑줄 표시된 DKK 포맷을 가짐)
서열식별번호: 8 (예시적인 cMet HC, 밑줄 및 이탤릭체 표시된 RE 포맷을 가짐; Fab 영역은 밑줄 표시됨)
서열식별번호: 9 (예시적인 cMet LC, 밑줄 표시된 ADK 포맷을 가짐)
서열식별번호: 10 (예시적인 PD1 HC, Fab 영역은 밑줄 표시됨)
서열식별번호: 11 (예시적인 PD1 LC)
서열식별번호: 12 (예시적인 TIGIT HC, Fab 영역은 밑줄 표시됨)
서열식별번호: 13 (예시적인 TIGIT LC)
서열식별번호: 14 (예시적인 DKK LC, 밑줄 표시된 DKK 포맷을 가짐)
서열식별번호: 15 (예시적인 PD1 LC, 밑줄 표시된 ADK 포맷을 가짐)
서열식별번호: 16 (예시적인 PD1 LC, 밑줄 표시된 DK 포맷을 가짐)
서열식별번호: 17 (예시적인 PD1 LC, 밑줄 표시된 KK 포맷을 가짐)
SEQUENCE LISTING
<110> Eli Lilly and Company
<120> MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS AND METHODS OF DEVELOPING THE SAME
<130> X22566
<150> US62/994,509
<151> 2020-03-25
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Leu His Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Glu Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Ala Thr Gly Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Asp Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Met Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Ala Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 2
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 2
Arg Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Asp Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Tyr Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Trp Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 3
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Tyr Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Asp Ser Gly Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Arg Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Val Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Val Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Asp Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Lys Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 5
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Leu His Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Glu Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Ala Thr Gly Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Glu Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 6
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Leu His Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Glu Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Ala Thr Gly Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 7
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 7
Arg Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr
20 25 30
Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Asp Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Tyr Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Lys Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Trp Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Lys Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 8
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Leu His Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Glu Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Ala Thr Gly Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Glu Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Asp Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Met Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Ala Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 9
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 9
Arg Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Asp Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Tyr Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Trp Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Lys Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 10
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Tyr Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Ile Pro Ser Phe Asp Thr Ala Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Ala Ile Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Glu His Ser Ser Thr Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Ala Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ala Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Asp Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Met Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Ala Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Asp Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn His Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Arg Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 12
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Pro Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Phe Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Gly Tyr Ala Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Arg Pro Arg Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Val Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Val Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 13
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 13
Arg Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Pro Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Leu Asp Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Arg Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Val His Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Asp Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn His Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Arg Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Lys Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Lys Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Asp Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn His Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Arg Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Lys Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 16
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Asp Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn His Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Arg Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Lys Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 17
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Asp Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn His Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Arg Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Lys Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Lys Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
Claims (56)
- 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 다중특이적 결합 단백질이며,
제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제1 항원 결합 도메인, 및
제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인
을 포함하고,
제1 경쇄 Fab 영역은
아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신,
아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌,
아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산,
아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산,
아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신,
아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌,
아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신,
아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌,
아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신,
아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신, 또는
아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산
을 포함하는 카파 경쇄이고,
제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합하는 것인 다중특이적 결합 단백질. - 제1항에 있어서,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하지 않고,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하지 않고,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하지 않고,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신, 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하지 않고,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하지 않고,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하지 않고,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하지 않고,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산, 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 포함하지 않고,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하지 않고,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하지 않고,
제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 경우, 제2 경쇄 Fab 영역은 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하지 않는 것인
다중특이적 결합 단백질. - 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 다중특이적 결합 단백질로서, 다중특이적 결합 단백질은
제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및
제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인
을 포함하고,
여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합하는 것인,
다중특이적 결합 단백질. - 제3항에 있어서, 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 추가로 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 추가로 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 다중특이적 결합 단백질로서, 다중특이적 결합 단백질은
제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및
제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인
을 포함하고,
여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합하는 것인,
다중특이적 결합 단백질. - 제6항에 있어서, 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 추가로 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 다중특이적 결합 단백질로서, 다중특이적 결합 단백질은
제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및
제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인
을 포함하고,
여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합하는 것인,
다중특이적 결합 단백질. - 제8항에 있어서, 제1 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 추가로 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 다중특이적 결합 단백질로서, 다중특이적 결합 단백질
제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및
제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인
을 포함하고,
여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합하는 것인,
다중특이적 결합 단백질. - 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 다중특이적 결합 단백질로서, 다중특이적 결합 단백질은
제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및
제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인
을 포함하고,
여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합하는 것인,
다중특이적 결합 단백질. - 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 다중특이적 결합 단백질로서, 다중특이적 결합 단백질은
제1 경쇄 Fab 영역 및 제1 중쇄 Fab 영역을 포함하고, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄이고 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 것인 제1 항원 결합 도메인; 및
제2 경쇄 Fab 영역 및 제2 중쇄 Fab 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인
을 포함하고,
여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합하는 것인,
다중특이적 결합 단백질. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 제1 중쇄 Fc 영역을 추가로 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제13항에 있어서, 제1 중쇄 Fc 영역이 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 제2 중쇄 Fc 영역을 추가로 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제15항에 있어서, 제2 중쇄 Fc 영역이 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄 Fc 영역이 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 중쇄 Fc 영역이 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 Fc 영역이 모두 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나; 모두 인간 IgG2 불변 영역을 포함하거나; 또는 모두 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 Fc 영역이 모두 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 포함하는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109의 알라닌을 포함하지 않거나; 아미노산 잔기 110의 아스파르트산을 포함하지 않거나; 아미노산 잔기 143의 리신을 포함하지 않거나; 또는 아미노산 잔기 199의 리신을 포함하지 않는 것인 다중특이적 결합 단백질.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 경쇄 Fab 영역이 카파 경쇄인 다중특이적 결합 단백질.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 경쇄 Fab 영역이 람다 경쇄인 다중특이적 결합 단백질.
- 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 단백질의 정제 방법으로서,
아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계;
다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 및
다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및
정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제24항에 있어서, 도입 단계가 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 도입 단계가 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 단백질의 정제 방법으로서,
아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계;
다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 및
다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및
정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제27항에 있어서, 도입 단계가 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 단백질의 정제 방법으로서,
아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계;
다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 및
다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및
정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제29항에 있어서, 도입 단계가 아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 단백질의 정제 방법으로서,
아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 143 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계;
다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 및
다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및
정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 단백질의 정제 방법으로서,
아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 199 (EU 번호지정)의 리신을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계;
다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 및
다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및
정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 단백질의 정제 방법으로서,
아미노산 잔기 109 (EU 번호지정)의 알라닌 및 아미노산 잔기 110 (EU 번호지정)의 아스파르트산을 포함하는 제1 경쇄 Fab 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 단계로서, 여기서 제1 경쇄 Fab 영역은 카파 경쇄인 단계;
다중특이적 결합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 함께 조립되는 것인 단계; 및
다중특이적 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및
정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 도입 단계가 제1 중쇄 Fc 영역을 제1 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 제1 중쇄 Fc 영역이 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 것인 방법.
- 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 도입 단계가 제2 중쇄 Fc 영역을 제2 항원 결합 도메인에 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 제2 중쇄 Fc 영역이 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 것인 방법.
- 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 도입 단계가 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 제1 중쇄 Fc 영역에 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 도입 단계가 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 제2 중쇄 Fc 영역에 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄 Fc 영역 및 제2 중쇄 Fc 영역이 모두 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나; 모두 인간 IgG2 불변 영역을 포함하거나; 또는 모두 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 것인 방법.
- 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 도입 단계가 아미노산 잔기 311 (EU 번호지정)의 아르기닌 및 아미노산 잔기 317 (EU 번호지정)의 글루탐산을 제1 중쇄 Fc 영역 및 제2 중쇄 Fc 영역 모두에 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109의 알라닌을 포함하지 않거나; 아미노산 잔기 110의 아스파르트산을 포함하지 않거나; 아미노산 잔기 143의 리신을 포함하지 않거나; 또는 아미노산 잔기 199의 리신을 포함하지 않는 것인 방법.
- 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 경쇄 Fab 영역이 아미노산 잔기 109의 알라닌을 포함하지 않고; 아미노산 잔기 110의 아스파르트산을 포함하지 않고; 아미노산 잔기 143의 리신을 포함하지 않고; 아미노산 잔기 199의 리신을 포함하지 않는 것인 방법.
- 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 경쇄 Fab 영역이 카파 경쇄인 방법.
- 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 경쇄 Fab 영역이 람다 경쇄인 방법.
- 제24항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 컬럼이 카파 친화성 리간드를 포함하는 것인 방법.
- 제24항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 컬럼이 람다 친화성 리간드를 포함하는 것인 방법.
- 제24항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 컬럼이 단백질 A를 포함하는 것인 방법.
- 제24항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 경쇄 Fab 영역이 제1 경쇄 Fab 영역에 비해 더 큰 친화성으로 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하는 것인 방법.
- 제24항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 경쇄 Fab 영역이 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하지 않는 것인 방법.
- 제24항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:
정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계 후 정제된 다중특이적 결합 단백질을 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계; 및
정제된 다중특이적 결합 단백질을 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계 후 정제된 다중특이적 결합 단백질을 회수하는 단계. - 제51항에 있어서, 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼이 카파 친화성 리간드를 포함하는 것인 방법.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼이 람다 친화성 리간드를 포함하는 것인 방법.
- 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼이 단백질 A를 포함하는 것인 방법.
- 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 경쇄 Fab 영역이 제1 경쇄 Fab 영역에 비해 더 큰 친화성으로 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하는 것인 방법.
- 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 경쇄 Fab 영역이 제2 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하지 않는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202062994509P | 2020-03-25 | 2020-03-25 | |
| US62/994,509 | 2020-03-25 | ||
| PCT/US2021/022935 WO2021194839A1 (en) | 2020-03-25 | 2021-03-18 | Multispecific binding proteins and methods of developing the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220156912A true KR20220156912A (ko) | 2022-11-28 |
Family
ID=75478220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020227036637A Ceased KR20220156912A (ko) | 2020-03-25 | 2021-03-18 | 다중특이적 결합 단백질 및 그의 개발 방법 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230242671A1 (ko) |
| EP (1) | EP4126929A1 (ko) |
| JP (1) | JP7664943B2 (ko) |
| KR (1) | KR20220156912A (ko) |
| CN (1) | CN115605506A (ko) |
| AU (2) | AU2021241426A1 (ko) |
| BR (1) | BR112022018452A2 (ko) |
| CA (1) | CA3173162A1 (ko) |
| IL (1) | IL296428A (ko) |
| MX (1) | MX2022011847A (ko) |
| WO (1) | WO2021194839A1 (ko) |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE122009000068I2 (de) * | 1994-06-03 | 2011-06-16 | Ascenion Gmbh | Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern |
| EP1272647B1 (en) | 2000-04-11 | 2014-11-12 | Genentech, Inc. | Multivalent antibodies and uses therefor |
| US7612181B2 (en) | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
| US20070122404A1 (en) * | 2005-11-17 | 2007-05-31 | O'keefe Theresa L | Humanized immunoglobulin reactive with alpha4beta7 integrin |
| WO2007110205A2 (en) | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Merck Patent Gmbh | Engineered heterodimeric protein domains |
| DK2235064T3 (en) | 2008-01-07 | 2016-01-11 | Amgen Inc | A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects |
| WO2010151792A1 (en) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format |
| TWI743461B (zh) | 2011-03-28 | 2021-10-21 | 法商賽諾菲公司 | 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白 |
| JP6435193B2 (ja) | 2011-10-19 | 2018-12-05 | ノビミューン エスアー | 抗体を精製する方法 |
| PT2825559T (pt) | 2012-03-13 | 2019-06-07 | Novimmune Sa | Anticorpos biespecíficos prontamente isolados com formato de imunoglobulina nativo |
| US10047167B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-14 | Eli Lilly And Company | Methods for producing fabs and bi-specific antibodies |
| MA41375A (fr) | 2015-01-22 | 2017-11-28 | Lilly Co Eli | Anticorps igg bispécifiques et leurs procédés de préparation |
| US20180201693A1 (en) * | 2015-07-09 | 2018-07-19 | Genmab A/S | Bispecific and multispecific antibodies and method for isolation of such |
| SG11201810470XA (en) * | 2016-06-10 | 2018-12-28 | Eisai R&D Man Co Ltd | Lysine conjugated immunoglobulins |
| WO2018224951A2 (en) * | 2017-06-05 | 2018-12-13 | Janssen Biotech, Inc. | Engineered multispecific antibodies and other multimeric proteins with asymmetrical ch2-ch3 region mutations |
| KR20240056666A (ko) * | 2017-06-05 | 2024-04-30 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 이중특이성 항체 생성을 위한 표면 전하 조작 방법 |
-
2021
- 2021-03-18 JP JP2022557816A patent/JP7664943B2/ja active Active
- 2021-03-18 CA CA3173162A patent/CA3173162A1/en active Pending
- 2021-03-18 AU AU2021241426A patent/AU2021241426A1/en not_active Abandoned
- 2021-03-18 IL IL296428A patent/IL296428A/en unknown
- 2021-03-18 CN CN202180038085.0A patent/CN115605506A/zh active Pending
- 2021-03-18 WO PCT/US2021/022935 patent/WO2021194839A1/en not_active Ceased
- 2021-03-18 US US17/905,520 patent/US20230242671A1/en active Pending
- 2021-03-18 BR BR112022018452A patent/BR112022018452A2/pt unknown
- 2021-03-18 MX MX2022011847A patent/MX2022011847A/es unknown
- 2021-03-18 EP EP21718331.8A patent/EP4126929A1/en active Pending
- 2021-03-18 KR KR1020227036637A patent/KR20220156912A/ko not_active Ceased
-
2025
- 2025-08-14 AU AU2025217346A patent/AU2025217346A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115605506A (zh) | 2023-01-13 |
| BR112022018452A2 (pt) | 2022-11-01 |
| US20230242671A1 (en) | 2023-08-03 |
| JP7664943B2 (ja) | 2025-04-18 |
| WO2021194839A1 (en) | 2021-09-30 |
| AU2021241426A1 (en) | 2022-10-06 |
| CA3173162A1 (en) | 2021-09-30 |
| IL296428A (en) | 2022-11-01 |
| EP4126929A1 (en) | 2023-02-08 |
| AU2025217346A1 (en) | 2025-09-04 |
| MX2022011847A (es) | 2023-01-04 |
| JP2023525444A (ja) | 2023-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113501878B (zh) | 针对人tslp的多种抗体及其用途 | |
| CA2122732C (en) | Multivalent antigen-binding proteins | |
| CA1341411C (en) | Method for producing fv fragments in eukaryotic cells | |
| US20190330329A1 (en) | Human anti-il-33 neutralizing monoclonal antibody | |
| JP7566856B2 (ja) | 多重特異的抗体を調製するためのポリペプチドリンカー | |
| JP6734467B2 (ja) | 抗ｐｃｓｋ９モノクローナル抗体 | |
| AU2021398061B2 (en) | Anti-lag-3 monoclonal antibody and antigen binding fragment thereof, and use thereof | |
| BG60716B1 (en) | Specific binding agents | |
| CN108178799B (zh) | 一种抗ca125糖类抗原的纳米抗体及其应用 | |
| US20200299413A1 (en) | Stable multispecific antibodies | |
| JP2023524515A (ja) | インターロイキン－３４を標的とする化合物及び方法 | |
| CN116554323B (zh) | 人源化抗il21抗体的开发和应用 | |
| CN117820480A (zh) | 纳米抗体串联体、编码基因及应用 | |
| JP2022542088A (ja) | 抗ｂｃｍａ抗体、その抗原結合断片、及びそれらの医療用途 | |
| JP7664943B2 (ja) | 多重特異性結合タンパク質およびそれを開発する方法 | |
| JP7734856B2 (ja) | 二重特異性抗体及びその使用 | |
| CN113512119B (zh) | 一种抗ca125的纳米抗体5d2及其应用 | |
| RU2753973C2 (ru) | Терапевтическое антитело, специфичное к интерлейкину-11, ингибирующее сигналирование через его рецептор, и способ его использования для лечения пациентов | |
| US12516114B2 (en) | Human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody | |
| CN117843802B (zh) | 串联抗体及其下游产品和应用 | |
| RU2765689C2 (ru) | Моноклональные антитела к с-концевому фрагменту антимюллерова гормона | |
| WO2022262828A1 (zh) | 抗il-36r抗体及其用途 | |
| WO2022138707A1 (ja) | 筋萎縮性側索硬化症の治療用医薬組成物 | |
| CN120173099A (zh) | 一种抗pT181 Tau蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| CN113999306A (zh) | 一种获得识别空间构象表位抗体的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E13-X000 | Pre-grant limitation requested |
St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000 |
|
| P11-X000 | Amendment of application requested |
St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000 |
|
| P13-X000 | Application amended |
St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000 |
|
| PA0105 | International application |
St.27 status event code: A-0-1-A10-A15-nap-PA0105 |
|
| PA0201 | Request for examination |
St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201 |
|
| PG1501 | Laying open of application |
St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501 |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902 |
|
| P11-X000 | Amendment of application requested |
St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000 |
|
| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
St.27 status event code: N-2-6-B10-B15-exm-PE0601 |
|
| T11 | Administrative time limit extension requested |
Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: U-3-3-T10-T11-OTH-X000 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE) |
|
| T11-X000 | Administrative time limit extension requested |
St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000 |
|
| E13 | Pre-grant limitation requested |
Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-2-3-E10-E13-LIM-X000 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE) |
|
| E13-X000 | Pre-grant limitation requested |
St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000 |
|
| P11 | Amendment of application requested |
Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-2-2-P10-P11-NAP-X000 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE) |
|
| P11-X000 | Amendment of application requested |
St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000 |
|
| T13 | Administrative time limit extension granted |
Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: U-3-3-T10-T13-OTH-X000 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE) |
|
| T13-X000 | Administrative time limit extension granted |
St.27 status event code: U-3-3-T10-T13-oth-X000 |