KR20190116617A

KR20190116617A - 알베린 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물

Info

Publication number: KR20190116617A
Application number: KR1020180039468A
Authority: KR
Inventors: 조재열; 김성규; 양우석; 박상희; 박경자; 장석구; 김동삼; 김지현; 최영임
Original assignee: 삼척시
Priority date: 2018-04-05
Filing date: 2018-04-05
Publication date: 2019-10-15
Anticipated expiration: 2038-04-05
Also published as: KR102057173B1

Abstract

본 발명은 알베린 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물에 관한 것으로, 상기 알베린 화합물이 우수한 항산화 효과를 가지고 있음을 확인하였고, 이를 이용하여 항산화 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

알베린 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물{Antioxidant composition comprising alverine compound}

본 발명은 알베린(alverine) 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

현대적 산업의 발달과 더불어 풍요로운 경제적, 문화적 혜택을 누리고 있지만, 평균 수명의 연장과 함께 성인 질환과 고령화 사회에 따른 삶의 질에 대한 인식이 동반되고 있다.

생체 내에서 에너지 생산을 위한 산화 과정 중에 상당량의 유해한 활성산소(reactive oxygen species, ROS)들이 생성된다. 이들 활성산소는 생체 내 제거 기작에 의해 대부분 소멸 되지만 순간적으로 활성산소가 발생되어 항산화 방어계와의 균형이 깨지면 각종 질환의 원인이 된다(Aruoma O.I., et al., 1998). 또한 노화의 원인으로 산소에서 유래되는 활성산소의 역할이 대두되면서 이들의 제거에 대한 관심이 높아지고 있다(Fridorich I., 1978).

활성산소 생성의 생체 내적 요인으로는 세포 대사 작용, 산화효소, 박테리아 작용 등을 들 수 있고, 생체 외적 요인으로는 오염된 공기, 대사율 증가, 흡연, 발암물질, 특정 항생제, 자외선, 열, 인스턴트 음식의 과량 섭취 등을 들 수 있다.

활성산소의 종류로는 일반적으로 리피드 라디칼(lipid radical), 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical) 및 히드록시 라디칼(hydroxy radical, ·OH)과 같은 라디칼뿐만 아니라 비라디칼인 과산화수소(hydrogen peroxidase, H₂O₂), 리피드 퍼옥시드(lipid peroxide), 차아염소산(hypochlorous acid), N-클로라민(N-chloramine) 성분들을 포함한다. 이들 활성산소들은 단백질, 불포화 지방산 등과 결합하여 과산화 지질을 생성하고, DNA, RNA 등에 손상을 일으키며, 생체막의 손상, 면역능력의 약화와 함께 고혈압, 동맥경화, 심부전, 류마티스 관절염, 알레르기, 암과 같은 각종 질병과 노화를 유발시키게 된다(Chung H.Y., 1992; Yagi K., 1987; Lopaczyski W., et al., 2001; Yu B.P., 1994; Cooke M.S., et al., 1997). 또한 활성산소는 산화스트레스의 주요 요인으로 노화와 깊게 관련되어 있으며 이는 노화 관련 퇴행성질환 뿐만 아니라 만성염증 질환의 주요 원인이기도 하다. 여러 동물에서 활성산소의 비율은 개체 수명과 상관관계가 있으며 활성산소의 양은 개체의 노화 진행 상태를 결정짓는 요인이 된다(Yu B.P., 1994).

세포 내 항산화 효과에 의한 항상성 유지는 세포의 기능을 회복할 수 있으며, 이는 노화의 진행을 예방 또는 지연시킬 뿐만 아니라 만성염증 제어 및 면역력을 향상시켜 건강한 삶의 질을 높일 수 있다. 노화 과정에서 항산화 물질은 결함이 나타난 미토콘드리아의 활성을 도모할 수 있고 항상성을 유지시켜 궁극적으로 세포의 생존력을 높이는 것으로 알려져 있다(Lee Y.H., et al., 2015; Yang T.K., et al., 2013).

따라서 이러한 활성산소들을 효과적으로 제어하는 항산화제에 대한 연구가 자연스럽게 증가하게 되었다(허수진, 2005). 그러나 BHT, BHA, TBHQ 등과 같은 합성 항산화제는 열안정성과 인체에 대한 독성이 문제시 되고 있어 사용상에 많은 제한을 받고 있다(Jun B.S., et al., 2001). 따라서 보다 안전하고 우수한 효능을 가진 천연 항산화제에 대한 개발이 지금까지 꾸준히 시도되고 있다. 천연 항산화제는 대부분 식물기원의 항산화성 물질로서 오미자 추출물(Jang E.J., et al., 1996), 칡 추출물(Han M.J., et al., 1999), 감귤류 플라보노이드(Cha J.H., et al., 2000), 뽕나무(Kim H.J., et al., 2000) 등이 항산화능이 높다고 알려져 있다.

민물김(Prasiola japonica)은 바다김과는 달리 녹조류(green algae, Phylum Chlorophyta)로, 바다가 아닌 소하천에서 생육하며 민물파래과(Prasiolaceae)에 속한다(Park, M.K., et al., 1970). 민물김에는 바다김에서 관찰되지 않았던 만노스(mannose), 롤리올라이드(loliolide), 솔비톨(sorbitol), 글루시톨(glucitol), 만니톨(mannitol) 및 알베린(alveine) 등이 포함되어 있음이 보고되었다(Seo, D.W., et al., 2013).

알베린(alverine)은 가장 흔히 쓰이는 평활근 이완제 중의 하나로 위장관계 진경을 목적으로 과민성 대장증후군 등에 많이 사용된다(Han, J.Y., et al., 2010). 그러나 아직까지 알베린의 항산화 효과는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자는 민물김에 포함되어 있는 화합물들의 효능을 확인하는 과정에서, 알베린 화합물이 우수한 항산화 활성을 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

종래 선행기술로서 미국등록특허 제6335368호에는 알베린 화합물의 피부조직 또는 피하 조직의 이완을 통한 주름 감소 효과가 기재되어 있고, 유럽등록특허 제2165704호에는 알베린 화합물의 항균 및 항진균 활성을 통한 피부 개선 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 알베린 화합물의 항산화 효과는 기재 및 암시되어 있지 않다. 또한, 한국등록특허 제1591401호에는 알베린 화합물을 포함하는 민물김 추출물이 기재되어 있으나, 본 발명의 알베린 화합물의 항산화 효과는 기재 및 암시되어 있지 않다.

또한, 비특허문헌으로서 Seo, D.W., et al.(2013)은 민물김 추출물의 항산화 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 알베린 화합물의 항산화 효과는 기재되어 있지 않다.

미국등록특허 제6335368호, Use of alverine for reducing wrinkles, 2002. 01. 01. 등록. 유럽등록특허 제2165704호, Use of alverine for the treatment of cutaneous affections, 2012. 04. 18. 등록. 한국등록특허 제1591401호, 암 치료용 약학 조성물, 2016. 01. 28. 등록.

허수진, et al., 해조류의 효소적 가수분해물에 의한 항산화 효과와 세포손상 억제활성, 식품 산업과 영양, 10(1), 31-41, 2005. Aruoma, O.I., Free radical, oxidative stress and antioxidants in human health and disease, J. Am. Oil Chem., Soc., 75, 199-212, 1998. Cha, J.H., et al., Effect of citrus flavonoids on the lipid peroxidation contents, Korean J. Postharvest Sci. Technol., 7, 211-217, 2000. Chung, H.Y., Aging and carcinogenic mechanisms induced by free radicals, Kor. J. Gerontol., 2, 1-11, 1992. Cooke, M.S., et al., Immunogenicity of DNA damaged by reactive oxygen species-implications for anti-DNA antibodies in lupus, Free Radic. Biol. Med., 22, 151-159, 1997. Fridorich, I., The biology of oxygen radicals, Science, 201, 875-881, 1978. Han, J.Y., et al., A case report of alverine-citrate-induced acute hepatitis, The Korean Journal of Hepatology, 16, 75-78, 2010. Han, M.J., et al., Antioxidant effect of ether and ethylacetate fractions of Pueraria thunbergiana extract on perilla oil, Korean J. Soc. Food Sci., 15, 114-120, 1999. Jang, E.J., et al., Antioxidant effect of Omija(Shizandra chinensis Baillon) extracts, Korean J. Soc. Food Sci., 12, 372-376, 1996. Jun, B.S., et al., Antioxidative activities of fruit extracts of Paulownia tomentosa stued, Korean J. Postharvest Sci. Technol., 8(2), 231-238, 2001. Kim, H.J., et al., Antioxidative activites by water-soluble extracts of Morus alba and Cudrania tricusdata, Korean J. Soc. Agric. Chem. Biotechnol., 43, 148-152, 2000. Lee, Y.H., et al., Terrein reduces age-related inflammation induced by oxidative stress through Nrf2/ERK1/2/HO-1 signalling in aged HDF cells, Cell Biochem. Funct. 33(7), 479-486, 2015. Lopaczyski, W., et al., Antioxidants, programmed cell death, and cancer, Nutr. Res., 21, 295-307, 2001. Park, M.K., et al., Ecological and morphological studies on the Prasiola sp. in the Samchuck-Chodang, J. Plant Bio., 13, 1-10, 1970. Seo, D.W., et al., Screening of functional components derived from fresh water laver, Prasiola japonica, and its pharmacological properties, J. Biomed. Res., 14(2), 83-90, 2013. Yagi, K., Lipid peroxidase and human disease, Chem. Phys. Lipids, 45, 337-341, 1987. Yang, T.K., et al., Davallialactone from mushroom reduced premature senescence and inflammation on glucose oxidative stress in human diploid fibroblast cells, J. Agric. Food Chem., 61(29), 7089-7095, 2013. Yu, B.P., Cellular defense against damage from reactive oxygen species, Physiol. Rev., 74, 139-162, 1994.

본 발명의 목적은 알베린(alverine) 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 알베린 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

상기 항산화 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 알베린 화합물이 약학적 조성물 총 중량을 기준으로 0.001~50중량%로 첨가될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 만성알코올중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작, 아토피성 피부염, 기관지염, 간질, 만성폐쇄성 질환, 당뇨병성 혈관합병증 및 심근경색으로 이루어진 군에서 선택되는 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물일 수 있다.

또한, 상기 항산화 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 알베린 화합물이 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 0.001~50중량%로 첨가될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 피부 거칠음 및 건조로 이루어진 군에서 선택되는 활성산소에 의한 피부 장애 개선용 조성물일 수 있다.

또한, 상기 항산화 조성물은 건강기능식품일 수 있다.

상기 건강기능식품은 알베린 화합물이 건강기능식품 총 중량을 기준으로 0.001~50중량%로 첨가될 수 있다.

상기 건강기능식품은 노화, 만성알코올중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작, 아토피성 피부염, 기관지염, 간질, 만성폐쇄성 질환, 당뇨병성 혈관합병증 및 심근경색으로 이루어진 군에서 선택되는 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환의 개선용 건강기능식품일 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 알베린 화합물은 통상적인 방법에 따라 합성할 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있으며, 또는 민물김(Prasiola japonica)으로부터 분리, 정제될 수 있다.

상기 민물김은 녹조류로 홍조류인 바다김과는 다르며, 바다김에서는 관찰되지 않은 만노스(mannose), 롤리올라이드(loliolide), 솔비톨(sorbitol), 글루시톨(glucitol), 만니톨(mannitol) 및 알베린(alveine) 화합물 등이 포함되어 있다.

상기 항산화 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 알베린 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있으며, 상기 알베린 화합물은 약학적 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~40중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨,자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 알베린 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로, 상기 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환은 만성알코올중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작 아토피성 피부염, 기관지염 및 심근경색으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(alzheimer's disease), 파킨슨병(parkinson's disease) 헌팅톤병(huntington's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 다발성 신경위축(polyneuropatchy), 간질(epilepsy), 뇌질환 또는 뇌졸중(stroke) 및 치매(dementia) 등일 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 상기 항산화 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 활성산소에 의한 피부 장애 개선용 화장료 조성물일 수 있으며, 상기 활성산소에 의한 피부 장애는 피부 노화, 잔주름, 피부 거칠음 및 건조일 수 있다. 바람직하게는 피부 거칠음 및 건조이다.

상기 화장료 조성물은 상기 알베린 화합물이 전체 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~40중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 화장료 조성물은, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 본 발명의 알베린 화합물에 지방물질, 유기용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 항산화 조성물은 건강기능식품일 수 있다.

상기 건강기능식품은 상기 알베린 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 항산화 효과를 갖는 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 노화, 만성알코올중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작, 아토피성 피부염, 기관지염, 간질, 만성폐쇄성 질환, 당뇨병성 혈관합병증 및 심근경색으로 이루어진 군에서 선택되는 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환의 개선용 건강기능식품 일 수 있다.

상기 건강기능식품은 상기 알베린 화합물이 건강기능식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~30중량%, 가장 바람직하게는 0.001~10중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.

본 발명은 알베린 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물에 관한 것으로, 상기 알베린 화합물이 우수한 항산화 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 알베린 화합물을 이용하여 항산화 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 개발에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 알베린 화합물의 ABTS 라디칼 소거능을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 알베린 화합물의 과산화수소 소거능을 확인한 결과로, (A)는 알베린 화합물의, (B)는 알베린 화합물이 포함되어 있는 민물김 추출물의 처리에 따른 과산화수소 소거능을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 알베린 화합물의 세포 내 활성산소(ROS) 생성 억제 활성을 확인한 것으로, (A)는 알베린 화합물의 활성산소 유도제에 의한 세포 내 활성산소 생성 억제효과를 보여주고 있고, (B)는 세포 내 활성산소 생성 억제가 세포 수 감소에 의한 것이 아닌 알베린 화합물의 항산화 활성에 의한 활성산소 생성 억제 효과에 의한 것임을 보여주고 있다.
도 4는 알베린 화합물의 산화적 스트레스로부터의 세포 보호 효과를 보여주고 있다.
도 5는 알베린 화합물의 세포 독성 확인 결과를 보여주고 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 동물 세포의 배양>

본 발명의 알베린 화합물의 항산화 활성을 확인하기 위해 동물 세포를 배양하였다. 이때 동물 세포는 인간 각질 세포주(keratinocyte cell)인 HaCaT 세포를 이용하였다. 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린(penicillin) 및 100U/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Medium) 배지를 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

<실시예 2. 알베린 화합물의 활성산소 제거 효과 확인>

실시예 2-1. 라디칼 소거능 확인

본 발명의 알베린 화합물의 활성산소 제거 효과를 확인하기 위해 ABTS(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 어세이를 수행하였다.

7.4mM ABTS와 2.4mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 1:1로 혼합하여 ABTS 용액을 만들고 암실에서 실온으로 24시간 이상 반응시켜 ABTS 라디칼을 형성시켰다. ABTS 라디칼이 형성된 ABTS 용액을 PBS(phosphate-buffered saline)(pH 7.4)를 혼합하여 734㎚에서 흡광도가 0.7±0.002가 되도록 희석하였다. 96웰 플레이트에 PBS로 희석한 ABTS 용액 100㎕와 0, 50, 100, 200uM 농도의 알베린 화합물을 넣고 암실에서 15분 동안 반응시킨 후 734㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 시료의 흡광도를 100% 기준으로 하여, 알베린 화합물 처리에 따른 ABTS 라디칼 소거능을 계산하였다.

도 1에서 보여주듯이, 알베린 화합물의 처리 농도에 따라 ABTS 라디칼의 양이 감소되는 것을 확인하였다.

실시예 2-2. 과산화수소(H ₂ O ₂ ) 소거능 확인

본 발명의 알베린 화합물의 활성산소 제거 효과를 확인하기 위해 비라디칼인 과산화수소(hydrogen peroxidase, H₂O₂) 소거능을 확인하였다.

96웰 플레이트에 20mM 과산화수소를 분주하고, 알베린 화합물을 0, 12, 24, 48㎍/㎖(0, 25, 50, 100uM)이 되도록 각각 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 20분간 반응시켰다. 20분 후에 230㎚에서 흡광도를 측정하였고, 아무것도 처리하지 않은 시료의 흡광도를 100% 기준으로 하여, 알베린 화합물 처리에 따른 과산화수소 소거능을 계산하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때, 알베린 화합물이 포함되어 있다고 알려진 민물김 추출물을 0, 50, 100, 200㎍/㎖이 되도록 처리하여, 민물김 추출물 대비 알베린 화합물의 항산화 효과를 비교하였다.

도 2에서 보여주듯이, (A)의 알베린 화합물의 처리한 경우와 (B)의 민물김 추출물을 처리한 경우 모두에서 과산화수소의 양이 감소되는 것을 확인하였다. 구체적으로, (B)의 민물김 추출물 처리양 대비 (A)의 알베린 화합물 처리 농도가 현저히 낮음에도 불구하고 과산화수소의 양이 현저히 감소되는 것을 확인하였다.

따라서, 상기 실시예 2-1 및 실시예 2-2의 결과를 통해, 본 발명의 알베린 화합물이 우수한 라디칼 및 과산화수소와 같은 비라디칼의 활성산소 제거능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

실시예 2-3. 세포 내 활성산소 생성 효과 확인

본 발명의 알베린 화합물의 세포 내 활성산소 생성 억제 효과를 확인하였다.

상기 실시예 1에서 배양한 HaCaT 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵개의 세포가 되도록 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 각 웰에 알베린 화합물이 0, 25, 50, 100uM이 되도록 처리하고, 활성산소 유도제인 SNP(sodium nitroprusside) 200uM을 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후에 배양액 100㎕를 새로운 96웰 플레이트에 넣고, 그리스 시약(griess reagent) 100㎕와 10분간 반응시킨 다음, 540㎚에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3(A)에 나타내었다. 이때, SNP만 처리한 세포 배양액에서의 활성산소량을 100% 기준으로 하여, 활성산소 생성률을 계산하였다.

도 3(A)의 활성산소 생성률 분석 결과에서 보여주듯이, 알베린 화합물 처리 농도에 따라 세포 내 활성산소 생성률이 감소하는 것을 확인하였다.

상기 세포 내 활성산소 생성률의 감소가 알베린 화합물에 의한 세포 사멸에 의한 것인지 확인하기 위해 세포 생존율을 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 통해 확인하였다.

상기 활성산소 생성률 확인 방법과 동일하게 세포에 시료를 처리하고 얻은 세포 배양액에서 배양액 100㎕를 제거하고, 5㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 10㎕씩 첨가하여 37℃에서 3시간 반응시킨 후 배양액을 제거하고 각 웰 당 반응정지 용액(10% SDS in 0.1N HCl) 100㎕를 가하여 24시간 반응시킨 뒤, 540㎚에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3(B)에 나타내었다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 HaCaT 세포의 세포 생존율을 100% 기준으로 하여, 시료를 처리한 세포의 생존율을 계산하였다.

도 3(B)의 세포 생존율을 확인한 결과에서 보여주듯이, 아무것도 처리하지 않은 세포 또는 SNP만을 처리한 세포와 대비하여 알베린 화합물을 처리한 세포의 생존율은 큰 차이가 없는 것을 확인하였다.

이를 통해, 상기 알베린 화합물의 세포 내 활성산소 생성 억제는 세포 수 감소에 의한 것이 아닌, 알베린 화합물이 세포 내 활성산소 생성 기작을 억제함으로써 나타난다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 3. 산화적 스트레스로부터의 세포 보호 효과 확인>

본 발명의 알베린 화합물의 산화적 스트레스로부터의 세포 보호 효과를 확인하기 위해 세포에 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 후, MTT 어세이를 통해 세포 생존율을 확인함으로써 세포 보호 효과를 확인하였다.

상기 실시예 1에서 배양한 HaCaT 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵개의 세포가 되도록 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 과산화수소를 50uM이 되도록 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였다. 이때, 일부 웰에 알베린 화합물을 50uM 또는 100uM이 되도록 함께 처리하였고, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 상기 실시예 2-3의 MTT 어세이 방법과 동일한 방법으로 세포 생존율을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보여주듯이, 과산화수소만을 처리한 경우에는 생존한 세포 생존율이 감소한 반면에, 알베린 화합물을 처리한 경우에는 과산화수소에 의해 감소된 세포 생존율이 다시 증가하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 알베린 화합물이 과산화소수에 의한 산화적 스트레스로부터 세포를 보호한다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4. 알베린 화합물의 세포 독성 확인>

본 발명의 알베린 화합물에 의한 세포 독성 여부를 MTT 어세이 방법을 이용해 확인하였다.

상기 실시예 1에서 배양한 HaCaT 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵개의 세포가 되도록 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 각 웰에 알베린 화합물이 0, 25, 50, 100, 200uM이 되도록 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후에 상기 실시예 2-3의 MTT 어세이 방법과 동일한 방법으로 세포 생존율을 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보여주듯이, 알베린 화합물 200uM을 제외한 나머지 농도에서는 HaCaT 세포의 생존율이 아무것도 처리하지 않은 세포와 유사한 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 알베린 화합물 100uM 까지는 세포 독성이 거의 없다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 5. 알베린 화합물의 피부 건조 개선 효과 확인>

본 발명의 알베린 화합물의 피부 건조 개선 효과를 확인하기 위해, 무모(hairless) 마우스에 UV를 조사하여 산화 스트레스에 의한 피부 건조를 유도하고, 건조된 피부에의 가려움증에 의한 긁기 횟수를 측정하여 피부 건조 개선 효과를 확인하였다.

마우스에 UV 조사를 통해 피부 건조를 유도하고, 하기 제조예 2-1의 알베린 화합물을 포함하는 크림을 피부에 도포하여 마우스의 긁기 횟수를 측정한 결과, 피부 건조를 유도한 마우스에 비해 제조예 2-1의 크림을 도포한 경우에 그 횟수가 감소하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 알베린 화합물이 항산화 효과를 통해 산화 스트레스에 의한 피부 건조를 개선할 수 있음을 알 수 있었다.

<제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 정제의 제조

본 발명의 알베린 화합물 200㎎을 락토즈 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄하여 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활성 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 알베린 화합물 100㎎, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<제제예 2. 화장료 조성물의 제조>

제제예 2-1. 크림 제조

본 발명의 알베린 화합물 5g에 시토스테롤 4g, 폴리글리세릴 2-올레이트 3g, 세라마이드 0.7g, 세테아레스-4 2g, 콜레스테롤 3g, 디세틸포스페이트 0.4g, 농글리세린 5.0g, 선플라우어오일 22g, 카르복시비닐폴리머 0.5g, 트리에탄올아민 0.5g, 방부제 및 향료 미량 및 정제수를 총 무게가 100g이 되도록 혼합하였고, 통상의 크림 제조 방법에 따라 영양 크림을 제조하였다.

제제예 2-2. 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해하였다. 본 발명의 알베린 화합물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 혼합 생약의 추출물을 함유하는 화장수를 제조하였다.

제제예 2-3. 유액 제조

세틸알코올 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 본 발명의 알베린 화합물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시켰다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 유액을 제조하였다.

제제예 2-4. 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 본 발명의 알베린 화합물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 미용액을 제조하였다.

<제제예 3. 건강기능식품의 제조>

제제예 3-1. 건강기능식품의 제조

본 발명의 알베린 화합물 2g, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산 마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 섞어 과립으로 제조하였으나, 용도에 따라 다양한 제형으로 변형시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조할 수 있다.

제제예 3-2. 건강기능성 음료의 제조

본 발명의 알베린 화합물 1g, 구연산 0.1g, 프락토올리고당 100g, 정제수 900g을 섞어 통상의 음료 제조방법에 따라 교반, 가열, 여과, 살균, 냉장하여 음료를 제조하였다.

Claims

알베린(alverine) 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제2항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 알베린 화합물이 약학적 조성물 총 중량을 기준으로 0.001~50중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 만성알코올중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작, 아토피성 피부염, 기관지염, 간질, 만성폐쇄성 질환, 당뇨병성 혈관합병증 및 심근경색으로 이루어진 군에서 선택되는 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제5항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 알베린 화합물이 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 0.001~50중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부 거칠음 및 건조로 이루어진 군에서 선택되는 활성산소에 의한 피부 장애 개선용 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능식품인 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제8항에 있어서,
상기 건강기능식품은 알베린 화합물이 건강기능식품 총 중량을 기준으로 0.001~50중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 건강기능식품은 노화, 만성알코올중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작, 아토피성 피부염, 기관지염, 간질, 만성폐쇄성 질환, 당뇨병성 혈관합병증 및 심근경색으로 이루어진 군에서 선택되는 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환의 개선용 건강기능식품인 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.