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KR20220081301A - 감초 및 상백피를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

감초 및 상백피를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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KR20220081301A
KR20220081301A KR1020210173842A KR20210173842A KR20220081301A KR 20220081301 A KR20220081301 A KR 20220081301A KR 1020210173842 A KR1020210173842 A KR 1020210173842A KR 20210173842 A KR20210173842 A KR 20210173842A KR 20220081301 A KR20220081301 A KR 20220081301A
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KR1020210173842A
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Inventor
김만종
최사랑
최믿음
최원기
Original Assignee
농업회사법인 주식회사 루아흐
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Publication date
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Abstract

본 발명은 감초 및 상백피를 포함하는 기관지 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물에 관한 것으로, 이들은 감초 및 상백피 추출 복합물을 포함함으로써 염증인자 개선을 통한 염증 완화 효과가 있다.

Description

감초 및 상백피를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING INFALMMATORY DISEASE COMPRISING GLYCYRRHIZA GLABRA L. AND ORUS ALBA L.}
본 명세서는 2020년 12월 8일에 한국특허청에 제출된 한국 특허 출원 제10-2020-0170811호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용 전부는 본 발명에 포함된다.
본 발명은 감초 및 상백피를 포함하는 기관지 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물을 제공한다.
염증(inflammation)이란 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 뜻한다. 구체적으로, 외부 세균이 특정 조직에 침입하여 증식을 하게 되면 생체의 백혈구가 이를 인지하여 증식된 외부 세균을 활발히 공격하게 되는데, 이 과정 중 발생되는 백혈구의 사해가 균에 의하여 침입받은 조직에 축적됨과 동시에 백혈구에 의하여 사멸된 침입균의 세포 파괴물이 침입받은 조직 내로 융해되어 농양이 형성된다. 염증에 의한 농양의 치료는 소염작용을 통하여 촉진될 수 있는데, 소염작용이란 항균제를 이용하여 침입균의 증식을 억제하거나 농양중에 축적된 이물질들을 탐식하는 대식세포 (macrophage)를 활성화하여 상기 이물질들을 소화 및 배설하는 대식세포의 기능을 항진시키는 등의 염증치료 촉진작용이다.
일반적으로 염증반응은 생체의 세포나 조직에 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 및 재생하기 위한 생체방어 반응과정이고, 이 반응과정에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 정상적으로 외부 침입균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증성 질환이라 한다. 상기 염증성 질환은 외부자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 류마티스관절염과 같은 관절내에서의 질환, 건선 등의 형태로 나타나는 피부질환 및 기관지 천식 등의 알러지성 염증질환 등을 포함한다.
많은 염증관련 질환의 발병에는 대식세포의 활성화와 이에 따른 염증관련 인자들의 과도한 생성이 연관되어 있는데, 대표적인 염증관련 인자들로는 IL-1β, TNF-α 및 일산화질소(nitrogen oxide, NO) 등이 있다. 염증반응 중 활성화된 백혈구(monocytes) 및 대식세포에 의한 일산화질소(NO)의 생성이 강력한 염증반응을 개시하고, 세균 병원체에 대한 초기 면역 반응에서 가장 중요한 부분이 된다(Bogdan C, Nat.Immunol., 2:907-916, 2001). 또한, 염증반응의 결과로서, 유도성 일산화질소합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)에 의해 생성된 일산화질소(NO)의 상기 생리학적 농도(supraphysiological concentrations)가 다양한 염증질환의 병리생물 학에 있어서 역할을 하고 있다고 여겨지고 있다(Clancy RM et al., Arthritis. Rheum., 41:1141-1151, 1998).
현재 염증치료제로는 부신피질 호르몬 성분을 이용한 덱사메타손(Dexamethasone), 코티손(cortisone) 등이 있다. 그러나 이들은 염증 치료제로서 작용을 하기는 하나, 독성이 강하며 부작용으로서 부종과 같은 증상을 일으키기도 한다. 또한, 염증 원인에 대하여 선택적으로 작용하지 못하여 심한 면역억제를 유발하는 문제가 생기는 경우도 있다(Check WA & Kaliner MA, Am. Rev. Respir. Dis., 141:44-51. 1990). 현재까지 존재하는 항염증제는 부신피질 호르몬 성분을 이용한 스테로이드 약제로 부종과 같은 심한 부작용을 나타내므로 새로운 염증설 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 소재가 절실히 요청된다.
이에, 본 발명자들은 다양한 약재의 세포독성, 염증성 지표를 확인, 분석하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양상은 감초 및 상백피 추출 복합물을 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 감초 및 상백피 추출 복합물을 포함하는 피부 염증 완화 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 감초 및 상백피 추출 복합물을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
감초 및 상백피 추출 복합물을 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "감초"는 콩과의 식물로, 학명은 Glycyrrhiza glabra L. 이고 포함하는 성분으로는 글리시리진산(Glycyrrhetinic acid), 글리시리진(Glycyrrhizin) 등 테르펜 화합물과 리퀴리티게닌(Liquiritigenin), 리퀴리틴(Liquiritin) 등 플라보노이드가 알려져 있으며 수집종과 재배방법에 따라 그 성분의 차이가 나타난다고 보고되고 있다. 활성성분인 글리시리진(Glycyrrhizin)은 신경 세포주 PC12 cell에서 독성을 유발하였을 때 독성완화 활성에 대한 연구결과가 보고되었으며, 리퀴리티게닌 (Liquiritigenin)은 황사에 포함된 중금속인 카드뮴을 투입한 동물실험에서 독성을 줄여준다는 연구결과가 보고된 바 있다.
상기 "상백피"는 뽕나무과(Moraceae)에 속하는 낙엽교목인 뽕나무(Morus alba L.) 및 동속식물의 수피로서, 그 성분으로는 움벨리페론(Umbelliferone), 스코폴레틴(scopoletin), 모루신(morusin), 멀베린(mulberrin), 등을 함유하고, 이뇨작용, 혈압강하작용 등의 효능이 알려져 있다.
본 발명에서의 "추출 복합물"은 복수의 원료 각각으로부터 추출한 추출물을 혼합한 것뿐만 아니라 복수의 원료를 함께 추출한 것, 복수의 원료 중 일부로부터 추출한 추출물에 다른 원료를 혼합하여 추출한 것도 포함한다.
상기 "추출물(extract)"은, 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온, 저온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
본 발명에서의 "염증성 질환"이란, 급성 또는 만성 염증질환, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 비염, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증, 동맥경화, 심장병 질환, 다발성 경화증, 파킨슨씨 병, 알츠하이머 병, 결장암 등을 비롯한 질환, 구체적으로는 기관지에 관련된 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염을 포함하는 것으로 해석될 수 있고, 동물의 기관지 염증을 포함하는 것으로도 해석될 수도 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 개체에 염증 질환이 발생할 경우, 사이토카인과 같은 다양한 염증인자 또는 이를 암호화 하는 유전자의 발현이 증가하는데, 유효성분이 염증 질환의 예방 또는 치료의 효과가 있는 경우 증가한 염증인자의 발현이 줄어든다.
본 발명에서의 "완화"는 본 발명의 조성물의 투여로 염증성 질환의 증상을 줄이거나 누그러뜨리는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서의 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 염증성 질환의 증상을 억제시키거나 진행을 지연 시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서의 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 염증성 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학적 조성물은 인간을 포함한 동물의 염증 질환을 치료, 경감, 처치 또는 예방을 목적으로 사용하는 약재를 의미한다. 구체적으로는 인간 또는 반려동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방을 목적으로 사용하는 약재를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 추출 복합물은 감초 추출물 및 상백피 추출물을 혼합한 것, 즉, 감초 추출물 및 상백피 추출물의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 감초 추출물 및 상백피 추출물은 정제수, C1 내지 C4 알코올 중 어느 하나 이상의 용매로 추출한 것일 수 있고, 구체적으로 상기 감초 추출물 및 상백피 추출물은 50 내지 70% 에탄올 용매 추출물일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 감초 추출물 및 상백피 추출물은 70% 에탄올로 추출된 것일 수 있다. 상기 감초 추출물 및 상백피 추출물은 70% 에탄올을 감초 또는 상백피 각각의 16배수 용매로 첨가하고 70 내지 80℃에서 6시간 추출 후 로터리 증발기를 활용하여 농축한 뒤 동결 건조하여 제조될 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 추출 복합물은 감초 추출물 및 상백피 추출물을 1:2 내지 2:1 비율로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 감초 추출물 및 상백피 추출물은 1:2, 1:1 또는 2:1 비율로 포함하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 1:2 또는 2:1의 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 비율 범위 외의 경우 본 발명이 목적하는 염증인자 개선을 통한 염증 질환 개선 효과를 얻을 수 없다.
본 발명의 다른 일 구체예에서 상기 추출 복합물은 농도가 50 내지 100μg/ml일 수 있고, 더욱 구체적으로 추출 복합물은 농도가 100μg/ml일 수 있다. 본 발명의 추출 복합물이 상기한 범위 외의 농도일 경우 본 발명이 목적하는 염증인자 개선을 통한 염증 질환 개선 효과를 얻을 수 없다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 염증성 질환 완화, 예방 또는 치료용일 수 있다. 상기 염증성 질환 완화, 예방 또는 치료용 조성물은 인간을 포함한 동물의 염증성 질환을 치료, 경감, 처치 또는 예방을 목적으로 사용하는 약재를 의미한다. 구체적으로는 인간, 또는 인간을 제외한 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방을 목적으로 사용하는 약재를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 호흡기 질환 완화, 예방 또는 치료용일 수 있다. 상기 호흡기 질환 완화, 예방 또는 치료용 조성물은 인간을 포함한 동물의 호흡기 질환을 치료, 경감, 처치 또는 예방을 목적으로 사용하는 약재를 의미한다. 구체적으로는 인간, 또는 인간을 제외한 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방을 목적으로 사용하는 약재를 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 호흡기 질환은 염증성 호흡기 질환일 수 있고, 보다 더 구체적으로 기도 과민반응, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 폐손상(acute lung injury), 농흉, 폐농양, 폐렴, 폐결핵, 기침, 가래, 기관지염, 인후염, 편도염, 부비동염, 비염, 폐쇄성 세기관지염 및 후두염으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, "동물"은 반려동물을 포함하며, 상기 반려동물은 구체적으로 강아지, 고양이, 햄스터, 토끼, 닭, 이구아나, 기니피그, 저빌, 달팽이, 라쿤, 앵무새, 도마뱀, 열대어를 포함한 어류 등 인간과 더불어 살아가는 동물의 종류는 불문하고 모두 포함할 수 있다.
후술되는 실험예에서 확인되는 바와 같이 상기한 본 발명의 추출 복합물은 단독 추출물 대비 염증성 질환 개선과 관련된 바이오마커에서 고른 개선능을 나타내었다. 특히, 추출 복합물은 전반적으로 우수한 효능을 나타내었으나, 이 중 감초 추출물 및 상백피 추출물을 2:1 비율로 100 ㎍/㎖ 농도일 경우 가장 안정적이고 우수한 효능을 확인하였다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 조성물 중의 추출 복합물의 함량은 동물의 종, 주령, 체중, 및 사육 조건 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출 복합물을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 0.1 중량% 내지 99 중량%, 또는 1 중량% 내지 20 중량% 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 추출물의 함량은 약학적으로 유효한 양 또는 바람직한 양으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다. 상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려 진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 투여 대상의 종류, 연령, 성별, 체중, 증상, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 0.01 내지 1000 mg/일로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 할 수도 있고, 수회 나누어 할 수도 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물의 투여량은 10 내지 2000 mg/kg/일 수 있고, 보다 구체적으로 10 mg/kg/일 이상, 20 mg/kg/일 이상, 30 mg/kg/일 이상, 40 mg/kg/일 이상, 50 mg/kg/일 이상, 60 mg/kg/일 이상, 70 mg/kg/일 이상, 80 mg/kg/일 이상, 90 mg/kg/일 이상, 100 mg/kg/일 이상, 110 mg/kg/일 이상, 120 mg/kg/일 이상, 130 mg/kg/일 이상, 140 mg/kg/일 이상, 150 mg/kg/일 이상, 160 mg/kg/일 이상, 170 mg/kg/일 이상, 180 mg/kg/일 이상, 190 mg/kg/일 이상, 200 mg/kg/일 이상, 250 mg/kg/일 이상, 300 mg/kg/일 이상, 400 mg/kg/일 이상, 500 mg/kg/일 이상, 600 mg/kg/일 이상, 700 mg/kg/일 이상, 800 mg/kg/일 이상 또는 900 mg/kg/일 이상일 수 있고, 2000 mg/kg/일 이하, 1900 mg/kg/일 이하, 1800 mg/kg/일 이하, 1700 mg/kg/일 이하, 1600 mg/kg/일 이하, 1500 mg/kg/일 이하, 1400 mg/kg/일 이하, 1300 mg/kg/일 이하, 1200 mg/kg/일 이하, 1100 mg/kg/일 이하, 1000 mg/kg/일 이하, 900 mg/kg/일 이하, 800 mg/kg/일 이하, 700 mg/kg/일 이하, 600 mg/kg/일 이하, 500 mg/kg/일 이하, 400 mg/kg/일 이하, 300 mg/kg/일 이하, 290 mg/kg/일 이하, 280 mg/kg/일 이하, 270 mg/kg/일 이하, 260 mg/kg/일 이하, 250 mg/kg/일 이하, 240 mg/kg/일 이하, 230 mg/kg/일 이하, 220 mg/kg/일 이하, 210 mg/kg/일 이하, 200 mg/kg/일 이하, 190 mg/kg/일 이하, 180 mg/kg/일 이하, 170 mg/kg/일 이하, 160 mg/kg/일 이하, 150 mg/kg/일 이하, 140 mg/kg/일 이하, 130 mg/kg/일 이하, 120 mg/kg/일 이하, 110 mg/kg/일 이하, 100 mg/kg/일 이하, 90 mg/kg/일 이하, 80 mg/kg/일 이하, 70 mg/kg/일 이하, 60 mg/kg/일 이하, 50 mg/kg/일 이하, 40 mg/kg/일 이하 또는 20 mg/kg/일 이하일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 투여량은 연령, 성별, 체중, 질병의 정도, 투여경로 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 상기 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 피부 염증의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 본 발명의 추출 복합물 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 및/또는 부성분을 더 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 추출 복합물 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.
상기 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다.
상기 약학적 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 상기 제형의 예로 연고, 크림, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 수용액, 비수성용제, 현탁제 및 유제로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 일 수 있다.
상기 제형을 위하여 부형제, 일 예로 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등을 더욱 포함할 수 있다.
일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(TABLETS), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 산제(POWDERS) 및 과립제(GRANULES) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제 될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
또한, 경구 투여를 위한 액상제제에는 현탁제(SUSTESIONS), 내용액제, 유제(EMULSIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
피부 투여를 위해 언급할 수 있는 예로는 더스팅 파우더, 에멀젼, 현탁액, 오일, 스프레이, 연고, 그리지 연고, 크림 페이스트, 겔, 폼, 또는 용액을 생성시키는데 적합하고, 경피 약물 전달체(TTS: Transdermal therapeuticsystem)에 적합한 담체 및/또는 부형제가 있다. 본 발명의 국소용 약학제제는 반고체상 제형일 수 있으며 특히 연고(용액 연고, 현탁액 연고), 크림, 겔 또는 페이스트가 있다. 유상에 주로 사용되는 것은 지방 알콜, 예를 들면 라우릴 알코올, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 지방산, 예를 들면 팔미트산 또는 스테아르산, 액상 또는 고체상 파라핀 또는 오조케라이트, 액상 내지 고체상 왁스, 예를 들면 이소프로필 미리스테이트, 천연 지방 또는 일부 합성 지방, 예를 들면 코코넛 지방산 트리글리세라이드, 경화유, 예를 들면 수소화된 피넛 또는 캐스터 오일, 또는 글리세롤의 지방산 부분 에스테르, 예를 들면 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 디스테아레이트가 있다. 적합한 유화제로는 계면활성제, 예를 들어 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리알코올 또는 이것의 산화에틸렌 부가물의 지방산 에스테르, 예컨대 폴리글리세롤 지방산 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대 소르비탄 올레에이트 및/또는 소르비탄 이소스테아레이트 등, 이소스테아레이트, 스테롤, 또는 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르 또는 지방산 에스테르, 예를 들어 음이온성 계면활성제, 예를 들면 지방 알코올 설포네이트의 알칼리 금속염, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 세틸 설페이트 또는 나트륨 스테아릴 설페이트가 있으며 이들은 상기 지방 알코올, 예를 들면 세틸 알코올 또는 스테아릴 알코올의 존재 하에서 일반적으로 사용된다. 이 중에서도 특히 크림 건조를 방지하는 제제, 예를 들면 폴리알코올, 예컨대 글리세롤, 소르비톨, 프로필렌 글리콜 및/또는 폴리에틸렌 글리콜을 수상에 첨가하거나 또는 보존제, 향료 등을 수상에 첨가하는 것이 가능하다.
본 발명의 약학적 조성물은 무수상태의 연고일 수 있고, 국소용도에 적합하고 체온상태에서 액체인 파라핀, 특히 저점도 파라핀을 함유하거나, 또는 상기 천연지방 또는 부분합성 지방, 예를 들면, 코코넛 지방산 트리글리세라이드, 경화유, 예를 들면 수소화된 피넛 도는 캐스터 오일, 글리세롤의 지방산 부분 에스테르, 예를 들면 글리세롤 모노스테아레이트 및 디스테아레이트, 실리콘, 예를 들면 폴리메틸실록산, 예컨대 헥사메틸디실록산 또는 옥타메틸트리실록산을 함유할 수 있으며, 예를 들어 수성크림과 관련되어 있고 수분 흡수 용량을 증가시키는 지방 알코올, 그리고 스테롤, 울 왁스, 다른 유화제 및/또는 기타 첨가제를 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물을 의약품으로 제형화할 경우 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명의 다른 일 양상은 피부 개선용 조성물을 포함하는 피부 염증 완화 화장료 조성물을 제공한다.
상기 피부 염증 완화 화장료 조성물은 전술한 추출 복합물을 포함하고, 상기 추출 복합물은 염증인자 개선을 통한 염증 완화 효과가 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 상기 추출 복합물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코 시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 감초 및 상백피 추출 복합물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 전술한 감초 및 상백피 추출 복합물을 포함하고, 감초 및 상백피 추출 복합물은 염증인자 개선을 통한 염증 완화 효과가 있다.
본 발명에서의 "식품 조성물"이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서 건강기능식품, 기능성식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함한다.
상기 식품 조성물은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등일 수 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료 (예, 과실 및 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 식품, 기능성식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 감초 및 상백피를 포함하는 기관지 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물은 감초 및 상백피 추출 복합물을 포함함으로써 염증인자 개선을 통한 염증 완화 효과가 있다.
도 1 은 RAW 264.7에 대한 증류수 또는 주정 (70% 에탄올) 시료 추출물의 세포독성 효과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 RAW 264.7 세포들은 시료의 100 및 200 (㎍/㎖) 농도로 24시간 처리되었다. 세포독성은 MTT 분석으로 측정되었고, 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3).
도 2는 글리시리진 기준 용액 (500 ㎍/㎖) (A) 및 감초 추출물 (B)의 HPLC 크로마토그램 및 UV 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 3은 LPS-유도된 RAW 264.7 세포의 산화질소 (nitric oxide, NO) 수준에 대한 증류수 (A), 70%에탄올 (B) 시료 추출물의 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 100 ㎍/㎖의 에탄올/증류수 시료 추출물 및 LPS (1 ㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, 산화질소는 ELISA로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05).
도 4는 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 RAW 264.7 세포의 세포 생존율에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물로 24시간 처리되었고, 세포독성은 MTT로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3).
도 5는 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 LPS유도-RAW 264.7 세포의 산화질소 (nitric oxide, NO)에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물 및 LPS (1㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, NO수준은 ELISA로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 ***p<0.001).
도 6은 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 LPS유도-RAW 264.7 세포의 PGE2 생성량 에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물 및 LPS (1㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, PGE2 생성량 수준은 ELISA로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 **p<0.001, *p<0.05).
도 7은 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 LPS유도-RAW 264.7 세포의 IL-1β 생성량 에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물 및 LPS (1㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, IL-1β 생성량 수준은 Luminex로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 ***p<0.0001, **p<0.001).
도 8은 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 LPS유도-RAW 264.7 세포의 IL-6 생성량 에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물 및 LPS (1㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, IL-6 생성량 수준은 Luminex로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 ***p<0.0001, **p<0.001).
도 9는 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 LPS유도-RAW 264.7 세포의 TNF-α 생성량 에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물 및 LPS (1㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, TNF-α 생성량 수준은 Luminex로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 ***p<0.001, **p<0.01).
도 10은 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 LPS유도-RAW 264.7 세포의 iNOS 발현량에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물 및 LPS (1㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, iNOS 발현량 수준은 Luminex로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 ***p<0.0001, **p<0.001, *p<0.005).
도 11은 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 LPS유도-RAW 264.7 세포의 COX-2 발현량에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물 및 LPS (1㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, COX-2 발현량 수준은 웨스턴블랏으로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 ***p<0.0001, **p<0.001, *p<0.005).
도 12는 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 LPS유도-RAW 264.7 세포의 IL-1β 발현량 에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물 및 LPS (1㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, IL-1β 발현량 수준은 웨스턴블랏으로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05).
도 13은 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 LPS유도-RAW 264.7 세포의 IL-6 발현량 에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물 및 LPS (1㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, IL-6 발현량 수준은 웨스턴블랏으로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 **p<0.01).
도 14는 감초 및 상백피 70% 에탄올 복합 추출물의 LPS유도-RAW 264.7 세포의 TNF-α 발현량 에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 50, 100 ㎍/㎖의 시료 추출물 및 LPS (1㎍/㎖)로 24시간 처리되었고, TNF-α 발현량 수준은 웨스턴블랏으로 분석되었다. 측정값은 대조군 대비 백분율로 표시되었다 (평균±표준편차, n=3) (대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함 **p<0.01).
도 15는 기관지 염증성 천식 모델에서 감작(sensitization), OVA (ovalbumin) 챌린지 및 처리의 실험 프로토콜을 나타내는 도이다.
도 16은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 특이적-IgE 수준에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 17은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 PGE2 수준에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 ***p<0.001에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 18은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 히스타민 수준에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05, **p<0.01에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 19는 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 WBC(백혈구) 수에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 20은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 백혈구 내 호산구 수에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 **p<0.01, ***p<0.001에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 21은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 백혈구 내 호중구 수에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 **p<0.01, ***p<0.001에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 22는 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 백혈구 내 단핵구 수에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 23은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 백혈구 내 림프구 수에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하였다.
도 24는 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 PLT 수에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 **p<0.01에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 25는 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 IL-1β 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 26은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 IL-4 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 27은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 IL-5 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 28은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 IL-6 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 29는 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 IL-10 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 30은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 IL-13 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 31은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 IL-17 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 32는 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 IFN-γ 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 33은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 TNF-α 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 34는 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 NFK-кB 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 35는 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 iNOS 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 36은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 비장의 COX-2 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이며, 데이터 값은 평균±SD (n=6)으로 표현되었고, student's t-검정을 사용하여 *p<0.05에서 대조군과 유의한 차이를 비교하였다.
도 37 및 38은 감초복합물의 OVA-유도된 기관지 면역저하 마우스에서 폐의 조직병리학적 변화에 미치는 효과를 나타내는 사진으로서, 도 37은 폐 조직을 H&E (x200)으로 염색한 결과를 나타내는 도이고, 도 38은 폐 조직을 PAS (x200)으로 염색한 결과를 나타내는 도이다. 구체적으로, 무처리군인 정상군(Nor); 기관지 면역저하군인 대조군(Con); 용각산 처리군인 양성 대조군(PC); 감초복합물을 50 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (50); 감초복합물을 100 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (100); 감초복합물을 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여한 군 (200)이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험재료
1) 시료
본 실험에 사용한 분말 시료 10종은 주관기관인 ㈜루아흐에서 준비하고 초저온 냉동고(-80 ℃)에서 보관하면서, 필요한 농도를 증류수로 제조하여 사용하였으며, 본 연구에서 스크리닝 및 복합물 연구에 사용한 10종 시료 및 추출에 사용한 용매에 대한 정보는 표 1과 같다.
Samples
(botanical Name) 		Solvent
DW 70% EtOH
감초
Glycyrrhiza glabra L.		 O O
길경
Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC.		 O O
대조Zizyphus jujuba Mill. O O
모과Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. O O
곤포Ecklonia kurome Okam. O O
석창포Acorus gramineus var. pusill (Siebold) Engl. O O
상백피Morus alba L. O O
오미자Schizandra sphenanthera Rehd. et Wils. O O
유근피Ulmus pumila L. O O
황기Astragalus membranaceus var. mongholicus Bunge O O
구체적으로, 상기 분말 시료들은 상기 원료들을 증류수 또는 주정 (70% 에탄올)을 활용하여 용매 16배수로 70 내지 80℃ 하에 6시간 이상 무압력 추출하였다 (경서 E&P COSMO660). 이후 회전 농축기(회전농축기 HS-2005S)를 활용하여 농축하였고, 동결건조기. (동결건조기 MLB-9003)를 활용하여 동결건조 후 분말 시료로 활용하였다.
2) 시약
본 실험에 사용된 시약은 dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS : Welgene, Korea), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM:Gibco BRL Co., U.S.A.), 우태아혈청 (fetal bovine serum,FBS : Invitrogen Co., U.S.A.), penicillin/streptomycin (Gibco BRL Co., U.S.A.), cell viability assay kit (Daeillab sevice, Korea), lipopolysaccharide (LPS:Sigma Co., U.S.A.), nitric oxide detection kit (Intron Biotechnology, Korea), As, Pb, Hg, Cd standard solution (SCP Science, Canada), water (Duksan, Korea), acetonitrile (Duksan, Korea), mouse cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), prostaglandin E2 parameter assay kit (R&D system, U.S.A.), protease inhibitor cocktail (Sigma, U.S.A.), phosphatase inhibitor cocktail 2 (Sigma, U.S.A.), phosphatase inhibitor cocktail 3 (Sigma, U.S.A.), bovine serum albumin (BSA : Gendepot, U.S.A.), miracle-star™ western blot detection system (Intron Biotechnology, Korea), IL-1β Antibody (Cell signaling, U.S.A.), IL-6 Antibody (Cell signaling, U.S.A.), TNF-α Antibody (Cell signaling, U.S.A.), COX-2 Antibody (Cell signaling, U.S.A.), iNOS Antibody (Cell signaling, U.S.A.), β-actin Antibody (Cell signaling, U.S.A.), peroxidase-conjugated affinipure rabbit anti-goat IgG (Jackson immunoresearch,U.S.A.), peroxidase-conjugated affinipure goat anti-mouse IgG (H+L) (Jackson immunoresearch,U.S.A.), OVA albumin (Sigma, U.S.A.), Aluminium hydroxide gel (invivogen, U.S.A.), Mouse OVA specific IgE ELISA kit (Biolegend, U.S.A.), Histamine assay kit (Biomax, Korea), Mouse PGE2 ELISA kit (Mybiosource, U.S.A.), total RNA prep Kit (Intronbio. Co., U.S.A.), Accu Power RT Premix (Bioneer Co., Korea), Primer (Bioneer Co., Korea), Accu Power HotStart PCR Premix (Bioneer Co., Korea), Agarose A (Cosmo Co., U.S.A.), 50ХTAE (Bioneer Co., Korea) 등을 사용하였다.
3) 기기
본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench (Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo Co., Japan), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), centrifuge (Sigma Co., U.S.A.), ELISA reader (MolecularDevices Co., U.S.A.), ICP (Shimadzu, Co., Japan), 수은분석기 (TELEDYNE Leeman Labs, U.S.A.), HPLC (Shimadzu, Co., Japan), Luminex (Millipore, U.S.A.), mini trans-Blot® (Bio-RAD, U.S.A.), funsion FX (Vilber, U.S.A.), plate shaker (Lab-Line Co., U.S.A.), Submarine electrophoresis system (Mupid-exu Co., Japan), Fusion Quick Guide (Vilber Lourmant Co., France), Thermal Cycler D-360 (Thermal Dynamic, Co., U.S.A.) 등을 사용하였다.
4) 실험동물 사양 및 관리
본 실험에 사용된 실험동물은 수컷 6주령의 BALB/c 수컷 생쥐(20 ~22 g)를 ㈜라온바이오에서 공급받았으며 실험 당일까지 충분한 고형사료와 물을 공급하고 온도 22 ± 2 ℃, 습도 55 ± 15%, 12시간-12시간(light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다.
실험방법
1) RAW 264.7 세포 배양
동결된 RAW 264.7 세포를 50 ㎖ 튜브에 옮기고 PBS 9 ㎖을 넣어 세포를 부유시킨 뒤 1,200 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin/streptomycin으로 조성된 DMEM 배지 1 ㎖을 넣어 부유시켜 세포 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 계대배양 횟수는 5회 이상으로 하였고, 시료들을 처리하기 전에 24시간을 적응시켰다.
2) 세포 독성 측정
실험이 가능한 농도 선택을 위해 세포 독성 측정을 다음과 같이 진행하였다. RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.5×105 cells/well로 분주하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, 시료 20종을 100, 200 (㎍/㎖) 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 WST solution을 첨가하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
이후 확인된 세포 독성 결과를 바탕으로 20종의 시료에서 공통으로 독성이 검출되지 않은 최고 농도를 선정하여 연구를 진행하였으며, 스크리닝 결과를 근거로 선택한 감초와 상백피 주정 추출물 역시 복합비율로 나누어 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 위와 같은 방법과 동일하게 독성을 확인하였다.
3) 중금속 검사
납, 비소, 카드뮴 분석은 시료 0.5 g을 극초단파 시료전처리장치 전용용기에 넣고 질산 10 ㎖을 넣은 후, 용기를 후드 안에 정치시켜 발생 가스를 제거하고 극초단파 시료전처리장치를 사용하여 분해하였다. 분해가 끝난 다음 분해액을 여과지로 여과하여 용량플라스크에 넣고 물을 넣어 적절하게 표준액의 농도범위로 희석하여 검액으로 하였다. 따로 질산 10 ㎖를 극초단파 시료전처리장치 전용용기에 넣어 검액 조제와 같은 방법으로 조작하여 공시험액으로 사용하였다. 준비된 검액, 표준액 및 공시험액을 가지고 유도결합플라즈마분광계 (ICP)를 이용하여 검량선을 작성하고 공시험액으로 보정하여 검액을 측정하였다.
수은 분석은 시료 50 ㎎을 특별한 전처리 과정 없이 수은 분석기를 이용하여 측정하였다.
4) Glycyrrhizic acid 함량 분석
감초의 대표적 성분인 glycyrrhizic acid 함량을 분석하기 위해 감초 건조 분말 0.5 g을 정해진 조건에 의해 초음파 추출기(WUC-A22H, Daihan Scientific, Wonju, Korea)로 추출한 후 여과 및 정용하여 분석시험액으로 사용하였다. 분석시험액을 0.45 μm 필터로 vial에 여과 후 high-performance liquid chromatography(HPLC)/diode-array detector(DAD)로 분석하여 농도를 산출하였으며, HPLC 분석조건은 표 2와 같다.
Item Condition
Instrumnet SHIMADZU LC20A series
Column Agilent eclipse plus C18 (250×4.6) mm with Guard column
Eluent A (DW), B (Acetonitrile) gradient
5%B (0~15 min), 5%B~10%B (15~100 min)
Wave length UV 251 nm
Column Temp. 30℃
Injection 10 ㎕
5) Nitric oxide (NO) 생성량 측정
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.5×105 cells/well로 분주하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, 시료 20종 100 ㎍/㎖의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, kit에 동봉된 N1 buffer 50 ㎕를 각 well에 처리하여 10분간 상온에서 반응시킨 후, N2 buffer 50 ㎕를 각 well에 처리하고 10분간 반응시켰다. 반응 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준 곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였으며, 대조군 대비 백분율로 환산하여 NO 생성량을 확인하였다.
이후 진행된 감초와 상백피 추출물은 복합비율로 나누어 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 NO 생성량을 RAW 264.7 세포로 위와 같은 방법과 동일하게 진행하였다.
6) Prostaglandin E2 (PGE 2 ) 생성량 측정
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.5×105 cells/well로 분주하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, 감초와 상백피 추출물을 복합비율로 나누어 50, 100 ㎍/㎖의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하고 획득한 상층액을 통해 다음과 같이 측정하였다.
96 well plate에 standard와 Control, 측정 시료 등 150 ㎕를 넣고 추가로 primary antibody 50 ㎕를 넣어 1시간 동안 plate shaker를 이용하여 혼합하였다. 이후, PGE2 conjugate 50 ㎕를 넣고 다시 2시간 동안 plate shaker를 이용하여 혼합하고 wash buffer 400 ㎕씩 넣어 washing 작업을 실행한 후 substrate solution 200 ㎕를 첨가하고 상온에서 30분 동안 빛을 차단한 채 반응시켰다. 마지막으로 stop solution 100 ㎕를 넣고 450 nm 파장에서 측정하였다.
7) 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) 생성량 측정
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.5×105 cells/well로 분주하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, 감초와 상백피 추출물을 복합비율로 나누어 50, 100 ㎍/㎖의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하고 획득한 상층액을 통해 다음과 같이 측정하였다.
96 well plate에 standard와 Control, 측정 시료 등 25 ㎕를 넣고 assay buffer 및 matrix buffer, antibody-immobilized beads를 각 25 ㎕씩 가하여 혼합한 후 2시간 동안 실온에서 반응시키고 washing 완충 용액을 이용하여 2회 세척하였다. 이를 다시 25 ㎕의 detection antibody을 가하여 1시간 동안 실온에서 빛을 차단한 채 반응시키고 추가로 25 ㎕의 Streptavidin-Phycoerythrin을 가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 washing 완충 용액을 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후 PBS를 150 ㎕ 넣고 Luminex를 이용하여 측정하였다.
8) 단백질(iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α) 발현량 측정
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.5×105 cells/well로 분주하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, 감초와 상백피 추출물을 복합비율로 나누어 50, 100 ㎍/㎖의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하고 획득한 세포를 통해 다음과 같이 측정하였다.
측정 시료 세포에 protease inhibitor cocktail Ⅰ, phosphatase inhibitor Ⅱ,Ⅲ가 포함된 RIPA buffer를 넣어 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 pierce BCA protein assay kit를 이용하여 정량하였으며, sample loading buffer와 섞어 95℃에서 5분간 반응시켜 준비하였다. 준비된 단백질은 10% acrylamide gel을 통해 SDS-PAGE하여 크기별로 분리하였으며, PVDF membrane에 이동시켰다. 단백질이 옮겨진 membrane을 3% BSA에 담가 상온에서 2시간동안 반응시켰다. TBS-T buffer를 이용하여 3회 세척하고 IL-1β (1:1000), IL-6 (1:1000), TNF-α (1:1000), COX-2 (1:1000), iNOS (1:1000), β-actin (1:1000) first antibody를 넣어 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 다시 3회 세척하고 secondary antibody (1:10000)를 넣어 상온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 다시 10회 세척하고 ECL solution을 통해 단백질을 발색시켰다. 이후, chemidoc fusion FX를 통해 단백질 발현량을 분석하였다. 분석 결과는 β-actin 발현량을 기준으로 LPS 및 시료를 처리하지 않은 정상군의 결과를 계산하고 정상군을 기준으로 대조군과 실험군의 결과를 백분율로 표시하였다.
9) 난알부민-유도 기관지 면역 모델 제작 및 실험군 분류
알레르기성 천식 동물모델을 제작하기 위해 먼저, 난알부민(ovalbumin, chicken egg albumin; OVA) 1 ㎎을 PBS와 수산화알루미늄 겔[Al(OH)3 gel]을 1:1 비율로 혼합한 용액을 0.3 ㎖씩 실험 시작일로부터 7일 간격으로 하루에 1번 0일, 7일, 14일에 마우스에게 복강으로 주사하였다. 이후 마지막 복강 주사 7일 후인 21일부터 마우스를 50x15x50 ㎝ 크기의 아크릴상자(pie cage) 안에 넣고 네블라이저(nebulizer) 기기와 연결하여 PBS로 희석된 1% OVA 용액을 매일 1회(30분, 구동 유속 3 ㎖/분) 분사함으로써 호흡을 통한 천식을 유발하였다.
실험군은 천식을 유발하지 않은 정상군(이하, Nor로 표기)과 OVA 용액 분사 직후 증류수만을 경구투여하는 음성대조군(이하, Con으로 표기), OVA 용액 분사 직후 용각산을 성인기준 1일 복용 최대치인 1.8 g을 마우스 체중으로 환산하여 투여한 양성대조군(이하, PC로 표기), 감초복합물(감초와 상백피가 2:1 비율로 혼합된 복합물)을 50 ㎎/㎏/day(이하, 50로 표기), 100 ㎎/㎏/day(이하, 100으로 표기), 200 ㎎/㎏/day(이하, 200으로 표기) 등 총 6개 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다.
분석을 위한 동물의 희생은 정상군을 제외한 실험군의 OVA 용액 분사와 약물을 경구 투여하는 기간(총 9일) 후 2일 후(31일 차)에 진행하였으며, 혈액채취와 조직(비장, 폐) 적출과 안락사 등은 동물실험윤리 위원회의 승인을 받은 방법에 의거하여 수행하였다.
10) 혈액 분석
혈액 분석을 위해 동물 희생 시 심장 천자법을 이용하여 채혈하였으며, 전혈 200 ㎕는 EDTA tube에 옮긴 후 남은 혈액은 상온에서 30분간 보관하고 15분간 3,000 rpm에서 원심 분리하여 혈청을 분리하여 실험을 진행하였다.
(1) Specific-IgE 생성량 분석(혈청)
96 well plate에 standard와 혈청 시료를 50 ㎕를 넣고 추가로 50 ㎕의 Matrix A 용액(standard) 또는 Assay buffer(혈청 시료)를 넣은 후 2시간 동안 반응(plate shaker, 200 rpm)시켰다. 이후 washing 작업을 실행한 후, 100 ㎕의 IgE detection antibody를 넣고 1시간 반응시키고 washing 작업을 진행하였다. 다시 100 ㎕의 Avidin-HRP D solution을 넣고 30분간 반응시킨 후 washing 작업을 진행하였고 100 ㎕의 Substrate solution F를 넣은 뒤 15분간 반응시켰다. 마지막으로 100 ㎕의 Stop solution을 가하여 ELISA reader 450 nm 파장에서 측정하였으며, standard curve를 기준으로 결과를 도출하였다.
(2) Histamine 함량 분석(혈청)
96 well plate에 standard와 혈청 시료를 50 ㎕를 넣고 추가로 50 ㎕의 Background 용액(0 ppm) 또는 Reaction mix 용액(standard 및 혈청 시료)를 넣은 후 30℃에서 10분간 반응시켰다. 이후, ELISA reader 570 nm 파장에서 측정하였으며, standard curve를 기준으로 결과를 도출하였다.
(3) PGE 2 생성량 분석(혈청)
96 well plate에 standard와 혈청 시료를 100 ㎕를 넣고 1시간 30분 동안 반응(37℃ incubator)시키고 washing 작업을 실행한 후, 100 ㎕의 Biotinylated antibody solution을 넣고 1시간 반응시켰다. 이후, washing 작업을 진행하고 100 ㎕의 Enzyme conjugate solution을 넣어 30분간 반응시킨 후 다시 washing 작업을 수행하였다. 마지막으로 100 ㎕의 Color reagent solution을 가하여 30분 반응 후 100 ㎕의 Color reagent C solution을 추가하고 ELISA reader 450 nm 파장에서 측정하였으며, standard curve를 기준으로 결과를 도출하였다.
(4) 면역 세포 수 및 혈소판 검사
면역 세포 수(백혈구, 백혈구 내 호중구, 호산구, 림프구, 단핵구) 및 혈소판 검사를 위해 혈청을 분리하지 않은 전혈을 KP&T (Korea)에 분석 의뢰하여 결과를 도출하였다.
11) 유전자 발현 측정
유전자 발현 측정을 위해 동물 희생 시 개복 후 획득한 비장조직을 PBS에 세척하여 불순물을 제거하고 실험을 진행하였다.
(1) RNA 추출
비장조직을 균질화하고 Binding buffer 400 ㎕와 혼합 후 천천히 흔들고 column에 용액을 주입하였다. 이를 다시 4℃ 원심분리기로 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 washing buffer를 넣고 다시 원심 분리하였다. washing buffer를 다시 넣어 수세한 후 elution buffer 50 ㎕를 넣고 반응시키고 원심 분리하여 total RNA를 추출하였다.
(2) 역전사 반응
RT premix kit의 mixture (reaction buffer, dNTPs mixture, RNase inhibitor, stabilizer, oligo dT15 primer)를 사용하여 total RNA 1 ㎍이 되도록 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리된 증류수에 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하여 첨가하였다. 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 45℃에서 60분 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 후 95℃에서 5분 동안 반응시키고 M-MLV RT를 불활성화하여 합성이 완료된 cDNA를 유전자 발현량 측정에 사용하였다.
(3) Real-time PCR
합성이 완료된 cDNA를 증폭시키기 위하여 real-time PCR을 진행하였으며, real-time 전용 tube에 cDNA 1 ㎕, 각 primer 2 ㎕, SYBR Green 10 ㎕, DEPC-DW 5 ㎕씩 넣어 95℃에서 2분 동안 반응한 다음 95℃에서 5초, 62.5℃에서 30초를 40회 반복하여 진행하고 이후 유전자 발현량은 대조군 대비 계산하였으며, 사용한 primer의 sequence는 표 3과 같다.
프라이머 F/R 서열 (5`->3`) 크기 (bp)
IL-1β F GCCACCTTTTGACAGTGATGAG 135
R ATGTGCTGCTGCGAGATTTG
IL-2 F CTGAAACTCCCCAGGATGCTC 102
R CCGCAGAGGTCCAAGTTCATC
IL-4 F CCATATCCACGGATGCGACA 118
R CGTTGCTGTGAGGACGTTTG
IL-5 F TGAGACGATGAGGCTTCCTG 105
R CCCCCACGGACAGTTTGATT
IL-6 F CCCCAATTTCCAATGCTCTCC 141
R CGCACTAGGTTTGCCGAGTA
IL-10 F CGCTGTCATCGATTTCTCCC 106
R CATTCATGGCCTTGTAGACACC
IL-13 F GGCAGCATGGTATGGAGTGT 132
R CTTGCGGTTACAGAGGCCAT
IL-17A F TCCAAACACTGAGGCCAAGG 120
R GACGTGGAACGGTTGAGGTA
TNF-α F GATCGGTCCCCAAAGGGATG 129
R TTTGCTACGACGTGGGCTAC
IFN-γ F CACGGCACAGTCATTGAAAGC 115
R CATCCTTTTGCCAGTTCCTCC
COX-2 F CCGTGGGGAATGTATGAGCA 128
R GGGTGGGCTTCAGCAGTAAT
NF-кB1 F CTGCCAAAGAAGGACACGACA 130
R GGCAGGCTATTGCTCATCACA
iNOS F GCTCCAGCATGTACCCTCAG 127
R AAGGCATCCTCCTGCCCACT
β-actin F AGGGAAATCGTGCGTGACAT 95
R TCCAGGGAGGAAGAGGATGC
* F:forward, R:reverse
12) 조직병리학 분석
조직병리학 분석을 위해 동물 희생 시 개복 후 획득한 폐 조직을 10% 중성 포르말린에 48시간 고정한 후 KP&T (Korea)에 hematoxyline과 eosin (H&E) 염색과 Periodic acid-Schiff (PAS) 염색 후 진행한 스캐닝 결과를 Motic DSAssistant (China) 프로그램을 통해 분석하였다.
3. 통계처리
본 연구의 실험 결과는 그룹별로 평균값±표준 편차(mean±S.D.)로 표시하였다. 그룹 간의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 이용하였고, student's t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였다(***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함).
실험결과
1. 추출물의 선정
1-1 세포독성 확인
RAW 264.7 세포를 통해 시료 20종의 세포 독성을 측정한 결과는 표 4 및 도 1과 같다. 시료 처리를 하지 않은 대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때, 시료 20종 중 200 ㎍/㎖ 농도에서 열수 추출물인 오미자, 주정 추출물인 석창포, 상백피, 오미자 등이 대조군 대비 15% 이상의 세포 독성이 확인되었다(표 4, 도 1A 및 B). 이를 제외한 모든 추출물과 농도에서는 대조군 대비 15% 이하의 생존율이 나타나 안전한 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 바탕으로 이후 모든 실험은 모든 시료에서 독성이 확인되지 않은 100 ㎍/㎖ 농도로 진행하였다.
Sample Name Control DW extracts 70% EtOH extracts
100 ㎍/㎖ 200 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖ 200 ㎍/㎖
감초 100.0±1.0 104.1±0.2 97.2±0.7 98.3±0.5 86.1±0.2
길경 107.3±2.2 105.3±1.7 94.4±1.2 90.6±0.0
대조 93.0±0.8 90.0±0.3 92.6±0.1 88.0±0.6
모과 96.2±0.7 90.4±1.1 94.5±0.3 90.6±0.1
곤포 94.0±0.5 85.7±0.5 94.5±0.0 88.9±0.1
석창포 97.2±0.2 86.7±0.2 94.7±1.0 84.8±0.7
상백피 97.6±0.5 93.1±0.4 86.0±0.1 80.1±0.3
오미자 88.2±0.3 81.2±1.1 86.6±0.6 79.4±0.9
유근피 92.6±0.2 90.6±1.2 89.0±0.5 86.9±0.4
황기 97.1±0.1 96.5±0.6 98.6±0.5 94.5±0.6
1-2. 중금속 함량 확인
시료 20종의 중금속 함량을 측정한 결과, 카드뮴, 납, 비소, 수은 모두 기준치 이하로 검출되었거나 검출되지 않았다(표 5).
Pb As Cd Hg
permissive density (㎎/㎏) 5 3 0.3 0.2
DW
extracts		 감초 ND1) ND1) 0.002 ND1)
길경 ND1) ND1) 0.001 ND1)
대조 ND1) ND1) ND1) ND1)
모과 ND1) ND1) ND1) ND1)
곤포 ND1) 0.178 0.003 ND1)
석창포 ND1) ND1) ND1) ND1)
상백피 ND1) ND1) 0.001 ND1)
오미자 ND1) ND1) ND1) ND1)
유근피 ND1) ND1) ND1) ND1)
황기 ND1) ND1) ND1) ND1)
80% EtOH
extracts		 감초 ND1) ND1) 0.002 ND1)
길경 ND1) ND1) 0.001 ND1)
대조 ND1) ND1) ND1) ND1)
모과 ND1) ND1) ND1) ND1)
곤포 ND1) 2.115 0.015 ND1)
석창포 ND1) ND1) ND1) ND1)
상백피 0.116 ND1) ND1) ND1)
오미자 ND1) ND1) ND1) ND1)
유근피 ND1) ND1) ND1) 0.005
황기 ND1) ND1) ND1) ND1)
1)N.D. : Not detected.
1-3. Glycyrrhizic acid 함량 확인
감초 추출물의 glycyrrhizic acid 함량을 측정한 결과, DW와 주정 추출물은 각각 16.98, 15.44 ㎎/g으로 확인되었다(도 2).
1-4. NO 생성량 확인
RAW 264.7 세포를 통해 시료 20종의 NO 생성량을 측정한 결과는 표 6 및 도 3과 같다. LPS만을 처리한 대조군을 100.0±4.8%로 나타냈을 때, 시료 20종은 대조군 대비 열수 추출물은 곤포, 주정 추출물은 석창포, 오미자, 유근피, 황기를 제외한 시료에서 약 15% 이상 유의적인 생성량 감소가 나타났다(표 6, 도 3).
Sample Name Normal Control 100 ㎍/㎖
DW 70% EtOH
감초 10.8±1.6 100.0±4.8 28.2±0.9 84.2±0.3
길경 78.6±0.9 78.7±0.3
대조 85.0±0.4 82.4±0.3
모과 76.7±0.4 74.4±0.3
곤포 91.3±0.6 84.2±0.9
석창포 74.0±0.7 89.4±0.9
상백피 61.1±0.8 71.4±0.5
오미자 76.1±0.4 92.1±0.5
유근피 76.3±1.2 88.3±3.6
황기 78.7±1.2 97.1±0.5
상기와 같은 실험 결과를 종합하면, 세포 독성을 측정한 결과, 시료 20종 중 200 ㎍/㎖ 농도에서 열수 추출물인 오미자, 주정 추출물인 석창포, 상백피, 오미자 등이 대조군 대비 15% 이상의 사멸이 일어나 세포 독성이 확인되었고 100 ㎍/㎖ 농도는 열수 및 주정 추출물 모두 85% 이상의 생존율을 나타내었다. 중금속 함량을 확인한 결과, 시료 20종은 카드뮴, 납, 비소, 수은 모두 미검출 또는 기준치 이하로 검출되었다. 감초 추출물의 지표 성분인 glycyrrhizic acid 함량을 확인한 결과, 열수 추출물과 주정 추출물은 각각 16.98, 15.44 ㎎/g으로 확인되었다. NO 생성량을 측정한 결과, 시료 20종은 대조군 대비 열수 추출물은 곤포, 주정 추출물은 석창포, 오미자, 유근피, 황기를 제외한 시료에서 약 15% 이상 유의적인 생성량 감소가 나타났다. 따라서, 이하에서는 감초 추출물 및 상백피 추출물을 선정하여 실험하였다.
2. 추출 복합물의 특성 확인
2-1. 세포 독성 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 세포 독성을 측정한 결과는 표 7 및 도 4와 같다. 시료 처리를 하지 않은 대조군을 100.0±0.3%로 나타냈을 때, 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물은 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리 후 대조군과 차이를 보이지 않아 독성이 나타나지 않았다(표 7, 도 4).
Sample Name Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 100.0±0.3 100.6±3.5 99.1±0.7
감초:상백피
복합물 (1:2)		 100.4±0.4 100.1±0.6
감초:상백피복합물 (2:1) 100.8±2.0 100.3±1.3
2-2. NO 생성량 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 NO 생성량을 측정한 결과는 표 8, 도 5와 같다. LPS만을 처리한 대조군은 100.0±5.5%, LPS와 시료를 처리하지 않은 정상군은 100.0±5.5%로 나타났다. 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물을 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 감초 및 상백피 주정 복합물은 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 유의성 있는(***p<0.001) 감소가 나타났다(표 8, 도 5).
Sample Name Normal Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 15.6±0.3 100.0±5.5 67.4±5.7*** 49.5±3.1***
감초:상백피
복합물 (1:2)		 73.5±5.4*** 53.9±1.8***
감초:상백피복합물 (2:1) 59.7±3.0*** 39.1±1.9***
***p<0.001 대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함
2-3. PGE 2 생성량 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 PGE2 생성량을 측정한 결과는 표 9, 도 6과 같다. LPS만을 처리한 대조군은 584.8±33.0 pg/㎖, LPS와 시료를 처리하지 않은 정상군은 87.7±18.8 pg/㎖로 나타났다. 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물을 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 감초 및 상백피 주정 복합물은 1:1과 1:2 비율의 50 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 유의성 있는(**p<0.01, *p<0.05) 감소가 나타났다(표 9, 도 6).
Sample Name Normal Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 87.7±18.8 536.6±23.4 536.6±23.4 422.0±27.8**
감초:상백피
복합물 (1:2)		 560.5±28.2 479.6±18.9**
감초:상백피복합물 (2:1) 505.5±25.4* 399.0±6.1**
2-4. 사이토카인 생성량 확인
2-4-1. IL-1β 생성량 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 IL-1β 생성량을 측정한 결과는 표 10, 도 7과 같다. LPS만을 처리한 대조군은 150.6±1.6 pg/㎖, LPS와 시료를 처리하지 않은 정상군은 13.8±2.6 pg/㎖로 나타났다. 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물을 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 감초 및 상백피 주정 복합물은 1:2 비율의 50 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 유의성 있는(***p<0.001, **p<0.01) 감소가 나타났다(표 10, 도 7).
Sample Name Normal Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 13.8±2.6 150.6±1.6 124.0±2.8** 104.6±3.4***
감초:상백피
복합물 (1:2)		 133.6±2.8 103.7±2.5***
감초:상백피복합물 (2:1) 123.5±2.9** 93.5±3.1***
***p<0.001, **p<0.01 대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함
2-4-2. IL-6생성량 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 IL-6 생성량을 측정한 결과는 표 11, 도 8과 같다. LPS만을 처리한 대조군은 235.8±8.8 pg/㎖, LPS와 시료를 처리하지 않은 정상군은 57.2±11.0 pg/㎖로 나타났다. 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물을 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 감초 및 상백피 주정 복합물은 1:2 비율의 50 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 유의성 있는(***p<0.001, **p<0.01) 감소가 나타났다(표 11, 도 8).
Sample Name Normal Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 57.2±11.0 235.8±8.8 176.7±8.2** 139.8±9.3***
감초:상백피
복합물 (1:2)		 210.7±10.4 147.8±7.9***
감초:상백피복합물 (2:1) 178.9±9.8** 129.8±11.4***
***p<0.001, **p<0.01 대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함
2-4-3. TNF-α 생성량 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 TNF-α 생성량을 측정한 결과는 표 12, 도 9와 같다. LPS만을 처리한 대조군은 953.7±53.4 pg/㎖, LPS와 시료를 처리하지 않은 정상군은 253.4±53.9 pg/㎖로 나타났다. 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물을 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 감초 및 상백피 주정 복합물은 1:2 비율의 50 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 유의성 있는(***p<0.001, **p<0.01) 감소가 나타났다(표 12, 도 9).
Sample Name Normal Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 253.4±53.9 953.7±53.4 735.5±34.3** 553.5±55.2***
감초:상백피
복합물 (1:2)		 854.2±55.2 652.7±55.1***
감초:상백피복합물 (2:1) 654.1±56.1*** 453.1±55.7***
***p<0.001, **p<0.01 대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함
2-5. 유전자 발현량 확인
2-5-1. iNOS 유전자 발현량 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 iNOS 발현량을 측정한 결과는 표 13, 도 10과 같다. LPS만을 처리한 대조군은 1.00±0.06%, LPS와 시료를 처리하지 않은 정상군은 0.09±0.01%로 나타났다. 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물을 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 감초 및 상백피 주정 복합물은 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 유의성 있는(***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05) 감소가 나타났다(표 13, 도 10).
Sample Name Normal Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 0.09±0.01 1.00±0.06 0.68±0.02** 0.38±0.02***
감초:상백피
복합물 (1:2)		 0.85±0.03* 0.48±0.04***
감초:상백피복합물 (2:1) 0.67±0.06** 0.29±0.02***
***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함
2-5-2. COX-2 유전자 발현량 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 COX-2 발현량을 측정한 결과는 표 14, 도 11과 같다. LPS만을 처리한 대조군은 1.00±0.04%, LPS와 시료를 처리하지 않은 정상군은 0.03±0.01%로 나타났다. 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물을 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 감초 및 상백피 주정 복합물은 1:2 비율의 50 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 유의성 있는(***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05) 감소가 나타났다(표 14, 도 11).
Sample Name Normal Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 0.03±0.01 1.00±0.04 0.76±0.10* 0.68±0.05**
감초:상백피
복합물 (1:2)		 1.01±0.02 0.82±0.01*
감초:상백피복합물 (2:1) 0.76±0.02** 0.62±0.05***
***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함
2-5-3. IL-1β 유전자 발현 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 IL-1β 발현량을 측정한 결과는 표 15, 도 12와 같다. LPS만을 처리한 대조군은 1.00±0.04%, LPS와 시료를 처리하지 않은 정상군은 0.10±0.05%로 나타났다. 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물을 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 감초 및 상백피 주정 복합물은 1:2 비율의 50 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 유의성 있는(***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05) 감소가 나타났다(표 15, 도 12).
Sample Name Normal Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 0.10±0.05 1.00±0.04 0.82±0.07* 0.52±0.03***
감초:상백피
복합물 (1:2)		 0.95±0.01 0.63±0.08**
감초:상백피복합물 (2:1) 0.76±0.07* 0.46±0.02***
***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함
2-5-4. IL-6 유전자 발현량 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 IL-6 발현량을 측정한 결과는 표 16, 도 13과 같다. LPS만을 처리한 대조군은 1.00±0.09%, LPS와 시료를 처리하지 않은 정상군은 0.03±0.00%로 나타났다. 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물을 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 감초 및 상백피 주정 복합물은 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 유의성 있는(**p<0.01) 감소가 나타났다(표 16, 도 13).
Sample Name Normal Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 0.03±0.00 1.00±0.09 0.55±0.04** 0.48±0.05**
감초:상백피
복합물 (1:2)		 0.64±0.06** 0.47±0.06**
감초:상백피복합물 (2:1) 0.55±0.06** 0.47±0.01**
**p<0.01 대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함
2-5-5. TNF-α 유전자 발현량 확인
RAW 264.7 세포를 통해 감초와 상백피 복합물의 TNF-α 발현량을 측정한 결과는 표 17, 도 14와 같다. LPS만을 처리한 대조군은 1.00±0.06%, LPS와 시료를 처리하지 않은 정상군은 0.18±0.02%로 나타났다. 대조군의 조건에 감초 및 상백피 주정을 1:1, 1:2, 2:1 비율로 혼합한 복합물을 각각 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 감초 및 상백피 주정 복합물은 1:2 비율의 50 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 유의성 있는(***p<0.001, *p<0.05) 감소가 나타났다(표 17, 도 14).
Sample Name Normal Control RAW 264.7 cell
50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
감초:상백피
복합물 (1:1)		 0.18±0.02 1.00±0.06 0.83±0.02* 0.55±0.02***
감초:상백피
복합물 (1:2)		 1.03±0.07 0.85±0.05*
감초:상백피복합물 (2:1) 0.80±0.07* 0.49±0.05***
***p<0.001, *p<0.05 대조군과 비교하여 유의한 경우 표시함
3-1. Specific-IgE 생성량
혈청 내 Specific-IgE 생성량을 측정한 결과, 정상군은 2.4±0.5 ng/㎖, 음성대조군은 7.2±1.4 ng/㎖, 양성대조군은 7.3±2.7 ng/㎖, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 7.2±1.6 ng/㎖, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 5.9±1.2 ng/㎖, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 5.8±1.4 ng/㎖로 나타나 음성대조군 대비 감초복합물을 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 16).
3-2. PGE 2 생성량
혈청 내 PGE2 생성량을 측정한 결과, 정상군은 32.2±2.0 pg/㎖, 음성대조군은 71.5±5.1 pg/㎖, 양성대조군은 15.6±3.8 pg/㎖, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 33.2±8.8 pg/㎖, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 32.3±3.1 pg/㎖, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 31.1±3.9 pg/㎖로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(***p<0.001) 감소가 나타났다(도 17).
3-3. Histamine 생성량
혈청 내 Histamine 생성량을 측정한 결과, 정상군은 21.3±4.1 ppm, 음성대조군은 39.2±3.0 ppm, 양성대조군은 33.4±7.1 ppm, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 34.7±0.7 ppm, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 32.1±4.5 ppm, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 29.3±0.5 ppm로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 실험군에서 유의성 있는(**p<0.01, *p<0.05) 감소가 나타났다(도 18).
3-4. 면역 세포 수
3-4-1. 백혈구(White blood cells)
혈액 내 백혈구 수를 측정한 결과, 정상군은 2.1±0.2 (x103 cells/㎕), 음성대조군은 3.0±0.3 (x103 cells/㎕), 양성대조군은 2.5±0.4 (x103 cells/㎕), 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 2.0±0.4 (x103 cells/㎕), 100 ㎎/㎏/day 투여군은 1.8±0.4 (x103 cells/㎕), 200 ㎎/㎏/day 투여군은 1.5±0.5 (x103 cells/㎕)로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 19).
3-4-2. 백혈구 내 호산구(Eosinophil)
혈액의 백혈구 내 호산구 수를 측정한 결과, 정상군은 1.5±0.2%, 음성대조군은 2.4±0.2%, 양성대조군은 1.5±0.2%, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 2.4±0.2%, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 2.0±0.1%, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 1.8±0.1%로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 실험군에서 유의성 있는(***p<0.001, **p<0.01) 감소가 나타났다(도 20).
3-4-3. 백혈구 내 호중구(Neutrophil)
혈액의 백혈구 내 호중구 수를 측정한 결과, 정상군은 20.8±5.8%, 음성대조군은 26.9±5.2%, 양성대조군은 25.4±9.5%, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 25.7±5.8%, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 25.1±6.7%, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 25.4±4.1%로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 실험군은 감소가 나타났으나, 유의성을 보이진 않았다(도 21).
3-4-4. 백혈구 내 단핵구(Monocyte)
혈액의 백혈구 내 단핵구 수를 측정한 결과, 정상군은 2.9±1.2%, 음성대조군은 5.0±1.5%, 양성대조군은 4.5±0.9%, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 5.2±0.7%, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 4.7±0.9%, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 4.2±0.3%로 나타나 음성대조군 대비 감초복합물을 200 ㎎/㎏/day로 투여한 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 22).
3-5-5. 백혈구 내 림프구(Lymphocyte)
혈액의 백혈구 내 림프구 수를 측정한 결과, 정상군은 74.9±8.5%, 음성대조군은 65.7±5.6%, 양성대조군은 68.6±10.2%, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 67.0±11.6%, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 68.4±9.0%, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 68.0±7.2%로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 실험군은 증가가 나타났으나, 유의성을 보이진 않았다(도 23).
3-5. 혈소판(Platelet) 수
혈액 내 혈소판 수를 측정한 결과, 정상군은 679.2±304.9 (x103 cells/㎕), 음성대조군은 1637.4±312.0 (x103 cells/㎕), 양성대조군은 1378.0±229.8 (x103 cells/㎕), 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 1374.9±206.6 (x103 cells/㎕), 100 ㎎/㎏/day 투여군은 1277.3±303.4 (x103 cells/㎕), 200 ㎎/㎏/day 투여군은 1209.5±95.6 (x103 cells/㎕)로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 24).
3-6. 유전자 발현량
3-6-1. IL-1β
비장조직으로 IL-1β 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 0.4±0.0, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 0.7±0.1, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 0.5±0.0, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 0.4±0.1로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 25).
3-6-2. IL-4
비장조직으로 IL-4 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 0.6±0.2, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 0.4±0.1, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 0.3±0.0, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 0.3±0.1로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 26).
3-6-3. IL-5
비장조직으로 IL-5 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 0.8±0.0, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 0.6±0.2, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 0.6±0.2, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 0.4±0.2로 나타나 음성대조군 대비 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 27).
3-6-4. IL-6
비장조직으로 IL-6 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 0.8±0.0, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 0.7±0.1, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 0.6±0.0, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 0.6±0.1로 나타나 음성대조군 대비 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 28).
3-6-5. IL-10
비장조직으로 IL-10 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 1.8±0.1, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 1.3±0.1, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 1.5±0.1, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 1.6±0.1로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 증가가 나타났다(도 29).
3-6-6. IL-13
비장조직으로 IL-13 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 0.2±0.1, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 0.6±0.0, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 0.4±0.0, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 0.3±0.1로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 30).
3-6-7. IL-17
비장조직으로 IL-17 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 0.6±0.1, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 0.6±0.2, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 0.6±0.2, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 0.6±0.1로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 31).
3-6-8. IFN-γ
비장조직으로 IFN-γ 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 1.6±0.1, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 1.4±0.1, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 1.3±0.1, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 1.4±0.2로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 증가가 나타났다(도 32).
3-6-9. TNF-α
비장조직으로 TNF-α 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 0.5±0.2, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 0.3±0.2, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 0.4±0.2, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 0.3±0.1로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 33).
3-6-10. NF-κB
비장조직으로 NF-κB 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 0.5±0.2, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 0.3±0.2, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 0.4±0.2, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 0.3±0.1로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 34).
3-6-11. iNOS
비장조직으로 iNOS 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 0.7±0.0, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 0.5±0.1, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 0.5±0.1, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 0.5±0.1로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 50, 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 모든 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 35).
3-6-12. COX-2
비장조직으로 COX-2 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.1±0.1, 음성대조군은 1.0±0.0, 양성대조군은 0.4±0.2, 감초복합물 50 ㎎/㎏/day 투여군은 0.8±0.1, 100 ㎎/㎏/day 투여군은 0.5±0.2, 200 ㎎/㎏/day 투여군은 0.5±0.1로 나타나 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물을 100, 200 ㎎/㎏/day로 투여한 실험군에서 유의성 있는(*p<0.05) 감소가 나타났다(도 36).
3-7. 조직 병리 분석
3-7-1. H&E 염색
H&E 염색 후 폐 조직의 조직 병리를 분석한 결과, 정상군은 세기관지 주변으로 염증세포(inflammatory cells)의 침윤과 수적 증가가 관찰되지 않았으며, 세기관지 내부 상피세포층 손상과 비후로 인한 기도 면적이 좁아지는 병리 구조적 변화가 관찰되지 않았다. 반면, 기관지 면역 저하 실험군에서는 세기관지 주변으로 염증세포 침윤과 수적 증가가 관찰되었고 세기관지 내부 상피세포층 손상이 나타나고 비후에 의한 기도 면적이 좁아지는 것이 확인되었다. 음성대조군과 양성대조군, 감초복합물 투여군 등의 비교에서는 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물 투여군에서 상대적으로 세기관지 주변의 염증세포 수와 침윤이 적은 것으로 나타났으며, 상피세포층 손상 및 내부의 비후가 감소되는 것이 관찰되었다(도 37).
3-7-2. PAS 염색
H&E 염색 후 폐 조직의 조직 병리를 분석한 결과, 정상군은 세기관지 내부 상피세포층 손상과 더불어 술잔세포(goblet cells) 증식에 의한 점액 분비가 관찰되지 않았다. 반면, 기관지 면역 저하 실험군에서는 세기관지 내부 상피세포층 손상과 술잔세포 증식에 따른 점액분비 증가로 PAS 염색에 의해 진하게 염색되는 부분이 확인되었다. 음성대조군과 양성대조군, 감초복합물 투여군 등의 비교에서는 음성대조군 대비 양성대조군과 감초복합물 투여군에서 상대적으로 세기관지 내부 상피세포층에서의 PAS에 의한 염색 부분이 현저히 줄어들어 점액 분비가 적어진 것이 관찰되었다(도 38).
상기한 감초 및 상백피 복합물에 대한 특성을 종합하면, 세포 독성을 측정한 결과, 감초 및 상백피의 1:1, 1:2, 2:1 배합 비율의 복합물은 50, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군과 큰 차이를 보이지 않아 안전성이 확인되었다. NO 생성량을 측정한 결과, 감초 및 상백피의 1:1, 1:2, 2:1 배합 비율의 복합물은 50, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군 대비 약 27~61% 이상 유의성 있는 생성량 감소가 나타났다. PGE2 생성량을 측정한 결과, 감초 및 상백피의 1:1, 1:2, 2:1 배합 비율의 복합물은 1:1과 1:2 비율의 50 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 약 14~32% 이상 유의성 있는 생성량 감소가 나타났다. Cytokine 생성량을 측정한 결과, 감초 및 상백피의 1:1, 1:2, 2:1 배합 비율의 복합물은 1:2 비율의 50 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 IL-1β(약 18~38%), IL-6(약 24~45%), TNF-α(약 23~53%) 이상 유의성 있는 생성량 감소가 나타났다. 유전자 발현량을 측정한 결과, 감초 및 상백피의 1:1, 1:2, 2:1 배합 비율의 복합물은 iNOS 및 IL-6 발현은 모든 배합비와 농도에서, COX-2, IL-1β, TNF-α 발현은 1:2 비율의 50 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 복합비율과 처리 농도에서 대조군 대비 iNOS(약 15~71%), COX-2(약 17~38%), IL-1β(약 18~54%), IL-6(약 36~53%), TNF-α(약 15~51%) 이상 유의성 있는 생성량 감소가 나타났다.
또한, 혈액 분석 결과, 감초복합물 투여군 (50, 100 또는 200 ㎎/㎏/day)은 Specific-IgE 생성량, PGE2 생성량, Histamine 생성량, 백혈구 수, 백혈구 내 호산구 수, 백혈구 내 단핵구 수, 혈소판 수를 유의적으로 감소시켰다. 비장에서의 유전자 발현 분석한 결과에 따르면, 감초복합물 투여군 (50, 100 또는 200 ㎎/㎏/day)은 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-17, IFN-γ, TNF-α, NF-κB, iNOS, COX-2 발현을 유의적으로 감소시켰으며, IL-10 발현을 유의적으로 증가시켰다. 나아가 폐 조직 병리 분석 결과, 감초복합물 투여군 (50, 100 또는 200 ㎎/㎏/day)에서 음성대조군 대비 세기관지 주변의 염증세포 수와 침윤이 적은 것으로 나타났으며, 상피세포층 손상 및 내부의 비후가 감소되는 것이 관찰되었고, 음성대조군 대비 세기관지 내부 상피세포층에서의 PAS에 의한 염색 부분이 현저히 줄어들어 점액 분비가 적어진 것이 관찰되었다.
따라서, 면역 관련 바이오마커에서 전사인자와 염증 매개체 등에서 종합적으로 감초와 상백피의 2:1 비율로 혼합된 복합물의 100 ㎍/㎖ 농도가 활용 가치가 높은 것으로 결과가 도출되었다. 특히, 기관지 질환에서 주요 추적 인자로 사용되는 IL-6의 생성량 및 유전자 발현의 부합되는 억제 결과와 더불어 전반적으로 선천 및 후천면역 단계에 각각 작용하는 염증 매개체들의 유의적인 효능은 천식, 비염, 알레르기와 같은 질환에도 사용할 수 있는 가능성을 확인할 수 있다.
또한, 감초복합물은 기관지 면역 및 알러지와 관련된 면역글로불린 및 히스타민, 프로스타글란딘, 체내 면역 세포, 혈소판 수에 관한 혈액학적 효능과 더불어 Th1/Th2 사이토카인의 조절, 염증 전사인자 및 관련 매개체를 감소하는 효과가 있음을 확인할 수 있다. 기관지 면역 관련 바이오마커의 효능은 폐 조직을 통해 진행한 조직병리학 분석을 통해 결과를 뒷받침하고 있어 감초복합물은 기관지 면역 개선이 가능한 원료임을 확인하였다. 이와 같은 결과는 감초 복합추출물이 활용한 반려동물 기관지 면역강화 기능성 사료 개발 가능하며, 나아가 본 연구 결과는 기관지 면역뿐만 아니라 기도 과민반응 및 천식을 비롯한 호흡기 질환에도 활용이 가능할 수 있음을 보여주고 있다.
이상의 상세한 설명은 본 발명을 예시하고 설명하는 것이다. 또한, 전술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내고 설명하는 것에 불과하며, 전술한 바와 같이 본 발명은 다양한 다른 조합, 변경 및 환경에서 사용할 수 있으며, 본 명세서에 개시된 발명의 개념의 범위, 저술한 개시 내용과 균등한 범위 및/또는 당업계의 기술 또는 지식의 범위 내에서 변경 또는 수정이 가능하다. 따라서, 이상의 발명의 상세한 설명은 개시된 실시 상태로 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 또한, 첨부된 청구범위는 다른 실시 상태도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 감초 및 상백피 추출 복합물을 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출 복합물은 감초 추출물 및 상백피 추출물을 혼합한 것인 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 감초 추출물 및 상백피 추출물은 정제수, C1 내지 C4 알코올 중 어느 하나 이상의 용매로 추출된 것인 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 감초 추출물 및 상백피 추출물은 50 내지 70% 에탄올 용매로 추출된 것인 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 추출 복합물은 감초 추출물 및 상백피 추출물을 1:2 내지 2:1 비율로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 추출 복합물은 농도가 50 내지 100μg/ml인 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 감초 및 상백피 추출 복합물을 포함하는 피부 염증 완화 화장료 조성물.
  8. 감초 및 상백피 추출 복합물을 포함하는 식품 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117503751A (zh) * 2023-11-20 2024-02-06 武汉大学 桑黄酮在制备预防和/或治疗脓毒症肺损伤的药物中的应用

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