KR20220060033A

KR20220060033A - Nvs-cecr2-1을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20220060033A
Application number: KR1020200144672A
Authority: KR
Inventors: 권종범
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-02
Filing date: 2020-11-02
Publication date: 2022-05-11

Abstract

본 발명은 NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법, NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) 암 세포 사멸용 조성물, 및 NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
NVS-CECR2-1은 다양한 인간 암 세포주에 대한 우수한 사멸 효과뿐만 아니라, 암 세포의 아폽토시스를 증가시키는 효과가 있으므로, 암의 예방, 개선, 치료 등에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

NVS-CECR2-1을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Cancer Comprising NVS-CECR2-1}

본 발명은 NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물; 상기 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법; NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) 암 세포 사멸용 조성물; 및 NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

암은 비정상적인 세포 증식으로 유발되는 질병으로써, 한국에서 사망 원인 1위를 차지하는 중대 질환 중 하나이며, 전세계적으로 순환계 질환에 이어 2번째로 높은 사망 원인에 해당한다. 그에 따라, 암의 근본적인 원인인 암세포의 증식을 억제하기 위한 항암제의 개발이 이어지고 있다 (대한민국 등록특허 제2063397호).

한편, 브로모도메인 (bromodomatin, BRD)은 약 110 개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질-단백질 상호작용 모듈로서, 히스톤 꼬리의 아세틸화된 라이신 잔기를 인식한다. BRD는 염색질 조절자로서 다양한 생물학적 기능을 하는데, 도메인에 포함된 ZA 및 BC 루프는 히스톤 및 비-히스톤 단백질 내 특정 아세틴-라이신 사이트에 특이적으로 결합할 수 있도록 한다.

이와 관련하여, JQ1 또는 I-BET와 같은 BRD 억제제의 항종양 활성에 대한 연구가 보고되었으며 (Nat. Rev. Drug Discov. 13, 337-356), 이러한 연구들은 주로 bromo- 및 extra-terminal domain (BET) 패밀리를 표적으로 한다 (Nat. Struct. Mol. Biol. 26, 870-879). 그러나, 비-BET 패밀리 (non-BET family)를 표적으로 하는 BRD 억제제 및 그 항암 활성에 대해서는 아직 연구된 바 없다.

NVS-CECR2-1은 묘안 증후군 염색체 영역 (cat eye syndrome chromosome region candidate 2, CECR2)을 표적으로 하는 비-BET BRD 억제제로서, CECR2의 BRD에 높은 결합력으로 결합한다 (Hum. Mol. Genet. 14, 513-524). CECR2는 단일 BRD를 가지며, DNA 손상 반응 뿐만 아니라 신경관형성 및 염색질 리모델링에도 관여하는 것으로 알려져 있다 (Mol. Cells 34, 85-91).

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 항암 치료제로서의 BRD 억제제의 기능을 제공하고, 보다 효과적으로 여러 암을 치료할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, NVS-CECR2-1의 다양한 암세포에 대한 사멸 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 시험관 내(in vitro) 암 세포 사멸용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 "NVS-CECR2-1"은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미한다.

[화학식 1]

상기 NVS-CECR2-1의 분자량은 495.68, 화학식은 C₂₇H₃₇N₅O₂S, 화학명은 싸이클로프로필-{2-(프로판-1-설포닐)-6-[1-(2,2,6,6-테트라메틸-파이퍼리딘-4-일)-1H-인돌-5-일]-피리미딘-4-일}-아민(Cyclopropyl-{2-(propane-1-sulfonyl)-6-[1-(2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-4-yl)-1H-indol-5-yl]-pyrimidin-4-yl}-amine), CAS 번호는 1992047-61-6으로 알려져 있으며, NVS-1으로도 불린다. 현재 NVS-CECR2-1의 약리학적 활성에 대한 연구는 미미한 실정으로, 이의 항암 효과는 본 발명자에 의해 처음으로 규명되었다.

상기 NVS-CECR2-1의 입수 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성하거나, 시판되는 물질을 사용할 수 있다. 또한, 상기 NVS-CECR2-1은 용매화된 형태 또는 비용매화된 형태로 존재할 수 있고, 결정형 또는 무정형 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 물리적 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산 과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등의 염이 될 수 있다.

본 발명에서 용어 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암(cancer)'이라 하며, 암의 종류로는 뇌척수종양, 뇌종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 본 발명의 암의 종류가 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 암은 대장암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 암의 예방 또는 치료는 암 세포 특이적 세포 사멸에 의하여 달성되는 것일 수 있으며, 콜로니 형성 억제 또는 아폽토시스(apoptosis)를 포함하는 것일 수 있으나, 세포가 죽은 일 형태라면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 실시에에서는 NVS-CECR2-1을 대장암, 폐암 등을 포함하는 다양한 인간 암 세포주에 처리한 결과, 모든 암 세포주에 대하여 유의한 세포 사멸 활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3). 또한, NVS-CECR2-1의 암세포 사멸능과 관련한 다양한 기작을 확인한 바, NVS-CECR2-1이 효과적인 항암제로서 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명의 용어 "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 본 발명에서는 NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 투여로 암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, 본 발명의 용어 "예방"은 본 발명에 따른 NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 이에 제한되지 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 "NVS-CECR2-1", "약학적으로 허용가능한 염", "암의 예방 또는 치료", 및 "약학 조성물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어 "개체"는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 약학 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) 암 세포 사멸용 조성물을 제공한다.

본 발명의 "NVS-CECR2-1", "약학적으로 허용가능한 염", 및 "암"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "암 세포 사멸"은 암 세포의 생장 억제, 콜로니 형성 억제 또는 아폽토시스(apoptosis)의 유도를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 NVS-CECR2-1은 다양한 암 세포주에 대하여 우수한 사멸 효과를 나타내므로, NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 시험관 내(in vitro) 암 세포 사멸을 목적으로 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 "NVS-CECR2-1", "약학적으로 허용가능한 염", 및 "암의 예방" 에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개선"은 NVS-CECR2-1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.

본 발명의 NVS-CECR2-1은 그대로 첨가되거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 건강기능식품 조성물은 생리학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품 조성물은 방부제, 살균제, 산화방지제, 착색제, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 향료, 팽창제, 강화제, 유화제, 증점제, 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 암의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

본 발명의 NVS-CECR2-1은 CECR2를 표적으로 하는 작용 기작, 또는 CECR2-독립적인 작용 기작을 통해 다양한 인간 암 세포주에 대한 우수한 사멸 효과뿐만 아니라 암 세포의 아폽토시스를 증가시키는 효과가 있으므로, 암의 예방, 개선, 치료 등에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 NVS-CECR2-1의 세포 내 CECR2 BRD의 염색질 결합 억제 효과에 관한 도이다. 도 1a는 NVS-CECR2-1의 분자 구조를 나타낸 도이다. 도 1b는 NVS-CECR2-1의 처리 여부에 따른 염색질 결합 억제 효과, 도 1c 및 도 1d는 NVS-CECR2-1의 처리 농도에 따른 염색질 결합 억제 효과를 이뮤노블랏 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 NVS-CECR2-1의 염색질로부터 CECR2 해리 활성에 관한 도이다. 도 2a는 NVS-CECR2-1의 처리 농도에 따른 CECR2 해리 효과를 이뮤노블랏 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이며, 도 2b는 이에 대한 B/(B+U) 비율을 나타낸 그래프이다. 도 2c는 염 구배 염색질 분획 결과를 나타낸 도이며, 도 2d는 이에 대한 CECR2의 상대적 정량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 NVS-CECR2-1의 다양한 인간 암 세포주에 대한 세포 사멸 활성을 MTS 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 아폽토시스 증가를 통한 NVS-CECR2-1의 SW48 사멸 효과에 관한 도이다. 도 4a는 NVS-CECR2-1을 농도 별로 SW48 세포주에 처리하여 콜로니 형성 어세이를 진행한 도이며, 도 4b는 상기 어세이의 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4c는 초기 (오른쪽 위) 및 후기 (왼쪽 아래)의 아폽토시스 세포를 나타낸 도이며, 도 4d는 아폽토시스 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4e는 아폽토시스 분석을 통해 PARP1 절단을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 4f 및 도 4g는 대조군으로서 항생제인 독소루비신의 세포 사멸 활성을 확인한 도이다.
도 5는 CECR2를 표적으로 하는 NVS-CECR2-1의 SW48 사멸 효과에 관한 도이다. 도 5a는 CECR2 결핍을 확인한 이뮤노블랏 어세이 결과를 나타낸 도이다. 도 5b는 NVS-CECR2-1의 처리 농도에 따른 콜로니 형성 어세이를 진행한 도이며, 도 5c는 상기 어세이의 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5d는 CECR2 녹다운 실험군의 이뮤노블랏 분석을 나타낸 도이며, 도 5e는 Annexin V/PI 염색을 통한 아폽토시스 세포를 나타낸 도이고, 도 5f는 아폽토시스 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5g는 PARP1 절단 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 CECR2-독립적인 NVS-CECR2-1의 세포 사멸 활성에 관한 도이다. 도 6a는 CECR2 결핍을 확인한 이뮤노블랏 어세이 결과를 나타낸 도이며, 도 6b 내지 도 6d는 NVS-CECR2-1의 처리 농도에 따른 세포 사멸 활성을 MTS 분석을 통해 확인한 그래프 및 도이다. 도 6e는 HAP1 세포에서 CECR2 결핍을 확인한 이뮤노블랏 어세이 결과를 나타낸 도이며, 도 6f 내지 도 6h는 NVS-CECR2-1의 처리 농도에 따른 세포 사멸 활성을 MTS 분석을 통해 확인한 그래프 및 도이다.
도 7은 다양한 인간 대장암 세포주에 대한 NVS-CECR2-1의 세포 사멸 활성에 관한 도이다. 도 7a는 SW48, DLD-1, LoVo, HCT116, HT29, 및 SW480의 CECR2 발현을 확인한 이뮤노블랏 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 7b는 CECR2 결핍에 따른 각 세포주의 콜로니 형성 어세이 결과를 나타낸 도이며, 도 7c는 상기 어세이의 결과를 나타낸 그래프이다. 도 7d는 NVS-CECR2-1의 처리 농도에 따른 콜로니 형성 어세이 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 인간 대장암 조직에서 CECR2 유전자 발현에 대한 미분 분석 결과를 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실험예 1: 염색질 분획 분석 (Chromatin fractionation assay)

먼저, 세포를 fraction 3 완충액 (50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0. 5mM PMSF, 5 μg/ml 아프로티닌, 5 ug/ml 류펩틴, 5 μg/ml 펩스타틴 A, 10 mM NaF)으로 얼음에서 1시간 동안 용해시킨 후, 16,000g에서 20분 동안 원심분리를 진행하여 상등액 (세포질 단백질)과 펠렛 (염색질-결합 단백질)을 분리하였다.

그 후, 염-구배 염색질 분획 (salt gradient chromatin fractionation)을 진행하였다. 먼저, 세포를 CEBN 완충액 (50 mM HEPES (pH 7.8), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.34 M 수크로스, 10% 글리세롤, 0.2% NP-40, 프로테아제 억제제)로 얼음에서 5분 동안 용해시킨 후 원심분리를 통해 상등액 (세포질 단백질)과 펠렛을 분리하였다. 그 후, 펠렛을 CEB 완충액으로 세척한 후, soluble nuclear 완충액 (3 mM EDTA, 0.2 mM EGTA, 프로테아제 억제제)로 얼음에서 5분 동안 용해시켰다. 원심분리를 통해 상등액과 펠렛을 분리한 후, 염 완충액 (50 mM Tris (pH 8.0), 0.05% NP-40, NaCl, 프로테아제 억제제)를 이용하여 펠렛에 대해 염 구배 추출 (gradient salt extraction)을 진행하였다.

실험예 2: 이뮤노블랏 분석 (Immunoblot analysis)

세포를 PBS로 세척한 후, RIPA 완충액 (50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5% 소듐데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1% NP-40, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 5 μg/ml 아프로티닌, 5 μg/ml 류펩틴, 5 μg/ml 펩스타틴 A, 10 mM NaF)로 얼음에서 30분 동안 용해시켰다. BCA 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정한 후, SDS 겔 전기 영동을 통해 단백질을 분리하였다. 트랜스퍼 완충액 (25 mM Tris-base, 192 mM 글리신, 20% 메탄올)을 이용하여 니트로셀룰로오스 막 (GE Healthcare Life Sciences)에 단백질을 트랜스퍼 시킨 후, ECL (enhanced chemiluminescence, sigma)을 이용하여 신호를 측정하였다.

실험예 3: 아폽토시스 분석 (Apoptosis assay)

FITC Annexin V 아폽토시스 검출 키트 I (556,547, BD Bioscience)의 방법에 따라 Annexin V/PI 이중 염색을 진행하였다. 먼저, 6 x 10⁵ 세포를 PBS로 2회 세척한 후 결합 완충액 (1 ml)에 풀어주었다. 100 μl를 5 μl의 Annexin V-FITC 및 5 ul 의 PI (propidium iodide, Invitrogen)와 섞어준 후, 빛이 차단된 실온에 20분간 보관한 다음, FACS 칼리버 (BD Biosciences)로 유세포분석을 진행하였다.

실시예 1: NVS-CECR2-1의 세포 내 CECR2 BRD의 염색질 결합 억제 효과

CECR2 BRD의 이합체 형태를 발현하는 플라스미드 벡터가 트랜스펙션 된 세포에, 10 μm의 NVS-CECR2-1을 처리하고, 세포 용해물은 불용성의 염색질-결합 분획 및 용해성의 염색질-비결합 분획으로 분획하였다. 이뮤노블랏 분석 (Immunoblot assay) 결과, CECR2 BRD는 두 분획에 대략 균등하게 분포하고, 이 분포는 염색질-결합 분획에서는 CECR2-BRD 밴드가 거의 검출되지 않았으며, 염색질 -비결합 분획으로 크게 이동한 것을 확인하였다 (도 1b의 1, 2, 5, 6). 이를 통해, NVS-CECR2-1이 CECR2 BRD의 염색질 결합을 억제함을 알 수 있었다.

또한, 히스톤 탈아세틸화 억제제인 트리코스타틴 A (TSA)의 전처리 시, 대부분의 CECR2 BRD는 염색질에 결합하였으나, NVS-CECR2-1을 처리한 결과, 상기 결합은 대부분 해지되었다 (도 1b의 3, 4, 7, 8). 이를 통해, NVS-CECR2-1의 CECR2 BRD에 대한 결합 억제 효과를 다시 한번 확인하였다.

대조군으로서, BRG1에 특이적인 BRD 억제제인 PFI-3에 대하여 유사한 염색질 분획 어세이를 진행한 결과, NVS-CECR2-1은 5 내지 15 μM의 농도에서 효과적으로 CECR2 BRD의 염색질 결합을 억제한 반면, PFI-3는 100 μM의 농도에서도 BRG1 BRD의 염색질 결합을 억제하지 못하였다 (도 1d). 즉, NVS-CECR2-1은 세포 내에서 CECR2 BRD에 대한 우수한 결합 억제 활성을 확인할 수 있었다.

실시예 2: NVS-CECR2-1의 염색질로부터 CECR2 해리 활성

세포에 5, 10, 15 μM 농도의 NVS-CECR2-1 및 대조군으로써 100, 200 μM 농도의 PFI-3를 처리한 결과, NVS-CECR2-1은 BRG1에 대한 영향 없이, 농도 의존적으로 염색질로부터 CECR2를 해리하였으며, 반대로, PFI-3는 CECR2에 대한 영향 없이 BRG1을 해리하였다 (도 2a, b).

상기 결과를 확인하기 위하여, 염 구배 염색질 분획 (salt gradient chromatin fractionation)을 실시한 결과, CECR2는 염 구배 염색질 분획 내 세포질 분획에서 거의 관찰되지 않았다 (도 2c, d). 이를 통해, NVS-CECR2-1은 표적 단백질인 CECR2가 세포 내에서 염색질에 결합하는 것을 방지하는 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 3: NVS-CECR2-1의 다양한 인간 암 세포주에 대한 세포 사멸 활성

NVS-CECR2-1의 암 세포에 대한 활성을 확인하기 위하여, 대장 (SW48, HT29, HCT116), 폐 (H460), 요로상피 (SV-HUC-1), 자궁경부 (HeLa), 및 뼈 (U2OS)와 같은 다양한 조직 유래의 인간 암 세포주를 선별하였다. 각 세포들은 농도 별로 NVS-CECR2-1가 처리되었으며, 3일 간의 MTS 분석을 통해 세포 사멸 정도를 측정하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 2-4 x 10³ cell/well로 72시간 배양한 후, SpectraMax i3X plate reader (Molecular Devices, I3X-SC-ACAD) 기기로 흡광도 (490 nm)를 측정하였다.

그 결과, NVS-CECR2-1의 처리는 농도 의존적으로 모든 암 세포의 생존률을 감소시켰으며, NVS-CECR2-1의 처리는 또한 비-암 조직 유래의 불멸 세포주인 HEK 293 T 세포에 대해서도 농도 의존적인 사멸 효과를 나타내었다 (도 3). NVS-CECR2-1은 모든 암 세포에 대하여 약학적으로 유의한 농도에서 모든 세포 종류에 대하여 세포 사멸 활성을 나타내었으며, 매우 적은 농도로도 반 이상의 세포를 사멸하였다.

실시예 4: 아폽토시스 증가를 통한 NVS-CECR2-1의 SW48 세포 사멸 효과

상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, NVS-CECR2-1은 8종의 세포주 중 SW48에 대하여 가장 우수한 세포 사멸 활성을 보인 바, 먼저 SW48 세포주에 대한 장기적인 세포 사멸 효과를 확인하기 위하여 콜로니 형성 어세이를 진행하였다. 세포에 NVS-CECR2-1을 농도 별로 처리하여 10일 후 콜로니 형성능을 측정한 결과, NVS-CECR2-1은 농도 의존적으로 SW48 세포의 콜로니 형성능을 저해하였으며 그 IC₅₀ 값은 0.64 μM으로 측정되었다 (도 4a, b).

이후, NVS-CECR2-1이 SW48 세포를 사멸하는 작용 기작을 밝히기 위하여 Annexin-V 어세이를 진행하였다. 세포에 NVS-CECR2-1을 농도 별로 처리하여 72 시간 후 아폽토시스 및 네크로시스(necrosis)를 측정한 결과, NVS-CECR2-1은 농도 의존적으로 아폽토시스를 증가시켰으며, 6 μM 처리군의 80 % 이상의 세포에서 아폽토시스가 진행되었지만, 네크로시스에는 유의적인 영향을 미치지 않았다 (도 4c, d). NVS-CECR2-1에 의한 아폽토시스의 증가는 PARP1 절단에 의해 확인되었다 (도 4e). 따라서, NVS-CECR2-1은 주로 아폽토시스의 유발을 통해 SW48 세포를 사멸시키는 것으로 알 수 있었다.

비교를 위하여, SW48 세포에 강력한 항암제로 알려진 독소루비신을 처리하여 그 세포독성을 측정하였다. 그 결과, 측정된 독소루비신의 IC₅₀값이 0.54 μM로서 (도 4f, g), NVS-CECR2-1은 독소루비신과 유사한 수준의 IC₅₀ 값을 가지는 바, 대장암의 치료에 효과적인 치료제로서 활용될 수 있음을 시사하였다.

실시예 5: CECR2를 표적으로 하는 NVS-CECR2-1의 SW48 사멸 효과

NVS-CECR2-1의 암세포 사멸 활성이 CECR2를 표적으로 하여 진행되는지 여부를 확인하기 위하여, CECR2 결핍이 세포의 NVS-CECR2-1에 대한 민감도에 미치는 영향을 확인하였다. SW48 세포에 특정 siRNA 처리를 통해 CECR2를 결핍시킨 후 (도 5a), 0.5 내지 2 μM의 농도로 NVS-CECR2-1을 처리하여 콜로니 형성 어세이를 통해 세포의 콜로니 형성을 측정하였다. 콜로니를 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후, 10% 아세트산으로 용해시켰다. 그 후, SpectraMax i3X plate reader (Molecular Devices, I3X-SC-ACAD) 기기로 흡광도 (590nm)를 측정하였다.

그 결과, 대조군에서는 NVS-CECR2-1의 농도 의존적으로 세포 사멸 활성이 나타났으며, 0.62 μM의 IC₅₀ 값을 나타내었다. CECR2가 결핍된 군에서는 세포 생존능이 현저히 감소한 바, CECR2는 SW48 세포의 생존에 필수적인 것을 알 수 있었다. 특히, NVS-CECR2-1은 대조군과 비교하여 CECR2-결핍 세포군에 매우 적은 영향을 미친 바, 이는 감소된 생존률 때문인 것으로 판단되었다 (도 5b, c). 그럼에도 불구하고, NVS-CECR2-1의 처리는 CECR2-결핍 세포군의 생존률 또한 농도 의존적으로 감소시켰으며, 대조군에 비하여 유의적인 생존률 감소 효과를 나타내었다. CECR2-결핍 세포군에서 NVS-CECR2-1에 의한 아폽토시스 증가율은 대조군의 증가율보다 낮았다 (도 5d-f).

일관적인 결과로서, NVS-CECR2-1은 농도 의존적으로 PARP1 절단을 증가시킨 반면, CECR2-결핍 군에서는 NVS-CECR2-1에 의한 추가적인 향상 없이, PARP1 절단의 현저한 증가를 보였다 (도 5g). 이러한 결과는, CECR2이 결핍된 후에도 어느 정도는 NVS-CECR2-1이 활성을 가지지만, SW48 세포에 대한 NVS-CECR2-1의 세포 사멸 활성은 CECR2 표적으로 인한 것임을 의미한다.

실시예 6: CECR2-독립적인 NVS-CECR2-1의 세포 사멸 활성

CECR2-결핍 세포가 NVS-CECR2-1에 여전히 민감한 이유는, CECR2의 불완전한 녹다운(knockdown) 또는 NVS-CECR2-1의 유효하지 않은 표적(off-target) 활성일 것이라고 가정하였다. 이를 검증하기 위하여, 세포의 생존과 CECR2가 무관한 것으로 알려진 HEK 293 T 세포에서 NVS-CECR2-1 결핍의 효과를 확인하였다 (Mol. Cells 34, 85-91, 2012). 그 결과, 예상한 바와 같이, CECR2의 결핍은 HEK 293 T 세포의 생존에 영향을 미치지 않았다 (도 6a, b-d). 특히, NVS-CECR2-1은 대조군과 CECR2-결핍 세포에서 단기적 (도 6b) 또는 장기적 (도 6c, d)으로 비슷한 정도의 농도 의존적인 세포 사멸 활성을 나타내었다. 즉, NVS-CECR2-1은 CECR2에 대하여 독립적으로 세포 사멸 활성을 보이는 것을 알 수 있었다.

상기 결과를 뒷받침하기 위하여, CRISPR/Cas9 시스템에 의해 CECR2를 코딩하는 유전자가 녹아웃 된 만성 골수성 백혈병 세포인 KBM-7에서 파생된 반수체에 가까운 인간 세포주인 HAP-1 세포를 분석하여 CECR2의 결핍이 미치는 영향을 분석하였다 (도 6e). 그 결과, CECR2-녹아웃된 HAP1 및 CECR2-자연형 HAP1 모세포 사이에 세포 성장에 관한 차이가 없음을 확인하였다. NVS-CECR2-1은 상기 두 세포주 사이에 단기적 (도 6f) 또는 장기적 (도 6g, h)으로 비슷한 정도의 세포 사멸 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 293 T 및 HAP1 세포주에 대한 IC₅₀ 값은, SW48 세포에 비하여 약 4배 정도 높은, 각각 2.45 μM 및 2.73 μM이었다. 상기 결과를 종합해보면, NVS-CECR2-1은 CECR2를 표적으로 하는 것 뿐만 아니라, CECR2 독립적인 작용 기작을 통해 세포 사멸 활성을 발휘한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7: 다양한 인간 대장암 세포주에 대한 NVS-CECR2-1의 세포 사멸 활성

세포 생존에 대하여 CECR2 의존적인 세포는 CECR2-독립적인 세포에 비하여 NVS-CECR2-1에 더 민감한 경향이 있는지 여부를 확인하기 위하여, SW48 외에도, DLD-1, LoVo, HCT116, HT29, 및 SW480을 포함하는 다양한 인간 대장암 세포주에 대한 이뮤노블랏 분석을 수행하였다. 그 결과, SW48 및 HCT116 세포는 HEK 293 T 세포와 비슷한 수준의 CECR2를 발현하였으며, 나머지 세포주들은 매우 낮은 CECR2 발현 수준을 나타내는 것을 확인하였다 (도 7a). CECR2의 결핍은 SW48 및 HCT116 세포의 생존률을 각각 약 72% 및 42% 정도로 감소시켰으며, 나머지 5종의 세포주의 생존률에 대해서는 영향을 미치지 않았다 (도 7b, c). IC₅₀ 값은 HCT116 세포의 경우 SW48 세포(0.64 μM)에 비하여 높은 1.30 μM이었으며, 나머지 CECR2-독립적인 5종의 세포주의 경우 2.1 내지 3.3 μM의 IC₅₀ 값을 나타내었다. 상기 결과를 통해, 암 세포에 대한 NVS-CECR2-1의 세포 사멸 활성과, 이들의 생존이 CECR2에 의존하는 정도 사이의 상관 관계가 존재함을 확인하였다.

실시예 8: 대장암 조직에서의 CECR2 유전자 발현 분석

본 발명의 임상학적 유의성을 평가하기 위하여, 온라인 데이터베이스를 이용하여 인간 대장암 조직에서의 CECR2 유전자 발현을 분석하였다. 먼저, TCGA Pan-Cancer Atlas의 데이터를 통해 대장암 조직에서 CECR2 mRNA 발현량은, 10,953 명의 환자의 10,967 개의 샘플에 포함된 32 개의 암 종류 중 중간 수준인 것을 알 수 있었다. 2033개의 샘플로 구성된 11개의 대장/직장 데이터 세트에서 정상 및 암 조직의 차등 분석 (differential analysis) 결과, CECR2 mRNA 발현이 정상 조직에 비해서 대장암 조직에서 상향 조절됨을 확인하였다 (도 8a).

상기 결과를 종합하면, 본 발명의 NVS-CECR2-1은 세포에 따라 CECR2를 타겟으로 하는 작용 기작 또는 CECR2-독립적인 작용 기작을 통해 암 세포 특이적인 사멸 활성을 가지며, 특히, 대장암 세포에 대한 세포 사멸 활성이 우수한 것을 알 수 있었다. 이는, NVS-CECR2-1을 유효성분으로 포함하는 조성물의 항암제로의 사용 가능성을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 암은 대장암인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항의 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 시험관 내(in vitro) 암 세포 사멸용 조성물.
[화학식 1]
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]