KR20190059536A

KR20190059536A - 활성형 진노세사이드 함유 아로니아 음료조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20190059536A
Application number: KR1020170157225A
Authority: KR
Inventors: 조계만; 김수철; 황정은
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단; 지리산마천농업협동조합
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2037-11-23
Also published as: KR102007576B1

Abstract

본 발명에는 활성형 진세노사이드인 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2을 함유하고 생리활성성분인 페놀산 및 플라보놀이 증진된 아로니아 음료조성물 및 그 제조방법이 개시된다. 본 발명에 따른 아로니아 음료는 활성형 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2 및 컴파운드 케이를 함유하고 페놀산 및 플라보놀이 증진되고, 더불어 우수한 알파-글루코시다제 저해활성과 췌장 리파제 저해활성도 가져서 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성이 증진되어 기능성 식품의약품의 소재로 사용될 수 있다.

Description

활성형 진노세사이드 함유 아로니아 음료조성물 및 그 제조방법{Beverage composition of Aronia melanocarpa containing active ginsenosides and preparation method thereof}

본 발명은 활성형 진노세사이드 함유 아로니아 음료조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 산양삼 전초를 이용하고 특정조건의 고온숙성을 거쳐서 제조된 활성산양삼 농축액을 포함하여, 활성형 진세노사이드인 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2 및 컴파운드 케이를 함유하고 생리활성성분인 페놀산 및 플라보놀이 증진된 아로니아 음료조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

고려인삼의 속명인 Panax는 그리스어의 Pan(모든)과 Akok(치료하다)의 복합어로서 '모든 병을 치료한다'라는 의미로 예로부터 식약용으로 가장 널리 이용되고 있는 약용작물이다. 인삼은 약 60％의 탄수화물, 8~15％의 조단백질, 1~3％의 조지방, 4~6％의 회분, 3~7％의 조사포닌, 그 외 미량성분들로 구성되어 있다. 인삼은 중추신계를 비롯하여 내분비계, 면역계, 대사계 등에 영향을 미쳐 신체기능 조절에 다양한 약리효과를 나타낸다고 보고되어 있으며, 이와 같은 약리효과는 특히 활성 진세노사이드의 기인에 기인하는 것으로 알려져 있다.

활성형 진세노사이드는 인체 장내에서 흡수가 용이한 진세노사이드로서 진세노사이드 Rg1, Rg3, Rd, Rf, Rh, F2, 컴파운드 케이(compound K) 등이 있다. 진세노사이드 Rg1은 학습기능 개선, 항피로 작용, 진세노사이드 Rf는 뇌신경세포 진통작용, 지질과산화 억제작용, 진세노사이드 Rg3는 암세포 전이억제, 간보호 작용, 항암제 내성억제 작용, 진세노사이드 Rd는 부신피질 호르몬 분비 촉진 작용, 진세노사이드 컴파운드 케이는 항암작용, 간보호 작용, 피부보호 작용, 종양증식억제 작용, 항산화 작용, 항알레르기 작용이 밝혀져 있다. 특히, 진세노사이드 컴파운드 케이 (20-O-beta-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)는 진세노사이드 대사체로서 특히 체내 흡수율이 탁월하고 약리학적 활성도 우수한 것으로 알려져 있으며, 최근에는 황반변성질환 치료, 신경변증성 통증 치료도 보고되고 있다 (등록특허 10-1539573).

삼에 대한 선호도가 인삼에서 홍삼으로 그리고 최근에는 무농약 산양삼(야생삼)으로 변화하고 있어 산양삼을 이용한 기능성식품의 요구가 급증하고 있는 실정이다.

아로니아 (블랙쵸크베리; Aronia melanocarpa)는 장미과에 속하는 베리류로 북미의 동부 아메리카 지역에서 자생하는 최근 몇 년 사이에 우리나라에서도 전국적으로 지배되고 있으며, 그 생산량이 증가하고 있다. 아로니아의 성분에 관한 연구는 폴란드의 바르샤바대학을 중심으로 지속적으로 연구되었으며, 최근에 국내에서 많은 연구결과들을 발표하고 있다.

아로니아에는 비타민 A, C, E, B2, B6, B9, B12, 엽산(folic acid), 퀴닌산(quinic acid), 페놀산(phenolicacids), 안토시아닌(anthocyanin), 타닌(tannin), 카테킨(catechins), 쿼르시틴(quercitin), 루테인 & 제아잔틴 (lutein & zeaxanthin), 루틴(rutin), 헤스페리딘(hesperidin), 레스베라트롤 (resveratrol), 베타카로틴(beta-carotene)을 비롯해 칼슘, 철분, 마그네슘, 아연, 칼륨, 망간과 같은 다양한 유기미네랄이 포함되어 있고 특히 강력한 항산화물질인 안토시아닌과 폴리페놀의 함량은 베리류의 과일 중 가장 높다고 알려져 있다. 아로니아는 항산화 효능뿐만 아니라 심혈관질환, 암, 당뇨, 위염 및 알러지성 피부질환 등의 개선에 효과가 있는 것으로 알려져 최근 아로니아를 음료의 원재료로 많이 활용하고 있는 추세이다. 그 일례로 아로니아에 포도나 배와 같은 당도가 높은 과일과의 혼합하여 제조한 아로니아 음료의 제조에 관한 기술들이 개발된 바 있다 (공개특허 제10-2017-0093087호, 등록특허 제10-1772014호).

그러나 활성형 진세노사이드가 함유된 아로니아 음료조성물 및 그 제조방법에 대해서는 알려진 바는 없다.

이에 본 발명자들은 종래 기술의 요구에 부응하기 위한 연구를 지속한 결과, 산양삼 전초를 이용하고 특정조건의 고온숙성을 거쳐서 제조된 활성산양삼 농축액을 아로니아 과즙에 첨가하여 제조한 아로니아 음료가 활성형 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2 및 컴파운드 케이를 함유하고, 생리활성성분인 페놀산 및 플라보놀이 상당히 증진됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 활성형 진세노사이드를 함유하는 아로니아 음료조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조되고, 활성형 진세노사이드를 함유하고 페놀산 및 플라보놀이 증진된 아로니아 음료조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아로니아 음료조성물을 포함하여 증진된 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는 기능성식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기와 같은 단계들을 포함하는 활성형 진세노사이드를 함유하는 아로니아 음료조성물의 제조방법을 제공한다:

ⅰ) 산양삼 전초를 100℃에서 30~60분간 증숙하고 70~90℃에서 2~3일간 고온숙성을 3~5회 반복하여 활성산양삼을 제조하는 단계;

ⅱ) 활성산양삼을 분말화하고 정제수를 첨가하여 추출하는 단계;

ⅲ) 활성산양삼 추출물을 여과하고 15~25 브릭스로 농축하는 단계;

ⅳ) 아로니아 과즙 100 중량부(v/v)에 활성산양삼 농축액을 2~10 중량부를 혼합하는 단계; 및

ⅴ) 혼합액에 부재료 첨가하여 음료를 제조하는 단계.

필요에 따라서, 본 발명의 제조방법은, ⅵ) 음료를 살균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 ‘산양삼’은 산지에서 차광막 등 인공시설을 설치하지 아니하고 무농약으로 재배되는 삼을 의미한다.

본 발명에서 '전초(全草)'는 삼의 뿌리, 줄기 및 잎을 포함한 전체를 의미한다.

단계 ⅰ): 활성산양삼 제조

산양삼 전초를 100℃에서 30~60분간 증숙하고 70~90℃에서 2~3일간 고온숙성을 3~5회 반복하여 활성산양삼을 제조한다.

산양삼 전초를 증숙(steaming process)한다. 본 발명에서 산양삼은 3년근 이상을 사용한다. 산양삼을 흐르는 물에 3회 세척하고 물기를 제거한 후 증숙한다. 증숙은 통상의 찜기와 같은 증숙기를 사용하여 수행할 수 있다. 증숙 시간이 30분 미만인 경우 충분한 증숙이 진행되지 않아 숙성과 같은 후속 단계가 원활하지 않을 수 있고 잡균의 오염이 발생될 수 있으며, 60분 초과하여 증숙될 경우는 오랜 열처리로 산양삼 전초의 생리활성성분이 파괴될 수 있으며 특히 잎과 줄기의 생리활성성분이 과다하게 파괴될 수 있다.

고온 숙성은 숙성 온도가 70℃ 미만이거나 숙성기간이 2일 미만이거나 숙성 횟수가 3회 미만인 경우 숙성이 원활히 이루어지지 않으며, 숙성온도가 90℃ 초과거나 숙성기간이 3일 초과거나 숙성 횟수가 5회 초과인 경우 생성된 생리활성물질이 분해되어 함량이 감소될 수 있다.

상기와 같이 제조된 활성산양삼은 산양삼 특유의 삽싸래한 맛이 저감되어 기호성이 향상되면서도 활성형 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2 및 컴파운드 케이의 함량이 현저히 증진된다 (표 1).

단계 ⅱ): 활성산양삼 추출

활성산양삼을 분말화하고 정제수를 첨가하여 추출한다.

분말화는 활성산양삼은 50∼55℃에서 2~3일 건조하여 100메쉬 이하로 분쇄하여 수행한다.

추출은 활성산양삼 분말에 15~25배 부피(v/w)의 정제수를 가하여 95∼100℃에서 4∼6시간 추출하는 과정을 2~3회 반복하여 추출하여 활성산양삼 추출물을 제조한다.

단계 ⅲ): 활성산양삼 농축액 제조

활성산양삼 추출물을 여과하고 15~25 브릭스로 농축한다.

여과는 9 mm 여과지에 여과하는데, 활성산양삼 분말을 건더기를 제거하여 추출 후 일정한 품질의 활성산양삼 농축액을 제조하기 위함이다.

여과액을 70∼100℃로 가열하여 가용성 고형분이 15~25 브릭스(brix)가 되도록 농축하여 활성산양삼 농축액을 제조한다.

단계 ⅳ) 아로니아 과즙과 활성산양삼 농축액 혼합

아로니아 과즙 100 중량부에 활성산양삼 농축액을 2~10 중량부를 혼합한다.

아로니아 과즙은 1~2배(v/w)의 정제수를 첨가하여 믹서기로 파쇄한 후 여과한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

정제수는 아로니아의 떫은맛을 상쇄시키고, 아로나아 과즙 수득율이 높이기 위해 필요에 따라 첨가한다.

아로니아 과즙 100 중량부에 활성산양삼 농축액을 2~10 중량부를 혼합하는 것이 바람직한데, 2 중량부 미만인 경우인 활성산양삼 유래 활성형 진세노사이드 함량이 충분하지 않을 수 있고, 10 중량부 초과인 경우 원료단가의 상승과 삼 특유 맛과 향이 지나치게 진하여 기호성이 나빠질 수 있다.

단계 ⅴ): 음료 제조

단계 ⅳ)로부터의 혼합액에 부재료 첨가하여 음료를 제조한다.

딸기, 사과, 배 등의 과일 농축액, 벌꿀, 구연산, 타우린 등의 부재료를 첨가하여 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물을 완성한다.

부재료의 첨가량은 당업자가 기호에 따라 적절하게 정할 수 있으며, 바람직하게는 혼합액의 2 ~ 5 %(v/v) 이다.

단계 ⅵ): 살균

활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물을 살균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

살균은 과즙 음료에 사용되는 통상의 방식으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 90 ~ 115℃에서 1 ~ 5분간 살균한다.

살균은 음료를 용기에 충전한 채, 또는 충전하기 전에 행해질 수 있다. 용기로는 통상의 음료 용기인 유리 용기, PET 용기, 파우치 용기, 도자기 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 아로니아 음료조성물은 활성형 진세노사이드 화합물인 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2 및 컴파운드 케이를 함유하고, 페놀산 및 플라보놀이 증진되어, 우수한 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는다 (표 3~ 표 5, 도 3a ~ 5b).

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된, 활성형 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2 및 컴파운드 케이를 함유하고 페놀산 및 플라보놀이 증진된 아로니아 음료조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아로니아 음료조성물을 포함하여 증진된 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는 기능성식품(음료 등)을 제공하는 것이다.

본 발명의 제조방법은 활성형 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2 및 컴파운드 케이를 함유하고, 페놀산 및 플라보놀이 증진된 아로니아 음료조성물을 생산케 한다.

본 발명에 따른 아로니아 음료는 활성형 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2 및 컴파운드 케이를 함유하고 페놀산 및 플라보놀이 증진되고, 더불어 우수한 알파-글루코시다제 저해활성과 췌장 리파제 저해활성도 가져서 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성이 증진되어 기능성식품의 소재로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 기능성식품은 우수한 항당뇨 및 항비만 기능성을 가져서, 지방생성 억제효과, 체중 조절, 콜레스테롤 저하, 고지혈증 개선, 동맥경화 완화, 당뇨병 완화, 혈액순환 개선, 면역력 개선용으로 유용하다.

도 1은 본 발명에 따른 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물의 제조공정의 일례를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물의 진세노사이드 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물의 생리활성물질 함량을 나타낸 것이다. 도 3a는 총 페놀릭스 함량을 나타낸 것이며, 도 3b는 총 플라보노이드 함량을 나타낸 것이며, 도 3c는 총 안토시안 함량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물의 항산화 활성을 나타낸 것이다. 도 4a는 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 4b는 ABTS 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 4c는 하이드록실 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 4d는 FRAP 환원력을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물의 소화효소 저해활성을 나타낸 것이다. 도 5a는 알파-글루코시다아제 저해활성을 나타낸 것이며, 도 5b는 췌장-리파아제 저해활성을 나타낸 것이다.

다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.

제조예 1. 활성산양삼 농축액 제조

함양군 서상면 일대 해발 500 m 이상에서 재배된 3년근 이상 산양삼을 구입하여 사용하였다. 산양삼 전초 10 kg을 흐르는 물에 3회 세척하고 완전히 물기를 제거한 후 찜기에 담았다. 그리고 나서 100℃에서 30분간 증숙한 후 증숙된 산양삼을 건조 채반에 나란히 담은 후 75℃의 고온에서 수분이 증발되게 하여 2일간 숙성시키는 과정 (증숙 및 고온 숙성 과정)을 4회 반복하여 수행하여 활성산양삼을 제조한 후, 55℃에서 2일 건조시킨 후 분쇄기로 100메쉬 이하로 분쇄하여 분말화하였다 (활성산양삼 분말). 비교를 위하여 산양삼 전초를 55℃에서 2일 건조시킨 후 동일한 방식으로 분말화하였다 (산양삼 분말).

활성산양삼 분말 100 g에 정제수를 2 L를 첨가하고 100℃에서 5시간 추출하는 과정을 2회 반복하여 활성산양삼 추출물을 얻었다. 이 활성산양삼 추출물을 9 mm 여과필터를 사용하여 여과하여 얻은 여과액을 100℃ 열을 가하여 가용성 고형분이 20 브릭스(brix)되게 농축하여 활성산양삼 농축액을 제조하였다. 산양삼 분말도 동일하게 진행하여 농축액을 제조하였다.

<진세노사이드 함량 분석>

활성산양삼 농축액과 산양삼 농축액 각각 5 ml에 HPLC용 물을 동량으로 가한 후 0.45 ㎛ 여과필터로 여과한 분석시료를 사용하여 진세노사이드 화합물 함량을 분석/비교하였다.

진세노사이드 분석은 기능성식품분석법에 기술된 방법을 약간 변형하여 고압액체크로마토그래피(HPLC, high press liquid chromatograph)로 분석하였다. 분석 컬럼은 TSKgel ODS-100Z을 사용하여 시료주입량 10㎕, 온도는 30℃ 측정파장은 203 nm, 유속은 1.0 ml/min으로 하였고 이동상으로는 A용액은 HPLC water, B용액은 아세토니트릴을 사용하였다. HPLC 분석 조건은 이동상 용액은 0분때 A용액 81%:B용액 19%로 흘려주고 15분때에는 A용액 80%:B용액 20%로 흘려주고 40분때 A용액 77%:B용액 23%, 42분때 A용액 70%:B용액 30%, 75분때에 A용액 65%:B용액 35%, 80분때에 A용액 30%:B용액 70%, 90분때에 A용액 10%:B용액 90%로 이동상을 흘려주었다. 활성산양삼 농축액 및 산양삼 농축액의 각각의 진세노사이드 함량을 표 1에 나타내었다.

진세노사이드 함량¹⁾ (mg/g d.w.)	산양삼 농축액	활성산양삼 농축액
Ginsenoside Rg1	nd	0.04
Ginsenoside Re	nd	0.02
Ginsenoside Ro	1.44	1.46
Ginsenoside Rf	0.15	0.17
Ginsenoside F3	nd	0.08
Ginsenoside Rg2	0.42	0.52
Ginsenoside Rh1	0.48	0.55
Ginsenoside Rb1	0.46	0.52
Ginsenoside Rd	0.47	0.67
Ginsenoside Rd2	0.14	0.54
Ginsenoside F2	0.78	1.51
Ginsenoside Rg3	0.43	1.01
Ginsenoside Compound K	0.47	1.38
Ginsenoside Rh2	0.05	0.10
Total Ginsenoside	5.29	8.57
¹⁾모든 실험은 삼반복 수행하였다. ²⁾nd, 검출되지 않음.

표 1에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드는 각각 5.29 mg/g 8.57 mg/g로 본 발명에 따른 활성산양삼 농축액이 산양삼 농축액 보다 약 1.6배 높은 함량을 보였다. 특히 활성형 진세노사이드인 진세노사이드 Rd, Rd2, F2, Rg3 및 컴파운드 케이(compound K)는 약 2.9배 증진되었다.

제조예 2. 활성산양삼 함유 아로니아 음료 제조

함양군 서상면 일대에서 재배된 아로니아를 구입하여 사용하였다. 아로니아 10 kg을 흐르는 물에 3회 세척하고 완전히 물기를 제거한 후 동량의 정제수를 가한 후 믹서기를 이용하여 분쇄하고 여과하여 아로니아 과즙을 제조하였다.

아로니아 과즙 95 ml에 제조예 1에서 제조한 활성산양삼 농축액 2 ml과 그 외 부재료로서 딸기 농축액 1 ml, 벌꿀 1 ml, 구연산 0.5 g과 타우린 0.5 g을 혼합하고 용기에 담은 후 100℃에서 3분간 살균하여 아로니아 음료조성물(실시예)을 제조하였다.

산양삼 농축액을 첨가하여 상기와 동일한 방식으로 아로니아 음료(비교예)를 제조하였다.

<이화학적 특성 분석>

상기에서 제조된 각각의 음료의 pH는 pH 미터기를 사용하여 측정하였고 총산도는 중화적정법을 통해 수행하여 젖산으로 환산하였으며, 환원당은 Miller의 DNS법을 이용하여 포도당으로 환산하였고, 가용성 고형분은 굴절당도계를 사용하여 측정한 결과를 표 2에 나타내었다.

	비교예	실시예
pH	3.92	3.86
산도(%, 젖산기준)	1.14	1.26
환원당(mg/ml)	3.54	3.64
가용성 고형분(Brix)	18.0	21.1

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물은 비교예에 비하여 pH는 약간 감소하였고 총산도, 환원당 가용성 고형분은 약간 증가하였다. pH가 높을 경우에는 식품위해미생물 등의 증식이 가능하고, 너무 낮을 경우에는 과다 산이 생성되면 신맛이 강화하여 기호성에 문제가 발생할 수 있는데, 본 발명의 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물은 적당한 산과 당이 생성되어 신맛과 단맛이 적절히 이루어져 있다.

시험예 1. 아로니아 음료조성물의 활성형 진세노사이드 함량 분석

상기 제조예 2에서 제조된 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물에 대한 활성형 진세노사이드 함량을 분석하였다.

<분석시료 및 진세노사이드 화합물 분석>

제조예 2에서 제조된 각각의 아로니아 음료 (실시예, 비교예)를 3,000 rpm의 속도로 원심분리하여 상등액만을 취하여 0.45μm 필터로 여과하고 이 여과액을 시료로 사용하여 상기 제조예 1에 기술된 대로 진세노사이드 함량을 분석하였고, 각 HPLC 크로마토그램을 도 2에 나타내고, 활성형 진세노사이드 화합물의 함량을 표 3에 나타내었다.

진세노사이드 함량¹ ⁾ (mg/g d.w.)	비교예 (산양삼 함유 아로니아 음료)	실시예 (활성산양삼 함유 아로니아 음료)
Ginsenoside Rd	nd	0.04
Ginsenoside Rd2	nd	0.03
Ginsenoside F2	nd	0.10
Ginsenoside Rg3	nd	0.09
Ginsenoside Compound K	nd	0.09
총 Ginsenoside	0	0.35
¹⁾모든 실험은 삼반복 수행하였다. ²⁾nd, 검출되지 않음.

표 3과 도 2에 나타낸 바와 같이, 비교예의 산양삼 함유 아로니아 음료는 활성형 진세노사이드가 전혀 검출되지 않은 반면에, 본 발명에 따른 실시예의 활성산양삼 함유 아로니아 음료는 활성형 진세노사이드 Rd, Rd2, F2, Rg3 및 컴파운드 케이가 유의한 함량으로 함유됨이 확인되었다.

시험예 2. 아로니아 음료조성물의 생리활성물질 함량 분석

아로니아 음료조성물의 생리활성성분인 총 페놀릭스, 총 플라보노이드, 총 안토시안 함량을 분석하였다.

<총 페놀릭스 함량>

총 페놀릭스 함량은 Folin Denis법(1912)으로 측정하였다.

구체적으로는 시험예 1에서와 같이 준비된 각각의 여과액 시료를 시험관에 0.5 ml 분주한 후, 25% Na₂CO₃ 용액 0.5 ml를 첨가하여 3분간 정치시켰다. 다시 2N-Folin-Ciocalteu 페놀 시약 0.25 ml를 첨가하여 혼합한 다음 30℃에서 1시간 동안 정치시킨 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 페놀릭스 함량은 갈산을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하여 갈산(Gallic acid)에 상당하는 양으로 계산하였고 그 결과를 도 3a에 나타냈다.

<총 플라보노이드 함량>

총 플라보노이드 함량은 Davis 변법으로 측정하였다.

시험예 1에서와 같이 준비된 각각의 여과액 시료 0.1 ml에 1 N NaOH 0.01 ml를 첨가한 후 디에틸렌글리콜 1.0 ml를 첨가하여 37℃에서 1시간 방치 후 420 nm 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 루틴(rutin)의 최종 농도를 0, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml로 제조하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였고 그 결과는 도 3b에 나타내었다.

<총 안토시안 함량>

총 안토시안(anthocyanins)은 Francis(1989)가 제안한 방법으로 Lambert-Beer 법칙을 적용하여 정량하였다.

시험예 1에서와 같이 준비된 각각의 여과액 시료를 3차 증류수로 10배 희석하고, 원심분리한 후 상등액을 1 ml를 두께 10 mm quartz cell에 분주한 다음 분광광도계 530 nm에서 측정한 후 다음 식으로 안토시안 함량을 구하였고, 그 결과를 도 3c에 나타내었다:

총 안토시안 = 흡광도(OD530 nm) ÷98.2 (안토시안의 흡광계수)

도 3a ~ 도 3c에 나타낸 바와 같이, 비교예 아로니아 음료(산양삼 함유)에 비하여, 본 발명에 따른 실시예의 아로니아 음료(활성산양삼 함유)의 총 페놀릭스, 총 플라보노이드 및 총 안토시안 함량이 더 높았다 (각각 2.72, 13.66 및 2.87 mg/ml).

시험예 3. 아로니아 음료조성물의 페놀산 및 플라보놀 분석

아로니아 음료조성물의 페놀산 및 플라보놀을 분석하였다.

페놀산과 플라보놀 함량 분석은 시험예 1에서와 같이 준비된 각각의 여과액 시료에 대해 HPLC(high performance liquid chromatography)를 사용하여 분석하였다.

분석 컬럼은 XBridge^TM C18(4.6mm, 5 ㎛, Waters Corp., Milford, MA, USA) 컬럼을 사용하였고 0.5% 글라시알 아세트산 (glacial acetic acid, 이동상 용매 A)와 100% 메탄올(이동상 용매 B)을 0~100% 선형 구배(linear gradient)로 30℃에서 60분간 1분당 1 ml의 속도로 가동하면서 UV 검출기로 페놀산(280 nm)과 플라보놀(270 nm)을 검출하였고 결과는 표 4와 표 5에 나타내었다.

함량 (μg/ml)¹⁾	비교예 (산양삼 함유 아로니아 음료)	실시예 (활성산양삼 함유 아로니아 음료)
Gallic acid	10.39	11.37
Protocatechuic acid	nd	3.25
Chlorgenic acid	228.24	239.34
p-Hydrobenzoic acid	134.77	151.19
Vanillic acid	14.05	18.03
Ferulic acid	13.33	22.30
¹⁾모든 실험은 삼반복 수행하였음. ²⁾nd, 검출되지 않음.

표 4에 나타낸 바와 같이, 비교예에 비하여, 본 발명에 따른 아로니아 음료가 모든 페놀산의 함량이 높았고, 특히 프로토카테큐산은 새로이 생성되었다.

함량 (μg/ml)¹⁾	비교예 (산양삼 함유 아로니아 음료)	실시예 (활성산양삼 함유 아로니아 음료)
Epigallocatechin	228.51	231.96
Epicatechin	34.72	49.15
Rutin	79.14	89.55
Quercetin	123.44	149.16
Naringin	67.28	86.92
¹⁾모든 실험은 삼반복 수행하였음.

표 5에 나타낸 바와 같이, 비교예에 비하여, 본 발명에 따른 아로니아 음료가 모든 플라보놀의 함량이 높았고, 특히 에피카테킨, 쿼르세틴 등은 훨씬 증진되었다.

시험예 4. 아로니아 음료조성물의 항산화 활성 분석

본 발명에 따른 아로니아 음료조성물의 항산화 활성은 DPPH, ABTS, 하이드록실(

OH) 라디칼 소거활성 및 FRAP 환원력을 측정하여 분석하였다.

<분석시료>

시험예 1에서와 같이 준비된 각각의 여과액 시료의 원액(0배), 5배, 10배 부피(v/v)로 희석하여 제조한 분석시료를 사용하였다.

DPPH 라디칼 소거활성은 상기에서 준비된 분석시료 (각각의 원액, 5배 희석, 10배 희석의 농도 3가지) 0.2 ml에, DPPH 용액(1.5^-4M) 0.8 ml를 첨가하여 균일하게 혼합한 30분간 방치한 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 수행하였다. DPPH 라디칼 소거활성의 음성 대조구는 시료 대신 증류수를 사용하여 동일한 방법으로 진행하여 흡광도의 차이를 다음 식에 의해 백분율(%)로 산출하였으며, 그 결과를 도 4a에 도시하였다.

라디칼 소거활성(%) = [1-(음성대조구 흡광도 ÷실험구 흡광도)]

ABTS 라디칼 소거활성은 7 mM ABTS 시약 5 ml과 140 mM K₂S₂O₈ (FW 270.3, Sigma 9392) 5 ml을 섞어 어두운 곳에 16시간 방치시켜 양이온 라디칼을 생성시킨 후, 이를 메탄올로 섞어 732 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7가 되도록 조절한 ABTS 용액을 사용하였다. 상기에서 준비된 분석시료 (각각 원액, 5배 희석, 10배 희석의 농도 3가지) 0.1 ml과 ABTS 용액 0.9 ml를 혼합하여 3분간 반응시키고 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 저해활성 역시 음성 대조구는 시료 대신 증류수를 사용하여 동일한 방법으로 진행하여 흡광도의 차이를 상기 식에 의해 백분율(%)로 산출하였으며, 그 결과를 도 4b에 도시하였다.

<하이드록실(OH) 라디칼 소거활성>

하이드록실(OH) 라디칼 소거활성 측정은 10 mM FeSO₄ _.7H₂0-EDTA 0.2ml, 10 mM 2-데옥시리보스 0.2 ml, 10 mM H₂O₂ 0.2 ml, 상기에서 준비된 분석시료 (각각 원액, 5배 희석, 10배 희석의 농도 3가지) 1.4 ml 혼합한 뒤 37℃에서 4시간 동안 반응시켜 혼합액을 만든 후, 이 혼합액에 1% 티오바르비투르산(thiobarbituric acid)/증류수와 2.8% 트리클로로아세트산(trichloroaceric acid)/증류수를 각각 1 ml를 가하여 100℃에서 20분간 발색시켜 냉각시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 행하였다. 하이드록실 라디칼 소거활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 상기 식에 의해 % 값을 산출하였고, 그 결과를 도 4c에 나타냈다.

FRAP (Ferric reducing antioxidant power) 환원력 분석은 화합물의 환원력을 측정하는 방법으로 Fe3+를 Fe2+로 환원시키는 힘을 측정하는 방법이다. 구체적으로는 FeⅢ-TPTZ(ferric tripyridyl triazine)가 시료의 환원력에 의하여 푸른색의 FeⅡ-TPTZ(ferrous tripyridyl triazine)으로 환원될 때 흡광도를 측정하여 항산화성을 알아보는 것이다.

FRAP 환원력 분석에서 반응액으로는 30 mM 아세테이트 완충액(pH 3.6), 40 mM 염산에 녹인 10 mM 2,4,6-트리피리딜-s-트리아진(TPTZ, T1253, C18H12N6, MW312.33) 및 20mM FeCl3(F7134, MW 162.20, in DW)를 준비하였으며, 아세테이트 완충액, TPTZ 용액 및 FeCl3 용액을 10:1:1 (v/v/v)로 혼합하여 37℃에서 15분간 예비반응을 시켜두었다. 상기에서 준비된 시료(각각 원액, 5배 희석, 10배 희석의 농도 3가지) 50 ㎕와 FRAP 시약 950 ㎕를 시험관에 분주한 후 약 15분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더 (Biorad 3055, Sweden)를 사용하여 593 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 4d에 나타냈다.

도 4a ~ 도 4d에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예의 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물은, 비교예 (산양삼 함유 아로니아 음료)에 비하여, DPPH, ABTS, 하드록실 라디칼의 소거활성 및 FRAP 환원력이 상당히 증진되었고, 특히 낮은 농도에서 더 두드러졌다. 5배 희석 농도의 경우, DPPH 라디칼 소거활성은 비교예가 55.76%, 실시예가 65.33%이었고, ABTS 라디칼 소거활성은 비교예가 79.77%, 실시예가 96.44%였고, 하이드록실 라디칼 소거활성은 비교예가 32.19%, 실시예가 46.77%였고, FRAP 환원력은 비교예가 1.366, 실시예가 1.714였다.

시험예 5. 아로니아 음료조성물의 소화효소 저해활성 검정

본 발명에 따른 아로이나 음료조성물에 대해 항당뇨(당뇨 개선) 효과의 지표인 알파-글루코시다아제 저해활성을 검정하였고, 항비만(비만 개선) 지표인 췌장 리파아제 저해활성을 검정하였다.

<알파-글루코시다아제 저해활성>

알파-글루코시다아제 저해활성은 상기 시험예 4에서 준비된 분석시료 (각각 원액, 5배 희석, 10배 희석의 농도 3가지) 50 ㎕에 0.5 U/ml 알파-글루코시데이즈 효소액 50 ㎕를 첨가하고 200 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 50 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 예비 배양한 후, 인산나트륨 완충액(pH 6.8)을 100 ㎕ 첨가하여 37℃에서 10 분간 반응시켰다. 반응액에 100 mM Na₂CO₃ 0.75 ml를 첨가하여 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며 음성 대조구는 시료 대신 증류수를 사용하여 동일한 방법으로 진행하여 흡광도의 차이를 다음 식에 의해 백분율(%)로 산출하였으며, 그 결과를 도 5a에 도시하였다.

저해활성(%) = [1-(음성대조구 흡광도 ÷실험구 흡광도)] ×100

도 5a에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예의 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물은, 비교예 (산양삼 함유 아로니아 음료)에 비하여, 알파-글루코시다아제 저해활성이 현저히 증진되었고, 특히 5배 희석 농도의 경우 약1.4배 증진된 것을 확인할 수 있다.

<췌장-리파아제 저해활성>

췌장-리파아제 저해활성은 상기 시험예 4에서 준비된 분석시료(각각 원액, 5배 희석, 10배 희석의 농도 3가지) 50 ㎕, 1.0 U/ml 췌장 리파아제 효소액 50 ㎕, 200 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 50 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 예비 배양한 후, 인산나트륨 완충액(pH 6.8)을 100 ㎕ 가하여 37℃에서 10 분간 반응시켰다. 이 반응액에 100 mM Na₂CO₃ 0.75 ml를 첨가하여 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하고 음성 대조구는 증류수를 사용하여 동일한 방법으로 진행하여 흡광도의 차이를 상기 식에 의해 백분율(%)로 산출하였으며, 그 결과를 도 5b에 도시하였다.

도 5b에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예의 활성산양삼 함유 아로니아 음료조성물은, 비교예 (산양삼 함유 아로니아 음료)에 비하여, 췌장 리파아제 저해활성이 상당히 증진되었다 (원액의 경우 비교예는 38.57%, 실시예는 46.22%).

상기 기능성 검정 결과들로부터, 본 발명에 따른 활성산양삼 함유 아로니아 음료는 활성형 진세노사이드인 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2와 컴파운드 케이를 함유하고, 페놀산 및 플라보놀이 증진될 뿐만 아니라 항산화 활성, 알파-글루코시다제 저해활성과 췌장 리파제 저해활성도 증진되어 우수한 항산화, 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는 기능성 음료라는 것을 알 수 있다.

Claims

활성형 진세노사이드를 함유하는 아로니아 음료조성물의 제조방법으로, 상기 방법은
ⅰ) 산양삼 전초를 100℃에서 30~60분간 증숙하고 70~90℃에서 2~3일간 고온숙성을 3~5회 반복하여 활성산양삼을 제조하는 단계;
ⅱ) 활성산양삼을 분말화하고 정제수를 첨가하여 추출하는 단계;
ⅲ) 활성산양삼 추출물을 여과하고 15~25 브릭스로 농축하는 단계;
ⅳ) 아로니아 과즙 100 중량부에 활성산양삼 농축액을 2~10 중량부를 혼합하는 단계; 및
ⅴ) 혼합액에 부재료 첨가하여 음료를 제조하는 단계를 포함하고,
상기 활성형 진세노사이드는 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2 및 컴파운드 케이인 것인 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 부재료는 과일 농축액, 벌꿀, 구연산 및 타우린인 것을 특징으로 하는 활성형 진세노사이드를 함유하는 아로니아 음료조성물.
제 1항 또는 제 2항에 따른 방법에 의해 제조되고, 활성형 진세노사이드 Rd, Rd2, Rg3, F2 및 컴파운드 케이를 함유하고 페놀산 및 플라보놀이 증진된 아로니아 음료조성물.
제 3항에 따른 아로니아 음료조성물을 포함하고, 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는 음료.