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KR20190083655A - 간 질환을 치료하는 방법 - Google Patents

간 질환을 치료하는 방법 Download PDF

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KR20190083655A
KR20190083655A KR1020197016182A KR20197016182A KR20190083655A KR 20190083655 A KR20190083655 A KR 20190083655A KR 1020197016182 A KR1020197016182 A KR 1020197016182A KR 20197016182 A KR20197016182 A KR 20197016182A KR 20190083655 A KR20190083655 A KR 20190083655A
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KR
South Korea
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formula
compound
liver
effective amount
fxr agonist
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020197016182A
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English (en)
Inventor
데이비드 고돈 클락손 브레켄리지
그란트 레이몬드 부다스
존 티. 릴레스
윌리암 제이. 왓킨스
Original Assignee
길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
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Application filed by 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 filed Critical 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드
Publication of KR20190083655A publication Critical patent/KR20190083655A/ko
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Abstract

본 개시 내용은 ASK1 저해제를 FXR 효능제와 병용하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 간 질환을 예방하고/거나 치료하는 방법과 관련된 것이다.

Description

간 질환을 치료하는 방법
분야
본 개시는 간 질환을 예방하고/거나 치료하는 방법에 관한 것이다.
배경
간 질환은 질환의 기간에 기반하여 일반적으로 급성 또는 만성으로 분류된다. 간 질환은 감염, 상해, 약물 또는 독성 화합물에 노출, 알콜, 음식 안의 불순물 및 혈액 내 정상 물질의 비정상적인 축적, 자가면역 과정, 유전적인 결함 (예를 들어, 혈색소증) 또는 알려지지 않은 원인(들)에 의해 야기될 수 있다.
간 질환은 세계적으로 주요한 사망 원인이다. 특히, 지방이 높은 식이가 간염과 놀랍게도 유사한 방식으로 간을 손상시킨다는 것이 보여졌다. 미국 간 재단은 20 퍼센트를 초과하는 인구가 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)을 갖는다고 추정한다. 비만, 건강하지 못한 식이, 및 좌식 생활방식이 높은 NAFLD 유병률에 기여하는 것으로 제안된다. 치료되지 않은 채로 방치되는 경우, NAFLD는 심각한 부작용을 야기하는 비-알콜성 지방간염 (NASH)로 진행될 수 있다. NASH가 일단 발병되면, 시간이 지남에 따라 간에 부종 및 흉터 (즉, 경화)를 야기할 수 있다.
비록 예비 보고서가 긍정적인 생활방식의 변화로 간 손상을 예방하거나 역전시킬 수 있다고 제안하지만, NAFLD에 대한 효과적인 약물 치료법이 없다. 따라서, 간 질환을 치료하는 새롭고 효과적인 제약적 약제를 제공하는 수요가 남아있다.
요약
본원에 개시된 것은 환자에게 치료 유효량의 아폽토시스 신호 조절 키나아제 1 (signal regulating kinase 1 (ASK1)) 저해제를 치료 유효량의 파네소이드 (farnesoid) X 수용체 (FXR) 효능제와 병용하여 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 간 질환을 치료하고/거나 예방하는 방법이다. 간 질환은 만성 및/또는 대사성 간 질환, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 및 비알콜성 지방간염 (NASH)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 임의의 간 질환이 될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 것은 치료 유효량의 ASK1 저해제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 병용하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 비알콜성 지방간염 (NASH)을 치료하고/거나 예방하는 방법이다.
본원에 제공된 방법에서, ASK1 저해제 및 FXR 효능제는 공동 투여될 수 있다. 이러한 실시양태에서, ASK1 저해제 및 FXR 효능제는 단일 제약 조성물로 함께, 또는 하나 초과의 제약 조성물로 별도로 투여될 수 있다. 따라서, 또한 본원에서 제공된 것은 치료 유효량의 ASK1 저해제 및 치료 유효량의 FXR 효능제를 포함하는 제약 조성물이다.
도면의 설명
도 1: 형태측정 이미지 분석에 의하여 정량된 PSR 염색 (간의 면적%). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 2: 간 조직의 그램당 히드록시프롤린의 마이크로그램으로 나타낸 간의 히드록시프롤린 함량. 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 3: 형태측정 이미지 분석에 의하여 정량된 데스민(Desmin)+ 염색 (간의 면적%). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 4: 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 간 섬유화 유전자 Col1a1의 간 발현. 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 5: 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 간 섬유화 유전자 TIMP-1의 간 발현. 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 6: 형태측정 이미지 분석에 의하여 정량된 간 지방증 (간의 공포 면적%). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 7: 간 조직의 그램당 콜레스테롤의 밀리그램으로 나타낸 간의 간 콜레스테롤 함량. 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 8: 혈장의 밀리리터당 담즙산의 나노그램으로 나타낸 혈장 내 전체 담즙산 수치. 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 9: 정량적 나노스트링에 의해 측정된 간 내 염증성 유전자 IL1-β의 간 발현. 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
상세한 설명
정의 및 일반적 파라미터
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하기의 용어 및 문구는 일반적으로 그들이 사용되는 문맥이 다른 것을 나타내는 경우를 제외하고는, 아래에서 설명되는 의미를 갖는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 정량 측정의 맥락에서 사용되는 "약"이라는 용어는 지시된 양 ± 10 %, 또는 대안으로 지시된 양 ± 5 % 또는 ± 1 %를 의미한다.
용어 "제약적으로 허용되는 염"은 기본 화합물의 생물학적 유효성 및 속성을 유지하면서, 생물학적이거나 달리 비바람직하지 않은 본원에 개시된 화합물의 염을 언급한다. 여기에 산 첨가 염 및 염기 첨가 염이 있다. 제약적으로 허용되는 산 첨가 염은 무기 및 유기 산으로부터 제조될 수 있다.
제약적으로 허용되는 염 (산 첨가 또는 염기 첨가 염 각각)을 형성하기 위한 기본 화합물과 반응에 유용한 산 및 염기는 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 유사하게, (개시에 있는) 기본 화합물로부터 제약적으로 허용되는 염을 제조하는 방법은 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있고 예를 들면, 문헌[Berge, at al. Journal of Pharmaceutical Science, Jan. 1977 vol. 66, No.1] 및 다른 자료에 개시되어 있다.
본원에서 사용된, "제약적으로 허용되는 담체"는 개시된 화합물 또는 이의 용도에 유해하지 않은 부형제 또는 약제 예를 들어 용매, 희석제, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약적으로 활성인 물질의 조성물을 제조하기 위한 이러한 담체 및 약제의 용도는 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA 17th Ed. (1985); 및 Modern Pharmaceutics, Marcel Dekker, Inc. 3rd Ed. (G.S. Banker & C.T. Rhodes, Eds.)를 참조).
용어 "치료 유효량" 및 "유효량"은 상호교환적으로 사용되고, 하기에 정의된 것과 같이 1 회 이상의 투여로 이러한 치료가 필요한 환자 (예를 들면, 인간)에게 투여된 경우에, 치료를 행하기에 충분한 양의 화합물을 언급한다. 치료 유효량은 검증된 처방자 또는 의료진에 의해 결정되는 바와 같이, 환자, 치료될 질환, 환자의 체중 및/또는 연령, 질환의 중증도, 또는 투여의 방식에 따라 달라질 것이다.
"치료"또는 "치료하는"이란 용어는 (i) 질환의 발병을 지연시키는, 즉 질환의 임상 증상이 발생하지 못하도록 하거나 이의 발생을 지연시키는; (ii) 질환을 저해하는, 즉, 임상 증상의 발생을 억제하는 및/또는 (iii) 질환을 완화하는, 즉 임상 증상 또는 이의 중증도의 퇴보를 야기하는 목적으로 식 (I)의 화합물 또는 제약적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 의미한다.
간 질환
간 질환은 질환의 기간에 기반한 간에 대한 급성 또는 만성 손상이다. 간 손상은 감염, 상해, 약물 또는 독성 화합물 예를 들어 알콜 또는 음식 안의 불순물에 노출, 혈액의 정상 물질의 비정상적인 축적, 자가면역 과정, 유전적인 결함 (예를 들어 혈색소증) 또는 다른 알려지지 않은 원인들에 의해 야기될 수 있다. 예시적인 간 질환은 경화, 간 섬유화, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비-알콜성 지방간염 (NASH), 알콜성 지방간염 (ASH), 간의 허혈성 재관류 손상, 원발성 담즙성 간경화 (PBC), 및 바이러스성 및 알콜성 간염을 모두 포함하는 간염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)은 알콜에 의해 야기된 것이 아닌 간 세포 내 여분의 지방 축적이다. NAFLD는 간의 부종(즉, 지방간염)을 야기할 수 있고, 결국 시간이 지남에 따라 상처 (즉, 경화)를 야기할 수 있고, 간암 또는 간부전으로 이어질 수 있다. NAFLD는 간세포 내 지방의 축적을 특징으로 하고 종종 일부 대사 증후군의 측면 (예를 들면, 제2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고지혈증, 고혈압)과 연관되어 있다. 이 질환의 빈도가 풍부한 탄수화물 및 고지방 식이의 소비 때문에 점점 더 흔해지고 있다. NAFLD 환자의 일부 (~20 %)에서 비알콜성 지방간염 (NASH)이 발생한다.
지방간 질환의 아형인 NASH는 NAFLD의 보다 심각한 형태이다. 이는 거대공포성 지방증 (macrovesicular steatosis), 간세포의 풍선 퇴화, 및/또는 궁극적으로 간의 상처 (즉 섬유화)로 이어지는 염증을 특징으로 한다. NASH로 진단된 환자는 진행된 단계의 간 섬유화 및 결국 경화로 진전된다. 질환 말기의 경화성 NASH 환자를 위한 현재의 치료법은 간 이식이다.
시험은 유의한 비율의 진단된 NASH 환자 (39 %)가 진단을 확정하기 위해 간 조직 검사를 받은 적이 없다는 것을 보였다. 문헌에 보고된 것 (II-형 당뇨병 54 %, 비만 71 %, 대사 증후군 59 %)보다 더 많은 비율의 진단된 NASH 환자가 대사 증후군 파라미터를 가진다. 82 %의 의사가 유의한 알콜 소비를 정의하는 데 실무 지침 권장 사항에 비해 더 낮은 역치를 사용한다. 88 %의 의사는 NASH에 대해 약학적 치료의 일부 형태를 처방한다 (NASH 환자에 대해 Vit E: 53 %, 스타틴: 57 %, 메트폴민: 50 %로 처방됨). 따라서 확립된 진단 또는 개입을 지지하는 유의한 데이터가 부족하고 NASH를 배재하기 위한 알콜 역치가 기대했던 것보다 낮음에도 불구하고 대다수의 환자는 약제를 처방받는다.
또 다른 흔한 간 질환은 원발성 경화성 담관염 (PSC)이다. 이는 간 안쪽과 바깥쪽의 담관을 천천히 손상시키는 만성 또는 장기 간 질환이다. PSC 환자에서, 막힌 담관으로 인해 간에 담즙이 축적되고 간세포를 점차적으로 손상시켜 간의 경화 또는 상처를 야기한다. 현재, PSC를 치료할 효과적인 치료법은 없다. PSC를 가진 많은 환자들은 질환으로 진단되고 전형적으로 약 10 년 뒤에는, 간부전으로 인해 궁극적으로 간 이식이 필요하다. PSC는 또한 담관암으로 이어질 수도 있다.
간 섬유화는 대부분 유형의 만성 간 질환에서 발생하는, 콜라겐을 포함하는 세포외 기질 단백질의 과도한 축적이다. 진행된 간 섬유화는 경화, 간부전 및 문맥성 고혈압을 야기하고 종종 간 이식을 요구한다.
방법
본원에 개시된 것은 치료 유효량의 FXR 효능제와 병용하여 치료 유효량의 ASK1 저해제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 간 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법이다. 활성 간 질환의 발생은 혈액에서 상승된 효소 수치의 존재에 의하여 검출될 수 있다. 특히, 임상적으로 허용되는 정상 범위를 넘는 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)의 혈액 수치는 진행중인 간 손상을 암시하는 것으로 알려져 있다. ALT 및 AST의 혈액 수치에 대한 간 질환 환자의 일상적인 모니터링은 의학적 치료 중에 간 질환의 진행을 측정하기 위해 임상적으로 사용된다. 상승된 ALT 및 AST를 허용된 정상 범위 내로 감소시키는 것은 환자의 진행중인 간 손상의 중증도 감소를 반영하는 임상적 증거로 간주된다.
특정 실시양태에서, 간 질환은 만성 간 질환이다. 만성 간 질환은 섬유화와 경화로 이어지는 간 실질의 점진적인 파괴와 재생을 포함한다. 일반적으로 만성 간 질환은 바이러스 (예를 들어 B형 간염, C형 간염, 거대세포바이러스 (CMV) 또는 엡스타인 바 바이러스(EBV)), 독성 약제 또는 약물 (예를 들어 알콜, 메토트렉세이트 또는 니트로푸란토인), 대사성 질환 (예를 들어 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비-알콜성 지방 간염 (NASH), 혈색소증 또는 윌슨병), 자가면역 질환 (예를 들어, 자가면역 만성 간염, 원발성 담즙성 담관염 (이전에 원발성 담즙성 경화로 알려짐) 또는 원발성 경화성 담관염), 또는 다른 원인 (예를 들어 우심부전)에 의하여 야기될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 것은 경화의 수준을 감소시키는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 경화는 병리학적으로, 섬유화 및 결절의 재생을 동반한, 현미경으로 관찰되는 정상 소엽 구조의 손실을 특징으로 한다. 경화의 정도를 측정하는 방법은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 하나의 실시양태에서, 경화의 수준이 약 5 % 내지 약 100 % 감소된다. 하나의 실시양태에서, 경화의 수준이 환자에서 적어도 약 5 %, 적어도 약 10 %, 적어도 약 15 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 25 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 35 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 45 %, 적어도 50 %, 적어도 약 55 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 65 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 75 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 또는 약 100 % 감소된다.
특정 실시양태에서, 간 질환은 대사성 간 질환이다. 하나의 실시양태에서, 간 질환은 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)이다. NAFLD는 인슐린 저항성 및 대사성 증후군 (비만, 복합된 고지혈증, (II 형) 당뇨병 및 고혈압)과 관련된다. NAFLD는 질환 활동의 스펙트럼을 포괄하는 것으로 고려되고 간 내 지방 축적 (간 지방증)으로 시작한다.
비만 및 인슐린 저항성 모두 NAFLD의 질환 과정에서 강력한 역할을 하는 것으로 보여졌다. 불량한 식이 요법 외에도, NAFLD는 몇가지 다른 알려진 원인을 갖는다. 예를 들면, NAFLD는 특정 약물 예를 들어 아미오다론, 항 바이러스제 (예를 들면, 뉴클레오시드 유사체), 아스피린 (소아에서 라이증후군의 일부로서 드물게 ), 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트, 타목시펜 또는 테트라사이클린에 의해 야기될 수 있다. NAFLD는 또한 복부 내 증가된 지방 축적을 야기할 수 있는 고과당 옥수수 시럽의 존재를 통한 청량 음료의 소비와 연관되어 있지만, 자당의 소비도 (과당으로의 분해 때문에 마찬가지로) 유사한 효과를 보인다. 이 감수성에 대한 두가지 유전적 돌연변이가 확인되었기 때문에, 유전학 또한 역할을 하는 것으로 알려졌다.
치료되지 않은 채로 방치된다면, NAFLD는 NAFLD의 가장 극단적인 형태, 지방증이 염증 및 섬유화와 결합된 상태인 비-알콜성 지방간염 (NASH)로 발전할 수 있다. NASH는 간경화의 주요 원인으로 여겨지고 있다. 따라서 본원에서 제공되는 것은 이를 필요로 하는 환자에서, 치료 유효량의 ASK1 저해제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 병용하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는 비알콜성 지방간염 (NASH)을 치료하고/거나 예방하는 방법이다.
또한 본원에서 제공되는 것은 이를 필요로 하는 환자에서, 치료 유효량의 ASK1 저해제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 병용하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는 간 섬유화를 치료하고/거나 예방하는 방법이다. 간 섬유화는 대부분의 유형의 만성 간 질환에서 발생하는 콜라겐을 포함하는 세포외 기질 단백질의 과도한 축적이다. 특정 실시양태에서, 진행된 간 섬유화는 경화 및 간부전을 야기한다. 간 조직학, 예를 들어 섬유화, 소엽성 간염 및 문맥주위 가교성 괴사의 정도의 변화를 측정하는 방법은 기술 분야에 잘 알려져 있다.
하나의 실시양태에서, 섬유 조직의 형성, 섬유증 또는 섬유성 퇴화인 간 섬유화의 수준은 약 90 %를 초과하여 감소된다. 하나의 실시양태에서, 섬유 조직의 형성, 섬유증 또는 섬유성 퇴화인 섬유화의 정도는, 적어도 약 90 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 10 %, 적어도 약 5 % 또는 적어도 약 2 % 감소한다.
하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물은 간에서 섬유 형성(fibrogenesis)의 수준을 감소시킨다. 간 섬유 형성은 섬유화로 알려진 간에서 세포외 기질 성분의 과도한 축적으로 이어지는 과정이다. 이는 많은 상태, 예를 들어 만성 바이러스성 B형 및 C형 간염, 알콜성 간 질환, 약물-유발된 간 질환, 혈색소증, 자가-면역 간염, 윌슨병, 원발성 담즙성 담관염 (이전에 원발성 담즙성 간경화로 알려짐), 경화성 담관염, 간 주혈흡충증 및 다른 것들에서 관찰된다. 하나의 실시양태에서, 섬유 형성 수준이 약 90 %를 초과하여 감소된다. 하나의 실시양태에서, 섬유 형성의 수준이 적어도 약 90 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 50 %, 적어도 40 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 10 %, 적어도 약 5 % 또는 적어도 2 % 감소된다.
여전히 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 것은 치료 유효량의 ASK1 저해제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 병용하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 환자에서 원발성 경화성 담관염 (PSC)을 치료하고/거나 예방하는 방법이다.
NASH를 가진 환자는 후생유전학 테스트에서 건강한 환자보다 평균적으로 약 2.8 세 나이들었다는 것이 관찰되었다. 따라서, 하나의 실시양태에서, NASH의 치료에 유용한 화합물은 후생유전학 연령 또는 NASH로 인한 노화 효과를 감속, 개선 또는 역전시키는데 유용할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들면 본원에 개시된 바와 같은 ASK1 저해제와 FXR 효능제의 병용과 같은 NASH의 치료를 위한 병용 요법이 NASH로 인한 노화 효과의 개선 또는 역전에 유용할 수 있다.
하나의 실시양태에서, ASK1 저해제 및 FXR 효능제는 병용 제형 또는 별도의 제약 조성물로 함께 투여될 수 있으며, 여기서 각각의 저해제는 임의의 적합한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법은 ASK1 저해제 및 제약적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물 및 FXR 효능제 및 제약적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 별도로 투여하는 것을 포함한다. 본 개시에 따른 병용 제형은 하나 이상의 제약적으로 허용되는 담체 또는 부형제 및 임의의 다른 치료 약제와 함께 ASK1 저해제 및 FXR 효능제를 포함한다. 유효 성분을 함유하는 병용 제형은 의도된 투여 방법에 적합한 임의의 형태일 수 있다.
ASK1 저해제
본원에 개시된 방법 및 제약 조성물의 특정 실시양태에서, ASK1 저해제가 하기 식 (I)의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00001
본원에 개시된 방법 및 제약 조성물의 특정 실시양태에서, ASK1 저해제가 하기 식 (II)의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00002
식 (I) 및 식 (II)의 화합물은 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0009410 및 2013/0197037에 기재된 것과 같은 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법을 사용하여 합성되고 특징지어질 수 있다. 하나의 실시양태에서, ASK1 저해제가 식 (I)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염이다. 하나의 실시양태에서, ASK1 저해제가 식 (II)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염이다.
FXR 효능제
본원에 개시된 방법 및 제약 조성물의 특정 실시양태에서 FXR 효능제가 하기 식 (III)의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00003
본원에 개시된 방법 및 제약 조성물의 특정 실시양태에서 FXR 효능제가 하기 식 (IV)의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00004
식 (III) 및 식 (IV)의 화합물은 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법, 예를 들어 미국 공개 번호 2014/0221659에 기재된 것을 사용하여 합성되고 특징지어질 수 있다.
투약 및 투여
유효 성분을 단독으로 투여하는 것이 가능하지만, 하기에 기재되는 바와 같이 제약적 제형 또는 제약 조성물로서 이들을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 개시의, 가축 및 인간 모두에 대한 사용을 위한 제형은 적어도 하나의 유효 성분을, 하나 이상의 허용되는 이를 위한 담체 및 임의의 다른 치료 성분과 함께 포함한다. 담체(들)는 제형의 다른 성분과 호환되면서 이의 수용자에게 생리학적으로 무해하다는 의미에서 "허용되어야"한다.
각각의 유효 성분은 일상적인 실시에 따라 선택될 통상적인 담체 및 부형제로 제형화될 수 있다. 정제는 부형제, 활택제, 충전제, 결합제 등을 함유할 수 있다. 수성 제형은 멸균 형태로 제조되고, 경구 투여 이외의 전달을 의도하는 경우에는 일반적으로 등장성일 것이다. 모든 제형은 문헌[the Handbook of Pharmaceutical Excipients (1986)]에 기재된 것과 같은 부형제를 임의로 함유할 것이다. 부형제는 아스코르브산 및 다른 항산화제, 킬레이트제 예를 들어 EDTA, 탄수화물 예를 들어 덱스트린, 히드록시알킬셀룰로오스, 히드록시알킬메틸셀룰로오스, 스테아르산 등을 포함한다. 제형의 pH는 약 3 내지 약 11 범위이지만, 일상적으로 약 7 내지 10이다.
유효 성분의 치료 유효량은 통상적인 용량 상승 연구를 사용하여 숙련된 임상의에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 유효 성분은 0.01 밀리그램 내지 2 그램의 용량으로 투여될 것이다. 하나의 실시양태에서, 용량은 약 10 밀리그램 내지 450 밀리그램일 것이다. 또 다른 실시양태에서, 용량은 약 25 내지 약 250 밀리그램일 것이다. 또 다른 실시양태에서, 용량은 약 50 또는 100 밀리그램일 것이다. 하나의 실시양태에서, 용량은 약 100 밀리그램일 것이다. 하나의 실시양태에서, 18 mg의 ASK1 저해제가 투여된다. 특정 실시양태에서, 18 mg의 식 (II)의 화합물이 투여된다. 하나의 실시양태에서, 30 mg의 FXR 효능제가 투여된다. 특정 실시양태에서, 30 mg의 식 (III)의 화합물이 투여된다. 유효 성분은 1 일 1 회, 2 회 또는 3 회 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 유효 성분은 1 주에 1 회 또는 2 회, 2 주에 1 회, 3 주에 1 회, 4 주에 1 회, 5 주에 1 회, 또는 6 주에 1 회 투여될 수 있다.
유효 성분을 위한 제약 조성물은 상기 투여 경로에 대해 적합한 것을 포함할 수 있다. 제형은 단위 용량 형태로 편리하게 제공될 수 있고 약학 기술 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 기술 및 제형은 일반적으로 문헌[Remington 's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., PA, Easton)]에서 발견된다. 이러한 방법은 유효 성분을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 유효 성분을 액체 담체 또는 미분 고체 담체 또는 모두와 균일하고 단단하게 결합시킨 후, 필요하다면 생성물을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 제형은 미리 결정된 양의 유효 성분을 분말 또는 과립으로; 수성 또는 비-수성 액체 중에서의 용액 또는 현탁액으로; 또는 수중유적형 액체 유화액 또는 유중수적형 액체 유화액으로; 각각 함유하는 개별 단위, 예를 들어 캡슐, 카세(cachets) 또는 정제로 제공될 수 있다. 유효 성분은 또한 볼루스(bolus), 연약(electuary) 또는 페이스트로서 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 유효 성분은 피하 주사로서 투여될 수 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과, 압축 또는 성형에 의해 만들어 질 수 있다. 압축된 정제는 자유-유동 형태, 예를 들어 분말 또는 과립인 유효 성분을 적합한 기계에서 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 방부제 또는 표면 활성제와 혼합하고 압축함으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤화된 유효 성분 분말의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 만들어 질 수 있다. 정제는 임의적으로 코팅되거나 분할선을 넣을 수 있고 임의적으로 그로부터 유효 성분의 느리거나 제어된 방출을 제공하도록 제형화된다.
유효 성분은 조건에 적합한 임의의 경로로 투여될 수 있다. 적합한 경로는 경구, 직장, 비강, 국소 (구강 및 설하 포함), 질 및 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척수강내 및 경막외를 포함함) 등을 포함한다. 바람직한 경로는 예를 들면 수용자의 상태에 따라 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 특정 실시양태에서, 유효 성분은 경구로 생체이용가능하고, 따라서 경구로 투여될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 환자는 인간이다.
본원에 개시된 방법에서 병용하여 사용되는 경우, ASK1 저해제 및 FXR 효능제는 단일 제약 조성물로 함께 투여되거나 하나 초과의 제약 조성물에서 별도로 (동시에 또는 순차적으로) 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, ASK1 저해제 및 FXR 효능제는 함께 투여된다. 다른 실시양태에서, ASK1 저해제 및 FXR 효능제는 별도로 투여된다. 일부 측면에서, ASK1 저해제는 FXR 효능제 전에 투여된다. 일부 측면에서, FXR 효능제는 ASK1 저해제 전에 투여된다. 별도로 투여되는 경우, ASK1 저해제 및 FXR 효능제는 동일 또는 상이한 전달 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
제약 조성물
개시의 제약 조성물은 식 (I)의 화합물 및 식 (II)의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효량의 ASK1 저해제, 및 식 (III)의 화합물 및 식 (IV)의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효량의 FXR 효능제를 포함한다.
경구용으로 사용되는 경우, 예를 들면 정제, 트로키제, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 유화액, 경질 또는 연질 캡슐, 시럽 또는 엘릭서가 제조될 수 있다. 경구용으로 의도된 조성물은 제약 조성물의 제조를 위해 기술 분야에 알려진 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 조성물은 입맛에 맞는 제제를 제공하기 위해 감미제, 향료, 착색제 및 보존제를 포함하는 하나 이상의 작용제를 함유할 수 있다. 정제의 제조에 적합한 비-독성인 제약적으로 허용되는 부형제와 혼합한 유효 성분을 함유하는 정제가 허용된다. 이러한 부형제는, 예를 들면, 비활성 희석제, 예를 들어, 칼슘 또는 나트륨 카보네이트, 락토오스, 락토오스 일수화물, 크로스카멜로스 나트륨, 포비돈, 칼슘 또는 나트륨 포스페이트; 과립제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어, 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크일 수 있다. 정제는 비코팅될 수 있거나 위장관에서의 붕해 및 흡착을 지연시키기 위한 미세캡슐화를 포함하는 알려진 기술에 의해 코팅될 수 있으며, 이에 의해 더 장기간에 걸쳐 지속되는 작용을 제공한다. 예를 들면, 시간 지연 물질 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 사용할 수 있다.
경구용 제형은 또한 유효 성분이 비활성 고체 희석제, 예를 들면 인산 칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서 또는 유효 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들면, 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.
개시의 수성 현탁액은 유효 물질을 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합물로 함유한다. 이러한 부형제로는 현탁제, 예컨대 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아 및 분산제 또는 습윤제, 예컨대 자연적으로 발생하는 포스파타이드 (예를 들면, 레시틴), 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합 생성물(예를 들면, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 장쇄 지방족 알콜과 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물(예를 들면, 헵타데카에틸렌옥시세탄올), 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물(예를 들면, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 포함한다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제 및 하나 이상의 감미제, 예컨대 자당 또는 사카린을 함유할 수 있다.
유성 현탁액은 식물성 오일, 예를 들어, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일에 또는 미네랄 오일, 예를 들어 액체 파라핀에 유효 성분을 현탁함으로써 제형화될 수 있다. 경구 현탁액은 농후제, 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 감미제 예를 들어, 상기 설명한 것 및 향미제가 첨가되어 입맛에 맞는 경구 제제를 제공할 수 있다. 이들 조성물은 산화 방지제, 예를 들어 아스코르브산의 첨가에 의해 보존될 수 있다.
물의 첨가에 의한 수성 현탁액의 제제에 적합한 개시 내용의 분산성 분말 및 과립은 분산 또는 습윤제, 현탁화제, 및 하나 이상의 방부제와 혼합한 유효 성분을 제공한다. 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁화제는 상기 개시된 것들로 예시된다. 추가적 부형제, 예를 들어 감미, 향미 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.
개시 내용의 제약 조성물은 또한 수중유적형 유화액의 형태일 수 있다. 오일 층은 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일 또는 아라키스 오일, 미네랄 오일, 예를 들어 액체 파라핀 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 자연적-발생하는 검, 예를 들어 검 아카시아 및 검 트라가칸트, 자연적으로 발생하는 포스파타이드, 예를 들어, 대두 레시틴, 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 모노올레에이트, 및 이들 부분 에스테르의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함한다. 유화액은 또한 감미 및 향미제를 포함할 수 있다. 시럽 및 엘릭서는 감미제, 예를 들어, 글리세롤, 소르비톨 또는 자당과 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 또한 완화제, 방부제, 향미 또는 착색제를 포함할 수 있다.
개시 내용의 제약 조성물은 멸균 주사용 제제, 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 비-독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄-디올 중의 용액이거나 동결건조한 분말로서 제조될 수 있다. 허용되는 부형제 및 용매 중에서 사용될 수 있는 것은 물, 링거스 용액 및 등장성 염화 나트륨 용액이다. 그 외에, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용될 수 있다. 이 목적을 위해 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함한 임의의 무자극성 고정유가 사용될 수 있다. 그 외에, 지방산 예를 들어, 올레산이 마찬가지로 주사용 제제로서 사용될 수 있다.
단일 용량 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 결합될 수 있는 유효 성분의 양은 치료된 대상체 및 구체적인 투여 방식, 예를 들면 경구 투여 또는 피하 주사에 의존하여 다양할 것이다. 예를 들어, 사람에게 경구 투여용으로 의도된 서방형 제형은 전체 조성물의 약 5 내지 약 95 %로 (중량:중량) 다양할 수 있는 적절하고 편리한 담체 물질의 양으로 배합된 대략 1 내지 1000 mg의 활성 물질을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 투여를 위해 용이하게 측정 가능한 양을 제공하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 관류용으로 의도된 수용액은 적합한 부피의 관류가 약 30 mL/hr의 속도로 발생할 수 있게 하기 위해 용액의 밀리리터당 약 3 내지 500 μg의 유효 성분을 함유할 수 있다. 피하 투여를 위해 제형화된 경우, 제형은 약 2 내지 약 4 개월의 기간에 걸쳐 일반적으로 약 매달 두번씩 투여된다.
비경구 투여를 위한 적합한 제형은 항-산화제, 버퍼, 정균제 및 제형을 의도된 수령자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다.
제형은 단위-용량 또는 다-용량 용기 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용하기 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 요구하는 냉동-건조된 (동결건조) 조건으로 보관될 수 있다. 임시 주사(Extemporaneous injection) 용액 및 현탁액은 상기 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로 제조된다. 바람직한 단위 용량 제형은 본원에서 상기 언급하였듯이, 유효 성분의 하루 용량 또는 단위 하루 분할-용량 또는 이의 적절한 분획을 포함하는 것들이다.
실시예
실시예 1. NASH 래트 모델에서 효능
하기의 시험은 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 설치류 모델에서 ASK1 저해제 및 FXR 효능제의 병용의 효능을, 모델에서 각각의 약제 단독의 효능에 대비하여 평가하기 위해 수행하였다. NASH는 나트륨 니트리트 (CDHFD/NaNO2)의 만성적 투여와 결합한 콜린-결핍된 고 지방 식이 (CDHFD)의 투여에 의해 수컷 위스타 래트에서 유발되었다. 상기 모델은 진행된 NASH 환자에서 볼 수 있는 것과 특징 및 중증도가 유사한, 간섬유화를 야기하는 대사성 기능장애 (CDHFD) 및 산화적 스트레스 (NaNO2) 모두를 간에서 유발하는, NASH의 “이중타격이론”을 활용하였다.
래트에게 14 주 전체 동안 CDHFD를 급여하였고 4 내지 14 주에 NaNO2를 투여하였다. 4 내지 14 주에 식 (III)의 화합물 (식이에 혼합물로서 주어짐, 30 mg/kg/day를 전달하도록 조정됨), 식 (I)의 화합물 (식이에 0.2 % 혼합물로서 투여됨), 또는 부형제를 투여하였다. 하기 평가변수를 연구 14 주의 종료 때 평가하였다: i) 간 섬유화는 간 히드록시프롤린 (OHP) 함량에 의하고 피코시리우스 레드 (Picosirius red (PSR)) 염색에 의한 콜라겐 함량의 정량적 형태측정 분석에 의해 측정되었고; ii) 간 절편에서 근섬유아세포 활성은 근섬유아세포 마커 데스민의 정량적 IHC에 의해 측정되었고, iii) 간 조직에서 Col1a1 및 Timp1은 RT-PCR에 의하여 측정되었다.
방법
동물
수컷, 위스타 래트 (시험 시작시 6-8 주령)가 시험에 사용되었다. 모든 동물은 표준 사육장 조건하에 사육하였고 시험 시작 전에 14 일 동안 순응하도록 하였다.
CDHFD/NaNO 2 래트 모델에 대한 생애 실험 프로토콜
실험 디자인은 표 1에 보여진다. 모든 CDHFD/NaNO2 동물은 14 주간 콜린-결핍 고-지방 식이 (CDHFD; 리서치 다이어츠, 잉크 (Research Diets, Inc))를 급여하였고 또한 NaNO2 (주 3 회 주사; 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich) #31443)를 25 mg/kg의 용량으로 (4 내지 10 주) 및 12.5 mg/kg의 용량으로 (10 내지 14 주) 복강내 주사로 투여하였다.
식 (III) (CDHFD 식이에 혼합물로서 주어짐, 30 mg/kg/day를 전달하도록 조정됨, 군 당 n = 10 마리 동물) 및 식 (I) (CDHFD 식이에 0.2 % 혼합물로서 주어짐, 군 당 n=10)이 4 내지 14 주에 투여된 약물이었다. 부형제 대조군 동물 (부형제; 군 당 n = 10 마리 동물)에는 약물 첨가 없이 동일한 CDHFD 사료를 4 내지 14 주에 투여하였다. 건강한 대조군 동물에는 보통의 사료 식이를 급여하였고 NaNO2를 주지 않았다 (대조군, 군 당 n=10). 시험 마지막 날에, 래트는 동물을 안락사시키기 4 시간 전에 식 (I) 또는 식 (III)를 30 mg/kg의 용량으로 단회 경구 가비지(gavage) 받았고, 분석을 위해 조직을 수집하였다. 모든 평가변수는 14 주 시험 프로토콜의 종료 시점에 평가하였다.
표 1. 실험 디자인 및 용량군
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PSR의 정량적 형태측정 분석 및 데스민 IHC
피크로시리우스 레드 (PSR) 및 데스민 염색된 슬라이드의 전체 슬라이드 이미지를 40X 배율의 레이카 (Leica) AT2 스캐너를 사용하여 캡쳐하였다. 디지털 슬라이드 이미지는 스캐닝 품질이 체크되고, 주석이 첨부되어 레이카 디지털 이미지 허브 아카이브 안의 적절한 네트워크 폴더에 내보내졌다. PSR 및 데스민의 범위 및 강도를 결정하기 위해 데피니언스 티슈 스튜디오 아키텍트 (Definiens Tissue Studio Architect) XD (데피니언스 잉크)를 사용하여 정량적 이미지 분석을 전체 슬라이드-스캔 이미지에 수행하였다. 간 조직을 주변 유리 슬라이드로부터 구별하고 광학적 비정상 및 조직 결함을 단리하여 제거하기 위해 데피니언스 콤포저 (Composer) 기능이 사용되었다. 정체 PSR-염색된 면적 및 데스민 IHC 염색을 측정하였고 염색된 간 면적 전체의 퍼센트로 표현하였다.
qRT-PCR에 의한 유전자 발현
2 종의 표적 기관, 회장 및 간이 qRT-PCR에 의해 유전자 발현 분석을 받게 되었다. 25 mg의 간 냉동 조직으로부터 전체 RNA를 알엔에이졸(RNAzol) RT 시약 (시그마 알드리치, Cat No #R4533) 및 RNA 분리 키트 (퀴아젠(Qiagen), Cat No #74182)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 분리하였다. cDNA는 0.5 μg의 전체 RNA로부터 50 pmol의 랜덤 헥사머로 프라임한 수퍼스크립트(Superscript)IITM 역전사효소 (라이프 테크놀로지(Life Technologies), Cat No #18064-014)를 사용하여 합성하였다. 정량적 PCR을 수행하였고 앱솔루트 큐피씨알 록스 믹스 (Absolute QPCR Rox Mix (라이프 테크놀로지, Cat No # AB-1132))와 384-포맷 ABI 7900HT 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 사용하여 분석하였다. 간 조직에서 역방향 및 정방향 특이적 프라이머 및 프로브 (인터그레이티드 디엔에이 테크놀로지(Integraded DNA Technologies), 미국)를 Col1A1 및 TIMP1의 발현 분석을 위해 사용하였다.
간 히드록시프롤린 계수
간 히드록시프롤린은 존재하는 히드록시프롤린에 비례하여 비색 (560 nm) 생성물을 생성하는 산화된 히드록시프롤린과 4-(디메틸아미노)벤즈알데히드 (DMAB)의 반응에 의한 효소적 방법에 의하여 정량하였다. 급속 냉동된 간 샘플은 액체 질소하에 분말화하였고 이어서 물에서 균질화하고 (100 μl / 10 mg) 18 h 동안 120 ℃의 12 N HCl 용액에서 가수분해하였다. 가수분해가 완료된 후에, 샘플을 5 min 동안 13,000 g로 실온에서 원심분리하였고 이어서 96 웰 플레이트로 옮기고 60 ℃에서 건조하였다. 건조된 샘플은 100 μl 클로르아민-T로 산화하였고, 20 분 동안 실온에서 배양하였다. 100 μl의 신선하게-만든 DMAB 용액을 각 웰에 첨가하였고 샘플을 30 분간 배양하였다. 히드록시프롤린 함량은 560 nm에서 흡광도 측정하여 광도 측정으로 결정하였다. 표준 곡선은 각 샘플의 히드록시프롤린 함량을 결정하기 위해 사용되었다.
결과
간 OHP 함량 및 PSR에 의한 콜라겐의 정량적 형태측정 분석
CDHFD/NaNO2의 12 주 후에 간 콜라겐 함량을 시각화하기 위해 조직학적 간 절편을 피크로시리우스 레드 (PSR)로 염색하였다. PSR 염색은 형태측정 이미지 분석에 의하여 정량되었다. 데이터는 도 1에 보여진다. CDHFD/NaNO2 투여된 래트는 건강한 대조군 래트와 비교할 때 (건강한 대조군 래트에서 1.7 ± 0.3 %로부터 부형제-처치된 CDHFD/NaNO2 래트에서 8.5 ± 0.6 %로 증가된 PSR 면적, p < 0.001) 간 콜라겐의 5-배 증가를 가졌다. 식 (I)의 화합물로의 처치는 간 콜라겐을 27 % 감소시켰다 (PSR 면적은 부형제-처치된 CDHFD/NaNO2 래트에서 8.5 ± 0.6 %로부터 6.2 ± 1.1 %로 감소하였음, p < 0.05). 식 (III)의 화합물로의 처치는 간 콜라겐을 22 % 감소시켰다 (PSR 면적은 부형제-처치된 CDHFD/NaNO2 래트에서 8.5 ± 0.6 %로부터 6.6 ± 0.9 %로 감소하였음, p < 0.05). 식 (I)의 화합물과 식 (III)의 화합물의 병용으로 처치는 콜라겐을 54 % 감소시켰다 (PSR 면적은 부형제-처치된 CDHFD/NaNO2 래트에서 8.5 ± 0.6 %로부터 3.9 ± 0.6 %로 감소하였음, p < 0.001). 간 콜라겐을 감소시키는 식 (I)의 화합물과 식 (III)의 화합물의 병용 처치의 효과는 단독 투여된 각각의 약제보다 유의하게 더 양호하였다 (p < 0.05).
간 섬유화의 생화학적 평가는 간 히드록시프롤린 함량을 측정하여 수행되었다.
데이터는 도 2에 보여진다. CDHFD/NaNO2를 투여한 래트는 건강한 대조군 래트와 비교할 때 간 히드록시프롤린 함량이 1.6-배 증가하였다 (간 히드록시프롤린이 건강한 대조군 래트에서 4.0 ± 0.3 μmol/g로부터 부형제-처치된 CDHFD/NaNO2 래트에서 6.5 ± 0.5 μmol/g로 증가하였음, p < 0.001). 단독 약제로서 투여된 식 (I)의 화합물 또는 식 (III)의 화합물로의 처치는, 간 히드록시프롤린 함량을 유의하게 감소시키지 않았다. 식 (I)의 화합물 및 식 (III)의 화합물의 병용 처치는, 간 히드록시프롤린을 33 % 감소시켰다 (간 히드록시프롤린 함량이 부형제-처치된 CDHFD/NaNO2 래트에서 6.5 ± 0.5 μmol/g로부터 4.4 ± 0.5 μmol/g로 감소하였음, p < 0.01). 식 (I)의 화합물과 식 (III)의 화합물의 병용 처치의 간 히드록시프롤린을 감소시키는 효과는 단독 투여된 식 (III)의 화합물 (p < 0.05 vs. 식 (III)의 화합물 단독) 보다 유의하게 더 우수하였다.
근섬유아세포 마커 데스민의 정량적 IHC
조직학적인 간 절편이 데스민, 활성화된 근섬유아세포의 마커에 대해 염색되었다. 데이터는 도 3에 보여진다. 데스민 염색은 형태측정 이미지 분석에 의하여 정량되고 데스민 마커 면적%로 표현되었다. CDHFD/NaNO2 투여된 래트는 건강한 대조군 래트와 비교하였을 때 간에서 데스민 염색이 15-배 증가하였다 (간 데스민 마커 면적%가 건강한 대조군 래트에서 0.7 ± 0.1 %로부터 부형제-처치된 CDHFD/NaNO2 래트에서 10.3 ± 0.8 %로 증가하였음, p < 0.001). 식 (I)의 화합물로의 처치는 간 데스민 염색을 46 % 감소시켰다 (간 데스민 마커 면적%가 부형제-처치된 CDHFD/NaNO2 래트에서 10.3 ± 0.8 %로부터 5.6 ± 0.7 %로 감소하였음, p < 0.001). 식 (III)의 화합물로의 처치는 간 데스민 염색을 43 % 감소시켰음 (간 데스민 마커 면적%가 부형제-처치된 CDHFD/NaNO2 래트에서 10.3 ± 0.8 %로부터 5.9 ± 0.7 %로 감소하였음, p < 0.001). 식 (I)의 화합물과 식 (III)의 화합물의 병용 처치는 간 데스민 염색을 39 % 감소시킨다 (간 데스민 마커 면적%가 부형제-처치된 CDHFD/NaNO2 래트에서 10.3 ± 0.8 %로부터 6.2 ± 1.0 %로 감소하였음, p < 0.001).
Col1a1 및 Timp1의 간 발현
시험 12 주 끝에 건강한 대조군 래트와 비교할 때 CDHFD/NaNO2 투여 후에 간 섬유화 유전자 Col1a1 및 TIMP-1의 간 발현이 각각 40-배 및 13-배 증가하였다 (p < 0.001). Col1a1에 대한 데이터는 도 4에 보여지고, TIMP-1에 대한 데이터는 도 5에 보여진다. 식 (I)의 화합물로의 처치는 CDHFD/NaNO2에 의해 유도된 Col1a1을 65 % 감소시키고 (p < 0.01 vs. 부형제) TIMP-1을 28 % 감소시켰다 (p < 0.05 vs. 부형제). 식 (III)의 화합물로의 처치는 CDHFD/NaNO2에 의해 유도된 간의 Col1a1 발현을 44 % 감소시켰으나 (p < 0.05 vs. 부형제) TIMP-1는 유의하게 감소시키지 않았다. 식 (I)의 화합물 및 식 (III)의 화합물의 병용 처치는 CDHFD/NaNO2에 의해 유도된 간의 Col1a1 발현을 80 % 감소시켰다 (p < 0.001 vs. 부형제). 식 (I)의 화합물 및 식 (III)의 화합물의 병용 처치의 Col1a1 유전자 발현을 감소시키는 효과는 단독 투여된 식 (I)의 화합물 또는 식 (III)의 화합물에 비하여 통계적으로 유의하게 더 우수하다 (p < 0.05 vs. 부형제). 식 (I)의 화합물 및 식 (III)의 화합물의 병용 처치의 TIMP-1 유전자 발현을 감소시키는 효과는 식 (I)의 화합물 단독 처치에 의해 관찰된 감소와 비교할 때 통계적으로 유의하게 상이하지 않았다.
요약하면, 이 시험의 데이터는 ASK1 저해제 및 FXR 효능제의 병용 처치가 NASH의 설치류 모델에서 단독 투여된 각각의 약제보다 더 우수한 항-섬유증 효능을 야기하였다는 것을 입증한다.
실시예 2. NASH의 마우스 모델에서 효능
하기의 시험은 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 마우스 모델에서, ASK1 저해제 및 FXR 효능제의 병용의 효능을 모델에서의 각각의 약제 단독 효능과 대비하여 평가하기 위해 수행하였다. NASH는 수컷 C57BL/6 마우스에서 총 10 개월 동안 포화 지방, 콜레스테롤 및 당이 높은 “패스트 푸드” 식이 (FFD)의 만성 투여에 의해서 유발되었고, 반면에 마른 대조군(lean control) 동물은 보통 사료 식이로 유지하였다. 비만, 고콜레스테롤증 및 AST/ALT 상승 및 NASH의 조직학적 특징 예를 들면 간세포의 거대공포성 지방증 및 풍선 퇴화를 특징으로 하는 NASH 표현형이 대조군 마우스에 대비하여 7 개월차에 FFD 마우스에서 설립되었다. 문헌[Charlton M, et al. Fast food diet mouse: novel small animal model of NASH with ballooning, progressive fibrosis, and high physiological fidelity to the human condition. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology 2011; 301 (5):G825-34] 참조.
7 개월 후, FFD 마우스에 위약 (부형제), ASK1 저해제 (식 (I)), FXR 효능제 (식 (III)), 또는 식 (I) 및 식 (III)의 병용으로 3 개월 동안 처치하였다. 대조군 마우스는 전체 10 개월 시험 기간 동안 보통 사료 식이를 유지하였다. 평가변수 분석은 간 지방증의 형태측정 정량 (지방증 면적%), 간 콜레스테롤 함량, 혈청 ALT/AST 수치, 혈청 담즙산 수치, 및 유전자 발현의 나노스트링 평가를 포함하였다.
방법
동물
수컷, C57BL/6 마우스 (시험 시작시 12 주령)가 시험에 사용되었다. 모든 동물은 표준 사육장 조건하에 사육하였고 시험 시작 전에 7 일 동안 순응하도록 하였다.
FFD 마우스 모델에 대한 생애 실험 프로토콜
실험 디자인은 표 2에 보여진다. 패스트-푸드 식이 (FFD)를 나타내기 위해 동물에 상업적으로 이용가능한 고지방 및 고콜레스테롤 식이 (D12079B; 리서치 다이어츠 잉크, 뉴 브런즈윅, 뉴저지) 및 1000 mL의 수돗물 당 23.1 g의 과당 (시그마, F2543) 및 17.2 g의 포도당 (시그마, 49158)을 함유하는 음용수를 총 10 개월 동안 투여하였다. 모든 시험 마우스는 하나씩 케이지에 넣었다 (1 마리 마우스/케이지). 식 (I)의 화합물 또는 식 (III)의 화합물의 단독으로, 또는 식 (I) 및 식 (III)의 화합물을 병용으로 처치를 시험의 마지막 3 개월 동안 투여하였다 (7 개월차 - 10 개월차). 분리된 군의 연령을 맞춘 마우스는 보통 대조군을 나타내기 위해 전체 시험 기간 동안 표준 설치류 사료를 받았다 (테클라드 다이어트(Teklad Diet) TD2014, 인디애나폴리스, 인디애나).
FFD 식이에 0.15 %로 혼합하여 식 (I)의 화합물을 투여하였고 (군 당 n=x), 식 (III)의 화합물을 경구 가비지를 통해 1 일 1 회 투여하였다 (10 mg/kg, PO, QD). 식 (III)의 화합물의 투여를 위한 부형제는 나트륨 CMC, 1 % w/w 에탄올, 98.5 % w/w 50 mM 트리스 버퍼, pH 8로 구성되었다. 부형제 대조군 동물에는 약물의 첨가없이 동일한 부형제를 투여하였다.
표 2. 실험 디자인 및 용량군
Figure pct00006
간 지방증의 측정
헤마톡실린 & 에오신 (H&E) 및 피크로시리우스 레드 (PSR) 염색된 슬라이드의 전체 슬라이드-스캔 이미지를 40X 배율로 레이카 SCN400 스캐너를 사용하여 캡쳐하였다. 디지털 슬라이드 이미지는 스캐닝 품질이 체크되고, 주석이 첨부되어 레이카 디지털 이미지 허브 아카이브 안의 적절한 네트워크 폴더에 내보내졌다. 데피니언스 디벨로퍼 (developer) 소프트웨어 패키지를 사용하여 지방증의 정도를 H&E 염색된 조직 절편에서 결정하였다. 광학적 비정상 및 손상된 조직 면적을 배제하면서, 전체 조직 횡단면 면적의 적절한 측정을 위한 분석 파라미터가 허용되었다. 간 실질의 지방증 지방 공포를 낮은 광밀도의 면적 (흰색)으로서 관찰할 수 있었다. 이들 면적의 수 및 크기를 계수하였고 전체 지방증 면적을 전체 간 조직 횡단면 면적의 퍼센트로 나타내었다. 간내 혈관 (예를 들면 문맥 및 중심 정맥의 분지)을 혈관 크기 및 치수에 기반한 이 분석으로 배제하였다. 결과의 정확도를 결정하기 위해 자동화된 분석의 결과를 수작업으로 검토하였다. 샘플 미리 결정된 QC 기준 (부정확한 조직의 식별 및 부정확한 지방증 면적의 식별)에 미달한 샘플은 보고에서 배제되었다.
전체 간 콜레스테롤의 결정
조직 샘플 (25 ± 5 mg, 냉동된 상태에서 칭량함)을 균질화하였고, 유기 층으로 유리 및 에스테르화된 콜레스테롤 분획을 추출하는, 물과 섞이지 않는 유기 용매 혼합물로 추출하였다. 원심분리 후, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스테르를 함유하는 유기 상층 분액을 분석하였다.
내부 표준 용액 (콜레스테롤-d6) 및 1 M 에탄올성 칼륨 히드록시드 용액을 적절한 샘플 희석의 분액에 첨가하였다. 혼합물을 70 ℃에서 1 시간 동안 콜레스테롤 에스테르를 유리 지방산 및 콜레스테롤로 가수분해하기 위해 배양하였다. 이후에, 반응 혼합물을 빙초산으로 산성화하였고 헥산으로 추출하였다. 헥산 층을 제거하고, 증발시키고 아세토니트릴에서 재구성하였다. 이어서, 재구성된 추출물의 분획을 C18 역상 컬럼을 장착한 워터스 액퀴티 (Waters Acquity)/AB 사이엑스 큐트랩 (Sciex QTrap) 4000 LC MS/MS 시스템에 주입하였다. m/z 369 [M-H2O]+→161+의 콜레스테롤의 생성물 이온의 피크 면적을 m/z 375 [M-H2O]+→167+의 콜레스테롤-D6 생성물 이온의 피크 면적에 대하여 측정하였다. 참고 표준으로 콜레스테릴 올레에이트를 사용한 강화된 검량 표준으로 생성한 가중된 (1/x) 선형 최소 자승 회귀 분석을 사용하여 정량화를 수행하였다. 검량 표준 샘플은 조직 샘플과 동일한 추출 및 가수분해 단계를 거쳤다. 초기 데이터 (Raw data)를 수집하였고 AB 사이엑스 소프트웨어 애널리스트(Analyst) 1.5.1을 사용하여 가공하였다. 데이터 정리, 가중 보정, 콜레스테릴 올레에이트의 콜레스테롤로의 가수분해에 대한 보정 및 농도 검량을 마이크로소프트 엑셀 (Microsoft Excel) 2013을 사용하여 수행하였다. 최종 조직 함량은 전체 콜레스테롤의 mg / 간 조직의 g으로 얻는다.
담즙산의 측정
혈장 샘플을 일차 및 이차 담즙산 및 그들의 접합체를 LC-MS/MS로 정량하기 위해 메타볼론 잉크 (Metabolon, Inc. (더럼, 노스캐롤라이나))로 보냈다.
유전자 발현
RNA 분리, 역전사 및 qPCR DC3 테라퓨틱스 (Therapeutics) (사우스 샌 프란시스코)에서 수행하였다. 간은 프리셀리스(Precellys) 24 호모게나이저를 제조사의 설명에 따라 사용하여 균질화하였다. RNA는 E.Z.N.A. HP 전체 RNA 키트 (오메가 바이오텍 (Omega Biotek) #R6812)와 DNase I 다이제션 세트 (Digestion Set) (오메가 바이오텍 #E1091)를 제조사의 설명에 따라 사용하여 분리하였다. 나노스트링 엔카운터 엑스티 리포터 코드셋 (Nanostring nCounter XT Reporter CodeSet) 및 캡처 프로브셋 (Capture ProbeSet)을 실온에서 녹이도록 하였다. 마스터 믹스는 70 μL의 혼성화 버퍼를 리포터 코드셋 (Reporter CodeSet) 튜브에 첨가하여 만들었다. 이어서 8 μL의 마스터 믹스를 각각의 12 혼성화 스트립 튜브에 첨가하였다. 5 μL의 RNA를 각각 튜브에 첨가하고 이후에 2 μL의 캡쳐 프로브셋을 첨가하였다. 튜브는 이어서 예비-가열된 65 ℃의 서말 사이클러 (베리티 (Veriti), 어플라이드 바이오시스템즈) 16 시간 동안에 놓았다. 혼성화 스트립 튜브는 이어서 시약 및 샘플 가공을 위한 엔카운터 마스터 키트 (Master Kit)로부터의 소모품과 함께 엔카운터 프렙 스테이션 (Prep Station) (나노스트링 테크놀로지 잉크 (Technologies, Inc.) Cat # NCT-PREP-120) 에 놓았고 데이터 취득을 위해 디지털 아날라이저 (Digital Analyzer) (나노스트링 테크놀로지 잉크, Cat # NCT-DIGA-120)에 놓았다. 데이터는 엔솔버(nSolver) 분석 소프트웨어 (나노스트링)를 사용하여 분석하였고, 배수 변화로 나타내었다.
결과
H&E 염색된 간 절편의 정량화는 식 (I)의 화합물, 식 (III)의 화합물, 및 식 (I) 및 식 (III)의 화합물의 병용이 각각 39 %, 27 %, 및 75 %의 지방증 감소를 야기하였다는 것을 입증하였다 (도 6). 그 외에, 간 콜레스테롤 함량이 식 (I)의 화합물, 식 (III)의 화합물, 및 식 (I) 및 식 (III)의 화합물의 병용, 각각에 대해 74 %, 36 % 및 88 % 감소되었다 (도 7). 식 (I) 및 식 (III)의 화합물의 병용으로의 처치는 각각 약제 단독으로 처치한 것에 대비하여 통계적으로 더 우수한 공포 면적 및 간 콜레스테롤 함량의 감소를 야기하였다.
혈장 담즙산의 수치는 대조군 FFD 마우스에서 유의하게 상승하였다. 식 (I)의 화합물, 식 (III)의 화합물, 및 식 (I) 및 식 (III)의 화합물의 병용의 투여는 각각 52 %, 46, 및 82 % 만큼 혈장 담즙산 수치의 감소를 야기하였다 (도 8). 식 (I) 및 식 (III)의 화합물의 병용으로의 처치는 담즙산 수치에서 가장 우수한 감소를 야기하였다. 그 외에, 염증성 유전자 IL1-β의 간 발현이 식 (I) 및 식 (III)의 화합물의 병용으로의 처치에서 유의하게 감소하였다 (도 9).
요약하면, 이 시험으로부터 데이터는 ASK1 저해제 및 FXR 효능제로의 병용 처치가 NASH의 설치류 모델에서 단독 투여된 각각 약제에 비해 보다 더 우수한 항-지방증 효능을 야기한다는 것을 입증한다.

Claims (12)

  1. ASK1 저해제가 하기 식 (I)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00007
    (I)이고;
    FXR 효능제가 하기 식 (III)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00008
    (III)
    인, 치료 유효량의 ASK1 저해제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 병용하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 간 질환을 치료하고/거나 예방하는 방법.
  2. ASK1 저해제가 하기 식 (I)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00009
    (I)이고;
    FXR 효능제가 하기 식 (IV)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00010
    (IV)
    인, 치료 유효량의 ASK1 저해제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 병용하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 간 질환을 치료하고/거나 예방하는 방법.
  3. ASK1 저해제가 하기 식 (II)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00011
    (II)이고;
    FXR 효능제가 하기 식 (III)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00012
    (III)
    인, 치료 유효량의 ASK1 저해제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 병용하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 간 질환을 치료하고/거나 예방하는 방법.
  4. ASK1 저해제가 하기 식 (II)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00013
    (II)이고;
    FXR 효능제가 하기 식 (IV)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00014
    (IV)
    인, 치료 유효량의 ASK1 저해제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 병용하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 간 질환을 치료하고/거나 예방하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ASK1 저해제 및 FXR 효능제를 함께 투여하는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ASK1 저해제 및 FXR 효능제를 별도로 투여하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 간 질환은 비-알콜성 지방간염 (NASH)인 방법.
  8. ASK1 저해제가 하기 식 (I)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00015
    (I)이고;
    FXR 효능제가 하기 식 (III)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00016
    (III)
    인, 치료 유효량의 ASK1 저해제 및 치료 유효량의 FXR 효능제를 포함하는 제약 조성물.
  9. ASK1 저해제가 하기 식 (I)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00017
    (I)이고;
    FXR 효능제가 하기 식 (IV)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00018
    (IV)
    인, 치료 유효량의 ASK1 저해제 및 치료 유효량의 FXR 효능제를 포함하는 제약 조성물.
  10. ASK1 저해제가 하기 식 (II)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00019
    (II)이고;
    FXR 효능제가 하기 식 (III)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00020
    (III)
    인, 치료 유효량의 ASK1 저해제 및 치료 유효량의 FXR 효능제를 포함하는 제약 조성물.
  11. ASK1 저해제가 하기 식 (II)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00021
    (II)이고;
    FXR 효능제가 하기 식 (IV)의 화합물 또는 이의 제약적으로 허용되는 염:
    Figure pct00022
    (IV)
    인, 치료 유효량의 ASK1 저해제 및 치료 유효량의 FXR 효능제를 포함하는 제약 조성물.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 제약적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.

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