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KR20190052890A - 콜레스테롤 유출능과 관련된 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

콜레스테롤 유출능과 관련된 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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KR20190052890A
KR20190052890A KR1020170148720A KR20170148720A KR20190052890A KR 20190052890 A KR20190052890 A KR 20190052890A KR 1020170148720 A KR1020170148720 A KR 1020170148720A KR 20170148720 A KR20170148720 A KR 20170148720A KR 20190052890 A KR20190052890 A KR 20190052890A
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South Korea
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chromosome
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human
cardiovascular disease
risk
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KR1020170148720A
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이상학
지헌영
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연세대학교 산학협력단
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Abstract

단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 마이크로 어레이, 및 개체의 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 의하면, 개체의 심혈관질환의 발병 위험 수준을 예측 또는 측정할 수 있다. 예측 또는 측정된 개체의 심혈관질환 발병 위험 수준은 관상동맥질환 등을 조기에 진단하여 발병을 예방하기 위한 정보로 이용될 수 있고, 개인 맞춤의학적 치료에 적용하여 치료 효과를 증대시킬 수 있다.

Description

콜레스테롤 유출능과 관련된 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법{Composition, kit for predicting the risk of developing cardiovascular disease related to Cholesterol efflux capacity, and method using the same}
유전자의 변이를 검출하여 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물 및 키트, 및 이를 이용한 개체의 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
심혈관 질환(cardiovascular disease: CVD)은 세계 최고 사망률을 기록하고 있는 질병으로 세계보건기구의 보고에 의하면 2030년까지 2360만명이 심혈관 질환으로 사망할 것으로 예상하고 있다. 심근경색증(myocardial infarction)은 성인 돌연사 원인 1위를 차지하는 치명적인 질환으로 계속 증가하는 추세에 있다. 심혈관질환의 원인으로는 흡연, 섭식, 과체중, 비만, 혈당 대사 문제 등이 존재하며, 혈압 강하, 혈청 콜레스테롤 하강, 심리적 치료를 통하여 심혈관 질환을 예방 및 치료하고자 하는 연구가 지속되고 있다.
종래 심혈관질환의 진단 방법으로 혈관내 초음파 방법(intravascular ultrasound: IVUS) 등의 침습적 방법을 사용하였으며, 심혈관질환의 진단을 위한 바이오마커로는 글루타민산 옥살로초산 트란스아미나제(glutamic oxaloacetic transaminase: GOT), 락테이트 데히드로게나제(lactate dehydrogenase: LDH), 크레아틴 키나제-MB(creatine kinase-MB: CK-MB), 트로포닌(troponin) I, 트로포닌 T, C 반응성 단백질(C-reactive protein: CRP) 및 B형 나트륨이뇨펩티드(B-type natriuretic peptide: BNP) 등을 사용하였다. 그러나, 아직 심혈관질환에 관한 유전적 특징을 이용하여 심혈관질환의 발병을 예측할 수 있는 유전적 지표에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 지속적인 연구를 토대로 유전자 검사를 통한 심혈관질환의 고위험군을 조기 진단하여 예방 및 관리할 필요가 있다.
일 양상은 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 키트를 제공한다.
다른 양상은 개체의 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 양상은 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단일염기다형성 마커는, 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기가 A 또는 C, 인간의 6번째 염색체의 21041698 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21148021 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21196501 번째 염기가 C 또는 G, 인간의 6번째 염색체의 21226461 및 21226462 번째 염기가 TG 또는 결실, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)은 당해 기술분야에 통상적으로 알려진 의미로 사용된다. 단일염기다형성은 유전체 상에서 단일 염기 또는 뉴클레오티드(A, T, C 또는 G, 뉴클레오티드 A는 아데닌, 뉴클레오티드 T는 티민, 뉴클레오티드 C는 시토신, 뉴클레오티드 G는 구아닌을 의미함)가 종의 멤버들 간 또는 집단 내 게놈에 존재하는 염기 또는 뉴클레오티드 서열의 다양성 또는 다형을 의미한다. 단일염기다형성는 인간 유전체 상에 가장 많이 존재하는 유전적 다형성으로, 유전학적으로 단일염기다형성에 따라 각 개체에 큰 차이를 야기할 수 있다. 상기 단일염기다형성은 단일뉴클레오티드변이(single nucleotide variant: SNV)와 혼용될 수 있다. 상기 단일뉴클레오티드변이는 유전체 상에서 하나의 염기 또는 뉴클레오티드의 차이를 보이는 서열의 변경을 의미한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 단일염기다형성 마커인 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기가 A 또는 C, 인간의 6번째 염색체의 21041698 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21148021 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21196501 번째 염기가 C 또는 G, 인간의 6번째 염색체의 21226461 및 21226462 번째 염기가 TG 또는 결실, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 하나의 단일가닥 폴리뉴클레오티드가 심혈관질환의 발병 위험과 연관되어 있는 경우, 상기 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드도 당연히 심혈관질환 발병 위험과 연관되어 있는 것을 판단될 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은, 하나의 특정한 서열을 가진 심혈관질환의 발병 위험과 연관되어 있는 단일가닥 폴리뉴클레오티드 및 그에 상보적인 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
예를 들면, 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기(단일염기다형성 마커)는 "A" 또는 "C"이다. 이 경우, 상기 조성물은 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기(단일염기다형성 마커)의 "A" 또는 "C" 뉴클레오티드를 포함할 뿐만 아니라, 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기(단일염기다형성 마커)에 대응되는 위치에 "T" 또는 "G" 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 조성물은 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기(단일염기다형성 마커)를 검출할 수 있다. 또는 상기 조성물은 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기(단일염기다형성 마커)에서 A>C를 검출할 수 있다.
상보적인 서열을 가진 폴리뉴클레오티드는 다른 단일염기다형성 마커에 대하여, 동일하게 적용된다.
상기 폴리뉴클레오티드는 LOC541471 유전자의 하류(downstream)의 단일염기다형성 마커를 분석하기 위한 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. LOC541471은 종양 성장을 촉진하는 RNA 및 단백질을 수송하는 교모세포종(Glioblastoma) 미세소포(microvesicle)에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 아직 그 기능이 명확하게 규명되지 않았다. 상기 LOC541471은 인간의 경우, LOC541471 유전자에 의해 암호화되는 단백질인 것일 수 있다. LOC541471 유전자는 인간의 경우, GRCh37/hg19에서, 2번째 염색체, 및 2q13에 위치하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 CDKAL1 유전자의 인트론의 단일염기다형성 마커를 분석하기 위한 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. CDKAL1은 메틸티오트랜스퍼라제(methylthiotransferase) 패밀리의 구성원으로 알려져 있으나, 아직 그 기능이 명확하게 규명되지 않았다. 상기 CDKAL1은 인간의 경우, CDKAL1 유전자에 의해 암호화되는 단백질인 것일 수 있다. CDKAL1 유전자는 인간의 경우, GRCh37/hg19에서, 6번째 염색체, 및 6p22.3에 위치하는 것일 수 있다.
용어 "유전자"는 유전 정보를 결정하는 구조 단위를 의미하며, 단백질의 아미노산 서열 또는 기능 RNA(tRNA, rRNA 등)의 염기 배열을 결정하는 정보를 가지는 구조 유전자, 및/또는 구조 유전자의 발현을 제어하는 조절 유전자, 예를 들면, 프로모터, 억제자(repressor), 작동유전자(operator) 등을 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "유전자"는 유전자의 산물을 생성하기 위해 전사되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 가닥 쪽을 의미하는 것으로 이해된다.
통상의 기술자라면 상기 등록번호를 이용하여 단일염기다형성 마커 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. UCSC genome browser 또는 GenBank에 등록되어 있는 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 다소 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이를 지닌 뉴클레오티드 폴리머를 의미하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 핵산, 또는 올리고뉴클레오티드와 상호교환적으로 사용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 영역의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 특이적 결합 특성을 이용하여, 혼합물로로부터 표적 영역을 포함하는 표적 유전자 또는 그의 단편을 효과적으로 분리할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 단수개 또는 복수개인 것일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 형태인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 상보적인 뉴클레오티드와 수소 결합에 의하여 혼성화될 수 있는 성질을 갖는 것이면, 천연 뉴클레오티드로 구성된 것뿐만 아니라, 천연 뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드의 유사체, 천연 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 인산 부위가 변형되어 있는 뉴클레오티드 및 이들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA인 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 단일염기다형성 마커를 포함하는 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
용어 "연속 뉴클레오티드 서열(contiguous nucleotide sequence)"은 인접한 2개 이상의 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
용어 "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건하에서 상기 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다.
상기 폴리뉴클레오티드의 크기는 5 내지 200nt(nucleotide : nt)인 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 10 내지 150 nt, 10 내지 100 nt, 또는 15 내지 100 nt인 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머, 프로브, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는, 표적 영역의 뉴클레오티드 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 뉴클레오티드 서열이 이용될 수 있으나, 특이적으로 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 뉴클레오티드 서열이 이용될 수도 있다. 또한, 상기 프라이머 또는 프로브는, 표적 영역의 뉴클레오티드 서열에 대하여 특이적으로 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서, 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
용어 "프라이머(primer)"는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합 반응에서, 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들면, 상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건, 즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합효소의 존재 하에서 주형-지시(template-directed) DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드인 것일 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들면, 온도와 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 길이가 5 내지 100nt, 5 내지 70nt, 10 내지 50nt, 또는 15 내지 30nt인 것일 수 있다. 예를 들면, 프라이머의 길이가 짧을수록, 낮은 어닐링(annealing) 온도에서 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성할 수 있다. 상기 프라이머의 길이가 5nt 미만의 크기를 가질 경우 표적 영역을 캡처하기 위한 정확도가 낮으며, 100nt 초과의 크기를 가질 경우 합성 비용이 증가하는 단점을 갖는다. 따라서 상기 프라이머는 경제적이면서 유전자 다형성 또는 변이 검출에 최적화된 크기를 갖는다. 프라이머의 설계는 주어진 증폭하고자 하는 표적 영역의 뉴클레오티드 서열을 참조하여 통상의 기술자에 의해 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 구입가능한 프라이머 설계용 프로그램을 사용하여 설계할 수 있다. 상기 상업적으로 구입가능한 프라이머 설계용 프로그램의 예는 PRIMER 3 프로그램이 포함된다.
상기 프라이머는 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트와 같은 뉴클레오티드 유사체(analogue), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid) 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 표지 물질을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 형광 표지 물질은 VIC, NED, FAM, PET, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 표지되는 것일 수 있다. 또한, 방사성 표지 물질은, 32P 또는 35S와 같은 방사성 동위원소가 첨가된 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)의 반응액을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭 산물에 혼입되는 것일 수 있다.
상기 프라이머는 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), PCR 연장 분석, PCR 단일 가닥 고차 구조 다형성(PCR-single strand conformation polymorphism: PCR-SSCP), TaqMan 방법 및 시퀀싱 등을 이용한 방법에 이용되는 것일 수 있다.
용어 "프로브(probe)"는 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프로브는 길이가 5 내지 100nt, 10 내지 90nt, 15 내지 80nt, 20 내지 70nt, 또는 30 내지 50nt인 것일 수 있다. 상기 프로브의 길이가 10nt 미만의 크기를 가질 경우 표적 영역을 캡처하기 위한 정확도가 낮으며, 100nt 초과의 크기를 가질 경우 합성 비용이 증가하는 단점을 갖는다. 따라서 상기 프로브는 경제적이면서 유전자 다형성 또는 변이 검출에 최적화된 크기를 갖는다. 상기 프로브는, 예를 들면, 표적 영역의 뉴클레오티드 서열에 완전 상보적인 서열로 이루어진 완전 매치 프로브(perfect match probe) 및 단일염기다형성 마커를 제외한 모든 뉴클레오티드 서열에 대하여 완전 상보적인 서열을 갖는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 프로브는 혼성화 방법, 예를 들면, 마이크로어레이(microarray), 서던 블로팅, 다이나믹 대립유전자 혼성화(dynamic allele-specific hybridization) 및 DNA 칩 등을 이용한 방법에 이용되는 것일 수 있다. 마이크로어레이는 당해 기술 분야에 알려진 의미로 사용되며, 예를 들면, 기판 상의 복수 개의 구분된 영역에 프로브 또는 프로브의 집단이 고정화되어 있는 것일 수 있다. 상기 기판은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예를 들면, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼(wafer), 파이버(fiber), 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하는 것일 수 있다. 상기 프로브 또는 그에 상보적인 프로브는 개체로부터 수득된 핵산과 혼성화되고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정할 수 있는 방법에 이용되는 것일 수 있다.
상기 심혈관질환은 관상동맥질환, 말초혈관질환, 죽상경화성 심혈관질환, 뇌혈관질환 또는 이들의 조합인 것일 수 있으며, 통상의 기술자에게 알려진 의미로 사용될 수 있다.
"심혈관질환 발병 위험"은 심혈관질환 발병 위험 발병 위험의 상대적인 위험일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 발병의 확률이 건강한 정상인 군에 비하여 증가되어 있는지, 또는 감소되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 위험은 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체가 다른 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체에 비하여 심혈관질환 발병의 확률이 증가되어 있는지 또는 감소되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다.
심혈관질환은 콜레스테롤 유출능이 건강한 군 또는 정상인 군에 비하여 감소되어, 유발된 것일 수 있다.
상기 개체는 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 대상을 의미한다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 또는 인간(Homo sapiens)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간은 한국인일 수 있다.
상기 단일염기다형성 마커는 심혈관질환 발병 위험을 진단 또는 예측하기 위한 마커로 사용될 수 있다. 상기 단일염기다형성 마커는 콜레스테롤 유출능 억제를 진단 또는 예측하기 위한 마커로 사용될 수 있다. 상기 단일염기다형성 마커는 콜레스테롤 유출능이 억제되어 야기된 심혈관질환 발병 위험을 진단 또는 예측하기 위한 마커로 사용될 수 있다.
다른 양상은 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트는 상기 조성물을 포함하는 포함하는 것일 수 있다. 상기 키트은 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단일염기다형성 마커는, 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기가 A 또는 C, 인간의 6번째 염색체의 21041698 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21148021 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21196501 번째 염기가 C 또는 G, 인간의 6번째 염색체의 21226461 및 21226462 번째 염기가 TG 또는 결실, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 키트는, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드와 그의 특정 용도에 필요한 구성들을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드와 함께 그의 사용 방법에 필요한 시약을 포함하는 것일 수 있다. 상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드가 핵산과 혼성화하는데 요구되는 알려진 물질을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 키트는 표적 영역의 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 증폭하고, 증폭 산물의 존재 유무를 통하여, 개체의 심혈관질환을 진단하기 위한 키트인 것일 수 있다. 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그로부터 유래된 프로브를 시료 중의 핵산과 혼성화시키고, 그 혼성화 결과로부터 개체의 심혈관질환의 발병 위험을 진단하기 위한 키트인 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산의 혼성화에 필요한 시약, 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예를 들면, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소보조인자 및 dNTPs를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 키트는 표적 영역을 증폭하기 위하여 사용하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있으며, 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. 상기 사용 설명서는 예를 들면, 상기 특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 영역이 증폭되고, 상기 비특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 영역이 증폭되지 않는 경우, 증폭에 사용된 시료 중에서 심혈관질환과 연관된 표적 영역, 다형성 또는 변이가 존재하는 것으로 결정하고, 그 결과로부터 개체의 심혈관질환의 발병 위험을 결정하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 및 다형성에 대하여는 전술한 바와 같다.
다른 양상은 개체의 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개체의 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및 수득된 핵산 시료로부터 단일염기다형성 마커의 유전형을 분석하는 단계를 포함하고, 상기 단일염기다형성 마커는, 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기가 A 또는 C, 인간의 6번째 염색체의 21041698 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21148021 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21196501 번째 염기가 C 또는 G, 인간의 6번째 염색체의 21226461 및 21226462 번째 염기가 TG 또는 결실, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 방법은 개체의 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계를 포함한다.
상기 개체는 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 대상을 의미한다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 인간(Homo sapiens), 마우스, 래트, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 인간은 아시아계 인, 또는 한국인일 수 있다. "개체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
상기 생물학적 시료는 생물로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 혈액, 조직, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 생물학적 시료는 순수하게 분리된 핵산, 조 분리된 핵산, 핵산을 포함하는 세포 파쇄물, 또는 세포 유리 핵산을 포함하는 것일 수 있다.
생물학적 시료로부터 유전체 핵산을 분리하는 방법은 통상의 핵산 분리 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reactionL: PCR), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 전사 증폭(transcription amplification), 또는 실시간-핵산 서열 기초 증폭(realtime-nucleic acid sequence based amplification: NASBA)을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다.
상기 방법은 수득된 핵산 시료로부터 단일염기다형성 마커의 유전형을 분석하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서 단일염기다형성 마커의 유전형을 분석하는 단계는 염색체 내 표적 영역 또는 단일염기다형성 마커의 각 위치에서의 뉴클레오티드를 결정하는 것을 의미한다. 예를 들면, 알려진 핵산의 뉴클레오티드 시퀀싱 방법(sequencing method)에 의하여 염색체 내 표적 영역 또는 각 위치에서의 뉴클레오티드를 직접적으로 결정할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 결정 방법은 생거(또는 디데옥시) 시퀀싱 방법 또는 막삼-길버트(화학 절단) 방법을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 프로브를 대상 폴리뉴클레오티드와 혼성화시키고, 혼성화 결과를 분석함으로써, 표적 영역의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 혼성화 정도는 예를 들면, 검출 가능한 표지를 대상 핵산에 표지하고, 혼성화된 대상 핵산을 검출함으로써 확인되거나, 전기적 방법 등에 의하여 확인될 수 있다. 또한, 단일 염기 연장(single base primer extension: SBE) 방법이 이용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 결정 방법은 또한, 차세대 염기 시퀀싱을 포함하는 것일 수 있다. 용어 "차세대 염기시퀀싱(next generation sequencing: NGS)은 칩(Chip)기반 그리고 PCR 기반 쌍-말단(paired end) 형식으로 전장 유전체를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응(hybridization)에 기초하여 초고속으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미한다. 차세대 염기시퀀싱에 의해 짧은 시간 내에 분석 대상이 되는 시료에 대해 대량의 염기서열 데이터를 생성할 수 있다.
상기 유전형을 분석하는 단계는 상기 단일염기다형성 마커에서의 특정 대립유전자의 유무 또는 특정 유전형의 유무에 근거하여, 개체 또는 피검체가 심혈관질환에 걸릴 위험성 또는 심혈관질환을 나타내는 환자인지를 판별할 수 있다.
상기 단일염기다형성 마커는 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기가 A 또는 C, 인간의 6번째 염색체의 21041698 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21148021 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21196501 번째 염기가 C 또는 G, 인간의 6번째 염색체의 21226461 및 21226462 번째 염기가 TG 또는 결실, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 방법은 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기가 C, 인간의 6번째 염색체의 21041698 번째 염기가 A, 인간의 6번째 염색체의 21148021 번째 염기가 A, 인간의 6번째 염색체의 21196501 번째 염기가 G, 인간의 6번째 염색체의 21226461 및 21226462 번째 염기가 결실, 또는 이들의 조합인 경우, 심혈관질환의 발병 위험이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기가 C, 인간의 6번째 염색체의 21041698 번째 염기가 A, 인간의 6번째 염색체의 21148021 번째 염기가 A, 인간의 6번째 염색체의 21196501 번째 염기가 G, 인간의 6번째 염색체의 21226461 및 21226462 번째 염기가 결실, 또는 이들의 조합인 경우, 콜레스테롤 유출능이 억제된 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 개체의 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 것은 심혈관질환의 발병의 상대적인 위험을 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 참조 유전체 서열을 갖고 있는 군에 비하여 심혈관질환 발병 가능성이 증가되어 있는지를 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다.
용어 "참조 유전체 서열(reference genome sequence)"은 다형성 또는 변이 확인을 위해 참조가 되는, 인간 유전체 서열인 것일 수 있다. 참조 유전체 서열은, 참조 유전체의 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 미국 국립보건원 산하 생물공학정보연구소의 데이터베이스에 게시된 인간 유전자의 뉴클레오티드 서열, 구체적으로, NCBI37.1 또는 UCSC hg19(GRCh37)인 것일 수 있다. 상기 개체의 뉴클레오티드 서열과 참조 유전체 서열 간의 비교는 공지된 다양한 서열 비교 분석프로그램, 예를 들면 Maq, Bowtie, SOAP, GSNAP 등을 이용하여 수행할 수 있다.
상기 단일염기다형성 마커에서 다형성의 수가, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개인 경우, 심혈관질환의 발병 위험이 높다고 판단할 수 있으며, 예측에 대한 정확도가 높아질 수 있다.
상기 유전형을 분석하는 단계는 시퀀싱, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화(dynamic allele-specific hybridization), PCR 연장 분석, PCR-SSCP(PCR-single strand conformation polymorphism), TaqMan 방법 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 것일 수 있다. 상기 유전형을 분석하는 단계는 상기 조성물 또는 키트를 이용할 수 있다.
시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자 분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 대립유전자 특이적 PCR은 단일염기다형성 마커가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 단일염기다형성 마커가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. PCR 연장 분석은 먼저 단일염기다형성 마커가 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 단일염기다형성 마커에 특이적인 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. TaqMan 방법은 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하고, 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 및 VIC로 표지(Applied Biosystems)하여, 증폭 및 분석하는 단계로 수행된다.
상기 조성물, 키트 또는 방법은, 아시아인, 한국인 또는 50세 이상의 한국인과, 심혈관질환과 특이적으로 연관되어 있다. 따라서, 상기 조성물, 키트 또는 방법은, 아시아인, 또는 한국인의 심혈관질환의 발병 위험을 예측 또는 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 마이크로 어레이, 및 개체의 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 의하면, 개체의 심혈관질환의 발병 위험 수준을 예측 또는 측정할 수 있다. 예측 또는 측정된 개체의 심혈관질환 발병 위험 수준은 관상동맥질환 등을 조기에 진단하여 발병을 예방하기 위한 정보로 이용될 수 있고, 개인 맞춤의학적 치료에 적용하여 치료 효과를 증대시킬 수 있다.
도 1는 콜레스테롤 유출능에 대한 게놈-전체 연관성을 나타낸 것으로, 도 1a는 발굴 군에서 분위수-분위수 (Quantile-Quantile: Q-Q) 플롯을 나타낸다. 관찰된 (y-축) 및 예상된 (x-축) p-수치의 음의 대수(logarithm)를 각 SNP에 대하여 구성하였다. 붉은색 선은 귀무 가설(null hypothesis)을 나타낸다. 이 플롯은 편향된 신호가 실제 연관성을 나타냄을 암시한다.
도 1b는 발굴 군에서 콜레스테롤 유출능과 게놈-전체 변이와의 연관성을 나타낸다. 품질 관리 기준을 통과한 단일염기다형성은 -log10P에 대한 염색체 위치에 따라 맨하탄 플롯의 x-축에 나타내었다. P < 5x10-5의 경우 유의한 것으로 보았다. 붉은색 글씨로 표시된 4종의 점은 검증 군에서의 유의한 CDKAL1의 단일염기다형성을 나타낸다.
도 2는 CDKAL1 유전자 및 주변 영역의 좌의 locuszoom 영역 플롯을 나타낸다. 게놈 빌드 및 연관 비평형(linkage disequilibrium: LD)은 hg19/1000 Genomes Asian(Nov 2014)이며, 파란색 선은 HapMap 데이터를 사용한 재조합 비율을 나타낸다. 점은 CDKAL1의 대체 단일염기다형성을 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 심혈관질환 마커 선별
1. 연구 대상 선정
본 연구에서 발굴 군은 연세대학교 의과대학 심혈관 유전체 센터 코호트에서 관상동맥 질환(coronary artery diseas) 환자 607명을 대상으로 하였다. 상기 환자들은 흉부 증상에 따라 관상동맥 조영술(coronary angiography)을 받았다. 관상동맥 질환은 적어도 하나의 심외막(epicardial) 관상동맥(epicardial coronary artery)에서 유의한 협착(stenosis)(≥50%)을 보이는 것에 근거하여 진단하였다. 검증 군(replication group)은 세브란스 병원에 관상동맥 질환으로 방문한 환자 158명을 대상으로 하였다. 상기 연구는 세브란스 병원의 임상 시험 심의위원회의 승인하에 수행되었으며(IRB no. 4-2001-0039), 모든 참가자는 서면으로 동의하였다.
2. 관상동맥 질환 환자에서의 혈장 지질 수준 및 콜레스테롤 유출능 평가
상기 연구 대상으로부터 병력 및 인구통계적인 변인(demographic variables)에 관한 임상 데이터를 수득하였다. 모든 연구 대상으로부터 혈액 샘플을 채취하고, 튜브에 넣어 원심분리하였다. 이어서, 혈장을 수거하고 -80 ℃에서 보관하였다.
혈장 지질 수준을 통상적인 방법에 따라 측정하였으며, 콜레스테롤 유출능 분석은 다음의 방법으로 측정하였다. J774 세포를 플레이트에 분주하고, 2 μCi의 3H-콜레스테롤/㎖를 첨가하고 24간 동안 반응시켜 세포에 방사성 표지(radiolabling) 하였다. 아데노신 트리포스페이트-결합 카세트 트랜스포터 서브패밀리 멤버 A1(adenosine triphosphate-binding cassette transporter subfamily member A1: ABCA1)을 증가시키기 위하여, 세포를 0.2%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA) 및 0.3 mM의 시클릭 아데노신 모노포스페이트를 함유하는 배지에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 0.2%의 BSA 및 환자 샘플을 함유하는 배지로 교체하고 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포에 2 ㎍/㎖의 아실-조효소 A: 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 억제제를 첨가하였다. 콜레스테롤 유출 비율은 하기 식을 이용하여 계산하였다.
콜레스테롤 유출능(Cholesterol efflux capacity: CEC)(%)=[고밀도 지단백을 함유하는 배지 중의 3H-콜레스테롤(μCi) / 고밀도 지단백을 함유하는 배지 중의 3H-콜레스테롤 {μCi} + 세포 중의 3H-콜레스테롤의 μCi{μCi}] x 100. 수치들을 각각의 플레이트에서 풀링된 혈청의 유출능에 기초하여 조정하였다. 모든 시료에 대하여 2회 이상 반복 실험하였다.
환자의 평균 연령은 발굴 군 및 검증 군에서 각각 52세 및 61세 이었다. 남성은 두 그룹에서 모두 우세하였다. 모든 환자의 약 25%는 당뇨병을 가지고 있었다. 평균 HDL-C 수치는 발굴 군 및 검증 군에서 각각 42.1 및 42.6 mg/dL 이었고, 평균 LDL-C 수치는 발굴 군 및 검증 군 모두에서 약 99 mg/dL 이었다(표 1).
발굴 군(n=607) 검증 군(n=158)
연령, 년 52.3 ± 8.0 60.9 ± 8.0
남성(%) 321(52.9) 129(81.6)
당뇨병(%) 150(24.7) 39(24.7)
고혈압(%) 286(47.1) 81(51.3)
급성 관상동맥 증후군(Acute coronary syndrome)(%) 349(57.5) 90(57.0)
현재 흡연 여부(%) 140(23.1) 55(34.8)
총 콜레스테롤, mg/dL 168 ± 44 162 ± 45
트리글리세라이드
(Triglycerides: TG), mg/dL		 139 ± 101 129 ± 71
HDL-C, mg/dL 42.1 ± 10.0 42.6 ±11.8
LDL-C, mg/dL 99 ± 39 99 ± 40
스타틴(Statin) 사용(%) 121(19.9) 126(79.7)
3. 유전형 분석 및 대체(imputation) 변이 분석
발굴 군에 대하여, Affymetrix 게놈-전체(wide) 인간 SNP 분석 6.0(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 유전자형을 분석하였다. 검증 군에 대하여, AxiomTM 게놈-전체 ASI-30 분석 플레이트(Affymetrix Inc)를 이용하여 유전자형을 분석하였다. 통계 수준을 높이기 위하여, 표준화된 방법을 대체 분석하였다.
상염색체의 유전형은 SHAPEIT2(v.2.20) 및 HapMap 단계 II NCBI GRCh37/hg19 유전체 맵(genetic map)을 사용하여 1차 선별하고, 게놈-전체 대체 분석은 IMPUTE2(v.2.3.2)(Delaneau, Nat Methods 2013; Marchini, Nat Rev Genet 2010; Howie, Nat Genet 2012) 및 1000 게놈 프로젝트 단계 III을 국제 참조 패널(cosmopolitan reference panel)로 사용하여 수행하였다.
품질 관리(quality control)를 위해, 발굴 군 및 검증 군 모두에서 1) 전체 변이 추출 비율 < 95% ; 2) 소수 대립유전자 빈도(minor allele frequency) < 0.5%; 또는 3) 하디-바인베르그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium) P < 1.0 × 10-6인 경우, SNP를 제외하였다.
또한, 대체 정보 점수(imputation information score)(r2 info)가 0.3 미만인 대체 변이는 QCTOOL(v.1.4)을 사용하여 제외하였으며, GTOOL(v.0.7.5)를 사용하여 PLINK로 변환하였다. 대체 및 품질 관리의 전과정에서, UCSC 게놈 브라우저 및 UCSC liftOver 알고리즘을 사용하여 GRCh36/hg18 유전형 위치(coordinates)를 GRCh37/hg19로 변환하고, 가장 가까운 유전자에 주석(annotation)을 달았다. 그 결과, 발굴 군 및 검증 군에서 각각 약 580 만 건 및 약 710 만 건의 SNP를 확인였다.
3. 통계 분석
콜레스테롤 유출능 및 유전형(genotyped) 또는 대체(imputed) 변이 사이의 게놈-전체 연관성을 평가하였다. 콜레스테롤 유출능과 관련된 인자를 규명하기 위하여, 유출능과 임상 파라미터 사이의 스피어만 순위 상관계수(Spearman rank correlation coefficients)를 구하였다. 콜레스테롤 유출능을 연령, 성별, 고밀도-지단백-콜레스테롤(high-density lipoprotein-cholesterol: HDL-C)을 고려하여 조정하였다. 조정된 콜레스테롤 유출능과 변이 사이의 연관성은, 가산 유전체 모델(additive genetic model)을 가정하여, 선형 회귀 분석(linear regression)으로 평가하였다. 각 변이의 dosage는 0 에서 2까지의 범위에서 수행된 소수 대립유전자의 수와 동일하다. 상관 계수 계산 및 게놈 전체 통계 분석은 각각 Python(V.3.5.2) 및 PLINK(v.1.07)에서 SciPy 라이브러리를 이용하여 수행하였다. 게놈 인플레이션 계수(Genomic inflation factor)(λ)는 중앙값 카이 제곱(median chi-square) 통계에 기초하여 계산하였고, 맨하탄 플롯 및 분위수-분위수(quantile-quantile: Q-Q) 플롯은 R 소프트웨어(V.3.3.3)에서 qqman 라이브러리를 사용하여 수득하였다.
검증 군에 대하여, P < 5.0 × 10-5를 만족하는 변이를 조사하여 유전자 좌(loci)를 선별하였다. 연관 비평형(linkage disequilibrium: LD) 계산은 PLINK 소프트웨어를 이용하여 수행하였으며, 발굴 군 및 검증 군 모두에서 콜레스테롤 유출능과 유의하게 연관된 변이를 포함하는 좌(loci)를 LocusZoom(v.0.4.8)를 사용하여 구성하였다.
대체와 품질 관리를 통과한 약 580만 SNP에 대하여, 발굴 군에서 콜레스테롤 유출능과의 연관성을 분석한 결과는 다음과 같다. 게놈 인플레이션 계수(genomic inflation factor: λ)는 0.99이었다. 이러한 결과는 집단 하위 구조의 바이어스(bias)에 영향을 받지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 결과는 또한, Q-Q 플롯에서 p-수치 편차로 확인하였다. 도 1는 콜레스테롤 유출능에 대한 게놈-전체 연관성을 나타낸 것으로, 도 1a는 발굴 군에서 분위수-분위수 (Quantile-Quantile: Q-Q) 플롯을 나타낸다.
임상 파라미터와 콜레스테롤 유출능 사이의 스피어만 순위와 P 수치의 상관관계 (correlation coefficient) 분석 결과를 표 2에 나타내었다. 다른 파라미터와는 달리 HDL-C는 발굴 군 및 검증 군에서 모두 가장 높은 계수 및 유의한 P 수치(각각 ρ = 0.313, P = 2.89 × 10-15 및 ρ = 0.241, P = 0.002)를 나타내었다. 연관성 분석을 수행하기 전에, 연령, 성별 및 HDL-C를 조정하였다.
발굴 군
(Discovery group)		 검증 군
(Replication group)
ρ P ρ P
연령, 년 0.073 0.07 0.020 0.81
남성 0.097 0.02 0.100 0.21
당뇨병 0.075 0.07 0.007 0.93
고혈압 0.047 0.25 0.185 0.02
현재 흡연 여부 0.005 0.90 -0.138 0.08
급성 관상동맥 증후군 0.030 0.45 -0.013 0.08
총 콜레스테롤, mg/dL 0.062 0.13 -0.077 0.33
트리글리세라이드, mg/dL 0.015 0.71 -0.001 0.99
HDL-C, mg/dL 0.313 2.89 x 10-15 0.241 0.002
LDL-C, mg/dL -0.033 0.42 -0.123 0.13
스타틴 사용 0.024 0.55 -0.051 0.53
도 1b는 발굴 군에서 콜레스테롤 유출능과 게놈-전체 변이와의 연관성을 나타낸다. 품질 관리 기준을 통과한 단일염기다형성은 -log10P에 대한 염색체 위치에 따라 맨하탄 플롯의 x-축에 나타내었다. 붉은색 글씨로 표시된 4종의 점은 검증 군에서의 유의한 CDKAL1의 단일염기다형성을 나타낸다.
발굴 군(n = 607)의 게놈-전체 연관성 분석에서, 631 종의 변이는 통계적으로 유의하였으며(P < 5.0 × 10-5), 가장 높은 P 수치는 2.28 × 10- 10 이었다. 또한, 검증 군(n=158)의 게놈-전체 연관성 분석에서, 5종의 대체 변이가 콜레스테롤 유출능과 유의하게 연관된 것으로 확인되었다. 5종의 변이를 표 3에 나타내었다.
LOC541471의 하류(downstream)에 위치한, 좌 2q13의 변이는 발굴 군에서 P = 2.5 × 10-5 및 검증 군에서 P = 2.6 × 10- 3를 나타내었다. 다른 4종의 변이(rs117835232, rs117252933, rs118065692, 및 rs150434350)는 모두 CDKAL1 유전자의 인트론 영역에 위치하였으며, 좌 6p22.3에서 확인되었다. 각각의 변이에 대한 P 수치는 발굴 군에서 1.1 × 10-7 내지 3.8 × 10- 5 이었으며, 검증 군에서 8.7 × 10-6 내지 3.0 × 10-3이었다. 5종의 좌는 콜레스테롤 유출능과 유의한 상관관계가 있었으며, P 수치는 두 군의 종합 분석에서 3.8 x 10-10 내지 2.8 x 10- 7 이었다.
염색체 위치 rs 번호 유전자
(Closest gene)		 대립
유전자		 연구대상 MAF β P ?
2q13 112357897 - LOC541471
(다운스트림, 105kb)		 A>C 발굴 군
검증 군
두군종합		 0.005
0.010
0.006		 8.1
9.5
8.3		 2.4x10-5
2.6x10-3
2.8x10-7
6p22.3 21041698 rs117835232 CDKAL1
(인트론)		 G>A 발굴 군
검증 군
두군종합		 0.007
0.013
0.008		 6.9
11.8
8.6		 3.8x10-5
8.7x10-6
1.1x10-9
21148021 rs117252933 CDKAL1
(인트론)		 G>A 발굴 군
검증 군
두군종합		 0.014
0.010
0.013		 5.2
10.9
6.1		 5.2x10-6
3.1x10-4
1.3x10-8
21196501 rs118065692 CDKAL1
(인트론)		 C>G 발굴 군
검증 군
두군종합		 0.010
0.010
0.010		 7.0
10.9
7.8		 1.1x10-7
3.2x10-4
1.5x10-10
21226461 및 21226462 rs150434350 CDKAL1
(인트론)		 delTG- 발굴 군
검증 군
두군종합		 0.014
0.020
0.015		 4.9
6.5
5.3		 1.8x10-5
3.0x10-3
1.3x10-7
rs_id는 NCBI가 초기에 등록되는 모든 단일염기다형성에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs-ID를 의미한다. 이와 같은 표에 기재된 rs_id는 다형성 마커인 SNP 마커를 의미함.
CDKAL1에서 4종의 변이는 높은 콜레스테롤 유출능과 연관이 있었다. 이 중, rs117835232는 rs117252933와 강한 연관 비평형을 보이지 않는 것으로 보였다(r2 = 0.50, D' = 0.75). 그러나, rs117252933 및 rs118065692(r2 = 0.82, D' = 0.91), rs117252933 및 rs150434350(r2 = 0.75, D' = 0.93), 및 rs118065692 및 rs150434350(r2 = 1.0, D' = 1.0) 사이의 r2 및 D' 수치를 살펴보면, 상기 3종의 변이는 강한 연관 비평형을 보였다. 구체적으로, rs117252933 및 rs150434350(r2 = 0.75, D' = 0.93), 및 rs118065692 및 rs150434350(r2 = 1.0, D' = 1.0)은 완전한 연관 비평형에 있는 것으로 판단되었다. 도 2는 CDKAL1 좌의 영역 플롯을 나타낸다.
상기 변이가 콜레스테롤 유출능에 미치는 영향이 조정에 상관없이 다른 임상 변수와 독립적인지 확인하기 위하여, 발굴 군에서 연령, 성별, 당뇨병, 고혈압, 흡연, 급성 관상 동맥 증후군, 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, HDL-C, 저밀도 지단백 콜레스테롤 및 스타틴(statin) 사용을 포함한 사후(post-hoc) 선형 회귀 분석을 수행하였다.
사후 선형 회귀 분석 결과는 다음과 같다. HDL-C(β=0.155, p=6.81 x 10-14) 및 CDKAL1 변이(β=4.945, p=2.11 x 10-5)는 콜레스테롤 유출능과 독립적으로 연관성이 있는 반면, 트리글리세라이드(β=0.008, p=0.01) 및 LDL-C 수준(β=4.945, p=2.11 x10-5)은 경계성 연관(borderline association)을 보였다. 도 2는 CDKAL1 유전자 및 주변 영역의 좌의 locuszoom 영역 플롯을 나타낸다. 게놈 빌드 및 연관 비평형(linkage disequilibrium: LD)은 hg19/1000 Genomes Asian(Nov 2014)이며, 파란색 선은 HapMap 데이터를 사용한 재조합 비율을 나타낸다. 점은 CDKAL1의 대체 단일염기다형성을 나타낸다.
변수 β SE P
연령, 년 -0.029 0.036 0.42
남성 0.756 0.600 0.21
당뇨병 0.656 0.458 0.15
고혈압 0.493 0.399 0.22
현재 흡연 여부 0.485 0.501 0.33
급성 관상동맥 증후군 0.643 0.394 0.10
트리글리세라이드, mg/dL 0.008 0.003 0.01
HDL-C, mg/dL 0.155 0.020 6.81 x 10-14
LDL-C, mg/dL -0.010 0.005 0.051
스타틴 사용 0.576 0.480 0.23
CDKAL1 유전 변이 4.945 1.153 2.11 x 10-5
CDKAL1 변이에 대한 유전 점수를 부여할 때, 4종의 변이 중 적어도 하나가 발생하면 점수를 부여하고, 야생형의 경우 0 점을 부여함.
본 연구에서 확인된 콜레스테롤 유출능과 연관된 5종의 변이 가운데, 1종의 변이는 염색체 2q13의 LOC541471 부근(하류)에 위치하였고, 4종은 염색체 6p22.3의 CDKAL1에 위치하였다. 상기 변이들은 콜레스테롤 유출능과 연관성을 보였으며, 이는 HDL-C 수준 및 다른 변수들과 독립적이었다.

Claims (9)

  1. 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물로서,
    상기 단일염기다형성 마커는, 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기가 A 또는 C, 인간의 6번째 염색체의 21041698 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21148021 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21196501 번째 염기가 C 또는 G, 인간의 6번째 염색체의 21226461 및 21226462 번째 염기가 TG 또는 결실, 또는 이들의 조합인 것인, 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드는 프라이머, 프로브 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 크기는 5 내지 200 nt인 것인 조성물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심혈관질환은 관상동맥질환, 말초혈관질환, 죽상경화성 심혈관질환, 뇌혈관질환 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심혈관질환은 콜레스테롤 유출능 억제에 의해 유발된 것인 조성물.
  6. 청구항 1의 조성물을 포함하는 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 키트.
  7. 하기 단계를 포함하는 개체의 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    개체의 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및
    수득된 핵산 시료로부터 단일염기다형성 마커의 유전형을 분석하는 단계를 포함하고,
    상기 단일염기다형성 마커는, 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기가 A 또는 C, 인간의 6번째 염색체의 21041698 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21148021 번째 염기가 G 또는 A, 인간의 6번째 염색체의 21196501 번째 염기가 C 또는 G, 인간의 6번째 염색체의 21226461 및 21226462 번째 염기가 TG 또는 결실, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 인간의 2번 염색체의 112357897 번째 염기가 C, 인간의 6번째 염색체의 21041698 번째 염기가 A, 인간의 6번째 염색체의 21148021 번째 염기가 A, 인간의 6번째 염색체의 21196501 번째 염기가 G, 인간의 6번째 염색체의 21226461 및 21226462 번째 염기가 결실, 또는 이들의 조합인 경우, 심혈관질환의 발병 위험이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 유전형을 분석하는 단계는 시퀀싱, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화(dynamic allele-specific hybridization), PCR 연장 분석, PCR-SSCP(PCR-single strand conformation polymorphism), TaqMan 방법 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 것인 방법.
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