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KR20190039061A - 배아줄기세포로부터 소장 오가노이드의 제조방법 - Google Patents

배아줄기세포로부터 소장 오가노이드의 제조방법 Download PDF

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KR20190039061A
KR20190039061A KR1020190039394A KR20190039394A KR20190039061A KR 20190039061 A KR20190039061 A KR 20190039061A KR 1020190039394 A KR1020190039394 A KR 1020190039394A KR 20190039394 A KR20190039394 A KR 20190039394A KR 20190039061 A KR20190039061 A KR 20190039061A
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small intestine
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Abstract

본 발명은 배아줄기세포로부터 소장 오가노이드를 제조하는 방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 소장 오가노이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 소장 오가노이드는 각 단계별로 생산 및 분화 조절이 가능하여 치료의 다양성과 효율적 생산이 가능하고, 만능성 줄기세포인 배아줄기세포를 이용하였는바 소장 오가노이드의 대량생산이 가능하기 때문에 질병 모델링을 통한 다양한 질환 발생 기작 규명, 약물 효과 테스트, 및 대체 장기 치료 모델로 이용할 수 있으며, 상기 배아줄기세포는 면역거부반응이 없어 새로운 재생 의학과 장기 이식 기술 개발의 연구 및 장 발달에 관여하는 주요 인자와 발달 기작 규명 연구 등에 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

Description

배아줄기세포로부터 소장 오가노이드의 제조방법{Method for preparing intestinal organoid from embryonic stem cells}
본 발명은 배아줄기세포로부터 소장 오가노이드를 제조하는 방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 소장 오가노이드에 관한 것이다.
오가노이드(organoid)는 장기 유사체로서, 줄기세포나 장기 기원세포로부터 분리한 세포를 3D 배양을 통해 다시 응집 · 재조합하여 만든 조직 또는 기관의 형태와 기능 모두를 재현하는 작은 배양체를 의미한다. 이러한 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 여러 특이적 세포 집단들을 포함하고 있고, 실제 조직 또는 기관과 유사한 형태 및 구조적 조직화가 이루어져 있으며, 각 기관이 가지는 특수한 기능을 재현할 수 있다. 오가노이드는 공통적인 일련의 과정에 의해 형성되는데, 기능이 같은 세포들끼리 뭉쳐 적절한 위치로 배치되며, 세포들의 구획이 분리된 후에는 더욱 세부적인 분화가 일어난다. 이를 계통 특성화(lineage specification)라고 하며, 실제 기능을 수행할 수 있도록 전구체가 완전한 성체 세포로 분화되는 것이다.
효과적인 오가노이드 대량 배양 기술의 개발은 다양한 응용 분야로 접목되어 질병 모델링, 약물 효력 테스트, 장기 대체 치료법(organ replacement) 등에 활용될 수 있다. 오가노이드는 맞춤형 의료(personalized medicine)의 강력한 모델로, 2차원에서 만든 세포 조직보다 신약의 안전성과 효능을 시험하는데 더욱 효과적이며, 환자 또는 개인별로 가장 적절한 약물을 선택하도록 도와줄 수 있을 것으로 기대되고 있다. 또한, 치료용도로 활용되어 질환으로 손상되거나 제대로 발달하지 못한 장기에 오가노이드를 이식해 상태를 개선할 수 있다. 이러한 오가노이드의 제작기술은 이론적으로는 줄기세포만으로 거의 모든 종류의 장기를 제작 가능한 것으로 알려져 있고, 따라서 다양한 질병에 이용 가능할 것으로 기대되어 최근 재생의학 분야에서 관련 연구가 더욱 활발해지는 추세이다.
한편, 여러 가지 기능을 동시에 처리 하는 소장의 상피세포는 소화 효소를 분비해 음식물을 소화시키고 음식물로부터 양분을 흡수 할 뿐만 아니라 생명에 치명적인 미생물이나 발암물질로부터 소장을 보호하는 기능을 수행한다. 소장의 장선와(crypt) 아래쪽에 존재하는 줄기세포는 변화 증폭 세포(transit-amplifying cell; TA cell)로 분화되고, 분화된 세포는 융털(villi) 쪽으로 올라가면서 여러 종류의 세포로 더 분화되어 각자의 기능을 다하고 죽게 되는데, 이러한 과정은 5일 이내에 일어나며 인간의 장에서는 하루 평균 1011개의 장 상피세포가 죽고 줄기세포에서 유래한 새로운 상피세포로 다시 채워진다고 알려져 있다. 따라서 장 줄기세포의 자가 증식 능력을 유지하면서 동시에 분화할 수 있는 능력은 재생 의학을 위한 좋은 연구 대상이 될 수 있으며, 이러한 능력을 이해하는 것이 미래의 장기 이식 기술 개발 및 질병 치료에 있어 중요한 첫걸음이 될 수 있다.
기존의 장 오가노이드는 2009년 Hans Clevers 연구실에서 분리된 장 줄기세포를 마트리젤을 이용한 3차원 배양에 처음으로 성공하여 장 줄기 세포로부터 생체 내 장의 구조와 비슷하게 장선와-융털 구조를 가지고 있는 장 오가노이드를 스스로 형성한다는 것을 보여준 바가 있으며, 이렇게 형성된 장 오가노이드는 배양되는 수 년 동안 그 성질이 유지될 수 있다고 보고되었다. 이러한 오가노이드는 장 내 줄기세포인 성체줄기세포를 이용하여 생산되며, 성체 줄기세포로부터 유래한 오가노이드는 조직이 자기복제 되거나 손상으로부터 회복될 때 체내 줄기 세포가 갖는 niche 환경을 모방하면 분화된 세포가 형성될 수 있다. 특히 상피 성체 줄기세포의 정상적인 역할 수행에는 윈트(Wnt) 신호가 아주 중요하다. 그러므로 Wnt 신호의 활성화물질인 Wnt3a, R-스폰딘(R-spondin) 등은 성체 줄기세포 배양 프로토콜에 주요한 요소로 포함되며, 이런 배양환경에서 Lgr5+ 세포가 항상 나타나게 된다. 여기서 Lgr5는 Wnt 신호의 표적 유전자이자 Wnt 신호를 증폭시키는 R-spondin의 수용체로 작동하는 인자이고, 성체 줄기세포의 활성도를 나타내는 지표이기도 하다. Lgr5+ 세포는 대부분의 조직 및 장기에서 유래한 오가노이드 형성에서 관찰되는 매우 중요한 성체줄기세포이다. 하지만 얻을 수 있는 세포 수에 한계가 있어 효율적 생산과 연구에 제한이 있으므로, 장의 발달, 분화 및 성숙에 대한 연구에 있어 새로운 모델이 필요하다.
이에, 장 오가노이드 제조에 있어서 성체줄기세포 대신 만능줄기세포를 이용할 경우, 대량증식이 가능하고 거의 모든 신체세포로 분화가 가능하며 면역거부반응이 없어 타인과 타종에게 이식이 가능한 장점이 있다. 그러나 분화조절이 어려워 암세포로 변화될 가능성이 있으므로 분화조절 기술의 정밀함을 요하며, 따라서 적합한 분화 조절 환경을 찾아내는 것이 필수적 요인이다.
한편, 후생동물의 발달과정에서, 소화기의 주요부분이나 호흡기는 가장 안쪽의 배엽인 내배엽에서 발달한다. 내배엽에서 호메오박스 유전자(homeobox gene) 중 하나인 Cdx2의 발현을 중심으로 장으로 계통 특수화가 시작된다. 지금까지 만능줄기세포를 이용하여 장 오가노이드를 형성함에 있어 인위적인 성장인자 처리로 인한 암세포로의 변이가 존재하여 적합한 배양법이 필요하였다. 따라서 후생동물의 발달과정을 체외(in vitro)에서 모방하여 암세포로의 변이 없이 장 오가노이드를 제조할 수 있다면 이는 새로운 모델 제시 뿐 아니라 연구 한계를 극복하여 연구의 폭을 확장시켜 줄 수 있는 중요한 출발점이 될 것이다.
상기와 같은 종래의 문제점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 마우스의 배아줄기세포로부터 얻은 배양체를 3차원 배양하고 내배엽으로 특수화시킨 다음 Cdx2를 발현하는 소장 오가노이드를 제조하였으며, 제조된 소장 오가노이드는 실질적인 소장의 특성을 가지는 것을 실험적으로 확인하였다. 이에 성체줄기세포 대신 대량증식이 가능한 만능성 줄기세포로부터 인위적인 성장인자의 처리 없이 내배엽으로 분화를 유도하여 소장 오가노이드를 제조하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 배아줄기세포로부터 소장 오가노이드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 소장 오가노이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 배아줄기세포로부터 소장 오가노이드를 제조하는 방법을 제공한다.
(a) 마우스 배아줄기세포를 부착성이 낮은 물질이 처리된 플레이트에서 배양하여 3차원 구체인 배양체(Embryoid-body)를 제조하는 단계;
(b) 상기 배양체를 마트리겔 내에 포함시켜 3차원 배양하는 단계;
(c) 상기 3차원 배양된 배양체에 액티빈 A(Activin A)를 처리하고 배양하여 내배엽으로 특수화시키는 단계;
(d) 상기 내배엽에 6-브로모인디루빈-3’-옥심(6-bromoindirubin-3′-oxime; BIO) 및 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스터(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester; DAPT)를 동시 처리하여 Cdx2 단백질의 발현을 유도하여 소장 계통으로 특수화시키는 단계; 및
(e) 상기 Cdx2 단백질의 발현이 유도된 소장 오가노이드를 배양하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 단계 (a)의 배양체는 마우스 배아줄기세포를 3 내지 10일 동안 배양함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 내배엽은 Foxa2 유전자를 발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 BIO 및 DAPT는 각각 0.5 내지 10 uM 및 1 내지 20 uM 농도로 처리될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 소장 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 소장 오가노이드는 하기의 특성을 나타낼 수 있다.
(a) 소장 점막에 존재하는 파네트 세포 특이적 그라뉼(Paneth cell specific granule)이 존재함;
(b) 소장 특이적 줄기세포 마커인 Msi1 및 Lgr5; 분화마커인 Lysozyme, Muc2, 및 ChgA; 및 장 분비 호르몬인 Cck를 발현함; 및
(c) 소장의 파네트 세포 및 줄기세포가 존재함.
본 발명은 마우스 배아줄기세포를 내배엽으로 분화되도록 유도하여 실제 소장의 특성을 갖는 소장 오가노이드를 구현하였다. 따라서 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 소장 오가노이드는 세포 분화가 진행되는 각 단계별로 생산 시기 및 생산량 조절이 효율적으로 가능하고 만능성 줄기세포의 특성인 대량 증식이 용이하여 단시간에 소장 오가노이드의 대량 배양 확보가 가능하다. 이를 통하여 각종 소장 질환 병변 부위의 조직 이식을 통한 재생 치료, 치료 약물의 효능 모니터링, 개인별 맞춤 의료를 위한 약물 반응 테스트, 질환 원인 규명을 위한 모델 시스템으로 활용, 음식물 섭취와 같은 환경적 요인에 따른 장내 반응 변화 관찰 등이 가능하다. 또한 장기 이식시 면역거부반응 회피를 위한 원천 기술 개발을 위한 모델 시스템으로 활용 가능하다.
도 1은, 마우스 배아줄기세포로부터 배양체를 만드는 과정 및 상기 과정에 따른 마우스 배아줄기세포의 형태 변화를 보여주는 결과이다.
도 2는, 마우스 배아줄기세포로부터 만든 구체의 배양체를 3차원으로 배양하는 과정 및 액티빈 A(Activin A) 처리 유무에 따른 내배엽 특이적 유전자인 Foxa2의 mRNA 수준을 비교하기 위해 RT-PCR을 실시한 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는, 마우스 배아줄기세포에서 분화시킨 내배엽에서 Cdx2의 발현을 유도한 후 발현수준을 측정한 결과로서, 도 3a 및 도 3b는 상기 내배엽에 윈트/베타-카테닌 신호전달 경로를 활성화시키는 GSK-3β 억제제인 BIO 및 노치 신호전달 경로를 억제하는 감마-세크레타제(γ-secretase) 억제제인 DAPT를 함께 처리한 후 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 실시하여 Cdx2 mRNA(도 3a) 및 단백질(도 3b) 수준을 측정한 결과이고, 도 3c는 면역조직화학염색법을 실시하여 상기 BIO 및 DAPT의 처리 농도에 따른 Cdx2 단백질의 발현정도를 비교한 결과이다.
도 4a 내지 도 4c는, 마우스 배아줄기세포로부터 분화시킨 소장 오가노이드가 실질적으로 소장의 특성을 가지고 있는지 검증한 결과로서, 도 4a는 장선와로부터 제조한 소장 오가노이드(crypt derived-organoid)와 구조적 특성을 비교한 결과이고, 도 4b는 RT-PCR을 통해 소장 특이적 유전자인 소장 특이적 줄기세포 마커(Msi1 및 Lgr5), 분화마커(Lysozyme, Muc2, ChgA), 및 장 분비 호르몬인 Cck mRNA의 발현수준을 측정한 결과이며, 도 4c는 면역조직화학염색법을 통해 소장 특이적인 파네트 세포(Paneth cell) 및 줄기세포(stem cell)를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 소장 오가노이드 제조방법의 전체적인 과정을 그림으로 도시한 것이다.
본 발명은 배아줄기세포로부터 소장 오가노이드를 제조하는 방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 소장 오가노이드에 관한 것이다. 본 발명자들은 성체줄기세포 대신 대량증식이 가능한 만능성 줄기세포인 배아줄기세포부터 인위적인 성장인자의 처리 없이 내배엽으로 분화를 유도하여 소장 오가노이드를 제조하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 배아줄기세포로부터 소장 오가노이드의 제조방법을 제공한다.
하기의 단계를 포함하는, 마우스 배아줄기세포로부터 소장 오가노이드 제조방법:
(a) 마우스 배아줄기세포를 부착성이 낮은 물질이 처리된 플레이트에서 배양하여 3차원 구체인 배양체(Embryoid-body)를 제조하는 단계;
(b) 상기 배양체를 마트리겔 내에 포함시켜 3차원 배양하는 단계;
(c) 상기 3차원 배양된 배양체에 액티빈 A(Activin A)를 처리하고 배양하여 내배엽으로 특수화시키는 단계;
(d) 상기 내배엽에 6-브로모인디루빈-3’-옥심(6-bromoindirubin-3′-oxime; BIO) 및 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스터(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester; DAPT)를 동시 처리하여 Cdx2 단백질의 발현을 유도하여 소장 계통으로 특수화시키는 단계; 및
(e) 상기 Cdx2 단백질의 발현이 유도된 소장 오가노이드를 배양하는 단계.
이하, 각 단계에 대하여 상세히 설명하고자 한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “배아줄기세포(embryonic stem cell; ESC)”는, 수정 후 14일이 되기 전 배아에서 추출한 세포로서, 신체의 모든 조직으로 분화할 수 있기 때문에 전능세포 또는 만능세포로도 불리는 아직 분화되지 않은 미분화 세포를 의미한다. 배아줄기세포는 성체줄기세포와 달리 무한대로 증식이 가능하기 때문에 이를 이용하여 오가노이드를 제조하는 경우 대량생산이 가능하다. 본 발명에서는 마우스 유래 배아줄기세포를 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 (a)는, 마우스 배아줄기세포를 부착성이 낮은 물질이 처리된 플레이트에 분주하고 3일 내지 10일, 보다 바람직하게는 5일 내지 7일, 더욱 바람직하게는 6일 동안 배양함으로써 구체의 배양체를 수득할 수 있다. 상기 배양체는 마우스 배아줄기세포의 응집된 세포덩어리로써 중력에 의해 형성될 수 있다.
상기 단계 (b)에서, 상기 배양체는 마트리젤(matrigel)에 심어 3차원 배양된 후 액티빈 A(Activin A) 처리에 의해 내배엽으로 특수화 될 수 있다. 상기 액티빈 A는 노달 신호전달 경로(Nodal signaling)를 활성화시킴으로써 배양체를 내배엽으로 특수화시키며, 이때 액티빈 A의 활성 감소를 방지하기 위해 배양액 내 FBS 대신 넉아웃 혈청 대체제(Knockout serum replacement; KSR)를 이용할 수 있다. 상기 방법으로 특수화된 내배엽은 Foxa2 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다.
상기 단계 (c)에서, 장 계통으로의 특수화는 신호전달 조절을 통한 장 특이적 유전자를 유도하여 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 특수화된 내배엽 내 윈트/베타-카테닌 신호전달(Wnt/β-catenin signaling) 경로 및 노치 신호전달 경로(Notch signaling)를 조절함으로써 Cdk2의 발현을 유도하여 소장 계통으로 특수화시킬 수 있다. 보다 상세하게 상기 내배엽에 윈트/베타-카테닌 신호전달 경로 활성화제로 글리코겐 합성효소 키나아제-3β(glycogen synthase kinase-3β; GSK-3β) 억제제인 6-브로모인디루빈-3’-옥심(6-bromoindirubin-3′-oxime; BIO) 및 노치 신호전달 경로 억제제로 감마-세크레타제(γ-secretase) 억제제인 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스터(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester; DAPT)를 각각 0.5 내지 10 uM 및 1 내지 20 uM의 농도, 보다 바람직하게는 1 내지 5 uM 및 2 내지 10 uM의 농도로 처리할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 상기 신호전달 경로를 조절할 수 있는 물질이라면, 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.
상기 단계 (d)는, Cdk2 발현이 유도된 소장 오가노이드를 별도의 성장인자의 처리 없이 기존의 성체줄기세포로 유도되는 오가노이드 배양액 조건과 동일한 배양액에서 배양하는 과정으로 이루어질 수 있다.
본 발명은 실시예를 통해 상기 방법으로 제조한 소장 오가노이드가 실질적으로 소장의 특성을 갖는지 검증하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에 따른 소장 오가노이드와 장선와로부터 제조한 소장 오가노이드(crypt derived-organoid)의 구조적 특성을 비교한 결과, 상기 비교군과 동일하게 본 발명에서 제조한 소장 오가노이드에서 파네트 세포 특이적인 그라뉼(Paneth cell specific granule)이 관찰되었고, 소장 특이적 유전자들의 mRNA 수준을 측정한 결과 소장 특이적 줄기세포 마커(Msi1 및 Lgr5), 분화마커(Lysozyme, Muc2, ChgA), 및 장 분비 호르몬인 Cck가 모두 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 소장에 존재하는 파네트 세포 및 줄기세포가 존재하는 것을 확인함으로써 본 발명에 따른 소장 오가노이드가 소장의 특성을 나타내는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
이에, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 소장 오가노이드를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 마우스 배아줄기세포를 이용한 3차원의 구체 배양
마우스 배아줄기세포를 이용해 모든 배엽으로 발달할 수 있는 3차원 조직배양의 초기 단계의 작은 구체(spheroid)인 배양체(Embryoid-body; EB)를 만들기 위해, 부착성이 낮은 물질이 처리된 96웰 플레이트에 마우스 배아줄기세포를 103 cells/well개씩 분주하고 DMEM high glucose base 배양액(15% FBS, 0.1 mM NEAA, 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 0.1 mg/ml 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin))으로 37℃에서 배양하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 약 6일 정도 배양한 결과 중력에 의해 마우스 배아줄기세포들 간에 배양체가 효과적으로 형성된 것을 확인하였다.
실시예 2: 배양체의 3차원 배양 및 내배엽으로의 특수화
상기 실시예 1의 방법에 따라 마우스 배아줄기세포로부터 만든 배양체를 마트리젤(matrigel)에 심어 3차원 배양을 시작하였다. 다음 단계로 내배엽에서 유래된 장 오가노이드를 제조하기 위해, 상기 배양체에 TGF-β superfamily 중의 하나인 액티빈 A(Activin A)를 100 ng/ml의 농도로 처리하여 노달 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 배양체를 내배엽으로 특수화되도록 하였다. 이때, 배양체의 배양액에 함유된 우태아혈청(FBS)이 상기 액티빈 A의 효과를 감소시킬 수 있기 때문에 FBS 대신 15% 넉아웃 혈청 대체제(Knockout serum replacement; KSR)를 첨가하고 이와 함께 0.1 mM NEAA, 및 0.1 mg/ml 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 DMEM high glucose 배양액에서 배양하였다.
상기와 같은 방법으로 배양하여 내배엽으로의 특수화가 잘 이루어졌는지 알아보기 위해, RT-PCR을 실시하여 내배엽 특이적 유전자인 Foxa2의 mRNA 수준을 측정하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 액티빈 A를 처리하여 배양한 경우 상기 유전자의 발현이 증가하였으며, 이에 반해 중배엽 특이적 유전자인 T의 발현은 사라진 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 장 발달의 필수 단계인 만능 마우스 배아줄기세포로부터 Foxa2+ 내배엽으로 분화가 잘 진행된 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 장 발달 특이적 유전자인 Cdx2 유도
장 발달 과정에서 호메오박스 유전자(homeobox gene) 중 하나인 Cdx2의 발현을 중심으로 장으로의 계통 특수화가 시작된다. 이에, 상기 실시예 1 및 2의 방법에 따라 마우스 배아줄기세포의 배양체를 내배엽으로 특수화시킨 다음, Cdx2의 발현을 유도하고자 하였다. 보다 구체적으로, 윈트/베타-카테닌 신호전달 경로(Wnt/β-catenin signaling) 및/또는 노치 신호전달 경로(Notch signaling)를 조절함으로써 상기 유전자의 발현을 유도하고자 하였다.
먼저, 윈트/베타-카테닌 신호전달 경로를 활성화시키는 글리코겐 합성효소 키나아제-3β(glycogen synthase kinase-3β; GSK-3β) 억제제인 BIO(6-bromoindirubin-3′-oxime)를 단독으로 처리(B 및 -BD IOs)한 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 상기 유전자의 mRNA 및 단백질 발현이 뚜렷하게 증가하지 않은 반면, 노치 신호전달 경로를 억제하는 감마-세크레타제(γ-secretase) 억제제인 DAPT(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)와 동시에 처리(BD 및 +BD IOs)한 경우 Cdx2 mRNA 및 단백질의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 나아가 최적의 처리 농도를 결정하기 위해, 상기 BIO 및 DAPT를 각각 1 uM/2 uM 또는 5 uM/10 uM으로 처리한 후 면역조직화학염색법(immunohistochemistry)를 실시하여 Cdx2의 단백질 수준을 비교하였다. 그 결과, BIO 및 DAPT를 각각 5 uM 및 10 uM 농도로 처리한 경우 Cdx2 단백질이 더 높게 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 4: 소장 오가노이드의 배양
상기 실시예 1 내지 3의 방법에 따라 제조한 cdx2 발현이 유도되는 장 오가노이드를 다른 별도의 성장인자 없이 기존의 성체줄기세포로부터 유도되는 오가노이드 배양액과 동일한 조건 즉, 상피세포성장인자(Epithelial Growth Factor; EGF), 노긴(Noggin), 및 R-스폰딘 1(R-spondin 1)을 함유하여 배양하였다. 이후 상기 방법으로 배양한 오가노이드가 실질적으로 소장의 특성을 갖는지 검증하였다.
먼저 본 발명에 따른 오가노이드의 구조를 장선와로부터 제조한 소장 오가노이드(crypt derived-organoid)와 비교하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 상기 비교군과 동일하게 소장 점막에 존재하는 파네트 세포 특이적인 그라뉼(Paneth cell specific granule)들이 관찰되었다. 또한, RT-PCR을 실시하여 소장 특이적 유전자들의 mRNA 수준을 측정한 결과 도 4b에 나타낸 바와 같이, 소장 특이적 줄기세포 마커(Msi1 및 Lgr5), 분화마커(Lysozyme, Muc2, ChgA), 및 장 분비 호르몬인 Cck가 모두 발현되는 것을 확인하였다. 나아가 도 4c에서 볼 수 있는 바와 같이 면역조직화학염색법을 통해 소장에 존재하는 파네트 세포 및 줄기세포가 본 발명의 오가노이드에 존재하는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통해 본 발명의 제조방법에 따라 마우스 배아줄기세포로부터 소장 오가노이드가 성공적으로 제조된 것을 알 수 있었다. 이에 본 발명의 소장 오가노이드 제조방법의 전체적인 과정을 도 5에 그림으로 도시하여 나타내었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (5)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 마우스 배아줄기세포로부터 소장 오가노이드 제조방법:
    (a) 마우스 배아줄기세포를 부착성이 낮은 물질이 처리된 플레이트에서 배양하여 3차원 구체인 배양체(Embryoid-body)를 제조하는 단계;
    (b) 상기 배양체를 마트리겔 내에 포함시켜 3차원 배양하는 단계;
    (c) 상기 3차원 배양된 배양체에 액티빈 A(Activin A)를 처리하고 배양하여 내배엽으로 특수화시키는 단계;
    (d) 상기 내배엽에 6-브로모인디루빈-3’-옥심(6-bromoindirubin-3′-oxime; BIO) 및 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스터(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester; DAPT)를 동시 처리하여 Cdx2 단백질의 발현을 유도하여 소장 계통으로 특수화시키는 단계; 및
    (e) 상기 Cdx2 단백질의 발현이 유도된 소장 오가노이드를 배양하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 내배엽은 Foxa2 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는, 제조방법
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 배양체는 마우스 배아줄기세포를 3 내지 10일 동안 배양함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 BIO 및 DAPT는 각각 0.5 내지 10 uM 및 1 내지 20 uM의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된, 소장 오가노이드.
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